JPH0634748B2

JPH0634748B2 - 微生物による３−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−カルボン酸の製造法

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Publication number: JPH0634748B2
Application number: JP59042855A
Authority: JP
Inventors: 貢飯田
Original assignee: Permachem Asia Ltd
Current assignee: Permachem Asia Ltd
Priority date: 1984-03-08
Filing date: 1984-03-08
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2009-05-11
Also published as: JPS60188094A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は微生物による３−オキソ−１，４−プレグナジ
エン−２０−カルボン酸の製造法に関する。

即ち、本発明はβ−シトステロール（カンペステロール
を含有）を３−オキソ、１，４−プレグナジエン−２０
−カルボン酸に変換する能力を有する新菌種コリネバク
テリウム・エスピー３２０−６−２−１をβ−シトステ
ロールを基質とする培地中で培養し、培養後の培養液か
ら３−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−カルボ
ン酸を採取することを特徴とする３−オキソ−１，４−
プレグナジエン−２０−カルボン酸の製造方法である。

３−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−カルボン
酸は下記の式（Ｉ）で表わされる化合物で、ステロイド
ホルモンの製造のための有用な中間体である。

式（Ｉ）の化合物は、ステロール化合物を基質としてコ
リネバクテリウム属微生物もしくはコリネ型バクテリア
を用いて醗酵することにより製造することが知られてい
る（特開昭５４−１４５２８７号、特開昭５５−１２７
９９１号）。また、これらの従来方法においては、式
（Ｉ）の化合物のほかに、３−オキソ−４−プレグネン
−２０−カルボン酸が同時に生成することが知られてい
る。

本発明者は、炭化水素であるケロセンとコレステロール
を資化しうる微生物を広く土壌より探索したところ、神
奈川県横浜市中区根岸の土壌から分離したコリネバクテ
リウム３２０−６−２−１菌をグルコースを炭素源とし
β−シトステロール（カンペステロール含有）を含む培
地に培養すると、式（Ｉ）で表わされる３−オキソ−
１，４−プレグナジエン−２０−カルボン酸が著しく高
収率（例えば５６％）で生産され、そして３−オキソ−
４−プレグネン−２０−カルボン酸は生産されないこと
を発見した。

本発明はこの知見に基いて完成されたものである。

本発明で使用するコリネバクテリウム３２０−６−２−
１菌の菌学的性質は、以下の通りである。

（１）形態および一般的性質グラム陽性、好気性、細胞は短桿菌もしくは球菌に近く
０．４〜１×０．４〜１μｍ、スナツピング(Snapping)
型の分裂様式、OFテスト陰性、非抗酸性、カタラーゼ陽
性、オキシダーゼ陰性、運動性なし（２）培養的性質（ａ）肉汁寒天平板培養コロニー周縁は裂片状、隆起状態は台状、コロニーの色
調はクリーム色〜淡橙色（ｂ）肉汁液体培養少し混濁し、菌膜を形成（ｃ）ゼラチン穿刺培養液化せず（ｄ）リトマスミルク変化せず（３）生理的性質（ａ）硝酸塩還元：陽性（ｂ）ＯＦテスト：陰性（ｃ）糖からの酸生成：アラビノース陰性トレハロース陰性キシロース陰性セロビオース陰性グルコース陰性ラフイノース陰性フルクトース陰性アドニトール陰性マンノース陰性マンニトール陰性マルトース陰性ソルビトール陰性ガラクトース陰性イノシトール陰性シユクロース陰性サリシン陰性ラクトース陰性（ｄ）炭素源の利用性：酢酸陽性ギ酸陽性ピルビン酸陽性プロピオン酸陽性酒石酸陽性酪酸陽性フマル酸陽性グルコン酸陰性 α−ケト−グルタル酸陰性グリコール酸陰性クエン酸陰性（ｅ）インドール生成：陰性（ｆ）ＭＲテスト：陰性（ｇ）デンプンの加水分解：陽性（弱）（ｈ）硫化水素の生成：陽性（ｉ）ウレアーゼ：陽性（ｊ）色素の生成：あり（ｋ）最適生育温度：２５〜３５℃ （ｌ）塩化ナトリウムの耐性：２．５％生育、５％生育
せず（ｍ）DNase：陽性（ｎ）ＤＮＡのＧＣ％：７１．４１％（ｏ）細胞壁の主なアミノ酸：meso−ＤＡＰ以上のことから、本菌株を山田および駒形：ジヤーナル
・オブ・ジエネラル・アプライド・ミクロバイオロジー
(Journal of General Applied Microbiology)１６，２
１５，１９７０と１８，３９９−４１６，４１７−４３
１，１９７２の論文を参照し、バージエイズ・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジー(Ber
gey′s Manual of Determinative Bacteriology)第８版
（１９７４年）の分類で検索した結果、本菌株はコリネ
バクテリウム・エクイに類似している。そして本菌株
は、顕微鏡観察の結果、細胞の分裂はスナツピング現象
が認められた〔参照：駒形ら：ジヤーナル・オブ・ジエ
ネラル・アプライド・ミクロバイオロジー(Journal of
General Applied Microbiology)１５，２４３，１９６
９〕。

この細胞の分裂様式を菌体脂肪酸組成のパターンから見
ると、スナツピングタイプの菌は飽和脂肪酸、一不飽和
脂肪酸および分枝脂肪酸（１０−Me−１９）がある。ま
た典型的なベンデングタイプであるノカルデイア属、ミ
コバクテリウム属の菌体脂肪酸組成には、イソーアンテ
イソ脂肪酸がある。そして本菌株の菌体脂肪酸を分析し
た結果、イソ−アンテイソ脂肪酸の存在が認められず、
スナツピングタイプであるコリネバクテリウム・エクイ
ＡＴＣＣ６９３９と脂肪酸組成のパターンが一致するこ
とがわかつた（参照：鈴木らの発表：日本農芸化学会昭
和５６年度大会講演要旨集p316)。

次に本菌株のメナキノン（ＭＫ）を調べたところ、メナ
キノン（ＭＫ）が存在していた。そこで山田ら：ジヤー
ナル・オブ・ジエネラル・アプライド・ミクロバイオロ
ジー(Journal of General Applied Microbiology)２
２，２０３，１９７６の論文に準拠して分析を行ない、
計算した結果、ＭＫ−８（Ｈ_２）になり、山田らのコリ
ネバクテリウム・エクイＡＴＣＣ６９３９と同じである
ことがわかつた。

これらの点から、本菌株はコリネバクテリウム・エクイ
と類似しているが、以下の点でコリネバクテリウム・エ
クイとは明瞭に異なることを示した。

即ち、本菌株は生理的性質から見て、グリコール酸陰
性、DNase陽性であり、塩化ナトリウムの耐性が弱いこ
とやＤＮＡのＧＣ％が７１．４１％で基準株コリネバク
テリウム・エクイＡＴＣＣ6939のＤＮＡのＧＣ％６７．
８％より４％とひらきがあり、またコリネバクテリウム
・エクイといわれている菌株の中に、ＤＮＡのＧＣ％が
６９％以上の値を示すものが現在のところ見つかつてい
ない〔参照：山田および駒形：ジヤーナル・オブ・ジエ
ネラル・アプライド・ミクロバイオロジー(Journal of
General Applied Microbiology)１６，２１５，１９７
０〕。

以上のことから本菌株はコリネバクテリウム属に属する
新菌種である。そして本菌株は工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第７５２１号（ＦＥＲＭＰ−７
５２１）として寄託されている。

つぎに、本発明において基質として用いられるβ−シト
ステロール（カンペステロール含有）は、微粉末状とし
て、またはトウイーン（アトラス社商品名）、ノニオン
（日本油脂社商品名）等のような界面活性剤中における
乳濁液状として、あるいはメタノール、ジメチルホルム
アミドおよびジメチルスルホキシド等の水と混和する有
機溶媒中における溶液状として培地に加えることができ
る。そして基質であるβ−シトステロール（カンペステ
ロール含有）の濃度は通常０．１〜１０ｇ／、好まし
くは０．５〜１ｇ／である。

つぎに、本発明において、培地の炭素源としては、グル
コース、蔗糖、デキストリン、澱粉、グリセリン等が用
いられる。また培地中の窒素源としては、有機窒素源、
無機窒素源、例えばコーンスチープリカー、硫酸アンモ
ニウム等が用いられる。また微量の金属塩類、酵母エキ
ス等を培地に加えることができる。

さらに、培地には、キレート化剤、金属イオンなどを加
えるのが好ましく、その具体例として、例えばα，α′
−ジピリジル、ｏ−フエナントロリン、８−オキシキノ
リン、コバルトイオン等が使用出来る。このキレート化
剤もしくは金属イオンの濃度は１０^-3〜１０^-4モル濃度
であるのがよく、好ましくは１×１０^-3モル濃度であ
る。なお、このキレート化剤、金属イオンなどは培養中
に培地に加えるのがよい。

培地のpHは６〜８に調整するのが好ましい。

培養は、液体培養で、好気的条件下、好ましくは深部攪
拌培養法または振盪培養法によつて行なうことができ
る。

培養の温度は、一般に２０〜３０℃の範囲、好ましくは
２７〜３０℃の範囲である。

培養日数はβ−シトステロール（カンペステロール含
有）添加後、３〜１４日間行なうのが適当である。

培養終了後、培養液中に蓄積した３−オキソ−１，４−
プレグナジエン−２０−カルボン酸は、既知の方法で採
取することができる。例えば培養液を酢酸エチル等の有
機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒を留去し、残渣物をシ
リカゲルのカラムに吸着させ、ベンゼン−酢酸エチルの
混合溶媒を用いて３−オキソ−１，４−プレグナジエン
−２０−カルボン酸を分取することができる。

本発明によれば、目的物である３−オキソ−１，４−プ
レグナジエン−２０−カルボン酸が著しく高収率で生産
され、そして副生物が少ない。即ち、本発明によれば、
副生物のアンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジ
オン、カンペステノン、β−シト−４−エン−３−オ
ン、ステグマステノンが少量であることから、純粋な３
−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−カルボン酸
を楽に分取することができる。

本発明で製造される３−オキソ−１，４−プレグナジエ
ン−２０−カルボン酸は、例えばプレドニソロンなどの
ステロイドホルモンを製造するための中間体として有用
である。

つぎに、本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより
制限されるものではない。

なお、実施例において３−オキソ−１，４−プレグナジ
エン−２０−カルボン酸の定量は、ジアゾメタンでメチ
ル化したものを、また、アンドロスタ−１，４−ジエン
−３，１７−ジオン、β−シト−４−エン−３−オン、
カンペステノン、スチグマステノンの定量はそのまま
で、ガスクロマトグラフイーにて内部標準法（昭和４４
年１１月１５日広川書店発行、舟阪・池川編著「最新ガ
スクロマトグラフイー〔Ｉ〕」第３０８頁〜第３０９頁
参照）により行なつた。

又これら生成物は分取用薄層クロマトグラフイーにより
分離して結晶をとり出し、薄層クロマトグラフイー、ガ
スクロマトグラフイー、紫外吸収スペクトル、ガスクロ
マトグラフイー−直結質量分析、質量分析を標品と比較
して同定した。

実施例１コーンスチープリカー１％、肉エキス０．５％、グルコ
ース０．５％、K₂HPO₄０．２％、寒天２％、pH７．２か
らなるスラントに３０℃で２４時間培養したコリネバク
テリウム３２０−６−２−１菌〔微工研菌寄第７５２１
号（ＦＥＲＭＰ−７５２１）〕の１白金耳量を、コー
ンスチープリカー１％、肉エキス０．５％、グルコース
０．５％、K₂HPO₄０．２％、蒸留水からなる液体培地
（pH７．２）１００mlを５００mlフラスコに分注し、滅
菌した培地に植菌した。

２７℃、４８時間２２０回転で振盪培養し、前培養を行
なつた。前培養液から２mlを上記液体培地１００mlから
なる５００mlフラスコに植菌した。２７℃、２２０回転
で振盪培養し、培養２２時間後、β−シトステロール
（カンペステロール４０％含有）５００mgを乳鉢ですり
つぶした後、蒸留水１０ml、トウイーン(Tween)８０
１００mgを加え、超音波をかけ分散させたものを１ml
（５０mg）添加し、そのまま振盪培養を続けた。上記の
β−シトステロール（カンペステロール４０％含有）添
加後、６時間目にα，α′−ジピリジルを１×１０^-3Ｍ
になる様に添加し、さらに２７℃で振盪培養を１４日間
行なつた。経日的に培養液を２ml採取し、酢酸エチルで
抽出し、抽出液をガスクロマトグラフイーにかけ、内部
標準法により生成物を定量した。その結果を第１表に示
す。なお、第１表中、上段の数字はmg/ml、下段の括弧
内の％はモル％である。

実施例２コーンスチープリカー１％、肉エキス０．５％、グルコ
ース０．５％、K₂HPO₄０．２％、寒天２％、pH７．２か
らなるスラントに３０℃で２４時間培養したコリネバク
テリウム３２０−６−２−１菌〔微工研菌寄第７５２１
号（ＦＥＲＭＰ−７５２１）〕の１白金耳量をコーン
スチープリカー１％、肉エキス０．５％、グルコース
０．５％、K₂HPO₄０．２％、蒸留水からなる液体培地
（pH７．２）１００mlを５００mlフラスコに分注し、滅
菌した培地に植菌し、２７℃、４８時間２２０回転で振
盪培養し、前培養を行なつた。

この前培養液８０mlを上記液体培地４からなる７ジ
ヤーフアーメンターに植菌した。２７℃で通気攪拌培養
（４００回転、空気３／分）し、培養２２時間後、β
−シトステロール（カンペステロール４０％含有）２ｇ
を乳鉢ですりつぶした後、蒸留水４０ml、トウイーン(T
ween)８０４００mgを加え、超音波をかけ分散させたも
のを添加し、そのまま通気攪拌培養を続けた。このβ−
シトステロール（カンペステロール４０％含有）添加
後、６時間目にα，α′−ジピリジルを１×１０^-3Ｍに
なる様に添加し、さらに２７℃で通気攪拌培養を３日間
行なつた。

培養終了後、培養液を硫酸でpH２に補正後、酢酸エチル
４で２回抽出した。抽出液を減圧下で濃縮し、残渣２
１．９６ｇ得た。この残渣を少量の酢酸エチルに溶か
し、シリカゲルカラム（和光純薬製、ワコーゲルＣ−２
００５００ｇ、カラムサイズ５０mmφ×６０cm）にか
け、２０％酢酸エチル−ベンゼン２．５、３０％酢酸
エチル−ベンゼン２．０、４０％酢酸エチル−ベンゼ
ン３．５、酢酸エチル１．５で溶出した。酢酸エチ
ル溶出区分を集めて減圧下で溶媒を留去し、得られた残
渣を再びシリカゲルカラム（ワコーゲルＣ−２００４
５ｇ、カラムサイズ２０mmφ×４０cm）にかけ、１０％
酢酸エチル−ベンゼン１．５、酢酸エチル０．５で
溶出させた。酢酸エチル溶出区分を集め、溶媒を減圧下
で留去し、粗の３−オキソ−１，４−プレグナジエン−
２０−カルボン酸を３．１８ｇ得た。この粗物質を酢酸
エチルで再結晶を３回くり返して３−オキソ−１，４−
プレグナジエン−２０−カルボン酸の無色結晶を９９．
７mg得た。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】β−シトステロール（カンペステロールを
含有）を３−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−
カルボン酸に変換する能力を有する新菌種コリネバクテ
リウム・エスピー３２０−６−２−１をβ−シトステロ
ールを基質とする培地中で培養し、培養後の培養液から
３−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−カルボン
酸を採取することを特徴とする３−オキソ−１，４−プ
レグナジエン−２０−カルボン酸の製造方法