JPH0634722B2 - プロモーター核酸塩基配列 - Google Patents
プロモーター核酸塩基配列Info
- Publication number
- JPH0634722B2 JPH0634722B2 JP59251971A JP25197184A JPH0634722B2 JP H0634722 B2 JPH0634722 B2 JP H0634722B2 JP 59251971 A JP59251971 A JP 59251971A JP 25197184 A JP25197184 A JP 25197184A JP H0634722 B2 JPH0634722 B2 JP H0634722B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- human
- promoter
- dna
- nucleotide sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ａ．産業上の技術分野 本発明はプロモーター機能を有する核酸塩基配列及びそ
れを含む遺伝子断片に関するものである。更に詳しくは
ヒト抗体遺伝子に由来するプロモーター機能を有する核
酸塩基配列及びそれを含む遺伝子断片に関するものであ
る。
れを含む遺伝子断片に関するものである。更に詳しくは
ヒト抗体遺伝子に由来するプロモーター機能を有する核
酸塩基配列及びそれを含む遺伝子断片に関するものであ
る。
ｂ．従来技術 近時、抗体遺伝子の研究が進められ、ヒト抗体における
Ｈ鎖の解明も行なわれつつある。Ｈ鎖は可変領域（“Ｖ
領域”と呼ばれている）である抗原との結合部位と、補
体との結合や特定の細胞との相互作用などの生理活性を
有している定常領域（“Ｃ領域”と呼ばれている）より
主として形成されていることはよく知られている。
Ｈ鎖の解明も行なわれつつある。Ｈ鎖は可変領域（“Ｖ
領域”と呼ばれている）である抗原との結合部位と、補
体との結合や特定の細胞との相互作用などの生理活性を
有している定常領域（“Ｃ領域”と呼ばれている）より
主として形成されていることはよく知られている。
また抗体遺伝子の塩基配列及びそれの機能の解明は、マ
ウスの遺伝子についてかなりよく進められており、その
可変領域（Ｖ領域）の近辺においては、Ｖ遺伝子，Ｄ遺
伝子及びＪ遺伝子が存在し、これら抗体遺伝子を転写す
るためにＶ遺伝子の上流にプロモーター機能を有する塩
基配列が存在すること、またＪ遺伝子と定常領域（Ｃ）
との間に、転写効率を著しく増大させる機能を有する塩
基配列、つまりエンハンサーの存在が推測された（培風
館発行、現代化学1983年11月号62〜68頁参照）。このエ
ンハンサーはＪ遺伝子の下流に存在し、未分化型ではプ
ロモーターが遠く離れているため転写効率を上げられな
いが、Ｖ−Ｊ遺伝子及びＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子の組み換えを
起した時に組み換えを起しＶ遺伝子の上流のプロモータ
ーからの転写効率を上げる機能を有していると云われて
いる。
ウスの遺伝子についてかなりよく進められており、その
可変領域（Ｖ領域）の近辺においては、Ｖ遺伝子，Ｄ遺
伝子及びＪ遺伝子が存在し、これら抗体遺伝子を転写す
るためにＶ遺伝子の上流にプロモーター機能を有する塩
基配列が存在すること、またＪ遺伝子と定常領域（Ｃ）
との間に、転写効率を著しく増大させる機能を有する塩
基配列、つまりエンハンサーの存在が推測された（培風
館発行、現代化学1983年11月号62〜68頁参照）。このエ
ンハンサーはＪ遺伝子の下流に存在し、未分化型ではプ
ロモーターが遠く離れているため転写効率を上げられな
いが、Ｖ−Ｊ遺伝子及びＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子の組み換えを
起した時に組み換えを起しＶ遺伝子の上流のプロモータ
ーからの転写効率を上げる機能を有していると云われて
いる。
そしてマウスのＨ鎖遺伝子におけるエンハンサーに関し
て、その塩基配列は、最近シャフナー(Walter Schaffne
r)らが明らかにし発表している(Cell.Vol.33,729-740 J
uly 1983参照）。
て、その塩基配列は、最近シャフナー(Walter Schaffne
r)らが明らかにし発表している(Cell.Vol.33,729-740 J
uly 1983参照）。
また利根川進氏らも同様にマウスのＨ鎖遺伝子のエンハ
ンサーの存在並びにその塩基配列を明らかにしている。
(Cell.Vol.33,717-728,July 1983参照）。
ンサーの存在並びにその塩基配列を明らかにしている。
(Cell.Vol.33,717-728,July 1983参照）。
このように、マウスのＨ鎖遺伝子に関しては、可変領域
（Ｖ領域），定常領域（Ｃ領域）の両領域共それらの含
まれる種々の遺伝子単位をはじめ、プロモーター，エン
ハンサーなどの種々の機能を有する単位が詳細に究明さ
れ、また一部はそれらの塩基配列が決められている。
（Ｖ領域），定常領域（Ｃ領域）の両領域共それらの含
まれる種々の遺伝子単位をはじめ、プロモーター，エン
ハンサーなどの種々の機能を有する単位が詳細に究明さ
れ、また一部はそれらの塩基配列が決められている。
一方ヒト抗体遺伝子のＨ鎖については、その構成遺伝子
及びその機能が次第に明らかにされ、プロモーター及び
エンハンサーはその存在が推測されているが、その全塩
基配列及びその機能を発現させる塩基配列単位について
は未だ明らかにされてはいない。
及びその機能が次第に明らかにされ、プロモーター及び
エンハンサーはその存在が推測されているが、その全塩
基配列及びその機能を発現させる塩基配列単位について
は未だ明らかにされてはいない。
そこで本発明者らは、ヒト抗体遺伝子のＨ鎖における遺
伝子について研究を進めた所、Ｖ遺伝子，Ｄ遺伝子及び
Ｊ遺伝子の配列と定常領域の間にエンハンサーの存在が
確認されると共にその塩基配列及びその中核となる塩基
配列が明らかとなり先に提案した（特願昭58-229037
号；発明の名称エンハンサー塩基配列）。
伝子について研究を進めた所、Ｖ遺伝子，Ｄ遺伝子及び
Ｊ遺伝子の配列と定常領域の間にエンハンサーの存在が
確認されると共にその塩基配列及びその中核となる塩基
配列が明らかとなり先に提案した（特願昭58-229037
号；発明の名称エンハンサー塩基配列）。
そこで本発明者らは、さらに研究を進めた結果、Ｖ遺伝
子の５′側の上流にプロモーター機能を有する塩基配列
が存在することが確認され、その塩基配列が明らかとな
り本発明に到達した。
子の５′側の上流にプロモーター機能を有する塩基配列
が存在することが確認され、その塩基配列が明らかとな
り本発明に到達した。
本発明はかかる究明事実に基いて到達されたものであっ
て、下記核酸塩基配列単位（Ｐ１） ＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧ
ＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＡ
ＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡ
ＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＴＡ
ＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＡＧ
ＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣ
ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＡＣ
ＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧ
ＣＴ ［但しここでＡはデオキシアデノシン−５′−リン酸，
Ｃはデオキシシチジン−５′−リン酸，Ｇはデオキシグ
アノシン−５′−リン酸，Ｔはデオキシチミジン−５′
−リン酸を示す。］ を含有する塩基配列の下流（……ＣＡＧＣＴ）に (i)下記核酸塩基配列単位（Ｐ２） ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣ
ＡＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＧＧＴ （ここでＡ，Ｃ，Ｇ及びＴは前記定義と同じ）及び／又
は下記核酸塩基配列単位（Ｐ３） ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣ
ＡＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＧＧＴ （ここでＡ，Ｃ，Ｇ及びＴは前記定義と同じ）が配列し
た塩基配列及びそれに相補的な塩基配列からなるプロモ
ーター核酸塩基配列である。
て、下記核酸塩基配列単位（Ｐ１） ＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧ
ＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＡ
ＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡ
ＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＴＡ
ＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＡＧ
ＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣ
ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＡＣ
ＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧ
ＣＴ ［但しここでＡはデオキシアデノシン−５′−リン酸，
Ｃはデオキシシチジン−５′−リン酸，Ｇはデオキシグ
アノシン−５′−リン酸，Ｔはデオキシチミジン−５′
−リン酸を示す。］ を含有する塩基配列の下流（……ＣＡＧＣＴ）に (i)下記核酸塩基配列単位（Ｐ２） ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣ
ＡＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＧＧＴ （ここでＡ，Ｃ，Ｇ及びＴは前記定義と同じ）及び／又
は下記核酸塩基配列単位（Ｐ３） ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣ
ＡＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＧＧＴ （ここでＡ，Ｃ，Ｇ及びＴは前記定義と同じ）が配列し
た塩基配列及びそれに相補的な塩基配列からなるプロモ
ーター核酸塩基配列である。
本発明者らの研究によれば、本発明のプロモーター機能
を有する核酸塩基配列は、ヒト抗体遺伝子のＨ鎖中の先
導領域(leading region)とＶ領域の間のイントロン中に
存在していることが確認され、その塩基配列は前記Ｐ−
Ａ又はＰ−Ｂであることが確認された。
を有する核酸塩基配列は、ヒト抗体遺伝子のＨ鎖中の先
導領域(leading region)とＶ領域の間のイントロン中に
存在していることが確認され、その塩基配列は前記Ｐ−
Ａ又はＰ−Ｂであることが確認された。
本発明のプロモーター核酸塩基配列は、その下流に蛋白
遺伝子の組み換えを起したときに、転写効率を増大させ
る機能を有している。従って、本発明のプロモーター核
酸塩基配列（Ｐ−Ａ，Ｐ−Ｂ）は、例えばヒト抗体遺伝
子中のＶ遺伝子，Ｄ遺伝子及びＪ遺伝子，β−グロビン
遺伝子などの蛋白遺伝子の複製，転写，翻訳を目的とし
てその転写効率を高めることができるので、このプロモ
ーターを用いて、蛋白遺伝子の大量の産生（例えばヒト
モノクローナル抗体の大量生産に極めて有用である。
遺伝子の組み換えを起したときに、転写効率を増大させ
る機能を有している。従って、本発明のプロモーター核
酸塩基配列（Ｐ−Ａ，Ｐ−Ｂ）は、例えばヒト抗体遺伝
子中のＶ遺伝子，Ｄ遺伝子及びＪ遺伝子，β−グロビン
遺伝子などの蛋白遺伝子の複製，転写，翻訳を目的とし
てその転写効率を高めることができるので、このプロモ
ーターを用いて、蛋白遺伝子の大量の産生（例えばヒト
モノクローナル抗体の大量生産に極めて有用である。
本発明のプロモーター核酸塩基配列（Ｐ−Ａ，Ｐ−Ｂ）
と蛋白遺伝子とは、約５キロ塩基対（Ｋbp）以下の距離
で位置することができる。
と蛋白遺伝子とは、約５キロ塩基対（Ｋbp）以下の距離
で位置することができる。
本発明者らは、ヒト抗体遺伝子における抗体蛋白を発現
することが可能なヒト抗体遺伝子断片について見出し既
に提案した（特願昭58-208383号明細書参照）。
することが可能なヒト抗体遺伝子断片について見出し既
に提案した（特願昭58-208383号明細書参照）。
この先に提案したヒト抗体遺伝子断片を添付第１図を用
いて説明する。
いて説明する。
第１図は抗体遺伝子を含むヒト染色体ＤＮＡの制限エン
ドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによる切断部位５′側末端
の塩基（５′と略称する）及び３′側末端の塩基（以下
３′と略称する）の間に存在する各単位及び各塩基配列
を模式的に示したものである。
ドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによる切断部位５′側末端
の塩基（５′と略称する）及び３′側末端の塩基（以下
３′と略称する）の間に存在する各単位及び各塩基配列
を模式的に示したものである。
第１図において、５′及び３′はそれぞれヒト染色体Ｄ
ＮＡの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによる抗体
遺伝子を含む切り出し断片の切断部位の末端の塩基を示
し、５′と３′との間は約21Kb(21Kb±１Kb)の長さであ
る。この中で切り出し断片のＡａｔIIとして矢印で示さ
れた個所は、切り出し断片における制限エンドヌクレア
ーゼＡａｔIIによって切断され得る位置であり、５′か
ら約1.6Kb(1.6Kb±0.1Kb)の位置にある。
ＮＡの制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによる抗体
遺伝子を含む切り出し断片の切断部位の末端の塩基を示
し、５′と３′との間は約21Kb(21Kb±１Kb)の長さであ
る。この中で切り出し断片のＡａｔIIとして矢印で示さ
れた個所は、切り出し断片における制限エンドヌクレア
ーゼＡａｔIIによって切断され得る位置であり、５′か
ら約1.6Kb(1.6Kb±0.1Kb)の位置にある。
このＡａｔIIによる切断可能部位を起点にして、５′の
方へ約0.33Kb(0.33Kb±0.02Kb)の点から３′の方へ約0.
04Kb(0.04Kb±0.005Kb)の点までの約0.37Kb(0.37Kb±0.
025Kb)の長さを有している単位の中にはＶ遺伝子，Ｄ遺
伝子及びＪ遺伝子が含まれ、５′から見てこの順序で配
列されている。
方へ約0.33Kb(0.33Kb±0.02Kb)の点から３′の方へ約0.
04Kb(0.04Kb±0.005Kb)の点までの約0.37Kb(0.37Kb±0.
025Kb)の長さを有している単位の中にはＶ遺伝子，Ｄ遺
伝子及びＪ遺伝子が含まれ、５′から見てこの順序で配
列されている。
本発明者らの研究によれば、第１図中のＶ，Ｄ及びＪ遺
伝子の５′側に示されたＰの領域に本発明におけるプロ
モーター核酸塩基配列（Ｐ−Ａ，Ｐ−Ｂ）が存在するこ
とが確認された。また第１図中のＥはＶ，Ｄ及びＪ遺伝
子と後述するＣγ1との間に存在するエンハンサー機能
を有する塩基配列を示している。
伝子の５′側に示されたＰの領域に本発明におけるプロ
モーター核酸塩基配列（Ｐ−Ａ，Ｐ−Ｂ）が存在するこ
とが確認された。また第１図中のＥはＶ，Ｄ及びＪ遺伝
子と後述するＣγ1との間に存在するエンハンサー機能
を有する塩基配列を示している。
また、第１図中Ｐｓｔ Ｉとして矢印で示された個所
は、前記切り出し断片における制限エンドヌクレアーゼ
Ｐｓｔ Ｉによって切断され得る位置であり、５′から
約7.9Kb(7.9Kb±0.5Kb)の位置にある。このＰｓｔ Ｉ
による切断可能部位を起点にして５′の方へ約0.69Kb
(0.69Kb±0.02Kb)の点から３′の方へ約1.02Kb(1.02Kb
±0.03Kb)の点までの約1.71Kb(1.71Kb±0.05Kb)の長さ
を有している所謂定常領域(constant region)Ｃγ1と称
される部分を含んでおり、５′から見てＣＨ１領域，ｈ
領域，ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をこの順序で含んでい
る。さらにこの単位の３′側の端部にはストップ・ゴド
ンが含まれている。
は、前記切り出し断片における制限エンドヌクレアーゼ
Ｐｓｔ Ｉによって切断され得る位置であり、５′から
約7.9Kb(7.9Kb±0.5Kb)の位置にある。このＰｓｔ Ｉ
による切断可能部位を起点にして５′の方へ約0.69Kb
(0.69Kb±0.02Kb)の点から３′の方へ約1.02Kb(1.02Kb
±0.03Kb)の点までの約1.71Kb(1.71Kb±0.05Kb)の長さ
を有している所謂定常領域(constant region)Ｃγ1と称
される部分を含んでおり、５′から見てＣＨ１領域，ｈ
領域，ＣＨ２領域及びＣＨ３領域をこの順序で含んでい
る。さらにこの単位の３′側の端部にはストップ・ゴド
ンが含まれている。
前記のヒト抗体遺伝子断片は、プロモーター機能を有す
る塩基配列（Ｐ），Ｖ，Ｄ及びＪ遺伝子，エンハンサー
機能を有する塩基配列（Ｅ）及びＣγ1領域によってこ
の順序で構成されている。
る塩基配列（Ｐ），Ｖ，Ｄ及びＪ遺伝子，エンハンサー
機能を有する塩基配列（Ｅ）及びＣγ1領域によってこ
の順序で構成されている。
かかるプロモーター機能を有する塩基配列（Ｐ）には、
本発明における前記核酸塩基配列単位（Ｐ１），
（Ｐ２）及び（Ｐ３）とこれに相補的な塩基配列が、こ
の順序で含まれていることがわかった。
本発明における前記核酸塩基配列単位（Ｐ１），
（Ｐ２）及び（Ｐ３）とこれに相補的な塩基配列が、こ
の順序で含まれていることがわかった。
かくして本発明のプロモーター核酸塩基配列は、前記核
酸塩基配列単位のＰ１，Ｐ１−Ｐ２，Ｐ１−Ｐ３及びＰ
１−Ｐ２−Ｐ３の配列とそれに相補的な塩基配列からな
る塩基配列であって、これらは種々の有用な蛋白遺伝子
と組合せて遺伝子断片とし、これを更にベクターに組み
込ませてハイブリッドＤＮＡとすることにより、有用蛋
白遺伝子の産生に利用することができる。
酸塩基配列単位のＰ１，Ｐ１−Ｐ２，Ｐ１−Ｐ３及びＰ
１−Ｐ２−Ｐ３の配列とそれに相補的な塩基配列からな
る塩基配列であって、これらは種々の有用な蛋白遺伝子
と組合せて遺伝子断片とし、これを更にベクターに組み
込ませてハイブリッドＤＮＡとすることにより、有用蛋
白遺伝子の産生に利用することができる。
従って本発明のプロモーター核酸塩基配列である前記
（Ｐ−Ａ）又は（Ｐ−Ｂ）は、種々の蛋白遺伝子と組合
された遺伝子断片として利用される。
（Ｐ−Ａ）又は（Ｐ−Ｂ）は、種々の蛋白遺伝子と組合
された遺伝子断片として利用される。
この遺伝子断片を構成する蛋白遺伝子としては、例え
ば、ヒト蛋白遺伝子及びヒト以外の哺乳動物の蛋白遺伝
子、殊にヒト及びヒト以外の哺乳動物の抗体蛋白遺伝
子，インシュリン遺伝子，インターフェロン遺伝子など
を挙げることができる。
ば、ヒト蛋白遺伝子及びヒト以外の哺乳動物の蛋白遺伝
子、殊にヒト及びヒト以外の哺乳動物の抗体蛋白遺伝
子，インシュリン遺伝子，インターフェロン遺伝子など
を挙げることができる。
蛋白遺伝子は、例えばヒトＶ遺伝子，ヒトＤ遺伝子，ヒ
トＪ遺伝子，ヒトＣγ1遺伝子の如きヒト抗体遺伝子，
その他ヒトβ−グロビン遺伝子などであることができ
る。
トＪ遺伝子，ヒトＣγ1遺伝子の如きヒト抗体遺伝子，
その他ヒトβ−グロビン遺伝子などであることができ
る。
これらヒト抗体蛋白遺伝子の機能及び核酸塩基配列につ
いては、下記の通りであることが知られている。
いては、下記の通りであることが知られている。
Ｖ遺伝子：免疫グロブリン分子のＮＨ２末端から約100
残基の可変領域部分をコードする遺伝子。
残基の可変領域部分をコードする遺伝子。
Ｄ遺伝子：Ｊ遺伝子とＶ遺伝子との間に位置し、免疫グ
ロブリン分子中で最も多様性のみられる部分をコードす
る遺伝子〔例えば、ジエイ・シリング、ビー・クレビン
ガー、ジエイ・エム・デイビーおよびエル・フツドらの
ネイチヤー(J.Schilling,B.Clevinger,J.M.Davie and
L.Hood,Nature)283,35(1980)参照〕 Ｊ遺伝子：免疫グロブリン分子の可変領域と定常領域と
の連結部分をコードする遺伝子。［例えば、シエイ・ジ
ー・シヤイドマン、イー・イー・マツクスおよびピー・
レーダーらのネイチヤー(J.G.Seidman,E.E.Max and P.L
eder,Nature)280,370(1979)参照］ Ｃγ1遺伝子：免疫グロブリンＨ鎖分子のＣＯＯＨ末端
から約330残基の定常領域部分をコードする遺伝子の一
つ。γ1はＩｇＧサブクラス１のＨ鎖を示すもの。
ロブリン分子中で最も多様性のみられる部分をコードす
る遺伝子〔例えば、ジエイ・シリング、ビー・クレビン
ガー、ジエイ・エム・デイビーおよびエル・フツドらの
ネイチヤー(J.Schilling,B.Clevinger,J.M.Davie and
L.Hood,Nature)283,35(1980)参照〕 Ｊ遺伝子：免疫グロブリン分子の可変領域と定常領域と
の連結部分をコードする遺伝子。［例えば、シエイ・ジ
ー・シヤイドマン、イー・イー・マツクスおよびピー・
レーダーらのネイチヤー(J.G.Seidman,E.E.Max and P.L
eder,Nature)280,370(1979)参照］ Ｃγ1遺伝子：免疫グロブリンＨ鎖分子のＣＯＯＨ末端
から約330残基の定常領域部分をコードする遺伝子の一
つ。γ1はＩｇＧサブクラス１のＨ鎖を示すもの。
プロモーター：ＤＮＡからＲＮＡへの転写を開始させる
ための信号機能を有する塩基配列。
ための信号機能を有する塩基配列。
エンハンサー：ＤＮＡ組換えによって近づいたＶ遺伝子
上流のプロモーターからの転写効率を上げる働きを有す
る塩基配列。［例えば二階堂敏雄，本庶佑，現代化学，
152,62(1983)参照］ その他蛋白遺伝子については例えばβ−グロビン遺伝子
について下記機能が知られている。
上流のプロモーターからの転写効率を上げる働きを有す
る塩基配列。［例えば二階堂敏雄，本庶佑，現代化学，
152,62(1983)参照］ その他蛋白遺伝子については例えばβ−グロビン遺伝子
について下記機能が知られている。
β−グロビン遺伝子 ヘモグロビンの蛋白質部分であるグロビンをコードする
遺伝子 前記した如き蛋白遺伝子は、本発明のプロモーター核酸
塩基配列の下流に組合されて遺伝子断片として構成され
これは種々のベクターに組み込ませてハイブリッドＤＮ
Ａとすることができる。
遺伝子 前記した如き蛋白遺伝子は、本発明のプロモーター核酸
塩基配列の下流に組合されて遺伝子断片として構成され
これは種々のベクターに組み込ませてハイブリッドＤＮ
Ａとすることができる。
かかるベクターとしては、例えばＣｈａｒｏｎ ４Ａ，
Ｃｈａｒｏｎ 28，λｇｔＷＥＳ・λＢの如き大腸菌用
ファージベクター；ｐＢＲ322，ｐＢＲ325，ｐＭＢ９の
如き大腸菌用プラスミドベクター；ｐＵＢ110，ｐＨＷ
Ｉの如き枯草菌用プラスミドベクター；ＹＥｐ13，ｐＪ
ＤＢ219，ＹＲｐ７，ＹＲｐ16，ＹＩｐ５，ＹＩｐ32の
如き酵母用プラスミドベクター；ｐＳＶ２−ｇｐｔ，ｐ
ＫＳＶ−10の如き動物細胞用プラスミドベクター；ｐＴ
ｉＢ６−806の如き植物細胞用プラスミドベクターが挙
げられるが、これらベクターは単に例として示したもの
であって、これら以外のベクターであって使用し得るこ
とは云うまでもない。
Ｃｈａｒｏｎ 28，λｇｔＷＥＳ・λＢの如き大腸菌用
ファージベクター；ｐＢＲ322，ｐＢＲ325，ｐＭＢ９の
如き大腸菌用プラスミドベクター；ｐＵＢ110，ｐＨＷ
Ｉの如き枯草菌用プラスミドベクター；ＹＥｐ13，ｐＪ
ＤＢ219，ＹＲｐ７，ＹＲｐ16，ＹＩｐ５，ＹＩｐ32の
如き酵母用プラスミドベクター；ｐＳＶ２−ｇｐｔ，ｐ
ＫＳＶ−10の如き動物細胞用プラスミドベクター；ｐＴ
ｉＢ６−806の如き植物細胞用プラスミドベクターが挙
げられるが、これらベクターは単に例として示したもの
であって、これら以外のベクターであって使用し得るこ
とは云うまでもない。
さらに本発明のプロモーター核酸塩基配列は、エンハン
サー塩基配列と組み合せることにより蛋白遺伝子の転写
効率を一層高めることができる。
サー塩基配列と組み合せることにより蛋白遺伝子の転写
効率を一層高めることができる。
本発明において、前記プロモーターに蛋白遺伝子及びエ
ンハンサーを組合せて使用する場合には、この順序で配
列して遺伝子断片として使用することができる。
ンハンサーを組合せて使用する場合には、この順序で配
列して遺伝子断片として使用することができる。
本発明において、プロモーター核酸塩基配列と蛋白遺伝
子とは、好ましくは約５キロ塩基対以下の距離で位置し
ている。
子とは、好ましくは約５キロ塩基対以下の距離で位置し
ている。
以下実施例を掲げて、プロモーター核酸塩基配列及び遺
伝子断片について詳細に説明する。
伝子断片について詳細に説明する。
実施例１．（ヒト染色体ＤＮＡの単離） ヒト培養細胞ＡＲＨ77株３×108個をガラス棒でつぶ
し、２％ソディウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）存
在下、プロテアーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、10
mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH8.0）−１mM ＥＤＴＡ水溶
液で飽和したフェノールを加えた。遠心により水相とフ
ェノール相を分離し、水相を20mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（pH7.5）−100mM ＮａＣｌ−５mM ＥＤＴＡ水溶液に
対して透析した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）処
理をし、フェノール抽出を行なった後、10mM Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（pH8.0）−１mM ＥＤＴＡ水溶液に対して透
析し、ヒト染色体ＤＮＡ約1.2mgを取得した［N.Blin an
d D.W.Stafford,Nucleic Acids Res.,3,2303(1976)参
照］。
し、２％ソディウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）存
在下、プロテアーゼＫ（シグマ社製）で処理した後、10
mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（pH8.0）−１mM ＥＤＴＡ水溶
液で飽和したフェノールを加えた。遠心により水相とフ
ェノール相を分離し、水相を20mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ
（pH7.5）−100mM ＮａＣｌ−５mM ＥＤＴＡ水溶液に
対して透析した。リボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）処
理をし、フェノール抽出を行なった後、10mM Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ（pH8.0）−１mM ＥＤＴＡ水溶液に対して透
析し、ヒト染色体ＤＮＡ約1.2mgを取得した［N.Blin an
d D.W.Stafford,Nucleic Acids Res.,3,2303(1976)参
照］。
実施例２（ヒト遺伝子ライブラリーの作成） 実施例１で得られたヒト染色体ＤＮＡ150μｇを後述す
る実施例４に示した方法に準じて制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲ Ｉ（宝酒造製）で部分消化した後、蔗糖密
度勾配遠心［庶糖10〜40%(wt/vol),28000r.p.m.×15時
間，20℃］を行ない、15Kb〜23Kbに相当するＤＮＡ断片
4.3μｇを得た。次にこのＤＮＡ断片0.8μｇとＣｈａｒ
ｏｎ ４Ａベクター〔エワー・アール・ブラツトナー、
ビー・ジー・ウイリアムス、エイ・イー・ブレツチエ
ル、ケイ・デー・トンプソン、エイチ・イー・フエイバ
ー、エル・エイ・フアーロング、デイ・ジエイ・グルン
バルト、デイー・オー・キーフアー、デイ・オー・モー
ア、ジエイ・ダブリユー・シヤム、エフ・エル・シエル
ドンおよびオー・スミシーズらのサイエンス(F.R.Blatt
ner,B.G.Williams,A.E.Blechl,K.D.Thompson,H.E.Fabe
r,L.A.Furlong,D.J.Grunward,D.O.Kiefrr,D.O.Moore,J.
W.Schumm,F.L.Sheldon and O.Smithies,Science)196,16
1(1977)参照〕との連結を行い、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａベ
クターのＲｉｇｈｔ−ａｒｍとＬｅｆｔ−ａｒｍの間に
ヒト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリッドＤＮＡを得
た。連結にはＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社製）を用い、連結反応は66mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6）−6.6mM ＭｇＣｌ２−10mMジ
チオスレイトール−１mM ＡＴＰ水溶液中で、11℃，12
時間行なった。得られたハイブリッドＤＮＡについて、
ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング〔エイ・ベツカーおよ
びエム・ゴールドのプロシーデイングス・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミイー・オブ・サイエンシーズ・ユー
・エス・エイ(A.Becker and M.Gold,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.)72,581(1975)〕を行ない、ヒト遺伝子ライブ
ラリー(1.8×106ＰＦＵ／μｇ，ヒトＤＮＡの99％以上
を含む）とした。
る実施例４に示した方法に準じて制限エンドヌクレアー
ゼＥｃｏＲ Ｉ（宝酒造製）で部分消化した後、蔗糖密
度勾配遠心［庶糖10〜40%(wt/vol),28000r.p.m.×15時
間，20℃］を行ない、15Kb〜23Kbに相当するＤＮＡ断片
4.3μｇを得た。次にこのＤＮＡ断片0.8μｇとＣｈａｒ
ｏｎ ４Ａベクター〔エワー・アール・ブラツトナー、
ビー・ジー・ウイリアムス、エイ・イー・ブレツチエ
ル、ケイ・デー・トンプソン、エイチ・イー・フエイバ
ー、エル・エイ・フアーロング、デイ・ジエイ・グルン
バルト、デイー・オー・キーフアー、デイ・オー・モー
ア、ジエイ・ダブリユー・シヤム、エフ・エル・シエル
ドンおよびオー・スミシーズらのサイエンス(F.R.Blatt
ner,B.G.Williams,A.E.Blechl,K.D.Thompson,H.E.Fabe
r,L.A.Furlong,D.J.Grunward,D.O.Kiefrr,D.O.Moore,J.
W.Schumm,F.L.Sheldon and O.Smithies,Science)196,16
1(1977)参照〕との連結を行い、Ｃｈａｒｏｎ ４Ａベ
クターのＲｉｇｈｔ−ａｒｍとＬｅｆｔ−ａｒｍの間に
ヒト由来のＤＮＡが挿入されたハイブリッドＤＮＡを得
た。連結にはＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ベセスダ・リサー
チ・ラボラトリーズ社製）を用い、連結反応は66mM Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6）−6.6mM ＭｇＣｌ２−10mMジ
チオスレイトール−１mM ＡＴＰ水溶液中で、11℃，12
時間行なった。得られたハイブリッドＤＮＡについて、
ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージング〔エイ・ベツカーおよ
びエム・ゴールドのプロシーデイングス・オブ・ザ・ナ
シヨナル・アカデミイー・オブ・サイエンシーズ・ユー
・エス・エイ(A.Becker and M.Gold,Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.)72,581(1975)〕を行ない、ヒト遺伝子ライブ
ラリー(1.8×106ＰＦＵ／μｇ，ヒトＤＮＡの99％以上
を含む）とした。
実施例３．（ヒト抗体遺伝子のスクリーニング） 前記実施例２で得られたヒト由来のＤＮＡを含むＣｈａ
ｒｏｎ ４Ａファージの集合（遺伝子ライブラリー）を
大腸菌ＬＥ392株に感染させ、プラークを形成させた。
ヒト抗体遺伝子を含むクローンは、ベントン(Benton)と
デイビス(Davis)のプラーク・ハイブリダイゼーシヨン
法〔ダブリユー・デイ・ベントンとアール・ダブリユー
・デイビスのサイエンス(W.D.Benton and R.W.Davis,Sc
ience)196,180(1977)参照〕を使用して、［32ｐ］−標
識ヒト抗体Ｈ鎖Ｊ遺伝子で選択した。ヒト抗体遺伝子を
含むＣｈａｒｏｎ ４ＡファージからのＤＮＡの調製
は、トーマス(Thomas)とデイビス(Davis)の方法［M.Tho
mas and R.W.Davis,J.Mol.Biol.,91,315(1974)参照］に
より行った。
ｒｏｎ ４Ａファージの集合（遺伝子ライブラリー）を
大腸菌ＬＥ392株に感染させ、プラークを形成させた。
ヒト抗体遺伝子を含むクローンは、ベントン(Benton)と
デイビス(Davis)のプラーク・ハイブリダイゼーシヨン
法〔ダブリユー・デイ・ベントンとアール・ダブリユー
・デイビスのサイエンス(W.D.Benton and R.W.Davis,Sc
ience)196,180(1977)参照〕を使用して、［32ｐ］−標
識ヒト抗体Ｈ鎖Ｊ遺伝子で選択した。ヒト抗体遺伝子を
含むＣｈａｒｏｎ ４ＡファージからのＤＮＡの調製
は、トーマス(Thomas)とデイビス(Davis)の方法［M.Tho
mas and R.W.Davis,J.Mol.Biol.,91,315(1974)参照］に
より行った。
実施例４．（制限エンドヌクレアーゼ切断点地図の作
成） 実施例３で得られたヒト抗体遺伝子を含むＣｈａｒｏｎ
４Ａ ＤＮＡ １μｇを制限エンドヌクレアーゼ消化
用バッファー［Ｅｃｏ Ｒ Ｉ，Ｍｌｕ Ｉ又はＳｐｈ
Ｉ．による消化では 50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
4）−100mM ＮａＣｌ−10mM ＭｇＳＯ４水溶液を用
い、ＡａｔII，Ａｖａ Ｉ，Ｂａｍ Ｈ Ｉ ，Ｂｓｔ
ＥII，ＨｉｎｄIII，Ｐｓｔ Ｉ又はＰｖｕIIによる
消化では 10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）−60mM
ＮａＣｌ−７mM ＭｇＣｌ２水溶液を用いＢｇｌII消化
では10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.4）−10mM ＭｇＳ
Ｏ４−１mMジチオスレイトール水溶液を用いそしてＨｐ
ａ Ｉ消化では 10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−2
0mM ＫＣｌ−７mM ＭｇＣｌ２−７mM２−メルカプト
エタノール水溶液を用いた。］20μに溶解させ、制限
エンドヌクレアーゼ（ＡａｔIIは東洋紡製，Ａｖａ Ｉ
はベセンダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製，Ｂｓｔ
ＥII，Ｓｐｈ Ｉはニュー・イングランド・バイオラブ
ズ社製，それ以外は宝酒造社製を用いた。）２ユニット
を添加して、37℃，１時間以上消化を行なった。なお、
二種類の制限エンドヌクレアーゼによる消化を行なう場
合には、まず低塩濃度で作用する制限エンドヌクレアー
ゼで処理し、次に所定濃度まで塩濃度を上げてから、よ
り高塩濃度で作用する制限エンドヌクレアーゼで処理す
る方法に従った。
成） 実施例３で得られたヒト抗体遺伝子を含むＣｈａｒｏｎ
４Ａ ＤＮＡ １μｇを制限エンドヌクレアーゼ消化
用バッファー［Ｅｃｏ Ｒ Ｉ，Ｍｌｕ Ｉ又はＳｐｈ
Ｉ．による消化では 50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.
4）−100mM ＮａＣｌ−10mM ＭｇＳＯ４水溶液を用
い、ＡａｔII，Ａｖａ Ｉ，Ｂａｍ Ｈ Ｉ ，Ｂｓｔ
ＥII，ＨｉｎｄIII，Ｐｓｔ Ｉ又はＰｖｕIIによる
消化では 10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）−60mM
ＮａＣｌ−７mM ＭｇＣｌ２水溶液を用いＢｇｌII消化
では10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.4）−10mM ＭｇＳ
Ｏ４−１mMジチオスレイトール水溶液を用いそしてＨｐ
ａ Ｉ消化では 10mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0）−2
0mM ＫＣｌ−７mM ＭｇＣｌ２−７mM２−メルカプト
エタノール水溶液を用いた。］20μに溶解させ、制限
エンドヌクレアーゼ（ＡａｔIIは東洋紡製，Ａｖａ Ｉ
はベセンダ・リサーチ・ラボラトリーズ社製，Ｂｓｔ
ＥII，Ｓｐｈ Ｉはニュー・イングランド・バイオラブ
ズ社製，それ以外は宝酒造社製を用いた。）２ユニット
を添加して、37℃，１時間以上消化を行なった。なお、
二種類の制限エンドヌクレアーゼによる消化を行なう場
合には、まず低塩濃度で作用する制限エンドヌクレアー
ゼで処理し、次に所定濃度まで塩濃度を上げてから、よ
り高塩濃度で作用する制限エンドヌクレアーゼで処理す
る方法に従った。
制限エンドヌクレアーゼによる消化後、４μの0.25％
ブロモフェノールブルー・50％グリセロール水溶液を加
え、0.8％〜2.5％アガロースゲル電気泳動を行なった。
アガロースはシグマ社のタイプII電気泳動用を使用し
た。電気泳動バッファーとして、40mM Ｔｒｉｓ−ＣＨ
３ＣＯＯＨ（pH8.0）−１mM ＥＤＴＡ水溶液を用い
た。厚さ２mmの垂直ゲルにて、６〜９Ｖ／cmの電圧で、
1.5〜３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際、
ＤＮＡ断片の分子量マーカーとして、λファージのＤＮ
ＡをＨｉｎｄIIIで消化したもの（ベーリンガー・マン
ハイム社製）を用いた。電気泳動終了後、アガロースゲ
ル中のＤＮＡを２μｇ／mlエチジウムブロマイド水溶液
を染色し、このゲルに対して長波長紫外線を照射して、
消化パターンの観察を行なった。各種制限エンドヌクレ
アーゼ単独による消化，及び二種の制限エンドヌクレア
ーゼの組合せによる消化のパターンを解析することによ
り、後述するような各制限エンドヌクレアーゼ切断点の
相対位置関係を決定した。
ブロモフェノールブルー・50％グリセロール水溶液を加
え、0.8％〜2.5％アガロースゲル電気泳動を行なった。
アガロースはシグマ社のタイプII電気泳動用を使用し
た。電気泳動バッファーとして、40mM Ｔｒｉｓ−ＣＨ
３ＣＯＯＨ（pH8.0）−１mM ＥＤＴＡ水溶液を用い
た。厚さ２mmの垂直ゲルにて、６〜９Ｖ／cmの電圧で、
1.5〜３時間電気泳動を行なった。この電気泳動の際、
ＤＮＡ断片の分子量マーカーとして、λファージのＤＮ
ＡをＨｉｎｄIIIで消化したもの（ベーリンガー・マン
ハイム社製）を用いた。電気泳動終了後、アガロースゲ
ル中のＤＮＡを２μｇ／mlエチジウムブロマイド水溶液
を染色し、このゲルに対して長波長紫外線を照射して、
消化パターンの観察を行なった。各種制限エンドヌクレ
アーゼ単独による消化，及び二種の制限エンドヌクレア
ーゼの組合せによる消化のパターンを解析することによ
り、後述するような各制限エンドヌクレアーゼ切断点の
相対位置関係を決定した。
実施例５．［ヒト抗体遺伝子のリクローニング（プロモ
ーター核酸塩基配列，Ｖ，Ｄ及びＪ遺伝子，エンハンサ
ー塩基配列を含む，3.4Kb−ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄIII
断片と大腸菌用プラスミドｐＢＰ322とのハイブリッド
ＤＮＡ）］ ヒト抗体遺伝子を含むＣｈａｒｏｎ ４Ａ ＤＮＡ ３
μｇを実施例４の方法に準じて制限エンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲ Ｉで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度0.8％）を行なった。プロモータ
ー核酸塩基配列，Ｖ，Ｄ及びＪ遺伝子，エンハンサー塩
基配列を含む3.4KbのＤＮＡの部分に相当するバンドを
切り出し、そのアガロースゲル断片を３倍量(vol./wt.)
の８Ｍ ＮａＣｌＯ４水溶液に溶解させた。チエン(Che
n)とトーマス(Thomas)のグラスフイルター法〔シー・ダ
ブリユー・チエンおよびシー・エイ・トーマス、ジユニ
アーのアナリテイカル・バイオケミストリー(C.W.Chen
and C.A.Thomas Jr.,Anal.Biochem)101,399(1980)〕に
より、3.4KbのＤＮＡ断片をアガロースゲルより回収し
た。一方、大腸菌用プラスミドｐＢＲ322 １μｇを実
施例４に準じて制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII及
びＥｃｏＲ Ｉで消化したものに対して、アルカリ性ホ
スファターゼ(E.coliC75)（宝酒造社製）を、0.5ユニッ
ト加えて、45℃で１時間反応させた。反応終了後、反応
液中のアルカリ性ホスファターゼを失活・除去するため
に、フェノール抽出を３回繰返した。このようにして得
られたｐＢＲ322のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲ Ｉ／アルカ
リ性ホスファターゼ処理液を、ゲルより回収した3.4Kb
ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄIII断片水溶液と混ぜ、エタノ
ール沈澱の後、連結反応用バッファー（実施例２を参
照）50μに溶解させる。２ユニットのＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼを加え、11℃，12時間反応させて、ハイブリッド
ＤＮＡを得た。
ーター核酸塩基配列，Ｖ，Ｄ及びＪ遺伝子，エンハンサ
ー塩基配列を含む，3.4Kb−ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄIII
断片と大腸菌用プラスミドｐＢＰ322とのハイブリッド
ＤＮＡ）］ ヒト抗体遺伝子を含むＣｈａｒｏｎ ４Ａ ＤＮＡ ３
μｇを実施例４の方法に準じて制限エンドヌクレアーゼ
ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲ Ｉで消化し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度0.8％）を行なった。プロモータ
ー核酸塩基配列，Ｖ，Ｄ及びＪ遺伝子，エンハンサー塩
基配列を含む3.4KbのＤＮＡの部分に相当するバンドを
切り出し、そのアガロースゲル断片を３倍量(vol./wt.)
の８Ｍ ＮａＣｌＯ４水溶液に溶解させた。チエン(Che
n)とトーマス(Thomas)のグラスフイルター法〔シー・ダ
ブリユー・チエンおよびシー・エイ・トーマス、ジユニ
アーのアナリテイカル・バイオケミストリー(C.W.Chen
and C.A.Thomas Jr.,Anal.Biochem)101,399(1980)〕に
より、3.4KbのＤＮＡ断片をアガロースゲルより回収し
た。一方、大腸菌用プラスミドｐＢＲ322 １μｇを実
施例４に準じて制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII及
びＥｃｏＲ Ｉで消化したものに対して、アルカリ性ホ
スファターゼ(E.coliC75)（宝酒造社製）を、0.5ユニッ
ト加えて、45℃で１時間反応させた。反応終了後、反応
液中のアルカリ性ホスファターゼを失活・除去するため
に、フェノール抽出を３回繰返した。このようにして得
られたｐＢＲ322のＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲ Ｉ／アルカ
リ性ホスファターゼ処理液を、ゲルより回収した3.4Kb
ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｉｎｄIII断片水溶液と混ぜ、エタノ
ール沈澱の後、連結反応用バッファー（実施例２を参
照）50μに溶解させる。２ユニットのＴ４−ＤＮＡリ
ガーゼを加え、11℃，12時間反応させて、ハイブリッド
ＤＮＡを得た。
大腸菌Ｃ600株の形質転換は、通常のＣａＣｌ２法〔エ
ム・ブイ・ノーガード、ケイ・キーンおよびジエイ・ジ
エイ・モナハンのジーン（M.V.Norgard,K.K.Keen and
J.J.Monaham,Gene,)3,297(1978)〕の改良法で行なっ
た。すなわち、５mlのＬ−ブロス（１％トリプトン，0.
5％酵母エキス，0.5％ＮａＣｌ，pH7.2）に大腸菌Ｃ600
株の18時間培養基を接種し、600nmにおける光学密度0.3
まで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッファ
ー［0.1Ｍ ＮａＣｌ−５mM ＭｇＣｌ２−５mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6，Ｏ℃）］中で２回洗い、２mlの
冷やしたカルシウム・バッファー［100mM ＣａＣｌ２
−250mM ＫＣｌ−５mM ＭｇＣｌ２−５mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH7.6，Ｏ℃）］中に再懸濁させ、Ｏ℃で25
時間放置する。次に菌体をこの容量の１／10にカルシウ
ム・バッファーの中で濃縮し、ハイブリッドＤＮＡ水溶
液と２：１(vol.：vol.)混合する。この混合物を60分
間，Ｏ℃で保った後、１mlのＬＢＧ−ブロス（１％トリ
プトン，0.5％酵母エキス，１％ＮａＣｌ，0.08％グリ
コース，pH7.2)を添加し、37℃で１時間培養する。培養
液を、選択培地（アンピシリン30μｇ／mlを含むＬ−ブ
ロス・プレート）に100μ／プレートで接種する。プ
レートを37℃で１晩培養して、形質転換株を生育させ
る。得られたコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡ
を調整し、アガロースゲル電気泳動により、目的のハイ
ブリッドＤＮＡを確認した。
ム・ブイ・ノーガード、ケイ・キーンおよびジエイ・ジ
エイ・モナハンのジーン（M.V.Norgard,K.K.Keen and
J.J.Monaham,Gene,)3,297(1978)〕の改良法で行なっ
た。すなわち、５mlのＬ−ブロス（１％トリプトン，0.
5％酵母エキス，0.5％ＮａＣｌ，pH7.2）に大腸菌Ｃ600
株の18時間培養基を接種し、600nmにおける光学密度0.3
まで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッファ
ー［0.1Ｍ ＮａＣｌ−５mM ＭｇＣｌ２−５mM Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6，Ｏ℃）］中で２回洗い、２mlの
冷やしたカルシウム・バッファー［100mM ＣａＣｌ２
−250mM ＫＣｌ−５mM ＭｇＣｌ２−５mM Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（pH7.6，Ｏ℃）］中に再懸濁させ、Ｏ℃で25
時間放置する。次に菌体をこの容量の１／10にカルシウ
ム・バッファーの中で濃縮し、ハイブリッドＤＮＡ水溶
液と２：１(vol.：vol.)混合する。この混合物を60分
間，Ｏ℃で保った後、１mlのＬＢＧ−ブロス（１％トリ
プトン，0.5％酵母エキス，１％ＮａＣｌ，0.08％グリ
コース，pH7.2)を添加し、37℃で１時間培養する。培養
液を、選択培地（アンピシリン30μｇ／mlを含むＬ−ブ
ロス・プレート）に100μ／プレートで接種する。プ
レートを37℃で１晩培養して、形質転換株を生育させ
る。得られたコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡ
を調整し、アガロースゲル電気泳動により、目的のハイ
ブリッドＤＮＡを確認した。
実施例６．（ＤＮＡ塩基配列の決定） ヒト抗体遺伝子プロモーター領域の塩基配列は、マキサ
ム−ギルバート法〔エイ・マツクスおよびダブリユー・
ギルバートのメソーヅ・イン・エンザイモロジー(A.Max
am and W.Gilbert,Gilbcrt,Methods Enzymol.,)65,499
(1980)〕により決定した。
ム−ギルバート法〔エイ・マツクスおよびダブリユー・
ギルバートのメソーヅ・イン・エンザイモロジー(A.Max
am and W.Gilbert,Gilbcrt,Methods Enzymol.,)65,499
(1980)〕により決定した。
たとえば、前記実施例５において作成されたサブクロー
ン ｐＴＪ３ ＤＮＡ約50μｇを実施例４の方法に準じ
てＢａｍＨ Ｉで消化する。得られたＤＮＡ断片をアル
カリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社製）５ユニ
ットを用いて［γ−32ｐ］ＡＴＰで標識した。ポリヌク
レオチドキナーゼ反応は50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH9.
5）−10mM ＭｇＣｌ２−５mMジチオスレイトール水溶
液中で行ない、［γ−32ｐ］ＡＴＰはアマーシャム社製
を100μＣｉ分用いた。32ｐ標識ＤＮＡ断片をＢａｎ
Ｉで消化した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）により目的のＤＮＡ断片を分離し、ゲルか
らの抽出を行なった。得られた32ｐ標識−ＢａｍＨ Ｉ
／Ｂａｎ Ｉ断片について、各塩基特異的な部分分解反
応を行ない、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ゲル濃度８％〜23％）で分離した。２〜７日
間，−80℃でオートラジオグラフィーを行なった後、分
解パターンの解析を行ない、プロモーター領域の塩基配
列決定のための資料とした。
ン ｐＴＪ３ ＤＮＡ約50μｇを実施例４の方法に準じ
てＢａｍＨ Ｉで消化する。得られたＤＮＡ断片をアル
カリ性ホスファターゼで脱ホスホリル化し、ポリヌクレ
オチドキナーゼ（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ社製）５ユニ
ットを用いて［γ−32ｐ］ＡＴＰで標識した。ポリヌク
レオチドキナーゼ反応は50mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH9.
5）−10mM ＭｇＣｌ２−５mMジチオスレイトール水溶
液中で行ない、［γ−32ｐ］ＡＴＰはアマーシャム社製
を100μＣｉ分用いた。32ｐ標識ＤＮＡ断片をＢａｎ
Ｉで消化した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）により目的のＤＮＡ断片を分離し、ゲルか
らの抽出を行なった。得られた32ｐ標識−ＢａｍＨ Ｉ
／Ｂａｎ Ｉ断片について、各塩基特異的な部分分解反
応を行ない、７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電
気泳動（ゲル濃度８％〜23％）で分離した。２〜７日
間，−80℃でオートラジオグラフィーを行なった後、分
解パターンの解析を行ない、プロモーター領域の塩基配
列決定のための資料とした。
マウスミエローマ中でのヒト抗体遺伝子の蛋白質の産生
に発現型ベクターｐＳＶ−２ｇｐ＋〔シー・ミユルガン
とピー・ベルグのサイエンス(C.Mulligan and P.Berg,S
cience)209,1422-1427(1980)〕のＥｃｏＲ Ｉサイトに
ヒト鎖遺伝子21Kbp（ｐＳＶ−２−ＨＩＧＩ）を挿入し
た。この遺伝子のオリエンテーシヨン（方向性）はベク
ターｐＳＶ−２ｇｐｔのＳＶ40アーリー・プロモーシヨ
ン(early promotion)と逆である。
に発現型ベクターｐＳＶ−２ｇｐ＋〔シー・ミユルガン
とピー・ベルグのサイエンス(C.Mulligan and P.Berg,S
cience)209,1422-1427(1980)〕のＥｃｏＲ Ｉサイトに
ヒト鎖遺伝子21Kbp（ｐＳＶ−２−ＨＩＧＩ）を挿入し
た。この遺伝子のオリエンテーシヨン（方向性）はベク
ターｐＳＶ−２ｇｐｔのＳＶ40アーリー・プロモーシヨ
ン(early promotion)と逆である。
ｐＳＶ−２ＨＩＧＩを大腸菌ＭＣ1000に形質転換し、こ
れをマウスミエローマＮＳ−１にプロトプラスト融合で
導入し選択培地（マイコフェノール酸６γ／mlを含む）
で培養したところ、マウスミエローマＮＳ−１ＤＮＡに
ＨＩＧＩが１コピー挿入した形質転換体を得た。この形
質転換体から全ＲＮＡを抽出してＣγ1ｐｓｔ Ｉフラ
グメントをプローグとしてノーザン・ハイブリダイゼー
シヨンを行なったところ1.8KbにＨＩＧＩのＭＲＮＡが
検出されその量は元のヒトリンホーマＡＲＨ77の約50〜
100倍であった。
れをマウスミエローマＮＳ−１にプロトプラスト融合で
導入し選択培地（マイコフェノール酸６γ／mlを含む）
で培養したところ、マウスミエローマＮＳ−１ＤＮＡに
ＨＩＧＩが１コピー挿入した形質転換体を得た。この形
質転換体から全ＲＮＡを抽出してＣγ1ｐｓｔ Ｉフラ
グメントをプローグとしてノーザン・ハイブリダイゼー
シヨンを行なったところ1.8KbにＨＩＧＩのＭＲＮＡが
検出されその量は元のヒトリンホーマＡＲＨ77の約50〜
100倍であった。
又、Ｓメチオニン存在下で形質転換体を培養し、細胞内
に産生したＨ鎖蛋白をリルアミド電気泳動にかけオート
ラジオグラフィーにとったところ54Ｋに分泌方Ｈ鎖蛋白
が検出され、その量はＡＲＨ77の鎖蛋白の50〜100倍で
あった。
に産生したＨ鎖蛋白をリルアミド電気泳動にかけオート
ラジオグラフィーにとったところ54Ｋに分泌方Ｈ鎖蛋白
が検出され、その量はＡＲＨ77の鎖蛋白の50〜100倍で
あった。
実施例７（β−グロビンの発現） ヒト−β−グロビン遺伝子〔エム・ポンツ、イー・シユ
バルツ、エム・バレンチンおよびエス・サーリイらのザ
・ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(M.Poncz,E.Schwartz,M.Ballantine and S.Surry,The J
ounal of Biological Chemistry)258(19)11599-11609(1
983)〕の５′上流にあるエンドヌクレアーゼサイドＳｐ
ｈ Ｉに、ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の前記本発明のプロモー
ター核酸塩基配列（Ｐ−Ｂ，これはＰ１＋Ｐ２＋Ｐ３型
の配列を含む）を含むエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉ
−Ｓｐｈ Ｉフラグメント2.3KbのＳｐｈ Ｉサンドで
結いだ。これは発現の方向性が同一になるようにしたも
のである。
バルツ、エム・バレンチンおよびエス・サーリイらのザ
・ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
(M.Poncz,E.Schwartz,M.Ballantine and S.Surry,The J
ounal of Biological Chemistry)258(19)11599-11609(1
983)〕の５′上流にあるエンドヌクレアーゼサイドＳｐ
ｈ Ｉに、ヒト抗体Ｈ鎖遺伝子の前記本発明のプロモー
ター核酸塩基配列（Ｐ−Ｂ，これはＰ１＋Ｐ２＋Ｐ３型
の配列を含む）を含むエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉ
−Ｓｐｈ Ｉフラグメント2.3KbのＳｐｈ Ｉサンドで
結いだ。これは発現の方向性が同一になるようにしたも
のである。
また、同様にヒト−β−グロビン遺伝子の５′上流Ｈｐ
ａ Ｉサイトにヒト−エンハンサーを含むＡａｔII−Ｈ
ｐａ Ｉフラグメント1.4KbまＨｐａ Ｉサイトで結ぎ
同じく発現の方向性が同一になるようにした。
ａ Ｉサイトにヒト−エンハンサーを含むＡａｔII−Ｈ
ｐａ Ｉフラグメント1.4KbまＨｐａ Ｉサイトで結ぎ
同じく発現の方向性が同一になるようにした。
いずれもベクターとしてＰＢＲ322を用い、上記のよう
に結合したハイブリッドＤＮＡを持つプラスミドを作成
し、更に大腸菌ＭＣ1000にＲｂ Ｃｌ法により形質転換
することによりこのプラスミドを移入した。
に結合したハイブリッドＤＮＡを持つプラスミドを作成
し、更に大腸菌ＭＣ1000にＲｂ Ｃｌ法により形質転換
することによりこのプラスミドを移入した。
次にこのプラスミドを含む大腸菌ＭＣ1000の形質転換体
とマウスミエローマＪ558Ｌとのプラスミド融合により
プラスミドをマウスミエローマＪ558Ｌ内に導入した。
ＲＰＭＩ完全培地で72時間、この細胞を成育させた後、
約１×107個の細胞からＲＮＡ300μｇを得た。
とマウスミエローマＪ558Ｌとのプラスミド融合により
プラスミドをマウスミエローマＪ558Ｌ内に導入した。
ＲＰＭＩ完全培地で72時間、この細胞を成育させた後、
約１×107個の細胞からＲＮＡ300μｇを得た。
このＲＮＡ20μｇを用い、ヒト−β−グロビン遺伝子の
Ｅｘｏｎ２とＥｘｏｎ３を含むＢａｍＨ Ｉ−ＥｃｏＲ
ＩフラグメントをプローブとしてNorthernhybridizat
ionを行ったところ、５ｓにバンドが検出されヒト−β
−グロビン遺伝子のＥｘｏｎ２のｍＲＮＡの発現が見ら
れた。またこのバンドの濃淡から発現の強さを比較する
と、本発明の前記プロモーター核酸遺伝子を結合させた
場合でも、またエンハンサーを結合させた場合のいずれ
であっても、ヒト−β−グロビン遺伝子のみに比べて約
５〜10倍のｍＲＮＡレベルでの発現が増大した。
Ｅｘｏｎ２とＥｘｏｎ３を含むＢａｍＨ Ｉ−ＥｃｏＲ
ＩフラグメントをプローブとしてNorthernhybridizat
ionを行ったところ、５ｓにバンドが検出されヒト−β
−グロビン遺伝子のＥｘｏｎ２のｍＲＮＡの発現が見ら
れた。またこのバンドの濃淡から発現の強さを比較する
と、本発明の前記プロモーター核酸遺伝子を結合させた
場合でも、またエンハンサーを結合させた場合のいずれ
であっても、ヒト−β−グロビン遺伝子のみに比べて約
５〜10倍のｍＲＮＡレベルでの発現が増大した。
添付図面は、該抗体遺伝子を含むヒト染色体ＤＮＡの制
限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによる切断部位及び
その間に存在する単位及び塩基配列を示すものである。
限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによる切断部位及び
その間に存在する単位及び塩基配列を示すものである。
Claims (1)
- 【請求項１】(i)下記核酸塩基配列単位（Ｐ１） ＧＧＧＴＴＴＧＧＴＧＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧ
ＡＡＧＡＧＡＡＣＴＧＡＧＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＡ
ＣＡＧＣＣＡＧＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡ
ＧＣＣＣＡＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＣＣＣＴＡ
ＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＡＡＡＧ
ＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＣＡＣ
ＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＴＡＣ
ＡＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＡＡＡＴＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧ
ＣＴ ［但しここでＡはデオキシアデノシン−５′−リン酸，
Ｃはデオキシシチジン−５′−リン酸，Ｇはデオキシグ
アノシン−５′−リン酸，Ｔはデオキシチミジン−５′
−リン酸を示す。］ を含有する塩基配列、 (ii)下記核酸塩基配列単位（Ｐ２） ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣ
ＡＧＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＧＧＴ （ここでＡ，Ｃ，Ｇ及びＴは前記定義と同じ）及び (iii)下記核酸塩基配列単位（Ｐ３） ＡＧＴＧＴＣＴＣＡＣＣＡＡＴＧＣＧＧＡＴＡＴＧＡＡ
ＧＡＴＡＴＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＧＡＴＣＣＣ
ＡＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴ
ＣＡＣＡＧＧＧＧＴ （ここでＡ，Ｃ，Ｇ及びＴは前記定義と同じ）を含有す
る塩基配列及びそれに相補的な塩基配列からなるプロモ
ーター核酸塩基配列。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59251971A JPH0634722B2 (ja) | 1984-11-30 | 1984-11-30 | プロモーター核酸塩基配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59251971A JPH0634722B2 (ja) | 1984-11-30 | 1984-11-30 | プロモーター核酸塩基配列 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61132185A JPS61132185A (ja) | 1986-06-19 |
| JPH0634722B2 true JPH0634722B2 (ja) | 1994-05-11 |
Family
ID=17230715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59251971A Expired - Lifetime JPH0634722B2 (ja) | 1984-11-30 | 1984-11-30 | プロモーター核酸塩基配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0634722B2 (ja) |
-
1984
- 1984-11-30 JP JP59251971A patent/JPH0634722B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61132185A (ja) | 1986-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kaufman et al. | Drosophila P element transposase recognizes internal P element DNA sequences | |
| Sheppard et al. | Allelic forms of rat κ chain genes: evidence for strong selection at the level of nucleotide sequence | |
| Maki et al. | The role of DNA rearrangement and alternative RNA processing in the expression of immunoglobulin delta genes | |
| Mishima et al. | Fractiontion and reconstitution of factors required for accurate transcription of mammalian ribosomal RNA genes: identification of a species-depandent initiation factor | |
| JP2682858B2 (ja) | 白血病抑制性因子 | |
| Crabtree et al. | Evolution and structure of the fibrinogen genes: random insertion of introns or selective loss? | |
| AU634314B2 (en) | Chimeric mouse-human a10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen | |
| JPS61134325A (ja) | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 | |
| JPH05304989A (ja) | ヒト型キメラ抗体の製造法 | |
| JPH02500329A (ja) | ターゲット化多機能蛋白質 | |
| WO1988007089A1 (en) | Altered antibodies | |
| Solnick | Construction of an adenovirus-SV40 recombinant producing SV40 T antigen from an adenovirus late promoter | |
| JPS63503275A (ja) | ファクター８：ｃの製造方法 | |
| JPH04505552A (ja) | 哺乳動物宿主細胞における組み込み部位非存性遺伝子発現用のベクター | |
| JP3123650B2 (ja) | ヒトフォン・ヴィレブランド因子のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ、及び該ｃＤＮＡを含有する宿主細胞 | |
| JPH03501323A (ja) | 真正のヒト血清アルブミンをコードする人工遺伝子、その使用およびその製造法 | |
| Akira et al. | A cloned human immunoglobulin heavy chain gene with a novel direct-repeat sequence in 5'flanking region | |
| CA2123492C (en) | Lymphoid antigen cd30 | |
| EP0146743B1 (en) | Gene fragments derived from human immunoglobulin gene | |
| JPH0634722B2 (ja) | プロモーター核酸塩基配列 | |
| EP0404003A2 (en) | Chimeric mouse-human KM10 antibody with specificity to a human tumor cell antigen | |
| CN120641443A (zh) | 特异性结合tnf-样配体1a（tl1a）的单克隆抗体或其抗原结合片段及其用途 | |
| WO1991012272A1 (en) | Protein factor | |
| JPH0440894A (ja) | イヌ免疫グロブリンγ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片およびマウス×イヌキメラ抗体 | |
| JPH0698021B2 (ja) | マウス−ヒトキメラ抗体、それをコ−ドする発現型キメラｄｎａ配列、プラスミド及び細胞 |