JPH0634005B2 - 細胞の電気化学的識別方法 - Google Patents
細胞の電気化学的識別方法Info
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- JPH0634005B2 JPH0634005B2 JP58221388A JP22138883A JPH0634005B2 JP H0634005 B2 JPH0634005 B2 JP H0634005B2 JP 58221388 A JP58221388 A JP 58221388A JP 22138883 A JP22138883 A JP 22138883A JP H0634005 B2 JPH0634005 B2 JP H0634005B2
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- cell
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は各種細胞の電気化学的識別方法に係わり、より
詳しくは微生物や動植物等の細胞の新規な計数方法及び
それら細胞の種類の新規な判別方法に関する。
詳しくは微生物や動植物等の細胞の新規な計数方法及び
それら細胞の種類の新規な判別方法に関する。
微生物等の種類の分類学的識別乃至同定は、臨床検査分
野を始めとして広汎な各種産業分野等に於いて極めて重
要な位置を占めているものであるが、その実施は所謂選
択培地を使用したコロニー計数法、顕微鏡直接観察法等
に依るものであるため、著しく煩雑且つ長時間を要する
ものとならざるを得なかった。
野を始めとして広汎な各種産業分野等に於いて極めて重
要な位置を占めているものであるが、その実施は所謂選
択培地を使用したコロニー計数法、顕微鏡直接観察法等
に依るものであるため、著しく煩雑且つ長時間を要する
ものとならざるを得なかった。
他方、本発明者らは、先に生細胞が電極に直接接触する
と電流が得られる現象を発見し、この現象を利用した電
気化学的菌数計数法を提案した〔アナリティカ ケミカ
アクタ、Anal. Chim.Acta，98，25(1978)；アプライ
ド アンド エンバイアンメンタル マイクロバイオロ
ジー、Appl.Environ. Microbiol.，37,117(1979)；及
び、ヨーロピアン ジャーナル オブ アプライド マ
イクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー、Eu
r. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.，10，125(198
0)〕ものであるが、細胞の種類、菌学的性質等の識別更
にはその機作等に関しては全然未解明であった。
と電流が得られる現象を発見し、この現象を利用した電
気化学的菌数計数法を提案した〔アナリティカ ケミカ
アクタ、Anal. Chim.Acta，98，25(1978)；アプライ
ド アンド エンバイアンメンタル マイクロバイオロ
ジー、Appl.Environ. Microbiol.，37,117(1979)；及
び、ヨーロピアン ジャーナル オブ アプライド マ
イクロバイオロジー アンド バイオテクノロジー、Eu
r. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.，10，125(198
0)〕ものであるが、細胞の種類、菌学的性質等の識別更
にはその機作等に関しては全然未解明であった。
上記に鑑み本発明者らは更に鋭意研究の結果、細胞と作
用電極との接触で得られる電流は、主として、細胞の細
胞壁中に存在する補酵素Ａ乃至類似物等の活性物質と電
極間の電子の授受によるものであること、及び、所謂サ
イクリックボルタメトリを始めとして、微分パルスボル
タメトリ、微分パルスポーラログラフ、位相差弁別交流
ポーラログラフ或いは矩形波ポーラログラフ等々の手法
に準じて細胞に走査電位を印加し、生起する電流値又は
微分電流値を測定すれば極めて高精度に細胞の種類が識
別され得ることを知見した。
用電極との接触で得られる電流は、主として、細胞の細
胞壁中に存在する補酵素Ａ乃至類似物等の活性物質と電
極間の電子の授受によるものであること、及び、所謂サ
イクリックボルタメトリを始めとして、微分パルスボル
タメトリ、微分パルスポーラログラフ、位相差弁別交流
ポーラログラフ或いは矩形波ポーラログラフ等々の手法
に準じて細胞に走査電位を印加し、生起する電流値又は
微分電流値を測定すれば極めて高精度に細胞の種類が識
別され得ることを知見した。
更に、微分パルスボルタメトリ、微分パルスポーラログ
ラフ、位相差弁別交流ポーラログラフ或いは矩形波ポー
ラログラフ等々の手法に準じて、細胞に漸増走査電位と
これに重畳された適切な微小電位とを印加し、４，４′
−ビピリジンにより増強されて生起する微分電流値を測
定すれば極めて高精度に細胞の種類が識別され得ること
を知見した。
ラフ、位相差弁別交流ポーラログラフ或いは矩形波ポー
ラログラフ等々の手法に準じて、細胞に漸増走査電位と
これに重畳された適切な微小電位とを印加し、４，４′
−ビピリジンにより増強されて生起する微分電流値を測
定すれば極めて高精度に細胞の種類が識別され得ること
を知見した。
すなわち、上記方法により得られる電流−電位曲線（ボ
ルタモグラム、Voltammogram）又は微分電流−電位曲線
（微分パルスボルタモグラム）、乃至電流値又は微分電
流値の極値を与える電位値（ピーク電位値）、或いは曲
線パターン等は、細胞の種類に応じて相互に相違するの
で、これにより各細胞（微生物）相互の弁別、固定が極
めて明瞭に達成され得るものとなる。なお、上記のピー
ク電位値は、各種ポーラログラフの手法によれば半波電
位値として求められるものである。
ルタモグラム、Voltammogram）又は微分電流−電位曲線
（微分パルスボルタモグラム）、乃至電流値又は微分電
流値の極値を与える電位値（ピーク電位値）、或いは曲
線パターン等は、細胞の種類に応じて相互に相違するの
で、これにより各細胞（微生物）相互の弁別、固定が極
めて明瞭に達成され得るものとなる。なお、上記のピー
ク電位値は、各種ポーラログラフの手法によれば半波電
位値として求められるものである。
特に、本発明の識別方法においては、メンブラン・フィ
ルタ等の支持体上に細胞等を高密度に集積させ、作用電
極に接触させれば、増強された電流値又は微分電流値が
観測されるので、例えば、測定対象が細胞希薄懸濁液等
の場合も、これをフィルタ処理して支持体（濾材）上に
集積させて測定することにより、明瞭判明な識別方法を
提供するものである。
ルタ等の支持体上に細胞等を高密度に集積させ、作用電
極に接触させれば、増強された電流値又は微分電流値が
観測されるので、例えば、測定対象が細胞希薄懸濁液等
の場合も、これをフィルタ処理して支持体（濾材）上に
集積させて測定することにより、明瞭判明な識別方法を
提供するものである。
従って、本発明は、 作用電極及び対向電極を浸漬した液体中で、支持体に集
積された細胞又は細胞壁片と前記作用電極とを接触さ
せ、前記作用電極に走査電位を印加し、走査電位の印加
により生起する電流値又は微分電流値を測定する工程を
含むことを特徴とする細胞の電気化学的識別方法に関す
る。
積された細胞又は細胞壁片と前記作用電極とを接触さ
せ、前記作用電極に走査電位を印加し、走査電位の印加
により生起する電流値又は微分電流値を測定する工程を
含むことを特徴とする細胞の電気化学的識別方法に関す
る。
以下、本発明の構成等について、より詳細に分説する。
測定乃至制御対象 細菌類、放線菌、カビ類、微細藻類、酵母類等の各種微
生物、赤血球、白血球、腫瘍細胞及び培養動植物細胞等
々の各種動植物細胞など、殆ど全ての細胞が識別乃至制
御対象となり得る。
生物、赤血球、白血球、腫瘍細胞及び培養動植物細胞等
々の各種動植物細胞など、殆ど全ての細胞が識別乃至制
御対象となり得る。
又、本発明方法においては、生細胞をそのまま用いるの
みでなく、例えば、生細胞を超音波破壊処理して得られ
る溶出液を放出した細胞、主に細胞壁を用いてもよい。
みでなく、例えば、生細胞を超音波破壊処理して得られ
る溶出液を放出した細胞、主に細胞壁を用いてもよい。
細胞の識別乃至判定 ボルタメトリ等によって、作用電極に走査電位を印加
し、走査電位の印加により生起する電流値又は微分電流
値を測定することにより得られる、細胞−電極間のピー
ク電位値或いは電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線
の形状は、測定に用いられる細胞の細胞壁或いは細胞膜
の特性に起因するものである。
し、走査電位の印加により生起する電流値又は微分電流
値を測定することにより得られる、細胞−電極間のピー
ク電位値或いは電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線
の形状は、測定に用いられる細胞の細胞壁或いは細胞膜
の特性に起因するものである。
例えば後記各実施例に示す通り、バチルス・スブチリス
（Bacillus subtilis）、ラクトバチリス・ファーメン
タム（Lactobachillus fermentum）、ストレプトコッカ
ス・サンギス（Streptococcus sanguis）及びスタフィ
ロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcusepider
midis）のようなグラム陽性菌に於けるピーク電位値、
電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線と、上記グラム
陽性菌よりも複雑な細胞壁構造を有する大腸菌（Escher
ichia coli）及びサルモネラ・チィフィムリウム（Salm
onellatyphymurium）のようなグラム陰性菌に於けるピ
ーク電位値、電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線と
の間には明確な差異が見られる。
（Bacillus subtilis）、ラクトバチリス・ファーメン
タム（Lactobachillus fermentum）、ストレプトコッカ
ス・サンギス（Streptococcus sanguis）及びスタフィ
ロコッカス・エピデルミディス（Staphylococcusepider
midis）のようなグラム陽性菌に於けるピーク電位値、
電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線と、上記グラム
陽性菌よりも複雑な細胞壁構造を有する大腸菌（Escher
ichia coli）及びサルモネラ・チィフィムリウム（Salm
onellatyphymurium）のようなグラム陰性菌に於けるピ
ーク電位値、電流−電位曲線又は微分電流−電位曲線と
の間には明確な差異が見られる。
従って、本発明方法に依れば、多種多様の細胞の識別、
例えば、各種細胞の菌学的弁別、同定、具体的には、グ
ラム陰陽性菌の分別、所謂エイムズ(Ames)テストに於け
る変異復帰又は非復帰菌株の弁別等々、適切な測定条件
を設定すれば極めて広範囲に亘る識別が可能となるもの
である。
例えば、各種細胞の菌学的弁別、同定、具体的には、グ
ラム陰陽性菌の分別、所謂エイムズ(Ames)テストに於け
る変異復帰又は非復帰菌株の弁別等々、適切な測定条件
を設定すれば極めて広範囲に亘る識別が可能となるもの
である。
測定諸条件及び適用分野 装置としては通常の各種ボルタメトリ用装置が使用され
得るものであるが、サイクリックボルタメトリ用装置の
１例につき模式説明図を示せば第１図の通りである。
得るものであるが、サイクリックボルタメトリ用装置の
１例につき模式説明図を示せば第１図の通りである。
すなわち、例示の装置は作用電極１、対向電極２及び飽
和塩化ナトリウム甘汞電極（以下ＳＳＣＥという）、飽
和塩化カリウム甘汞電極（以下ＳＣＥという）等の参照
極３を具備する電解セル４、ポテンシオスタット５、線
型走査乃至掃引電源６及びＸＹ記録計乃至シンクロスコ
ープ７より構成されている。
和塩化ナトリウム甘汞電極（以下ＳＳＣＥという）、飽
和塩化カリウム甘汞電極（以下ＳＣＥという）等の参照
極３を具備する電解セル４、ポテンシオスタット５、線
型走査乃至掃引電源６及びＸＹ記録計乃至シンクロスコ
ープ７より構成されている。
ここに於いて、作用電極１、対向電極２としては通常の
白金、金、銀、水銀、炭素等々の電極及びこれらを電導
性高分子等で被覆等の各種修飾電極が使用され得、又、
対向電極２の電位が安定不変である場合は参照電極３を
欠く通常のポーラログラフと同等の回路構成で足りる。
白金、金、銀、水銀、炭素等々の電極及びこれらを電導
性高分子等で被覆等の各種修飾電極が使用され得、又、
対向電極２の電位が安定不変である場合は参照電極３を
欠く通常のポーラログラフと同等の回路構成で足りる。
尚、電解セルに関しては、本発明の具体例としては、第
３図に示すとおり、測定対象である細胞（１０７）を保
持する支持体乃至フィルタ（１０８）を接触させた作用
電極（１０５）、これを支えるプラスチック等のケース
（１０９）、対向電極（１０４）及びガラスチューブで
仕切られた参照電極（１０６）をリン酸緩衝液中に浸し
て成る電極システムが例示される。
３図に示すとおり、測定対象である細胞（１０７）を保
持する支持体乃至フィルタ（１０８）を接触させた作用
電極（１０５）、これを支えるプラスチック等のケース
（１０９）、対向電極（１０４）及びガラスチューブで
仕切られた参照電極（１０６）をリン酸緩衝液中に浸し
て成る電極システムが例示される。
上記細胞保持用の支持体乃至フィルタとしては、各種合
成樹脂多孔質膜、例えば、東洋メンブランフィルタ（東
洋濾紙株式会社製）又はミリポアフィルタ（日本ミリポ
アリミテッド製）、或いは活性炭等の多孔質基材等を適
宜選択使用し得る。
成樹脂多孔質膜、例えば、東洋メンブランフィルタ（東
洋濾紙株式会社製）又はミリポアフィルタ（日本ミリポ
アリミテッド製）、或いは活性炭等の多孔質基材等を適
宜選択使用し得る。
測定は、支持体にメンブランフィルタを使用する場合
は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによりろ過し、
細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブランフィルタ
を作用電極１に接触させ、電極間に周期的走査（掃引）
電位を印加して生起する電流を測定することによりなさ
れるが、通常、その電位走査としては時間に比例して電
位を変化させる所謂線型走査（Linear Sweep）が好適に
採用される。
は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによりろ過し、
細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブランフィルタ
を作用電極１に接触させ、電極間に周期的走査（掃引）
電位を印加して生起する電流を測定することによりなさ
れるが、通常、その電位走査としては時間に比例して電
位を変化させる所謂線型走査（Linear Sweep）が好適に
採用される。
このようにして得られる電流−電位曲線は、後に詳述す
る通り細胞濃度に比例する極大電流値（ピーク電流値）
を与えるのみならず、細胞の種類により相違するピーク
電位値やその曲線形状等の特異性により、細菌等の微生
物の同定に充分な情報をも与えるものとなる。
る通り細胞濃度に比例する極大電流値（ピーク電流値）
を与えるのみならず、細胞の種類により相違するピーク
電位値やその曲線形状等の特異性により、細菌等の微生
物の同定に充分な情報をも与えるものとなる。
従って、本発明方法によって細胞の種類を判別する場合
には、一連の標準細胞を担持した支持体について特定条
件下でそれぞれピーク電流値を与える電位値（ピーク電
位値）を求めておく。続いて、被検試料についても前記
と同じ特定条件下でピーク電位値を求め、ピーク電位値
が一致する標準細胞と対比することによって被検試料の
細胞の種類（特に、グラム陽性菌であるかグラム陰性菌
であるか）を判別することができる。
には、一連の標準細胞を担持した支持体について特定条
件下でそれぞれピーク電流値を与える電位値（ピーク電
位値）を求めておく。続いて、被検試料についても前記
と同じ特定条件下でピーク電位値を求め、ピーク電位値
が一致する標準細胞と対比することによって被検試料の
細胞の種類（特に、グラム陽性菌であるかグラム陰性菌
であるか）を判別することができる。
また、本発明方法により、細胞数を計測する場合には、
最初に一連の既知数の標準細胞を担持した支持体につい
て特定条件下でそれぞれピーク電流値を求め、各標準細
胞毎に検量線を作成する。続いて、被検試料についても
前記と同じ特定条件下でピーク電流値を求め、前記検量
線から被検試料の細胞数を求めることができる。
最初に一連の既知数の標準細胞を担持した支持体につい
て特定条件下でそれぞれピーク電流値を求め、各標準細
胞毎に検量線を作成する。続いて、被検試料についても
前記と同じ特定条件下でピーク電流値を求め、前記検量
線から被検試料の細胞数を求めることができる。
すなわち、従来技術と対比するとき本発明方法によれ
ば、細胞の識別に際し、応答時間ひいては測定時間の著
しい短縮が計られる。さらに、測定が走査電位によるた
め、電極反応に於ける撹乱的諸要因が排除され得るの
で、より精密且つ正確な測定が可能となり、並びに、細
胞濃度（数）のみならずその種類の同定も同時になされ
得る等々の実用上多大の利点が得られるものである。
ば、細胞の識別に際し、応答時間ひいては測定時間の著
しい短縮が計られる。さらに、測定が走査電位によるた
め、電極反応に於ける撹乱的諸要因が排除され得るの
で、より精密且つ正確な測定が可能となり、並びに、細
胞濃度（数）のみならずその種類の同定も同時になされ
得る等々の実用上多大の利点が得られるものである。
従って、本発明は醗酵プロセスのリアル・タイム制御用
センサ、水質の微生物汚染度の測定、赤血球や白血球数
の測定等々、広汎な各分野に於けるセンサ手段として極
めて有用なものと云い得る。
センサ、水質の微生物汚染度の測定、赤血球や白血球数
の測定等々、広汎な各分野に於けるセンサ手段として極
めて有用なものと云い得る。
他方、細胞識別に特に有用な微分パルスボルタメトリ用
装置の１例につき模式説明図を示せば第２図の通りであ
る。
装置の１例につき模式説明図を示せば第２図の通りであ
る。
すなわち、例示の装置は平面熱分解黒鉛（以下ＢＰＧと
いう）、高純度分光分析用カーボン（以下ＨＰＧとい
う）等の黒鉛、炭素、白金、金、銀、水銀等々より成る
作用電極１１及び対向電極１２とＳＳＣＥ、ＳＣＥ等の
参照電極１３を具備するセル１４、パルスシーケンサ１
５、ポテンシャルプログラマ１６、ポテンシオスタット
１７、ドロップノッカ１８、電流−電圧コンバータ１
９、サンプル／ホルド（τ）１１０及び同（τ′）１１
１、ディファレンシャルアンプリファイア１１２及びレ
コーダ１１３より構成され、公知のシステムで微分パル
ス電位を印加し記録するものである。
いう）、高純度分光分析用カーボン（以下ＨＰＧとい
う）等の黒鉛、炭素、白金、金、銀、水銀等々より成る
作用電極１１及び対向電極１２とＳＳＣＥ、ＳＣＥ等の
参照電極１３を具備するセル１４、パルスシーケンサ１
５、ポテンシャルプログラマ１６、ポテンシオスタット
１７、ドロップノッカ１８、電流−電圧コンバータ１
９、サンプル／ホルド（τ）１１０及び同（τ′）１１
１、ディファレンシャルアンプリファイア１１２及びレ
コーダ１１３より構成され、公知のシステムで微分パル
ス電位を印加し記録するものである。
測定は、支持体にメンブランフィルタを使用する場合
は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによりろ過し、
細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブランフィルタ
をセル１４中の作用電極１１に接触させ、電極間に微小
電位の重畳された漸増走査（掃引）電位を印加して、生
起する微分電流を測定することによりなされるが、通
常、その電位走査としては時間に比例して電位を変化さ
せる所謂線型走査（Linear Sweep）が好適に採用され
る。
は、細胞の懸濁液をメンブランフィルタによりろ過し、
細胞をフィルタ上に保持させ、そのメンブランフィルタ
をセル１４中の作用電極１１に接触させ、電極間に微小
電位の重畳された漸増走査（掃引）電位を印加して、生
起する微分電流を測定することによりなされるが、通
常、その電位走査としては時間に比例して電位を変化さ
せる所謂線型走査（Linear Sweep）が好適に採用され
る。
走査電位に重畳される微小電位としては、前述の通り、
微分電流値を与え得る適切な波形及び周期を有するもの
が適宜選択使用され得る。
微分電流値を与え得る適切な波形及び周期を有するもの
が適宜選択使用され得る。
このようにして得られる微分電流−電位曲線は、細胞の
種類によって相違する明瞭なピーク電位値を与え、これ
によりそれらの識別を可能とするのみならず、そのピー
ク波形の解析により細菌等の微生物の電気化学的活性に
関する情報をも与えるものとなる。
種類によって相違する明瞭なピーク電位値を与え、これ
によりそれらの識別を可能とするのみならず、そのピー
ク波形の解析により細菌等の微生物の電気化学的活性に
関する情報をも与えるものとなる。
すなわち、従来技術と対比するとき本発明方法に依れ
ば、各種細菌等の識別、同定が極めて短時間且つ容易に
達成されるものである。
ば、各種細菌等の識別、同定が極めて短時間且つ容易に
達成されるものである。
ここで、本発明方法においては、細胞−電極間の電子伝
達の重要な賦活剤である４，４′−ビピリジン（以下Ｂ
Ｐという）を使用してもよく、その使用条件について要
約して示せば次の通りである。
達の重要な賦活剤である４，４′−ビピリジン（以下Ｂ
Ｐという）を使用してもよく、その使用条件について要
約して示せば次の通りである。
すなわち、本発明に於いてＢＰは、緩衝液中に直接添加
されるか、或いは、ニトロセルロース膜等に固定されて
電極に接触されることにより細胞−電極間反応に関与す
るものとなる。
されるか、或いは、ニトロセルロース膜等に固定されて
電極に接触されることにより細胞−電極間反応に関与す
るものとなる。
尚、緩衝液中に於けるＢＰの濃度は、対象細胞の種類に
よって変動するものであるが、一般には数ｍＭ〜１００
ｍＭ程度が好ましい。
よって変動するものであるが、一般には数ｍＭ〜１００
ｍＭ程度が好ましい。
後記実施例にも示す通り、本発明の方法に於いてＢＰ共
存下で走査電位を印加し、走査電位の印加により生起す
る電流値又は微分電流値を測定することにより、各種細
胞のピーク電流値の１．５〜２．５倍程度の増強及び波
形の鮮明化、微分電流値のピークの先鋭化がもたらされ
るものとなる。
存下で走査電位を印加し、走査電位の印加により生起す
る電流値又は微分電流値を測定することにより、各種細
胞のピーク電流値の１．５〜２．５倍程度の増強及び波
形の鮮明化、微分電流値のピークの先鋭化がもたらされ
るものとなる。
尚、高精度の測定が必要でないときは、賦活剤は省略で
きる。
きる。
電流生成のメカニズム 細胞−電極間の電子授受は補酵素Ａの存在と密接な関係
を持つと考えられる。したがって、ピーク電流値は代謝
経路と関係していることが推定される。
を持つと考えられる。したがって、ピーク電流値は代謝
経路と関係していることが推定される。
そこでサッカロミセス・セレビシエ （Saccharomyces cerevisiae）の懸濁液（２．４×１０
８個／ｍｌ）に代謝阻害剤であるロテノン（７．６ｍ
Ｍ）、アンティマイシン（５．７ｍＭ）、青酸塩（１
０．８ｍＭ）、亜ヒ酸塩（１０．０ｍＭ）を各々添加
し、走査電位を印加して生起する電流値を測定した。
８個／ｍｌ）に代謝阻害剤であるロテノン（７．６ｍ
Ｍ）、アンティマイシン（５．７ｍＭ）、青酸塩（１
０．８ｍＭ）、亜ヒ酸塩（１０．０ｍＭ）を各々添加
し、走査電位を印加して生起する電流値を測定した。
その結果、ロテノン、アンティマイシン及び青酸塩の添
加によってはピーク電流値は減少しなかった。一方、亜
ヒ酸塩の添加によって４．８μＡから３．７μＡの減少
が観察された。
加によってはピーク電流値は減少しなかった。一方、亜
ヒ酸塩の添加によって４．８μＡから３．７μＡの減少
が観察された。
ロテノンは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼに於ける電子授
受を特異的に阻害し、アンティマイシンはチトクロム
ｂ、チトクロムｃ間の電子の移動を阻害し、青酸塩はチ
トクロムオキシダーゼとＯ２との間の電子の移動を阻害
する。一方、亜ヒ酸塩はピルビン酸デヒドロゲナーゼを
阻害することが知られている。
受を特異的に阻害し、アンティマイシンはチトクロム
ｂ、チトクロムｃ間の電子の移動を阻害し、青酸塩はチ
トクロムオキシダーゼとＯ２との間の電子の移動を阻害
する。一方、亜ヒ酸塩はピルビン酸デヒドロゲナーゼを
阻害することが知られている。
従って、ピーク電流の生成は、ピルビン酸デヒドロゲナ
ーゼとクエン酸回路に関係していることが推定された。
ーゼとクエン酸回路に関係していることが推定された。
また後記試験例に示すように、細胞壁に存在する化合物
を超音波処理することにより得られた、超音波処理細胞
乃至細胞壁及びその溶出液のピーク電流値を測定した。
を超音波処理することにより得られた、超音波処理細胞
乃至細胞壁及びその溶出液のピーク電流値を測定した。
その結果、該細胞乃至細胞壁からのピーク電流値（ピー
ク電位値：０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥ）は減少した
が、溶出液のピーク電流値（ピーク電位値：０．６５Ｖ
ｖｓ． ＳＳＣＥ）は次第に増加した。
ク電位値：０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥ）は減少した
が、溶出液のピーク電流値（ピーク電位値：０．６５Ｖ
ｖｓ． ＳＳＣＥ）は次第に増加した。
超音波処理によって細胞の数が影響されることはないの
で、上記の結果は、細胞壁中の電気化学的に活性な物質
が超音波処理によって溶出し、電気化学的に検出された
ことを示す。
で、上記の結果は、細胞壁中の電気化学的に活性な物質
が超音波処理によって溶出し、電気化学的に検出された
ことを示す。
溶出液の波長２６０ｎｍに於ける吸収はアデニン環と関
連を有し、細胞懸濁液を超音波処理するとピーク電流値
と共に増大する。
連を有し、細胞懸濁液を超音波処理するとピーク電流値
と共に増大する。
アデニン環を持つ補酵素であるＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、
ＦＭＮＨ２、ＦＡＤＨ２、及び補酵素Ａは電気化学的に
酸化され得るが、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨに相当する波長
３４０ｎｍに於ける吸収及びＦＭＮＨ２、ＦＡＤＨ２に
相当する波長４４５〜４５０ｎｍに於ける吸収は、溶出
液より得られなかった。
ＦＭＮＨ２、ＦＡＤＨ２、及び補酵素Ａは電気化学的に
酸化され得るが、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨに相当する波長
３４０ｎｍに於ける吸収及びＦＭＮＨ２、ＦＡＤＨ２に
相当する波長４４５〜４５０ｎｍに於ける吸収は、溶出
液より得られなかった。
さらに、炭素電極における、ＮＡＤＨとＮＡＤＰＨの半
波電位値（本発明のピーク電位値）は、０．３５〜０．
７５Ｖ ｖｓ． ＳＣＥの範囲であった。ＦＭＮＨ２と
ＦＡＤＨ２は、−０．４Ｖ ｖｓ． ＳＣＥに於いて電
気化学的に酸化されることが報告されている。
波電位値（本発明のピーク電位値）は、０．３５〜０．
７５Ｖ ｖｓ． ＳＣＥの範囲であった。ＦＭＮＨ２と
ＦＡＤＨ２は、−０．４Ｖ ｖｓ． ＳＣＥに於いて電
気化学的に酸化されることが報告されている。
又、ＢＰＧ電極を用いてＮＡＤＨ及び補酵素Ａの電流−
電位曲線を得たところ、ＮＡＤＨのピーク電流値は０．
３５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであったのに対し、補酵素Ａの
ピーク電流値は０．６５Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥに於いて
各々観察された。
電位曲線を得たところ、ＮＡＤＨのピーク電流値は０．
３５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであったのに対し、補酵素Ａの
ピーク電流値は０．６５Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥに於いて
各々観察された。
以上から、補酵素Ａのピーク電位値は、超音波処理した
細胞からのそれと類似していることがわかった。
細胞からのそれと類似していることがわかった。
次に、溶出液中の補酵素Ａをスタッドマン等による方法
〔E. R. Stadtman et al.,ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー、J. Biol.Chem.，191 367(195
1)〕で酵素学的に定量したところ、３．６ｍＭの補酵素
Ａが検出された。
〔E. R. Stadtman et al.,ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー、J. Biol.Chem.，191 367(195
1)〕で酵素学的に定量したところ、３．６ｍＭの補酵素
Ａが検出された。
細胞を超音波処理すると補酵素Ａの濃度は、溶出液のピ
ーク電流値の増大と共に増大するので、溶出液から得ら
れるピーク電流値の増大は、緩衝液中の補酵素Ａの濃度
の増大に因ることが推定される。
ーク電流値の増大と共に増大するので、溶出液から得ら
れるピーク電流値の増大は、緩衝液中の補酵素Ａの濃度
の増大に因ることが推定される。
換言すれば、細胞中の電極活性物質である補酵素Ａが電
極と接触し、酸化されて電流が流れやすくなり、酸化波
（陽極波 anodic wave）のピーク電流値が現れるものと
考えられる。
極と接触し、酸化されて電流が流れやすくなり、酸化波
（陽極波 anodic wave）のピーク電流値が現れるものと
考えられる。
一方、細胞壁に存在する補酵素Ａは、緩衝液中に溶出す
るので、細胞乃至細胞壁より得られるピーク電流値は減
少した。
るので、細胞乃至細胞壁より得られるピーク電流値は減
少した。
上記の結果は、細胞壁中に存在する補酵素Ａは、細胞−
炭素電極間の電子授受を仲介することを示す。溶出液よ
り得られるピーク電位値は、補酵素Ａのピーク電位値と
類似しており、細胞全体より得られるそれとは相違して
いる。
炭素電極間の電子授受を仲介することを示す。溶出液よ
り得られるピーク電位値は、補酵素Ａのピーク電位値と
類似しており、細胞全体より得られるそれとは相違して
いる。
ピーク電位値は、ｐＨにより決まり、したがって上記の
現象は、緩衝液と細胞壁に於ける補酵素Ａを取り巻く環
境との間でのｐＨの差異に基づくものであると推定され
る。
現象は、緩衝液と細胞壁に於ける補酵素Ａを取り巻く環
境との間でのｐＨの差異に基づくものであると推定され
る。
試験例 １．グルコース４ｇ、ポリペプトン１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇを含有す
る培地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）にサッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomycescerevisiae）を、３０℃で１
８時間好気的条件下で培養した後、５℃、８０００×ｇ
で遠心分離に付し菌体を採集した。
０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇを含有す
る培地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）にサッカロミセス・セ
レビシエ（Saccharomycescerevisiae）を、３０℃で１
８時間好気的条件下で培養した後、５℃、８０００×ｇ
で遠心分離に付し菌体を採集した。
採集した菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で２度洗浄し、これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１０ｍｌに懸濁し（細胞濃度：９×１０８個／ｍ
ｌ）通気した。
で２度洗浄し、これを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）１０ｍｌに懸濁し（細胞濃度：９×１０８個／ｍ
ｌ）通気した。
次に、上記培養菌体を３０分間超音波処理し、５℃、８
０００×ｇで遠心分離に付し、溶出液を得、超音波処理
細胞壁は集めて緩衝液に再度懸濁させた。この細胞壁及
びその溶出液を試料として用いた。
０００×ｇで遠心分離に付し、溶出液を得、超音波処理
細胞壁は集めて緩衝液に再度懸濁させた。この細胞壁及
びその溶出液を試料として用いた。
電解セル（容量約２５ｍｌ）、ポテンシオスタット（北
斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＡ３０１）、線型走
査電源（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０
４）、及びＸＹ記録計（理研電子 Ｆ３５）を第１図の
通りに回路構成し、これをサイクリックボルタメトリ用
装置として使用した。尚、電解セルを構成する作用電極
はＢＰＧ電極であり、対向電極として白金線電極、参照
電極としてはＳＳＣＥを用いた。
斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＡ３０１）、線型走
査電源（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０
４）、及びＸＹ記録計（理研電子 Ｆ３５）を第１図の
通りに回路構成し、これをサイクリックボルタメトリ用
装置として使用した。尚、電解セルを構成する作用電極
はＢＰＧ電極であり、対向電極として白金線電極、参照
電極としてはＳＳＣＥを用いた。
上記サイクリックボルタメトリ用装置の電解セルに前記
各試料を注入し、２５±２℃の条件下サイクリックボル
タモグラムを得、各試料のピーク電流値を経時的に測定
した。
各試料を注入し、２５±２℃の条件下サイクリックボル
タモグラムを得、各試料のピーク電流値を経時的に測定
した。
結果を第４図〔縦軸：ピーク電流値（μＡ）；横軸：時
間（分）〕に示す。
間（分）〕に示す。
図中、曲線ａは溶出液の、曲線ｂは細胞壁の、各値であ
る。
る。
図から明らかなように、電気化学的活性物質は細胞内に
存在し、超音波処理により容易に溶出可能なものと認め
られる。尚、ピーク電位は破壊されていない細胞（Whol
e Cell）では０．７４Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであり、溶出
液では０．６５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥである。
存在し、超音波処理により容易に溶出可能なものと認め
られる。尚、ピーク電位は破壊されていない細胞（Whol
e Cell）では０．７４Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥであり、溶出
液では０．６５Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥである。
２．次にスタッドマン等の方法により溶出液中の活性物
質を検定したところ、補酵素Ａ乃至その類似物質である
ことが確認されたので、別途準備した３．７ｍＭの補酵
素Ａを用いて前記と同様にサイクリックボルタメトリを
行ったところ、そのピーク電位としては前記の溶出液と
同じ値である０．６５Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥの値が得ら
れた。
質を検定したところ、補酵素Ａ乃至その類似物質である
ことが確認されたので、別途準備した３．７ｍＭの補酵
素Ａを用いて前記と同様にサイクリックボルタメトリを
行ったところ、そのピーク電位としては前記の溶出液と
同じ値である０．６５Ｖ ｖｓ． ＳＳＣＥの値が得ら
れた。
これらのことから、菌体中の補酵素Ａがピーク電流に影
響していることがわかる。
響していることがわかる。
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明する
が、これらは本発明を限定するものではない。
が、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１ 第３図は、本発明の細胞識別に用いる電極システムの一
例を示すものである。
例を示すものである。
この電極システムは、測定対象である細胞（１０７）を
支持する為の支持体であるメンブランフィルタ（１０
８）を装着した表面積０．１７cm2のＢＰＧ製作用電極
（１０５）、白金線よりなる対向電極（１０４）、ＳＣ
Ｅ参照電極（１０６）、ポテンシオスタット（北斗電工
株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＡ３０１）（１０２）、線
型走査電源（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１
０４）（１０１）、及びＸＹ記録計（理研電子 Ｆ３
５）（１０３）より成る。特に指定されている場合を除
き、電極はアルミナの水懸濁液を浸み込ませたつや出し
布で磨いた。
支持する為の支持体であるメンブランフィルタ（１０
８）を装着した表面積０．１７cm2のＢＰＧ製作用電極
（１０５）、白金線よりなる対向電極（１０４）、ＳＣ
Ｅ参照電極（１０６）、ポテンシオスタット（北斗電工
株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＡ３０１）（１０２）、線
型走査電源（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１
０４）（１０１）、及びＸＹ記録計（理研電子 Ｆ３
５）（１０３）より成る。特に指定されている場合を除
き、電極はアルミナの水懸濁液を浸み込ませたつや出し
布で磨いた。
上記３電極を有し、隔膜（１１０）で隔てたガラス製の
電解セルを用い、参照電極（１０６）は、先端が電解液
の通過できるポーラスな焼結ガラスのフリット（１０６
ａ）で主要部と結合されたガラスチューブに浸すことに
よってセルの主要部から隔離されている。
電解セルを用い、参照電極（１０６）は、先端が電解液
の通過できるポーラスな焼結ガラスのフリット（１０６
ａ）で主要部と結合されたガラスチューブに浸すことに
よってセルの主要部から隔離されている。
大腸菌（Escherichia coli）を寒天培地で３７℃で１２
時間培養した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に懸濁させた。メンブランフィルタ（東洋メンブランフ
ィルタ ＴＭ−２タイプ、ニトロセルロース、孔径０．
４５μｍ、径２５ｍｍ）の上に上述の培養細胞の懸濁液
５ｍｌをわずかに吸引しながら落とした。
時間培養した後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に懸濁させた。メンブランフィルタ（東洋メンブランフ
ィルタ ＴＭ−２タイプ、ニトロセルロース、孔径０．
４５μｍ、径２５ｍｍ）の上に上述の培養細胞の懸濁液
５ｍｌをわずかに吸引しながら落とした。
次に、このメンブランフィルタの細胞付着側を炭素電極
表面に接触させ培養細胞が炭素電極と接触するようにし
た。電極システムをリン酸緩衝液中に挿入し２５±２℃
でサイクリックボルタモグラムを得た。
表面に接触させ培養細胞が炭素電極と接触するようにし
た。電極システムをリン酸緩衝液中に挿入し２５±２℃
でサイクリックボルタモグラムを得た。
第５図は０〜１．０Ｖ ｖｓ．ＳＣＥの電位に於けるサ
イクリックボルタモグラムを示す〔縦軸：電流値（μ
Ａ）；横軸：電位（Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ）〕。
イクリックボルタモグラムを示す〔縦軸：電流値（μ
Ａ）；横軸：電位（Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ）〕。
プラス方向への最初の走査に於いて０．７２Ｖ ｖｓ．
ＳＣＥで陽極波のピーク電流値が現れた。逆の走査の
際、それに対応するような減少ピークは見られなかっ
た。
ＳＣＥで陽極波のピーク電流値が現れた。逆の走査の
際、それに対応するような減少ピークは見られなかっ
た。
従って、細胞の電極反応は不可逆的なものである。
この実施例の場合は、０．１〜１．９×１０９個／mlの
範囲でのピーク電流値は、メンブランフィルタ上の細胞
数に比例していた。
範囲でのピーク電流値は、メンブランフィルタ上の細胞
数に比例していた。
この結果は、メンブランフィルタ上の大腸菌（Escheric
hia coli）の細胞数が、サイクリックボルタメトリのピ
ーク電流値から求められることを意味する。検出可能な
最小限度の大腸菌（Escherichia coli）の細胞数は５×
１０７個／ml（懸濁液換算）である。
hia coli）の細胞数が、サイクリックボルタメトリのピ
ーク電流値から求められることを意味する。検出可能な
最小限度の大腸菌（Escherichia coli）の細胞数は５×
１０７個／ml（懸濁液換算）である。
実施例２ 実施例１と同様の電極システムを用い、バチルス・スブ
チリス（Bacillus subtilis ；グラム陽性）、ラクトバ
チリス・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum；
グラム陽性）、ストレプトコッカス・サンギス（Strept
ococcussanguis ；グラム陽性）、スタフィロコッカス
・エピデルミディス（Staphylococcusepidermidis；グ
ラム陽性）、大腸菌（Escherichia coli；グラム陰
性）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typ
hymurium；グラム陰性）各々を前例と同様のメンブラン
フィルタ上に６×１０８個保持し、それぞれのサイクリ
ックボルタメトリによるピーク電流値の現れる電位を測
定した。結果は下記第１表に示す通りである。
チリス（Bacillus subtilis ；グラム陽性）、ラクトバ
チリス・ファーメンタム（Lactobachillus fermentum；
グラム陽性）、ストレプトコッカス・サンギス（Strept
ococcussanguis ；グラム陽性）、スタフィロコッカス
・エピデルミディス（Staphylococcusepidermidis；グ
ラム陽性）、大腸菌（Escherichia coli；グラム陰
性）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typ
hymurium；グラム陰性）各々を前例と同様のメンブラン
フィルタ上に６×１０８個保持し、それぞれのサイクリ
ックボルタメトリによるピーク電流値の現れる電位を測
定した。結果は下記第１表に示す通りである。
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）、ラクト
バチリス・ファーメンタム（Lactobachillus fermentu
m）、ストレプトコッカス・サンギス（Streptococcus s
anguis ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S
taphylococcus epidermidis）の様なグラム陽性菌の細
胞膜は、ペプチドグリカン及びディコイル酸より成る細
胞壁（代表的なもので、厚さ約２５０Å）に囲まれてい
る。大腸菌（Escherichiacoli）及びサルモネラ・チィ
フィムリウム（Salmonella typhymurium）の様なグラム
陰性菌の細胞壁及び細胞膜の構造はより複雑であり、細
胞膜は厚さ約３０Åのペプチドグリカンの壁に取り囲ま
れ、その壁はさらにその外側が厚さ約８０Åのタンパク
質、脂質及びリポポリサッカライドのモザイクの膜で覆
われている。
バチリス・ファーメンタム（Lactobachillus fermentu
m）、ストレプトコッカス・サンギス（Streptococcus s
anguis ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（S
taphylococcus epidermidis）の様なグラム陽性菌の細
胞膜は、ペプチドグリカン及びディコイル酸より成る細
胞壁（代表的なもので、厚さ約２５０Å）に囲まれてい
る。大腸菌（Escherichiacoli）及びサルモネラ・チィ
フィムリウム（Salmonella typhymurium）の様なグラム
陰性菌の細胞壁及び細胞膜の構造はより複雑であり、細
胞膜は厚さ約３０Åのペプチドグリカンの壁に取り囲ま
れ、その壁はさらにその外側が厚さ約８０Åのタンパク
質、脂質及びリポポリサッカライドのモザイクの膜で覆
われている。
上記の結果は、サイクリックボルタメトリのピーク電位
値には細胞壁の構造が影響することを示している。
値には細胞壁の構造が影響することを示している。
すなわち、より複雑な膜で被覆されているグラム陰性菌
のピーク電流は、グラム陽性菌のそれよりもプラス側の
電位に於いて現れた。
のピーク電流は、グラム陽性菌のそれよりもプラス側の
電位に於いて現れた。
実施例３ グラム陽性菌であるバチルス・スブチリス（Bacillus s
ubtilis ）ＩＦＯ３００９を栄養培地（Nutrient Brot
h、牛肉エキス１％、ペプトン１％）の中で培養し、対
数期に集菌し、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で洗浄後、同緩衝液に懸濁し細胞懸濁液（１．２×１０
９個／ｍｌ）を調製した。
ubtilis ）ＩＦＯ３００９を栄養培地（Nutrient Brot
h、牛肉エキス１％、ペプトン１％）の中で培養し、対
数期に集菌し、０．１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
で洗浄後、同緩衝液に懸濁し細胞懸濁液（１．２×１０
９個／ｍｌ）を調製した。
同様にして、グラム陽性菌であるサッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae、ＹＲＤ培地：酵母
エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）、グ
ラム陽性菌であるラクトバチリス・ファーメンタム（La
ctobachillus fermentum）ＩＦＯ３０７１（栄養培
地）、グラム陽性菌であるロイコノストック・メセンテ
ロイデス（Leuconostoc mesenteroides ）ＩＦＯ３８３
２（トマトジュース培地：トリプトン１％、酵母エキス
１％、トマトジュース２０％）及びグラム陰性菌である
大腸菌（Escherichia coli、栄養培地）をそれぞれ培養
し、対数期に集菌し、前記緩衝液に懸濁して生菌数濃度
１．０３×１０９、５．０×１０８、１．３×１０９及
び１．０×１０10個／ｍｌの各懸濁液を調製した。
ビシエ（Saccharomyces cerevisiae、ＹＲＤ培地：酵母
エキス１％、ポリペプトン２％、グルコース２％）、グ
ラム陽性菌であるラクトバチリス・ファーメンタム（La
ctobachillus fermentum）ＩＦＯ３０７１（栄養培
地）、グラム陽性菌であるロイコノストック・メセンテ
ロイデス（Leuconostoc mesenteroides ）ＩＦＯ３８３
２（トマトジュース培地：トリプトン１％、酵母エキス
１％、トマトジュース２０％）及びグラム陰性菌である
大腸菌（Escherichia coli、栄養培地）をそれぞれ培養
し、対数期に集菌し、前記緩衝液に懸濁して生菌数濃度
１．０３×１０９、５．０×１０８、１．３×１０９及
び１．０×１０10個／ｍｌの各懸濁液を調製した。
次にこれら細胞各懸濁液を、前例と同様のメンブランフ
ィルタ上に各５ｍｌわずかに吸引しながら落とし、その
表面にこのメンブランフィルタを取りつけた作用電極Ｂ
ＰＧ、対向電極白金線及び参照電極ＳＳＣＥを用いて、
走査電位０〜１．０Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥ、サンプリング
・タイム２０ミリ秒、変調電圧５０ｍＶ及び１００ｍ
Ｖ、電位単掃引０．５ｍＶ／秒、測定温度２５℃の条件
下、微分パルスボルタメトリを実施した。尚、装置は扶
桑製作所製「ポーラログラフ３１２型」を使用した。
ィルタ上に各５ｍｌわずかに吸引しながら落とし、その
表面にこのメンブランフィルタを取りつけた作用電極Ｂ
ＰＧ、対向電極白金線及び参照電極ＳＳＣＥを用いて、
走査電位０〜１．０Ｖ ｖｓ．ＳＳＣＥ、サンプリング
・タイム２０ミリ秒、変調電圧５０ｍＶ及び１００ｍ
Ｖ、電位単掃引０．５ｍＶ／秒、測定温度２５℃の条件
下、微分パルスボルタメトリを実施した。尚、装置は扶
桑製作所製「ポーラログラフ３１２型」を使用した。
第６図はバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）
の微分パルスボルタモグラムであり、０．６８Ｖ ｖｓ
ＳＳＣＥに極めて明瞭なピーク電位が認められる（図
中、符号(a)及び(b)は変調電圧１００ｍＶ、５０ｍＶに
それぞれ対応する）。
の微分パルスボルタモグラムであり、０．６８Ｖ ｖｓ
ＳＳＣＥに極めて明瞭なピーク電位が認められる（図
中、符号(a)及び(b)は変調電圧１００ｍＶ、５０ｍＶに
それぞれ対応する）。
各細菌のピーク電位値を下記第２表に要約して示す。
同表からも明らかなように、本発明方法に依れば細菌相
互の識別が微分パルスボルタメトリで極めて明瞭且つ容
易になされ得るものであり、特にグラム陰性菌である大
腸菌（Escherichia coli）とその余の各グラム陽性菌と
が明瞭に区別され得ることは注目に値するものである。
互の識別が微分パルスボルタメトリで極めて明瞭且つ容
易になされ得るものであり、特にグラム陰性菌である大
腸菌（Escherichia coli）とその余の各グラム陽性菌と
が明瞭に区別され得ることは注目に値するものである。
実施例４ １．微生物 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisi
ae）は、グルコース４ｇ、ポリペプトン１ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇを含
む１００ｍｌの培値（ｐＨ７．０）に好気的に３０℃１
２時間培養した。
ae）は、グルコース４ｇ、ポリペプトン１ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４ ０．５ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．２ｇを含
む１００ｍｌの培値（ｐＨ７．０）に好気的に３０℃１
２時間培養した。
サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typhymuri
um）ＴＡ１００は、１ｇのポリペプトン及び肉エキスを
含む１００ｍｌの培地で好気的に３０℃１５時間培養し
た。
um）ＴＡ１００は、１ｇのポリペプトン及び肉エキスを
含む１００ｍｌの培地で好気的に３０℃１５時間培養し
た。
大腸菌（Escherichia coli）Ｋ１２は、グルコース０．
１ｇ、バクトートリプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、
及びＮａＣｌ５ｇを含む１００ｍｌの培地（ｐＨ７．
０）に好気的に３０℃１２時間培養した。
１ｇ、バクトートリプトン１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、
及びＮａＣｌ５ｇを含む１００ｍｌの培地（ｐＨ７．
０）に好気的に３０℃１２時間培養した。
ラクトバチリス・ファーメンタム （Lactobachillus f
ermentum）ＡＴＣＣ９３３８は、トリプチケース１ｇ、
トリプトース０．３ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４ ０．３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３ｇ、クエン酸ア
ンモニウム０．２ｇ、グルコース２ｇ、ツィーン８０
（登録商標）０．１ｇ、システイン塩酸塩０．０２ｇ、
及び０．５ｍｌの溶液（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １１．
５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６８％、ＭｎＳＯ４
・２Ｈ２Ｏ ２．４％含有）を含む１００ｍｌの培地
（ｐＨ６．８）で嫌気的に３７℃１６時間培養した。
ermentum）ＡＴＣＣ９３３８は、トリプチケース１ｇ、
トリプトース０．３ｇ、酵母エキス０．５ｇ、ＫＨ２Ｐ
Ｏ４ ０．３ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３ｇ、クエン酸ア
ンモニウム０．２ｇ、グルコース２ｇ、ツィーン８０
（登録商標）０．１ｇ、システイン塩酸塩０．０２ｇ、
及び０．５ｍｌの溶液（ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １１．
５％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６８％、ＭｎＳＯ４
・２Ｈ２Ｏ ２．４％含有）を含む１００ｍｌの培地
（ｐＨ６．８）で嫌気的に３７℃１６時間培養した。
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）ＭＩ１１
２は、Ｋ２ＨＰＯ４ １．４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６
ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．２ｇ、クエン酸ナトリウ
ム０．１ｇ、カザミノ酸０．５ｇ、グルコース０．５
ｇ、及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇを含む１０
０ｍｌの培地（ｐＨ７．０）で好気的に３０℃１５時間
培養した。２．４，４′−ビピリジン修飾電極 ４，４′−ビピリジン１．５６ｇを１００ｍｌのメタノ
ールに溶かし、溶液の濃度を１００ｍＭとした。０．３
μｍの粒径のアルミナ水懸濁液を浸み込ませたつや出し
布であらかじめ磨いておいたＢＰＧ電極（０．１７c
m2）を上記溶液に浸し、１分間ゆっくりと揺り動かし
た。
２は、Ｋ２ＨＰＯ４ １．４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６
ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．２ｇ、クエン酸ナトリウ
ム０．１ｇ、カザミノ酸０．５ｇ、グルコース０．５
ｇ、及びＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２ｇを含む１０
０ｍｌの培地（ｐＨ７．０）で好気的に３０℃１５時間
培養した。２．４，４′−ビピリジン修飾電極 ４，４′−ビピリジン１．５６ｇを１００ｍｌのメタノ
ールに溶かし、溶液の濃度を１００ｍＭとした。０．３
μｍの粒径のアルミナ水懸濁液を浸み込ませたつや出し
布であらかじめ磨いておいたＢＰＧ電極（０．１７c
m2）を上記溶液に浸し、１分間ゆっくりと揺り動かし
た。
上記の様にしてＢＰＧ電極を操作前に毎回磨き、その都
度４，４′−ビピリジンによる修飾も行った。
度４，４′−ビピリジンによる修飾も行った。
３．測定方法 ポテンシオスタット（北斗電工株式会社製 Ｍｏｄｅｌ
ＨＡ３０１）、線型走査電源（北斗電工株式会社製
Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０４）、及びＸＹ記録計（理研電子
Ｆ３５）を用い４，４′−ビピリジン修飾炭素電極を
用いてサイクリックボルタメトリを実施した。
ＨＡ３０１）、線型走査電源（北斗電工株式会社製
Ｍｏｄｅｌ ＨＢ１０４）、及びＸＹ記録計（理研電子
Ｆ３５）を用い４，４′−ビピリジン修飾炭素電極を
用いてサイクリックボルタメトリを実施した。
サイクリックボルタメトリの電解セルは、容積２５ｍｌ
程度のガラス製セルであり、対向電極は白金線、参照電
極はＳＣＥである。参照電極は先端が焼結ガラスのフリ
ットで主要部と結合しているガラスチューブに浸すこと
によって電解セルの主要部から隔離されている。
程度のガラス製セルであり、対向電極は白金線、参照電
極はＳＣＥである。参照電極は先端が焼結ガラスのフリ
ットで主要部と結合しているガラスチューブに浸すこと
によって電解セルの主要部から隔離されている。
メンブランフィルタ（東洋メンブランフィルタ ＴＭ−
２タイプ、ニトロセルロース、孔径０．４５μｍ、径２
５ｍｍ）上に測定対象である各種細胞を１．１×１０９
個保持し、このメンブランフィルタを前記４，４′−ビ
ピリジン修飾炭素電極に取り付け、菌体を電極に接触さ
せた。
２タイプ、ニトロセルロース、孔径０．４５μｍ、径２
５ｍｍ）上に測定対象である各種細胞を１．１×１０９
個保持し、このメンブランフィルタを前記４，４′−ビ
ピリジン修飾炭素電極に取り付け、菌体を電極に接触さ
せた。
さらに、測定は、扶桑製作所製「ポーラログラフ３１２
型」及びＸＹ記録計を用い、サイクリックボルタモグラ
ムと同様の条件で、微分パルスボルタメトリについても
行い、微分パルスボルタモグラムを得た。
型」及びＸＹ記録計を用い、サイクリックボルタモグラ
ムと同様の条件で、微分パルスボルタメトリについても
行い、微分パルスボルタモグラムを得た。
第７図はｐＨ７．０に於けるサッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）に関するサイクリック
ボルタモグラム及び微分パルスボルタモグラムを示す。
図中（Ａ）はサイクリックボルタモグラム、（Ｂ）は微
分パルスボルタモグラムを示し、(a)は４，４′−ビピ
リジン修飾電極に関し、(b)は４，４′−ビピリジン修
飾をしていない電極に関するものである。また、電流値
の大きさを矢印の幅とその幅に相当する電流値によって
示す。
エ（Saccharomyces cerevisiae）に関するサイクリック
ボルタモグラム及び微分パルスボルタモグラムを示す。
図中（Ａ）はサイクリックボルタモグラム、（Ｂ）は微
分パルスボルタモグラムを示し、(a)は４，４′−ビピ
リジン修飾電極に関し、(b)は４，４′−ビピリジン修
飾をしていない電極に関するものである。また、電流値
の大きさを矢印の幅とその幅に相当する電流値によって
示す。
測定は２５±２℃で行った。サイクリックボルタモグラ
ムは、走査速度１０ｍＶ／秒に於いて、微分パルスボル
タモグラムは、走査速度１０ｍＶ／秒、波高１００ｍＶ
及びパルス幅２０ｍ秒で得られた。
ムは、走査速度１０ｍＶ／秒に於いて、微分パルスボル
タモグラムは、走査速度１０ｍＶ／秒、波高１００ｍＶ
及びパルス幅２０ｍ秒で得られた。
プラス方向への最初の走査に際し、修飾電極、非修飾電
極共０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＣＥに於いて陽極波が観察
された。サイクリックボルタモグラムのピーク電位値と
微分パルスボルタモグラムのそれは一致している。
極共０．７４Ｖ ｖｓ． ＳＣＥに於いて陽極波が観察
された。サイクリックボルタモグラムのピーク電位値と
微分パルスボルタモグラムのそれは一致している。
４，４′−ビピリジン修飾電極より得られたピーク電流
値は、非修飾電極より得られたピーク電流値よりも高か
った。細胞が不在の場合、ピーク電流は生成しなかっ
た。
値は、非修飾電極より得られたピーク電流値よりも高か
った。細胞が不在の場合、ピーク電流は生成しなかっ
た。
従って、４，４′−ビピリジン修飾によって電極が賦活
されることがわかる。
されることがわかる。
前記各種微生物試料についてピーク電位を測定したとこ
ろ、大腸菌（Escherichia coli）０．７２Ｖ ｖｓ Ｓ
ＣＥ、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typ
hymurium）０．７０Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ、バチルス・スブ
チリス（Bacillus subtilis）０．６８Ｖ ｖｓ．ＳＣ
Ｅ、ラクトバチリス・ファーメンタム （Lactobachill
us fermentum）０．６８Ｖ ｖｓ．ＳＣＥであった。
ろ、大腸菌（Escherichia coli）０．７２Ｖ ｖｓ Ｓ
ＣＥ、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonella typ
hymurium）０．７０Ｖ ｖｓ．ＳＣＥ、バチルス・スブ
チリス（Bacillus subtilis）０．６８Ｖ ｖｓ．ＳＣ
Ｅ、ラクトバチリス・ファーメンタム （Lactobachill
us fermentum）０．６８Ｖ ｖｓ．ＳＣＥであった。
実施例５ バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１
２（Ａｒｇ−１５、ｌｅｕ Ｂ８ ｔｈｉ５ ｒ−ｍ−
ｒｅｃ Ｅ４、以下本実施例ではプラスミド無しとい
う）は、スピッツェン培地(Spizizen Medium) １００ｍ
ｌに、又、バチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s）ＭＩ１１２（プラスミドＰＴＬ１２含有、以下本実
施例ではプラスミド有りという）は、１μｇ／ｍｌのト
リメトプリム(trimethoprim)を含んだスピッツェン培地
(Spizizen Medium) １００ｍｌに、各々植菌し、３７
℃、１２時間好気的に培養した。集菌後、０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、懸濁させて菌体をＢ
ＰＧ電極表面にメンブランフィルタを用いて接触させ
た。
２（Ａｒｇ−１５、ｌｅｕ Ｂ８ ｔｈｉ５ ｒ−ｍ−
ｒｅｃ Ｅ４、以下本実施例ではプラスミド無しとい
う）は、スピッツェン培地(Spizizen Medium) １００ｍ
ｌに、又、バチルス・スブチリス（Bacillus subtili
s）ＭＩ１１２（プラスミドＰＴＬ１２含有、以下本実
施例ではプラスミド有りという）は、１μｇ／ｍｌのト
リメトプリム(trimethoprim)を含んだスピッツェン培地
(Spizizen Medium) １００ｍｌに、各々植菌し、３７
℃、１２時間好気的に培養した。集菌後、０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、懸濁させて菌体をＢ
ＰＧ電極表面にメンブランフィルタを用いて接触させ
た。
測定は、電解セルに２０ｍｌＨ型セルを用い、作用極に
はＢＰＧ（０．１７cm2）、対向電極には白金線、参照
電極にはＳＣＥを用いサイクリックボルタメトリにより
電気化学的挙動を測定し、サイクリックボルタモグラム
を求めた。電位走査速度は１０ｍＶ／秒に設定し、測定
は２５℃で行った。
はＢＰＧ（０．１７cm2）、対向電極には白金線、参照
電極にはＳＣＥを用いサイクリックボルタメトリにより
電気化学的挙動を測定し、サイクリックボルタモグラム
を求めた。電位走査速度は１０ｍＶ／秒に設定し、測定
は２５℃で行った。
プラスミド無しとプラスミド有りのサイクリックボルタ
モグラムを求めた結果、下記第３表のように各細胞にお
いてピーク電流の発生するピーク電位が得られた。
モグラムを求めた結果、下記第３表のように各細胞にお
いてピーク電流の発生するピーク電位が得られた。
このことは、プラスミド有りの細胞も同様に測定出来る
ことを示している。
ことを示している。
実施例６ ラクトバチリス・ファーメンタム（Lactobachillus fer
mentum）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（St
aphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・サ
ンギス（Streptococcus sanguis ）、大腸菌（Escheric
hia coli）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonel
la typhymurium）、プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaris）をロゴサ(Rogosa)培地で３７℃、１６時間、
好気的に静置培養した。
mentum）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（St
aphylococcus epidermidis）、ストレプトコッカス・サ
ンギス（Streptococcus sanguis ）、大腸菌（Escheric
hia coli）、サルモネラ・チィフィムリウム（Salmonel
la typhymurium）、プロテウス・ブルガリス（Proteus
vulgaris）をロゴサ(Rogosa)培地で３７℃、１６時間、
好気的に静置培養した。
各々のコロニーを適量かき取り、０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）に懸濁させ、これをメンブランフィルタ
上に滴下し、菌体をフィルタ上に集菌し、ＢＰＧ電極表
面（０．１７cm2）に接触させて作用極とした。対向電
極には白金線、参照電極にはＳＣＥを用い、電解セルに
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌの入った
Ｈ型セルを用い、サイクリックボルタメトリにより電気
化学的挙動を測定し、サイクリックボルタモグラムを求
めた。
（ｐＨ７．０）に懸濁させ、これをメンブランフィルタ
上に滴下し、菌体をフィルタ上に集菌し、ＢＰＧ電極表
面（０．１７cm2）に接触させて作用極とした。対向電
極には白金線、参照電極にはＳＣＥを用い、電解セルに
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１０ｍｌの入った
Ｈ型セルを用い、サイクリックボルタメトリにより電気
化学的挙動を測定し、サイクリックボルタモグラムを求
めた。
各試料についてのピーク電位の測定結果を下記第４表に
示す。
示す。
この結果より、細胞数が同一でなくても、一定の範囲で
あれば固有のピーク電位を示すことがわかる。
あれば固有のピーク電位を示すことがわかる。
実施例７ バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis ）ＩＦＯ３
００９、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）、ラクトバチリス・ファーメンタム（Lact
obachillus fermentum）ＩＦＯ３０７１、ロイコノスト
ック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides
）ＩＦＯ３８３２、及び、大腸菌（Escherichia col
i）を夫々前記実施例２と同様の条件で培養し、対数期
に集菌し、生菌数１．３×１０９個／フィルタの各試料
を調製した。
００９、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces
cerevisiae）、ラクトバチリス・ファーメンタム（Lact
obachillus fermentum）ＩＦＯ３０７１、ロイコノスト
ック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides
）ＩＦＯ３８３２、及び、大腸菌（Escherichia col
i）を夫々前記実施例２と同様の条件で培養し、対数期
に集菌し、生菌数１．３×１０９個／フィルタの各試料
を調製した。
次に、フィルタ上に保持したこれらの各試料につき、前
記実施例４で用いた４，４′−ビピリジン修飾ＢＰＧ電
極を使用し、実施例３と同様の条件下、微分パルスボル
タメトリを実施した。
記実施例４で用いた４，４′−ビピリジン修飾ＢＰＧ電
極を使用し、実施例３と同様の条件下、微分パルスボル
タメトリを実施した。
各試料のピーク電位値を第５表に要約して示す。
同表からも明らかなように、本発明方法に依れば、細胞
相互の識別が極めて明瞭かつ容易になされ得るものであ
る。
相互の識別が極めて明瞭かつ容易になされ得るものであ
る。
実施例８ １２時間好気的に培養したサッカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）を集菌後、０．１Ｍリン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、菌体を単層にな
るように、メンブランフィルタ上に固定化した後、この
菌体をＢＰＧ電極表面に接触させた。
（Saccharomyces cerevisiae）を集菌後、０．１Ｍリン
酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に懸濁させ、菌体を単層にな
るように、メンブランフィルタ上に固定化した後、この
菌体をＢＰＧ電極表面に接触させた。
電解セル（２５mlＨ型）に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を入れ、作用極にはＢＰＧ、対向電極には白金
線、参照電極にはＳＣＥを用いて、サイクリックボルタ
メトリにより電位走査を行ったところ、０．７４Ｖ ｖ
ｓ．ＳＣＥ付近に特異的な電流のピークが得られた。
７．０）を入れ、作用極にはＢＰＧ、対向電極には白金
線、参照電極にはＳＣＥを用いて、サイクリックボルタ
メトリにより電位走査を行ったところ、０．７４Ｖ ｖ
ｓ．ＳＣＥ付近に特異的な電流のピークが得られた。
第１図は本発明で使用するサイクリックボルタメトリ用
装置の模式的説明図であり、第２図は本発明で使用する
微分パルスボルタメトリ用装置の模式的説明図であり、
第３図は細胞識別に用いる電極システムの一例の模式的
説明図であり、第４図はピーク電位値の経時変化を示す
グラフであり、第５図は大腸菌（Echerichia coli）の
サイクリックボルタモグラムであり、第６図はバチルス
・スブチリス（Bacillus subtilis）の微分パルスボル
タモグラムであり、第７図はサッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）のサイクリックボルタ
モグラム（Ａ）及び微分パルスボルタモグラム（Ｂ）で
ある。 ４……電解セル、５……ポテンシオスタット、 ６……リニア・スイーブ電源、 ７……ＸＹ記録計乃至シンクロスコーブ、 １１……作用電極、１２……対向電極、 １４……電解セル、 １５……パルスシーケンサ、 １７……ポテンシオスタット、 １１２……ディファレンスアンプリフィア及び １１３……レコーダ
装置の模式的説明図であり、第２図は本発明で使用する
微分パルスボルタメトリ用装置の模式的説明図であり、
第３図は細胞識別に用いる電極システムの一例の模式的
説明図であり、第４図はピーク電位値の経時変化を示す
グラフであり、第５図は大腸菌（Echerichia coli）の
サイクリックボルタモグラムであり、第６図はバチルス
・スブチリス（Bacillus subtilis）の微分パルスボル
タモグラムであり、第７図はサッカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）のサイクリックボルタ
モグラム（Ａ）及び微分パルスボルタモグラム（Ｂ）で
ある。 ４……電解セル、５……ポテンシオスタット、 ６……リニア・スイーブ電源、 ７……ＸＹ記録計乃至シンクロスコーブ、 １１……作用電極、１２……対向電極、 １４……電解セル、 １５……パルスシーケンサ、 １７……ポテンシオスタット、 １１２……ディファレンスアンプリフィア及び １１３……レコーダ
Claims (3)
- 【請求項１】作用電極及び対向電極を浸漬した溶液中
で、支持体に集積させた細胞又は細胞壁片と前記作用電
極とを接触させ、前記作用電極に走査電位を印加し、走
査電位の印加により生起する電流値又は微分電流値の最
大値あるいは前記電流値又は微分電流値を最大とする走
査電位を測定する工程を含むことを特徴とする細胞の電
気化学的識別方法。 - 【請求項２】作用電極及び対向電極を浸漬した溶液中
で、支持体に集積させた細胞又は細胞壁片と前記作用電
極とを接触させ、前記作用電極に走査電位を印加し、走
査電位の印加により生起する電流値又は微分電流値を最
大とする走査電位を測定し、予め測定しておいた標準細
胞の相当する走査電位と対比する工程を含むことを特徴
とする細胞の電気化学的判別方法。 - 【請求項３】作用電極及び対向電極を浸漬した溶液中
で、支持体に集積させた細胞又は細胞壁片と前記作用電
極とを接触させ、前記作用電極に走査電位を印加し、走
査電位の印加により生起する電流値又は微分電流値の最
大値を測定し、予め測定しておいた前記電流値又は微分
電流値の最大値と細胞数との相関関係と対比する工程を
含むことを特徴とする細胞の電気化学的計数方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58221388A JPH0634005B2 (ja) | 1983-11-26 | 1983-11-26 | 細胞の電気化学的識別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58221388A JPH0634005B2 (ja) | 1983-11-26 | 1983-11-26 | 細胞の電気化学的識別方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60114763A JPS60114763A (ja) | 1985-06-21 |
| JPH0634005B2 true JPH0634005B2 (ja) | 1994-05-02 |
Family
ID=16765987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58221388A Expired - Lifetime JPH0634005B2 (ja) | 1983-11-26 | 1983-11-26 | 細胞の電気化学的識別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634005B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2539077B2 (ja) * | 1990-04-20 | 1996-10-02 | 日本電装株式会社 | 浄水器 |
| JP7460131B2 (ja) * | 2020-04-10 | 2024-04-02 | 国立研究開発法人物質・材料研究機構 | 診断装置、及び、プログラム |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2335602A1 (fr) * | 1975-12-16 | 1977-07-15 | Univ Virginia | Methode de detection et d'enumeration microbienne et appareil mis en oeuvre |
| JPS5529940A (en) * | 1978-08-23 | 1980-03-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Method and apparatus for determining activity of microorganism |
-
1983
- 1983-11-26 JP JP58221388A patent/JPH0634005B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60114763A (ja) | 1985-06-21 |
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