JPH0634636A - ステロイドホルモンの測定法 - Google Patents

ステロイドホルモンの測定法

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JPH0634636A
JPH0634636A JP21228392A JP21228392A JPH0634636A JP H0634636 A JPH0634636 A JP H0634636A JP 21228392 A JP21228392 A JP 21228392A JP 21228392 A JP21228392 A JP 21228392A JP H0634636 A JPH0634636 A JP H0634636A
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cortisol
progesterone
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steroid hormone
concentration
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JP21228392A
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Koichi Morimoto
康一 森本
Nami Kawakami
ナミ 川上
Tatsushi Fujii
達志 藤井
Noriyuki Ota
憲之 太田
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Tosoh Corp
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Tosoh Corp
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Abstract

(57)【要約】 【目的】試料中のステロイドホルモン濃度を正確に測定
する。 【構成】ステロイドホルモンの測定において、サリチル
酸またはその塩を用いて、ステロイドホルモンと結合蛋
白の結合を阻害したうえで、測定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ステロイドホルモンを
測定する方法において、ステロイドホルモンの結合蛋白
質に対する結合を阻害することで、試料中のステロイド
ホルモンの濃度を正確に測定する方法に関するものであ
る。
【0002】
【従来の技術】血液中のホルモンなどの小分子は、その
大部分が結合蛋白質と結合していることは広く認められ
ている。例えば、サイロイドホルモンであるT3,T4
は、血漿中でそれぞれ99.9%、99.5%が蛋白質
に結合している。コルチゾ−ルにおいては、95%がコ
ルチコステロイド結合グロブリンと結合して存在してい
ることが知られており、またエストラジオ−ルやテスト
ステロンにおいても、セックスホルモン結合グロブリン
と結合していることが明らかになっている。
【0003】血清試料中のホルモンは、遊離型と結合型
の二つの形態で存在し、臨床的にはともに重要であると
考えられている。またエストラジオ−ルやエストリオ−
ル、プロゲステロン、コルチゾ−ルなどは、血清試料中
の全濃度を測定することが重要であり、臨床的判断の根
本となる。必要な場合は、有機溶媒にて血清試料を前処
理し、ホルモンを結合蛋白質より遊離させた後、測定す
ることもある。
【0004】例えば、ジクロルメタンやメタノ−ルによ
る結合蛋白質の除去などがあげられるが、非特異的な沈
殿により測定誤差が生じ、信頼される精度と再現性に問
題が残る。またこの方法は、非常に時間のかかる方法で
あり、かつ有機溶媒を取り扱う危険が伴う。
【0005】従来知られている阻害剤には、コルチゾ−
ルの免疫測定法におけるグルタミン酸溶液(特開昭53
−101521号公報)、同じくコルチゾ−ルの分析方
法における8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸
(ANS)あるいはその塩(特公昭61−12547号
公報)などがある。ANSは、蛋白質の疎水性領域に結
合することが知られ、そのためホルモンの結合を阻害す
ると考えられている。サイロイドホルモンの免疫測定で
は、利用される阻害剤がUSP3,911,096号に
詳細に記載されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ステロイド
ホルモンを測定する際に、結合蛋白質に結合したホルモ
ンを遊離型とし、試料中のホルモン濃度を正確に測定す
る方法を提供することを目的とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】以上のことに鑑み、本発
明者らはホルモンの測定における阻害剤について鋭意検
討した結果、本発明に到達した。すなわち本発明は、ス
テロイドホルモンの測定において、ステロイドホルモン
と結合蛋白との結合をサリチル酸またはその塩にて阻害
し、測定することを特徴とするステロイドホルモンの測
定法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【0008】本発明で測定されるステロイドホルモンと
しては、アンドロゲン、エストロゲン、ゲスターゲン、
コルチコイドなどがあり、具体的には、エストラジオ−
ル、エストリオ−ル、プロゲステロン、コルチゾ−ル、
テストステロン、またはデヒドロエピアンドロステロン
硫酸などがあげられる。
【0009】このようなホルモンは、血液中で結合蛋白
質と結合しているので、その結合を阻害するためにサリ
チル酸またはその塩を添加する。サリチル酸の塩として
は、例えば、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸カルシ
ウム、サリチル酸アンモニウムなどがあげられる。これ
らサリチル酸またはその塩は、測定試料中に好ましくは
0.1−2.0%、さらに好ましくは0.2−1.0%
となるよう添加する。そして好ましくは、温度は4−5
0℃、時間は温度との兼ね合いによるが約5分−数時間
反応させることにより、ホルモンと結合蛋白質との結合
を阻害することができる。測定試料に対して、この結合
阻害反応をあらかじめ行った後、ホルモンの測定を行っ
てもよいし、また、ホルモンの測定と同時に行ってもよ
い。
【0010】ホルモンの測定方法には特に限定はない
が、測定感度の面などから免疫反応が好ましい。免疫反
応といっても測定原理には様々なものがあるが、特定の
反応に限定されるものではなく、モノクローナル抗体ま
たはポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ法、競合
法、凝集法などがあげられる。また、免疫反応の検出の
ために標識を用いてもよく、例えば放射性同位元素、酵
素、蛍光物質などを用いることができる。
【0011】
【発明の効果】本発明によれば、抽出操作なしに直接、
試料中のホルモン濃度を精度良く測定することが可能で
ある。今日の臨床検査において非常に有効な手段として
のEIA,RIAで用いられているホルモンの測定時間
の短縮、自動化への発展に対する多くの要望を簡便に解
決するものであり、その応用範囲は広い。
【0012】
【実施例】以下本発明を更に詳細に説明するために実施
例を示すが、本発明はこれら実施例になんら限定される
ものではない。
【0013】実施例1 (1)コルチゾ−ルの測定反応試薬 アルカリフォスファタ−ゼ標識コルチゾ−ル溶液 サリチル酸ナトリウムを0、0.3,0.5,0.8,
1.0%になるように、0.5%ウシ血清アルブミンを
含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解
し、それぞれを希釈液とした。
【0014】アルカリフォスファタ−ゼ標識コルチゾ−
ル溶液を280nmの吸光度で0.001Absになる
ように各希釈液に加え、よく混和した。 コルチゾ−ル抗血清 各希釈液に、4000倍でウサギ抗−コルチゾ−ル抗血
清を添加した。 コルチゾ−ル標準液 ステロイド非含有ヒト血清に、コルチゾ−ルを、それぞ
れ0,2.5,6.5,14.0,36.7,80.3
μg/dlになるように添加・調製し、標準液とした。 未知コルチゾ−ル試料 未知量のコルチゾ−ルを含む血清を2つ用意した。 (2)標準液の測定 で調製したアルカリフォスファタ−ゼ標識コルチゾ−
ル溶液50μl中に、各濃度の標準液を10μlづつマ
イクロピペットにて分注した。次にで調製した抗血清
溶液を90μl加え、さらに固相化抗ウサギ抗血清を加
えた。ボルテックスミキサ−にて良く混和した後、AI
A1200(東ソ−株式会社製)にて37℃で40分で
反応させ、アルカリフォスファタ−ゼによる4−メチリ
ウンベリフェロンの蛍光光度の増加速度を、蛍光光度計
にて測定した。各標準液はそれぞれ5回ずつ測定し平均
値を求めた。 (3)(2)の結果から基質の分解速度(nmol/s
ec)を求め、コルチゾール濃度0μg/dlの標準液
の蛍光増加量(Bo)に対する各標準液の蛍光増加量
(B)の割合(B/Bo×100)を求めた。結果を表
1に示す。表のように、既知濃度の試料に対する標準曲
線が得られた。
【0015】 表1 コルチゾール サリチル酸ナトリウム(濃度%) μg/dl 0 0.3 0.5 分解速度 B/Bo 分解速度 B/Bo 分解速度 B/Bo ──────────────────────────────────── 0 50.3 100 52.4 100 51.3 100 2.5 23.1 45.9 23.7 45.2 24.4 47.6 6.5 15.7 31.2 15.7 29.9 16.4 32.1 14.0 11.4 22.7 11.8 22.4 11.3 21.9 36.7 6.7 13.4 7.1 13.5 7.1 13.9 80.3 4.6 9.2 4.7 9.0 5.0 9.8 コルチゾール サリチル酸ナトリウム(濃度%) μg/dl 0.8 1.0 分解速度 B/Bo 分解速度 B/Bo ─────────────────────────── 0 50.3 100 50.1 100 2.5 23.3 46.4 23.8 47.4 6.5 15.6 31.0 14.9 29.6 14.0 11.3 22.4 10.9 21.9 36.7 7.0 14.0 6.9 13.7 80.3 5.0 10.0 4.9 9.8 (4)未知試料の測定 未知量のコルチゾールを含む血清に更にコルチゾール
2.9μg/dlを加えた血清1と14.0μg/dl
を加えた血清2の各10μlを、それぞれのサリチル酸
濃度の反応試薬140μlとよく混和し、実施例1と同
様に測定した。
【0016】実際に添加したコルチゾールの量に対する
測定値から求めたコルチゾールの添加量の割合(%)を
回収率として、結果を表2に示した。
【0017】 表2 サリチル酸ナトリウム濃度(%) 0 0.3 0.5 0.8 1.0 ────────────────────────────── 血清1 47.5 82.0 108 95.5 114 血清2 78.8 87.3 94.0 94.0 94.0 表2の結果より明らかなように、サリチル酸ナトリウム
を0.3%以上添加することで血清試料中のコルチゾ−
ル量を正確に測定することができた。
【0018】実施例2 (1)プロゲステロンの測定反応試薬 アルカリフォスファタ−ゼ標識プロゲステロン溶液 サリチル酸ナトリウムを0、0.2,0.4%になるよ
うに0.5%ウシ血清アルブミンを含む50mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解しそれぞれを希釈液
とした。
【0019】アルカリフォスファタ−ゼ標識プロゲステ
ロン溶液を280nmの吸光度で0.001Absにな
るように各希釈液に加え、よく混和した。 プロゲステロン抗血清 各希釈液に、50000倍でウサギ抗−プロゲステロン
抗血清を添加した。 プロゲステロン標準液 ステロイド非含有ヒト血清にプロゲステロンを、0、
0.5,2,10,30,60ng/mlになるように
加え調製した。 未知プロゲステロン試料 未知量のプロゲステロンを含む血清を1つ用意した。 (2)標準液の測定 で調製したアルカリフォスファタ−ゼ標識プロゲステ
ロン溶液25μl中に、各標準液を75μlづつマイク
ロピペットにて分注した。次にで調製した抗血清溶液
を50μl加え、さらに固相化抗ウサギ抗血清を加え
た。ボルテックスミキサ−にて良く混和した後、AIA
1200(東ソ−株式会社製)にて37℃で40分で反
応させ、アルカリフォスファタ−ゼによる4−メチリウ
ンベリフェロンの蛍光光度の増加速度を、蛍光光度計に
て測定した。測定は5回実施し、平均値を求めた。 (3)(2)の結果から基質の分解速度(nM/se
c)を求め、プロゲステロン濃度0ng/mlの標準液
の蛍光増加量(Bo)に対する各標準液の蛍光増加量
(B)の割合(B/Bo×100)を求めた結果を表3
に示す。
【0020】 表3 プロゲステロン サリチル酸ナトリウム(濃度%) ng/ml 0 0.2 0.4 分解速度 B/Bo 分解速度 B/Bo 分解速度 B/Bo ──────────────────────────────────── 0 85.6 100 80.2 100 86.9 100 0.1 81.2 94.8 75.6 94.2 82.4 94.8 1.0 69.8 81.5 60.9 76.0 69.0 79.4 3.9 44.5 51.9 39.6 49.3 41.8 48.1 9.8 27.3 31.8 24.7 30.8 25.4 29.2 41.2 10.1 11.8 8.7 10.9 9.5 10.9 表のように、既知濃度の試料に対する標準曲線を得た。 (4)未知試料の測定 未知量のプロゲステロンを含む血清に、さらに0.40
ng/mlのプロゲステロンを添加した。この試料75
μlを(2)と同様に反応試薬に加え、測定した。測定
は3回行い、平均値を求めた。実際に添加したプロゲス
テロンの量に対する測定値から求めたプロゲステロンの
添加量の割合(%)を回収率として、結果を表4に示
す。
【0021】 表4 サリチル酸ナトリウム濃度(%) 0 0.2 0.4 ───────────────────────────── プロゲステロン 0.40ng/ml添加 35.9 79.2 126 サリチル酸濃度に依存してプロゲステロンの回収率が良
くなっていることが表4から明らかとなり、サリチル酸
ナトリウムを0.2%以上添加することで血清試料中の
プロゲステロン量を正確に測定することができた。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ステロイドホルモンの測定において、ステ
    ロイドホルモンと結合蛋白との結合をサリチル酸または
    その塩にて阻害し、測定することを特徴とするステロイ
    ドホルモンの測定法。
  2. 【請求項2】ステロイドホルモンがエストラジオ−ル、
    エストリオ−ル、プロゲステロン、コルチゾ−ル、テス
    トステロン、またはデヒドロエピアンドロステロン硫酸
    である請求項1に記載の測定法。
  3. 【請求項3】サリチル酸またはその塩濃度が、0.1%
    以上2.0%以下である請求項1または2に記載の測定
    法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10617603B2 (en) 2016-01-22 2020-04-14 Baxter International Inc. Sterile solutions product bag
US11021275B2 (en) 2016-01-22 2021-06-01 Baxter International Inc. Method and machine for producing sterile solution product bags

Cited By (3)

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US10617603B2 (en) 2016-01-22 2020-04-14 Baxter International Inc. Sterile solutions product bag
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