JPS59501548A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリペプチド 技術分野 この発明は、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）に関係したポリペプ チドに関し、特に細胞表面と相互に作用して細胞表面への付着を促進する人の血 漿フィブロネクチンのポリペプチド・フラグメントに関する。

背景技術 フィブロネクチンは、約ｌ＋５０　ｘ　１０”ダルトン（原子質量単位）と大き な糖タンパク質であって、いくつかの独立した官能ドメインからなる。初期のフ ィブロネクチンは細胞外マトリックスの主タンパク質として発見された。そして それは、試験管内でコラーゲン。

グリコサミノグリカン、プロトグリカン。フィブリノーゲン、フィブリンおよび アクチンのような他の構成分子、並びに細胞表面と相互に作用することが示さｆ た。フィブロネクチンは浮遊細胞のコラーゲンへの付着を促進すると共に、この コラーゲンへの結合とは無関係に、浮遊細胞の組織培養基質への直接付着を促進 することが発見された。従って、細胞表面と相互に作用するフィブロネクチンの 分野についての研究が続けられてきた。

発明の開示 本発明により、フィブロネクチンの細胞付着を促進する活性を具体的に示すフィ ブロネクチンのポリペプチド・フラグメントが単離、精製された、そしてそれは 次式を有するＬ　Ｌ　５　ｋＤａｌの（キロダルトン）ペプチドとして特徴づけ られる： Ｈ−Ｉ　１ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ｇｉｎ−８ｓ　ｒ　−Ｔｈ　ｒ−Ｖａｌ−３ ｅ　ｒ　−Ａｓ　ｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ− Ｖａ　ｌ　−Ｖａ　１−Ａｌａ　−ＡＬａ　−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒ　ｏ　−Ｔｈｒ　 −３ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉ　ｌｅ　−８ｅ　ｒ　−Ｔ　ｒｐ−Ａｓ　ｐ− Ａｌａ−Ｐｒ　ｏ　−Ａｌａ−Ｖａ　１−Ｔｈｒ　−Ｖａｌ−Ａｒ　ｇ−Ｔ−ｙ ｒ−Ｔｙｒ　−Ａｒ　ｇ−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｔｙ　ｒ−（）ｌｙ−Ｇｌ ｕ−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−３ｅ　ｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａ　Ｌ −ＧＬｎ−ＧＬｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ　−Ｖａｌ−Ｐｒ　ｏ−Ｇ４ｙ−３ｅｒＬｙ ｓ−３ｅｒ　Ｔｈｒ−ＡＬａ　Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ｇｌｙ　Ｌｅｕ−Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ−ＧＬｙ−Ｖａ　１−Ａｓｐ　−Ｔｙ　ｒ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｉ　ｌｅ 　−Ｔｈ　ｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−ＡＬａ　−Ｖａ　１−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ−Ａ ｒ　ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−８ｅ　ｒ　−Ｐｒ　ｏ−Ａｌａ−３ｓ　ｒ−３ｅ　ｒ 　−Ｌｙｓ　−Ｐｒ　ｏ　−Ｉ　ｌ　ｅ　−！３ｅｒ−丁Ｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ −Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｉｎ −Ｍｅｔ−ＯＨ。

このペプチドは１０８個のアミノ酸残基全有しする。

そして細胞付着、生物学的活性ケ有するそのペプチドまたはそのフラグメントは 、細胞が付着する基質の調製に使用することができる。そのような基質は細胞培 養皿に有用であると共に、ある種の細胞を表面へ引き付けるところの人体におけ る移植用医療ゾロテーゼ（補綴）装置に用いるのに有効である。

図面の簡単な説明 第１図は、細胞付着を誘導する１　１．５　ｋＤａｌ　のフィブロネクチン・フ ラグメントの周知配列の後で考案された４つの合成ペプチドを示す。これらのペ プチド・フラグメントの開裂からの残基に対応する。図示の線は２つのペプチド に共通するアミノ酸残基す。

第２図は１人のフィブロネクチン（ＨＦ付）または合成ペプチド全被覆したポリ スチレン製ミクロタイター縦穴に普通のネズミの腎ｌ１ｌ（ＮＨＫ）細胞を付着 することに７Ｆすグラフである。それぞれの縦穴において、１０個の細胞が１時 間温置され、そして付着した細胞を計数した。フッ１プロネクチン訃よびペプチ ド１．ｎ、■およびｋＶは、ポリスチレンに直接吸着されたとき、およびアルブ ミン（ＢＳＡ）に結合されたとき分析した。アルブミン単独も試験した。フィブ ロネクチンのモル数は１つのサブ・ユニット（２１ＩＯｋＤａ１）の分子質量を 用いて計算した。細胞はフィブロネクチンおよびペプチド■全含む縦穴に付着す るが、他のペプチドまだはアルブミンのみを含む縦穴には付着しない。

第う図は．ヨウ素標識化ペプチドＸ．　ｎｌ．および■のプラスチック・ミクロ タイター縦穴への結合を示すグラフである。各縦穴において結合されたペプチド の量は各ペプチドの特定放射能から計算した。

発明を実施するための最良の形態 ポリペプチドを定義するために使用した命名法はＳｃｈｒｏｄｅｒ　およびＬｕ ｂｋｅ（’Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ’　、　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　（ １９６５））によって明記されたものであり．従来の表示に従っでＮ−末端は左 側そしてＣ−末端は右側に示される。アミノ酸残基が異性体の形をもつ場合には ．表示されるのはＬ形のアミノ酸である。

本発明は次の式を有するポリペプチドを提供する：ＨーＩ　Ｌｅ　−Ｇｌｙ−Ｇ ｉｎ−Ｇｉｎ−Ｓｅ　ｒ　−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅ　ｒ−Ａｓｐ−Ｖａ　ｌ−Ｐ ｒｏ　−Ａｒｇ−Ａｓ　ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−ＡＬａ　−ＡＬ ａ　−Ｔｈｒ　−Ｐｒ　ｏ　−Ｔｈ　ｒ　−Ｓｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−　Ｉ　 ｌ　ｅ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−ＡＬａ　−Ｐｒ　ｏ　−Ａｌａ　−Ｖａ　 Ｌ−Ｔｈｒ　−Ｖａ　ｌ−Ａｒ　ｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ　−Ａｒ　ｇ−　Ｉ　Ｌｅ −Ｔｈｒ　−Ｔｙ　ｒ−ＧＩｙ　−Ｇｌｕ−Ｔ．ｈ　ｒ−ＧＬｙ　−ＧＬｙ　− Ａｓｎ−Ｓ　ｓｒ−Ｐｒ　ｏ−Ｖａｌ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ　−Ｔｈ　ｒ− ＶａＬ　−Ｐｒ　ｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅ　ｒ　−Ｌｙａ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ− Ｔｈｒ−Ｉ　Ｌｅ−Ｓｅ　ｒ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｌｙ　ｓ−Ｐｒｏ−ＧＬｙ ’−ＶａＬ−八ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−　工Ｌｅ−Ｔｈｒ　−ＶａＬ−Ｔｙｒ− ＡＬａ−ＶａＬ−Ｔｈｒ−ＧＬｙ−Ａｒｇ−ＧＬｙ−Ａｓ　ｐ−Ｓｅ　ｔ−Ｐｒ ｏ−ＡＬａ−Ｓｅ　ｒ　−Ｓｅ　ｒ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｉ　ｌｅ−Ｓｓ　 ｒ　−Ｉ　ｌ　ｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ−Ｔｈｒ　−ＧＬｕ−Ｉ　ｌ　ｅ 　−Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ　−Ｐｒ　ｏ−Ｓｓ　ｒ　−Ｇｉｎ　−そして同一の細胞 付着活性を有する前述の分離フラグメント。

例えば次の合成フラグメントを含むことを意図している：Ｓｅ　ｒ−Ｓｅ　ｒ　 −Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｓｅ　ｒ　（　Ｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ− Ｔｈｒ　−Ｇｌｕ　−ＩＬｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅ ｔ−ＯＨ　。

上記フラグメントとして同一　の細胞付着活性を有するより短いフラグメントも 細胞が付着する表面を提供するのに有用でおシ，本発明に含まれる。さらに、ペ プチドを°表面に結合することが，ある場合にＣ−末端におけるＣｙｓ　（シス ティン）残基を添加することによって細胞付着促進活性に影響を与えることなく 促進される。

ペプチドまたはそのフラグメントは適当な方法、例えば独占的固相法５部分的固 相法，フラグメント縮合法．または古典的溶液添加法によって合成することがで きる。さら知．その合成は最近開発された組換えＤＮＡ法によっても行なわれる 。

ペプチドの化学合成に共通することは．種々のアミノ酸部分の活性側錯基奮適当 な保護用基（その基が最終的に除去されるまでその位置で化学反応が生じるの全 防ぐ基）での保護である。また、一般に、カルボキシル基において反応し，α− アミン保護基の選択的除去をしてその位置で後続の反応をさせる間、アミノ酸筐 たはフラグメントのα−アミノ基も保護される。従って．一般に、合成の１工程 としてペプチド連鎖に所望の配列で配置されたアミノ酸残基の各々を含む中間化 合物が生成される．こ扛ら種々の残基は側鎖保護基を有する。一般に、これらの 保護基は．次に所望の生成物を得るべく実質的に同時に除去される。

ペプチドは、前述の種々の化学合成法も使用されるけれども、例えば、メリフイ ルド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，　Ｊ．Ａｍ。

Ｃｈｅｍ．　Ｓａｃ．、　８５．　２１１１９（１９６１＋）　参照）によって 開示されたような固相合成法によって調製するのが望ましい。

同相合成法は．リビエル（Ｒｉｖｉｅｒ）　らによる１９８２されているように 、保護されるα−アミノ酸を適当な樹脂へ結合することによって５ペプチドのＣ −末端から始まる。この一般的な形式の合成例は米国特許第ヰ，５０　５．　８ ７　’２号および第４．　５　１　６，　８　９　１号に示されている。ベール ら（Ｖａｌｅ　ｅｔ　ａｌ）　の論文、すなわちＳｃｉｅｎｃｅ．　２１５．　 １５９４−１５９７　（　１　９　８　１年９月）には４１−残基のポリペプチ ドの固相合成が論議されている、それはさらに詳細な合成の論議をしており．マ ルキイーリ受，　３１７ｇ　（１９８１）　にみら扛る。

ペプチドの合成において、適当に保護されるα−アミン基を有するＭｅｔ（メチ オニン）はクロロメチル化ポリスチレン樹脂などに結合される。メチルチオール の側鎖は任意に保護または保護されないままである。

Ｃｙｓ　（シスディン）ｔ−Ｃ−末端に用いる場合，それは、そのα−アミノ基 およびスルフヒドリル側鎖を保護した後で樹脂に結合されるα−アミノ保護基の 除去後。

塩化メチレンにトリフルオロ酢酸を使用するような合成における次の工程を行な う。特定のアミン保護基を除去する他の標準開裂用試薬２よび条件が．前記単行 本「ペプチド」に記載されているように使用される。

次に．アミノ酸を保護する残シのα−アミノおよび側鎖を所望の順序で段階的に 結合して樹脂に結合された中間化合物を得る。合成において各アミノ酸を別々に 添加する別の方法としては、固相反応器に添加する前にそれらのいくらかが相互 に結合される。適当な結合試薬の選択は技術的な問題である。

所望のアミノ酸配列全完成した後、中間ペプチドは。

樹脂からペプチドを開裂するのみならず残りの側鎖保護基を全て開裂する液体Ｈ Ｆのような試薬で処理することによって樹脂担体から除去される。次に、ポリペ プチドは、リビエールらの論文（Ｒｉｖｉｅｒ　ｅｔ　ａＬ、。

Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：５ｔｒｕｅｔｕｖｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｕ ｎｃｔｉｏｎ（，１９７９）。

ｐＩ）−１２５−１１）に記載されているように、半調製のＨＰＬＣ（高性能液 体クロマトグラフィー）を伴うゲルパーミェーションによって精製することがで きる。少なくとも９５％またはそれ以上の純度（存在する全てのペプチドを基準 にした値）が適度に得られ、この純度は臨床試験や使用に望ましい値である。約 ９８％と高純度が実際的であるが、ある種の試験管での用途には、さらに低純度 が受け入れられる。従って、ポリペプチドは、この用途のためには、存在する全 てのペプチドを基準にして少なくとも約５０重量％を意味するかなりの純粋であ るときに特に有用であると考えられる。

実験■ 材料および方法 フィブロネクチンの細胞付着ドメインは、前述のように精製した（Ｐｉｅｒｓｃ ｈｂａｃｈｅｒ、　Ｍ、Ｄ、　ｅｔ　ａＬ、（１９ｇ１）Ｃｅｌｌ　２６．２５ ９−２６７　参照）。分子量の定量は、１Ｏ−２Ｏ％のポリアクリルアミドの濃 度勾配を用いた硫酸ドデシルナトリウム・ポリアクリルアミドのゲル電気泳動お よび超遠心分離によって行った。超遠心分離は６−場所のアルミニウム・ロータ を備えた分析用遠心分離機（ＭＳＥＣｅｎｔｒｉｓｃａｎ（ＴＭ））で行った。

ＩＣＩｎの単一セクター・セル内の５Ｗカラムで低速平衡沈降法を適用した。部 分的特定体積はアミノ酸の組成から計算した。

（モル）過剰の臭化シアンで試みた。

アスパルチル・ボンドにおける酸開裂は、密閉した真空管内の希塩酸中で１１０ ℃において２時間行った。

その試料は次に凍結乾燥した。

トリプトファン残基における開裂は１等体積のｇ８％ギ酸とへブタフルオロ酪酸 中、数千倍（モル）過剰の臭化シアンでタンパク質を処理することによって行Ｅ ｌｋｈａｒｔ、Ｉ　Ｎ　）の消化は、０１％硫酸ドデンルナトリウムを含む０． １　Ｍ重炭酸アンモニウム中で酵素と基質との比１　：　５０　（ｗ／ｗ）ｋ用 いて行った。

サーモリシン（Ｔ　Ｍ　）　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　 ＣＡ）ム中で４５℃において１時間行った。その消−化はＥＤＴＡを添加するこ とによって停止した。

カルボキシペプチダーゼＡの消化は、０１％硫酸ドデシル・ナトリウムを含む０ ．１　Ｍ重炭酸アンモニウムに溶解された細胞付着フラグメン）ｋ処理すること によって行った〔カルボキシペプチダーゼＡ　（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＯ）］での酵素と基質との比は１：　５゛ｏ　Ｏ（Ｗ／Ｗ）で あった）。種々の時点で一部を取り出し、最終濃度５０％に酢酸全添加すること によって反応を停止させた。これらの材料は次に凍結乾燥して、遊離アミノ酸を 分析した。基質を含まないブランクの消化は平行しセファデックスＧ−７５（Ｔ Ｍ）特級品またはセファクリ／Ｌ、　Ｓ　−２００（Ｔ　Ｍ　）　（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　Ａ、Ｂ、、Ｕｐｐｓａｌａ。

Ｓｗｅｄ　ｅ　ｎ　のゲル・クロマトグラフィーを最初の精製工程として採用し た。Ｇ−７５カラムを平衡させて０１Ｍ重炭酸アンモニウムで溶離した、Ｓ−２ ００カラムは６Ｍ塩酸グアニジンで行った。それ以上の精製は、μｍボンダパー ク（Ｂｏｎｄａｐａｋ）１′″１８−カラム（ＴＭ）に関する逆相液体クロマト グラフイシ（Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｌｆｏｒｄ。

ＭＡに重ポンプ勾配のクロマトグラフィー装置）によって行った。ペプチドの溶 離には０．１　Ｍ重炭酸アンモニウム中０−８０％エタノールの６０分の直線勾 配を用いｆ−、それはＬＤＣスペクトロモニターｍ　（Ｔ　Ｍ　）の可変波長検 出器を使用して波長２３０ｎｍにおける吸光度によって測定された。

ペプチドは、０１％フェノールを含む６Ｎ塩酸中で１１０℃において２１１時間 加水分解し、ベックマン（ＴＭ）１２１Ｍアミノ酸分析装置（Ｔｒａｇｒｄｈ、 　ＴＪ、　ｅｔａｌ（１９７０））で分析した。セリンおよびトレオニンの値は 、加水分解中のロスは標準補正係数を用いて、またそのままの細胞付着フラグメ ントの場合には２Ｉ１．Ｉ４８および７２時間の加水分解時間食用いて零時間へ の直線外挿法によって補正全行った。トリプトファンは分光光度法で定量した。

システィン酸としてシスティンの定量には過ギ酸の酸化を用いた。

アミノ酸配列の分析 自動エドマン分解は、ベックマン１２２９７＋４迅速タンパク質フアドロール（ ＴＭ）プログラムを使用したベックマン（ＴＭ）ｇ９ｏｃシーケンサ−で行った 。

クアドロール（Ｎ　、　Ｎ　、　Ｎ’　、　Ｎ’−テトラキス（２−ヒドロキシ プロピル）エチレンジアミンの商品名）の濃度は０５Ｍであった。アミノ酸のフ ェニルチオヒダントインの同定および定量は高性能液体クロマトグラフそのまま の細胞付着ドメインの自動アミノ酸配列の分析な最初の５０残基の明瞭な同定を させた。

化学的フラグメンテーション アスパラチル（ａｓｐａｒｔｙｌ）結合における開裂のための希塩酸での細胞付 着フラグメントの処理は、数種のペプチドを生成した、その中のいくらかは凍結 乾燥後不溶性であった。０．１　Ｍの重炭酸アンモニウムに可溶性のペプチドは 、セファデックスＧ−７５（ＴＭ）のカラムで１つの主ピークと４つの小ピーク に亦別された。

アミノ酸の組成データおよびＡ２ペプチドの配列分析は残基８７〜１０７の同定 をさせた。０．１　Ｍ重炭酸アンモニウムに不溶性の部分は６Ｍの塩酸グアニジ ンニ溶解し、６Ｍ塩酸グアニジンで平衡させた七フアクリルＳ　−２００（Ｔ　 Ｍ　）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）のカラムで分別した。

これは、５７残基ペプチド（フラグメントＡ１　）の単離をさせた。そして自動 エドマン分解法の５５サイクルは細胞付着フラグメントの残基３０〜８５のアミ ノ酸配列を生じた。

１つのフラグメントはトリプトファン配向臭化シアンの開裂から均一に積替した 。アミノ酸分析はそれが全細胞付着フラグメントのアミノ−末端２８残基である ことを示した。自動配列分析はこの領域のフラグメントがアミノ酸配列であるこ とを確認した。

完全な細胞付着フラグメントのアミノ酸組成およびそれから化学的フラグメンテ ーションによって誘導した他のペプチドを次表に挙げる。部分Ａ２における微少 汚染物質はアミノ酸組成と、見出された残基の実際の数との間に若干の不一致を もたらした。しかしながら、自動配列分析における良好な収率並びに他のペプチ ドとの広範囲の重畳はこのペプチドの配列を明瞭にペプチドのアミノ酸組成は細 胞付着フラグメントの化学的開裂から誘導した：かっこ内の整数値は配列に基づ く。

Ｌ　ｙ　ｓ　２．１ｆ２１　ＬＯ（２１５９ｆｔ１１Ａ　ｓ　ｐ　２．Ｇｆ５１ 　と２Ｆ２１　２．２（２１ｇ、ｔ　ｔｇｌＴ　ｈ　ｒ　８．４（９１１ｇ（１ １３，０（うｌ　１２．７Ｃ（１５）Ｓ　ｅ　ｒ　ＩＬ、　５ｎｌ　３．９（５ １ラフｆＩＩｌ　１２８°（１３）（）ｌｕ　５．４（うｌ　２．０Ｆ２＋　３ ．０（うｌ　８１１（８１Ｐ　ｒ　ｏ　１１．５ｆ１１１　２．Ｊ（３１１，９ ｆ２１　Ｆ！、８　（９１Ｇ　Ｌ　ｙ　７．２（８１１２（１１８，９（９１Ｔ ｙｒ　ヰ５（５１１，０（１１６，１（６１Ｐｈｅ　１．１（１１、１，１（１ １ Ｔｒｐ　’（１１０，９ｆｉ１ 合計　５７　２２　２８　１ｏｌｌ： 位置　５０−８６　ｇ７−１ｏｇ　１−２８’［＃（％）　Ｆ５　９０　５８ ａ：ペプチドの紫外線スペクトルで検出された被酸化生成物。

ｂ、過ギ酸酸化試料はシスティン酸を生成しなかった。

Ｃ：時間零へ直線外挿によって得た値。

ｄ、７２時間での値のみ。

メチオニンにおける開裂のための臭化シアンでの処理は検出可能なフラグメンテ ーション全もたらさなかった、これは、アミン末端配列にメチオニンが見られな かったから５単一のメチオニン残基がカルボキシ末端に、またはその直ぐ近くに 位置していることを示す。

酵素の消化 全細胞付着フラグメントのカルボキシペプチダーゼＡによる消化によって、５分 でタンパク質１モル当り１モルのメチオニン全放出した、それはこのアミノ酸を カルボキシ−末端残基として決定した。

２つの小ペプチドが、セファデックスＧ−７５クロマトグラフイーの後、　３． ａｕｒｅｕｓ　Ｖ８プロテアーゼ消化から単離された。それらのアミノ酸組成か ら、それらがそれぞれ分子のアミノ゛−末端部分とカルボキシ−末端部分に由来 することは明らかである。アミノ酸配列の分析は酸開裂フラグメントのカルボキ シ−末端部分の配列を確認した。

セファデックスＧ−７５（ＴＭ）のクロマトグラフィ、続く高性能液体クロマト グラフィーによる熱分解消化物から多数のペプチドが単離された。

熱分解ペプチドのアミノ酸配列データは他の配列ペプチドから得たデータ全確認 した。

全ポリペプチドが細胞付着活性により測定された所望の生物学的活性を示すこと 、およびポリペプチドのあるフラグメントも実質的に同一の細胞付着活性を示す ことがわかる。従って、１０８−アミノ酸残基ポリペプチドのそれら生物学的に 活性のフラグメントは、発明の構成部分、例えば合成、試験そして全配列と同じ 活性を示すことがわかったＣ−末端におけるう〇−残基フラグメントと考えられ る。Ｃ−末端におけるＣｙｓ−残基を有するまたは有さない全ペプチド、または 生物学的に活性のフラグメントは２表面の処理に使用することによって細胞を付 着する基質を提供するために細胞付着タンパク質として使用することができる。

合成プラスチック樹脂材料、例えばニトロセルロースのようなセルロース・エス テル、または同じＬうな材料の表面は、細胞付着全確実にするために本発明のポ リペプチドで処理することができる。細胞付着用の同様の基質は、ポリペプチド 全固体担体１例えばガラスや合成プラスチック樹脂、またはポリペプチドに結合 できる反応性基を含むアガロースのような長鎖多糖類にポリペプチドを共有結合 で結合させることによって生成させることができる。この方法は、ペプチド並び に合成５〇−残基フラグメントラ臭化シアン−活性化アガロース・ビード［Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅ ｎ）社により商品名セファロースで販売されている〕に結合させ、それらのビー ドを高圧滅菌によって殺菌し、しかる後にポリペプチドのコーティングが受動的 吸収によって得られる値よりも高濃度で細胞をそれらビードに付着さすのを誘導 することを示すことによって証明された。

細胞の付着位置の構造をさらに規定するために、４つの合成ペプチドを考案した 。各配列は１１．５−　ｋＤａｌフラグメントから２９または３０のアミノ酸の 配列を含み、共にこの全領域全構成する。これらのペプチド全使用して、Ｃ０Ｏ Ｈ末端の５０のアミノ酸がフィブロネクチンの１１．５−　ｋＤａｌの細胞付着 性フラグメントの細胞付着活性を説明することが示された。

実　験　■ 材料および方法 ペプチドの原料 前述のゼラチン−セファロース・クロマトグラフィーに使用することによって、 新しく吸い出した血漿から人のフィブロネクチンを得た。フィブロネクチンの消 化から１１．５−　ｋＤａＬ　のペプチドを単離した。メリフイルドの固相法を 用いて４つのペプチドを化学的に合成した、その合成はペニンスラ研究所（Ｓａ ｎ　Ｃａｒｇｏｓ。

ＣＡ）に与えられた仕様書に従って行った。合成ペプチドのデザインは、各配列 が１’　１．５−　ｋＤａｌの細胞付着性ラグメントのアミノ酸配列に従って、 隣接ペプチドと共通の５または４つのアミノ酸を有するものであった。

各ペプチドは、１１．５−　ｋＤｈｌのフラグメントがらの一連の２９または３ ０のアミノ酸とＣ０ＯＨ末端におけるシスティンを有して、ペプチドの固体相へ の結合を促進する。ペプチドの組成はアミノ酸の分析によって実証された。ペプ チドは、１１．５−　ｋＤａｌ　フラグメントのＮ　Ｈ２末端から始まるローマ 数字で数えられる（第１図）。

４つの合成ペプチドはプラスチックの培養皿内で次のように細胞付着活性の試験 をした。各ペプチドｌ　ｍｇｆ　ｐ　Ｈ８，０、２ｍｇ／ｍｌの濃度で６Ｍの尿 素に溶解した。

ペプチドは次に、リン酸塩緩衝化塩類で平衡させた５蛯セファデックスＧ−２５ カラムを通すことによってこれらの反応物質を除去した。ペプチドを含む部分は 収集し、プールして、細胞付着分析に使用した。未処理のポリスチレン製ミクロ タイター板に設けた複数の縦穴（ｗｅ　１１　）は、それらの穴に２０μｍ１７ ｍ１の溶液を室温で２時間温置することによってウシの血清アルブミン（以下ア ルブミンと記す）で被覆または被覆されなかった。付着しないタンパク質を除去 するために、それらの縦穴全洗浄した後、そのアルブミン被膜を先ずう−（２− ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル（Ｓｉ ｇｍａ）　、二、官能架橋剤で室温において５０分間、１０μｔｉ／ｍｌで誘導 し、次に還元されたペプチドを含む溶液を種々の濃度で前記縦穴に祭加し−（、 少なくとも１時間反応させた（架橋剤は主にアルブミン内のアミノ基と反応し、 続いてペプチド内のシスティンを介してペプチドをアルブミンに橋かけする）。

未付着のペプチドを除去するためくり返し洗浄をした後、ミクロタイター板は細 胞付着分析に使用した。ペプチドで直接被覆した縦穴における細胞付着は、アル ビミンの結合したペプチド、アルブミンの結合したフィブロネクチン、フィブロ ネクチン単独、または誘導さｎたアルブミン単独で見られるものと比較した。

ペプチドのセファロース・ビードへの結合４つの合成ペプチド並びにフィブロネ クチンの１１５−　ｋＤａＬのフラグメントおよび２００−ｋＤａｌのフラグメ ント’ｒ製造業者の仕様書に従って臭化シアンで活性化したセファロース−ＧＭ Ｂビード（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ　）に結合させた。それらのペプチドは先ず前 述のように還元されて、セファロースｌ　ｍｌ当りペプチド８萬ｇで使用された 。アルブミンを被覆したビードおよびエタノールアミンで誘導したビードは対照 試料として使用した。

細胞付着の分析 細胞Ｎ着の分析は１人のフィブロブラストまたニ普通のネズミの腎嫁（ＮＲＫ） でルオスラテイらの論文（ＲｕｏｓＬａｈｔｉ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ　（１９８１） Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙｍｏＬｏｇｙ８２、　ｌ！０５〜ｇ３１）に記載され ているように行った。要約すると、１０個の細胞を含む単一細胞けん濁液１００ ｍ１　ｆペプチドの１つまたはフィブロネクチンで被覆した平底のミクロタイタ ーの縦穴に入れた。５７℃で１時間後、未付着細胞は洗浄して除去し、付着細胞 は固定し、計数のために着色した。ある実験においては。

媒質に可溶性のペプチドを添加して、付着中にその存在が阻止作用を有するか否 か會決めた。アガロース・ビードへの細胞付着は、全く前述のように丸底ミクロ タイターの縦穴の底におけるビードの一層に関して行周仰のクロルアミン−Ｔ法 を用いてペプチド］１．Ｉ［［、■の５０＃’ｅそれぞれｏ３うｍＣ１（ｌ　Ｃ ｉ（キュリー）＝　３．７　ｘ　１０　Ｂ　ｑ　）の工（ヨウ素）で識別した。

未結合のヨウ化物は除去し、セファデックスＧ−２５のカラムを通すことによっ て定量した。

結　果 細胞付着に及ぼす作用を研究した４つの合成ペプチドを第１図に示す。分裂、お よびそれによる細胞識別位置を失う可能性全壁けるために若干の重畳が含まれた 。ペプチドはポリスチレンのミクロタイター縦穴へ直接吸着させられたか、或い は三官能架橋剤を使用することによってそれらの’ｃｏｏＨ末端のシスティ゛ン 残基を介してアルブミンを被覆したポリスチレ”ンに付着させられた。このよう に誘導された表面は次に細胞の付着を支える能力を試験した。第２図はそれらの 実験結果を示す。

フィブロネクチンの１１．５−　ｋＤａｌの細胞付着フラグメントのＣ００Ｈ− 末端の５０のアミノ酸（およびシスティン残基）からなるペプチド■は、ナルブ ミノに結合または表面に直接吸着されたＮＨＫの細胞および人のフィブロブラス トの付着を助けた。しかしながらアルブミンへの結合はこのペプチドの活性を著 しく増した。アルブミンに結合された場合、２ＯｎＩＩとわずかのペプチド■が 、１つのミクロタイター縦穴当りに検出された（第２図参照）。一方、ペプチド Ｉ−ＩＦ。

および■はこの分析では活性を有さなかった。全フィブロネクチンの活性は架橋 剤で誘導したアノしブミンでの基質の前処理には無関係であった。タンノクク質 が直接またはアルブミンを介してプラスチックに結合したか否かのフィブロネク チンに対する結合曲線は類似したので、プラスチックに結合したフィブロネクチ ンを使用して得たデータのみ會示す。

不活性ペプチドの活性欠除がポリスチレン表面への結合不足のためでないことを 確認するために、ペプチドｎ、ｍ−およびｗｌ＜放射性ヨウ素化して、ミクロタ イターの縦穴中で一晩装置した。第う図は、これらうつのペプチドは全てミクロ タイターの縦穴に同じ程度に結合することを示う。ペプチド■が他のペプチドよ り少し弱い結合であるのは、多分それが最も親水性であるためと考えられる。５ つのペプチドのポリスチレンへの結合は、対応する非標識化ペプチドによって抑 制することができた。これは放射性ヨウ素化がこの種の表面への結合能を変えな かったことを示す。その上、細胞は非標識化ペプチドで見られるものと同一の放 射線量依存法で　ニー標識化ペプチド■に付着した。試験は、可溶性の形でのペ プチドＨの存在がこのペプチドまたはフィブロネクチンを被覆したミクロタイタ ー縦穴への細胞の付着を抑制するか否かを決定するために行った。しかしながら ５１５０μｍｊＪ／Ｉｄまでの濃度におけるペプチド■は１時間後にこれらの表 面への細胞の付着に影響を与えなかった。

ペプチド■に見られた活性の特異性を確認するために、全てのペプチドを臭化シ アンで活性化１７たセフブロース６ＭＢへ結合した。４つのペプチドの結合効率 は全て、紫外線吸収を基準にして判定したものより９０％以上大であった。ペプ チド■を結合したビードは。

１１５−ｋＤａｌフラグメント全体またはタイプ【１ネクチンの２００−ｋＤａ ｌフラグメントでビードにしたように、細胞の付着を助けた。後者のフラグメン トは。

フラグメントで被覆されたビードの安定性および生物で誘導されたアガロース・ ビードは、それちの表面にペプチド１．Ｉ［、または■を有するビードのように 、細胞付着活性を欠いた。

データは、フィブロネクチンの細胞付着活性の大部分（全てでない場合）全５０ のアミノ酸残基によって説明できることを示す。これはそのままのフィブロネク チン・ポリペプチド単量体の約１％に過′ぎないので。

細胞表面とフィブロネクチン分子のこの部分との間の極めて特異な相互作用を推 測することができる。活性ペプチドのペプチド■は、フィブロネクチンの細胞付 着ドメインを構成する４つの合成ペプチドの中で最も親水性である。三方ペプチ ド■および■は極めて疎水性であって、ペプチドＩは中間の特性全示す。多分。

これがそのままのフィブロネクチン分子の対応する部分の表面にさらさ扛るペプ チド■の５０の雑基をもたらし、フラグメントのこの部分における活性の存在と 一致する。

ペプチド■は疎水性のポリスチレン表面と親水性のセファロース・ビードを含む うつの異なるタイプの表面に活性であったことに注目することが大切である。

これは、我々が細胞によ、り引きつけさせる表面のある種の非特異的改良をさせ ｌくする。この意見は、我々がこれら表面への異なるペプチドの結合が類似し、 しわもペプチド■のみが細胞の付着に有効なことを示すことができたことによっ て一層強められた。その上。

このペプチドは特異な高活性を有した。架橋剤で誘導したアルブミンがペプチド のポリスチレン表面への結合の媒介に使用されたとき、ペプチド■はモル奮基準 にしてそのままのフィブロネクチン自体と殆んど同じ位活性であった。ペプチド ■がポリスチレンのマイクロタイター縦穴の直接被覆に使用されたとき、細胞付 着の促進においてそのままのフィブロネクチンで見られるものと同一の効果を得 るためには、約１０倍のモル量を必要とした。こ扛は、結合の結果として機能の そう失のためであるか、或いは大きなフィブロネクチン分子に比較してこのペプ チドのポリスチレンへの結合の相対的な非効率または可逆性を反映するものであ ろう。

フィブロネクチンの細胞付着場所と相互に作用する細胞表面における成分（受容 体）の性質は知られていない。ここに、開示されたデータは、個々の細胞表面受 容体または受容体の類が存在することケ強く示唆している。合成ペプチドまたは 活性の場合その短い誘導体はこの受容体の同定に有効である。ペプチド■のグロ リン残基Ｎ１１１０の周囲の親水囲部分におけるペプチド鎖に曲がり（ねじれ） が予測される。これは細胞との相互作用に利用されるルーフゲもたらす。次の実 験は後で論議するようにこの結果を確認した。

十分に理解されない理由であるが、フィブロネクチンの細胞付着機能の発現はフ ィブロネクチンがプラスチックの表面やコラーゲンのマトリックスのような固相 に結合された細胞に提供されることが必要であるが。

可溶性のフィブロネクチンは細胞へ分離自在に結合しない。可溶性ペプチド■が 細胞の固定されたペプチド■またはフィブロネクチンへの付着を阻止しないこと においてペプチド■は同様に振舞う。生産的な相互作用には細胞表面といくつか のフィブロネクチ２分子との共同結合が必要のようである。細胞表面にさらに強 く結合するこのペプチドの類似体を作ることが可能であろう。これはフィブロネ クチンに対する細胞表面受容体の同定を促進するのみならず、細胞付着を変えさ せるであろう。

周囲の組織との結合を促進するために最適の細胞培養および種々の補綴物質用の 表面調製のような実際的な応用ももくろむことができる。う０のアミノ酸のペプ チドは１つ以上の結合場所を有するようであるから。

今扱うことができる問題の１つは、フィブロネクチンと全ての種類の細胞との相 互作用がこの同一領域の分子を含むか否かである。例えば、血小板はそれらの表 面に異なるメカニズムによってフィブロネクチンを結合する。これは、このペプ チドを細胞付着の調節に使用すること、または補綴物質の設計において重要な部 分である。それは、生体内においてフィブロネクチンのはたす役割も明らかにす るであろう。

産業上の利用可能性 培養基質の細胞付着ポリペプチドでの被覆は媒質にフィブロネクチンの使用を不 要てし、従って培養の条件をより良好に規定すると共に、再現性を良好にする。

細胞付着表面の商的使用の１例として、フラグメントで製造されたシトデックス （Ｃｙｔｏｄｅｘ）粒子はゼラチンで被覆される。それによって同数の付着性細 胞を皿内で可能な体積よりも著しく小さい体積で成長させることを可能にする。

これらビードの活性は一般に成長媒質におけるフィブロネクチンの使用に依存す る。そ−して細胞付着ポリペプチドはそのような目的に対して生体内で細胞を表 面に引き付けたり、或いは移植前に特定の表面に所望の細胞の成長を促進さすよ うな基質を使用させる医用装置？設計することができる。そのような方法の例は 、一般にポリエステル繊維、特にダクロン繊維（ポリエチレン・テレフタレート ）かう織るまたは編んだ補綴血管または空胞支片に内皮細胞の成長を誘導する方 法である。殆んどの種類の細胞はフィブロネクチンおよびこのポリペプチドに引 き付けられるが、特に内皮細胞およびフィブロブラスト細胞はフィブロネクチン に引き付けられる。後者の事項は。

事故や手術の傷口の閉鎖セよびゅ合を助けるためにパッチ移植皮片などの被覆に おいてこの規定されたポリペ７チドの潜在的な有用性を示す。そのような場合。

コラーゲン、グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンのような生物学的分 子にペプチドを結合するのが有利である。例えば、Ｃ−末端にＣｙｓ残基残基金 石３〇−残基フラグメント’に単量体コラーゲンに結合する。これは、う−（２ −ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのよ うな架橋剤を使用して、システィンをコラーゲンのりシン残基に橋かけすること によって行うことができる。また、それは、一時的または半永久的に体内２例え ば血管または腹膜腔内に挿入する目的の補綴器具（経皮器量とも呼は扛る）の表 面を被覆することにおいてその価値を示す。本発明は１例えば細胞付着の促進に 塗布される点眼液またはローション、または軟膏或いはゲルのような液体の形、 または他の便利な形にされる。

フィブロネクチンはフィブロブラストおよびマクロファージに対して走化性であ るように示された。この活性は細胞付着ドメインの存在に関係する。ここに記載 した合成ペプチドおよびその類似特性のフラグメントの細胞付着活性の明示は走 化性（又は化学走性）、活性である。

以上１本発明を２．５の望ましい実施態様に関して説明したが、当業者には明ら かなように請求の範囲に限定されている発明の範囲を逸脱することなく種々の変 化および改良が可能であることを理解さｎたい。例えば、他の基によってアミド 化または置換されるように、Ｃ−末端に遊離酸を有する必要がない。本発明の特 徴は次の請求の範囲において強調される。

イ２り２ 国際調査報告 ＃１頁の続き 優２先権主張　＠１９８２年１０月８日■）米国（ＵＳ）■４３３４５７ ９発　明　者　ルースラチ・エルキ・アイアメリカ合衆国カリフォルニア用９２ ０２４オリ−ベンバイン・ビア・デル・セリトロ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　実質的に次の式を有し： Ｈ−Ｉ　１ｅ−ＧＬｙ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−８ｅ　ｒ　−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−８ｅ　 ｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖ ａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−８ｅ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅ　ｕ −Ｉ　ｌ　ｅ−８ｅ　ｒ−Ｔｒ　ｐ　−Ａｓ　ｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｖ ａｌ−Ｔｈｒ　−Ｖａ　１−Ａｒ　ｇ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−工１ｅ−Ｔｈ ｒ　−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｔｈ　ｒ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ　−３ｅ 　ｒ　−Ｐｒ　ｏ−ＶａＬ−Ｇｌｎ　−（）ｌｕ−）’ｈｅ−Ｔｈｒ　−Ｖａｌ 　ＰｒｏＧｌｙ−３ｅｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−１１ｅ　 ５ｅｒ−Ｇ４ｙ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｐｒ　ｏ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ａｓ　ｐ −Ｔｙ　ｒ−Ｔｈｒ　−１Ｌ　ｅ　−Ｔｈｒ−Ｖａ　１−Ｔｙ　ｒ　−Ａｌａ　 −Ｖａ　１−Ｔｈ　ｒ　−Ｇｌｙ−Ａｒ　ｇ−Ｇｌｙ　−Ａｓ　ｐ−Ｓ　ｅ　ｒ −Ｐｒ　ｏ−ＡＬａ−３ｅｒ−Ｓｅ　ｒ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−４１ｅ−３ｅｒ 　（１ｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ　−Ａｒ　ｇ−Ｔｈｒ−ＧＬｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｌ ｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−ＧＬｎ−Ｍｅｔ−ＯＨ。 試験管内において、細胞表面との特異な細胞付着活性全特徴とする実質的に純粋 なポリペプチド；または該ポリペプチドと同一の細胞付着活性を示すポリペプチ ド・フラグメント。 ２、　補綴器具の表面に付着されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の ポリペプチドまたはフラグメント。 ５　合成樹脂繊維の表面に付着されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載 のポリペプチド。 ヰ、　経皮器具の表面に付着されることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の ポリペプチドまたはそのフラグメント。 ５　固体基質表面への細胞の付着を確実にするために該固体基質表面へ付着され ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載のポリペプチドまたはそのフラグメ ント。 ６　前記固体基質がガラス、合成樹脂または長鎖の多糖類であることを特徴とす る請求の範囲第５項に記載のポリペプチド。 Ｌ　前記固体基質が合成樹脂であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の ポリペプチド。 ８　前記固体基質がニトロセルロースまたはポリエステルであることを特徴とす る請求の範囲第７項に記載のポリペプチド。 α　前記固体基質がアガロースであることを特徴とする請求の範囲第７項に記載 のポリペプチド。 １０　コラーゲンに結合される請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ＩＬ　管移植皮片に結合されて、その一部分全形成することを特徴とする請求の 範囲第１項に記載のポリペプチド・フラグメント。 １２　液体、ローション、軟膏またはゲルの形を特徴とする請求の範囲第１項に 記載のポリペプチド・フラグメント。 １３　次の式を有するフラグメントから実質的になること全特徴とする請求の範 囲第１項に記載のポリペプチド・フラグメント： Ｈ−Ｔｙｒ　−Ａｌａ−Ｖａｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｙ−Ａｓｐ− ８ｅ　ｒ−Ｐｒ　ｏ　−Ａｌａ−５ｅｒ−８ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＩＬｅ−８ ｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａ’ｒｇ−Ｔｈ。 Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ−Ｒ−ＯＨ ただし、式中のＲは細胞付着活性を促進するシスティンまたはデス−Ｒである。 ｉｌｌ、補綴器具の表面に付着されることを特徴とする請求の範囲第１５項に記 載のポリペプチド・フラグメント。 １５、合成樹脂繊維の表面に付着されること全特徴とする請求の範囲第１５項に 記載のポリペプチド・フラグメント。 １６　経皮器具の表面に付着されること全特徴とする請求の範囲第１５項に記載 のポリペプチド・フラグメント。 １７、細胞の固体基質表面への付着を確実にするために該固体基質表面へ付着さ れることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のポリペプチド・フラグメント 。 １８　前記固体基質がガラス、合成樹脂または長鎖ポリ多糖類であること全特徴 とする請求の範囲第１７項に記載のポリペプチド・フラグメント。 １９　前記固体基質が合成樹脂であることを特徴とする請求の範囲第１ｇ項に記 載のポリペプチド・フラグメント。 ２０、前記固体基質がニトロセルロースまたはポリエステルであることを特徴と する請求の範囲第１９項に記載のポリペプチド・フラグメント。 ２Ｌ　前記固体基質がアガロースであることを特徴とする請求の範囲第１５項に 記載のポリペプチド・フラグメント。 ２２、コラーゲンに結合された請求の範囲第１３項に記載のポリペプチド・フラ グメント。 ２５　管移植皮片に結合されて、その一部分全形成することを特徴とする請求の 範囲第１５項に記載のポリペプチド・フラグメント。 ２４、液体、ローション、軟膏またはゲルの形であることを特徴とする請求の範 囲第１３項に記載のポリペプチド・フラグメント。