JPH06319554A - 修飾炭水化物補完体を有する二機能性糖タンパク質と腫瘍選択療法におけるそれらの用途 - Google Patents
修飾炭水化物補完体を有する二機能性糖タンパク質と腫瘍選択療法におけるそれらの用途Info
- Publication number
- JPH06319554A JPH06319554A JP6117524A JP11752494A JPH06319554A JP H06319554 A JPH06319554 A JP H06319554A JP 6117524 A JP6117524 A JP 6117524A JP 11752494 A JP11752494 A JP 11752494A JP H06319554 A JPH06319554 A JP H06319554A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tumor
- compound
- carbohydrate
- glycoprotein
- glucuronidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0002—Antibodies with enzymatic activity, e.g. abzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3046—Stomach, Intestines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 腫瘍特異性抗原と特異的に結合する第一要素
と無毒性プロドラッグを細胞毒性薬物に開裂する酵素活
性を有した第二要素を含む炭水化物補完体修飾二機能性
糖タンパク質が提供される。炭水化物補完体はマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグルコサミン、ラクト
ースおよびフコースからなる群より選択される少くとも
１つの露出炭水化物残基を含む。 【効果】 修飾炭水化物補完体は腫瘍部位における糖タ
ンパク質の相対濃度の増加と全身循環系および非腫瘍部
位からの浄化増強に寄与する。
と無毒性プロドラッグを細胞毒性薬物に開裂する酵素活
性を有した第二要素を含む炭水化物補完体修飾二機能性
糖タンパク質が提供される。炭水化物補完体はマンノー
ス、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグルコサミン、ラクト
ースおよびフコースからなる群より選択される少くとも
１つの露出炭水化物残基を含む。 【効果】 修飾炭水化物補完体は腫瘍部位における糖タ
ンパク質の相対濃度の増加と全身循環系および非腫瘍部
位からの浄化増強に寄与する。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、標的設定化タンパク質、および酵素の性質を
有する二機能性糖タンパク質に関する。更に詳しくは、
本発明は、炭水化物残基の補完体（complement）が循環
系からのこのような分子の浄化（clearance)および腫瘍
結合の選択性を高めるように修飾されたこのようなタン
パク質に関する。前記の酵素性質とは、同時に又は後に
投与された無毒性「プロドラッグ」を、腫瘍細胞を攻撃
する細胞毒性「薬物」に開裂する性質である。本発明は
このようなタンパク質による腫瘍の治療と組換えによる
産生およびトランスジェニック動物による産生を含めた
このようなタンパク質の産生にも関する。
有する二機能性糖タンパク質に関する。更に詳しくは、
本発明は、炭水化物残基の補完体（complement）が循環
系からのこのような分子の浄化（clearance)および腫瘍
結合の選択性を高めるように修飾されたこのようなタン
パク質に関する。前記の酵素性質とは、同時に又は後に
投与された無毒性「プロドラッグ」を、腫瘍細胞を攻撃
する細胞毒性「薬物」に開裂する性質である。本発明は
このようなタンパク質による腫瘍の治療と組換えによる
産生およびトランスジェニック動物による産生を含めた
このようなタンパク質の産生にも関する。
【０００２】背景技術の説明 腫瘍を制御しようと、抗体の特異性に基づき選択的な治
療効果を実現する試みがこの２０年間にわたり行われて
きた。しかしながら、大きな治療的成功は固形腫瘍の場
合にはまだ得られていない。高度に特異的な腫瘍選択性
モノクローナル抗体は標的設定化目的に利用できるが、
免疫療法において従来の試みが成功しなかったのは固形
腫瘍に局在化できるモノクローナル抗体分子が少量であ
ることに主に起因する。一般に治療目的には不十分とさ
れるこの低度の局在化の１つの理由は、腫瘍における拡
散障壁（diffusion barriers) の存在である(Jain,R.
K.,Cancer Res.47:3039(1987))。薬物の投与量を増加さ
せることで補う従来の試みは、非腫瘍構造における広い
非特異的結合と全身的な毒性副作用という問題を生じ
た。
療効果を実現する試みがこの２０年間にわたり行われて
きた。しかしながら、大きな治療的成功は固形腫瘍の場
合にはまだ得られていない。高度に特異的な腫瘍選択性
モノクローナル抗体は標的設定化目的に利用できるが、
免疫療法において従来の試みが成功しなかったのは固形
腫瘍に局在化できるモノクローナル抗体分子が少量であ
ることに主に起因する。一般に治療目的には不十分とさ
れるこの低度の局在化の１つの理由は、腫瘍における拡
散障壁（diffusion barriers) の存在である(Jain,R.
K.,Cancer Res.47:3039(1987))。薬物の投与量を増加さ
せることで補う従来の試みは、非腫瘍構造における広い
非特異的結合と全身的な毒性副作用という問題を生じ
た。
【０００３】従来の化合物では（ａ）モノクローナル抗
体又は腫瘍結合タンパク質パートナーの特異性および
（ｂ）酵素の触媒増幅潜在能力を利用しようとしてい
た。このような抗体‐酵素複合体は患者に投与され、し
ばらくしてから腫瘍と結合する。その後で、複合体の酵
素部分により開裂されて細胞毒性薬物を生じる無毒性プ
ロドラッグが患者に投与される。理論上、腫瘍に結合し
た分子の酵素部分は、腫瘍の近くでプロドラッグを腫瘍
に対して細胞毒性である薬物に変換させる。しかしなが
ら実際には、このような化合物はいくつかの欠点をも
つ。
体又は腫瘍結合タンパク質パートナーの特異性および
（ｂ）酵素の触媒増幅潜在能力を利用しようとしてい
た。このような抗体‐酵素複合体は患者に投与され、し
ばらくしてから腫瘍と結合する。その後で、複合体の酵
素部分により開裂されて細胞毒性薬物を生じる無毒性プ
ロドラッグが患者に投与される。理論上、腫瘍に結合し
た分子の酵素部分は、腫瘍の近くでプロドラッグを腫瘍
に対して細胞毒性である薬物に変換させる。しかしなが
ら実際には、このような化合物はいくつかの欠点をも
つ。
【０００４】第一に、このような抗体‐酵素複合体は、
それらがたいていマウス抗体および異種酵素から構成さ
れる化学複合体を表すために、ヒトにおいては高度に免
疫原性である。したがって、同一患者における同一抗体
‐酵素複合体の反復使用は有効でない(Bagshawe et a
l.,Disease Markers,9:233(1991)) 。
それらがたいていマウス抗体および異種酵素から構成さ
れる化学複合体を表すために、ヒトにおいては高度に免
疫原性である。したがって、同一患者における同一抗体
‐酵素複合体の反復使用は有効でない(Bagshawe et a
l.,Disease Markers,9:233(1991)) 。
【０００５】第二に、複合体は血漿から比較的ゆっくり
と除去され、そのため選択的で効果的なプロドラッグ活
性化は例えば半減期を短くして酵素活性を遮断する試薬
としてガラクトシル化抗酵素モノクローナル抗体（“ｍ
Ａｂ”）を注射した後にのみ可能である(Sharma et a
l.,Brit.J.Cancer 61:659,1990) 。
と除去され、そのため選択的で効果的なプロドラッグ活
性化は例えば半減期を短くして酵素活性を遮断する試薬
としてガラクトシル化抗酵素モノクローナル抗体（“ｍ
Ａｂ”）を注射した後にのみ可能である(Sharma et a
l.,Brit.J.Cancer 61:659,1990) 。
【０００６】異種抗体‐酵素複合体の免疫原性の上記問
題は、純粋にヒト成分から構成される組換え融合タンパ
ク質を用いることにより大部分は解決される。このよう
な融合タンパク質の作製に関する詳細は、参考のため全
体として本明細書の開示の一部とされる欧州特許出願第
ＥＰ‐Ａ‐５０１，２１５号明細書に記載されている。
その公開文献では例えば一般式ｈｕｔｕＭａｂ‐Ｌ‐β
‐ｇｌｕｃのタンパク質が記載されている（ここでｈｕ
ｔｕＭａｂはヒト化もしくはヒト腫瘍特異的モノクロー
ナル抗体、または腫瘍となおも結合しうるその一部であ
り、Ｌはリンカー分子を表し、β‐ｇｌｕｃはヒトβ‐
グルクロニダーゼを表す）。
題は、純粋にヒト成分から構成される組換え融合タンパ
ク質を用いることにより大部分は解決される。このよう
な融合タンパク質の作製に関する詳細は、参考のため全
体として本明細書の開示の一部とされる欧州特許出願第
ＥＰ‐Ａ‐５０１，２１５号明細書に記載されている。
その公開文献では例えば一般式ｈｕｔｕＭａｂ‐Ｌ‐β
‐ｇｌｕｃのタンパク質が記載されている（ここでｈｕ
ｔｕＭａｂはヒト化もしくはヒト腫瘍特異的モノクロー
ナル抗体、または腫瘍となおも結合しうるその一部であ
り、Ｌはリンカー分子を表し、β‐ｇｌｕｃはヒトβ‐
グルクロニダーゼを表す）。
【０００７】しかしながら、上記タイプの融合タンパク
質に関して薬理試験を行った結果、ヒト腫瘍担持ヌード
マウスへの融合タンパク質の静脈注射後に非常に短い時
間（１〜３分間）であっても、かなりの量のタンパク質
が血管に近い領域（易接近部位＝ＥＡＳ）で腫瘍細胞と
結合していることが意外にもわかった。更に、これらの
初期の時間において、多量の融合タンパク質がなおも血
漿中に存在しており、そのため腫瘍内における適切なプ
ロドラッグの選択的で効果的な活性化は注射後のこの初
期時点で不可能であった。
質に関して薬理試験を行った結果、ヒト腫瘍担持ヌード
マウスへの融合タンパク質の静脈注射後に非常に短い時
間（１〜３分間）であっても、かなりの量のタンパク質
が血管に近い領域（易接近部位＝ＥＡＳ）で腫瘍細胞と
結合していることが意外にもわかった。更に、これらの
初期の時間において、多量の融合タンパク質がなおも血
漿中に存在しており、そのため腫瘍内における適切なプ
ロドラッグの選択的で効果的な活性化は注射後のこの初
期時点で不可能であった。
【０００８】本発明者らは、比較的少量の分子が腫瘍に
選択的に局在化するときであっても治療効果を発揮する
ことを可能にする、前記問題に対する解決法を開発し
た。これらの解決法は以下に記載されている。
選択的に局在化するときであっても治療効果を発揮する
ことを可能にする、前記問題に対する解決法を開発し
た。これらの解決法は以下に記載されている。
【０００９】
【発明の概要】本発明では、第一治療段階において、二
機能性糖タンパク質または二機能性糖タンパク質複合体
を含む化合物を腫瘍患者に静脈内（ｉ．ｖ．）投与する
が、その化合物は酵素活性を有する第一部分と、腫瘍特
異性抗原と優先的に結合する第二部分と、そして炭水化
物補完体とを含んでなる。この化合物の炭水化物補完体
はマンノース、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグルコサミ
ン、ラクトース、およびフコースからなる群より選択さ
れる少くとも１つの露出炭水化物（exposed carbohydra
te）残基を含み、その露出残基は前記化合物の有利な結
合性および浄化特性に関与している。第一部分の酵素活
性は、化合物の投与と同時にまたはその後に被治療体に
投与された無毒性薬物を、腫瘍細胞に対して細胞毒性で
ある形に開裂する。ここで、修飾炭水化物補完体等とい
う用語はマンノース、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグル
コサミン、ラクトースおよびフコースからなる群より選
択される少くとも１つの露出炭水化物残基を含んだ糖タ
ンパク質の炭水化物補完体を表すために用いられる。
機能性糖タンパク質または二機能性糖タンパク質複合体
を含む化合物を腫瘍患者に静脈内（ｉ．ｖ．）投与する
が、その化合物は酵素活性を有する第一部分と、腫瘍特
異性抗原と優先的に結合する第二部分と、そして炭水化
物補完体とを含んでなる。この化合物の炭水化物補完体
はマンノース、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグルコサミ
ン、ラクトース、およびフコースからなる群より選択さ
れる少くとも１つの露出炭水化物（exposed carbohydra
te）残基を含み、その露出残基は前記化合物の有利な結
合性および浄化特性に関与している。第一部分の酵素活
性は、化合物の投与と同時にまたはその後に被治療体に
投与された無毒性薬物を、腫瘍細胞に対して細胞毒性で
ある形に開裂する。ここで、修飾炭水化物補完体等とい
う用語はマンノース、ガラクトース、Ｎ‐アセチルグル
コサミン、ラクトースおよびフコースからなる群より選
択される少くとも１つの露出炭水化物残基を含んだ糖タ
ンパク質の炭水化物補完体を表すために用いられる。
【００１０】このため、本発明の一面においては、腫瘍
標的設定化部分、酵素部分、および修飾炭水化物補完体
を含有した二機能性融合糖タンパク質（bifunctional f
usion glycoprotein: ＦＵＰ）が提供される。修飾炭水
化物補完体は腫瘍に結合するＦＵＰの相対的濃度の増加
と、全身循環矛および非特異的結合部位からのＦＵＰの
浄化増強に寄与する。ＦＵＰの酵素部分は無毒性薬物を
腫瘍細胞毒性薬物に開裂することができる。
標的設定化部分、酵素部分、および修飾炭水化物補完体
を含有した二機能性融合糖タンパク質（bifunctional f
usion glycoprotein: ＦＵＰ）が提供される。修飾炭水
化物補完体は腫瘍に結合するＦＵＰの相対的濃度の増加
と、全身循環矛および非特異的結合部位からのＦＵＰの
浄化増強に寄与する。ＦＵＰの酵素部分は無毒性薬物を
腫瘍細胞毒性薬物に開裂することができる。
【００１１】本発明のもう１つの面では、コロニー選
択、組換えＤＮＡおよびトランスジェニック動物技術と
化学または酵素反応により、修飾炭水化物補完体を有す
るＦＵＰを作製するための方法が提供される。
択、組換えＤＮＡおよびトランスジェニック動物技術と
化学または酵素反応により、修飾炭水化物補完体を有す
るＦＵＰを作製するための方法が提供される。
【００１２】本発明の更にもう１つの面では、抗体部分
が腫瘍特異性抗原上のエピトープに向けられ、酵素が無
毒性薬物を腫瘍細胞毒性薬物に変換する能力を有する、
修飾炭水化物補完体を有した、二機能性抗体‐酵素複合
体（bifunctional antibody-enzyme conjugate: ＡＥ
Ｃ）が提供される。
が腫瘍特異性抗原上のエピトープに向けられ、酵素が無
毒性薬物を腫瘍細胞毒性薬物に変換する能力を有する、
修飾炭水化物補完体を有した、二機能性抗体‐酵素複合
体（bifunctional antibody-enzyme conjugate: ＡＥ
Ｃ）が提供される。
【００１３】本発明の更に別の面では、ＡＥＣの炭水化
物補完体を適切に修飾するための方法が提供される。
物補完体を適切に修飾するための方法が提供される。
【００１４】本発明のもう１つの面では、有効量の前記
炭水化物修飾ＦＵＰまたはＡＥＣを与える医薬製剤を患
者に投与し、酵素により腫瘍細胞毒性薬物に開裂される
無毒性薬物の有効量を同時にまたはその後で患者に投与
することからなる、固形腫瘍を有する患者を腫瘍細胞毒
性薬物で治療する方法が提供される。本発明のこれらお
よび他の面は発明の説明および添付された特許請求の範
囲を参考にすると容易に明らかになるであろう。
炭水化物修飾ＦＵＰまたはＡＥＣを与える医薬製剤を患
者に投与し、酵素により腫瘍細胞毒性薬物に開裂される
無毒性薬物の有効量を同時にまたはその後で患者に投与
することからなる、固形腫瘍を有する患者を腫瘍細胞毒
性薬物で治療する方法が提供される。本発明のこれらお
よび他の面は発明の説明および添付された特許請求の範
囲を参考にすると容易に明らかになるであろう。
【００１５】図面の詳細な説明 図１はＶH およびＶL 遺伝子の増幅について示したもの
である。自己のシグナル配列を含んだＶH 遺伝子はオリ
ゴヌクレオチドｐＡＢ‐バック(Back)およびリンカー‐
アンチ（表１）を用いてｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈ
ｕｍＶH から増幅される(Gussow et al.,Meth.Enzymolo
gy,203:99(1991))。ＶL 遺伝子はオリゴヌクレオチドリ
ンカー‐センスおよびＶL-(Mut) ‐フォア(For) （表
２）を用いてｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈｕｍＶL か
ら増幅される。
である。自己のシグナル配列を含んだＶH 遺伝子はオリ
ゴヌクレオチドｐＡＢ‐バック(Back)およびリンカー‐
アンチ（表１）を用いてｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈ
ｕｍＶH から増幅される(Gussow et al.,Meth.Enzymolo
gy,203:99(1991))。ＶL 遺伝子はオリゴヌクレオチドリ
ンカー‐センスおよびＶL-(Mut) ‐フォア(For) （表
２）を用いてｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈｕｍＶL か
ら増幅される。
【００１６】図２はリンカーでＶL 遺伝子に連結された
ＶH から構成されるＰＣＲ断片について示したものであ
る。
ＶH から構成されるＰＣＲ断片について示したものであ
る。
【００１７】図３はベクターを作製するためにプラスミ
ドｐＡＢ４３１ＶＨからのＨｉｎｄIII 〜ＢｇｌII制限
断片の除去について示したものである。
ドｐＡＢ４３１ＶＨからのＨｉｎｄIII 〜ＢｇｌII制限
断片の除去について示したものである。
【００１８】図４は、クローンがヒト化ｓＦｖ４３１／
２６、ヒンジエクソンおよび完全β‐グルクロニダーゼ
を含み、クローンがＢＨＫ細胞中にトランスフェクトさ
れるプラスミドｐＭＣＧ‐Ｅ１を作製するための、図３
のベクター中への図２のＰＣＲ断片の挿入について示し
たものである。
２６、ヒンジエクソンおよび完全β‐グルクロニダーゼ
を含み、クローンがＢＨＫ細胞中にトランスフェクトさ
れるプラスミドｐＭＣＧ‐Ｅ１を作製するための、図３
のベクター中への図２のＰＣＲ断片の挿入について示し
たものである。
【００１９】図５はトランスフェクトされたＢＨＫ細胞
中にネオマイシン耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＲＭＨ
１４０について示したものである。
中にネオマイシン耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＲＭＨ
１４０について示したものである。
【００２０】図６はトランスフェクトされたＢＨＫ細胞
中にメトトレキセート耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＳ
Ｖ２について示したものである。
中にメトトレキセート耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＳ
Ｖ２について示したものである。
【００２１】図７はＰＣＲ増幅過程について示したもの
である。ｓＦｖ４３１／２６断片（ａ）はオリゴｐＡＢ
‐バック（表２）およびｓＦｖ‐フォア（表５）を用い
るＰＣＲのための鋳型として用いられる。その結果とし
て、新たに形成されたｓＦｖ４３１／２６断片（ｂ）の
３’末端にＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII 開裂部位が導入
される。ＰＣＲ断片は精製され、ＨｉｎｄIII で切断さ
れ、しかる後ＨｉｎｄIII で切断されかつアルカリホス
ファターゼで処理されたｐＵＣ１８ベクターに結合され
る。ＢｇｌII開裂部位のあるｓＦｖ断片を含有したプラ
スミドクローンｐＫＢＯ１が単離される。
である。ｓＦｖ４３１／２６断片（ａ）はオリゴｐＡＢ
‐バック（表２）およびｓＦｖ‐フォア（表５）を用い
るＰＣＲのための鋳型として用いられる。その結果とし
て、新たに形成されたｓＦｖ４３１／２６断片（ｂ）の
３’末端にＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII 開裂部位が導入
される。ＰＣＲ断片は精製され、ＨｉｎｄIII で切断さ
れ、しかる後ＨｉｎｄIII で切断されかつアルカリホス
ファターゼで処理されたｐＵＣ１８ベクターに結合され
る。ＢｇｌII開裂部位のあるｓＦｖ断片を含有したプラ
スミドクローンｐＫＢＯ１が単離される。
【００２２】図８はオリゴ大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐バック
１（表６）および大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐フォア（表７）
を用いたＰＣＲによるベクターｐＲＡＪ２７５由来の大
腸菌β‐グルクロニダーゼについてコードする遺伝子の
増幅について示したものであり、同時にＢｇｌII開裂部
位、ＸｂａＩ開裂部位および５’末端でリンカーについ
てコードする配列が与えられる。得られた断片は精製さ
れ、ＢｇｌII／ＸｂａＩで切断され、しかる後同様にＢ
ｇｌII／ＸｂａＩで切断されたベクターｐＫＢＯ１に組
み込んでクローニングされる。リンカー配列で大腸菌β
‐グルクロニダーゼに結合されたｓＦｖ４３１／２６を
含んだプラスミドクローンｐＫＢＯ２が単離される。
１（表６）および大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐フォア（表７）
を用いたＰＣＲによるベクターｐＲＡＪ２７５由来の大
腸菌β‐グルクロニダーゼについてコードする遺伝子の
増幅について示したものであり、同時にＢｇｌII開裂部
位、ＸｂａＩ開裂部位および５’末端でリンカーについ
てコードする配列が与えられる。得られた断片は精製さ
れ、ＢｇｌII／ＸｂａＩで切断され、しかる後同様にＢ
ｇｌII／ＸｂａＩで切断されたベクターｐＫＢＯ１に組
み込んでクローニングされる。リンカー配列で大腸菌β
‐グルクロニダーゼに結合されたｓＦｖ４３１／２６を
含んだプラスミドクローンｐＫＢＯ２が単離される。
【００２３】図９はＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩで切断する
ことによりベクターｐＫＢＯ２から得られ、精製され、
しかる後同様にＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩで切断された発
現ベクターｐＡＢｓｔｏｐ中に結合された、ｓＦｖ‐大
腸菌β‐ｇｌｕｃ断片について示したものである。ヒト
化ｓＦｖ４３１／２６、リンカーおよび完全大腸菌β‐
グルクロニダーゼを含んだプラスミドクローンｐＫＢＯ
３が単離される。
ことによりベクターｐＫＢＯ２から得られ、精製され、
しかる後同様にＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩで切断された発
現ベクターｐＡＢｓｔｏｐ中に結合された、ｓＦｖ‐大
腸菌β‐ｇｌｕｃ断片について示したものである。ヒト
化ｓＦｖ４３１／２６、リンカーおよび完全大腸菌β‐
グルクロニダーゼを含んだプラスミドクローンｐＫＢＯ
３が単離される。
【００２４】
【発明の具体的説明】被治療体における固形腫瘍は本発
明の炭水化物補完体修飾ＦＵＰまたはＡＥＣを投与する
ことにより細胞毒性薬物でインビボ上有効に治療され、
しかも非腫瘍組織に対する細胞毒性薬物の有害作用がな
いかまたは少ないことが見出された。ＦＵＰの標的設定
化部分またはＡＥＣの標的設定化抗体は融合糖タンパク
質または糖タンパク質複合体を腫瘍細胞中または上の特
異的部位に向かわせ、ＦＵＰまたはＡＥＣの酵素部分は
プロドラッグを腫瘍細胞毒性薬物に開裂することができ
る。上記のように、修飾炭水化物補完体は腫瘍部位にお
けるＦＵＰまたはＡＥＣの相対濃度を高め、しかも非特
異性部位および全身循環系からのこれらタンパク質の浄
化を進める。
明の炭水化物補完体修飾ＦＵＰまたはＡＥＣを投与する
ことにより細胞毒性薬物でインビボ上有効に治療され、
しかも非腫瘍組織に対する細胞毒性薬物の有害作用がな
いかまたは少ないことが見出された。ＦＵＰの標的設定
化部分またはＡＥＣの標的設定化抗体は融合糖タンパク
質または糖タンパク質複合体を腫瘍細胞中または上の特
異的部位に向かわせ、ＦＵＰまたはＡＥＣの酵素部分は
プロドラッグを腫瘍細胞毒性薬物に開裂することができ
る。上記のように、修飾炭水化物補完体は腫瘍部位にお
けるＦＵＰまたはＡＥＣの相対濃度を高め、しかも非特
異性部位および全身循環系からのこれらタンパク質の浄
化を進める。
【００２５】ＦＵＰまたはＡＥＣが血漿および正常組織
から実質上浄化されると、腫瘍に結合されているうち
に、無毒性であって細胞外に散在する親水性プロドラッ
グが第二段階において適当な（例えば、高い）濃度で静
脈投与される。次いでプロドラッグは腫瘍上で細胞外に
選択的に局在化されたＦＵＰまたはＡＥＣにより開裂さ
れて、腫瘍細胞毒性疎水性薬物を生じる。
から実質上浄化されると、腫瘍に結合されているうち
に、無毒性であって細胞外に散在する親水性プロドラッ
グが第二段階において適当な（例えば、高い）濃度で静
脈投与される。次いでプロドラッグは腫瘍上で細胞外に
選択的に局在化されたＦＵＰまたはＡＥＣにより開裂さ
れて、腫瘍細胞毒性疎水性薬物を生じる。
【００２６】糖タンパク質は、Ｏ‐グリコシド結合によ
りセリンまたはトレオニンの側鎖酸素原子を通じて、あ
るいはＮ‐グリコシド結合によりアスパラギン残基の側
鎖窒素に対して、タンパク質鎖に結合されたオリゴ糖単
位から構成される。糖タンパク質のオリゴ糖単位の全体
は炭水化物補完体と称される。Ｎ‐結合オリゴ糖は、下
記式Ｉ（高マンノースタイプ）で示されるように、３つ
のマンノース（ＭＡＮ）および２つのＮ‐アセチルグル
コサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる共通五糖コアを
含有する。
りセリンまたはトレオニンの側鎖酸素原子を通じて、あ
るいはＮ‐グリコシド結合によりアスパラギン残基の側
鎖窒素に対して、タンパク質鎖に結合されたオリゴ糖単
位から構成される。糖タンパク質のオリゴ糖単位の全体
は炭水化物補完体と称される。Ｎ‐結合オリゴ糖は、下
記式Ｉ（高マンノースタイプ）で示されるように、３つ
のマンノース（ＭＡＮ）および２つのＮ‐アセチルグル
コサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基からなる共通五糖コアを
含有する。
【００２７】
【化１】
【００２８】複合タイプのオリゴ糖コアは式IIで示さ
れ、そこでは末端炭水化物としてＮ‐アセチルノイラミ
ン酸（シアル酸、ＳＩＡ）残基、側鎖としてフコース
（ＦＵＣ）残基および末端から２番目の糖としてガラク
トース（Ｇａｌ）残基を示している。
れ、そこでは末端炭水化物としてＮ‐アセチルノイラミ
ン酸（シアル酸、ＳＩＡ）残基、側鎖としてフコース
（ＦＵＣ）残基および末端から２番目の糖としてガラク
トース（Ｇａｌ）残基を示している。
【００２９】
【化２】
【００３０】追加される糖は非常に多様なオリゴ糖パタ
ーンを形成するために多くの異なる方法でこの共通コア
に結合される。糖タンパク質における末端糖の性質は、
器官、マクロファージおよび他の組織による糖タンパク
質の取込みに特に影響を与えることが知られた複合認識
系の一部である（例えば、Steer et al.,Prog.LiverDi
s.,8:99(1986);Stahl,Curr.Opin.Immunol.,4:49(1992);
Brady et al.,J.Inherit.Metab.Dis.,in press(1994)を
参照）。これらの影響は高度に組織および糖タンパク質
特異的であり、特異的組織による特定の循環糖タンパク
質の浄化増加パターンを予想することは演繹的には知ら
れていなかった。
ーンを形成するために多くの異なる方法でこの共通コア
に結合される。糖タンパク質における末端糖の性質は、
器官、マクロファージおよび他の組織による糖タンパク
質の取込みに特に影響を与えることが知られた複合認識
系の一部である（例えば、Steer et al.,Prog.LiverDi
s.,8:99(1986);Stahl,Curr.Opin.Immunol.,4:49(1992);
Brady et al.,J.Inherit.Metab.Dis.,in press(1994)を
参照）。これらの影響は高度に組織および糖タンパク質
特異的であり、特異的組織による特定の循環糖タンパク
質の浄化増加パターンを予想することは演繹的には知ら
れていなかった。
【００３１】ＦＵＰをガラクトシル化することによりま
たはタンパク質をノイラミニダーゼで処理してそれから
末端ノイラミン酸残基を除去することにより、血漿中に
おけるＦＵＰの半減期は短縮される。こうして修飾され
た融合タンパク質は初期であってもその特異性、親和性
および酵素活性を維持しながらＥＡＳに結合し続けるこ
とが意外にもわかった。更に、融合タンパク質は、Shar
ma et al.,Brit.J.Cancer 61:659(1990)のように浄化性
第二抗体を注射する必要性なしに、適切なプロドラッグ
の効果的な腫瘍選択性活性化が有効に可能になるような
程度まで１〜３時間以内で血漿から浄化される。加え
て、本発明者らは例えばガラクトースをガラクトシル化
ＦＵＰと混ぜることで更に一層有効な腫瘍局在化を実現
することに成功した。生物学的性質を保存しながらガラ
クトシル化されまたはノイラミニダーゼで処理されたさ
らなるＦＵＰおよびＡＥＣにまで、本発明の範囲内にお
いて、これらの観察を広げることが首尾よく可能であっ
た。
たはタンパク質をノイラミニダーゼで処理してそれから
末端ノイラミン酸残基を除去することにより、血漿中に
おけるＦＵＰの半減期は短縮される。こうして修飾され
た融合タンパク質は初期であってもその特異性、親和性
および酵素活性を維持しながらＥＡＳに結合し続けるこ
とが意外にもわかった。更に、融合タンパク質は、Shar
ma et al.,Brit.J.Cancer 61:659(1990)のように浄化性
第二抗体を注射する必要性なしに、適切なプロドラッグ
の効果的な腫瘍選択性活性化が有効に可能になるような
程度まで１〜３時間以内で血漿から浄化される。加え
て、本発明者らは例えばガラクトースをガラクトシル化
ＦＵＰと混ぜることで更に一層有効な腫瘍局在化を実現
することに成功した。生物学的性質を保存しながらガラ
クトシル化されまたはノイラミニダーゼで処理されたさ
らなるＦＵＰおよびＡＥＣにまで、本発明の範囲内にお
いて、これらの観察を広げることが首尾よく可能であっ
た。
【００３２】本発明の一般的利用性は４つの異なる化学
組成物、即ち異種抗体‐酵素複合体、ヒト化二本鎖融合
タンパク質、ヒト化一本鎖融合タンパク質および異種一
本鎖融合タンパク質を用いて立証され、抗体断片‐酵素
複合体とｓＦｖ‐酵素複合体Ｉおよびリガンド‐酵素複
合体にも拡大する。
組成物、即ち異種抗体‐酵素複合体、ヒト化二本鎖融合
タンパク質、ヒト化一本鎖融合タンパク質および異種一
本鎖融合タンパク質を用いて立証され、抗体断片‐酵素
複合体とｓＦｖ‐酵素複合体Ｉおよびリガンド‐酵素複
合体にも拡大する。
【００３３】代表的なＡＥＣは、参考のため全体として
本明細書の開示の一部とされるHaismaら(Brit.J.Cancer
66:474(1992))またはWangら(Cancer Res.52:4484(199
2))に従いヘテロ二機能性試薬によって大腸菌グルクロ
ニダーゼ酵素と化学的に結合されたもとのままのモノク
ローナルマウス抗体（例えば、参考のため全体として本
明細書の開示の一部とされるＥＰ‐Ａ‐３８８，９１４
に記載されている）から構成される。同様に機能性ＡＥ
Ｃにすることができる他の結合可能性は、参考のため本
明細書の開示の一部とされるMeans らBioconjugate Che
m.1:2(1990) に要約されている。
本明細書の開示の一部とされるHaismaら(Brit.J.Cancer
66:474(1992))またはWangら(Cancer Res.52:4484(199
2))に従いヘテロ二機能性試薬によって大腸菌グルクロ
ニダーゼ酵素と化学的に結合されたもとのままのモノク
ローナルマウス抗体（例えば、参考のため全体として本
明細書の開示の一部とされるＥＰ‐Ａ‐３８８，９１４
に記載されている）から構成される。同様に機能性ＡＥ
Ｃにすることができる他の結合可能性は、参考のため本
明細書の開示の一部とされるMeans らBioconjugate Che
m.1:2(1990) に要約されている。
【００３４】ヒト化二本鎖融合タンパク質はＥＰ‐Ａ‐
５０１，２１５に詳細に記載されている。それは、２本
のポリペプチド鎖から構成され、遺伝子操作により作製
されたタンパク質である。１本の鎖はヒト化ＶH ＣH1ヒ
ンジＳ領域についてコードするヌクレオチド配列をヒト
β‐グルクロニダーゼについてコードするヌクレオチド
配列と結合させることにより作製された（Ｓ＝ポリペプ
チドスペーサーについてコードするオリゴヌクレオチ
ド）。適切な発現系、好ましくはＢＨＫまたはＣＨＯ細
胞、でトランスフェクションおよび発現後に、ヒト化Ｖ
L ＣL 鎖についてコードするヌクレオチド配列は上記ヌ
クレオチド配列と一緒になってヒト化二本鎖融合タンパ
ク質を産生する。
５０１，２１５に詳細に記載されている。それは、２本
のポリペプチド鎖から構成され、遺伝子操作により作製
されたタンパク質である。１本の鎖はヒト化ＶH ＣH1ヒ
ンジＳ領域についてコードするヌクレオチド配列をヒト
β‐グルクロニダーゼについてコードするヌクレオチド
配列と結合させることにより作製された（Ｓ＝ポリペプ
チドスペーサーについてコードするオリゴヌクレオチ
ド）。適切な発現系、好ましくはＢＨＫまたはＣＨＯ細
胞、でトランスフェクションおよび発現後に、ヒト化Ｖ
L ＣL 鎖についてコードするヌクレオチド配列は上記ヌ
クレオチド配列と一緒になってヒト化二本鎖融合タンパ
ク質を産生する。
【００３５】ヒト化一本鎖融合タンパク質は、ヒト化Ｖ
H ＳＶL ヒンジＳ領域（一本鎖Ｆｖ、ｓＦｖ）について
コードするヌクレオチド配列をヒトβ‐グルクロニダー
ゼについてコードするヌクレオチド配列と結合すること
により、適切な発現系、好ましくはＢＨＫまたはＣＨＯ
細胞で発現後に産生された。代表的なヒト化一本鎖融合
タンパク質の構築は下記実施例１〜４に記載されてい
る。異種一本鎖融合タンパク質は下記実施例５に記載さ
れている。
H ＳＶL ヒンジＳ領域（一本鎖Ｆｖ、ｓＦｖ）について
コードするヌクレオチド配列をヒトβ‐グルクロニダー
ゼについてコードするヌクレオチド配列と結合すること
により、適切な発現系、好ましくはＢＨＫまたはＣＨＯ
細胞で発現後に産生された。代表的なヒト化一本鎖融合
タンパク質の構築は下記実施例１〜４に記載されてい
る。異種一本鎖融合タンパク質は下記実施例５に記載さ
れている。
【００３６】適切なベクターに組み込んで再クローニン
グした後、下記実施例に記載された構築物は例えば大腸
菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev
isiae)およびハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula pol
ymorpha)、昆虫細胞またはトランスジェニック動物のよ
うな他の発現系でも発現させることができる。非ヒトト
ランスジェニック哺乳動物は乳、血液および尿のような
容易に入手しうる体液中に、腫瘍担持ヒトを治療する上
で適した量および形で本発明の組換えヒト炭水化物修飾
ＦＵＰを分泌するように遺伝子工学的に処理できる。
グした後、下記実施例に記載された構築物は例えば大腸
菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerev
isiae)およびハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula pol
ymorpha)、昆虫細胞またはトランスジェニック動物のよ
うな他の発現系でも発現させることができる。非ヒトト
ランスジェニック哺乳動物は乳、血液および尿のような
容易に入手しうる体液中に、腫瘍担持ヒトを治療する上
で適した量および形で本発明の組換えヒト炭水化物修飾
ＦＵＰを分泌するように遺伝子工学的に処理できる。
【００３７】ここで「動物」という用語はヒトを除くす
べての哺乳動物について表す。それには胚および胎児段
階を含めた発育の全段階における個々の動物も含む。
「トランスジェニック」動物とは、マイクロインジェク
ションまたは組換えウイルス感染によるような、細胞下
レベルでの意図的遺伝子操作により、直接的または間接
的に受容された遺伝情報を保有する細胞を含有したあら
ゆる動物のことである。
べての哺乳動物について表す。それには胚および胎児段
階を含めた発育の全段階における個々の動物も含む。
「トランスジェニック」動物とは、マイクロインジェク
ションまたは組換えウイルス感染によるような、細胞下
レベルでの意図的遺伝子操作により、直接的または間接
的に受容された遺伝情報を保有する細胞を含有したあら
ゆる動物のことである。
【００３８】本関係における「トランスジェニック」と
は古典的雑種形成またはインビトロ受精を包含せず、む
しろ１以上の細胞が組換えＤＮＡ分子を受容した動物を
表す。この分子は動物の染色体内に組み込まれることが
より好ましいが、本発明では工学的処理で酵母人工染色
体中に組み込まれるような染色体外複製ＤＮＡ配列の使
用についても考慮される。
は古典的雑種形成またはインビトロ受精を包含せず、む
しろ１以上の細胞が組換えＤＮＡ分子を受容した動物を
表す。この分子は動物の染色体内に組み込まれることが
より好ましいが、本発明では工学的処理で酵母人工染色
体中に組み込まれるような染色体外複製ＤＮＡ配列の使
用についても考慮される。
【００３９】「生殖細胞系トランスジェニック動物」と
いう用語は、遺伝情報が取り込まれて生殖系細胞中に組
み込まれ、こうして情報を子孫に伝える能力を付与する
トランスジェニック動物に関する。このような子孫が実
際にその情報の一部または全部を有しているならば、そ
れらもトランスジェニック動物である。動物中に導入さ
れる情報はレシピエントが属する動物の種類に対して外
来（即ち、「異種」）であることが好ましいが、情報は
具体的な個々のレシピエントにとってのみ外来であって
も、または遺伝情報は既にレシピエントにより保有され
ていてもよい。最後の場合において、導入された遺伝子
は天然遺伝子の場合とは異ってされるかもしれない。
いう用語は、遺伝情報が取り込まれて生殖系細胞中に組
み込まれ、こうして情報を子孫に伝える能力を付与する
トランスジェニック動物に関する。このような子孫が実
際にその情報の一部または全部を有しているならば、そ
れらもトランスジェニック動物である。動物中に導入さ
れる情報はレシピエントが属する動物の種類に対して外
来（即ち、「異種」）であることが好ましいが、情報は
具体的な個々のレシピエントにとってのみ外来であって
も、または遺伝情報は既にレシピエントにより保有され
ていてもよい。最後の場合において、導入された遺伝子
は天然遺伝子の場合とは異ってされるかもしれない。
【００４０】本発明のトランスジェニック動物は乳、血
清および尿を生じるヒト以外のいずれであってもよい。
家畜動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ
等）、げっ歯動物（例えば、マウス）および家庭ペット
（例えば、ネコおよびイヌ）も本発明の範囲内に含まれ
る。本発明のトランスジェニック動物は、本発明のＦＵ
Ｐについてコードする適切なポリヌクレオチドを、これ
らのポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系細胞のＤＮＡ
中に安定的に組み込まれて正常なメンデルの法則で遺伝
されるように、単一の細胞胚中に導入することで産生さ
れることがより好ましい。胚マイクロマニピュレーショ
ン技術の進歩により、現在では異種ＤＮＡを受精哺乳動
物卵中に導入することができる。例えば、全能性または
多能性幹細胞はマイクロインジェクション、リン酸カル
シウムによる沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感
染または他の手段により形質転換でき、しかる後形質転
換された細胞は胚の中に導入されて、胚はトランスジェ
ニック動物に成長していく。
清および尿を生じるヒト以外のいずれであってもよい。
家畜動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ
等）、げっ歯動物（例えば、マウス）および家庭ペット
（例えば、ネコおよびイヌ）も本発明の範囲内に含まれ
る。本発明のトランスジェニック動物は、本発明のＦＵ
Ｐについてコードする適切なポリヌクレオチドを、これ
らのポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系細胞のＤＮＡ
中に安定的に組み込まれて正常なメンデルの法則で遺伝
されるように、単一の細胞胚中に導入することで産生さ
れることがより好ましい。胚マイクロマニピュレーショ
ン技術の進歩により、現在では異種ＤＮＡを受精哺乳動
物卵中に導入することができる。例えば、全能性または
多能性幹細胞はマイクロインジェクション、リン酸カル
シウムによる沈殿、リポソーム融合、レトロウイルス感
染または他の手段により形質転換でき、しかる後形質転
換された細胞は胚の中に導入されて、胚はトランスジェ
ニック動物に成長していく。
【００４１】好ましい方法において、成長中の胚は望ま
しいＤＮＡを含んだレトロウイルスで感染され、トラン
スジェニック動物はその感染胚から生じてくる。しかし
ながら、最も好ましい方法では、適切なＤＮＡが好まし
くは単一細胞段階で胚の前核または細胞質中に同時注入
され、その胚が成熟トランスジェニック動物に成長して
いく。それらの技術も公知である。例えば、哺乳動物受
精卵中への異種ＤＮＡのマイクロインジェクションに関
する標準的実験室操作の総説にはHogan et al.,Manipul
ating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Press,19
86;Krimpenfortet al.,Bio/Technology 9:(1991);Palmi
ter et al.,Cell,41:343(1985);Kraemer et al.,Geneti
c Manipulation of the Early Mammalian Embryo,Cold
SpringHarbor Laboratory Press,1985;Hammer et al.,N
ature,315:680(1985);Meade らの米国特許第４，８７
３，３１６号；Wagnerらの米国特許第５，１７５，３８
５号；Krimpenfort らの米国特許第５，１７５，３８４
号があり、それらはすべて参考のため本明細書の開示の
一部とされる。例えば乳腺におけるβ‐カゼインプロモ
ーターのコントロール下で融合タンパク質を発現するト
ランスジェニックヤギを用いたMeade らの米国特許第
４，８７３，３１６号の操作は１つの有利な産生方法を
提供すると考えられる。
しいＤＮＡを含んだレトロウイルスで感染され、トラン
スジェニック動物はその感染胚から生じてくる。しかし
ながら、最も好ましい方法では、適切なＤＮＡが好まし
くは単一細胞段階で胚の前核または細胞質中に同時注入
され、その胚が成熟トランスジェニック動物に成長して
いく。それらの技術も公知である。例えば、哺乳動物受
精卵中への異種ＤＮＡのマイクロインジェクションに関
する標準的実験室操作の総説にはHogan et al.,Manipul
ating the Mouse Embryo,Cold Spring Harbor Press,19
86;Krimpenfortet al.,Bio/Technology 9:(1991);Palmi
ter et al.,Cell,41:343(1985);Kraemer et al.,Geneti
c Manipulation of the Early Mammalian Embryo,Cold
SpringHarbor Laboratory Press,1985;Hammer et al.,N
ature,315:680(1985);Meade らの米国特許第４，８７
３，３１６号；Wagnerらの米国特許第５，１７５，３８
５号；Krimpenfort らの米国特許第５，１７５，３８４
号があり、それらはすべて参考のため本明細書の開示の
一部とされる。例えば乳腺におけるβ‐カゼインプロモ
ーターのコントロール下で融合タンパク質を発現するト
ランスジェニックヤギを用いたMeade らの米国特許第
４，８７３，３１６号の操作は１つの有利な産生方法を
提供すると考えられる。
【００４２】本発明のＦＵＰを産生するようなトランス
ジェニック動物のゲノム中への挿入のための遺伝子は、
上記で本明細書の開示の一部とされる参考文献および下
記例に記載されたようにして得ることができる。ヒト化
二本鎖融合糖タンパク質についてコードする遺伝子はＥ
Ｐ‐Ａ‐５０１，２１５明細書に記載されている。代表
的な一本鎖融合糖タンパク質に関する遺伝子の構築は下
記実施例１〜４に記載されている。一本鎖融合糖タンパ
ク質に関する遺伝子は実施例５に記載されている。ここ
に記載された組換え作製される修飾の範囲内で、シアリ
ルトランスフェラーゼ合成サイクルが欠けているかまた
は不完全であり、このため末端シアル酸残基が数におい
て減少したりまたは存在しない融合タンパク質を生じる
構築物を例えば選択することができる。
ジェニック動物のゲノム中への挿入のための遺伝子は、
上記で本明細書の開示の一部とされる参考文献および下
記例に記載されたようにして得ることができる。ヒト化
二本鎖融合糖タンパク質についてコードする遺伝子はＥ
Ｐ‐Ａ‐５０１，２１５明細書に記載されている。代表
的な一本鎖融合糖タンパク質に関する遺伝子の構築は下
記実施例１〜４に記載されている。一本鎖融合糖タンパ
ク質に関する遺伝子は実施例５に記載されている。ここ
に記載された組換え作製される修飾の範囲内で、シアリ
ルトランスフェラーゼ合成サイクルが欠けているかまた
は不完全であり、このため末端シアル酸残基が数におい
て減少したりまたは存在しない融合タンパク質を生じる
構築物を例えば選択することができる。
【００４３】望ましいＦＵＰについてコードするｃＤＮ
Ａは、例えば常法に従い細菌ベクターでの調製により、
後で増幅される遺伝子構築物を作製するために、適正な
読取り枠内で適切な調節シグナルと融合させることがで
きる（参考のために本明細書の開示の一部とされるSamb
rook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press,1989 参照）。その後で増幅
された構築物はベクターから切り出され、トランスジェ
ニック動物を作り出す上での使用のために精製される。
精製は陰イオンＨＰＬＣの１回以上のサイクルにより実
施できる；代替技術としてはスクロースまたはＮａＣｌ
勾配による超遠心、ゲル電気溶出後のアガロース処理お
よびエタノール沈降、または低圧クロマトグラフィーが
ある。数サイクルのＨＰＬＣによる精製のおかげで、マ
ウスおよびブタの双方において２０％以上の程度で著し
く高い形質転換頻度が可能になる。
Ａは、例えば常法に従い細菌ベクターでの調製により、
後で増幅される遺伝子構築物を作製するために、適正な
読取り枠内で適切な調節シグナルと融合させることがで
きる（参考のために本明細書の開示の一部とされるSamb
rook et al,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Press,1989 参照）。その後で増幅
された構築物はベクターから切り出され、トランスジェ
ニック動物を作り出す上での使用のために精製される。
精製は陰イオンＨＰＬＣの１回以上のサイクルにより実
施できる；代替技術としてはスクロースまたはＮａＣｌ
勾配による超遠心、ゲル電気溶出後のアガロース処理お
よびエタノール沈降、または低圧クロマトグラフィーが
ある。数サイクルのＨＰＬＣによる精製のおかげで、マ
ウスおよびブタの双方において２０％以上の程度で著し
く高い形質転換頻度が可能になる。
【００４４】上記調節シグナルとしては融合タンパク質
の乳腺特異性発現およびそれらの翻訳後グリコシル化、
乳または他の体液中への発現された融合糖タンパク質の
分泌と全生物活性の発現に必要なシス作用シグナルがあ
る。このような調節シグナルは融合遺伝子の発現を促す
プロモーターを含む。乳腺細胞で特異的に活性であっ
て、乳タンパク質に関連したプロモーターがより好まし
い。このようなプロモーターの中では、乳清酸性タンパ
ク質（ＷＡＰ）、短および長α、βおよびκカゼイン、
α‐ラクトアルブミンとβ‐ラクトグロブリン（ＢＬ
Ｇ）プロモーターに関するものが好ましい。
の乳腺特異性発現およびそれらの翻訳後グリコシル化、
乳または他の体液中への発現された融合糖タンパク質の
分泌と全生物活性の発現に必要なシス作用シグナルがあ
る。このような調節シグナルは融合遺伝子の発現を促す
プロモーターを含む。乳腺細胞で特異的に活性であっ
て、乳タンパク質に関連したプロモーターがより好まし
い。このようなプロモーターの中では、乳清酸性タンパ
ク質（ＷＡＰ）、短および長α、βおよびκカゼイン、
α‐ラクトアルブミンとβ‐ラクトグロブリン（ＢＬ
Ｇ）プロモーターに関するものが好ましい。
【００４５】プロモーターは種々の動物乳の天然タンパ
ク質組成に基づき選択される。例えば、ＷＡＰおよびＢ
ＬＧプロモーターはトランスジェニックげっ歯類、ブタ
およびヒツジで特に有用である。これらのプロモーター
に関する遺伝子は単離および特徴付けがされた。参考の
ため本明細書の開示の一部とされるClark et al.,TIBTE
CH 5:20(1987);Henninghausen,Protein Expression and
Purification 1:3(1990) 参照。プロモーターは慣用的
な制限エンドヌクレアーゼおよびサブクローニング段階
により単離できる。ＷＡＰシグナル配列のすぐ５’側で
２．６kbＥｃｏＲＩ‐ＫｐｎＩ断片として単離されたマ
ウスＷＡＰプロモーターが使用できるが、マウス遺伝子
の“長”ＷＡＰプロモーター（５’ ４．２kbＳａｕ３
Ａ‐Ｋｐｎ１プロモーター）も適切である。
ク質組成に基づき選択される。例えば、ＷＡＰおよびＢ
ＬＧプロモーターはトランスジェニックげっ歯類、ブタ
およびヒツジで特に有用である。これらのプロモーター
に関する遺伝子は単離および特徴付けがされた。参考の
ため本明細書の開示の一部とされるClark et al.,TIBTE
CH 5:20(1987);Henninghausen,Protein Expression and
Purification 1:3(1990) 参照。プロモーターは慣用的
な制限エンドヌクレアーゼおよびサブクローニング段階
により単離できる。ＷＡＰシグナル配列のすぐ５’側で
２．６kbＥｃｏＲＩ‐ＫｐｎＩ断片として単離されたマ
ウスＷＡＰプロモーターが使用できるが、マウス遺伝子
の“長”ＷＡＰプロモーター（５’ ４．２kbＳａｕ３
Ａ‐Ｋｐｎ１プロモーター）も適切である。
【００４６】乳および／または他の体液中へのタンパク
質の分泌を指示する調節配列がトランスジェニック動物
態様にとり重要である。通常、乳または新生ターゲット
ポリペプチドからのシグナルペプチドのような乳タンパ
ク質の分泌を指示することが知られた同種または異種レ
ギュレーター配列が使用できるが、本発明の範囲内には
乳以外の液体中へのタンパク質の分泌を指示するシグナ
ル配列も含む。転写を調節する有用な配列の中には、前
記されたものに加えて、エンハンサー、スプライスシグ
ナル、転写終結コドンおよびポリアデニル化部位があ
る。注入されるＤＮＡ配列は、望ましい融合タンパク質
についてコードするＤＮＡの下流に３’非翻訳領域また
は調節に用いられる乳タンパク質遺伝子も含んでいてよ
い。この領域は発現系のＲＮＡ転写物を安定化させ、こ
うして望ましい融合タンパク質の収率を増加させる。こ
の点で有用なこれらの３’非翻訳領域の中にはポリＡシ
グナルを与える配列がある。このような配列は、例えば
ＳＶ４０の小さなｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域およ
びこの業界で周知のその他から誘導することができる。
質の分泌を指示する調節配列がトランスジェニック動物
態様にとり重要である。通常、乳または新生ターゲット
ポリペプチドからのシグナルペプチドのような乳タンパ
ク質の分泌を指示することが知られた同種または異種レ
ギュレーター配列が使用できるが、本発明の範囲内には
乳以外の液体中へのタンパク質の分泌を指示するシグナ
ル配列も含む。転写を調節する有用な配列の中には、前
記されたものに加えて、エンハンサー、スプライスシグ
ナル、転写終結コドンおよびポリアデニル化部位があ
る。注入されるＤＮＡ配列は、望ましい融合タンパク質
についてコードするＤＮＡの下流に３’非翻訳領域また
は調節に用いられる乳タンパク質遺伝子も含んでいてよ
い。この領域は発現系のＲＮＡ転写物を安定化させ、こ
うして望ましい融合タンパク質の収率を増加させる。こ
の点で有用なこれらの３’非翻訳領域の中にはポリＡシ
グナルを与える配列がある。このような配列は、例えば
ＳＶ４０の小さなｔ抗原、カゼイン３’非翻訳領域およ
びこの業界で周知のその他から誘導することができる。
【００４７】トランスジェニック雌性動物から乳を得る
ことは常法で行われる。McBurney et al.,J.Lab.Clin.M
ed.,64:485(1964);Velander et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 89:12003(1992)。
ことは常法で行われる。McBurney et al.,J.Lab.Clin.M
ed.,64:485(1964);Velander et al.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 89:12003(1992)。
【００４８】組換え作製される修飾の範囲内で、例えば
シアリルトランスフェラーゼに関する遺伝子が不活性で
あるかまたは欠けているもの、あるいはシアリルトラン
スフェラーゼ合成サイクルの他の酵素が不完全であるか
または欠けているものが用いられる。他の好ましい発現
系はガラクトシルトランスフェラーゼまたはマンノース
‐６‐リン酸シンテターゼ／トランスフェラーゼの過剰
発現を示す。加えて、ＥＰ‐Ａ‐３３０，９７７（参考
のためその全体で本明細書の開示の一部とされる）に従
い、例えば二重選択により、融合タンパク質を発現しう
る非常に高い能力を有するＣＨＯ細胞から産生されたク
ローンはシアリル化に欠陥があることがわかった。この
ため、このようなクローンは発現系としての使用に非常
に適している。
シアリルトランスフェラーゼに関する遺伝子が不活性で
あるかまたは欠けているもの、あるいはシアリルトラン
スフェラーゼ合成サイクルの他の酵素が不完全であるか
または欠けているものが用いられる。他の好ましい発現
系はガラクトシルトランスフェラーゼまたはマンノース
‐６‐リン酸シンテターゼ／トランスフェラーゼの過剰
発現を示す。加えて、ＥＰ‐Ａ‐３３０，９７７（参考
のためその全体で本明細書の開示の一部とされる）に従
い、例えば二重選択により、融合タンパク質を発現しう
る非常に高い能力を有するＣＨＯ細胞から産生されたク
ローンはシアリル化に欠陥があることがわかった。この
ため、このようなクローンは発現系としての使用に非常
に適している。
【００４９】これらのタンパク質（例として記載された
抗体‐酵素複合体、ヒト化二本鎖融合タンパク質、ヒト
化一本鎖融合タンパク質および異種一本鎖融合タンパク
質）は、それらが抗イディオタイプおよび／または抗β
‐グルクロニダーゼイムノアフィニティクロマトグラフ
ィーで精製されてから、Krantzら（参考のため全体で本
明細書の開示の一部とされるBiochemistry 15:3963(197
6)）により記載された方法に従い化学的にガラクトシル
化されるか、または代わりにキャリア結合ノイラミニダ
ーゼで処理された。下記において、それらは修飾糖タン
パク質と称される。
抗体‐酵素複合体、ヒト化二本鎖融合タンパク質、ヒト
化一本鎖融合タンパク質および異種一本鎖融合タンパク
質）は、それらが抗イディオタイプおよび／または抗β
‐グルクロニダーゼイムノアフィニティクロマトグラフ
ィーで精製されてから、Krantzら（参考のため全体で本
明細書の開示の一部とされるBiochemistry 15:3963(197
6)）により記載された方法に従い化学的にガラクトシル
化されるか、または代わりにキャリア結合ノイラミニダ
ーゼで処理された。下記において、それらは修飾糖タン
パク質と称される。
【００５０】修飾されたタンパク質はＢＨＫ細胞で発現
されたコントロール未修飾出発タンパク質とインビトロ
およびインビボで比較された。特異性、親和性、定量免
疫反応および定量酵素活性に関するインビトロ試験で
は、修飾されたタンパク質がコントロールタンパク質と
これらの点で有意に異ならないことが明らかになった。
逆に、マウスおよびラット血漿（インビボ）における修
飾タンパク質の半減期（ｔ１／２β）は劇的に短縮され
た（表６、７）。
されたコントロール未修飾出発タンパク質とインビトロ
およびインビボで比較された。特異性、親和性、定量免
疫反応および定量酵素活性に関するインビトロ試験で
は、修飾されたタンパク質がコントロールタンパク質と
これらの点で有意に異ならないことが明らかになった。
逆に、マウスおよびラット血漿（インビボ）における修
飾タンパク質の半減期（ｔ１／２β）は劇的に短縮され
た（表６、７）。
【００５１】ｔ／２βのこの劇的な短縮化の結果とし
て、腫瘍担持ヌードマウス中にガラクトシル化タンパク
質を静脈注射した後１〜３時間で、修飾タンパク質はも
はや血漿中で検出できなかった。脱シアリル化タンパク
質の場合において、ｔ１／２βは脱シアリル化タンパク
質が４８時間後にもはや血漿中で検出しえないような程
度まで短縮化された。同時に、腫瘍中における機能上活
性な修飾タンパク質の濃度は２００〜４００ng/g腫瘍の
範囲内であった（非常に高い特異性比＞１００：１はマ
ウス当たり修飾タンパク質約４００μｇを注射したとき
に結果的に得られた）。
て、腫瘍担持ヌードマウス中にガラクトシル化タンパク
質を静脈注射した後１〜３時間で、修飾タンパク質はも
はや血漿中で検出できなかった。脱シアリル化タンパク
質の場合において、ｔ１／２βは脱シアリル化タンパク
質が４８時間後にもはや血漿中で検出しえないような程
度まで短縮化された。同時に、腫瘍中における機能上活
性な修飾タンパク質の濃度は２００〜４００ng/g腫瘍の
範囲内であった（非常に高い特異性比＞１００：１はマ
ウス当たり修飾タンパク質約４００μｇを注射したとき
に結果的に得られた）。
【００５２】絶対的にみて、修飾タンパク質の濃度はイ
ンビボで未修飾出発タンパク質を用いて匹敵する特異性
比までかなり長時間後に達した場合よりも２〜３倍高
い。更に、修飾タンパク質に関して上記の高い特異性比
（修飾タンパク質μｇ／腫瘍ｇ：修飾タンパク質μｇ／
正常組織ｇ）はわずか数時間（各々１〜３時間または４
８時間）後に得られるが、一方未修飾出発タンパク質の
場合において、匹敵する特異性比（未修飾出発タンパク
質μｇ／腫瘍ｇ：未修飾出発タンパク質μｇ／正常組織
ｇ）は数日（７〜８日）後にやっと達するか、または正
常組織からの浄化速度を促進するために第二抗体の使用
さえも要する。
ンビボで未修飾出発タンパク質を用いて匹敵する特異性
比までかなり長時間後に達した場合よりも２〜３倍高
い。更に、修飾タンパク質に関して上記の高い特異性比
（修飾タンパク質μｇ／腫瘍ｇ：修飾タンパク質μｇ／
正常組織ｇ）はわずか数時間（各々１〜３時間または４
８時間）後に得られるが、一方未修飾出発タンパク質の
場合において、匹敵する特異性比（未修飾出発タンパク
質μｇ／腫瘍ｇ：未修飾出発タンパク質μｇ／正常組織
ｇ）は数日（７〜８日）後にやっと達するか、または正
常組織からの浄化速度を促進するために第二抗体の使用
さえも要する。
【００５３】糖結合レセプター（主に肝臓中のガラクト
ースレセプター、Thornburg et al.,J.Biol.Chem.255:6
820(1980))を介してインターナリゼーションにより生物
の血漿および細胞外領域から修飾タンパク質が急速に除
去されれば、特に抗体‐酵素複合体および異種一本鎖融
合タンパク質の場合において、ヒトで低い免疫原性を有
する修飾タンパク質も生じる。したがって、これも抗腫
瘍療法で異種またはヒト化ＦＵＰの使用を促進するか、
または少くともこのような使用を初めて実現可能にす
る。
ースレセプター、Thornburg et al.,J.Biol.Chem.255:6
820(1980))を介してインターナリゼーションにより生物
の血漿および細胞外領域から修飾タンパク質が急速に除
去されれば、特に抗体‐酵素複合体および異種一本鎖融
合タンパク質の場合において、ヒトで低い免疫原性を有
する修飾タンパク質も生じる。したがって、これも抗腫
瘍療法で異種またはヒト化ＦＵＰの使用を促進するか、
または少くともこのような使用を初めて実現可能にす
る。
【００５４】特に有用なヒト化二本鎖融合タンパク質は
非常に高レベルの発現用に選択されたＣＨＯ細胞で発現
され、抗イディオタイプアフィニティクロマトグラフィ
ーで精製された。静脈注射後３または数日目に、このＦ
ＵＰはＢＨＫ細胞で発現された類似融合タンパク質の場
合よりも２〜３倍高い程度まで腫瘍に集中されている
（表８）。加えて、ＣＨＯ細胞で発現されたＦＵＰはＢ
ＨＫ細胞で発現された融合タンパク質よりもかなり効率
的に血漿から除去され、そのため＞１５の腫瘍：血漿比
にはＣＨＯ融合タンパク質の場合で３日目に達する。Ｂ
ＨＫ融合タンパク質の場合では、対応比は＜１である
（表８）。７日目に、ＣＨＯ融合タンパク質に関する腫
瘍：血漿比は１３０程度であり、一方ＢＨＫ融合タンパ
ク質の場合は２０程度である（表８）。
非常に高レベルの発現用に選択されたＣＨＯ細胞で発現
され、抗イディオタイプアフィニティクロマトグラフィ
ーで精製された。静脈注射後３または数日目に、このＦ
ＵＰはＢＨＫ細胞で発現された類似融合タンパク質の場
合よりも２〜３倍高い程度まで腫瘍に集中されている
（表８）。加えて、ＣＨＯ細胞で発現されたＦＵＰはＢ
ＨＫ細胞で発現された融合タンパク質よりもかなり効率
的に血漿から除去され、そのため＞１５の腫瘍：血漿比
にはＣＨＯ融合タンパク質の場合で３日目に達する。Ｂ
ＨＫ融合タンパク質の場合では、対応比は＜１である
（表８）。７日目に、ＣＨＯ融合タンパク質に関する腫
瘍：血漿比は１３０程度であり、一方ＢＨＫ融合タンパ
ク質の場合は２０程度である（表８）。
【００５５】ＣＨＯ細胞で発現されたまたはＢＨＫ細胞
で発現されたヒト化二本鎖融合タンパク質の間における
これらの高度な薬物動態有意差は、融合タンパク質の炭
水化物含有率の差異で説明することができる。特に、Ｃ
ＨＯ発現産物中におけるＮ‐アセチルノイラミン酸の含
有率は４．２１mol/mol であり、ＢＨＫ発現産物の場合
（５．３７mol/mol)と比較して明らかに減少している。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有率に関するこの変化は、
酵素で脱シアリル化されたＢＨＫ発現産物と比較して、
血漿中の半減期を短縮している。更に、グリカン地図作
成によれば、正常なＢＨＫ発現産物と比較してＣＨＯ発
現産物の方が高マンノース／アシアロ構造（前記式II参
照）を高含有率で示した。
で発現されたヒト化二本鎖融合タンパク質の間における
これらの高度な薬物動態有意差は、融合タンパク質の炭
水化物含有率の差異で説明することができる。特に、Ｃ
ＨＯ発現産物中におけるＮ‐アセチルノイラミン酸の含
有率は４．２１mol/mol であり、ＢＨＫ発現産物の場合
（５．３７mol/mol)と比較して明らかに減少している。
Ｎ‐アセチルノイラミン酸含有率に関するこの変化は、
酵素で脱シアリル化されたＢＨＫ発現産物と比較して、
血漿中の半減期を短縮している。更に、グリカン地図作
成によれば、正常なＢＨＫ発現産物と比較してＣＨＯ発
現産物の方が高マンノース／アシアロ構造（前記式II参
照）を高含有率で示した。
【００５６】酵素活性試験で調べられた高いβ‐グルク
ロニダーゼ濃度は、内在ネズミβ‐グルクロニダーゼの
活性およびＦＵＰの場合と、可能性として生じうる開裂
により後者から遊離されたいずれかのヒトβ‐グルクロ
ニダーゼの活性を表す。酵素‐組織化学法(Murray et a
l.,J.Histochem.Cytochem.37:643(1989)) を用いて、こ
の酵素活性は正常組織で細胞内活性として存在すること
が証明された。このため、この触媒能力は細胞外に散在
する親水性プロドラッグの開裂に寄与しないか、または
わずかに寄与するだけである。
ロニダーゼ濃度は、内在ネズミβ‐グルクロニダーゼの
活性およびＦＵＰの場合と、可能性として生じうる開裂
により後者から遊離されたいずれかのヒトβ‐グルクロ
ニダーゼの活性を表す。酵素‐組織化学法(Murray et a
l.,J.Histochem.Cytochem.37:643(1989)) を用いて、こ
の酵素活性は正常組織で細胞内活性として存在すること
が証明された。このため、この触媒能力は細胞外に散在
する親水性プロドラッグの開裂に寄与しないか、または
わずかに寄与するだけである。
【００５７】以下で例示されたいくつかの態様は、明細
書および添付された請求の範囲に記載された発明の範囲
をいかなる場合も制限すると解釈されるものではない。
書および添付された請求の範囲に記載された発明の範囲
をいかなる場合も制限すると解釈されるものではない。
【００５８】
【実施例】実施例１〜４ ヒト化腫瘍抗体部分およびヒトβ‐グル
クロニダーゼからのヒト 化一本鎖融合タンパク質の組換
えによる調製
クロニダーゼからのヒト 化一本鎖融合タンパク質の組換
えによる調製
【００５９】実施例１ オリゴヌクレオチドｐＡＢ‐バックおよびリンカー‐ア
ンチ（表１）を用いて、自己のシグナル配列を含んだＶ
H 遺伝子をｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈｕｍＶH から
増幅させる（Gussow et al,1991,前記）。オリゴヌクレ
オチドリンカー‐センスおよびＶL-(Mut) ‐フォア（表
２）を用いて、ＶL 遺伝子をｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２
６ｈｕｍＶL から増幅させる（Gussow et al,1991,前
記）。
ンチ（表１）を用いて、自己のシグナル配列を含んだＶ
H 遺伝子をｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ｈｕｍＶH から
増幅させる（Gussow et al,1991,前記）。オリゴヌクレ
オチドリンカー‐センスおよびＶL-(Mut) ‐フォア（表
２）を用いて、ＶL 遺伝子をｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２
６ｈｕｍＶL から増幅させる（Gussow et al,1991,前
記）。
【００６０】表１ ｐＡＢ‐バック： 情報配列 No.１ 5' 3' ACC AGA AGC TTA TGA ATA TGC AAA TC
【００６１】リンカー‐アンチ： 情報配列 No.２ 5' GCC ACC CGA CCC ACC ACC GCC CGA TCC ACC GCC TCC TGA 3' GGA GAC GGT GAC CGT GGT C
【００６２】 表２ リンカー‐センス： 情報配列 No.３ 5' GGT GGA TCG GGC GGT GGT GGG TCG GGT GGC GGC GGA TCT 3' GAC ATC CAG CTG ACC CAG AGC
【００６３】ＶL(Mut)‐フォア： 情報配列 No.４ 5' TGC AGG ATC CAA CTG AGG AAG CAA AGT TTA AAT TCT ACT 3' CAC CTT TGA TC
【００６４】実施例２ オリゴヌクレオチドリンカー‐アンチおよびリンカー‐
センスは互いに部分的に相補的であり、ＶH およびＶL
ドメインを結合させてｓＦｖ断片を形成するように意図
されたポリペプチドリンカーについてコードする。増幅
されたＶH およびＶL 断片を融合させるために、それら
を精製して、下記のような１０サイクル反応に導入す
る： Ｈ２Ｏ： ３７．５μｌ ｄＮＴＰ’ｓ（２．５mM） ５．０μｌ ＰＣＲ緩衝液（１０ｘ） ５．０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ〔パーキン‐エルマー社(Perkin-Elmer Corp.)， エミリービル，ＣＡ〕（２．５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ ＶL 断片のＤＮＡ０．５μg/pl １．０μｌ ＶH 断片のＤＮＡ０．５μg/pl １．０μｌ ＰＣＲ緩衝液（１０ｘ）：ｐＨ８．３の１００mMトリ
ス、５００mMＫＣｌ、１５mMＭｇＣｌ２、０．１％(w/
v) ゼラチン
センスは互いに部分的に相補的であり、ＶH およびＶL
ドメインを結合させてｓＦｖ断片を形成するように意図
されたポリペプチドリンカーについてコードする。増幅
されたＶH およびＶL 断片を融合させるために、それら
を精製して、下記のような１０サイクル反応に導入す
る： Ｈ２Ｏ： ３７．５μｌ ｄＮＴＰ’ｓ（２．５mM） ５．０μｌ ＰＣＲ緩衝液（１０ｘ） ５．０μｌ Ｔａｑポリメラーゼ〔パーキン‐エルマー社(Perkin-Elmer Corp.)， エミリービル，ＣＡ〕（２．５Ｕ／μｌ） ０．５μｌ ＶL 断片のＤＮＡ０．５μg/pl １．０μｌ ＶH 断片のＤＮＡ０．５μg/pl １．０μｌ ＰＣＲ緩衝液（１０ｘ）：ｐＨ８．３の１００mMトリ
ス、５００mMＫＣｌ、１５mMＭｇＣｌ２、０．１％(w/
v) ゼラチン
【００６５】反応混合液の表面をパラフィンで密封し、
しかる後１０サイクル反応を９４℃、１分間；５５℃、
１分間；７２℃、２分間のプログラムを用いてＰＣＲ装
置で実施する。その後、２．５pMのフランキングプライ
マーｐＡＢ‐バックおよびＶL-(Mut) ‐フォアを加え、
更に２０サイクルを行う。ＶH 遺伝子から構成され、リ
ンカーでＶL 遺伝子に連結されたＰＣＲ断片が得られる
（図５）。ＶH 遺伝子自体のシグナル配列もＶH 遺伝子
の前に位置している。オリゴヌクレオチドＶL-(Mut)-フ
ォアを用いた結果として、ＶL 遺伝子の最終ヌクレオチ
ド塩基Ｃは同時にＧに代わっている。このＰＣＲ断片は
ヒト化一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）についてコードしている。
しかる後１０サイクル反応を９４℃、１分間；５５℃、
１分間；７２℃、２分間のプログラムを用いてＰＣＲ装
置で実施する。その後、２．５pMのフランキングプライ
マーｐＡＢ‐バックおよびＶL-(Mut) ‐フォアを加え、
更に２０サイクルを行う。ＶH 遺伝子から構成され、リ
ンカーでＶL 遺伝子に連結されたＰＣＲ断片が得られる
（図５）。ＶH 遺伝子自体のシグナル配列もＶH 遺伝子
の前に位置している。オリゴヌクレオチドＶL-(Mut)-フ
ォアを用いた結果として、ＶL 遺伝子の最終ヌクレオチ
ド塩基Ｃは同時にＧに代わっている。このＰＣＲ断片は
ヒト化一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）についてコードしている。
【００６６】実施例３ 実施例２のｓＦｖ断片をＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩ
で制限し、ＨｉｎｄIII で完全に開裂されてＢｇｌIIで
一部開裂されたベクターｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６Ｖ
H ｈｕβｇｌｕｃ１Ｈ中に結合させる。ベクターｐＡＢ
ｓｔｏｐ１／２６ＶH ｈｕβｇｌｕｃ１Ｈは、ＶH 特異
性シグナル配列を含んだＶH エキソン、続いてＣＨ１エ
クソン、ヒトＩｇＧ３ Ｃ遺伝子のヒンジエクソンおよ
びヒトβ‐グルクロニダーゼの完全ｃＤＮＡを含む。プ
ラスミドクローンｐＭＣＧ‐Ｅ１を単離したが、そのク
ローンはヒト化ｓＦｖ４３１／２６、ヒンジエクソンお
よび完全β‐グルクロニダーゼを含んでいる（図３）。
ベクターｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ＶH ｈｕβｇｌｕ
ｃは参考のため全体で本明細書の開示の一部とされるBo
sslet et al.,Brit.J.Cancer 65:234(1992) に記載され
ており、残りの個々の要素に関する情報はそこで掲載さ
れた参考文献から得ることができる。
で制限し、ＨｉｎｄIII で完全に開裂されてＢｇｌIIで
一部開裂されたベクターｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６Ｖ
H ｈｕβｇｌｕｃ１Ｈ中に結合させる。ベクターｐＡＢ
ｓｔｏｐ１／２６ＶH ｈｕβｇｌｕｃ１Ｈは、ＶH 特異
性シグナル配列を含んだＶH エキソン、続いてＣＨ１エ
クソン、ヒトＩｇＧ３ Ｃ遺伝子のヒンジエクソンおよ
びヒトβ‐グルクロニダーゼの完全ｃＤＮＡを含む。プ
ラスミドクローンｐＭＣＧ‐Ｅ１を単離したが、そのク
ローンはヒト化ｓＦｖ４３１／２６、ヒンジエクソンお
よび完全β‐グルクロニダーゼを含んでいる（図３）。
ベクターｐＡＢｓｔｏｐ４３１／２６ＶH ｈｕβｇｌｕ
ｃは参考のため全体で本明細書の開示の一部とされるBo
sslet et al.,Brit.J.Cancer 65:234(1992) に記載され
ており、残りの個々の要素に関する情報はそこで掲載さ
れた参考文献から得ることができる。
【００６７】実施例４ クローンｐＭＣＧ‐Ｅ１を、ネオマイシン耐性遺伝子を
保有するプラスミドｐＲＭＨ１４０（図５）およびメト
トレキセート耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＳＶ２
（図６）と一緒に、ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトす
る。ＢＨＫ細胞はＭａｂＢＷ４３１／２６ｈｕｍの抗原
結合性質とヒトβ‐グルクロニダーゼの酵素活性を双方
とも有する融合タンパク質を発現する（実施例８および
９参照）。
保有するプラスミドｐＲＭＨ１４０（図５）およびメト
トレキセート耐性遺伝子を保有するプラスミドｐＳＶ２
（図６）と一緒に、ＢＨＫ細胞中にトランスフェクトす
る。ＢＨＫ細胞はＭａｂＢＷ４３１／２６ｈｕｍの抗原
結合性質とヒトβ‐グルクロニダーゼの酵素活性を双方
とも有する融合タンパク質を発現する（実施例８および
９参照）。
【００６８】実施例５ 異種一本鎖融合タンパク質の構
築 異種一本鎖融合タンパク質は、ヒト化ＶH 、Ｓ、ＶL ヒ
ンジおよびＳ領域についてコードするヌクレオチド配列
（実施例１〜４および下記参照）を大腸菌β‐グルクロ
ニダーゼについてコードするヌクレオチド配列と結合さ
せることにより、適切な発現系、好ましくはＢＨＫ細胞
で発現後に産生した。ヒト化ｓＦｖ（アンチＣＥＡ）お
よび大腸菌β‐グルクロニダーゼからの一本鎖融合タン
パク質の構築は以下に詳細に記載されている。ｓＦｖ４
３１／２６断片はオリゴｐＡＢ‐バック（表１）および
ｓＦｖ‐フォア（表３）を用いるＰＣＲ用の鋳型として
用いる。こうして、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII 開裂部
位を新たに形成されたｓＦｖ４３１／２６断片（ｂ）の
３’末端に導入する。ＰＣＲ断片を精製し、ＨｉｎｄII
I で切断し、しかる後ＨｉｎｄIII で切断されかつアル
カリホスファターゼで処理されたｐＵＣ１８ベクター中
に結合させる。ＢｇｌII開裂部位のあるｓＦｖ断片を含
有したプラスミドクローンｐＫＢＯ１を単離する（図
７）。
築 異種一本鎖融合タンパク質は、ヒト化ＶH 、Ｓ、ＶL ヒ
ンジおよびＳ領域についてコードするヌクレオチド配列
（実施例１〜４および下記参照）を大腸菌β‐グルクロ
ニダーゼについてコードするヌクレオチド配列と結合さ
せることにより、適切な発現系、好ましくはＢＨＫ細胞
で発現後に産生した。ヒト化ｓＦｖ（アンチＣＥＡ）お
よび大腸菌β‐グルクロニダーゼからの一本鎖融合タン
パク質の構築は以下に詳細に記載されている。ｓＦｖ４
３１／２６断片はオリゴｐＡＢ‐バック（表１）および
ｓＦｖ‐フォア（表３）を用いるＰＣＲ用の鋳型として
用いる。こうして、ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIII 開裂部
位を新たに形成されたｓＦｖ４３１／２６断片（ｂ）の
３’末端に導入する。ＰＣＲ断片を精製し、ＨｉｎｄII
I で切断し、しかる後ＨｉｎｄIII で切断されかつアル
カリホスファターゼで処理されたｐＵＣ１８ベクター中
に結合させる。ＢｇｌII開裂部位のあるｓＦｖ断片を含
有したプラスミドクローンｐＫＢＯ１を単離する（図
７）。
【００６９】大腸菌β‐グルクロニダーゼについてコー
ドする遺伝子をオリゴ大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐バック１
（表４）および大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐フォア（表５）を
用いてＰＣＲによりベクターｐＲＡＪ２６０(Jefferson
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:8447(1986)) から
増幅させ、同時に５’末端でＢｇｌII開裂部位、３’末
端でＸｂａＩ開裂部位、および更に５’末端でリンカー
についてコードする配列を設ける。得られた断片を精製
し、ＢｇｌII／ＸｂａＩで切断し、しかる後同様にＢｇ
ｌII／ＸｂａＩで切断されたベクターｐＫＢＯ１に組み
込んでクローニングする。リンカー配列で大腸菌β‐グ
ルクロニダーゼに結合されたｓＦｖ４３１／２６を含有
するプラスミドクローンｐＫＢＯ２を単離する（図
８）。ＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩ切断によりベクターｐＫ
ＢＯ２から得られたｓＦｖ‐大腸菌β‐ｇｌｕｃ断片を
精製し、しかる後同様にＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩで切断
された発現ベクターｐＡＢｓｔｏｐ中に結合させた(Zet
tlmeissl et al.,Behring Institute Mitteilungen(Com
munications)82:26(1988))。ヒト化ｓＦｖ４３１／２
６、リンカーおよび完全大腸菌β‐グルクロニダーゼを
含有したプラスミドクローンｐＫＢＯ３を単離する（図
９）。
ドする遺伝子をオリゴ大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐バック１
（表４）および大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐フォア（表５）を
用いてＰＣＲによりベクターｐＲＡＪ２６０(Jefferson
et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:8447(1986)) から
増幅させ、同時に５’末端でＢｇｌII開裂部位、３’末
端でＸｂａＩ開裂部位、および更に５’末端でリンカー
についてコードする配列を設ける。得られた断片を精製
し、ＢｇｌII／ＸｂａＩで切断し、しかる後同様にＢｇ
ｌII／ＸｂａＩで切断されたベクターｐＫＢＯ１に組み
込んでクローニングする。リンカー配列で大腸菌β‐グ
ルクロニダーゼに結合されたｓＦｖ４３１／２６を含有
するプラスミドクローンｐＫＢＯ２を単離する（図
８）。ＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩ切断によりベクターｐＫ
ＢＯ２から得られたｓＦｖ‐大腸菌β‐ｇｌｕｃ断片を
精製し、しかる後同様にＨｉｎｄIII ／ＸｂａＩで切断
された発現ベクターｐＡＢｓｔｏｐ中に結合させた(Zet
tlmeissl et al.,Behring Institute Mitteilungen(Com
munications)82:26(1988))。ヒト化ｓＦｖ４３１／２
６、リンカーおよび完全大腸菌β‐グルクロニダーゼを
含有したプラスミドクローンｐＫＢＯ３を単離する（図
９）。
【００７０】表３ ｓＦｖ‐フォア： 情報配列 No.５ 5' 3' TTT TTA AGC TTA GAT CTC CAC CTT GGT C
【００７１】 表４ 大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐バック１： 情報配列 No.６ 5' AAA AAG ATC TCC GCG TCT GGC GGG CCA CAG TTA CGT GTA GAA 3' ACC CCA
【００７２】表５ 大腸菌β‐ｇｌｕｃ‐フォア： 情報配列 No.７ 5' 3' GCT TCT AGA TCA TTG TTT GCC TCC CTG
【００７３】 表６ ヒト腫瘍異種移植片（ＭｚＳｔｏ１）をもつＣＤ‐１ヌードマウスにおける 未修飾および修飾ヒト化二本鎖融合タンパク質の薬物動態比較 ＢＨＫ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＯＦＡＴで測定された融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 3 21 61.4 6.5 35.6 77.6 60.1 456.2 1 hr 4.9 15 26.1 8.6 17.3 33.9 19.5 199.9 1.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 hr 5.7 4.8 14.8 3.5 6.5 7.7 2.5 122 5.5 hr 3.8 3.8 8.4 3.8 7.7 8.8 2.9 84.9 24 hr 4.7 1 2.1 0.6 2.5 2.1 0.5 19 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr 0.19 0.005 0.003 0 0 0.002 0 0
【００７４】 ＢＨＫ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 胃 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr n.d. 48.5 81.7 18.6 45 83.7 60.2 n.d. 1 hr n.d. 58.9 126.2 20 24.1 39.7 21.1 n.d. 1.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 hr n.d. 50.2 125.2 15.6 11.4 13.3 4.2 n.d. 5.5 hr n.d. 78 177.8 17 9.3 14.5 5.4 n.d. 24 hr n.d. 90.7 267.5 15.9 6.7 8.5 4 n.d. 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００７５】 ＢＨＫ細胞で産生された修飾融合タンパク質（ガラクトシル化） ＯＦＡＴで測定された ガラクトシル化融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 1.6 7.1 51.9 2.15 7.78 21.6 15.7 83.3 1 hr 0.5 0.19 1.9 0.29 1.16 0.26 0.17 0.06 1.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 hr 0.16 0.27 0.09 0.03 0 0.3 0 0 5.5 hr 0.27 0.02 0.11 0.05 0.02 0.08 0 0 24 hr 0.05 0.02 0.04 0 0 0 0 0 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００７６】 ＢＨＫ細胞で産生された修飾融合タンパク質（ガラクトシル化） ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 胃 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr n.d. 35.5 75.1 14 13 39 17.9 n.d. 1 hr n.d. 27.6 167.5 17.4 5.5 7.2 1.4 n.d. 1.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 hr n.d. 23.8 132.7 8.9 4.4 6.3 0.86 n.d. 5.5 hr n.d. 28.3 164.5 10.7 4.1 6 1.1 n.d. 24 hr n.d. 31.5 126.2 12.8 4.7 5.6 1.4 n.d. 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００７７】 ＢＨＫ細胞で産生された修飾融合タンパク質（脱シアリル化） ＯＦＡＴで測定された 脱シアリル化融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 1.3 14.6 38.9 10.2 20.6 49.8 24.2 234.9 1 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 hr 3.3 1.1 2.8 0.37 1.5 1.8 1.3 13.8 5.5 hr 2.9 0.1 0.22 0.02 0.04 0.19 0.06 0.65 24 hr 0.4 0.1 0.04 0.002 0.004 0.16 0.001 0.004 48 hr 0.1 0 0.04 0 0 0.55 0 0 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００７８】 ＢＨＫ細胞で産生された修飾融合タンパク質（脱シアリル化） ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 胃 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 1.3 43.2 63.2 48.7 23.8 56.1 25.7 250 1 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 2 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 3 hr 3.3 69.8 199.2 9.2 7.4 6.1 3.9 13.5 5.5 hr 2.9 68.7 342.1 10.6 4 4.1 2.5 0.76 24 hr 0.4 179 641.1 34.6 15.8 16.9 7 0.058 48 hr 0.1 185.9 639.7 32.7 8.8 21 12.7 0.013 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００７９】 表７ ヒト腫瘍異種移植片（ＬｏＶｏ）をもつＣＤ‐１ヌードマウスにおける 未修飾および修飾ヒト化二本鎖融合タンパク質の薬物動態比較 ＢＨＫ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＯＦＡＴで測定された融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 0.86 13.5 56.8 1.9 7.6 15.5 3.4 602 1 hr n.d. 7.9 25.2 2.7 3.9 10.9 2.6 171.7 1.5 hr 4.05 7.3 19.5 3.3 10.3 23.9 14.2 138 2 hr n.d. 5.4 15.1 2.5 4.8 7.9 1.9 119 3 hr 1.8 4.9 12.4 3 8.5 17.3 9.2 105 5.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 24 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr 0.409 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 0.023
【００８０】 ＢＨＫ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 胃 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr n.d. 42.8 96.5 12.5 12.4 21.6 3.9 n.d. 1 hr n.d. 57.2 202.6 10.7 8.4 15.5 9.2 n.d. 1.5 hr n.d. 51.5 164.6 12.3 16.1 30.6 6.8 n.d. 2 hr n.d. 59.5 136.9 12 8.6 12.9 5.4 n.d. 3 hr n.d. 51.9 181 14.1 13.1 23.4 8.9 n.d. 5.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 24 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００８１】 ＢＨＫ細胞で産生された修飾融合タンパク質（ガラクトシル化） ＯＦＡＴで測定された ガラクトシル化融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 0.45 6.3 41.2 1.43 2.78 7.7 0.82 257.6 1 hr n.d. 0.16 0.63 0.05 0.03 0.033 0 0.032 1.5 hr 1.45 0.09 0.42 0.05 0.05 0.164 0.036 0.006 2 hr n.d. 0.008 0.11 0.03 0 0.1 0 0 3 hr 0.48 0 0.08 0.006 0 0.05 0.002 0 5.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 24 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００８２】 ＢＨＫ細胞で産生された修飾融合タンパク質（ガラクトシル化） ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 胃 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr n.d. 29.3 48.2 12.4 8.2 14.1 1.7 n.d. 1 hr n.d. 24.6 132.1 13.1 4.6 5.2 0.95 n.d. 1.5 hr n.d. 19.6 120.8 15.3 4.2 4.7 1.7 n.d. 2 hr n.d. 10.7 111.4 16.6 3.6 5.6 0.88 n.d. 3 hr n.d. 22 164.9 13.6 3.8 4.9 0.95 n.d. 5.5 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 24 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 48 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 168 hr n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
【００８３】 表８ ヒト腫瘍異種移植片（ＭｚＳｔｏ１）をもつＣＤ‐１ヌードマウスにおける ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞で産生された 未修飾ヒト化二本鎖融合タンパク質の薬物動態比較 ＢＨＫ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＯＦＡＴで測定された融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 3.807 22.779 44.411 7.732 27.792 53.59 33.941 413 3 hr 6.166 8.847 20.099 4.125 12.609 26.363 12.93 147 24 hr 4.944 0.935 1.416 0.249 1.315 2.779 1.493 12.3 72 hr 0.818 0.094 0.14 0.058 0.112 0.241 0.136 1.152 168 hr 0.314 0.002 0.005 0.002 0.002 0.008 0 0.015
【００８４】 ＢＨＫ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 6.473 27.927 44.748 13.045 27.419 59.345 30.897 n.d. 3 hr 9.982 70.009 445.32 15.714 16.415 27.014 14.427 n.d. 24 hr 28.384 41.799 33.834 6.605 2.422 3.99 2.498 n.d. 72 hr 9.929 20.458 12.391 12.416 1.051 2.283 1.306 n.d. 168 hr 7.423 7.393 6.083 5.164 0.94 1.483 0.502 n.d.
【００８５】 ＣＨＯ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＯＦＡＴで測定された融合タンパク質μｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 3.583 19.179 33.392 7.96 23.089 61.279 24.018 308 3 hr 6.526 8.555 17.787 7.098 11.613 26.755 10.824 157.9 24 hr 4.668 1.002 1.225 0.299 1.218 2.926 1.361 12.082 72 hr 2.176 0.036 0.028 0.013 0.023 0.059 0.029 0.144 168 hr 0.653 0.003 0.002 0.003 0 0.003 0 0.005
【００８６】 ＣＨＯ細胞で産生された未修飾融合タンパク質 ＥＡＴで測定されたβ‐グルクロニダーゼμｇ／腫瘍ｇまたは／器官ｇ 腫瘍 脾臓 肝臓 腸 腎臓 肺臓 心臓 血漿 0.05hr 6.475 23.883 29.696 14 23.223 56.864 23.042 n.d. 3 hr 10.96 89.594 204.82 15.928 13.66 26.994 12.556 n.d. 24 hr 29.279 72.999 23.754 7.011 2.513 5.003 3.089 n.d. 72 hr 50.13 25.828 7.527 7.613 1.542 2.568 1.719 n.d. 168 hr 5.515 14.251 4.172 4.172 1.202 1.588 1.193 n.d.
【００８７】実施例６ 二本鎖融合タンパク質のガラク
トシル化 融合タンパク質のガラクトシル化はMattesの方法の改変
したものを用いて実施した（全体でここに本明細書の開
示の一部とされるJ.Natl.Cancer Inst.,79:855(198
7)）。シアノメチル‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐ア
セチル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド〔シグ
マ(Sigma);２５０mg〕を無水メタノール〔メルク(Merc
k);６．２５ml〕に溶解し、しかる後ナトリウムメトキ
シドのメタノール溶液（５．４mg/ml)６２５μｌをピペ
ット注入した。室温で４８時間インキュベート後、一部
の活性化ガラクトース誘導体５mlを取出し、メタノール
を窒素流下で蒸発させ、融合タンパク質溶液１００ml
（ｐＨ８．５の０．２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液中１
mg/ml)を残りの残渣に加え、混合液を室温で２４時間イ
ンキュベートした。この後ＰＢＳに対して一夜透析し
た。前調製ＢＷ４３１／２６‐大腸菌β‐グルクロニダ
ーゼ複合体およびモノクローナル抗体ＢＷ４３１／２６
のガラクトシル化も同様のやり方で実施した。同様の化
学的手法を用いて、ラクトシル化、すなわちＡＥＣおよ
びＦＵＰのＮ‐アセチルラクトシル化およびグルコシル
化も行える。
トシル化 融合タンパク質のガラクトシル化はMattesの方法の改変
したものを用いて実施した（全体でここに本明細書の開
示の一部とされるJ.Natl.Cancer Inst.,79:855(198
7)）。シアノメチル‐２，３，４，６‐テトラ‐Ｏ‐ア
セチル‐１‐チオ‐β‐Ｄ‐ガラクトピラノシド〔シグ
マ(Sigma);２５０mg〕を無水メタノール〔メルク(Merc
k);６．２５ml〕に溶解し、しかる後ナトリウムメトキ
シドのメタノール溶液（５．４mg/ml)６２５μｌをピペ
ット注入した。室温で４８時間インキュベート後、一部
の活性化ガラクトース誘導体５mlを取出し、メタノール
を窒素流下で蒸発させ、融合タンパク質溶液１００ml
（ｐＨ８．５の０．２５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液中１
mg/ml)を残りの残渣に加え、混合液を室温で２４時間イ
ンキュベートした。この後ＰＢＳに対して一夜透析し
た。前調製ＢＷ４３１／２６‐大腸菌β‐グルクロニダ
ーゼ複合体およびモノクローナル抗体ＢＷ４３１／２６
のガラクトシル化も同様のやり方で実施した。同様の化
学的手法を用いて、ラクトシル化、すなわちＡＥＣおよ
びＦＵＰのＮ‐アセチルラクトシル化およびグルコシル
化も行える。
【００８８】実施例７ 融合タンパク質測定用の器官／
腫瘍の処理 下記連続段階を行った： １．皮下腫瘍を有しかつ融合タンパク質または抗体‐酵
素複合体で処置されたヌードマウス（ＣＤ１）を後眼窩
から採血し、しかる後殺す。 ２．血液を直ちにリクエミン(Liquemin)２５０００〔ホ
フマン・ラロシュ社(Hoffman LaRoche AG)〕１０μｌを
既に含有したエッペンドルフ管に加える。 ３．上記２の処理血液を２５００rpm で１０分間遠心す
る〔ヘレウス(Heraeus) のメガフュージ(Megafuge)１．
０遠心機〕；次いで血漿を単離し、試験まで凍結させて
おく。 ４．器官または腫瘍を摘出し、秤量し、しかる後ｐＨ
７．２のＰＢＳ中１％ＢＳＡ２mlと完全にホモゲナイズ
する。 ５．腫瘍ホモゲネートを０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．２
に調整する（サンプルは過剰滴定してはならず、さもな
ければβ‐グルクロニダーゼはｐＨ＜３．８で早めに活
性化される）。 ６．ホモゲネートを１６０００ｇで３０分間遠心する；
透明な上澄液を除去し、０．１Ｎ ＮａＯＨで中和す
る。 ７．上澄および血漿は下記例に記載されたようにＯＦＡ
Ｔ（ＦＵＰ濃度を測定する）またはＥＡＴ（β‐グルク
ロニダーゼ濃度を測定する）で試験することができる。
腫瘍の処理 下記連続段階を行った： １．皮下腫瘍を有しかつ融合タンパク質または抗体‐酵
素複合体で処置されたヌードマウス（ＣＤ１）を後眼窩
から採血し、しかる後殺す。 ２．血液を直ちにリクエミン(Liquemin)２５０００〔ホ
フマン・ラロシュ社(Hoffman LaRoche AG)〕１０μｌを
既に含有したエッペンドルフ管に加える。 ３．上記２の処理血液を２５００rpm で１０分間遠心す
る〔ヘレウス(Heraeus) のメガフュージ(Megafuge)１．
０遠心機〕；次いで血漿を単離し、試験まで凍結させて
おく。 ４．器官または腫瘍を摘出し、秤量し、しかる後ｐＨ
７．２のＰＢＳ中１％ＢＳＡ２mlと完全にホモゲナイズ
する。 ５．腫瘍ホモゲネートを０．１Ｎ ＨＣｌでｐＨ４．２
に調整する（サンプルは過剰滴定してはならず、さもな
ければβ‐グルクロニダーゼはｐＨ＜３．８で早めに活
性化される）。 ６．ホモゲネートを１６０００ｇで３０分間遠心する；
透明な上澄液を除去し、０．１Ｎ ＮａＯＨで中和す
る。 ７．上澄および血漿は下記例に記載されたようにＯＦＡ
Ｔ（ＦＵＰ濃度を測定する）またはＥＡＴ（β‐グルク
ロニダーゼ濃度を測定する）で試験することができる。
【００８９】実施例８ ＯＦＡＴ（器官融合タンパク質
活性試験） 試験は下記の方法で進める： １．ｐＨ７．２のＰＢＳで１：３００希釈されたヤギ抗
ヒトκ抗体〔サザーン・バイオテクノロジー・アソシエ
ーツ(Southern Biotechnology Associates),オーダー N
o.２０６０‐０１〕７５μｌを微量滴定プレート〔ポリ
スチレンＵ型，タイプＢ，ヌンク(Nunc)製，オーダー N
o.４‐６０４４５〕の各ウェルに加える。 ２．微量滴定プレートをカバーし、室温で一夜インキュ
ベートする。 ３．次いで微量滴定プレートをウェル当たりｐＨ７．４
の０．０５Ｍトリス‐クエン酸緩衝液２５０μｌで３回
洗浄する。 ４．こうして被覆されたこれらの微量滴定プレートを室
温で３０分間にわたりウェル当たりブロッキング溶液
（ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％カゼイン）２５０μｌとイ
ンキュベートする（非特異的結合部位をブロックする）
（必要としない被覆微量滴定プレートは室温で２４時間
乾燥させ、しかる後長期貯蔵用に被覆アルミニウムバッ
グ中でデシケーターカートリッジと一緒に密封する）。 ５．基質を調製しながら、ブロッキングを進める（各試
験用の新鮮基質：２．５mM４‐メチルウンベリフェリル
β‐Ｄ‐グルクロニド，オーダーNo.:Ｍ‐９１３０，シ
グマ製，ｐＨ４．５の２００mM酢酸Ｎａ＋０．０１％Ｂ
ＳＡ中）。 ６．その後で、１０サンプル＋１陽性コントロール＋１
陰性コントロールを未処理９６ウェルＵ型底微量滴定プ
レート〔ポリスチレン，レナー(Renner)製，オーダー N
o.１２０５８〕において８段階でｐＨ７．２のＰＢＳ中
１％カゼインで１：２に希釈する（サンプル１５０μｌ
から出発し、サンプル７５μｌをカゼインレシピエント
溶液７５μｌ中にピペット注入する）。 ７．ブロッキング溶液を抗ヒトκ抗体で被覆された微量
滴定プレートから吸出し、希釈サンプル５０μｌを希釈
プレートから試験プレートの各ウェルに移し、試験プレ
ートを室温で３０分間インキュベートする。 ８．試験プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液〔ベーリング
ウェルケ(Behringwerke)，オーダー No.ＯＳＥＷ９６〕
で３回洗浄する。 ９．基質５０μｌをウェル当たりで適用し、試験プレー
トをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。 １０．次いでストック溶液１５０μｌ（０．２Ｍグリシ
ン＋０．２％ＳＤＳ，ｐＨ１１．７）を各ウェルに加え
る。 １１．ケイ光測定評価は励起波長３５５nmおよび発光波
長４６０nmでフルオロスキャン(Fluoroscan)II〔ＩＣＮ
バイオメディカルズ(ICN Biomedicals),Cat.No.78-611-
00〕により行う。 １２．同一実験に含まれた陽性コントロール（標準曲線
として精製融合タンパク質の希釈シリーズ）に関するケ
イ光値によって、融合タンパク質の未知濃度をサンプル
で決定する。
活性試験） 試験は下記の方法で進める： １．ｐＨ７．２のＰＢＳで１：３００希釈されたヤギ抗
ヒトκ抗体〔サザーン・バイオテクノロジー・アソシエ
ーツ(Southern Biotechnology Associates),オーダー N
o.２０６０‐０１〕７５μｌを微量滴定プレート〔ポリ
スチレンＵ型，タイプＢ，ヌンク(Nunc)製，オーダー N
o.４‐６０４４５〕の各ウェルに加える。 ２．微量滴定プレートをカバーし、室温で一夜インキュ
ベートする。 ３．次いで微量滴定プレートをウェル当たりｐＨ７．４
の０．０５Ｍトリス‐クエン酸緩衝液２５０μｌで３回
洗浄する。 ４．こうして被覆されたこれらの微量滴定プレートを室
温で３０分間にわたりウェル当たりブロッキング溶液
（ｐＨ７．２のＰＢＳ中１％カゼイン）２５０μｌとイ
ンキュベートする（非特異的結合部位をブロックする）
（必要としない被覆微量滴定プレートは室温で２４時間
乾燥させ、しかる後長期貯蔵用に被覆アルミニウムバッ
グ中でデシケーターカートリッジと一緒に密封する）。 ５．基質を調製しながら、ブロッキングを進める（各試
験用の新鮮基質：２．５mM４‐メチルウンベリフェリル
β‐Ｄ‐グルクロニド，オーダーNo.:Ｍ‐９１３０，シ
グマ製，ｐＨ４．５の２００mM酢酸Ｎａ＋０．０１％Ｂ
ＳＡ中）。 ６．その後で、１０サンプル＋１陽性コントロール＋１
陰性コントロールを未処理９６ウェルＵ型底微量滴定プ
レート〔ポリスチレン，レナー(Renner)製，オーダー N
o.１２０５８〕において８段階でｐＨ７．２のＰＢＳ中
１％カゼインで１：２に希釈する（サンプル１５０μｌ
から出発し、サンプル７５μｌをカゼインレシピエント
溶液７５μｌ中にピペット注入する）。 ７．ブロッキング溶液を抗ヒトκ抗体で被覆された微量
滴定プレートから吸出し、希釈サンプル５０μｌを希釈
プレートから試験プレートの各ウェルに移し、試験プレ
ートを室温で３０分間インキュベートする。 ８．試験プレートをＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液〔ベーリング
ウェルケ(Behringwerke)，オーダー No.ＯＳＥＷ９６〕
で３回洗浄する。 ９．基質５０μｌをウェル当たりで適用し、試験プレー
トをカバーし、３７℃で２時間インキュベートする。 １０．次いでストック溶液１５０μｌ（０．２Ｍグリシ
ン＋０．２％ＳＤＳ，ｐＨ１１．７）を各ウェルに加え
る。 １１．ケイ光測定評価は励起波長３５５nmおよび発光波
長４６０nmでフルオロスキャン(Fluoroscan)II〔ＩＣＮ
バイオメディカルズ(ICN Biomedicals),Cat.No.78-611-
00〕により行う。 １２．同一実験に含まれた陽性コントロール（標準曲線
として精製融合タンパク質の希釈シリーズ）に関するケ
イ光値によって、融合タンパク質の未知濃度をサンプル
で決定する。
【００９０】実施例９ ＥＡＴ（酵素活性試験） 試験は下記の方法で行う： １．１０サンプル＋１陽性コントロール＋１陰性コント
ロールを９６ウェル微量滴定プレート（ポリスチレン，
レナー製，オーダー No.１２０５８）において８希釈段
階でｐＨ７．２のＰＢＳ中１％カゼインで１：２希釈
し、こうして各ウェルにはサンプル５０μｌを含有させ
る。 ２．基質５０μｌ〔２．５mM４‐メチルウンベリフェリ
ルβ‐Ｄ‐グルクロニド（シグマ製，オーダーNo.:Ｍ‐
９１３０，ｐＨ４．５の２００mM酢酸Ｎａ＋０．０１％
ＢＳＡ中）〕を各ウェルに加える。 ３．微量滴定プレートをカバーし、３７℃で２時間イン
キュベートする。 ４．次いでストック溶液１５０μｌ（０．２Ｍグリシン
＋０．２％ＳＤＳ，ｐＨ１１．７）を各ウェルに加え
る。 ５．ケイ光測定評価は励起波長３５５nmおよび発光波長
４６０nmでフルオロスキャンII（ＩＣＮバイオメディカ
ルズ，Cat.No.78-611-00）により行う。 ６．含まれた陽性コントロール（標準曲線として精製融
合タンパク質の希釈シリーズ）によって、サンプル濃度
を計算することができる。
ロールを９６ウェル微量滴定プレート（ポリスチレン，
レナー製，オーダー No.１２０５８）において８希釈段
階でｐＨ７．２のＰＢＳ中１％カゼインで１：２希釈
し、こうして各ウェルにはサンプル５０μｌを含有させ
る。 ２．基質５０μｌ〔２．５mM４‐メチルウンベリフェリ
ルβ‐Ｄ‐グルクロニド（シグマ製，オーダーNo.:Ｍ‐
９１３０，ｐＨ４．５の２００mM酢酸Ｎａ＋０．０１％
ＢＳＡ中）〕を各ウェルに加える。 ３．微量滴定プレートをカバーし、３７℃で２時間イン
キュベートする。 ４．次いでストック溶液１５０μｌ（０．２Ｍグリシン
＋０．２％ＳＤＳ，ｐＨ１１．７）を各ウェルに加え
る。 ５．ケイ光測定評価は励起波長３５５nmおよび発光波長
４６０nmでフルオロスキャンII（ＩＣＮバイオメディカ
ルズ，Cat.No.78-611-00）により行う。 ６．含まれた陽性コントロール（標準曲線として精製融
合タンパク質の希釈シリーズ）によって、サンプル濃度
を計算することができる。
【００９１】実施例１０ 二本鎖融合糖タンパク質の脱
シアリル化 二本鎖融合タンパク質をMurray(Methods in Enzymology
149:251(1987)) に従い脱シアリル化した。アガロース
にカップリングされた８単位のノイラミニダーゼ〔シグ
マ，クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium
perfringens)由来のタイプＸ‐Ａ〕をｐＨ５の１００m
M酢酸ナトリウム緩衝液４０mlで３回洗浄し、しかる後
１：１懸濁液として溶解させた。二本鎖融合タンパク質
（ｐＨ５の酢酸ナトリウム緩衝液中１mg/ml)１００mlを
この懸濁液に加え、しかる後３７℃で４時間穏やかに振
盪しながらインキュベートした。固定されたノイラミニ
ダーゼを遠心により除去し、融合タンパク質をＰＢＳに
対して一夜透析した。
シアリル化 二本鎖融合タンパク質をMurray(Methods in Enzymology
149:251(1987)) に従い脱シアリル化した。アガロース
にカップリングされた８単位のノイラミニダーゼ〔シグ
マ，クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium
perfringens)由来のタイプＸ‐Ａ〕をｐＨ５の１００m
M酢酸ナトリウム緩衝液４０mlで３回洗浄し、しかる後
１：１懸濁液として溶解させた。二本鎖融合タンパク質
（ｐＨ５の酢酸ナトリウム緩衝液中１mg/ml)１００mlを
この懸濁液に加え、しかる後３７℃で４時間穏やかに振
盪しながらインキュベートした。固定されたノイラミニ
ダーゼを遠心により除去し、融合タンパク質をＰＢＳに
対して一夜透析した。
【００９２】実施例１１ 修飾融合タンパク質の急速な
除去の証明 ヒト化二本鎖融合糖タンパク質１００mgをＥＰ‐Ａ‐５
０１，２１５明細書の第１０〜１１頁に記載されたよう
にＢＨＫトランスフェクタント上澄から精製した。精製
されたタンパク質を前記実施例に記載されたようにガラ
クトシル化または脱シアリル化した。こうして得られた
修飾タンパク質、この場合ではガラクトシル化されたヒ
ト化二本鎖融合タンパク質４００μｇ、をヌードマウス
に静脈注射した。マウスには１０６ＣＥＡ発現ヒト胃癌
細胞（Ｍｚ‐Ｓｔｏ‐１）を既に１０日前に皮下注射し
てある。種々の時間間隔で、マウスを殺し、機能上活性
な修飾タンパク質の濃度を、ＯＦＡＴまたはＥＡＴ（実
施例７、８および９参照）を用いて腫瘍、血漿および正
常組織で調べた。
除去の証明 ヒト化二本鎖融合糖タンパク質１００mgをＥＰ‐Ａ‐５
０１，２１５明細書の第１０〜１１頁に記載されたよう
にＢＨＫトランスフェクタント上澄から精製した。精製
されたタンパク質を前記実施例に記載されたようにガラ
クトシル化または脱シアリル化した。こうして得られた
修飾タンパク質、この場合ではガラクトシル化されたヒ
ト化二本鎖融合タンパク質４００μｇ、をヌードマウス
に静脈注射した。マウスには１０６ＣＥＡ発現ヒト胃癌
細胞（Ｍｚ‐Ｓｔｏ‐１）を既に１０日前に皮下注射し
てある。種々の時間間隔で、マウスを殺し、機能上活性
な修飾タンパク質の濃度を、ＯＦＡＴまたはＥＡＴ（実
施例７、８および９参照）を用いて腫瘍、血漿および正
常組織で調べた。
【００９３】各場合において１×１０６ＣＥＡ陰性ヒト
腫瘍（Ｏａｔ‐７５）で処置されたヌードマウスも抗原
コントロールとして用いた。加えて、同量のヒト化二本
鎖融合タンパク質（出発タンパク質）または固相ノイラ
ミニダーゼで処理されたヒト化二本鎖融合タンパク質サ
ンプル（脱シアリル化タンパク質）をタンパク質コント
ロールとして静脈注射した（実施例１０参照）。この代
表的実験において器官でみられる機能上活性なタンパク
質の量は表６および７に示されている。比較結果はＣＥ
Ａ陽性結腸癌、ＣＥＡ陽性直腸癌、肺のＣＥＡ陽性腺
癌、ＣＥＡ陽性膵臓癌、ＣＥＡ陽性甲状腺癌およびＣＥ
Ａ陽性乳癌の例を用いて同一動物モデル系でみられた。
腫瘍（Ｏａｔ‐７５）で処置されたヌードマウスも抗原
コントロールとして用いた。加えて、同量のヒト化二本
鎖融合タンパク質（出発タンパク質）または固相ノイラ
ミニダーゼで処理されたヒト化二本鎖融合タンパク質サ
ンプル（脱シアリル化タンパク質）をタンパク質コント
ロールとして静脈注射した（実施例１０参照）。この代
表的実験において器官でみられる機能上活性なタンパク
質の量は表６および７に示されている。比較結果はＣＥ
Ａ陽性結腸癌、ＣＥＡ陽性直腸癌、肺のＣＥＡ陽性腺
癌、ＣＥＡ陽性膵臓癌、ＣＥＡ陽性甲状腺癌およびＣＥ
Ａ陽性乳癌の例を用いて同一動物モデル系でみられた。
【００９４】標準化学療法の場合より優れた治療効果
は、適切な無毒性プロドラッグ、例えばＥＰ‐Ａ‐５１
１，９１７に記載されたものが用いられ、修飾タンパク
質が血漿から大部分除去されたかまたは正常組織で内面
化（internalize)および分解されたときに合わせてそれ
が適用されたときに実現できる。これらの効果は多量の
ガラクトースを関連修飾タンパク質に加えることで更に
一層改善して、薬物動態を最良にすることができる。も
っと他の改善は、グルコース、リン酸イオンまたはｍ‐
ヨードベンジルグアニジンを関連修飾タンパク質に加え
るか、あるいはこれらの化合物をタンパク質の前に注射
することで、Jahde ら(Cancer Res.52:6209(1992))によ
り記載された方法に従い実現できる。この方法では腫瘍
内のｐＨを低下させる。これは本発明による修飾および
未修飾タンパク質で用いられた酵素によるプロドラッグ
の触媒を更に効率的にする。一方、ＨＣＯ３ - も腫瘍で
ｐＨを低下させるために使用できる(Gullino et al.,J.
Nat.Cancer Inst.34:857(1965)) 。
は、適切な無毒性プロドラッグ、例えばＥＰ‐Ａ‐５１
１，９１７に記載されたものが用いられ、修飾タンパク
質が血漿から大部分除去されたかまたは正常組織で内面
化（internalize)および分解されたときに合わせてそれ
が適用されたときに実現できる。これらの効果は多量の
ガラクトースを関連修飾タンパク質に加えることで更に
一層改善して、薬物動態を最良にすることができる。も
っと他の改善は、グルコース、リン酸イオンまたはｍ‐
ヨードベンジルグアニジンを関連修飾タンパク質に加え
るか、あるいはこれらの化合物をタンパク質の前に注射
することで、Jahde ら(Cancer Res.52:6209(1992))によ
り記載された方法に従い実現できる。この方法では腫瘍
内のｐＨを低下させる。これは本発明による修飾および
未修飾タンパク質で用いられた酵素によるプロドラッグ
の触媒を更に効率的にする。一方、ＨＣＯ３ - も腫瘍で
ｐＨを低下させるために使用できる(Gullino et al.,J.
Nat.Cancer Inst.34:857(1965)) 。
【００９５】種々の修飾および変更が本発明の組成物お
よびプロセスに加えうることは当業者にとり明らかであ
ろう。このため、本発明はこのような修飾および変更を
カバーしていると考えられ、それらは添付された請求の
範囲およびそれらに相当する物の範囲内に属しなければ
ならない。前記で引用されたすべての公開文献の開示
は、各々が参考のため個別に本明細書の開示の一部とさ
れるのと同程度に、参考のためそれら全体でここに特に
本明細書の開示の一部とされる。３５ＵＳＣ§１１９下
の効果が請求されているドイツ特許出願Ｐ４３ １４
５５６．６の開示もその全体でここに特に本明細書の開
示の一部とされる。
よびプロセスに加えうることは当業者にとり明らかであ
ろう。このため、本発明はこのような修飾および変更を
カバーしていると考えられ、それらは添付された請求の
範囲およびそれらに相当する物の範囲内に属しなければ
ならない。前記で引用されたすべての公開文献の開示
は、各々が参考のため個別に本明細書の開示の一部とさ
れるのと同程度に、参考のためそれら全体でここに特に
本明細書の開示の一部とされる。３５ＵＳＣ§１１９下
の効果が請求されているドイツ特許出願Ｐ４３ １４
５５６．６の開示もその全体でここに特に本明細書の開
示の一部とされる。
【図１】図１はＶH およびＶL 遺伝子の増幅について示
したものである。
したものである。
【図２】図２はリンカーでＶL 遺伝子に連結されたＶH
から構成されるＰＣＲ断片について示したものである。
から構成されるＰＣＲ断片について示したものである。
【図３】図３はベクターを作製するためにプラスミドｐ
ＡＢ４３１ＶＨからのＨｉｎｄIII 〜ＢｇｌII制限断片
の除去について示したものである。
ＡＢ４３１ＶＨからのＨｉｎｄIII 〜ＢｇｌII制限断片
の除去について示したものである。
【図４】図４は、クローンがヒト化ｓＦｖ４３１／２
６、ヒンジエキソンおよび完全β‐グルクロニダーゼを
含み、クローンがＢＨＫ細胞中にトランスフェクトされ
るプラスミドｐＭＣＧ‐Ｅ１を作製するために、図３の
ベクター中への図２のＰＣＲ断片の挿入について示した
ものである。
６、ヒンジエキソンおよび完全β‐グルクロニダーゼを
含み、クローンがＢＨＫ細胞中にトランスフェクトされ
るプラスミドｐＭＣＧ‐Ｅ１を作製するために、図３の
ベクター中への図２のＰＣＲ断片の挿入について示した
ものである。
【図５】図５はトランスフェクトされたＢＨＫ細胞中に
ネオマイシン耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＲＭＨ１４
０について示したものである。
ネオマイシン耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＲＭＨ１４
０について示したものである。
【図６】図６はトランスフェクトされたＢＨＫ細胞中に
メトトレキセート耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＳＶ２
について示したものである。
メトトレキセート耐性遺伝子を運ぶプラスミドｐＳＶ２
について示したものである。
【図７】図７はＢｇｌII開裂部位のあるｓＦｖ断片を含
有したプラスミドクローンｐＫＢＯ１の構築について示
したものである。
有したプラスミドクローンｐＫＢＯ１の構築について示
したものである。
【図８】図８はリンカー配列で大腸菌β‐グルクロニダ
ーゼに結合されたｓＦｖ４３１／２６を含んだプラスミ
ドクローンｐＫＢＯ２の構築について示したものであ
る。
ーゼに結合されたｓＦｖ４３１／２６を含んだプラスミ
ドクローンｐＫＢＯ２の構築について示したものであ
る。
【図９】図９はヒト化ｓＦｖ４３１／２６、リンカーお
よび完全大腸菌β‐グルクロニダーゼを含んだプラスミ
ドクローンｐＫＢＯ３の構築について示したものであ
る。
よび完全大腸菌β‐グルクロニダーゼを含んだプラスミ
ドクローンｐＫＢＯ３の構築について示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/14 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/16 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ 8310−2Ｊ 33/535 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 5/16 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 ディーター、ホフマン ドイツ連邦共和国マールブルク、フォイエ ルドルンウェーク、12
Claims (22)
- 【請求項１】二機能性融合糖タンパク質または二機能性
糖タンパク質複合体を含んでなる化合物であって、 上記化合物が： ａ．酵素活性を有する少くとも１つの第一部分と； ｂ．腫瘍特異性抗原のエピトープと特異的に結合する少
くとも１つの第二部分と；そして ｃ．炭水化物補完体とを含んでなり、 ここで、上記炭水化物補完体がマンノース、ガラクトー
ス、Ｎ‐アセチルグルコサミン、ラクトースおよびフコ
ースからなる群より選択される少くとも１つの露出末端
炭水化物残基を含んでなるものである、化合物。 - 【請求項２】露出炭水化物残基が天然糖タンパク質の炭
水化物補完体の酵素分解により形成されるものである、
請求項１に記載の化合物。 - 【請求項３】酵素分解がエンドグリコシダーゼ、エキソ
グリコシダーゼ、ノイラミニダーゼ、およびそれらの組
合せからなる群より選択される酵素により行われる、請
求項２に記載の化合物。 - 【請求項４】露出炭水化物残基が天然糖タンパク質の炭
水化物補完体の化学分解により形成されるものである、
請求項１に記載の化合物。 - 【請求項５】露出炭水化物残基が化学的手段により化合
物に加えられる、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項６】第一部分が実質的に酵素からなる、請求項
１に記載の化合物。 - 【請求項７】酵素がペニシリンＧアミダーゼ、ペニシリ
ンＶアミダーゼ、β‐ラクタマーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、カルボキシペプチダーゼＧ２、カルボキシペプ
チダーゼＡ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクター
ゼ、ジアホラーゼ、アリールスルファターゼ、グリコシ
ダーゼ、β‐グルコシダーゼ、およびβ‐グルクロニダ
ーゼからなる群より選択されるものである、請求項６に
記載の化合物。 - 【請求項８】酵素が触媒抗体である、請求項６に記載の
化合物。 - 【請求項９】第二部分が結合する腫瘍細胞マーカーが、
ＣＥＡ、Ｎ‐ＣＡＭ、Ｎ‐カドヘリン、ＰＥＭ、ＧＩＣ
Ａ、ＴＡＧ‐７２、ＴＦβ、ＧＭ３、ＧＤ３、ＧＭ２、
ＧＤ２、ＧＴ３、ＨＭＷＭＡＡ、ｐＭｅ１１７、ｇｐ１
１３（Ｍｕｃ１８）、ｐ５３、ｐ９７、ＭＡＧＥ‐１、
ｇｐ１０５、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦ‐Ｒ、ＰＳＡ、トラン
スフェリン‐Ｒ、Ｐ‐糖タンパク質、およびサイトケラ
チンからなる群より選択される腫瘍関連抗原を含んでな
る、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項１０】第二部分が抗体またはその断片から実質
的になる、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項１１】抗体がモノクローナル抗体ＢＷ４３１／
２６またはその断片である、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項１２】第一部分と第二部分とがリンカー分子で
連結されている、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項１３】式ｈｕＴｕＭａｂ‐Ｌ‐β‐Ｇｌｕｃ
（ここでｈｕＴｕＭａｂはヒト腫瘍特異性モノクローナ
ル抗体またはその腫瘍結合性断片であり、Ｌはリンカー
分子でありおよびβ‐Ｇｌｕｃはヒトβ‐グルクロニダ
ーゼである）を有する、請求項１２に記載の化合物。 - 【請求項１４】ＣＨＯ細胞で合成された融合糖タンパク
質を含んでなるものであって、該細胞が上記糖タンパク
質の高レベルの発現用に選択されたものである、請求項
１に記載の化合物。 - 【請求項１５】露出炭水化物がガラクトースまたはマン
ノースである、請求項１に記載の化合物。 - 【請求項１６】露出炭水化物がラクトースである、請求
項１に記載の化合物。 - 【請求項１７】薬学上許容されるビヒクル中に、請求項
１に記載の化合物を含んでなる医薬製剤。 - 【請求項１８】薬学上許容されるビヒクル中に請求項１
に記載の化合物と、治療される腫瘍でｐＨを低下させう
る物質とを含んでなる医薬製剤。 - 【請求項１９】薬学上許容されるビヒクル中に、請求項
１に記載の化合物とガラクトースを含んでなる、医薬製
剤。 - 【請求項２０】ａ．腫瘍を有する被治療体に請求項１７
に記載の医薬製剤を第一段階として投与し、 ｂ．後に前記第一部分により腫瘍部位で細胞毒性薬物に
開裂される無毒性プロドラッグを第二段階として投与
し、それにより上記腫瘍が退行するようにする工程を含
んでなる、被治療体における腫瘍の治療方法。 - 【請求項２１】ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記
載の融合糖タンパク質をコードするＤＮＡを作製し、 ｂ）発現ベクターに上記ＤＮＡを挿入し、 ｃ）真核生物発現系で上記ＤＮＡを発現させ、そして、 ｄ）発現された融合糖タンパク質を単離する工程を含ん
でなる、融合糖タンパク質の製造法。 - 【請求項２２】発現系がトランスジェニック非ヒト哺乳
動物である、請求項２１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4314556A DE4314556A1 (de) | 1993-05-04 | 1993-05-04 | Modifizierte Antikörperenzymkonjugate und Fusionsproteine sowie ihre Anwendung zur tumorselektiven Therapie |
| DE4314556.6 | 1993-05-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06319554A true JPH06319554A (ja) | 1994-11-22 |
Family
ID=6487030
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6117524A Pending JPH06319554A (ja) | 1993-05-04 | 1994-05-06 | 修飾炭水化物補完体を有する二機能性糖タンパク質と腫瘍選択療法におけるそれらの用途 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8552159B2 (ja) |
| EP (1) | EP0623352B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06319554A (ja) |
| KR (1) | KR100387452B1 (ja) |
| AT (1) | ATE220921T1 (ja) |
| AU (1) | AU684750B2 (ja) |
| CA (1) | CA2122745C (ja) |
| DE (2) | DE4314556A1 (ja) |
| DK (1) | DK0623352T3 (ja) |
| ES (1) | ES2177554T3 (ja) |
| PT (1) | PT623352E (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021511013A (ja) * | 2018-01-04 | 2021-05-06 | シャンハイ ルーモサ セラピューティクス カンパニー リミテッド | シングルドメイン抗体−シトシンデアミナーゼ融合タンパク質 |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19513676A1 (de) * | 1995-04-11 | 1996-10-17 | Behringwerke Ag | Cytoplasmatische Expression von Antikörpern, Antikörperfragmenten und Antikörperfragmentfusionsmolekülen in E.coli |
| DK0795334T3 (da) * | 1996-03-12 | 2006-06-06 | Sanofi Aventis Deutschland | Nye prodrugs til behandling af tumorer og betændelsessygdomme |
| EP1176195B1 (en) | 1999-04-09 | 2013-05-22 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for controlling the activity of immunologically functional molecule |
| US6946292B2 (en) | 2000-10-06 | 2005-09-20 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity |
| CA2481920A1 (en) | 2002-04-09 | 2003-10-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Antibody composition-containing medicament |
| US7691810B2 (en) | 2003-10-09 | 2010-04-06 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method of producing recombinant antithrombin III composition |
| KR101540319B1 (ko) * | 2013-10-01 | 2015-07-30 | 한국생명공학연구원 | cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4859449A (en) * | 1987-09-14 | 1989-08-22 | Center For Molecular Medicine And Immunology | Modified antibodies for enhanced hepatocyte clearance |
| US5632990A (en) * | 1988-04-22 | 1997-05-27 | Cancer Research Campaign Tech. Ltd. | Treatment for tumors comprising conjugated antibody A5B7 and a prodrug |
| GB8809616D0 (en) * | 1988-04-22 | 1988-05-25 | Cancer Res Campaign Tech | Further improvements relating to drug delivery systems |
| US5135736A (en) * | 1988-08-15 | 1992-08-04 | Neorx Corporation | Covalently-linked complexes and methods for enhanced cytotoxicity and imaging |
| GB8905669D0 (en) * | 1989-03-13 | 1989-04-26 | Celltech Ltd | Modified antibodies |
| DE4106389A1 (de) * | 1991-02-28 | 1992-09-03 | Behringwerke Ag | Fusionsproteine zur prodrug-aktivierung, ihre herstellung und verwendung |
| GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
| AU656181B2 (en) * | 1991-05-03 | 1995-01-27 | Pasteur Sanofi Diagnostics | Heterobifunctional antibodies possessing dual catalytic and specific antigen binding properties and methods using them |
| DE4233152A1 (de) * | 1992-10-02 | 1994-04-07 | Behringwerke Ag | Antikörper-Enzym-Konjugate zur Prodrug-Aktivierung |
-
1993
- 1993-05-04 DE DE4314556A patent/DE4314556A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-04-25 DE DE69431018T patent/DE69431018T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-25 AT AT94106394T patent/ATE220921T1/de active
- 1994-04-25 PT PT94106394T patent/PT623352E/pt unknown
- 1994-04-25 EP EP94106394A patent/EP0623352B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-25 ES ES94106394T patent/ES2177554T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-25 DK DK94106394T patent/DK0623352T3/da active
- 1994-05-02 AU AU61829/94A patent/AU684750B2/en not_active Expired
- 1994-05-03 CA CA2122745A patent/CA2122745C/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-04 KR KR1019940009786A patent/KR100387452B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-06 JP JP6117524A patent/JPH06319554A/ja active Pending
-
2004
- 2004-04-02 US US10/815,925 patent/US8552159B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021511013A (ja) * | 2018-01-04 | 2021-05-06 | シャンハイ ルーモサ セラピューティクス カンパニー リミテッド | シングルドメイン抗体−シトシンデアミナーゼ融合タンパク質 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040202646A1 (en) | 2004-10-14 |
| EP0623352B1 (en) | 2002-07-24 |
| EP0623352A3 (en) | 1995-02-22 |
| DE69431018T2 (de) | 2003-02-27 |
| PT623352E (pt) | 2002-12-31 |
| EP0623352A2 (en) | 1994-11-09 |
| KR100387452B1 (ko) | 2003-11-13 |
| DE69431018D1 (de) | 2002-08-29 |
| US8552159B2 (en) | 2013-10-08 |
| DK0623352T3 (da) | 2002-11-11 |
| DE4314556A1 (de) | 1994-11-10 |
| ATE220921T1 (de) | 2002-08-15 |
| AU6182994A (en) | 1994-11-10 |
| CA2122745C (en) | 2010-06-22 |
| CA2122745A1 (en) | 1994-11-05 |
| AU684750B2 (en) | 1998-01-08 |
| ES2177554T3 (es) | 2002-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU672431B2 (en) | Fusion proteins for prodrug activation | |
| US6077835A (en) | Delivery of compacted nucleic acid to cells | |
| AU720223B2 (en) | Serpin enzyme complex receptor-mediated gene transfer | |
| US5844107A (en) | Compacted nucleic acids and their delivery to cells | |
| ES2260768T3 (es) | Metodos para modificar restos de hidratos de carbono. | |
| JPH10503469A (ja) | 緻密にした核酸および細胞へのデリバリ | |
| JP2008535475A (ja) | Ｑ３ｓｐａｒｃ欠失変異体及びその使用 | |
| SK80997A3 (en) | Pharmaceutical composition containing an enzymatic component being specific for the target cells | |
| JP3524933B2 (ja) | プロドラッグ活性化のための融合タンパク質、その製造および使用 | |
| KR100387452B1 (ko) | 변형된탄수화물보체를갖는이작용성당단백질및이를포함하는약제학적제제 | |
| IE83238B1 (en) | Fusion proteins with monoclonal antibody, linker and beta glucuronidase for prodrug activation; preparation and use thereof | |
| US6475486B1 (en) | Glycosyl-etoposide prodrugs, a process for preparation thereof and the use thereof in combination with functionalized tumor-specific enzyme conjugates | |
| JPH10509326A (ja) | 酵素プロドラッグ治療 | |
| JP2002534077A (ja) | トランスジェニック動物における分泌型ヒトアルファ−フェト蛋白質の発現 | |
| JPH0585532B2 (ja) | ||
| JP2002509423A (ja) | 単離されたポリシアリルトランスフェラーゼ、それらをコードする核酸分子、それらの製造方法及び使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040126 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040227 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040628 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20040818 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20041119 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20070316 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20070322 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20071029 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20071102 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080128 |