JPS60188094A - 微生物による３−オキソ−１，４−プレグナジエン−２０−カルボン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物による３−オキシー／、４−プレグナジ
ェン−、！Ｏ−カルボン酸の製造法に関する。

即チ、本発明はβ−シトステロール（カンペステロール
含有）を基質とする培地に、コリネバクテリウム３Ｊ！
、０−Ａ　−ｕ−／菌を培養することを特徴とする３−
オキシー／、＜ｉｎ−プレグナジェン−，２０−カルボ
ン酸の製造法で・ある。

３−オキソ−／、＆−プレグナジエンーコ０−カルボン
酸は下記の式（１）で表わされる化合物で、ステロイド
ホルモンの製造のための有用な中間体である。

式（１）の化合物は、ステロール化合物を基質としてコ
リネバクテリウム属微生物もしくはコリネ型バクテリア
を用いて醗酵することにより製造することが知られてい
る（特開昭オη−１ｌタ、２ｇ７号、特開昭オｊ−／Ｊ
７９９／号）０また、これらの従来方法においては、式
（１）の化合物のほかに、３−オキソ−４−プレグネン
−２０−カルボン酸が同時に生成することが知られてい
る０本発明者は、炭化水素マあるケロセンとコレステロ
ールを資化しうる微生物を広（土壌より探索したところ
、神奈川県横浜市中区根岸の土壌から分離したコリネバ
クテリウム３２０−６−２−／菌をグルコースを炭素源
としβ−シトステロール（カンペステロール含有）を含
む培地に培養すると、式（１）で表わされる３−オキシ
ー７．クーブレグナジエン−一〇−カルボン酸が著しく
高収率（例えばｊ６％）で生産され、そして３−オキソ
−ｌ−プレグネン−２０−カルボン酸は生産されないこ
とを発見した。

本発明はこの知見に基いて完成されたものである０ 本発明で使用するコリネバクテリウム３−２０−４−ニ
ー７菌の菌学的性質は、以下の通りである０（１）形態
および一般的性質 ダラム陽性、好気性、細胞は短桿菌もしくは球菌に近（
ｏ　−／ｌ〜／　×ｏ　−’ｌ−／　μｍ、スナツピン
グ（Ｓｎａｐｐｉｎｇ〕型の分裂様式、ＯＦテスト陰性
、非抗酸性、カタラーゼ陽性、オギシダーゼ陰性、運動
性なし く２）培養的性質 （ａ）肉汁寒天平板培養 コロニー周縁は裂片状、隆起状態は台状、コロニーの色
調はクリーム色〜淡橙色 （ｂ）肉汁液体培養 少し混濁し、菌膜を形成 （ｃ）ゼラチン穿刺培養　′ 液化せず （ｄ）リドマスミルク 変化せず （３）生理的性質 （ａ）硝酸塩還元：陽性 （ｂ）ＯＦテスト　：陰性 （ｃ）糖からの酸生成： アラビノース　陰性　トレハロース　陰性キシロース　
陰性　セロビオース　陰性グルコース　陰性　ラフィノ
ース　陰性フルクトース　陰性　アドニトール　陰性マ
ンノース　陰性　マンニトール　陰性マルトース　陰性
　ソルビトール　陰性ガラクトース　陰性　イノシトー
ル　陰性シュクロース　陰性　サリシン　陰性 ラクトース　陰性 （ｄ）炭素源の利用性： 酢　酸　陽性　ギ　酸　陽性 ピルビン酸　陽性　プロピオン酸　陽性酒石酸　陽性　
酪　酸　陽性 フマル酸　陽性　グルコン酸　陰性 α−ケトーグレタノ布　陰性　グリコール酸　陰性クエ
ン酸　陰性 （ｅ）インドール生成：陰性 （ｆ）ＭＲテスト　：陰性 （ｇ）ル外４水分解：陽性（弱） （１１）硫化水素の生成：陽性 （ｉ）ウレアーゼ　：陽性 （ｊ）色素の生成　：あり （、ｋ）最適生育温度：ユ、ｆ〜３ｊＣ（１）塩化す）
　ＩＪウムの耐性：、Ｚ−Ｓ％生育、５％生育せず（ｒ
ｌ）ＤＮａｓｅ　：陽性 （ｎ）ＤＮＡのＧＣ％ニアｔ、＜Ｉ！ｔ％（ｏ）細胞壁
の王なアミノ酸：　ｍｅｓｏ　−ＤＡＰ以上のことから
、本菌株を山田および駒形：ジャーナル・オブージエネ
ラル・アプライド・ミクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ　）　／　４．　−２ｔ　ｒ、／　ｑ　
７ｏとｉｇ。

３９９−４／６．＜４／７−＜ｔ３１．／９７＋２の論
文を参照し、パージエイズ・マニュアル・オプ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ＳＭ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）　第１版（／９７４年）の分
類で検索した結果、本菌株はコリネバクテリウム・エク
イに類似している。

そして本菌株は、顕微鏡観察の結果、細胞の分裂はスナ
ツピング現象が認められた〔参照：駒形ら：ジャーナル
Φオブ・ジェネラル・アプライド惨ミク０′９イオロジ
−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ａｐｐｌ
ｉｅｄＭｉｃｒｏｂｊｏｌｏｇｙ　）　／　ｊ、＋２　
ａ　、：ｔ、／　ｑ乙９〕。

この細胞の分裂様式を菌体脂肪酸組成のパターレかう見
ると、スナツピングタイプの菌は飽和脂肪酸、−不飽和
脂肪酸および分校脂肪酸（１０−Ｍｅ　−／　９　）が
ある。また典型的なベンゾンゲタイブであるノカルディ
ア属、ミコバクテリウム属の菌体脂肪酸組成には、イソ
−アンチイソ脂肪酸がある。そして本菌株の菌体脂肪酸
を分析した結果、イソ−アンチイソ脂肪酸の存在が認め
られず、スナツピングタイプであるコリネバクテリウム
・エクイＡＴＣＣ６ｑ　３　ｑと脂肪酸組成のパターン
が一致することがわかった（参照：銘木らの発表：日本
農芸化学会昭和！６年度大会講演要旨集ｐ、？＃）０次
に本菌株のメナギノン（ＭＫ）を調べたところ、メナキ
ノン（ＭＫ）が存在していた。そこマ山田ら：ジャーナ
ル・オプ・ジェネラル・アプライド・ミクロバイオロジ
ー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ＡｐＩ）
１ｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　、２．２．　
−２ｏ　３．　／　９７　ｂの論文に準拠して分析を行
ない、計算した結果、ＭＫ−ｇ　（Ｈ２）になり、山田
らのコリネバクテリウム働エクイＡＴＣＣＡ　９３　ｑ
と同じであることがわかった。

これらの点から、本菌株はコリネバクテリウム・エクイ
と類似しているが、以下の点でコリネバクテリウム・エ
クイとは明瞭に異なることを示した０ 即ち、本菌株は生理的性質から見て、グリコール酸陰性
、ＤＮａｓｅ　陽性であり、塩化す）リウムの耐性が弱
いことやＤＮＡのＧＣ％が７／　、４／％で基準法コリ
ネバクテリウム・エクイＡＴＣＣ６ｑ３ｑのＤＮＡのＧ
Ｃ係ｂ７−ｇ％まり１４とひらきがあり、またコリネバ
クテリウム・エクイといわれている菌株の中に、ＤＮＡ
のＧＣ％が６９％以上の値を示すものが現在のところ見
つかっていない〔参照：山田および駒形：ジャーナル・
オブ・ジェネラル・アプライド・ミクロバイオロジー（
Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　）　／　Ａｚ　−２／Ｊ
−。

／９７１！７）０ 以上のことから、本菌株はコリネバクテリウム属に属す
る新菌株と考えられる。そして本菌株は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第７３．２１号（ＦＥＲ
Ｍ　Ｐ　−２ｔｘｔ　）として寄託されている。

つぎに、本発明において基質として用いられるβ−シト
ステロール（カンペステロール含７ｆＫ　）　ハ、微粉
末状として、またはトウイータＣアトラフ社商品名）、
ノニオン（日本油脂社商品名）等のような界面活性剤中
における乳濁液状として、あるいはメタノール、ジメチ
ルホルムアミドおよびジメチルスルホキシド等の水と混
和する有機溶媒中における溶液状として培地に加えるこ
とができる０そして基質であるβ−シトステロール（カ
ンペステロール含有）の濃度は通常０−　／−／　ｏｆ
／、、ｌ！／、好ましくは０．夕〜／！ｊ−／Ｉ）′ｒ
″ある。

つぎに、本発明において、培地の炭素源としては、グル
コース、蔗糖、デキストリン、澱粉、グリセリン等が用
いられる。また培地中の窒素源としては、有機窒素源、
無機窒素源、例えばコーンスチーブリカー、硫酸アンモ
ニウム等が用いられる。−１：た微量の金属塩類、酵母
エキス等を培地に加えることができる。

さらに、培地には、キレート化剤、金−属イオンなどを
加えるのが好ましく、その具体例として、例えばα、α
′−ジピリジル、０−フェナントロリン、ｇ−オギシキ
ノリン、コバルトイオン等が使用出来る。このキレート
化剤もしくは金属イオンの濃度はｌｏ−３〜ｌ０−４モ
ル濃度であるのがよ（、好マシ（は／×／（ｆ３３モル
濃〒ある０なお、このキレート化剤、金属イオンなどは
培養中に培地に加えるのがよい。

培地のＩ）Ｈは乙〜ｇに調整するのが好ましい０培養は
、液体培養で、好気的条件下、好ましくは深部攪拌培養
法または振盪培養法によって行なうことができろ。

培養の温度は、一般に、２０〜３０Ｃの範囲、好ましく
はニア〜３０Ｃの範囲である。

培養日数はβ−シトステロール（カンペステロール含有
）添加後、３〜ｌη日間行なうのが適当である。

培養終了後、培養液中に蓄積した３−オキソ−ｌ、クー
プレグナジェン−２０−カルボン酸は、既知の方法で採
取することができる。例えば培養液を酢酸エチル等の有
機溶媒で抽出し、抽出液から溶媒を留去し、残渣物をシ
リカゲルのカラムに吸着させ、ベンゼン−酢酸エチルの
混合溶媒を用いて３−オキソ−／４−プレグナジェン−
２θ−カルボン酸を分取することが〒きる。

本発明によれば、目的物である３−オキソ−／、ＩＪ−
プレグナジェン−＋２０−カルボン酸が著しく高収率で
生産され、そして副生物が少ない。即ち、本発明によれ
ば、副生物のアンドロスタ−／、＆−ジエンー３，１２
−ジオン、カンベステノン、β−シト−η−エンー３−
オン、ステグマステノンが少量であることから、純粋な
３−オキソ−／、ｇ−プレグナジエンーコθ−カルボン
酸を楽に分取することができる０ 本発明でａすれる３−オキシーｌ、クープレグナシｘ　
７−．２ｏ−カルボン酸は、ｆｌばプレド＝：／ロンな
どのステロイドホルモンを製造スるための中間体として
イ１用である。

つぎに、本発明の実施例を示すが、本発明はこれにより
制限されるものｆはない０ なお、実施例において３−オキソ−７，クープレグナジ
エンーー〇−カルボン酸の定量は、ジアゾメタンでメチ
ル化したものを、また、アンドロスタ−７、クージエン
−３，ノ２−ジオン、β−シト−〃−エンー３−オン、
カンペステノン、スチグマステノンの定量はそのママで
、ガスクロマトグラフィーにて内部標準法（昭和４ｑ年
／／月ｌ夕日広川書店発行、舟板・性用編著「最新ガス
クロマトグラフィー〔工〕」第３０ｇ頁〜第３０９頁参
照）により行なった。

又これら生成物は分取用薄層クロマトグラフィーにより
分離して結晶をとり出し、薄層クロマトグラフィー、ガ
スクロマトグラフィー、紫外吸収スペクトル、ガスクロ
マトグラフィー−直Ｍ　’Ｉｆ　５コ分析、質量分析を
標品と比較して同定した。

実施例　１ コーンスチーブリカー１％、肉エキスｏ−ｓ％、グルコ
ースＯ，ｆ’ｌｙ、Ｋ、ＨＰＯ４０、２％％寒天λ％、
ｐＨ７−，２からなるスラントに３００で一２η時間培
養したコリネバクテリウム３コ０−６＝２−ノ菌〔微工
研菌寄第　７６−２／　号（ＦＥＢＭ　Ｐ　−７ｊ２／
　）］のｌ白金耳量な、コーンスチーブリカー’％ｓ肉
エキス０．夕係、グルコースｏ−、ｐ係、Ｋ２ＨＰＯ４
０、，２％、蒸留水からなる液体培地（ｐＨ７，２）１
００ｍ／ｊを！００ｍ１フラスコに分注し、滅菌した培
地に植菌した。

、２７Ｃ，’１．ｇ［音間コ、！０回転で振盪培養し、
前培養を行なった。前培養液から、２罰を上記液体培地
ｉｏａｍｅからなろオｏｏｍｌフラスコに植菌したＯ、
！７’Ｃ，ｉ、ｘｏ回転で振盪培養し、培養２．２時間
後、β−シトステロール（カンペステロールク０加え、
超音波をかけ分散させたものを／ｍｅ（夕Ｏｍり）添加
し、そのまま振盪培養を続けた。上記のβ−シトステロ
ール（カンペステロール４０％含有）添加後、乙時間目
にα、α′−ジピリジルをｌ×７０−”　Ｍになる様に
添加し、さらに−７Ｃで振盪培養をｌ１日間行なった。

経口的に培養液を７！ｍｌ採取し、酢酸エチルで抽出し
、抽出液をガスクロマトグラフィーにかけ、内部標準法
により生成物を定量した。その結果を第１表に示す０な
お、第１表中、上段の数字はｍｇ　／　ｍｌ、下段の括
弧内の係はモル％である。

実施例　２ コーンスチープリ力−１％、肉エキス０．５％、グルコ
ース０．１敷に２ＨＰ０４０＋＋２％、寒天λ％、ｐＨ
７１，２からなるスラントに３０Ｃ″ｒ、２４時間培養
したコリネバクテリウム３．２０−Ａ゛−２−７菌〔微
工研菌寄第７Ｊ−２／　号（、ＦＥＢＭ　Ｐ　−７３−
２〕　）〕の７白金耳量をコーンスチープリカ−／係、
肉エキス０＋５％、グルコース０．！係、Ｋ２ＨＰＯ，
、０−２０ＩＤ、蒸留水からなる液体培地（ｐＨ７−＋
２）　／　００ｍｌを３　ｏ、　ｏ　ｍＡフラスコに分
注し、滅菌した培地に植菌し１．２７’Ｃ，グｇ時間−
２．２０回転で振盪培養し、前培養を行なった。

この前培養Ｍ、ｇ　Ｏｍｌｊを上記液体培地り！からな
る２！容ジャーファーメンタ−に植菌した。−２７Ｃ′
ｖ−通気攪拌培養（ｑ００回転、空気３！／分）し、培
養、２．２ｆ１３間後、β−シトステロール（カンペス
テロール４０％含有）ｕ？を乳鉢ですりつぶつ した後、蒸留水ηｏｍｌ：、茜−ン（Ｔｗｅｅｎ　）　
ｇ　。

ηｏｏｍｇを加え、超音波をかけ分散させたものを添加
し、そのまま通気攪拌培養を続けた。このβ−シトステ
ロール（カンペステロールＩＩＱ％含有）添加後、ＡＦ
ｆ’５間目にα、α′−ジピリジルを／ｘ／Ｑ’Ｍにな
る様に添加し、さらにＪ７Ｃで通気攪拌培養を３日間行
なった。

培養終了後、培養液を硫酸でｐＨ，２に補正後、酢酸エ
チルク！で一回抽出した。抽出液を減圧下で濃縮し、残
渣、２．／　、９Ａノ得た。この残渣を少量ノ酢酸エチ
ルに溶かし、シリカゲルカラム（和光紬薬製、ワコーゲ
ルｃ−，２ｏｏ　３−ｏｏｇ、カラムサイズＪ’Ｏｎｔ
ｍφ×６０α）にかけ、２０％酢酸エチル−ベンゼンｘ
−ｊｐ、３０％酢酸エチル−ベンゼン、ｘ−ｏ、６．ｔ
ｔｏ％酢酸エチル−ベンゼン３、夕！、酢酸エチル／　
−！Ａで溶出した。酢酸エチル溶出区分を集めて減圧下
でｍ媒を留去し、得うした残渣を再びシリカゲルカラム
（ワコーゲルＣ−＋２００　Ｉｔオノ、カラムサイズ−
２０論φ×ａ　ＯＣｍ）にかけ、７０％酢酸エチル−ベ
ンゼン１−Ｈ１酢酸エチルｏ、３．Ｂで溶出させた。酢
酸エチル溶出区分を集め、溶媒を減圧下で留去し、粗の
３−オキソ−／４−プレグナジェン−２０−カルボン酸
を３−１ｇノ得た。この組物質を酢酸エチルで再結晶を
３回（り返して３−オギソー／、４−プレグナジェン−
＋２０−カルボン酸の無色結晶を９９−７ｍ９得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. β−シトステロール（カンペステロール含有）を基質と
   する培地に、コリネバクテリウム３−〇−６−−−７菌
   を培養することを特徴とする３−オキソ−／、４−プレ
   グナジェン−，２０−カルボン酸の製造法。