JPH0634721B2 - Ｄｎａベクタ−とその組換えｄｎａ技術への使用 - Google Patents
Ｄｎａベクタ−とその組換えｄｎａ技術への使用Info
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- JPH0634721B2 JPH0634721B2 JP59501670A JP50167084A JPH0634721B2 JP H0634721 B2 JPH0634721 B2 JP H0634721B2 JP 59501670 A JP59501670 A JP 59501670A JP 50167084 A JP50167084 A JP 50167084A JP H0634721 B2 JPH0634721 B2 JP H0634721B2
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
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- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明はDNAベクター、その産生及び組換えDNA技術にお
けるその応用に関する。本発明は又宿主生物の細胞中で
のDNAベクターの複製のコントロールと遺伝子産物の産
生に関する。
けるその応用に関する。本発明は又宿主生物の細胞中で
のDNAベクターの複製のコントロールと遺伝子産物の産
生に関する。
発明の背景 プラスミツドのようなDNAベクターは通常環状であり、
宿主生物の細胞内で自律的に増殖する染色体外DNA分子
である。多くの単細胞生物（いくつかの細菌が含まれ
る）の細胞は天然に存在する野生型のプラスミツドを含
有しており、このプラスミツドが宿主細胞の抗生物質耐
性や繁殖力などの種々の機能に影響を与える。これら野
生型プラスミツド及びその誘導体は組換えDNA技術にお
ける基本的な道具であり、宿主生物の細胞内での対応す
る外来のポリペプチドや蛋白産生の遺伝暗号を有する外
来DNA配列による宿主生物の細胞の形質転換のためのビ
ークルを供する。すなわち組換えDNA技術においてプラ
スミツドはインビトロで制限酵素を用いて特異的な部位
で切り開かれ、目的の異種生成物の遺伝暗号を有する遺
伝子を含有する追加的DNA配列で再結合され、適当な宿
主細胞を形質転換させるのに用いられる組換えプラスミ
ツドができる。
宿主生物の細胞内で自律的に増殖する染色体外DNA分子
である。多くの単細胞生物（いくつかの細菌が含まれ
る）の細胞は天然に存在する野生型のプラスミツドを含
有しており、このプラスミツドが宿主細胞の抗生物質耐
性や繁殖力などの種々の機能に影響を与える。これら野
生型プラスミツド及びその誘導体は組換えDNA技術にお
ける基本的な道具であり、宿主生物の細胞内での対応す
る外来のポリペプチドや蛋白産生の遺伝暗号を有する外
来DNA配列による宿主生物の細胞の形質転換のためのビ
ークルを供する。すなわち組換えDNA技術においてプラ
スミツドはインビトロで制限酵素を用いて特異的な部位
で切り開かれ、目的の異種生成物の遺伝暗号を有する遺
伝子を含有する追加的DNA配列で再結合され、適当な宿
主細胞を形質転換させるのに用いられる組換えプラスミ
ツドができる。
それらが得られた親プラスミツドに類似した組換えプラ
スミツドは宿主細胞内で自律的増殖が可能であり、複製
時には親プラスミツドのDNA配列のみでなく、外来遺伝
子を含む挿入された追加DNA配列も複製する。蛋白合成
時には、形質転換した宿主細胞中の組換えプラスミツド
のDNA配列の転写と翻訳により、特にその挿入された外
来遺伝子に対応する異種生成物が合成される。
スミツドは宿主細胞内で自律的増殖が可能であり、複製
時には親プラスミツドのDNA配列のみでなく、外来遺伝
子を含む挿入された追加DNA配列も複製する。蛋白合成
時には、形質転換した宿主細胞中の組換えプラスミツド
のDNA配列の転写と翻訳により、特にその挿入された外
来遺伝子に対応する異種生成物が合成される。
合成された異種生成物の収率に影響を与える要因のひと
つは、形質転換した細胞内に存在する外来遺伝子のコピ
ー数、すなわち宿主細胞内で組換えプラスミツドが維持
されるコピー数であり、これはふつう宿主ゲノム１個当
たりのプラスミツドのコピーの数と定義される。一般に
組換えプラスミツドのコピー数が多い程異種生成物の収
率が高い。コピー数の少ない（ふつう宿主内でゲノム１
個当たり約１−１０コピーが維持される）プラスミツド
もコピー数の多いプラスミツド（ふつうゲノム１個当た
り１１から数百コピーが維持される）も知られている。
ある野生型のレプリコンのコピー数は、複製開始点を規
定するDNA配列付近、又はそれを含有するDNA配列に支配
される。従つてこれ以後大コピー数複製開始点及び小コ
ピー数複製開始点という。
つは、形質転換した細胞内に存在する外来遺伝子のコピ
ー数、すなわち宿主細胞内で組換えプラスミツドが維持
されるコピー数であり、これはふつう宿主ゲノム１個当
たりのプラスミツドのコピーの数と定義される。一般に
組換えプラスミツドのコピー数が多い程異種生成物の収
率が高い。コピー数の少ない（ふつう宿主内でゲノム１
個当たり約１−１０コピーが維持される）プラスミツド
もコピー数の多いプラスミツド（ふつうゲノム１個当た
り１１から数百コピーが維持される）も知られている。
ある野生型のレプリコンのコピー数は、複製開始点を規
定するDNA配列付近、又はそれを含有するDNA配列に支配
される。従つてこれ以後大コピー数複製開始点及び小コ
ピー数複製開始点という。
大コピー数プラスミツドは組換え系において異種生成物
の高収率を目的として使用されてきた。しかし多くの大
コピー数プラスミツドは形質転換した細胞中で安定的に
維持されにくく、又充分増殖して大量の異種蛋白を生成
するようになる前に細胞から消失することもあるため、
大コピー数プラスミツドを用いる方法では目的の結果が
得られない可能性もある。たとえば異種生成物は形質転
換細胞の増殖を阻害したり、大コピー数プラスミツド自
身が本質的に不安定なこともある。
の高収率を目的として使用されてきた。しかし多くの大
コピー数プラスミツドは形質転換した細胞中で安定的に
維持されにくく、又充分増殖して大量の異種蛋白を生成
するようになる前に細胞から消失することもあるため、
大コピー数プラスミツドを用いる方法では目的の結果が
得られない可能性もある。たとえば異種生成物は形質転
換細胞の増殖を阻害したり、大コピー数プラスミツド自
身が本質的に不安定なこともある。
あるプラスミツドのコピー数を蛋白合成の阻害（たとえ
ば発酵培地にクロラムフエニコールのような蛋白合成阻
害剤を添加すること）により通常レベル以上に増幅させ
ることが可能であることは公知である。しかし多くの遺
伝子産物の産生には蛋白合成が必要なため、外来遺伝子
産物の合成が始まる前に阻害物を除去しなければならな
い。この阻害物の除去には複雑な操作が必要であり、必
ずしも可能ではない。
ば発酵培地にクロラムフエニコールのような蛋白合成阻
害剤を添加すること）により通常レベル以上に増幅させ
ることが可能であることは公知である。しかし多くの遺
伝子産物の産生には蛋白合成が必要なため、外来遺伝子
産物の合成が始まる前に阻害物を除去しなければならな
い。この阻害物の除去には複雑な操作が必要であり、必
ずしも可能ではない。
宿主細胞中での大コピー数プラスミツドの安定な維持と
いう問題を解決するために他の多くの溶液が提唱されて
いる。たとえば英国特許第１，５５７，７７４号明細書
では、温度依存性プラスミツドコピー数型を示す突然変
異プラスミツドの使用が提唱されている。この温度依存
性とは、プラスミツドを有する宿主細菌をある温度で培
養するとプラスミツドコピー数が一定に保たれ、別の温
度で培養するとプラスミツドのコピー数型が変化しはる
かに多い数の、又は全くコントロールされないコピー数
が得られるというものである。こうしてプラスミツドが
少ないコピー数で複製し、その遺伝子産物が細胞の増殖
を有意に阻害しない温度で培養することにより、細胞を
目的とする生産規模に繁殖させることができる。次に温
度を変えプラスミツドのコピー数及びその対応する遺伝
子産物の産生を著しく増加させることもできる。しかし
このような突然変異プラスミツドでコピー数温度依存性
を導入することはプラスミツドに不安定要因を導入する
ことになり、このような突然変異プラスミツドを有する
細胞を長期間増殖させるとプラスミツドが不安定になつ
たり消失したりする。
いう問題を解決するために他の多くの溶液が提唱されて
いる。たとえば英国特許第１，５５７，７７４号明細書
では、温度依存性プラスミツドコピー数型を示す突然変
異プラスミツドの使用が提唱されている。この温度依存
性とは、プラスミツドを有する宿主細菌をある温度で培
養するとプラスミツドコピー数が一定に保たれ、別の温
度で培養するとプラスミツドのコピー数型が変化しはる
かに多い数の、又は全くコントロールされないコピー数
が得られるというものである。こうしてプラスミツドが
少ないコピー数で複製し、その遺伝子産物が細胞の増殖
を有意に阻害しない温度で培養することにより、細胞を
目的とする生産規模に繁殖させることができる。次に温
度を変えプラスミツドのコピー数及びその対応する遺伝
子産物の産生を著しく増加させることもできる。しかし
このような突然変異プラスミツドでコピー数温度依存性
を導入することはプラスミツドに不安定要因を導入する
ことになり、このような突然変異プラスミツドを有する
細胞を長期間増殖させるとプラスミツドが不安定になつ
たり消失したりする。
プラスミツドの複製はその全DNA配列中に含まれるヌク
レオチド配列によりコントロールされる。この配列中に
はDNA複製が開始される点である複製開始点を規定する
配列が含まれ、それに関連して複製開始点での複製開始
をコントロールする配列やプラスミツドが維持されるコ
ピー数をコントロールする配列もしばしば含まれてい
る。たとえばある種のプラスミツド（代表例はColE1）
は、いくつかの共通の特徴を有するプラスミツド複製系
を有している。これらの系は複製開始点を規定するDNA
配列と、その上流側に２つのRNA(RNA IIとRNAＩ）の反
対方向への転写の遺伝暗号を有するDNA配列より成る。R
NA IIはDNA合成の開始される複製開始点又はその近く
で複合体を形成するプライマーとなり、RNAＩはこのイ
ニシエーシヨン複合体の形成を妨害する。この２つのRN
Aの転写は、その転写の遺伝暗号を有するDNA配列に関連
した異なるプロモーター配列によりコントロールされ
る。さらに小さいポリペプチド（rop蛋白）がありRNA
IIのプロモーターと相互作用をすると考えられている。
このポリペプチドは複製に必須のものではなくその役割
は不明である。複製開始点、RNAの遺伝暗号配列及び関
連するプロモーターは一緒になつて、内部的に自己制御
された系を与え、プラスミツドの複製の不和合性とコピ
ー数をコントロールしている。いくつかの他のプラスミ
ツド（ＲＩやいくつかのブドウ球菌プラスミツドなど）
も転写のレベルで複製開始をコントロールしているが、
これはメツセンジヤーRNAによるコントロールであり、
その生成物はおそらくポリペプチドである開始因子を与
えDNA複製に関係している。
レオチド配列によりコントロールされる。この配列中に
はDNA複製が開始される点である複製開始点を規定する
配列が含まれ、それに関連して複製開始点での複製開始
をコントロールする配列やプラスミツドが維持されるコ
ピー数をコントロールする配列もしばしば含まれてい
る。たとえばある種のプラスミツド（代表例はColE1）
は、いくつかの共通の特徴を有するプラスミツド複製系
を有している。これらの系は複製開始点を規定するDNA
配列と、その上流側に２つのRNA(RNA IIとRNAＩ）の反
対方向への転写の遺伝暗号を有するDNA配列より成る。R
NA IIはDNA合成の開始される複製開始点又はその近く
で複合体を形成するプライマーとなり、RNAＩはこのイ
ニシエーシヨン複合体の形成を妨害する。この２つのRN
Aの転写は、その転写の遺伝暗号を有するDNA配列に関連
した異なるプロモーター配列によりコントロールされ
る。さらに小さいポリペプチド（rop蛋白）がありRNA
IIのプロモーターと相互作用をすると考えられている。
このポリペプチドは複製に必須のものではなくその役割
は不明である。複製開始点、RNAの遺伝暗号配列及び関
連するプロモーターは一緒になつて、内部的に自己制御
された系を与え、プラスミツドの複製の不和合性とコピ
ー数をコントロールしている。いくつかの他のプラスミ
ツド（ＲＩやいくつかのブドウ球菌プラスミツドなど）
も転写のレベルで複製開始をコントロールしているが、
これはメツセンジヤーRNAによるコントロールであり、
その生成物はおそらくポリペプチドである開始因子を与
えDNA複製に関係している。
本発明の目的は、コントロール可能なコピー数型を有す
る新規のDNAベクターを提供し、それにより大コピー数
でのみ複製するベクターの安定的維持に関連する問題を
解決し、これまでに報告されている温度依存性コピー数
型の突然変異プラスミツドの不安定性という問題がな
く、さらにそのコピー数が温度以外の因子（たとえば代
謝物濃度）によりコントロール可能な新規のベクターを
提供することである。
る新規のDNAベクターを提供し、それにより大コピー数
でのみ複製するベクターの安定的維持に関連する問題を
解決し、これまでに報告されている温度依存性コピー数
型の突然変異プラスミツドの不安定性という問題がな
く、さらにそのコピー数が温度以外の因子（たとえば代
謝物濃度）によりコントロール可能な新規のベクターを
提供することである。
従つて第一の態様において本発明は以下の２つの複製系
より成るDNAベクターを供する。すなわち、小コピー数
でベクターが安定に維持される第一の複製開始点、そし
て第二の複製開始点における複製をコントロールする天
然のベクターの配列のDNA操作によるDNAの置換又は変更
により複製が直接コントロール可能な、大コピー数の第
二の複製開始点。
より成るDNAベクターを供する。すなわち、小コピー数
でベクターが安定に維持される第一の複製開始点、そし
て第二の複製開始点における複製をコントロールする天
然のベクターの配列のDNA操作によるDNAの置換又は変更
により複製が直接コントロール可能な、大コピー数の第
二の複製開始点。
本発明の方法により、ベクターを含有している宿主細胞
が第一の条件で繁殖しているときは、主にそして好まし
くは全面的に複製は小コピー数複製開始点から始まり、
宿主細胞が別の条件で繁殖しているときは、複製は大コ
ピー数で第二の複製開始点でも始まり、そしてベクター
の有する遺伝子の異種遺伝子産物の大量生産が誘導され
る。
が第一の条件で繁殖しているときは、主にそして好まし
くは全面的に複製は小コピー数複製開始点から始まり、
宿主細胞が別の条件で繁殖しているときは、複製は大コ
ピー数で第二の複製開始点でも始まり、そしてベクター
の有する遺伝子の異種遺伝子産物の大量生産が誘導され
る。
第二の態様において本発明は、複製開始点とその関連す
るDNA配列（複製開始点又はその近辺で複合体を形成す
ることによりDNA複製を開始させるプライマー又は開始
因子を（たとえばポリペプチド）を与える（RNAの遺伝
暗号を有する）より成る複製系を含有するDNAベクター
を与える。ただしここでRNAの転写は直接コントロール
可能であり、このベクターを含有する宿主細胞を選択し
た条件下で増殖させると複製開始点から大コピー数の複
製が始まり、ベクターにより暗号化されている大量の異
種遺伝子産物の産生が始まる。
るDNA配列（複製開始点又はその近辺で複合体を形成す
ることによりDNA複製を開始させるプライマー又は開始
因子を（たとえばポリペプチド）を与える（RNAの遺伝
暗号を有する）より成る複製系を含有するDNAベクター
を与える。ただしここでRNAの転写は直接コントロール
可能であり、このベクターを含有する宿主細胞を選択し
た条件下で増殖させると複製開始点から大コピー数の複
製が始まり、ベクターにより暗号化されている大量の異
種遺伝子産物の産生が始まる。
本発明の第一の態様の第二の複製系は、本発明の第二の
態様に特定された系であることが好ましい。
態様に特定された系であることが好ましい。
本発明は又、第二の複製系の遺伝暗号を有するDNA配列
に、第二の複製開始点での複製の直接のコントロールを
可能にさせるDNA配列を含有させることより成る、第一
の態様のベクターの調製方法を含む。
に、第二の複製開始点での複製の直接のコントロールを
可能にさせるDNA配列を含有させることより成る、第一
の態様のベクターの調製方法を含む。
本発明の第一の態様のベクターの調製方法は、第一の複
製開始点より成る複製系の遺伝暗号を有する最初のDNA
配列を、第二の複製系の遺伝暗号を有する第二のDNA配
列と結合させることより成る方法が適当である。第二の
複製開始点での複製の直接的なコントロールを可能にす
るDNA配列の、第二のDNA配列への導入は、最初のDNA配
列との結合の前でも後でもよい。本発明はさらに、RNA
の転写をコントロールして第二の複製開始点での複製の
コントロールを可能にするDNA配列を第二のDNA配列に含
有させることより成る、本発明の第二の態様のベクター
の調製方法を供する。
製開始点より成る複製系の遺伝暗号を有する最初のDNA
配列を、第二の複製系の遺伝暗号を有する第二のDNA配
列と結合させることより成る方法が適当である。第二の
複製開始点での複製の直接的なコントロールを可能にす
るDNA配列の、第二のDNA配列への導入は、最初のDNA配
列との結合の前でも後でもよい。本発明はさらに、RNA
の転写をコントロールして第二の複製開始点での複製の
コントロールを可能にするDNA配列を第二のDNA配列に含
有させることより成る、本発明の第二の態様のベクター
の調製方法を供する。
本発明はさらに、第二の態様のベクター（ポリペプチ
ド、蛋白又は他の遺伝子産物の産生のための遺伝暗号を
有する遺伝子配列を含有する）で宿主細胞を形質転換さ
せ、形質転換した細胞を、主に及び好ましくは全面的に
第一の複製開始点から小コピー数で複製の始まる第一の
条件で増殖させ、次にこの形質転換した細胞を第２の複
製開始点からも（又は第二の複製開始点からのみ）大コ
ピー数で複製の始まる第二の条件で増殖させ、ポリペプ
チド、蛋白又は他の遺伝子産物の発現を誘導することよ
り成る、ポリペプチド、蛋白又は他の遺伝子産物の産生
方法を含有する。
ド、蛋白又は他の遺伝子産物の産生のための遺伝暗号を
有する遺伝子配列を含有する）で宿主細胞を形質転換さ
せ、形質転換した細胞を、主に及び好ましくは全面的に
第一の複製開始点から小コピー数で複製の始まる第一の
条件で増殖させ、次にこの形質転換した細胞を第２の複
製開始点からも（又は第二の複製開始点からのみ）大コ
ピー数で複製の始まる第二の条件で増殖させ、ポリペプ
チド、蛋白又は他の遺伝子産物の発現を誘導することよ
り成る、ポリペプチド、蛋白又は他の遺伝子産物の産生
方法を含有する。
本発明の方法により、形質転換させた細胞を、ベクター
が小コピー数で複製し大コピー数ベクターに関連する不
安定性の問題を避ける条件で増殖させ、次にベクターが
大コピー数で複製し同時にポリペプチド、蛋白又は他の
産物が高収率で産生される別の条件で増殖させて、ポリ
ペプチド、蛋白又は他の産物の経済的生産に必要な大量
培養が与えられる。
が小コピー数で複製し大コピー数ベクターに関連する不
安定性の問題を避ける条件で増殖させ、次にベクターが
大コピー数で複製し同時にポリペプチド、蛋白又は他の
産物が高収率で産生される別の条件で増殖させて、ポリ
ペプチド、蛋白又は他の産物の経済的生産に必要な大量
培養が与えられる。
特に遺伝子産物の発現が細胞質レベルのリプレツサーに
より制御されるプロモーターにコントロールされている
時、ベクターのコピー数が増加するとリプレツサーによ
るコントロールが除かれ遺伝子産物が大量に発現される
ことが見出された。これはリプレツサーの合成が自己制
御されている時（たとえばプロモーター／リプレツサー
系がトリプトフアンオペロンのものである時）でさえ当
てはまる。
より制御されるプロモーターにコントロールされている
時、ベクターのコピー数が増加するとリプレツサーによ
るコントロールが除かれ遺伝子産物が大量に発現される
ことが見出された。これはリプレツサーの合成が自己制
御されている時（たとえばプロモーター／リプレツサー
系がトリプトフアンオペロンのものである時）でさえ当
てはまる。
本発明のベクターのコピー数のコントロールに用いるコ
ントロール系は、組換えDNA技術における複製（及び／
又は発現）のコントロールにつき公知のコントロール系
のいかなる方法を用いてもよい。特にコントロール可能
な複製開始点のコピー数は、温度又は１つ又は２つ以上
の代謝物又は代謝物類似化合物によりコントロールし得
る。使用可能な代謝物依存系の例としては、トリプトフ
アン、ラクトース、ガラクトース、アラビノース又は他
の任意の代謝物又は代謝物類似化合物があり、これらの
存在、除去さらには代謝はあるプロモーターからの転写
を活性化するのに使用し得る。
ントロール系は、組換えDNA技術における複製（及び／
又は発現）のコントロールにつき公知のコントロール系
のいかなる方法を用いてもよい。特にコントロール可能
な複製開始点のコピー数は、温度又は１つ又は２つ以上
の代謝物又は代謝物類似化合物によりコントロールし得
る。使用可能な代謝物依存系の例としては、トリプトフ
アン、ラクトース、ガラクトース、アラビノース又は他
の任意の代謝物又は代謝物類似化合物があり、これらの
存在、除去さらには代謝はあるプロモーターからの転写
を活性化するのに使用し得る。
本発明のベクターに使用されるコントロール可能な複製
系は、ColＥ１様プラスミツド（たとえばpAT１５３，NT
P１，CloDF１３，RSF１０３０又はＰ１５Ａ）などの大
コピー数のクローニングベクターに由来し、これらは複
製開始点又はその近辺で複合体を形成することによりDN
A複製を開始するプライマーを与えるRNA II又は類似の
RNAの転写を含むコピー数コントロール系を有する。さ
らにその複製がmRNA及び／又はその生成物によりコント
ロールされる他のプラスミツドの複製開始点は、本発明
のベクターに使用されるコントロール可能な複製系を与
える。このような複製開始点はＲ１，Ｒ６，Ｒ１００，
ＲＰ４などのグラム陰性細菌、又はPUB１００，PC１９
４などのグラム陽性細菌、及びいくつかの他のブドウ球
菌プラスミツドより得られる。さらにたとえばλ、Ｔ
３，Ｔ４，Ｔ７，Ｍ１３，φＸ１７４，SPP１，SPO２な
どのバクテリオフアージの複製開始点を二次性コントロ
ール可能複製開始点として使うこともできる。
系は、ColＥ１様プラスミツド（たとえばpAT１５３，NT
P１，CloDF１３，RSF１０３０又はＰ１５Ａ）などの大
コピー数のクローニングベクターに由来し、これらは複
製開始点又はその近辺で複合体を形成することによりDN
A複製を開始するプライマーを与えるRNA II又は類似の
RNAの転写を含むコピー数コントロール系を有する。さ
らにその複製がmRNA及び／又はその生成物によりコント
ロールされる他のプラスミツドの複製開始点は、本発明
のベクターに使用されるコントロール可能な複製系を与
える。このような複製開始点はＲ１，Ｒ６，Ｒ１００，
ＲＰ４などのグラム陰性細菌、又はPUB１００，PC１９
４などのグラム陽性細菌、及びいくつかの他のブドウ球
菌プラスミツドより得られる。さらにたとえばλ、Ｔ
３，Ｔ４，Ｔ７，Ｍ１３，φＸ１７４，SPP１，SPO２な
どのバクテリオフアージの複製開始点を二次性コントロ
ール可能複製開始点として使うこともできる。
本発明の重要な態様において、コントロール可能な複製
系は、RNAの転写を促進する天然のプロモーターをPLプ
ロモーター，PRプロモーター，Preプロモーター，Ｐ′
Ｒプロモーター，T7lateプロモータ，trpプロモータ
ー，tacプロモーター，lacプロモーター，galプロモー
ター，araプロモーター、又はrecAプロモーターなどの
コントロール可能なプロモーターにより置換することに
より、そのような大コピー数クローニングベクターから
調製される（このような系の複製開始点は「ハイブリツ
ド開始点」と呼ばれる）。あるいは天然のプロモータを
使い、オペレーター配列（たとえばlacオペレーター、
又はランダフアージのOL又はORオペレーター）などの制
御機能を複製系に導入することにより、RNAの転写がコ
ントロール可能となる。
系は、RNAの転写を促進する天然のプロモーターをPLプ
ロモーター，PRプロモーター，Preプロモーター，Ｐ′
Ｒプロモーター，T7lateプロモータ，trpプロモータ
ー，tacプロモーター，lacプロモーター，galプロモー
ター，araプロモーター、又はrecAプロモーターなどの
コントロール可能なプロモーターにより置換することに
より、そのような大コピー数クローニングベクターから
調製される（このような系の複製開始点は「ハイブリツ
ド開始点」と呼ばれる）。あるいは天然のプロモータを
使い、オペレーター配列（たとえばlacオペレーター、
又はランダフアージのOL又はORオペレーター）などの制
御機能を複製系に導入することにより、RNAの転写がコ
ントロール可能となる。
プラスミツドpMG９（ケイ・タツチエル（Ｋ Ｔａｔｃ
ｈｅｌｌ）ら、「セル」cell，第２７巻、２５−３５
頁、１９８１年１１月号（第２部）に記載の方法により
挿入されたXhoエリンカーDNA配列を含有する）はCol E1
複製開始点に基づくコントロール可能な複製系の調製用
の便利な出発物質を与える。このプラスミツドはRNA I
Iの転写の遺伝暗号を有する配列の出発点の近くにXhoＩ
制限部位を有しており、これはオペレーターやコントロ
ール可能なプロモーター配列（たとえばλPL）を挿入し
て直接コントロール可能な複製系を得るのに用いること
が可能であることを本発明者らは見出した。プラスミツ
ドpMG９はナシヨナル・コレクシヨン・オブ・タイプ・
カルチヤー，セントラル・パブリツク・ヘルス・ラボラ
トリイ(National Collection of Type Cultures,Centra
l Pullic Health Laboratory)(Colindale Anenue,Londo
n NW9 5HT)に1983年３月２４日に、プラスミツドpMG９
を含有する大腸菌Ｋ１２、ＤＨ１株の培養細胞としてNC
TC１１５３９番で寄託した。
ｈｅｌｌ）ら、「セル」cell，第２７巻、２５−３５
頁、１９８１年１１月号（第２部）に記載の方法により
挿入されたXhoエリンカーDNA配列を含有する）はCol E1
複製開始点に基づくコントロール可能な複製系の調製用
の便利な出発物質を与える。このプラスミツドはRNA I
Iの転写の遺伝暗号を有する配列の出発点の近くにXhoＩ
制限部位を有しており、これはオペレーターやコントロ
ール可能なプロモーター配列（たとえばλPL）を挿入し
て直接コントロール可能な複製系を得るのに用いること
が可能であることを本発明者らは見出した。プラスミツ
ドpMG９はナシヨナル・コレクシヨン・オブ・タイプ・
カルチヤー，セントラル・パブリツク・ヘルス・ラボラ
トリイ(National Collection of Type Cultures,Centra
l Pullic Health Laboratory)(Colindale Anenue,Londo
n NW9 5HT)に1983年３月２４日に、プラスミツドpMG９
を含有する大腸菌Ｋ１２、ＤＨ１株の培養細胞としてNC
TC１１５３９番で寄託した。
第一の複製開始点より成る複製系は、任意の適当な小コ
ピー数のプラスミツドから得られる。たとえばpsc１０
１複製開始点より成る複製系を用いることも可能であ
り、プラスミツドpHSG４１５（テイー・ハシモトおよび
ゴトー(T.Hashimoto-Gotoh)ら、「ジーン」Gene、第１
６巻、１９８１年、２２７−２３５頁）はそのような複
製系の便利な供給源を与える。pHSG４１５の複製開始点
は温度感受性であるが、これは温度に対して安定である
野生型のpSC１０１の複製開始点が置換が可能である。
しかし、pHSG４１５は後述する実施例で使用するのに、
便利な温度感受性の複製開始点を与える。
ピー数のプラスミツドから得られる。たとえばpsc１０
１複製開始点より成る複製系を用いることも可能であ
り、プラスミツドpHSG４１５（テイー・ハシモトおよび
ゴトー(T.Hashimoto-Gotoh)ら、「ジーン」Gene、第１
６巻、１９８１年、２２７−２３５頁）はそのような複
製系の便利な供給源を与える。pHSG４１５の複製開始点
は温度感受性であるが、これは温度に対して安定である
野生型のpSC１０１の複製開始点が置換が可能である。
しかし、pHSG４１５は後述する実施例で使用するのに、
便利な温度感受性の複製開始点を与える。
当業者に公知の技術を使つて、コントロール可能な機能
を大コピー数複製系に導入し、大コピー数複製系と小コ
ピー数複製系を結合させ、ベクターに外来遺伝子を導入
することにより、本発明のベクターを作ることができ
る。次に得られたベクターを、標準的な方法を用いて適
当な宿主細胞を形質転換させるのに用い、異種ポリペプ
チド、蛋白及び他の生産物を得ることができる。
を大コピー数複製系に導入し、大コピー数複製系と小コ
ピー数複製系を結合させ、ベクターに外来遺伝子を導入
することにより、本発明のベクターを作ることができ
る。次に得られたベクターを、標準的な方法を用いて適
当な宿主細胞を形質転換させるのに用い、異種ポリペプ
チド、蛋白及び他の生産物を得ることができる。
宿主細胞はS.セレビシエー(S.cere visiae)などの酵母
を含む真核細胞、又はさらに一般的には枯草菌(B.sulti
lis)又は特に大腸菌(E.coli)などの細菌でもよい。
を含む真核細胞、又はさらに一般的には枯草菌(B.sulti
lis)又は特に大腸菌(E.coli)などの細菌でもよい。
以下の実施例（実施例１−７）において本発明をさらに
詳しく説明する。これらの実施例は本発明の複製開始点
を２個有する具体的なプラスミツドの作成に関し、又コ
ピー数コントロール、不均一な遺伝子発現そしてこれら
のプラスミツドの安定性の研究に関する。しかし、本発
明はここに記載する具体的なプラスミツドや方法に限定
されるものではない。
詳しく説明する。これらの実施例は本発明の複製開始点
を２個有する具体的なプラスミツドの作成に関し、又コ
ピー数コントロール、不均一な遺伝子発現そしてこれら
のプラスミツドの安定性の研究に関する。しかし、本発
明はここに記載する具体的なプラスミツドや方法に限定
されるものではない。
実施例については添付の図を参照。
第１図はプラスミツドの制限地図を示し、本発明の複製
開始点を２個有するプラスミツド、pMG４１１、の調製
に使用するDNA操作を示す。
開始点を２個有するプラスミツド、pMG４１１、の調製
に使用するDNA操作を示す。
第２図は３０℃から４２℃へ温度を変更した後１時間毎
に採取した、大腸菌（Ｅ．coli）ＱＹ７のpMG411による
形質転換体の培養菌から単離したDNAをアガロースゲル
で電気泳動したものである（１−７は０−６時間に対
応）。
に採取した、大腸菌（Ｅ．coli）ＱＹ７のpMG411による
形質転換体の培養菌から単離したDNAをアガロースゲル
で電気泳動したものである（１−７は０−６時間に対
応）。
第３図はプラスミツドの制限地図を示し、本発明の複製
開始点を２個有するさらに２つのプラスミツド、pMG１
５９とpMG１６５、の調製に使用するDNA操作を示す。
開始点を２個有するさらに２つのプラスミツド、pMG１
５９とpMG１６５、の調製に使用するDNA操作を示す。
第４図はpMG１５９，pMG１６５，pMG１６８及びpMG１６
９を含有する大腸菌(E.coli)の形質転換体の温度変化
（３０℃から４２℃に変化させ、以後３７℃で培養し
た）後のコピー数の誘導のグラフである。
９を含有する大腸菌(E.coli)の形質転換体の温度変化
（３０℃から４２℃に変化させ、以後３７℃で培養し
た）後のコピー数の誘導のグラフである。
第５図はプラスミツドの制限地図を示し、本発明の代謝
物によりコントロール可能な複製開始点を２個有するベ
クター、pMG４２７、の調製に使用するDNA操作を示す。
物によりコントロール可能な複製開始点を２個有するベ
クター、pMG４２７、の調製に使用するDNA操作を示す。
第６図はプラスミツドの制限地図を示し、本発明の代謝
物によりコントロール可能な複製開始点を２個有するさ
らに２つのベクター、pMG４１５とpMG４１６の調製に使
用するDNA操作を示す。
物によりコントロール可能な複製開始点を２個有するさ
らに２つのベクター、pMG４１５とpMG４１６の調製に使
用するDNA操作を示す。
第７図は温度変更の処理の後に１時間毎に採取した、pM
G１６９により形質転換させた大腸菌(E.coli)Ｅ１０３
（Ｓ）から調製した全細胞抽出液からの蛋白を１０％ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動したものである（１−
８は０−７時間に対応）。
G１６９により形質転換させた大腸菌(E.coli)Ｅ１０３
（Ｓ）から調製した全細胞抽出液からの蛋白を１０％ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動したものである（１−
８は０−７時間に対応）。
第８図はpMG１６９で形質転換させた大腸菌(E.coli)Ｅ
１０３（Ｓ）の培養菌の温度シヨツク処理後のプラスミ
ツドのコピー数とクロラムフエニコールアセチルトラン
スフエラーゼ活性の増加を示すグラフである。
１０３（Ｓ）の培養菌の温度シヨツク処理後のプラスミ
ツドのコピー数とクロラムフエニコールアセチルトラン
スフエラーゼ活性の増加を示すグラフである。
第９図は温度変更の処理の後に５時間にわたつて１時間
毎に採取した、pMG１６９により形質転換させた大腸菌
(E.coli)Ｅ１０３（Ｓ）の培養菌から調製した全細胞抽
出液からの蛋白を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動したものである（６−１は０−５時間に対応）。
毎に採取した、pMG１６９により形質転換させた大腸菌
(E.coli)Ｅ１０３（Ｓ）の培養菌から調製した全細胞抽
出液からの蛋白を１０％ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動したものである（６−１は０−５時間に対応）。
実施例１ コピー数がplにコントロールされている複製開始点を２
個有するプラスミツドの作成 (a) 複製開始点を２個有するプラスミツドpMG404の作
成 プラスミツドpMG15（第１図）は、複製開始点領域（表
１）にXhoＩリンカー(CCTCGAGG)が挿入（タツチエル）
(Tatchell)ら、１９８１年）されているため構成的に大
コピー数（染色体１個当り約３００コピー）のRSa-12(p
BR322レプリコン）の誘導体である。RSa−１２の作成中
にtet遺伝子におけるSalＩ部位を越える消然消失により
rop遺伝子は消失したがBam HI部位は保持された。pMG１
５の1.1 kbのXho I-Bam HI DNA断片をバクテリオフアー
ジＭ１３mp８に挿入し、サンガー(Sanger)らの方法（１
９７７年）によりXhoＩ部位からDNA配列を決定すること
により、XhoＩリンカーの位置を決定した。
個有するプラスミツドの作成 (a) 複製開始点を２個有するプラスミツドpMG404の作
成 プラスミツドpMG15（第１図）は、複製開始点領域（表
１）にXhoＩリンカー(CCTCGAGG)が挿入（タツチエル）
(Tatchell)ら、１９８１年）されているため構成的に大
コピー数（染色体１個当り約３００コピー）のRSa-12(p
BR322レプリコン）の誘導体である。RSa−１２の作成中
にtet遺伝子におけるSalＩ部位を越える消然消失により
rop遺伝子は消失したがBam HI部位は保持された。pMG１
５の1.1 kbのXho I-Bam HI DNA断片をバクテリオフアー
ジＭ１３mp８に挿入し、サンガー(Sanger)らの方法（１
９７７年）によりXhoＩ部位からDNA配列を決定すること
により、XhoＩリンカーの位置を決定した。
リンカーの挿入部位は、RNA IIの転写開始部位から３
０塩基分下流のところにあつた（表１）。このXhoＩリ
ンカーはRNA II転写の５′末端に近いユニークな切断
部位を与え、pMG１５から単離した1.1 kbのXho I-Bam H
I断片はプロモーターのないRNA II配列を有していた
（第１図）。別のプロモーターに結合させた時この配列
がDNA複製のプライマーとして機能するか否かを調べる
ため、この1.1 kb断片をプラスミツドpHSG４１５のKm耐
性遺伝子(KmR)プロモータ（ハシモトおよびゴトーHashi
moto-Gotohら、１９８１年）の下流に挿入した（第１
図）。pHSG415は安定な小コピー数のApRKmRCmRプラスミ
ツドでありその複製開始点はpSC101に由来する。このプ
ラスミツドは３０℃で複製するが４２℃では複製しな
い。
０塩基分下流のところにあつた（表１）。このXhoＩリ
ンカーはRNA II転写の５′末端に近いユニークな切断
部位を与え、pMG１５から単離した1.1 kbのXho I-Bam H
I断片はプロモーターのないRNA II配列を有していた
（第１図）。別のプロモーターに結合させた時この配列
がDNA複製のプライマーとして機能するか否かを調べる
ため、この1.1 kb断片をプラスミツドpHSG４１５のKm耐
性遺伝子(KmR)プロモータ（ハシモトおよびゴトーHashi
moto-Gotohら、１９８１年）の下流に挿入した（第１
図）。pHSG415は安定な小コピー数のApRKmRCmRプラスミ
ツドでありその複製開始点はpSC101に由来する。このプ
ラスミツドは３０℃で複製するが４２℃では複製しな
い。
制限酵素による消化、DNAの結合、及びアガロースゲル
電気泳動の条件はマニアテイス(Maniatis)ら（１９８２
年）が記載した方法を使用した。pMG15からのXho I-Bam
HI断片の挿入、KmRプロモーターへのプロモーターのな
いRNA II配列の結合により、複製開始点を２個有する
プラスミツドpMG404が得られた（第１図）。制限酵素消
化による解析によりプラスミツドpMG404の構造は証明さ
れ（結果は示してない）、プラスミツドDNAの収率から
そのコピー数はpHSG415よりかなり多いことが証明され
た。さらにpMG404は細菌中で４２℃で維持されたが、pH
SG415はこの温度での複製は不可能なため消失した。ハ
イブリツドである「Col E1」複製開始点はpMG404中で機
能しておりKmR遺伝子プロモーターはRNA IIプロモータ
ーに代わり得ることを示していると結論された。
電気泳動の条件はマニアテイス(Maniatis)ら（１９８２
年）が記載した方法を使用した。pMG15からのXho I-Bam
HI断片の挿入、KmRプロモーターへのプロモーターのな
いRNA II配列の結合により、複製開始点を２個有する
プラスミツドpMG404が得られた（第１図）。制限酵素消
化による解析によりプラスミツドpMG404の構造は証明さ
れ（結果は示してない）、プラスミツドDNAの収率から
そのコピー数はpHSG415よりかなり多いことが証明され
た。さらにpMG404は細菌中で４２℃で維持されたが、pH
SG415はこの温度での複製は不可能なため消失した。ハ
イブリツドである「Col E1」複製開始点はpMG404中で機
能しておりKmR遺伝子プロモーターはRNA IIプロモータ
ーに代わり得ることを示していると結論された。
pMG404をBal lで消化し、ハイブリツド複製開始点のみ
を含有する大きい方の断片を再び環状化させることによ
り、ハイブリツド複製開始点が機能していることを確認
した。これにより３０℃と４２℃の両方で自律複製が可
能なプラスミツドpMG410が得られ、ハイブリツド複製開
始点が機能していることが証明された。
を含有する大きい方の断片を再び環状化させることによ
り、ハイブリツド複製開始点が機能していることを確認
した。これにより３０℃と４２℃の両方で自律複製が可
能なプラスミツドpMG410が得られ、ハイブリツド複製開
始点が機能していることが証明された。
(b) 複製開始点を２個有するpMG411の作成 プラスミツドpMG404は２個の複製開始点を有する：pSG1
01の小コピー数複製開始点と「ColＥ１」ハイブリツド
複製開始点．pSC101の複製開始点により３０℃における
プラスミツドの安定な複製が確保され(Hashimoto-Gotoh
ら、１９８１年）、コントロール可能なプロモーターに
より作動される「ColＥ１」ハイブリツド複製開始点を
有する誘導体の作成が可能になる。バクテリオフアージ
λのPlプロモーターを有する0.5 kbのSal I-Eco RI DNA
断片をプラスミッドpCT1050〔Yarranton et al.,Gene,2
8,(1984),293-300〕（第１図）から単離し（第１図）、
pMG404からの5.5 kbのEco RI-Xho l断片と結合させた。
この結合混液を用いて大腸菌QY 7（λcI５７欠陥溶原
菌）とDH１を３０℃で形質転換させ、ApR形質転換体をC
mSクローンについてスクリーニングした。このうちの１
つのpMG411を以後の研究に選んだ（第１図）。
01の小コピー数複製開始点と「ColＥ１」ハイブリツド
複製開始点．pSC101の複製開始点により３０℃における
プラスミツドの安定な複製が確保され(Hashimoto-Gotoh
ら、１９８１年）、コントロール可能なプロモーターに
より作動される「ColＥ１」ハイブリツド複製開始点を
有する誘導体の作成が可能になる。バクテリオフアージ
λのPlプロモーターを有する0.5 kbのSal I-Eco RI DNA
断片をプラスミッドpCT1050〔Yarranton et al.,Gene,2
8,(1984),293-300〕（第１図）から単離し（第１図）、
pMG404からの5.5 kbのEco RI-Xho l断片と結合させた。
この結合混液を用いて大腸菌QY 7（λcI５７欠陥溶原
菌）とDH１を３０℃で形質転換させ、ApR形質転換体をC
mSクローンについてスクリーニングした。このうちの１
つのpMG411を以後の研究に選んだ（第１図）。
DH１とQY７のプラスミツドpMG411の形質転換体は選択さ
れた条件下で充分増殖し、種々の増殖温度でコピー数の
測定を行なつた。
れた条件下で充分増殖し、種々の増殖温度でコピー数の
測定を行なつた。
(c) pMG411のコピー数測定 ２種類の方法によりプラスミツドのコピー数を求めた。
１つの方法は塩化セシウム遠心分離による染色体DNAと
超コイルDNAの分離に依存する。第二の方法はアガロー
スゲル電気泳動による染色体DNAとプラスミツドDNAの分
離に依存する。アンピシリンを含有するＬ−ブロース中
で細胞を一晩増殖させ、アンピシリンを含有する最小Ｍ
９塩中へ１００倍希釈した。OD660＝0.5のところで２−
デオキシアデノシン（200μｇ／ｍ）チミジン（１μ
ｇ／ｍ）、及び〔３Ｈ〕−チミジン（４μｇ Ci／ｍ
）を加え、インキユベーシヨンを２時間続けた。細胞
を遠心分離し洗浄し、等量の５０mMトリスHCl pH 7.5、
１０％シヨ糖（w/v）及びリゾチーム（２００μｇ／ｍ
）中に再浮遊させた。０℃で１０分間インキユベーシ
ヨン後EDTAを１０mMになるように加え、インキユベーシ
ヨンを１０分間続け、最後にサルコジル（0.45 w/v）を
加えた。溶解液中の染色体DNAを１９ゲージの針の中を
６回通過させて剪断変形させ、細胞破片を遠心分離で除
去した。DNA調製液をさらに１回のフエノールとクロロ
ホルムの抽出及びエタノールの沈澱により精製した。こ
の標識したDNA調製液を用いて２つの方法によるコピー
数の定量を行なつた。
１つの方法は塩化セシウム遠心分離による染色体DNAと
超コイルDNAの分離に依存する。第二の方法はアガロー
スゲル電気泳動による染色体DNAとプラスミツドDNAの分
離に依存する。アンピシリンを含有するＬ−ブロース中
で細胞を一晩増殖させ、アンピシリンを含有する最小Ｍ
９塩中へ１００倍希釈した。OD660＝0.5のところで２−
デオキシアデノシン（200μｇ／ｍ）チミジン（１μ
ｇ／ｍ）、及び〔３Ｈ〕−チミジン（４μｇ Ci／ｍ
）を加え、インキユベーシヨンを２時間続けた。細胞
を遠心分離し洗浄し、等量の５０mMトリスHCl pH 7.5、
１０％シヨ糖（w/v）及びリゾチーム（２００μｇ／ｍ
）中に再浮遊させた。０℃で１０分間インキユベーシ
ヨン後EDTAを１０mMになるように加え、インキユベーシ
ヨンを１０分間続け、最後にサルコジル（0.45 w/v）を
加えた。溶解液中の染色体DNAを１９ゲージの針の中を
６回通過させて剪断変形させ、細胞破片を遠心分離で除
去した。DNA調製液をさらに１回のフエノールとクロロ
ホルムの抽出及びエタノールの沈澱により精製した。こ
の標識したDNA調製液を用いて２つの方法によるコピー
数の定量を行なつた。
アガロースゲル法については、試料を0.7％アガロース
ゲル（0.04Ｎトリスアセテート、0.001 MEDTA、pH7.9
中）上で５０Ｖで１２時間電気泳動を行なつた。臭化エ
チジウムで染色してDNAバンドを肉眼で見えるようにし
た。染色体DNAとプラスミツドDNAバンドをゲルから切り
取り、飽和ヨウ化ナトリウムに溶解させ、１０％（w/
v）トリクロロ酢酸（TAC）を加えてDNAを沈澱させた。
沈澱物をGF/Cワツトマン濾紙上に集め、１０％（w/v)TC
A、エタノールで洗い風乾した。液体シンチレーシヨン
カウンター中で放射能を計測定量した。
ゲル（0.04Ｎトリスアセテート、0.001 MEDTA、pH7.9
中）上で５０Ｖで１２時間電気泳動を行なつた。臭化エ
チジウムで染色してDNAバンドを肉眼で見えるようにし
た。染色体DNAとプラスミツドDNAバンドをゲルから切り
取り、飽和ヨウ化ナトリウムに溶解させ、１０％（w/
v）トリクロロ酢酸（TAC）を加えてDNAを沈澱させた。
沈澱物をGF/Cワツトマン濾紙上に集め、１０％（w/v)TC
A、エタノールで洗い風乾した。液体シンチレーシヨン
カウンター中で放射能を計測定量した。
塩化セシウム遠心分離法によるコピー数測定について
は、DNAを塩化セシウム−臭化エチジウム中ベツクマンT
I５０ローター中で48,000rpmで２４時間遠心分離し平衡
化させた。この濃度勾配液を分別し、各画分をTCAでGF/
Cワツトマン濾紙上に沈澱させ、洗浄し上記したように
処理した。
は、DNAを塩化セシウム−臭化エチジウム中ベツクマンT
I５０ローター中で48,000rpmで２４時間遠心分離し平衡
化させた。この濃度勾配液を分別し、各画分をTCAでGF/
Cワツトマン濾紙上に沈澱させ、洗浄し上記したように
処理した。
３０℃、３７℃及び４２℃でpMG15,pAT153,及びpMG411
からプラスミツドコピー数を測定し、得られた結果を表
２に示す。
からプラスミツドコピー数を測定し、得られた結果を表
２に示す。
種々の温度でのQY7株（λ溶原菌）でのpMG411のコピー
数の測定によりλリプレツサーはpMG411コピー数をコン
トロールしていることが証明された。３０℃での増殖後
はコピー数は染色体１個当り４であつたが、３７℃では
７８に増加し、４２℃では染色体１個当り１４３に増加
した（表２）。
数の測定によりλリプレツサーはpMG411コピー数をコン
トロールしていることが証明された。３０℃での増殖後
はコピー数は染色体１個当り４であつたが、３７℃では
７８に増加し、４２℃では染色体１個当り１４３に増加
した（表２）。
pMG411中のハイブリツド「colＥ１」複製開始点はλリ
プレツサーを不活性化することによりスイツチがはいる
ことを示すために、QY7の形質変換体を３０℃で増殖さ
せ、次に指数増殖中に温度を４２℃に上げた。プラスミ
ツドコピー数の増加後培養菌１ｍから単離したDNAの
アガロースゲル分析を行なつた（第２図）。試料は７時
間にわたつて１時間毎に採取した。予想通り７時間にわ
たつてpMG411のコピー数の増加が観察された。
プレツサーを不活性化することによりスイツチがはいる
ことを示すために、QY7の形質変換体を３０℃で増殖さ
せ、次に指数増殖中に温度を４２℃に上げた。プラスミ
ツドコピー数の増加後培養菌１ｍから単離したDNAの
アガロースゲル分析を行なつた（第２図）。試料は７時
間にわたつて１時間毎に採取した。予想通り７時間にわ
たつてpMG411のコピー数の増加が観察された。
実施例２ Prにコントロールされる誘導可能なコピー数を有する、
複製開始点を２個有するプラスミツドの作成 (a) 複製開始点を２個有するプラスミツドpMG159とpMG
165の作成 プラスミツドpMG411は小コピー数の複製開始点pSC101
と、Plに作動されるColＥ１複製開始点の２個の複製開
始点を有する。コピー数コントロールにはリプレツサー
遺伝子であるcI８７が必要なため、pMGの溶原性細菌
株への使用を制限している。この制限を克服するためcI
８７を有する複製開始点を２個持つプラスミツドを作
成した。
複製開始点を２個有するプラスミツドの作成 (a) 複製開始点を２個有するプラスミツドpMG159とpMG
165の作成 プラスミツドpMG411は小コピー数の複製開始点pSC101
と、Plに作動されるColＥ１複製開始点の２個の複製開
始点を有する。コピー数コントロールにはリプレツサー
遺伝子であるcI８７が必要なため、pMGの溶原性細菌
株への使用を制限している。この制限を克服するためcI
８７を有する複製開始点を２個持つプラスミツドを作
成した。
まず第一に外来遺伝子の以後のクローニングを容易にす
るためにSalとHind IIIの制限部位より成るオリゴヌク
レオチドを、pMG411のハイブリツド複製開始点のすぐ下
流のBam HI部位に挿入した。こうしてpMG153が得られた
（図３）。pMG153の5.9 kbのEco RI-Bam HI断片を精製
し、pCQV2（クイーン（Queen）、１９８３年）の1.1 kb
のEco RI-BamHI断片に結合させてpMG159を得た。pCQV2
のEco RI-Bam HI断片はPr及びcI８７遺伝子共に有し
ており、pMG153に挿入するとPl含有断片と置き換わり、
ColＥ１複製開始調RNA II配列をPrと融合させる。リプ
レツサー遺伝子は複製開始点から離れる方向へ転写され
ることに注意（第３図）。この複製開始点を２個有する
ベクターを３０℃に維持したときのプラスミツドの安定
化（下記参照）を増加させるために、複製開始点、複製
蛋白、及びpar配列を有するpSC101の2.85 kb Hinc II
断片をpMG159に導入し、3.25 kbのEco RI-Bal Ｉを断
片を、一端にEco RIリンカーを有するpSC101のHinc II
断片で置換した。こうしてpMG165が得られた（第３
図）。
るためにSalとHind IIIの制限部位より成るオリゴヌク
レオチドを、pMG411のハイブリツド複製開始点のすぐ下
流のBam HI部位に挿入した。こうしてpMG153が得られた
（図３）。pMG153の5.9 kbのEco RI-Bam HI断片を精製
し、pCQV2（クイーン（Queen）、１９８３年）の1.1 kb
のEco RI-BamHI断片に結合させてpMG159を得た。pCQV2
のEco RI-Bam HI断片はPr及びcI８７遺伝子共に有し
ており、pMG153に挿入するとPl含有断片と置き換わり、
ColＥ１複製開始調RNA II配列をPrと融合させる。リプ
レツサー遺伝子は複製開始点から離れる方向へ転写され
ることに注意（第３図）。この複製開始点を２個有する
ベクターを３０℃に維持したときのプラスミツドの安定
化（下記参照）を増加させるために、複製開始点、複製
蛋白、及びpar配列を有するpSC101の2.85 kb Hinc II
断片をpMG159に導入し、3.25 kbのEco RI-Bal Ｉを断
片を、一端にEco RIリンカーを有するpSC101のHinc II
断片で置換した。こうしてpMG165が得られた（第３
図）。
(b) Prに作動される複製開始点を２個有するプラスミ
ツドのコピー数のコントロール Prによつて作動される「colＥ１」ハイブリツド複製開
始点はクローン化したcI８７遺伝子から発現される温
度感受性リプレツサーによりコントロールされることを
証明するために、pMG159とpMG165を大腸菌Ｅ１０３(S)
に導入した。３０℃におけるコピー数の測定は前記した
如く、３Ｈ−チミジン標識細胞から行なつた（表３）。
４２℃への温度変更後のコピー数の誘導をアガロースゲ
ル電気泳動で追跡した。Ｌ−ブロース中のコピー数の変
化と誘導の動力学を定量するために「スポツト」ハイブ
リダイゼーシヨン法を使用した。
ツドのコピー数のコントロール Prによつて作動される「colＥ１」ハイブリツド複製開
始点はクローン化したcI８７遺伝子から発現される温
度感受性リプレツサーによりコントロールされることを
証明するために、pMG159とpMG165を大腸菌Ｅ１０３(S)
に導入した。３０℃におけるコピー数の測定は前記した
如く、３Ｈ−チミジン標識細胞から行なつた（表３）。
４２℃への温度変更後のコピー数の誘導をアガロースゲ
ル電気泳動で追跡した。Ｌ−ブロース中のコピー数の変
化と誘導の動力学を定量するために「スポツト」ハイブ
リダイゼーシヨン法を使用した。
「スポツト」ハイブリダイゼーシヨン用に、ニツクトラ
ンスレーシヨン法（マニアテイス（Maniatis）ら、１９
８２年）により32ｐ−標識プローブDNAを調製した。温
度変更後の種々の時間に採取した１ｍの培養菌からア
ルカリ溶解法（アイシユ−ホロウイツツおよびバーク
（Ish-Horowitz and Burke）、１９８１年によりDNA試
料を調製した。DNA調製試料をRNaseで３７℃５分処理し
た後、制限酵素Bam HIで３０分インキユベーシヨンし、
１００℃で３分間熱変性させた。異なる量の消化したDN
A調製液をニトロセルロースフイルター上にスポツト
し、これを７０℃で乾燥し次に２×SSC／５０％ホルム
アミド中３７℃で変性したプローブDNAと一晩（１５時
間）ハイブリダイズさせた。次に２×SSC／５０％ホル
ムアミド中でフイルターを２回洗浄し、２×SSC中で１
回洗浄した後風乾した。液体シンチレーシヨンカウンタ
ー中で放射能を測定した。得られた値を誘導中の細胞増
殖量により補正し、誘導しない時の値に対するコピー数
の変化の大きさを測定した。
ンスレーシヨン法（マニアテイス（Maniatis）ら、１９
８２年）により32ｐ−標識プローブDNAを調製した。温
度変更後の種々の時間に採取した１ｍの培養菌からア
ルカリ溶解法（アイシユ−ホロウイツツおよびバーク
（Ish-Horowitz and Burke）、１９８１年によりDNA試
料を調製した。DNA調製試料をRNaseで３７℃５分処理し
た後、制限酵素Bam HIで３０分インキユベーシヨンし、
１００℃で３分間熱変性させた。異なる量の消化したDN
A調製液をニトロセルロースフイルター上にスポツト
し、これを７０℃で乾燥し次に２×SSC／５０％ホルム
アミド中３７℃で変性したプローブDNAと一晩（１５時
間）ハイブリダイズさせた。次に２×SSC／５０％ホル
ムアミド中でフイルターを２回洗浄し、２×SSC中で１
回洗浄した後風乾した。液体シンチレーシヨンカウンタ
ー中で放射能を測定した。得られた値を誘導中の細胞増
殖量により補正し、誘導しない時の値に対するコピー数
の変化の大きさを測定した。
pMG159及びpMG165共に４２℃に温度変更し、続けて３７
℃でインキユベーシヨンしたとき、急速なコピー数の誘
導を示した。誘導しないとき染色体１個当り３−４コピ
ーであつたものが、２時間の誘導後に９０−１００コピ
ーに増加し、４−５時間後には３００−４００コピーに
増加しており、これはクローン化PrプロモーターとcI
８７遺伝子によりコピー数がコントロールされている
ことを明白に証明している。
℃でインキユベーシヨンしたとき、急速なコピー数の誘
導を示した。誘導しないとき染色体１個当り３−４コピ
ーであつたものが、２時間の誘導後に９０−１００コピ
ーに増加し、４−５時間後には３００−４００コピーに
増加しており、これはクローン化PrプロモーターとcI
８７遺伝子によりコピー数がコントロールされている
ことを明白に証明している。
実施例３ Ptrpにコントロールされる誘導可能なコピー数を有する
複製開始点を２個有するプラスミツドの作成 コントロール可能なコピー数を有する複製開始点を２個
有するプラスミツドの上記２例では誘導に温度を使用し
たが、本例では代謝物を用いてコピー数をコントロール
している。pMG411の6.2 kbのHind III−Bgl II断片
を、標準緩衝液と標準方法（Maniatisら、１９８２年）
を用いてpCT54〔Emtage et al.,PNAS USA,80,(1983),36
71-3675の0.65 kb Hind III−Bam HI断片と結合させた
（第５図）。このプラスミツドはアンピシリンの選択下
及び培地にトリプロフアンが存在（これはPtrpからの転
写を抑制するはずである）した場合も不安定であつた。
この不安定性の原因はPtrpからの転写を完全に抑制する
ことができず大コピー数になると結論づけた。複製開始
点を通る転写を減少させるためにPtrpと「CalＥ１」複
製開始点配列の間に転写停止物質を挿入した。このよう
な転写停止物質は転写のレベルを約１０倍減少させる。
早期転写停止物質を有する、バクテリオフアージＴ７DN
Aからの１８０bp Alu lをDNAリンカーに結合させ、末端
をHind III認識部位に変えた（エムタージイ(Emtage)
ら、１９８３年）。次にこの断片をHind IIIで消化し
たpMG426DNAに結合させてpMG427を得た（図５）。pMG42
7はpMG426よりも安定であり、形質転換体をトリプトフ
アン（１００μｇ／ｍ）を含有する培地で増殖させた
とき小コピー数を示した。この培養菌をトリプトフアン
欠之培地に移すとコピー数は急速に増加した。これはRN
A II転写は代謝物又は外からの培地中の化学物質の濃
度によつてコントロールし得ることを示しており、コピ
ー数は温度以外の要因により変化させ得ることを証明し
ている。
複製開始点を２個有するプラスミツドの作成 コントロール可能なコピー数を有する複製開始点を２個
有するプラスミツドの上記２例では誘導に温度を使用し
たが、本例では代謝物を用いてコピー数をコントロール
している。pMG411の6.2 kbのHind III−Bgl II断片
を、標準緩衝液と標準方法（Maniatisら、１９８２年）
を用いてpCT54〔Emtage et al.,PNAS USA,80,(1983),36
71-3675の0.65 kb Hind III−Bam HI断片と結合させた
（第５図）。このプラスミツドはアンピシリンの選択下
及び培地にトリプロフアンが存在（これはPtrpからの転
写を抑制するはずである）した場合も不安定であつた。
この不安定性の原因はPtrpからの転写を完全に抑制する
ことができず大コピー数になると結論づけた。複製開始
点を通る転写を減少させるためにPtrpと「CalＥ１」複
製開始点配列の間に転写停止物質を挿入した。このよう
な転写停止物質は転写のレベルを約１０倍減少させる。
早期転写停止物質を有する、バクテリオフアージＴ７DN
Aからの１８０bp Alu lをDNAリンカーに結合させ、末端
をHind III認識部位に変えた（エムタージイ(Emtage)
ら、１９８３年）。次にこの断片をHind IIIで消化し
たpMG426DNAに結合させてpMG427を得た（図５）。pMG42
7はpMG426よりも安定であり、形質転換体をトリプトフ
アン（１００μｇ／ｍ）を含有する培地で増殖させた
とき小コピー数を示した。この培養菌をトリプトフアン
欠之培地に移すとコピー数は急速に増加した。これはRN
A II転写は代謝物又は外からの培地中の化学物質の濃
度によつてコントロールし得ることを示しており、コピ
ー数は温度以外の要因により変化させ得ることを証明し
ている。
実施例４ 「tac」プロモーターにコントロールされる誘導可能な
コピー数を有する複製開始点を２個有するプラスミツド
の作成 本例では、RNA IIプロモーターをtacプロモーター（Pt
ac）（ラツセルおよびベネツト(Russell and Bennet)、
１９８２年）により置換することによりコピー数がラク
トース又はラクトース類似化合物の添加又は除去により
コントロールされるようにしたベクターを作成した。Pt
acを有する１２１bp Bam HI-Eco RIのDNA断片をpDR540
より精製した。この断片をBam HI-Eco RIで消化したpMG
404 DNAに結合させ、大腸菌DH１のアンピシリン耐性、
クロラムフエニコール感受性形質転換体を単離した。こ
のような形質転換体のひとつからプラスミツドDNAを単
離し制限酵素により解析した結果、クロラムフエニコー
ル耐性遺伝子中に１２１bp断片が挿入されていることが
証明された（pMG421）（第６図）。pMG421 DNAをBam HI
で消化し、子牛腸アルカリフオスフアターゼで処理し、
pMG411から単離した1.2 kbのBam HIのプロモーターのな
い複製開始点に結合させた。形質転換混液を３０℃又は
４２℃で広げると、大腸菌DH１のアンピシリン耐性形質
転換体が得られた。４２℃では小コピー数複製開始点は
活性がなかつた。この形質転換体から２つのかけ離れた
プラスミツド型が同定された（pMG415とpMG416）（第６
図）。pMG415は正しい方向に（Ptacの下流に）単一のBa
m HI複製開始点断片を有しており、一方pMG416は複製開
始点断片が３つそのまま繰返しの形で、これもPtacから
の発現の方向を向いていた（第６図）。
コピー数を有する複製開始点を２個有するプラスミツド
の作成 本例では、RNA IIプロモーターをtacプロモーター（Pt
ac）（ラツセルおよびベネツト(Russell and Bennet)、
１９８２年）により置換することによりコピー数がラク
トース又はラクトース類似化合物の添加又は除去により
コントロールされるようにしたベクターを作成した。Pt
acを有する１２１bp Bam HI-Eco RIのDNA断片をpDR540
より精製した。この断片をBam HI-Eco RIで消化したpMG
404 DNAに結合させ、大腸菌DH１のアンピシリン耐性、
クロラムフエニコール感受性形質転換体を単離した。こ
のような形質転換体のひとつからプラスミツドDNAを単
離し制限酵素により解析した結果、クロラムフエニコー
ル耐性遺伝子中に１２１bp断片が挿入されていることが
証明された（pMG421）（第６図）。pMG421 DNAをBam HI
で消化し、子牛腸アルカリフオスフアターゼで処理し、
pMG411から単離した1.2 kbのBam HIのプロモーターのな
い複製開始点に結合させた。形質転換混液を３０℃又は
４２℃で広げると、大腸菌DH１のアンピシリン耐性形質
転換体が得られた。４２℃では小コピー数複製開始点は
活性がなかつた。この形質転換体から２つのかけ離れた
プラスミツド型が同定された（pMG415とpMG416）（第６
図）。pMG415は正しい方向に（Ptacの下流に）単一のBa
m HI複製開始点断片を有しており、一方pMG416は複製開
始点断片が３つそのまま繰返しの形で、これもPtacから
の発現の方向を向いていた（第６図）。
プラスミツドpMG415とpMG416を導入して大腸菌Ｄ９００
(lac Isq)とした。これはPtacプロモーターのコントロ
ール要素であるlacリプレツサーを過剰に産生する。ラ
クトース類似化合物であるIPTG（イソプロピルチオガラ
クトシド）を添加することによりPtacを誘導し得る。Ｌ
−ブロース中で増殖させたＤ９００のpMG415形質転換体
はアガロースゲル電気泳動で測定すると小コピー数であ
つたが、これはIPIGを添加しても増加しなかつた。Ｌ−
ブロース中で増殖させたＤ９００のpMG416形質転換体は
小コピー数であり、これは培養液にIPIGを添加すると急
速に増加し、PtacからのpMG416のコピー数誘導がコント
ロール可能であることを示している。
(lac Isq)とした。これはPtacプロモーターのコントロ
ール要素であるlacリプレツサーを過剰に産生する。ラ
クトース類似化合物であるIPTG（イソプロピルチオガラ
クトシド）を添加することによりPtacを誘導し得る。Ｌ
−ブロース中で増殖させたＤ９００のpMG415形質転換体
はアガロースゲル電気泳動で測定すると小コピー数であ
つたが、これはIPIGを添加しても増加しなかつた。Ｌ−
ブロース中で増殖させたＤ９００のpMG416形質転換体は
小コピー数であり、これは培養液にIPIGを添加すると急
速に増加し、PtacからのpMG416のコピー数誘導がコント
ロール可能であることを示している。
実施例５ 複製開始点を２個有するプラスミツドにクローン化した
子牛の胃のmetプロキモシン遺伝子の発現 (a) pMG168の作成 複製開始点を２個有するプラスミツドが大腸菌中のクロ
ーン化した不均一遺伝子の発現に有用であることを証明
するため、子牛のmet−プロキモシン遺伝子を有するプ
ラスミツドを作成した。pCT70(Emtageら、１９８３年）
をHind IIIとSal lで消化し、Ptrpにコントロールされ
るmet−プロキモシン遺伝子を有する〜2.4 kb断片を単
離した。この断片をpMG165より単離した２つのDNA断片
（5.6 kbのSal l-Pst l断片と１kbのHind III−Pst l
断片）に結合させた（第３図）。こうして大腸菌DH１の
形質転換体より単離したプラスミツド（pMG168）は複製
開始点の下流にクローン化した遺伝子を有しており、Pr
を通過するいかなる転写もmet−プロキモシン遺伝子を
追加転写することになる（第３図）。
子牛の胃のmetプロキモシン遺伝子の発現 (a) pMG168の作成 複製開始点を２個有するプラスミツドが大腸菌中のクロ
ーン化した不均一遺伝子の発現に有用であることを証明
するため、子牛のmet−プロキモシン遺伝子を有するプ
ラスミツドを作成した。pCT70(Emtageら、１９８３年）
をHind IIIとSal lで消化し、Ptrpにコントロールされ
るmet−プロキモシン遺伝子を有する〜2.4 kb断片を単
離した。この断片をpMG165より単離した２つのDNA断片
（5.6 kbのSal l-Pst l断片と１kbのHind III−Pst l
断片）に結合させた（第３図）。こうして大腸菌DH１の
形質転換体より単離したプラスミツド（pMG168）は複製
開始点の下流にクローン化した遺伝子を有しており、Pr
を通過するいかなる転写もmet−プロキモシン遺伝子を
追加転写することになる（第３図）。
(b) pMG168からのmet−プロキモシン蛋白の発現 pMG168を大腸菌Ｅ１０３(S)に導入し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によりmet−プロキモシンの発現を
調べた。大腸菌Ｅ１０３(S)形質転換体をＬ−ブロース
中３０℃でOD600＝0.4になるまで増殖させ４２℃に温度
を変更した。次に培養菌を３７℃で攪拌しながらインキ
ユベートし、１時間毎に試料を採取してコピー数と蛋白
の発現を調べた。DNAコピー数はpMG159及びpMG165に記
載した方法と同じ方法で測定した。蛋白の分析用に、各
培養試料を遠心分離し、ペレツトを集め停止緩衝液（１
％SDS、１０mMトリスHcl、pH7.5）と、等量の試料緩衝液
（0.12％トリスHcl、pH6.8、２０％グリセロール、1.2Ｍ
β−メルカプトエタノール、６％SDS）に再浮遊させ、
３分間沸騰させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
染色及び脱色法は基本的にManiatisら（１９８２年）が
記載した方法と同じである。ジヨイス・レーベル（Joyc
e Loebl）社のクロモスキヤン（Chromoscan）を用いて
５３０mmで、染色したポリアクリルアミドゲルをスキヤ
ンした。温度を３０℃から４２℃に変更するとプラスミ
ツドコピー数とmet−プロキモシン蛋白濃度も著しく増
加した（表４、第４図と第７図）。
ミドゲル電気泳動法によりmet−プロキモシンの発現を
調べた。大腸菌Ｅ１０３(S)形質転換体をＬ−ブロース
中３０℃でOD600＝0.4になるまで増殖させ４２℃に温度
を変更した。次に培養菌を３７℃で攪拌しながらインキ
ユベートし、１時間毎に試料を採取してコピー数と蛋白
の発現を調べた。DNAコピー数はpMG159及びpMG165に記
載した方法と同じ方法で測定した。蛋白の分析用に、各
培養試料を遠心分離し、ペレツトを集め停止緩衝液（１
％SDS、１０mMトリスHcl、pH7.5）と、等量の試料緩衝液
（0.12％トリスHcl、pH6.8、２０％グリセロール、1.2Ｍ
β−メルカプトエタノール、６％SDS）に再浮遊させ、
３分間沸騰させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
染色及び脱色法は基本的にManiatisら（１９８２年）が
記載した方法と同じである。ジヨイス・レーベル（Joyc
e Loebl）社のクロモスキヤン（Chromoscan）を用いて
５３０mmで、染色したポリアクリルアミドゲルをスキヤ
ンした。温度を３０℃から４２℃に変更するとプラスミ
ツドコピー数とmet−プロキモシン蛋白濃度も著しく増
加した（表４、第４図と第７図）。
３７℃でのインキユベーシヨン後の９０分間にコピー数
は急速に増加したが、met−プロキモシンの蓄積はもつ
とゆるやかであつた。ポリアクリルアミドゲルのスキヤ
ンから、温度変更後４−５時間までに組換え遺伝子産物
は全抽出可能蛋白の少なくとも１０％まで蓄積した。pM
G168の誘導されたコピー数は、複製開始点を２個有する
親のプラスミツド（pMG165）より少なかったが、それで
も染色体１個当り３−４から１２０−１５０まで増加し
た。pMG168は誘導後細胞生存率が低下したがpMG165では
変化はなかつた。この生存率の減少は組換え遺伝子産物
が毒性が出る量まで蓄積したためであると結論づけた。
は急速に増加したが、met−プロキモシンの蓄積はもつ
とゆるやかであつた。ポリアクリルアミドゲルのスキヤ
ンから、温度変更後４−５時間までに組換え遺伝子産物
は全抽出可能蛋白の少なくとも１０％まで蓄積した。pM
G168の誘導されたコピー数は、複製開始点を２個有する
親のプラスミツド（pMG165）より少なかったが、それで
も染色体１個当り３−４から１２０−１５０まで増加し
た。pMG168は誘導後細胞生存率が低下したがpMG165では
変化はなかつた。この生存率の減少は組換え遺伝子産物
が毒性が出る量まで蓄積したためであると結論づけた。
実施例６ 複製開始点を２個有するプラスミツドにクローン化させ
たクロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ遺
伝子の発現 (a) pMG169の作成 ポリアクリルアミドゲル上の染色した蛋白を正確に測定
することは限界があるため、複製開始点を２個有するベ
クター上のクローン化遺伝子の発現を、プラスミツドpM
G169のコピー数誘導後のクロラムフエニコールアセチル
トランスフエラーゼ活性の増加を測定することにより、
さらに定量した。精製したHind IV−SalI断片はPtrp
（第３図）にコントロールされるクロラムフエニコール
アセチルトランスフエラーゼの構造遺伝子を有している
ことを除いては、pMG168（実施例５）の作成と同様の方
法でpMG165よりプラスミツドpMG169を作った。ここで用
いたプラスミツドpCT119については、Shottle et al.,
(1981),J.Bacteriol.,146,360-368；及びRobinson et a
l.,Nucleic Acids Research,12(7),(1984)が参考とされ
る。
たクロラムフエニコールアセチルトランスフエラーゼ遺
伝子の発現 (a) pMG169の作成 ポリアクリルアミドゲル上の染色した蛋白を正確に測定
することは限界があるため、複製開始点を２個有するベ
クター上のクローン化遺伝子の発現を、プラスミツドpM
G169のコピー数誘導後のクロラムフエニコールアセチル
トランスフエラーゼ活性の増加を測定することにより、
さらに定量した。精製したHind IV−SalI断片はPtrp
（第３図）にコントロールされるクロラムフエニコール
アセチルトランスフエラーゼの構造遺伝子を有している
ことを除いては、pMG168（実施例５）の作成と同様の方
法でpMG165よりプラスミツドpMG169を作った。ここで用
いたプラスミツドpCT119については、Shottle et al.,
(1981),J.Bacteriol.,146,360-368；及びRobinson et a
l.,Nucleic Acids Research,12(7),(1984)が参考とされ
る。
(b) クローン化したクロラムフエニコールアセチルト
ランスフエラーゼの発現 pMG169を大腸菌E103(S)に導入し、クロラムフエニコー
ルアセチルトランスフエラーゼ濃度をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法と酵素定量法（シヨー(Shaw)，１９７
５年）で測定した。実施例５のpMG168形質転換体につい
て記載したように、大腸菌E103(S)形質変換体を増殖さ
せ４２℃に温度を変更して誘導し、３７℃でインキユベ
ーシヨンを続けた。一時間毎に試料を採取しプラスミツ
ドコピー数を定量し（第４図，第８図）、クロラムフエ
ニコールアセチルトランスフエラーゼの比活性を定量し
（Shaw，１９７５年、「リード・アンド ノルソコー
ト」Read and Northocote,１９８１年）（図８，表
５）、そして試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた（第９図）。このプラスミツドコピー数はpMG168
と類似の動力学的変化を示し、類似の絶対値を有してい
た（第４図）。クロラムフエニコールアセチルトランス
フエラーゼ活性は、コピー数誘導の結果粗抽出液中の酵
素の比活性は約８０倍増加したことを証明していた（第
３図）。クロラムフエニコールアセチルトランスフエラ
ーゼとして存在している抽出可能な蛋白の比率は、純粋
な蛋白の比活性から計算した（表５）。pMG169からの誘
導されないときの発現した量は0.25％抽出蛋白であり、
６時間の誘導後はこれが21.9％に増加した。
ランスフエラーゼの発現 pMG169を大腸菌E103(S)に導入し、クロラムフエニコー
ルアセチルトランスフエラーゼ濃度をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法と酵素定量法（シヨー(Shaw)，１９７
５年）で測定した。実施例５のpMG168形質転換体につい
て記載したように、大腸菌E103(S)形質変換体を増殖さ
せ４２℃に温度を変更して誘導し、３７℃でインキユベ
ーシヨンを続けた。一時間毎に試料を採取しプラスミツ
ドコピー数を定量し（第４図，第８図）、クロラムフエ
ニコールアセチルトランスフエラーゼの比活性を定量し
（Shaw，１９７５年、「リード・アンド ノルソコー
ト」Read and Northocote,１９８１年）（図８，表
５）、そして試料をポリアクリルアミドゲル電気泳動に
かけた（第９図）。このプラスミツドコピー数はpMG168
と類似の動力学的変化を示し、類似の絶対値を有してい
た（第４図）。クロラムフエニコールアセチルトランス
フエラーゼ活性は、コピー数誘導の結果粗抽出液中の酵
素の比活性は約８０倍増加したことを証明していた（第
３図）。クロラムフエニコールアセチルトランスフエラ
ーゼとして存在している抽出可能な蛋白の比率は、純粋
な蛋白の比活性から計算した（表５）。pMG169からの誘
導されないときの発現した量は0.25％抽出蛋白であり、
６時間の誘導後はこれが21.9％に増加した。
実施例７ 複製開始点を２個有するプラスミツドのプラスミツド安
定性試験 プラスミツドpMG165とpMG168を大腸菌RV308に導入し、p
MG168は大腸菌E103(S)に導入し、抗生物質は添加せずケ
モスタツト（chemostat）増殖条件下で３０℃で安定性
の試験をした。全ての実験は、抗生物質含有寒天平板か
ら採取し、金属製のバネの邪魔板のついた２５０ｍ用
の円錐フラスコ中の１００ｍのＬ−ブロース中に植菌
した適当な大腸菌株の単一コロニーから出発した。静止
期に達するまで培養菌を回転（orbital）シエーカー
（３７℃，２４０rpm）中で培養した。細胞を集め、無
菌の合成培地（グルコースを抜いてある）中に浮遊し、
発酵容器中に植菌した。合成培地の組成はグルコース４
ｇ／；〔NH4/2SO4５ｇ／；Na2HPO4７ｇ／；KH2PO
4３ｇ／；プロリン２００mg／；ロイシン，１００m
g／；チアミン１０mg／；MgSO4・7H2O２００mg／
，CaCl2・6H2O，５mg／，ZnSO4・7H2O２０mg／MnSO
4・4H2O２mg／；CuSO4・5H2O，５mg／，CoCl2・6H2O，
0.5mg／；FeSO4・7H2O１００mg／；NaCl２００mg／
；EDTA Na2６００mg／；NaOH１５０mg／〕。特に
明記していない場合はこの培地にトリプトフアンを１０
０mg／捕捉した。培地中消泡剤（ポリプロピレン−グ
リコール２０００）は0.0015v/vで存在した。発酵槽の
細胞密度は、菌体量が培地で維持できる量の少なくとも
６０％になるまで閉鎖系として増殖させた。次にポンプ
のスイッチを入れ、系をケモスタツト（chemostat）と
して培養した。発酵槽中の全菌体量が一定になつたと
き、初期の遷移増殖期は止まつたと仮定し、次に式ｎ
（世代数）＝μｔ／ln２（式中μ＝増殖速度であり、定
常状態での希釈速度に等しく、ｔ＝時間である）から定
常状態での世代数を計算した。
定性試験 プラスミツドpMG165とpMG168を大腸菌RV308に導入し、p
MG168は大腸菌E103(S)に導入し、抗生物質は添加せずケ
モスタツト（chemostat）増殖条件下で３０℃で安定性
の試験をした。全ての実験は、抗生物質含有寒天平板か
ら採取し、金属製のバネの邪魔板のついた２５０ｍ用
の円錐フラスコ中の１００ｍのＬ−ブロース中に植菌
した適当な大腸菌株の単一コロニーから出発した。静止
期に達するまで培養菌を回転（orbital）シエーカー
（３７℃，２４０rpm）中で培養した。細胞を集め、無
菌の合成培地（グルコースを抜いてある）中に浮遊し、
発酵容器中に植菌した。合成培地の組成はグルコース４
ｇ／；〔NH4/2SO4５ｇ／；Na2HPO4７ｇ／；KH2PO
4３ｇ／；プロリン２００mg／；ロイシン，１００m
g／；チアミン１０mg／；MgSO4・7H2O２００mg／
，CaCl2・6H2O，５mg／，ZnSO4・7H2O２０mg／MnSO
4・4H2O２mg／；CuSO4・5H2O，５mg／，CoCl2・6H2O，
0.5mg／；FeSO4・7H2O１００mg／；NaCl２００mg／
；EDTA Na2６００mg／；NaOH１５０mg／〕。特に
明記していない場合はこの培地にトリプトフアンを１０
０mg／捕捉した。培地中消泡剤（ポリプロピレン−グ
リコール２０００）は0.0015v/vで存在した。発酵槽の
細胞密度は、菌体量が培地で維持できる量の少なくとも
６０％になるまで閉鎖系として増殖させた。次にポンプ
のスイッチを入れ、系をケモスタツト（chemostat）と
して培養した。発酵槽中の全菌体量が一定になつたと
き、初期の遷移増殖期は止まつたと仮定し、次に式ｎ
（世代数）＝μｔ／ln２（式中μ＝増殖速度であり、定
常状態での希釈速度に等しく、ｔ＝時間である）から定
常状態での世代数を計算した。
連続培養から試料を採取し、希釈しＬ−寒天培地に広げ
た。１００個の単一コロニーを取り、抗生物質を捕捉し
た寒天培地とコントロールとしてのＬ−寒天培地に移し
た。抗生物質に対し耐性のコロニー数を、Ｌ−寒天平板
に増殖している数のパーセントとして表わし、これをプ
ラスミツドを有する集団の比率と考えた。周期的に試料
を取り、プラスミツドDNA調製液を作り、大きな変化が
あるか否かを調べた。
た。１００個の単一コロニーを取り、抗生物質を捕捉し
た寒天培地とコントロールとしてのＬ−寒天培地に移し
た。抗生物質に対し耐性のコロニー数を、Ｌ−寒天平板
に増殖している数のパーセントとして表わし、これをプ
ラスミツドを有する集団の比率と考えた。周期的に試料
を取り、プラスミツドDNA調製液を作り、大きな変化が
あるか否かを調べた。
大腸菌RV308中のpMG165とpMG168の安定性のケモスタツ
トによる解析から、これらのプラスミツドはトリプトフ
アンを加えた培地中で少なくとも６８世代（表６）安定
であることが証明された。これらの条件下ではpMG168上
のmet−プロキモシン遺伝子の転写は抑制されていた。
トによる解析から、これらのプラスミツドはトリプトフ
アンを加えた培地中で少なくとも６８世代（表６）安定
であることが証明された。これらの条件下ではpMG168上
のmet−プロキモシン遺伝子の転写は抑制されていた。
トリプトフアンがない場合の増殖の安定性解析はまだ進
行中であるが、３０世代後もプラスミツドの消失は認め
られない。大腸菌E103(S)中のpMG168の安定性解析も進
行中であるが、２０世代後もプラスミツドの消失は認め
られなかつた。複製開始点を２個有するプラスミツド
は、小コピー数でDNA複製がpar+,pSC101複製開始点から
指示される条件下では安定なようである。
行中であるが、３０世代後もプラスミツドの消失は認め
られない。大腸菌E103(S)中のpMG168の安定性解析も進
行中であるが、２０世代後もプラスミツドの消失は認め
られなかつた。複製開始点を２個有するプラスミツド
は、小コピー数でDNA複製がpar+,pSC101複製開始点から
指示される条件下では安定なようである。
文献 エムタージイ・ジエイ・エス，アルガル，エス・ドエ
ル，エム・テイー・ハリス，テイー・ジエイ・アール，
ジエンキンス，ビー・リリー・ジイーおよびロウ・ピー
・エイ（Emtage,J.S,Angal,S,Doel,M.T,Harris,T.J.R,J
enkins,B.Lilley,G and Lowe,P.A.），プロシーデイン
グ・ナチユラル・アキヤミデイ・サイアンス（Proc Nat
l Acad Sci）ＵＳＡ第８０巻（１９８３年）３６７１−
３６７５頁。
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ハシモト−ゴトー，テイー・フランクリン，エフ・シイ
ー・エイチ・ノードハイム．エイおよびチミス・ケイ・
エヌ（Hashimoto-Gotoh,T,Franklin,F.C.H,Nordheim,A
and Timmis,K.N.）「ジーン」 Gene 第１６巻（１９
８１年）２２７−２３５頁。
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アイシユーホロウイツツ・デイーおよびバーク・ジエイ
・エフ（Ish-Horowitz,D and Burke,J.F.），「ニユー
クレイツク アシツド リサーチ」Nucl Acids Res 第
９巻（１９８１年）２９８９−２９９８頁。マニアテイ
ス・テイー，フリツチ・イー・エフおよびサンブルツク
・ジエイ（Maniatis、T,Fritsch,E.F and Sambrook,
J.），「モレキユラー クローニング コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリイ」Molecular Cloning
Cold Sprirg Harbor Laboratory（１９８２年）。
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クイーン・シイー（Qeen,C.）「ジヤーナル・モレキユ
ラー・アンド・アプライド・ジーン」J Mol and Applie
d Gene第２巻（１９８３年）１−１０頁リード・エス・
エムおよびノースコート・デイー・エイチ（Read,S.M a
nd Northcote,D.H.「アナリテイカル バイオケミスト
リイー」Analy tical Biochem 第１１６巻（１９８１
年）５３−６４頁。
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ラツセル・デイー・アールおよびベネツト・ジイー・エ
ヌ（Russell,D.R and Bennett,G.N.）「ジーン」Gene第
２０巻（１９８２年）２３１−２４３頁。
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サンガー・エフ，ニクルン・エスおよびカルスン・エイ
・アール（Sanger,F,Nicklen,S.and Coulsen,A.R.），
「プロシーデイング・ナチユラル・アキヤデミ・サイア
ンス」Proc Natl Acad Sci USA第７４巻（１９７７
年），５４６３−５４６７頁。
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シヨー・ダブリユー・ブイ（Shaw,W.V.），「メソツド
・イン・エンザイモロジイー」Methods in Enzymology
第４３巻（１９７５年）７３７−７５５頁。
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タツチエル・ケイ，ナスミス・ケイ・エイおよびホール
・ビー・デイー（Tatchell,K,Nasmyth,K,A and Hall,B
D）、「セル」Cell第２７巻（１９８１年）２５−３５
頁。
・ビー・デイー（Tatchell,K,Nasmyth,K,A and Hall,B
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頁。
a) ATCCはアメリカン・タイプ・カルチヤー・フレクシ
ヨン American Type Culture Collectionの意味であ
る。
ヨン American Type Culture Collectionの意味であ
る。
本発明は、コピー数がPLやPRなどの制御可能なプロモー
ターにより意図的にコントロール可能な新しい種類のプ
ラスミツドの創製を可能にする。
ターにより意図的にコントロール可能な新しい種類のプ
ラスミツドの創製を可能にする。
RNA IIの５′末端からXhoＩリンカーの３０塩基対の存
在により、RNA IIの天然のプロモーターを他のプロモ
ーターで置換することが可能となる。たとえばプラスミ
ツドpMG404ではRNA IIはプラスミツドPHSG415上のカナ
マイシン耐性遺伝子プロモーターのコントロールを受け
ており、pMG404上の２個の複製開始点（pHSG415からの
温度感受性pSC101複製開始点とKR mプロモーターのコン
トロール下にあるCol E1複製開始点）とともに機能して
いると考えられる。これらのプラスミツドにおける正確
なDNA複製開始点は不明であるが、ハイブリツド複製開
始点が機能していることは、pHSG415よりpMG404の方が
コピー数が多いこと、そしてpMG404は４２℃で複製する
ことからわかる。ハイブリツド複製開始点を有するがpS
C101温度感受性複製開始点は持たない、再環状化させた
Bal I断片であるpMG410が作成できるということは、ハ
イブリツド複製開始点が機能していることの別の証拠で
ある。
在により、RNA IIの天然のプロモーターを他のプロモ
ーターで置換することが可能となる。たとえばプラスミ
ツドpMG404ではRNA IIはプラスミツドPHSG415上のカナ
マイシン耐性遺伝子プロモーターのコントロールを受け
ており、pMG404上の２個の複製開始点（pHSG415からの
温度感受性pSC101複製開始点とKR mプロモーターのコン
トロール下にあるCol E1複製開始点）とともに機能して
いると考えられる。これらのプラスミツドにおける正確
なDNA複製開始点は不明であるが、ハイブリツド複製開
始点が機能していることは、pHSG415よりpMG404の方が
コピー数が多いこと、そしてpMG404は４２℃で複製する
ことからわかる。ハイブリツド複製開始点を有するがpS
C101温度感受性複製開始点は持たない、再環状化させた
Bal I断片であるpMG410が作成できるということは、ハ
イブリツド複製開始点が機能していることの別の証拠で
ある。
pMG404の性質は、RNA IIのRNA IIプロモーターと最初
の３０塩基は、DNA複製開始をなくすことなく別のプロ
モーターで置換できることを示している。しかしKRmプ
ロモーターは構成的に発現されているため、pMG404のコ
ピー数の変更は不可能である。大腸菌内で働くいくつか
の充分規定されたコントロール可能なプロモーターが存
在する。バクテリオフアージλからのPLプロモーター
は、直接コントロールされるCol E1ハイブリツド複製開
始点を有するプラスミツドpMG411を作成するのに用いら
れた。pMG411はpHSG415からの複製開始点を保持してお
り、λリプレツサ−遺伝子(QY7)を有する株の中で３０
℃で小コピー数で維持された。λリプレツサーを４２℃
で不活性化するとコピー数が上昇し、これはCol E1複製
開始点の複製はPLにより作動されていることを示してい
る。従つてプラスミツドのコピー数は制御されたプロモ
ーターから意図的にコントロールすることが可能である
ことは明白であり、これは温度（たとえばpMG411中の
PL）や、又は、さらに重要であるが、トリプトフアンや
ラクトースなどの代謝物の濃度を変えることによりコピ
ー数がコントロールされるプラスミツド作成への道を開
くものである。
の３０塩基は、DNA複製開始をなくすことなく別のプロ
モーターで置換できることを示している。しかしKRmプ
ロモーターは構成的に発現されているため、pMG404のコ
ピー数の変更は不可能である。大腸菌内で働くいくつか
の充分規定されたコントロール可能なプロモーターが存
在する。バクテリオフアージλからのPLプロモーター
は、直接コントロールされるCol E1ハイブリツド複製開
始点を有するプラスミツドpMG411を作成するのに用いら
れた。pMG411はpHSG415からの複製開始点を保持してお
り、λリプレツサ−遺伝子(QY7)を有する株の中で３０
℃で小コピー数で維持された。λリプレツサーを４２℃
で不活性化するとコピー数が上昇し、これはCol E1複製
開始点の複製はPLにより作動されていることを示してい
る。従つてプラスミツドのコピー数は制御されたプロモ
ーターから意図的にコントロールすることが可能である
ことは明白であり、これは温度（たとえばpMG411中の
PL）や、又は、さらに重要であるが、トリプトフアンや
ラクトースなどの代謝物の濃度を変えることによりコピ
ー数がコントロールされるプラスミツド作成への道を開
くものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/59 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ロビンソン，マーチン キム イギリス国 エスエル６，４アールエツチ バークシヤー，メイドンヘツド，ヒーバ ー クロース，９ (72)発明者 カウルコツト，セリア アン イギリス国 エスエル６ １ピーエイ，バ ークシヤー，メイドンヘツド，ハイタウン ロード，15 (72)発明者 ライト，エドウイナ メリー イギリス国 エスエル６ ０エルテイー, バークシヤー，タツプロウ，ハギル ライ ズ，59 (56)参考文献 特開 昭57−172000（ＪＰ，Ａ)
Claims (5)
- 【請求項１】小コピー数でベクターが安定に維持される
第一の複製開始点、および第二の複製開始点における複
製が、直接コントロール可能なプロモーターの制御下に
DNA複製を開始させるプライマー又は開始因子をコード
するDNA配列を置くことによって直接コントロール可能
な、大コピー数の第二の複製開始点を包含する２つの複
製系より成るDNAベクターであって、更に遺伝子産物の
産生のための遺伝暗号を有する遺伝子配列を含有するDN
Aベクターを用いて宿主細菌を形質転換し、形質転換し
た細菌を主に又は全面的に最初の複製開始点から小コピ
ー数で複製が起きる第１の条件下で増殖させ、次にこの
形質転換した細菌を第２の複製開始点からも又は第２の
複製開始点からのみ大コピー数で複製が起きる第２の条
件下で増殖させ、そして遺伝子産物の発現を誘導して遺
伝子産物を産生させる、上記DNAベクターを用いた遺伝
子産物の産生方法。 - 【請求項２】プレプロキモシン、met-プロキモシン又は
met-キモシン産生のための、特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - 【請求項３】遺伝子産物の発現は、リプレッサーの細胞
質濃度により制御されるプロモーターによりコントロー
ルされ、形質転換した細胞を第２の条件下で培養すると
きにベクターのコピー数を増加させるとリプレッサーに
よるコントロールが除去され、遺伝子産物が高濃度に発
現される、特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
法。 - 【請求項４】リプレッサーの合成は自己制御されてい
る、特許請求の範囲第３項記載の方法。 - 【請求項５】プロモーター／リプレッサー系がトリプト
ファンオペロンのものである、特許請求の範囲第４項記
載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8308236 | 1983-03-25 | ||
| GB838308236A GB8308236D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-03-25 | Dna vectors |
| PCT/GB1984/000095 WO1984003713A1 (en) | 1983-03-25 | 1984-03-23 | Dna vectors and their use in recombinant dna technology |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5285157A Division JPH07114703B2 (ja) | 1983-03-25 | 1993-11-15 | Ｄｎａベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60501837A JPS60501837A (ja) | 1985-10-31 |
| JPH0634721B2 true JPH0634721B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=10540205
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59501670A Expired - Lifetime JPH0634721B2 (ja) | 1983-03-25 | 1984-03-23 | Ｄｎａベクタ−とその組換えｄｎａ技術への使用 |
| JP5285157A Expired - Lifetime JPH07114703B2 (ja) | 1983-03-25 | 1993-11-15 | Ｄｎａベクター |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5285157A Expired - Lifetime JPH07114703B2 (ja) | 1983-03-25 | 1993-11-15 | Ｄｎａベクター |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5015573A (ja) |
| EP (1) | EP0121386B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0634721B2 (ja) |
| AT (1) | ATE34770T1 (ja) |
| AU (1) | AU565352B2 (ja) |
| DE (2) | DE3471688D1 (ja) |
| GB (2) | GB8308236D0 (ja) |
| WO (1) | WO1984003713A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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