JPH06335332A - ベントグラスの形質転換植物体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 同種の雑草に対する病虫害や除草剤に対し大
きな抵抗力を持ち、好ましくは前記雑草に対し強靱な生
命力を持つ、ベントグラスの形質転換植物体の製造方法
を提供する。 【構成】 ベントグラスの種子、幼根、ランナーなどか
ら再分化能を有するカルスを誘導する手段と、上記誘導
カルスより懸濁培養細胞を得、さらに該細胞からプロト
プラストを単離する手段と、上記単離したプロトプラス
トへ外来遺伝子を導入する電気的手段と、上記遺伝子を
導入したプロトプラストを、培養してカルスを再度形成
させ、選抜する手段と、上記選別したカルスより形質転
換した植物体を再生する手段とを組合せ構成する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ランナー型ベントグラ
ス（クリーピングベントグラス）の種子などから誘導さ
れた再分化能を持つカルスを培養して得られた培養細胞
より単離したプロトプラストへの外来遺伝子を導入し、
ベントグラスの所望の形質転換を可能にした形質転換植
物体の製造方法に関する。

【０００２】

【本発明の概要】ベントグラスの細胞レベルでの育種技
術はここ数年で大きく進展し、レッドトップとクリーピ
ングベントグラス‘ぺンクロス’ではembryogenic call
usからの植物体再生、プロトプラストからの植物体再生
に成功し、さらにレッドトップでは、形質転換体の作出
も報告されている。本研究では、今回、ベントグラスの
なかでも重要な品種であるベンクロスを材料として、エ
レクトロポレーションによってｂａｒ遺伝子を導入し、
形質転換に成功した。

【０００３】まず、形質転換細胞の選抜に用いるビアラ
ホスに対するベンクロスの感受性を、コロニー成長およ
び再分化植物体について検討した。懸濁培養細胞からプ
ロトプラストを単離し、アガロースビーズ法とナース培
養法を併用した方法で１４日間培養し、その後、ナース
細胞を除去し、アガロースビーズを新しい培地に移すと
同時に、液体培地部分にビアラホスを終濃度で０〜５ｍ
ｇ／ｌとなるように添加して２週間培養した。その結
果、１ｍｇ／ｌ以上の濃度で完全にコロニー成長を抑制
することが出来た。また再分化植物体を０〜１．０ｍｇ
／ｍｌのビアラホスを含む培地に移し３週間培養した結
果、５ｍｇ／ｌ以上の濃度で完全に枯死した。

【０００４】次にエレクトロポレーションを行った。２
×１０⁶ protoplasts/mlの濃度でプロトプラストをエレ
クトロポレーション緩衝液に懸濁し、これに、終濃度で
２０μｇ／ｍｌとなるようにplasmid ＤＮＡおよびcarr
ier ＤＮＡを加え、４００Ｖ／ｃｍの減衰波を５０ｍｓ
ｅｃかけて遺伝子導入を行った。なお、Plasmid ＤＮ
ＡはｐＡＲＫ２２(３５Ｓ＋ｂａｒ) を用いた。エレク
トロポレーション後、プロトプラストを上記の方法で培
養し、１４日目に終濃度で１ｍｇ／ｌとなるようにビア
ラホスを添加して選抜を開始した。２〜３週間でビアラ
ホス耐性コロニーが確認でき、さらに、２ｍｇ／ｌのビ
アラホスを含む培地上で二次選抜を行った。Table 1に
二次選抜後に確認されたビアラホス耐性コロニーの出現
数を示す。ビアラホス耐性コロニーはその後増殖させ、
再分化培地に置床した。１〜２ヵ月でｓｈｏｏｔ形成が
確認された。ビアラホス耐性カルスからＤＮＡを単離し
サザン解析を行った結果、ｂａｒ遺伝子のＤＮＡへの組
み込みが確認された。また、形質転換カルスを、０〜５
０ｍｇ／ｌのビアラホスを含む液体培地に移したとこ
ろ、全ての濃度で増殖し耐性を示した。さらに、再分化
植物体を１０ｍｇ／ｌのビアラホスを含む培地に移した
が、枯死することなく成長を続け、耐性を示した。

【表１】 次に従来技術及びその問題点について説明する。

【０００５】

【従来の技術】従来、芝草であるベントグラスは、イネ
科のイチゴツナギ亜科に属するヌカボ属に分類され、そ
の品種改良は人工交雑や突然変異によってなされてき
た。上記人工交雑では、近縁種のみしか雑種が得られ
ず、特定の性質をベントグラスに与えることは不可能で
あった。また、突然変異法では、目的とする性質を得る
ことが困難でであり、再現性がなかった。然し、最近の
バイオ技術の急速な発展により、植物体を細胞までに分
解し、植物体をその細胞より自由に作り出すことが望ま
れ、ある特定の材料に対しては、細胞にまで分解する技
術、細胞を培養する技術、細胞から植物を再分化させる
技術が確立されており、これまで困難とされてきたイネ
科植物の細胞育種が可能になってきた。イネにおいて
は、「イネの細胞融合」が特開昭６３ー１７３５３０に
開示され、また、「イネの識別マーカーを利用した細胞
融合」が特開平１ー１７９６３５に開示され、イネの品
種改良に貢献されてきた。然し細胞融合の場合、融合し
て出来る植物は複２倍体の形となり、不必要で不利な遺
伝子も取り込まれることになる。

【０００６】そのため、必要な遺伝子のみの導入が当然
必要になるが、この遺伝子導入に最も一般的に使用され
るアグロバクテリウムを用いた手法の使用が、イネ科植
物にはその適用困難であるため、所要の効率的にして有
用な形質転換体の作出は困難とされてきた。然し、エレ
クトロポレーション法の普及に伴い、イネ科植物への遺
伝子導入が可能になつてきた。例えば、特開平１ー１８
１７９１号公報には、イネ科植物で機能するプロモータ
ー、外来遺伝子、ターミネーターを有するプラスミド
と、イネ科植物由来のプロトプラストとを液体媒体に懸
濁し、上記懸濁液に電気パルスを印加して前記プラスミ
ドをプロトプラスト内に導入した後、イネ培養細胞を含
有する培地で培養してコロニーを形成させ、該コロニー
より植物体を再生させて、形質転換させたイネ科植物を
作成する製造方法が開示されている。また、特開平１ー
６３３７３号公報には、プロトプラストまたはそれの誘
導細胞からトウモロコシ植物体を再生する方法、前記プ
ロトプラストのための源を構成する胚形成細胞培養体
（懸濁培養体またはカルス）、前記胚形成細胞培養体及
びカルスの製造方法、遺伝学的に変更されたプロトプラ
ストより再生されたトウモロコシ植物体、等に関する、
トウモロコシへの遺伝子導入を開示されている。また、
特開平２ー５８５７号公報には、イチゴツナギ亜科のイ
ネ科植物の植物体に再生され得るプロトプラストまたは
植物細胞内に発現可能の外因性ＤＮＡを安定的に組み入
れ、それらを利用してカルスを形成し、そのカルスか
ら、形質変換された前記植物の再生方法が開示され、特
に、カモガヤへの遺伝子導入などが挙げられている。

【０００７】然し、主要芝草であるベントグラスへの遺
伝子導入の文献による報告は、未だにされていない状況
である。ただ、前記特開平２ー５８５７には、前述のよ
うに、ベントグラスが属するイネ科のイチゴツナギ亜科
ヌカボ属への適用を示唆する記載があるが、具体的なプ
ロトプラスト培養方法や遺伝子導入の説明がなく、実施
例の記載もない。また、特開平３ー２６２４２６には、
ベントグラスの種子または幼苗細胞からカルスを作り、
カルスから培養細胞を作り、これらの細胞からプロトプ
ラストを調整し、該プロトプラストからカルスを再形成
し、再形成されたカルスを再分化してベントグラス植物
体を再生する方法が開示されているが、前記プロトプラ
ストへの遺伝子導入法は記載されていない。なお、浅野
らにより、［Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ，７９，２４７〜２５
２（１９９１）］にベントグラスの一種であるレッドト
ップについての遺伝子導入の報告がなされているが、ラ
ンナー型の主要ベントグラスであるクリーピングベント
グラスへの遺伝子導入の記載はない。

【０００８】一方ベントグラスのカルス、プロトプラス
トの培養についての報告は種々散見されており、その中
で特に主要芝草であるクリーピングベントグラスに関す
る文献を挙げると、例えば下記に示すように、カルス培
養系としては、 Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ． 第２２巻 第１１９３頁（１９８
２） Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ． 第２６巻 第１２４５頁（１９８
６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．第１０巻 第４５３頁
（１９９１） 植物組織培養学会、 ９（３）、２３３（１９９２） があり、プロトプラスト培養系としては、杉浦ら；日本
芝草学会春季大会、７１（１９９１）３／１５（１９９
１）発表がある。また、特開平３ー２６２４２６には、
前述したように、 ベントグラスの種子や幼苗等よりカルスの誘導→懸濁培
養による培養細胞／細胞塊の生成→プロトプラストの作
成→カルスの再生→植物体の再生 の工程より成る「ベントグラスのプロトプラストを利用
した植物再生方法」が開示されている。

【０００９】上記これらの方法は、植物体に再分化でき
るカルスを多数形成し、これらの多数のカルスより多数
の植物体再生能を保有するプロトプラストを作成し、こ
れらのプロトプラストより多数の植物体を再生できる
が、所要の形質転換を行なうことは無理であり不可であ
った。以上のように、該公知技術では、その適用が限定
されるものではない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】ところで、イネ科植物
のイチゴツナギ亜科に属し、ヌカボ属に分類されるベン
トグラスは、公園やゴルフ場などで多用されておるが、
その病虫害や雑草が大きな問題になつている。特に雑草
の駆除については、主たる雑草であるスズメノカタビラ
がベントグラスと同一のイチゴツナギ亜科に属するた
め、除草剤を使用すると、ベントグラスにも薬害を与え
枯死させてしまう問題があり、また、日本においては高
温多湿の気候が原因となり、真菌類がベントグラスに感
染しパッチ状、不定形状等の葉枯れ病状を呈し、場合に
よっては枯死に至る問題がある。また、害虫において
は、シバツトガ、タマナヤガ、マメコガネ等の幼虫が、
ベントグラスの根などを主食とするため、夏場これらの
幼虫が大量に発生した場合、ベントグラスを枯死にさせ
て大きな被害を受けることになる。

【００１１】上記状況にあって、これらに対応できる新
品種のベントグラスの早急な作出が強く望まれている。
本発明は上記事項に鑑みなされたもので、前記病虫害や
除草剤に対し大きな抵抗力をを持ち、好ましくは前記雑
草に対し強靱な生命力を持つ、有用なベントグラスの形
質転換植物体の製造方法を提供する事を目的とするもの
である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明はかかる技術的課
題を達成するために、不要な遺伝子の導入の恐れをなく
するため、ベントグラスの細胞内に希望する外来遺伝子
を直接導入するようにしたもので、ベントグラス（特に
芝草の主要品種であるクリーピングベントグラス）のプ
ロトプラストに所要の外来遺伝子を導入するプロトプラ
スト遺伝子導入手段法に、前記ベントグラスの種子等よ
り再分化能を有するカルスの誘導手段と、前記誘導した
カルスを懸濁液体培養により培養した細胞より、前記プ
ロトプラストを単離するプロトプラスト作出する手段
と、前記遺伝子を導入したプロプラストを培養してカル
スを再び形成させる手段と、該カルスより所要の形質転
換をしたベントグラス植物体を再生する手段とからなる
有用なベントグラスの形質転換植物体の製造方法を提案
するものである。

【００１３】即ち、 ベントグラスの種子、幼根、ランナーなどから、植
物成長物質などを用いて再分化能を有するカルスを誘導
する手段と、 上記誘導カルスを液体振盪培養により、懸濁培養細
胞を得て、その各細胞から酵素液を介して細胞壁を除去
し、プロトプラストを単離する手段と、 上記単離したプロトプラストへ外来遺伝子を導入す
る電気的手段と、 上記遺伝子を導入したプロトプラストを、培養して
カルスを再度形成させ、選抜する手段と、 上記選抜したカルスを再分化させて、形質転換した
植物体を再生する手段と、 を組合せ構成したことを特徴とするものである。

【００１４】なお、本発明の製造方法の適用できるベン
トグラスは、イネ科のイチゴツナギ（プーイデアエ）亜
科に属するヌカボ（アグロスティス）属に分類される各
種の芝草を指すもので、その名称は下記のとおりであ
る。 クリーピングベントグラス（Ａｇｒｏｓｔｉｓ ｓｔｏ
ｌｏｎｉｆｅｌａ） コロニアルベントグラス （Ａ． ｔｅｎ
ｕｉｓ） ベルベットベントグラス （Ａ． ｃａｎ
ｉｎａ）

【００１５】

【作用】上記手段により、再分化能を有するカルスを
誘導することが出来、手段により前記誘導カルスより
プロトプラストを単離することが出来、手段により所
要の外来遺伝子を導入することが出来、手段により前
記遺伝子を導入したカルスを再生することが出来、そし
てこれらと手段との組合せにより、求める形質転換を
した植物体を再生することが出来る。

【００１６】

【実施例】以下下記の実施例に基づき本発明を構成する
手段につき、工程順を具体的に説明する。但しその範囲
を限定するものではない。 カルス誘導手段 ベントグラスの完熟または未熟の種子、ランナーなどの
材料を、７０％エタノール水溶液及び次亜塩素酸ナトリ
ウム水溶液を用いて振盪滅菌し、よく水洗する。上記滅
菌処理をしたこれらの組織片を、植物成長物質（植物ホ
ルモン）などを含むＭＳ寒天培地等に無菌条件下で置床
する。なお、前記ランナーにおいては、成長点をメス等
により切りだし、前記培地に置床する。ついで、前記組
織片を置床した培地を、２０〜２８℃、０〜３０００Ｌ
ｕｘで１５〜２０時間日長の条件下でカルスを誘導す
る。（好ましくは、２５℃暗黒下でカルスを誘導す
る。） 上記条件下で、前記組織片を置床後、カルスは１ヶ月で
形成され、さらに１〜３ヶ月同様の培地で継代培養を続
けた後、カルス中から形成される再分化能を有する（エ
ンブリオジェニックな）カルスを選抜する。上記植物成
長物質は、カルス培養細胞を誘導維持するためには、オ
ーキシンが必要で、単独、または、低濃度のサイトカイ
ニンを組み合わせる。前記オーキシンとしては、２、４
−ジクロロフェノキシ酢酸（２、４−Ｄ）、または、ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）、 また
は、３−アミノ−３、４、６−トリクロロピコリン酸
（Ｐｉｃｌｏｒａｍ）または３、６−ジクロロ−２−メ
チルベンゼン酸（ＤＩＣＡＭＢＡ） 前記サイトカイニンとしては、カイネチン（Ｋｉｎｅｔ
ｉｎ）または、ゼアチン（Ｚｅａｔｉｎ）または、ベン
ジルアデニン（ＢＡ）等が挙げられる。

【００１７】 懸濁培養細胞からプロトプラストを単
離する手段 前記手段において選抜された再分化能を持つカルス
を、植物成長物質を含むＭＳ、Ｎ６、ＡＡ、Ｒ２ 培地
等で液体振盪培養をして、懸濁培養細胞を得る。つい
で、上記懸濁培養細胞から下記のようにしてプロトプラ
ストを単離する。即ち、セルラーゼ、マセロザイム、ド
リセラーゼ、ペクトリアーゼ等を含む酵素液中で、前記
培養細胞を１５〜３０℃、０〜５０ｒｐｍ、１〜１８時
間処理することにより行なわれ、前記細胞の細胞壁が取
り除かれプロトプラストが得られる。 ついで、上記酵
素処理により細胞壁を取り除かれた細胞、即ちプロトプ
ラストを、３０〜１００μｍのナイロンメッシュを通し
て、未消化組織を取り除き、さらに洗浄液で洗浄する。

【００１８】下記に、前記洗浄液及び洗浄操作につき説
明する。前記洗浄液は、０.３〜０.８ Ｍ マニトー
ル、０.１〜０.８ ｍＭ 塩化カルシウム２水塩 を含む
水溶液で、前記マニトールの濃度により浸透圧を加減す
る。 洗浄は次のようにして行なう。即ち、上記洗浄液
を加えたプロトプラスト液中でペピット操作により注意
深く懸濁し、５００〜２０００ｒｐｍで３〜１６ｍｉｎ
遠心分離する。分離後沈澱しているプロトプラスト層を
壊さぬように不要の上澄み部分を取り除く。さらに新し
い洗浄液を加えさらにペピットで懸濁する。この操作を
２〜４回繰り返して酵素液を完全に除去する。上記洗浄
工程において、最も注意すべき点は、懸濁に際してはプ
ロトプラストを破損しないように注意深く行い、且つ短
時間の内に洗浄を終了するようにすることが必要で、こ
れらの点を等閑にするとプロトプラストの破損が増大す
る上にプロトプラストの生存率も低下する。

【００１９】 プロトプラストへの外来遺伝子導入の
ための電気的手段 電気的手段としては高電圧の電気パルスによりプロトプ
ラストの細胞膜に１時的に孔をあけ、外来遺伝子を導入
するエレクトロポレーション法により行なう。まず、上
記のようにして精製された再分化能を有するプロトプラ
ストを、５×１０⁴〜５×１０⁷個／ｍｌの濃度になるよ
うに緩衝液に懸濁し、ミクロチューブに０.５ｍｌずつ
分注する。前記緩衝液は、マニトール、塩化カリウム、
塩化カルシウム２水塩、ＭＥＳ等を含むもので、あらか
じめ２〜１０℃に冷却しされている。ついで、環状ある
いは線状プラスミドＤＮＡ、キャリアーＤＮＡを添加す
る。上記プラスミドＤＮＡとしては、耐性用遺伝子ｐＧ
Ｌ２やＧＵＳ遺伝子ｐＢＩ２２１や除草剤耐性遺伝子ｐ
ＡＲＫ２２やシャトルベクタ遺伝子ｐＴＲＡ４０３等が
あげられ、この方法は１度に２種類以上の遺伝子の導入
が可能である。ついで、前記チュウブを氷中に２０ｍｉ
ｎ置き冷却したのち、キュウベットに移したのち、エレ
クトロポレーション装置の電極を挿入して、８００〜１
０００μＦ・３００〜９００Ｖの減衰波を２０〜６０ｍ
ｓｅｃ印加する。印加終了後、直ちにキュウペットから
チユウブへ移し、氷中で２０ｍｉｎ冷却する。

【００２０】 遺伝子導入をしたプロトプラストを、
培養してカルスを再度形成させる手段 遺伝子導入処理したプロトプラストを５〜１５％グルコ
ース、０〜５ｍｇ／ｌの植物成長物質を含んだＭＳ、Ｋ
Ｍ８ｐ、Ｂ５、Ｒ２などの液体培地に再懸濁する。この
懸濁液を液体状態である低融点アガロース（３０〜４０
℃）と混合し、シャーレ中で固化させる。なおこの際、
プロトプラストの濃度は、５×１０⁴ 〜５×１０⁶ 個／
ｍｌになるようにあらかじめ調整しておく。ついで、上
記固化したアガロース片を、前記液体培地と同様の成分
の液体培地またはＡＡ培地中に展開して、１５〜３０
℃、暗黒下で、０〜５０ｒｐｍの振盪懸濁培養する。つ
いで、上記培養を４〜１４日続けた後、培養細胞だけを
取りだし、同じ成分の新しい培地でさらに同じ条件下
で、５〜１０日間培養する。ついで、前記アガロース片
から増殖してきたカルスの中より、遺伝子の導入された
カルスのみを、選抜して取出し、植物成長物質を含むＭ
Ｓ固体培地に置床する。なお、上記選抜は例えば前記プ
ラスミドＤＮＡのｐＧＬ２とＧＵＳ遺伝子ｐＢＩ２２１
とを同時に導入すると、簡単に選抜が出来る。

【００２１】 カルスを再分化させて形質転換した植
物体の再生の手段 上記培養を７〜１５日間続けた後、成長したカルスをサ
イトカイニンを含むかまたは含むＭＳ固体培地に継代培
養をする。ついで、上記培養を７〜１５日続けることに
より、前記カルスは再分化して、求める形質転換した植
物体を得ることが出来る。なお、上記サイトカイニンと
しては、Ｋｉｎｅｔｉｎ、ＢＡ、Ｚｅａｔｉｎ等が好ま
しい。

【００２２】次に本発明の他の実施例について説明す
る。 （１）プロトプラストの単離 クリーピングベントグラスの一品種であるペンクロスの
種子を滅菌後、オーキシンを含むＭＳ寒天培地上に置床
し、カルスを誘導した。２〜３ヵ月間カルスを培養し、
この中からエンブリオジェニックなカルスを選抜し、オ
ーキシンなどを含むＡＡ培地で振とう培養し、サスペン
ジョン細胞を得た。このサスペンジョン細胞の中から再
分化能を有する系を選抜し、前培養培地中で３〜５日培
養し、酵素処理した。酵素処理は、セルラーゼＲＳ、ペ
クトリアーゼＹ−２３、マニトール、ＭＥＳ、（ｐＨ＝
５．６）を含む酵素液で２５℃、暗条件下で３〜４時間
処理した。処理後、１００μｍ及び２０μｍのナイロン
メッシュで酵素液を濾過し、洗浄液を加えた後、遠心分
離（１０００ｒｐｍで５〜１０分）して沈降したプロト
プラストを集め、さらに２回洗浄液で洗浄した。

【００２３】（２）電気処理 精製したプロトプラストを５×１０⁶ 個／ｍｌの濃度に
なるように約５℃に冷却した緩衝液に懸濁させた。懸濁
液は、滅菌したチューブに０．５ｍｌずつ分注しておい
た。この懸濁液にプロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓ、
外来遺伝子としてｐＡＲＫ２２、ターミネーターとして
ＮＯＳを連結し、ＰＴＺ１８Ｒに組み込んだベクターを
２０μｇ／ｍｌ、キャリアＤＮＡとしてｃａｌｆ ｔｈ
ｙｍｕｓ ＤＮＡを２０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、約
２０分氷中で冷却した。冷却後、プラスチックキュベッ
トに移し、エレクトロポレーション装置の電極を差し込
み、電気処理した。この時、５００Ｖ／ｃｍ、３０ｍｓ
ｐｃの減衰波をかけた。パルス印加後、氷中で２０分程
度冷却した。この時減衰波は３００〜７５０Ｖ／ｃｍ、
２０〜６０ｍｓｐｃの範囲ならば特に問題が生じない。

【００２４】（３）プロトプラストの培養 プロトプラストの培養は図１に示すように、ミックスナ
ース法で行ない、導入処理したプロトプラストを、ＫＭ
８Ｐ培地３を含むプロトプラスト培養液に再懸濁し、こ
の懸濁液を約４０℃程度に冷却した低融点アガロース液
と混合し、６ｃｍシャーレ中で固化した。この時、アガ
ロース片の厚さは、０．５〜１．０ｍｍになるように
し、細胞の密度は１．０×１０⁶ 個／ｍｌとした。プロ
トプラストを含むアガロースをプロトプラスト液５ｍｌ
中に展開し、さらにサスペンジョン細胞４を１００ｍ
ｇ、ナース細胞として入れ、培養した。プロトプラスト
の培養は２５℃、暗条件下で３０〜５０ｒｐｍで振とう
させた。

【００２５】（４）形質転換細胞の選抜 ７〜１５日間、プロトプラストを培養した後、ナース細
胞を除き、培養液で洗浄し、さらに培養を続けた。この
とき、第１次選抜として、ビアラホスを１．０ｍｇ／ｌ
濃度になるように添加した。１５〜２０日後、耐性を示
したコロニーをアガロース片ごと、増殖培地に移し、ビ
アラフォスが２．０ｍｇ／ｌ濃度になるように添加し、
第２選抜を行なった。ここで増殖したコロニーを選抜し
た。

【００２６】（５）再分化 選抜されたカルスを再分化固体培地に移し、７〜１５日
培養することにより、再分化し、植物体を得た。

【００２７】（６）形質転換の調査 得られた形質転換体により、常法に従って、ＤＮＡを抽
出し、サザンハイブリダイゼーションによって、外来遺
伝子の存在を確認した。なお、ハイブリダイゼーション
に使用したプローブは、ｐＡＲＫ２２をＢａｍＨＩ、Ｅ
ｃｏＲＩで切断した部位（約０．９Ｋｂｐ）とした。次
に前記実施例において使用した培地について説明する。

【００２８】（１）プロトプラスト単離 ａ、（振とう培地）ＡＡ無機塩、オーキシン２，４−Ｄ
３mｇ／ｌ，２％ショ糖，３％ソルビトール，２００ｍ
ｇ／ｌカゼイン加水分解物，５ｍＭ ＭＥＳ ＰＨ＝
５．８ ｂ、（前培養）ショ糖をソルビトールにした培地を用い
る。 ｃ、酵素液にはＭＳ無機塩、０．５Ｍマニトール、３ｍ
Ｍ ＭＥＳ，７ｍＭ塩化カルシウム２水塩 ３％セルラーゼＲＳ、０．１％ペクトリアーゼＹ−２
３、１％ドリセラーゼ、２％マセロザイムＲ１０ ＰＨ
＝５．８ ｄ、洗浄液 ０．３Ｍマニトール ０．３Ｍソルビトール ０．２５ｍＭ塩化カルシウム２水塩（CaCl₂2H₂O）ＰＨ
＝５．８

【００２９】（２）電気処理 ａ、緩衝液 ７ｍＭ 塩化カリウム（KCl） ４ｍＭ 塩化カルシウム２水塩（CaCl₂2H₂O） ０．５ｍＭ ＭＥＳ ０．５Ｍ マニトール ＰＨ＝５．８

【００３０】（３）プロトプラスト培養 ＫＭ８Ｐ培地，オーキシン２，４−Ｄ ０．５ｍｇ／ｌ ０．４Ｍグルコース ０．８％アガロース（低融点）

【００３１】（４）選抜 （増殖培地） ＭＳ培地 オーキシン２，４−Ｄ １．０ｍｇ／ｌ ０．８％アガロース ３％ショ糖，３％ソルビトール

【００３２】（５）再分化 再分化固体培地 ＭＳ培地 ホルモンフリー又はカイネチン１mｇ／ｌ ３％ショ糖 ０．３％ゲランガム ２００ｍｇ／ｌカゼイン加水分解物

【００３３】尚ＭＥＳとは2-(N-Morpholino)ethanesulf
onic acid, monohydrateを指す。又前記ｐＡＲＫ２２遺
伝子はｂａｒ遺伝子と呼ばれ、除草剤ビアラホスに耐性
を示す。つまり、ｂａｒ遺伝子を有していない植物はビ
アラホスを与えると枯死するが、ｂａｒ遺伝子が導入さ
れれば、枯死せずに成長する。ｐＡＲＫ２２遺伝子は特
開昭６３−２５１０８７号，特開昭６１−５８５８９号
に開示されている。ＴＰＺ１８Ｒは東洋紡（株）で市販
しているベクターである。

【００３４】

【発明の効果】以上、記載した如く本発明によれば、従
来不可能とされてきたベントグラス特にクリーピングベ
ントグラスにおける、プロトプラストへの外来遺伝子の
導入を可能にし、そのため、同種の雑草に対し病虫害や
除草剤に大きな抵抗力を持たせることが出来、また使用
する遺伝子によっては前記雑草に対し強靱な生命力を持
つ有用な形質転換植物を得ることが出来る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ミックスナース法に基づくプロトプラストの培
養概要図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ベントグラスの種子、幼根、ランナーな
   どから、植物成長物質などを用いて再分化能を有するカ
   ルスを誘導する手段と、 上記誘導カルスを液体懸濁培養して、その培養細胞から
   酵素液を介してプロトプラストを単離する手段と、 上記単離したプロトプラストへの外来遺伝子導入の手段
   と、 上記遺伝子を導入したプロトプラストを、培養してカル
   スを再度形成させ、選別する手段と、 上記選別したカルスを再分化させて、形質転換した植物
   体を再生する手段と、を組合せ構成したことを特徴とす
   るベントグラスの形質転換植物体の製造方法。
2. 【請求項２】 前記ベントグラスは、クリーピングベン
   トグラスであることを特徴とする請求項１記載のベント
   グラスの形質転換植物体の製造方法。
3. 【請求項３】 前記外来遺伝子の導入は、エレクトロポ
   レーション法により構成した請求項１記載のベントグラ
   スの形質転換植物体の製造方法。