JPH0635975B2 - 抗リン脂質抗体結合用担体、それを使用する免疫学的測定法およびキット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、抗リン脂質抗体結合用担体、それを使用する
免疫学的測定法およびその測定法に使用するキット、並
びにこれらの測定法に用いることのできる血清もしくは
血漿から得られる分画物及び蛋白質に関し、特に抗リン
脂質抗体症候群に特異的な自己抗体の測定に関するもの
である。

背景技術 生体内に侵入した病原性ウイルス、細菌、真菌、寄生虫
等の外来性異物に対し、生体は免疫応答を起こし、これ
を排除するように働く。この現象は一般に抗体の関与す
る液性免疫、および直接免疫担当細胞が関与して異物を
排除する細胞性免疫の二種類に大別される。ところが、
自己免疫疾患と総称される病態においては、自己、非自
己の認識機構が正常に働かず、自己の細胞や組織に対し
て液性あるいは細胞性の免疫応答が起こる。自己成分に
対して反応する抗体（自己抗体）が出現する代表的な臨
床例としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）があ
り、血中に抗一本鎖ＤＮＡ抗体、抗二本鎖ＤＮＡ抗体、
抗Ｓｍ抗体、抗カルジオリピン抗体等の出現が認められ
る。また慢性関節リウマチ（ＲＡ）でリウマチ因子が、
シェーグレン症候群（ＳＪＳ）で抗ＳＳ−Ａ抗体、抗Ｓ
Ｓ−Ｂ抗体および抗ミトコンドリア抗体が、全身性強皮
症（ＰＳＳ）で、抗ｓｃｌ抗体および抗一本鎖ＤＮＡ抗
体が、また混合型結合織病（ＭＣＴＤ）で抗ＲＮＰ抗体
が見い出される。現在のところ、これら抗体の出現と病
態の発症意義の関連については不明な点も多いが、抗体
を測定することは病気の診断および予後の病態の変化を
知る上で重要な手段である。

これら種々の自己抗体を検出するため、抗体の抗原特異
性、生化学的特性、および物理化学的性状に応じて、免
疫拡散法、対面免疫電気泳動法、赤血球凝集法、ラジオ
イムノアッセイ法（ＲＩＡ法）、酵素免疫測定法（ＥＩ
Ａ法）およびラテックス凝集法などが開発されている。

ところで、前述の抗カルジオリピン抗体の測定法に関し
ては１９４０年代後半に梅毒の診断（マススクリーニン
グ）用として免疫沈降法が初めて開発された。しかしな
がら、この方法を用いた診断では感度が低いという欠点
の他、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の患者血清
で、高頻度の生物学的偽陽性が出現することが問題とな
っていた。ところが、近年、動脈および静脈の血栓症、
流産、血小板減少症の症状を示すループス様症候群を発
症する若い女性患者の血中に高濃度の抗カルジオリオピ
ン抗体の出現が認められ、抗カルジオリピン抗体を測定
することによってこれらの疾患を診断することの臨床的
意義についても高い評価を受けるに至っている。

このような状況で、ループスコアグランドの非特異的測
定法や生物学的偽陽性が高頻度に認められる抗カルジオ
リピン抗体免疫沈降測定法などの従来の方法に代わる高
感度かつ高精度な測定法に期待が寄せられてきた（Proc
tor,R.R.& Rapaport,S.L.,Am.J.Clin.Pathal.,36,212,
(1961)；Exner,T.et al.,British J.Haematol.,40,143,
(1987)；Margolios,A.,Medicine 40,145(1961)）。そし
て、１９８３年、ハリスら（Harris,E.N.et al.,Lance
t,1211-1214,(1983)）によって抗カルジオリピン抗体測
定用ＲＩＡが開発された。その後もＲＩＡ以外の方法と
して、アルカリホスファターゼ等の酵素をラベルした標
識抗体を用いた非競合法（サンドイッチ法）によるＥＩ
Ａ法が開発されてきている。この種のＥＩＡ法によるカ
ルジオリピン抗体の測定は定量性があり、簡便で、ＳＬ
Ｅ等膠原病患者の診断および経過観察に適している他、
基礎医学の領域では抗カルジオリピン抗体の特異性解析
に用いられている。また近年、膠原病の領域のなかで
も、特に習慣性流産が抗カルジオリピン抗体等の抗リン
脂質抗体の出現に起因する血栓症によるもの（抗リン脂
質抗体症候群）であるとの見方が強まってきており、産
婦人科領域でも抗カルジオリピン抗体の測定に期待が寄
せられている。

血中抗カルジオリピン抗体のサブクラスは、ＩｇＧ、Ｉ
ｇＭ、ＩｇＡなど多様であるが、ＳＬＥ患者血清中には
比較的、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスが出現することが多
い。

また、抗リン脂質抗体症候群に特異的な抗体の各々の特
異抗原と思われるｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ抗体）、ｓ
ｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）、カルジオリピン、ホスファ
チジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどには、
それらのリン酸エステルを中心とする限定された極性部
位に類似の分子構造が存在し、現在、これら抗体の異同
性についても議論の対象となっている。

前述のようにＳＬＥ、習慣性流産等、抗リン脂質抗体症
候群の診断用の測定系として、抗カルジオリピン抗体を
測定するためのＲＩＡ法、ＥＩＡ法が種々の施設で開発
されているが、それらの測定系には、いまだ以下の通り
の問題点が残されている。

すなわち、抗原固相化担体を用いる方法では、ＳＬＥ等
の患者血清を測定に供する場合、適切なブロッキング剤
を用いない限り非特異的吸着によりカルジオリピンに特
異的な抗体の定量が困難なことがある。ブロッキング剤
として通常使用されているウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用
いる場合、ＳＬＥ由来の抗カルジオリピン抗体とその他
の外来性要因（例えば、感染症等）の抗カルジオリピン
抗体との分別定量が不可能であり、このような目的に適
合するブロッキング剤は見いだされていない。

発明の開示 本発明者らは、抗リン脂質抗体症候群に特異的に存在す
る抗リン脂質抗体を選択的に補捉する抗リン脂質抗体結
合用担体および抗リン脂質抗体症候群の特異的な診断法
として実用化し得る抗リン脂質抗体の高精度かつ高感度
な測定法を開発すべく種々の研究を重ねてきた。その結
果、次のような手段で前述の問題点を解消し、本発明を
完成した。

すなわち、本発明は、 （１）リン脂質を結合した担体物質が精製血清アルブミ
ンおよび界面活性剤で処理されていることを特徴とする
抗リン脂質抗体結合用担体、 （２）リン脂質を結合した担体物質が精製血清アルブミ
ン、界面活性剤および血清、血漿、その分画物もしくは
その分画物中の蛋白質で処理されていることを特徴とす
る抗リン脂質抗体結合用担体、 （３）リン脂質が結合した抗リン脂質抗体結合用担体と
被検液とを接触させて抗リン脂質抗体症候群に特異的に
存在する抗体と該担体に結合したリン脂質との免疫複合
体を形成させて該抗体を検出する方法において、抗リン
脂質抗体結合用担体として上記（１）または（２）の担
体を使用することを特徴とする免疫学的測定法。

（４）抗リン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させ
て被検液中の抗リン脂質抗体と担体上のリン脂質との免
疫複合体を形成させる第１の抗原抗体反応（以下、１次
反応ということもある。）工程と、該免疫複合体と標識
抗イムノグロブリン抗体とを反応させて該免疫複合体と
標識抗イムノグロブリン抗体とからなるサンドイッチ状
免疫複合体を形成させる第２の抗原抗体反応（以下、２
次反応ということもある。）工程と、ついで該サンドイ
ッチ状免疫複合体を含む相と担体に結合しなかった物質
を含む相とを分離する分離工程と、いずれかの相の標識
物質（マーカー）を検出する検出工程とからなる方法に
おいて、抗リン脂質抗体結合用担体として上記（１）ま
たは（２）の担体を使用し、かつ少なくとも第１の抗原
抗体反応工程を反応液に被検液と同種もしくは類縁の動
物に由来する血清、血漿、その分画物もしくはその分画
物中の蛋白質を添加して行うことを特徴とする免疫学的
測定法、 （５）抗リン脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させ
て被検液中の抗リン脂質抗体と担体上のリン脂質との免
疫複合体を形成させる第１の抗原抗体反応工程と、該免
疫複合体と標識抗イムノグロブリン抗体とを反応させて
該免疫複合体と標識抗イムノグロブリン抗体とからなる
サンドイッチ状免疫複合体を形成させる第２の抗原抗体
反応工程と、ついで該サンドイッチ状免疫複合体を含む
相と担体に結合しなかった物質を含む相とを分離する分
離工程と、いずれかの相の標識物質（マーカー）を検出
する検出工程とからなる方法において、抗リン脂質抗体
結合用担体がリン脂質を結合した担体物質を界面活性剤
で処理したものであること、および少なくとも第１の抗
原抗体反応工程を反応液に被検液と同種もしくは類縁の
動物に由来する血清、血漿、その分画物もしくはその分
画物中の蛋白質を添加して行うことを特徴とする免疫学
的測定法、 （６）少なくとも下記構成試薬から構成される上記
（４）の免疫学的測定法に使用するキット； （Ａ）上記（１）または（２）の抗リン脂質抗体結合用
担体、 （Ｂ）標識抗イムノグロブリン抗体、 （Ｃ）被検液と同種もしくは類縁の動物に由来する血
清、血漿、その分画物もしくはその分画物中の蛋白質を
添加した検体希釈液、 （７）少なくとも下記構成試薬から構成される上記
（４）の免疫学的測定法に使用するキット； （Ａ′）リン脂質を結合した担体物質が界面活性剤で処
理されている抗リン脂質抗体結合用担体、 （Ｂ）標識抗イムノグロブリン抗体、 （Ｃ）被検液と同種もしくは類縁の動物に由来する血
清、血漿、その分画物もしくはその分画物中の蛋白質を
添加した検体希釈液、 （８）血清もしくは血漿をゲル濾過して得ることができ
る分画物であって、抗リン脂質抗体症候群に特異的に存
在する抗リン脂質抗体とリン脂質との結合性を高める作
用を有する分画物、 （９）血清もしくは血漿から得ることができる分画物で
あって、抗リン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗リ
ン脂質抗体とリン脂質との結合性を高める作用を有し、
且つ以下の理化学的性質を有する分画物： 分画分子量６，０００〜８，０００のセルロース膜を
用いて透析すると非透析画分に含まれる； ゲル濾過またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分画すると血清アルブミンの近傍か、僅か
に低分子側に確認される； プロテインＡと結合しない； ジエチルアミノエチル基を含む弱塩基性陰イオン交換
体によるクロマトグラフィーにおいてＩｇＧ画分の近傍
に溶出される； 及び３０〜６０％飽和硫酸アンモニウムで塩析される
画分に含まれる （10）血清もしくは血漿からえることができる蛋白質で
あって、抗リン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体
とリン脂質との結合性を高める作用を有し、且つ以下の
理化学的性質を有する蛋白質： ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動により測定される
分子量が約５０，０００±２，０００で等電点が約６．
６０±０．４であり； 及びリン脂質に対して結合性を有する、 （11）健常人血清から上記（10）記載の蛋白質を単離精
製するに際し、後述する式〔１〕で表わされるリン脂質
からなるリポソーム、該リン脂質を結合したアフィニテ
ィー吸着剤あるいは該リン脂質を１つの構成成分とする
リポソームを用いて精製する工程を含むことを特徴とす
る上記（10）記載の蛋白質の製造法。

（12）リン脂質が結合した抗リン脂質抗体結合用担体と
被検液とを接触させて抗リン脂質抗体症候群に特異的に
存在する抗体と該担体に結合したリン脂質との免疫複合
体を形成させて該抗体を検出する方法において、該免疫
複合体を形成させる際に、反応液中に高濃度の血清もし
くは血漿を存在させるか、反応液中に上記（８）もしく
は（９）記載の分画物または上記（10）記載の蛋白質を
存在させることを特徴とする免疫学的測定法、 （13）リン脂質が結合した抗リン脂質抗体結合用担体と
被検液とを接触させて抗リン脂質抗体症候群由来の抗リ
ン脂質抗体と感染症由来の抗リン脂質抗体とを分別検出
する方法であって、リン脂質が結合した抗リン脂質抗体
結合用担体と被検液とを接触させる際に、反応液中に高
濃度の血清もしくは血漿を存在させるか、反応液中に上
記（８）もしくは（９）記載の分画物、または上記（1
0）記載の蛋白質を存在させて接触させる方法と、これ
らを存在させないで接触させる方法の両者を実施して、
抗リン脂質抗体症候群由来の抗リン脂質抗体と感染症由
来の抗リン脂質抗体とを分別検出する方法、より具体的
には、 カルジオリピンを結合させた抗カルジオリピン抗体結合
用担体と被検液とを接触させて抗リン脂質抗体症候群由
来の抗カルジオリピン抗体と感染症由来の抗カルジオリ
ピン抗体とを分別検出または分別定量する方法であっ
て、抗カルジオリピン抗体結合用担体と被検液とを接触
させる際、抗カルジオリピン・コファクターを存在させ
て接触させる方法と、抗カルジオリピン・コファクター
を存在させないで接触させる方法の両者を実施して、抗
リン脂質抗体症候群由来の抗カルジオリピン抗体と感染
症由来の抗カルジオリピン抗体とを分別検出または分別
定量する方法、 （14）高濃度の血清もしくは血漿、上記（８）もしくは
（９）の記載の分画物または（10）記載の蛋白質を構成
試薬の１つとして含む、抗リン脂質抗体症候群に特異的
に存在する抗体を測定する免疫学的測定法に使用するキ
ット、及び （15）、構成試薬として抗カルジオリピン・コファクタ
ーおよびカルジオリピンからなる、抗リン脂質抗体症候
群由来の抗カルジオリピン抗体と感染症由来の抗カルジ
オルピン抗体とを分別検出または分別定量する方法を実
施するためのキット、 を要旨とするものである。

図面の簡単な説明 第１図（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ従来法によ
る参考例、本発明の効果を示す比較実験例、本発明方法
の実施例において抗リン脂質症候群由来のＡｓ血清およ
び感染症由来のＹａ血清の抗リン脂質抗体価の指標とし
ての吸光度（４５００ｎｍ）を測定した結果を示すもの
である。

第２図は、第１図（Ｃ）の実施例とは別の方法で作成し
た抗リン脂質抗体結合用担体を用いてＡｓ血清およびＹ
ａ血清の抗体価の指標としての吸光度（４５０ｎｍ）を
測定した結果を示すものである。

第３図は添加した健常人血清の濃度（希釈度）と抗体価
の指標としての吸光度（４５０ｎｍ）の関係を示すもの
である。

第４図は、健常人血清のゲル濾過パターンと、その分画
物を添加して１次反応を行うことによって測定したＡｓ
血清およびＹａ血清の抗体価の指標としての吸光度（４
５０ｎｍ）との関係を示すものである。

第５図は、健常人血清のＨＰＬＣ法によるゲル濾過パタ
ーンと、その分画物を添加して１次反応を行うことによ
って測定したＡｓ血清の抗体価の指標としての吸光度
（４５０ｎｍ）との関係を示すものである。

第６図は、健常人血清のプロテインＡ−セファロースカ
ラムによる分画パターンを示すものである。

第７図は、健常人血清のＤＥＡＥ−セルロースカラムに
よる分画パターンとＡｓ血清の抗体価の指標としての吸
光度（４５０ｎｍ）との関係を示すものである。

第８図は、健常人血清の硫酸アンモニウムによる分画と
Ａｓ血清の抗体価の指標としての吸光度（４５０ｎｍ）
との関係を示すものである。

第９図は、本発明方法によって健常人血清と抗リン脂質
抗体症候群患者血清の抗体価（ユニット：unit／ｍ；
以下Ｕとする）を測定した結果を示すものである。

第１０図は、本発明方法および従来法によって測定した
自己免疫疾患患者血清の抗体価（Ｕ）について、両者の
相関を求めた結果を示すものである。

第１１図は、ＳＬＥ患者血清について本発明方法の希釈
直線性をもとめたものである。

第１２図は、自己免疫疾患患者および感染症（結核性髄
膜炎、梅毒）患者の血清について、本発明方法（網掛
け）と対照方法（白抜き）によって抗体価の指標として
の吸光度（４５０ｎｍ）を測定した結果を示すものであ
る。

第１３図は、１次反応液としてＨＥＰＥＳを含む緩衝液
を使用してＡｓ血清の抗体価の検量線を作成した結果を
示すものである。

第１４図は、健常人血清のＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ
−５２）カラムによるイオン交換クロマトグラフィーの
分画パターンを示すものである。

第１５図は、第１４図に示したイオン交換クロマトグラ
フィーにより得られた抗カルジオリピン・コファクター
活性含有画分をプロテインＡ−セルロースカラムクロマ
トグラフィーに付した時の分画パターンを示すものであ
る。

第１６図は、第１５図に示したクロマトグラフィーによ
り得られた抗カルジオリピン・コファクター活性含有画
分を抗ヒトＩｇＧ抗体−セファロースＣＬ−４Ｂカラム
によるアフィニティーカラムクロマトグラフィーに付し
た時の分画パターンを示すものである。

第１７図は、抗カルジオリピン・コファクターをＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付して得られた結
果を示すものである。

第１８図は、リポソームにより精製した抗カルジオリピ
ン・コファクターをＨＰＬＣに付した時の分離パターン
を示すものであり、矢印で示したピーク部分が抗カルジ
オリピン・コファクターに相当する。

第１９図は、第１６図に示した抗ヒトＩｇＧ抗体−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂカラムによるアフィニティーカラム
クロマトグラフィーにより得られる抗カルジオリピン・
コファクター活性含有画分をＩＳＯＤＡＬＴ電気泳動に
付して得られた結果を示すものである。

第２０図は、ビオチン化抗カルジオリピン・コファクタ
ーのカルジオリピン固相化プレートへの濃度依存的な結
合性を示すグラフである。

第２１図は、抗カルジオリピン・コファクターのリン脂
質に対する結合特異性を示すグラフである。

第２２図は、抗カルジオリピン抗体（Ａｓ抗体）の抗カ
ルジオリピン・コファクター依存性を示すグラフであ
る。

第２３図は、抗カルジオリピン抗体の反応系における抗
カルジオリピン・コファクターの種特異性を示すグラフ
である。

第２４図は、健常人血清のＤＥＡＥ−セルロース・カラ
ムクロマトグラフィーによる分画パターンを示すもので
ある。

第２５図は、健常人血清のヘパリンセファロース・カラ
ムクロマトグラフィーによる分画パターンを示すもので
ある。

第２６図は、健常人血清のカルジオリピン−ポリアクリ
ルアミドゲルカラムクロマトグラフィーによる分画パタ
ーンを示すものである。

第２７図は、精製ウシ血清アルブミンが本発明の免疫測
定法に及ぼす影響を示したものである。

発明を実施するための最良の形態 以下本発明を具体的に説明する。

１．リン脂質 本発明におけるリン脂質は、そのホスホジエステル結合
の近位に電子供与性官能基を有するものであればよく、
特に一般式［Ｉ］ ［式中、Ｒ^１およびＲ^２は同一または異なり、炭素鎖中
にアルキル基もしくはアルケニル基を有するアシル基、
アルキル基またはアルケニル基を示し、Ｒ^３は水素分子
または−（ＣＨ_２）ｎ−ＣＨＲ^４−Ｒ^５を示し、Ｒ^４は
水素原子、水酸基、カルボキシル基、ホルミル基、メル
カプト基もしくはハロゲン原子を示し、Ｒ^５はアミノ
基、ヒドロキシアルキル基もしくは一般式 ［式中、Ｒ^１および^２は前記と同意義。］で表される置
換基を示し、またはＲ^４とＲ^５とで糖もしくは糖アルコ
ール残基を示し、ｎは０ないし３の整数を示す。］で表
されるグリセロリン脂質が好ましい。このグリセロリン
脂質は陰性電荷を有するものであり、このようなグリセ
ロリン脂質として具体的にはカルジオリピン、ホスファ
チジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファ
チジルグリセロールまたはホスファチジン酸が例示され
る。

特にカルジオリピンが好ましい。カルジオリピンは通常
牛などの哺乳動物の心臓、大腸菌などの微生物から調製
されるが、特に哺乳動物の心臓から得られるものが好ま
しい。

これらは、その由来、脂肪酸組成、精製度などには限定
されず、塩型であっても、遊離型であってもよく、担体
物質への結合に際して溶解すべき溶媒も限定されない
が、精製度は試薬級以上のものが好ましい。

２．担体物質 本発明において使用される担体物質としては、リン脂質
を結合することができ、測定に際し、免疫反応（抗原抗
体反応）を阻害しないものであれば特に限定されない
が、ＢＦ分離（免疫反応において免疫複合体を形成した
標識体と遊離の標識体との分離をいう。）が容易に行え
ることを考慮すると、反応液に不溶性の担体物質（固
相）が好ましい。

反応液に不溶性の担体物質の材質としては、例えばポリ
塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼ
ン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイ
ロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポ
リアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメ
タクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラ
ン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セ
ファロース、バイオゲルなど）、セルロースル（ペーパ
ー・ディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリ
カゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物が挙げら
れ、これらはアミノ基、アミノアルキル基、カルボキシ
ル基、アシル基、水酸基などの官能基を導入したもので
あってもよい。なお、担体物質の材質は蛋白質の結合能
の低いものが好ましく、このような材質としては未処理
のポリスチレン、ポリ塩化ビニルが例示される。

反応液に不溶性の担体物質の形状は、平板状（マイクロ
タイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズな
ど）、管状（試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状
（ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状、リポ
ソーム状（多層もしくは単層の脂質膜）などが例示さ
れ、測定法に応じた適宜な形状の担体を選択することが
できる。

３．抗リン脂質抗体結合用担体 本発明における抗リン脂質抗体結合用担体は上記リン脂
質を上記担体物質に結合させたものである。リン脂質と
担体物質との結合法は、物理的吸着法、イオン結合法、
共有結合法、包括法など公知の方法（例えば、「固定化
酵素」（千畑一郎編、昭和５０年３月２０日、（株）講
談社発行）参照）を採用することができる。とりわけ、
物理的吸着法は簡便である点で好ましい。また、リン脂
質と担体物質との結合は、直接行ってもよく、両物質の
間に他の物質を介して行ってもよい。

物理的吸着法によってリン脂質を担体物質に結合させる
には、通常、リン脂質の有機溶媒（メタノール、エタノ
ール、クロロホルムなどリン脂質を溶解できる有機溶
媒）溶液を担体物質と一定時間接触させ、溶液の有機溶
媒を留去する方法を用いることができる。溶媒の留去は
減圧乾燥、通風乾燥などの公知の方法によって行うこと
ができる。また、リン脂質の有機溶媒溶液から溶媒を留
去することによってリン脂質を担体物質以外の物質の表
面に一旦吸着させ、これを緩衝液（例えば、ナトリウム
系、カリウム系またはナトリウム−カリウム系のリン酸
緩衝食塩水）などに懸濁した後、この懸濁液と担体物質
を一定時間（例えば、数十分〜数時間）、反応を阻害し
ない温度条件下（例えば、０〜５０℃）で接触させ、次
いで溶液を吸引、傾寫、遠心分離などの方法によって除
去し、さらに必要に応じて乾燥（減圧乾燥、通風乾燥な
ど）する方法によってリン脂質を担体物質に結合させる
こともできる。

本発明において使用される抗リン脂質抗体結合用担体
は、界面活性剤だけで処理されたもの、精製血清アルブ
ミンと界面活性剤の二種を併用して処理されたもの、ま
たは精製血清アルブミン、界面活性剤および血清、血
漿、その分画物もしくはその分画物中の蛋白質の三種
（以下これらを処理物質ということもある）を併用して
処理されているものが好ましい。尚、反応液中に高濃度
の血清もしくは血漿を存在させて、または本発明で得ら
れる後述する血清もしくは血漿から得られる分画物ある
いは蛋白質を存在させて、抗リン脂質抗体結合用担体に
結合したリン脂質と被検液中の抗リン脂質抗体との免疫
複合体を形成させる抗原抗体反応を行う場合には、必ず
しも上記した本発明の抗リン脂質抗体結合用担体を使用
しなくともよい。ここで「処理」とは、抗リン脂質抗体
結合用担体に対し、これらの処理物質が作用し、物理的
もしくは化学的に結合しうる操作をいう。具体的には、
このような処理は、リン脂質を担体物質に結合させた
後、処理物質を含有する溶液のそれぞれを、順次に（順
番は無関係）、もしくはこれらの物質の二種か三種を含
有する溶液を担体物質と一定時間（例えば、数十分〜数
時間）、反応を阻害しない温度条件下（例えば、０〜５
０℃）で接触させることによって行うことができる。こ
のような処理を行うに際し、これらの処理物質を溶解す
る溶媒は特に限定されないが、通常は緩衝液（ナトリウ
ム系、カリウム系またはナトリウム−カリウム系のリン
酸緩衝生理食塩水など）などが使用される。また、この
ような処理を行う際に処理液に糖類（シュークロースな
どの少糖類、デトストリン、サイクロデキストリン、デ
キストランなどの多糖類、単糖類など）などを共存させ
てもよい。

上記の処理を行った抗リン脂質抗体結合用担体を使用す
ることによって第１の抗原抗体反応（１次反応）工程に
おいて抗リン脂質抗体結合用担体に感染症に由来する抗
リン脂質抗体が結合することを防止できる。なお、この
ような処理を行うことによる他の効果として、非特異的
吸着の防止（担体物質上のリン脂質非結合部分への抗リ
ン脂質抗体、標識抗体の結合防止）、担体物質上のリン
脂質への抗リン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗リ
ン脂質抗体の結合能の増強、担体物質上のリン脂質の安
定化などを挙げることができる。

本発明で使用される精製血清アルブミンとは、牛、馬、
犬、猫、山羊、羊、豚、鶏、兎、ラット、マウス、ヒト
などの動物の血清から公知の方法で精製されたものであ
り、分画Ｖ（コーンの低温エタノール分画法、ヒートシ
ョック法、塩析などによる）よりも精製度の高いもの
で、本発明の目的に適合するものをいう。すなわち、具
体的には、例えば分画Ｖを活性炭処理、クロマトグラフ
ィー（イオン 換クロマトグラフィーなど）、血晶化に
よって精製したもの、あるいは分画Ｖを精製したものと
同等の精製度を有し、他の方法で精製されたものであ
り、特に脂質含量を減少させたものが好ましい。

また、血清、血漿、その分画物もしくはその分画物中の
蛋白質（以下、これらを「本発明血液成分」ということ
もある）とは、動物の血液から公知の方法によって製造
される血清または血漿そのもの、それらを分画して得ら
れる分画物またはその分画物をさらに精製して得られる
蛋白質である。その由来は、測定すべき被検液と同種の
動物であることが好ましいが、類縁の動物に由来するも
のであってもよい。このような本発明血液成分は、後述
する一次反応時に添加するものと本質的に同様のもので
ある。

なお、従来リン脂質を結合した担体を牛胎児血清、牛新
生児血清、、牛血清アルブミン、界面活性剤などで処理
することは行われていたが、このような従来法では抗リ
ン脂質抗体結合用担体に感染症に由来する抗リン脂質抗
体が結合することを防止できなかった。また、従来使用
されていた牛血清アルブミンはコーンの低温エタノール
分画法による分画Ｖなど未精製のものであった。

本発明で使用される界面活性剤には非イオン性、両性、
陰イオン性、陽イオン性のものが包含されるが、とりわ
け非イオン性界面活性剤が好適である。非イオン性界面
活性剤としては、具体的にはポリオキシエチレングリコ
ールソルビタンアルキルエステル類（例えば、トゥイー
ン（Tween）系界面活性剤など）、アシルソルビタン類
（例えば、スパン（Span）系界面活性剤、アラセル（Ar
lacel）系界面活性剤など）、ポリオキシエチレングリ
コールアルキルフェニルエーテル類（例えば、トリトン
（Triton）系界面活性剤など）、しょ糖脂肪酸エステル
類などを例示できる。

なお、本発明の抗リン脂質抗体結合用担体は、免疫学的
測定にだけでなく、抗リン脂質抗体を選択的に吸着除去
または分離精製するための種々の用途に使用できる。例
えば、血漿交換療法において、抗リン脂質抗体の選択的
な吸着体として使用できる（例えば、特開平１−６８２
７３参照）。また、抗リン脂質抗体を分離精製するため
のアフィニティークロマトグラフィー用吸着剤としても
使用できる。

尚、後述の一次反応において本発明血液成分を反応液中
に存在させて反応を行う場合には、これらの処理物質で
処理された担体を使用する代わりに、従来公知のリン脂
質抗体結合用担体を使用することもできる。

４．抗リン脂質抗体症候群 本発明のリン脂質抗体結合用担体を使用する免疫学的測
定は抗リン脂質抗体症候群の診断の目的に使用すること
ができる。ここで抗リン脂質抗体症候群とは自己免疫疾
患（全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、習慣性流産な
ど）のうち、その患者の体液中に抗リン脂質抗体が出現
する疾患をいう。このような疾患は結核性髄膜炎、梅毒
などその体液中に抗リン脂質抗体が出現する感染性の疾
患とは区別される。

本発明の免疫学的測定法は、このような感染性疾患に由
来する抗リン脂質抗体から抗リン脂質抗体症候群に特異
的な抗体を区別して測定できるところに特徴を有するも
のである。

５．免疫学的測定法 本発明の免疫学的測定法とは、抗リン脂質抗体の測定を
目的とし、上記のリン脂質抗体結合用担体及び／又は一
次反応の際に反応液中に本発明血液成分を存在させて反
応を行い、抗原抗体反応に基づく方法であれば、その操
作方法、標識物質（マーカー）、被標識物質、担体、Ｂ
Ｆ分離法などの種類は問わない。免疫学的測定法として
知られている公知の方法から本発明の目的に適合する方
法を適宜選択することができる。

公知の免疫学的測定法としては以下の方法が知られてい
る。

抗原抗体反応の反応様式による分類として、競合反応法
として非競合反応法（イムノメトリックアッセイ）が知
られているが、本発明においては非競合反応法が好まし
い。

検出方法による分類として、抗原抗体反応の結果を直接
検出する非標識法（ネフェロメトリーなど）と、なんら
かのマーカーを使用して検出する標識法が知られている
が、本発明ではいずれの方法によってもよい。測定感度
などを考慮すると、特に標識法が好ましい。なお、標識
法において使用される標識物質（マーカー）については
後に説明する。

ＢＦ分離を行う必要のあるヘテロジニアス法と必要のな
いホモジニアス法が知られており、本発明にはいずれの
方法を適用してもよい。

反応相による分類として、全反応が液相で行われる液相
法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法が知
られているが、本発明においては前記の担体物質として
反応液可溶性の物質を使用する場合が液相法に相当し、
反応液不溶性の物質を使用する場合が固相法に相当す
る。

以上、公知の免疫学的測定と本発明との関係を説明した
が、一般的方法については以下の文献に詳細に記載され
ている。

入江 寛編「続 ラジオイムノアッセイ」（（株）講
談社、昭和５４年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、１９８２年１２月１５日発行） 臨床病理 臨床増刊 特集第５３号「臨床検査のため
のイムノアッセイ −技術と応用−」（臨床病理刊行
会、１９８３年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
１９８６年１０月９日発行） 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70 （Immunochemical techniques(Part A)） 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.73 （Immunochemical techniques(Part B)） 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.74 （Immunochemical techniques(Part C)） 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.84 （Immunochemical techniques(Part D：Selected Immun
oassay)） 「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.92 （Immunochemical techniques(Part E：Monoclonal Ant
ibodies and General Immunoassay Methods)） ［〜はアカデミックプレス社発行］ 以下、本発明の免疫学的測定法を具体的に説明する。

５．１被検液 本発明の免疫学的測定法（以下、本発明方法という場合
もある。）によって抗リン脂質抗体の存在またはその含
有量を測定する対象である被検液とは、ヒトを含む動物
の体液である。ここで体液とは、血液、血清、腹水、リ
ンパ液、関節内液もしくはこれらから得られた分画成
分、またはその他の生体由来の液性成分をいう。

また、被検液を希釈液で適当な抗体価となるように希釈
してもよい。このような希釈液としては、例えばナトリ
ウム系、カリウム系またはナトリウム−カリウム系のリ
ン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、グッドの緩衝液（例え
ば、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−
エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチル−２−アミノエタンスルホン酸（Ｔ
ＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸
（ＭＯＰＳ）などの緩衝剤を含む緩衝液）、グリシン緩
衝食塩水、ベロナール緩衝食塩水などの緩衝液が好まし
い。

５．２第１の抗原抗体反応（１次反応）工程 本発明において「第１の抗原抗体反応工程」とは抗リン
脂質抗体結合用担体と被検液とを接触させて被検液中の
抗リン脂質抗体と担体上のリン脂質との免疫複合体を形
成させる工程をいう。

本発明方法は、前記処理物質を使用して処理されている
抗リン脂質抗体結合用担体を使用し、及び／又はこの工
程において反応液中に被検液と同種もしくは類縁の動物
に由来する血清もしくは血漿を存在させ、あるいはその
分画物あるいは精製されたその分画物中の蛋白質を存在
させて反応を行うことに特徴がある。このような方法を
採用することによって抗リン脂質抗体結合用担体に感染
症に由来する抗リン脂質抗体が結合することを防止で
き、抗リン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体を担
体に特異的に結合させることができる。

この工程は、被検液として抗リン脂質抗体症候群患者の
体液または既知濃度の抗リン脂質抗体を含む標準試薬を
抗リン脂質抗体結合用担体と一定時間（例えば、数十分
〜数時間）、反応を阻害しない温度条件下（例えば、０
〜５０℃）で接触させることによって行うことができ
る。

１次反応の際には前記の精製血清アルブミンを添加して
１次反応を実施することができる。この際に用いる精製
血清アルブミンは５％以下、特に１％以下の濃度で用い
るのが好ましい。

通常は１次反応工程終了後、適当な分離手段によって、
抗リン脂質抗体との免疫複合体を形成した抗リン脂質抗
体結合用担体と、被検液とを分離する。適用できる分離
手段は使用する担体物質の種類に依存するが、応液不溶
性の担体物質を使用する場合は、吸引、傾寫、濾過、遠
心分離など公知の方法によって分離することができる。
分離後、抗リン脂質抗体結合用担体を緩衝液などで洗浄
してもよい。

なお、１次反応工程と後述する２次反応工程を同時に行
ってもよく、または１次反応工程後、被検液を分離する
ことなく、引続き行ってもよい。

５．３分画物及び蛋白質 １次反応工程で使用する「被検液と同種の動物に由来す
る血清、血漿」は、その体液中の抗リン脂質抗体を測定
すべき動物と同種の動物（類縁種も含む）の血液から公
知の方法によって製造されたものであればよい。例え
ば、ヒトの体液を測定対象とする場合にはヒト血清また
はヒト血漿が使用され、特に健常人の血清または血漿が
好適である。また、その分画物とは例えばヒト血清また
はヒト血漿を公知の分離精製法（ゲル濾過（分子ふるい
クロマトグラフィー）；ＤＥＡＥ−セルロースなどを用
いるイオン交換クロマトグラフィー；プロテインＡセフ
ァロース、ペパリンセファロース、カルジオリピン−ポ
リアクリルアミドなどによるアフィニティークロマトグ
ラフィー；カルジオリピン等のリン脂質を含むリポソー
ムによるアフィニティー吸着；透析、限外濾過などによ
る膜分離；電気泳動；溶媒抽出など）によって分画した
ものであって、本発明方法の１次反応工程において、反
応液中に添加することによって、抗リン脂質抗体症候群
に特異的に存在する抗体と担体に結合したリン脂質との
結合性を高める効果を示す画分である。

上記の血清もしくは血漿の分画物としては、例えば、ヒ
ト血清もしくは血漿を、例えばウルトロゲルＡＣＡ−３
４（ＬＫＢ社製）カラムを用いてゲル濾過し、抗リン脂
質抗体症候群の患者血清中に特異的に存在する抗体とリ
ン脂質との結合製を高める作用を示す画分を採取するこ
とによって得られるものが挙げられる。

あるいは、以下に示す理化学的性質を有する分画物が挙
げられる。

分画分子量６，０００〜８，０００のセルロース膜を
用いて透析すると非透析画分に含まれる。

ゲル濾過またはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分画すると血清アルブミンの近傍か、僅か
に低分子側に確認される。

プロテインＡと結合しない。

ジエチルアミノエチル基を含む弱塩基製陰イオン交換
体によるクロマトグラフィーにおいてＩｇＧ画分の近傍
に溶出される。例えば、ＤＥＡＥ−セルロースカラムに
よるクロマトグラフィーにおいて、０．０１４Ｍリン酸
緩衝液（pH７．４）で溶出すると素通りする画分でＩｇ
Ｇ画分の近傍かより僅かに遅れて溶出される。

３０〜６０％飽和硫酸アンモニウムで塩析される画分
に含まれる。

上記の血清、血漿その分画物もしくはその分画物中の下
記の蛋白質の前記した抗原抗体反応液中での濃度は前記
のような本発明の効果が達成できる程度に高濃度であれ
ば特に限定されない。血清もしくは血漿を、例えば血液
から通常の方法によって調製された血清もしくは血漿を
約２００倍に希釈した濃度以上、特に約４０倍に希釈し
た濃度以上（分画物、下記の蛋白質の場合は、血清また
は血漿の上記希釈度に相当する濃度以上）の高濃度に反
応液中に存在させることが好ましい。

高濃度の血清、血漿その分画物もしくはその分画物中の
蛋白質を反応中に存在させることは、抗リン脂質抗体症
候群の患者血清中に特異的に存在する抗体リン脂質との
結合性を高める作用を有し、他方、結核性髄膜炎、梅毒
などの感染症患者血清中に存在する抗リン脂質抗体とリ
ン脂質との反応を抑制する作用を有する。

上記分画物の活性成分である蛋白質は以下のようにして
均質な蛋白質として単離精製することができる。

先ず、健常人の血清もしくは血漿を、例えばＤＥＡＥ−
セルロースなどを用いたイオン交換カラムクロマトグラ
フィーに付し、活性成分を含有する画分を採取する。活
性画分は、抗リン脂質抗体症候群の患者血清中に特異的
に存在する抗体とリン脂質との結合性を高める作用を指
標として採取する。

次いで得られる活性画分をプロテインＡ−セルファロー
スカラムクロマトグラフィーに付して、活性画分に含有
するヒトＩｇＧを取り除く。更に抗ヒトＩｇＧ抗体を例
えば、セファロースＣＬ−４Ｂ樹脂（ファルマシア社
製）に結合して調製したカラムを用いるアフィニティー
カラムクロマトグラフィーに付して、プロテインＡ非吸
着性の人ヒトＩｇＧを取り除く。

尚、上記の各カラムクロマトグラフィーに付した後に得
られる各活性画分は、必要に応じて常法により透析し、
また限外濾過器もしくは飽和硫酸アンモニウムによる塩
析により適宜濃縮してもよい。

次いで、ヒトＩｇＧが取り除かれた精製画分と、リポソ
ームとを接触させて活性成分をリポソームに吸着させて
活性成分を精製する。ここで用いるリポソームは、カル
ジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイ
ノシトール、ホスファチジン酸などの式［Ｉ］で表わさ
れるリン脂質からなるリポソーム、あるいは該リン脂質
を１つの構成成分とするリポソームである。リポソーム
の調製は常法［免疫実験操作法IX，第２９８９−２９９
４頁、昭和５５年１２月４日、日本免疫学会発行］によ
り行うことができる。例えば、カルジオリピンのアルコ
ール溶液を梨型フラスコに取り、減圧乾固し、これに適
当な緩衝液を加えてボルテックスミキサーにより激しく
攪拌してカルジオリピン・リポソームを調製することが
できる。

リポソームを含む緩衝溶液に活性成分を含む画分を加え
て活性成分をリポソームに吸着させ、次いで活性成分が
吸着されたリポソーム懸濁液を遠心分離に付し、得られ
る上清より精製された活性成分が回収される。活性成分
は更にＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーに付して更に
精製してもよい。

かくして得られる精製された活性成分は以下の理化学的
性質を示す。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定さ
れる分子量が約５０，０００±２，０００で等電点が約
６．６０±０．４であり、 リン脂質に対して結合性を有する。

活性成分は、特に陰性電荷をもつカルジオリピンなどの
リン脂質に対して特異的な結合性を示す。また、抗リン
脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体、例えば自己免
疫疾患患者中の抗カルジオリピン抗体と、担体に結合し
たカルジオリピンとは、本活性成分に依存的に反応す
る。

結核性髄膜炎、梅毒などの感染症由来の抗リン脂質抗
体とリン脂質との反応性を抑制する作用を有する。

これらの性質から、担体に結合したカルジオリピンと抗
リン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体とを含有す
る反応系に上記活性成分を添加した場合には、先ず、活
性成分と担体に結合したカルジオリピンとが反応して複
合体を形成し、これに抗リン脂質抗体症候群に特異的な
抗体が結合するものと考えられる。

また、上記及びの性質を有することから、後述する
如く、本活性成分を用いて抗リン脂質抗体症候群由来の
抗リン脂質抗体と感染症由来の抗リン脂質抗体とを分別
検出することができる。尚、高濃度の血清もしくは血
漿、あるいはその分画物を反応液中に存在させても同様
に分別検出することができる。

なお、本明細書においては、上記〜の理化学的性質
を有する蛋白質を抗カルジオリピン・コファクターと称
する。

本発明で得られる上記の活性成分蛋白質（抗カルジオリ
ピン・コファクター）を、前記した第１の抗原抗体反応
の際に添加することにより、抗リン脂質抗体症候群に特
異的に存在する抗体を、選択的に検出することが可能と
なる。

５．４第２の抗原抗体反応（２次反応）工程 本発明において「第２の抗原抗体反応工程」とは、１次
反応工程で形成された免疫複合体と標識抗イムノグロブ
リン抗体とを反応させて該免疫複合体と標識抗イムノグ
ロブリン抗体とからなるサンドイッチ状免疫複合体を形
成させる工程をいう。

この工程で使用される標識抗イムノグロブリン抗体は、
抗イムノグロブリン抗体が後で説明する検出工程の検出
方法に対応する適当なマーカーで標識されたものであ
る。

ここで使用される抗イムノグロブリン抗体とは、測定す
べき抗リン脂質抗体と結合できる抗体またはそのフラグ
メントであれば、その由来、製法には特に限定されな
い。

通常、体液中の抗リン脂質抗体のサブクラスはＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡなどであるので、抗イムノグロブリン抗
体は抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体、抗ＩｇＡ抗体などか
ら目的に応じて適宜に選択し得る。また、測定すべき抗
リン脂質抗体がヒト由来のものである場合は、抗ヒトイ
ムノグロブリン抗体が使用されることはいうまでもな
い。

このような抗イムノグロブリン抗体の調製は、測定すべ
き抗リン脂質抗体を産生する動物と同一種の動物由来の
イムノグロブリンを他の動物に投与して免疫し、その動
物の血清から分離精製する方法、またはその動物の抗体
産生細胞（脾細胞、リンパ節細胞、末梢血リンパ球な
ど）をハイブリドーマ法、トランスフォーメーション法
（ＥＢウイルスなどによる）など公知の方法（例えば、
Eur.J.Immunol.,6,511(1976)など参照）で半永久的に増
殖可能とし、この細胞をin vitro（試験管内）もしくは
in vivo（生体内）で増殖させた培養物から分離精製す
る方法によって行うことができる。これらの抗イムノグ
ロブリン抗体は市販されており、本発明方法にはこのよ
うな当業者が容易に入手できる抗体を使用することがで
きる。

また、抗イムノグロブリン抗体は抗体分子をそのまま使
用してもよく、蛋白分解酵素（例えば、パパイン、ペプ
シンなど）などで分解して抗体フラグメント（Ｆ（ａ
ｂ′）_２，Ｆａｂ′など）として使用してもよい。

抗イムノグロブリン抗体を標識する標識物質（マーカ
ー）は、検出工程に対応するものであれば特に限定され
ない。例えば、放射性同位元素（¹²³I、¹³¹I、³H、¹⁴C
など）、酵素（ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、グルコース−６−リン
酸デヒドロゲナーゼ、リゾチーム、グルコアミラーゼ、
アセチルコリンエステラーゼ、マレイン酸デヒドロゲナ
ーゼなど）、その他の生体内リガンド・レセプター（ビ
オチン、アビジン、ストレプトアビジンなど）、補酵素
・補欠分子族（ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰなど）、蛍光物
質（フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、
ユーロピウム、フィコエリトリンなど）、発光物質（ル
ミノール誘導体など）、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）用マ
ーカー物質（ピペリジン−１−Ｎ−オキシル化合物、ピ
ロリジン−１−Ｎ−オキシル化合物など）、リポソーム
（酵素、蛍光物質、発光物質などの標識物質を含有す
る）など公知のマーカーで標識することができる（前記
文献、、参照）。

抗イムノグロブリン抗体をこれらのマーカーで標識する
方法も公知技術によって行うことができる。例えば、放
射性同位元素をマーカーとして使用する場合には、クロ
ラミンＴ法、ラクトペルオキシダーゼなどを用いる酵素
法、ボルトン−ハンター（Bolton-Hunter）法などによ
って行うことがでる（前記文献参照）。また、例えば
酵素をマーカーとして標識する場合は、マレイミド架橋
法（例えば、サクシミジル ６−マレイミドヘキサノエ
ート（ＥＭＣＳ）を使用する。）、グルタルアルデヒド
架橋法、過ヨウ素酸架橋法（中根法）、イソシアネート
架橋法（例えば、イソシアネート類（トルエンジイソシ
アネートなど）、イソチオシアネート類を使用す
る。）、ベンゾキノン架橋法によって行うことができる
（前記文献、参照）。

この２次反応工程を１次反応工程と分離して行う場合、
１次反応工程によって得られた免疫複合体が結合した抗
リン脂質抗体結合用担体と標識抗イムノグロブリン抗体
を含有する溶液（緩衝液などの溶液）とを一定時間（例
えば、数十分〜数時間）、反応を阻害しない温度条件下
（例えば、０〜５０℃）で接触させることによって反応
を行うことができる。

また、１次反応工程と同時、または反応液を分離するこ
となく引続き反応を行う場合には、１次反応を行うと
き、または反応終了後、反応液中に標識抗イムノグロブ
リン抗体を存在させればよい。

５．５ＢＦ分離工程 本発明方法のＢＦ分離工程は、２次反応工程において形
成されたサンドイッチ状免疫複合体を含む相と担体に結
合しなかった物質を含む相とを分離する分離工程であ
る。

本発明方法をホモジニアス法で行う場合はこの工程は必
要ないが、ヘテロジニアス法で行う場合は必須の工程で
ある。

この工程は、反応液不溶性の担体物質を使用する場合
は、吸引、傾寫、濾過、遠心分離など公知の分離手段に
よって行うことができる。

上記の分離操作後、または同時に緩衝液（ＰＢＳなど）
で担体を洗浄してもよい。

５．６検出工程 本発明方法の「検出工程」とは、ヘテロジニアス法の場
合上記ＢＦ分離工程において分離されたサンドイッチ状
免疫複合体に含まれる標識抗イムノグロブリン抗体の、
または該複合体を形成しなかった標識抗イムノグロブリ
ン抗体の標識物質（マーカー）を検出する工程をいう。
この検出は定量的であっても、定性的であってもよい。

検出工程は、使用するマーカーに対応するものであれば
よく、公知の方法によって行える（前記文献〜参
照）。例えば、放射性同位元素をマーカーとして用いた
場合にはシンチレーションカウンターによって、酵素を
マーカーとして用いた場合には使用する酵素の活性測定
に使用される公知に方法によって検出を行うことができ
る。

以下、ペルオキシダーゼをマーカーとして用いた場合の
酵素活性の測定について説明する。

ペルオキシダーゼ活性の測定は、基質である過酸化水素
が水に分解される際の電子の授受を検出する各種の方法
で行うことができる。すなわち、例えば色原体（Chromo
gen）の酸化に基づく吸光度の変化の測定、酸化還元電
位の変化の電極による測定など公知の方法を利用するこ
とができる。特に、色原体を使用する方法が一般的であ
る。色原体としては、例えばテトラアルキルベンジジン
（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭ
ＢＺ）など）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、
２，２′−アジノジ（３−エチル）ベンゾチアゾリノン
−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）、ジアニシジン、ジカル
ボキシジン、ジアミノベンジジンなど公知の物質を使用
することができる（例えば、特公表昭６２−５０２６５
３（ＷＯ８６／０４６１０）参照）。

ペルオキシダーゼ活性の色原体を使用する測定は、ＢＦ
分離によって分離されたいずれかの相に過酸化水素およ
び色原体を含有する溶液（好ましくは、緩衝液（クエン
酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ＰＢＳなど）の溶液）を添加
して一定時間（例えば、数分〜数時間）、常温下（例え
ば、室温下）で反応し、酸素反応停止液（例えば、硫
酸）によって反応を停止した後、吸光度（ＴＭＢＺの場
合は４５０ｎｍにおける吸光度）を測定することによっ
て行うことができる。なお、被検液中の抗リン脂質抗体
の定量は、既知濃度の抗リン脂質抗体を含有し、例えば
被検液と同種もくしは類縁の動物に由来する血清、血漿
その分画物もしくはその分画物中の蛋白質（抗カルジオ
リピン・コファクター）を添加した標準試薬を使用して
測定した標準曲線（吸光度と抗体濃度（または抗体価）
との関係を示す。）と、測定された吸光度を比較するこ
とによって行うことができる。

５．１分別検出 反応液中に高濃度の血清もしくは血漿、その分画物、あ
るいはその分画物中の活性成分である蛋白質（抗カルジ
オリピン・コファクター）を存在させて抗リン脂質抗体
症候群由来の抗リン脂質抗体と感染症由来の抗リン脂質
抗体とは分別検出は以下のようにして行なうことができ
る。

即ち、前記した抗原抗体反応（１次反応）工程におい
て、高濃度の血清もしくは血漿、その分画物、あるいは
蛋白質（抗カルジオリピン・コファクター）を存在させ
て１次反応を実施する系と、これらを存在させないで１
次反応を実施する系の両者を実施する。そしてこれらの
本発明血液成分（抗カルジオリピン・コファクター）を
存在させることによって抗リン脂質抗体と担体に固定化
されたリン脂質との反応性が依存的に増強した場合に
は、抗リン脂質抗体症候群由来の抗リン脂質抗体と判断
できる。これらの本発明血液成分（抗カルジオリピン・
コファクター）を存在させることによって依存的に反応
性が減少した場合には、感染症由来の抗リン脂質抗体と
判断できる。

６．キット ６．１キット（６） 上記（４）の本発明方法に使用される免疫学的測定法用
キット（６）は少なくとも前記（Ａ）〜（Ｃ）の構成試
薬から構成される。

構成試薬（Ａ）の「抗リン脂質抗体結合用担体」は、前
記「３．抗リン脂質抗体結合用担体」で説明したものの
うち、精製血清アルブミンと界面活性剤の二種を併用し
て処理されたもの、または精製血清アルブミン、界面活
性剤および被検液と同種もしくは類縁の動物に由来する
血清、血漿、その分画物もしくはその分画物中の蛋白質
（抗カルジオリピン・コファクター）の三種を併用して
処理されたものが使用される。構成試薬（Ｂ）の「標識
抗イムノグロブリン抗体」は、前記「５．３第２の抗原
抗体反応（２次反応）工程」で説明したものが使用され
る。構成試薬（Ｃ）の「被検液と同種の動物に由来する
血清、血漿もしくはその分画物を添加した検体希釈液」
は測定すべき被検液もしくは標準試薬を必要に応じて希
釈するためのものであり、上記と同様の理由で本発明血
液成分（抗カルジオリピン・コファクター）が添加され
ている。

本発明のキット（６）には上記構成試薬の他に、必要に
応じて標準試薬、あるいは標識物質を検出するための試
薬を添付することができる。標準試薬としては、既知濃
度の抗リン脂質抗体を含み、必要に応じ本発明血液成分
（抗カルジオリピンコファクター）を添加した標準試薬
が例示される。これは、通常抗リン脂質抗体症候群の患
者から分離された抗リン脂質抗体を必要に応じて段階希
釈したもので、前記「５．２第１の抗原抗体反応（１次
反応）工程」に説明した理由により、本発明血液成分
（抗カルジオリピン・コファクター）を添加したもので
ある。標識物質を検出するための試薬としては例えば、
キットが酵素免疫学的測定法用のキットである場合には
必要に応じて酵素活性を測定するための試薬、すなわち
酵素の基質とその反応のインディケータ（例えば、前記
「５．５検出工程」の色原体）を添付することが好まし
い。また、酵素反応停止液（例えば、硫酸を含む溶液）
を添付してもよい。

６．２キット（７） 上記（５）の本発明方法に使用される免疫学的測定法用
キット（７）少なくとも前記（Ａ′）〜（Ｃ）の構成試
薬から構成される。必要に応じてキット（６）と同様
に、標準試薬、標識物質を検出するための試薬を添付す
ることができる。

構成試薬（Ａ′）は前記「３．抗リン脂質抗体結合用担
体」で説明した抗リン脂質抗体結合用担体のうち、界面
活性剤だけで処理されたものである。その他の構成試薬
は上記６．１と同様の試薬である。

６．３キット（１４） 上記（１２）の免疫学的測定法用に使用するキットは、
その構成試薬の１つとして、高濃度の血清もしくは血
漿、あるいは上記した分画物またはその分画物中の（抗
カルジオリピン・コファクター）蛋白質を含む。他の構
成試薬は従来用いられているいずれの抗リン脂質抗体結
合用担体でもよく、勿論、上記した本発明の抗リン脂質
抗体結合用担体でもよい。また他の構成試薬も通常使用
される試薬をそのまま用いることができる。

〔実施例〕

以下、参考例および実施例を示し、本発明をより具体的
に説明する。

参考例 従来法による一般的な操作法とそれによる測定例を以下
に示す。

牛（ウシ）心臓由来のカルジオリピン（シグマ社製）５
０μg/mlのエタノール溶液を５μｌ／ウェルずつ９６ウ
ェルマイクロタイタープレート（ポリスチレン；タイタ
ーテック社製）の各ウェルに入れ、ウェル中のエタノー
ルを減圧乾燥によって乾燥した。乾燥後、１０％ウシ胎
児血清含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（以下、Ｐ
ＢＳ−ＦＢＳと略す。）（pH７．４）を２５０μｌ／ウ
ェル加え、室温で１時間ブロッキングした後、全ウェル
を２５０μｌの０．０５％（Ｖ／Ｖ）トゥイーン２０
（Tween20，商品名，キシダ化学（株）製）含有ＰＢＳ
（以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎと略す。）で３回洗浄し
た。次に被検液（血清）のＰＢＳ−ＦＢＳによる適宜希
釈液を１００μｌずつウェルに入れ、室温で１時間反応
させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２５０μｌで５回洗浄した。
西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１
００μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間反応させ、
ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。基質溶液（0.003
％過酸化水素水を含む０．３ｍＭ ３，３′，５，５′
−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）溶液）１００μ
ｌを加え、室温で１５分反応させた後、反応停止液（２
Ｎ硫酸）１００μｌを反応液に加え、吸光度（450nm）
を測定した。その結果を第１図（Ａ）に示す。なお、使
用した酵素標識抗体は過ヨウ素酸架橋法で西洋ワサビペ
ルオキシダーゼとマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗
体（Ｇ−０２，ＩｇＧクラス；ヤマサ醤油（株）製）を
結合したものである。なお、ここで用いた被検液Ａｓ血
清は典型的な抗リン脂質抗体症候群（ＳＬＥで習慣性流
産）の患者血清（以下、Ａｓ血清という。）で、被検液
Ｙａ血清は全く抗リン脂質抗体症候群の兆候のない結核
性髄膜炎患者の血清である（以下、Ｙａ血清とい
う。）。１次反応においてウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用
いる従来法では第１図（Ａ）のとおりＹａ血清中の抗体
（以下、Ｙａ抗体という。）とＡｓ血清中の抗体（以
下、Ａｓ抗体という。）を分別定量することは不可能で
あった。

実施例１健常人血清添加による抗リン脂質抗体症候群特
異的抗体の検出 （１）抗リン脂質抗体結合用担体の作成 抗リン脂質抗体結合用担体は以下の２種類の方法を用い
て作成した。

［方法（Ｉ）］ ウシ心臓由来のカルジオリピン（シグマ社製）５０μg/
mlのエタノール溶液を５μｌ／ウェルずつ９６ウェルマ
イクロタイタープレート（ポリスチレン；タイターテッ
ク社製）の各ウェルに入れ、ウェル中のエタノールを減
圧乾燥によって乾燥した。次いで、１％（Ｗ／Ｖ）精製
牛（ウシ）血清アルブミン（シグマ社製；No.8511,Fatt
y acid-free；以下、ｐＢＳＡと略す。）を含有するＰ
ＢＳ（pH７．４）（以下、ＰＢＳ−ｐＢＳＡと略す。）
２５０μｌを入れ、４℃で１時間処理し、0.05％（Ｖ／
Ｖ）トゥイーン２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）
２５０μｌで３回洗浄して本発明の抗リン脂質抗体結合
用担体を得た。

［方法（II）］ ウシ心臓由来のカルジオリピン（シグマ社製）５００μ
g/mlのエタノール溶液をガラス試験管に入れ、減圧下で
乾燥した後、ＰＢＳを加え、カルジオリピンを懸濁させ
た。このカルジオリピン懸濁液を５０μｌ／ウェルずつ
９６ウェルマイクロタイタープレート（ポリスチレン；
タイターテック社製）の各ウェルに入れ、４℃で１時間
反応させ、懸濁液を吸引除去した。以後は方法（Ｉ）と
同様の操作で本発明の抗リン脂質抗体結合用担体を得
た。

（２）抗リン脂質抗体の測定 参考例で使用したものと同じ患者血清（Ａｓ血清およひ
Ｙａ血清）のそれぞれに健常人血清５％を添加し、ＰＢ
Ｓ−ｐＢＳＡで希釈した。この希釈液をそれぞれ１００
μｌずつ、方法（Ｉ）および方法（II）で作成したカル
ジオリピン結合タイタープレートに添加し、４℃で１時
間反応させ、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２５０μｌで５回洗浄
した。以後の反応は参考例と同様の操作を行って吸光度
を測定した（本発明方法）。なお、方法（Ｉ）で作成し
たプレートについては１次反応においてｐＢＳＡを添加
して反応を行った他は上記と同様に操作し、吸光度測定
した（比較実験）。それぞれの方法によって得られた結
果を希釈曲線として示した。第１図（Ｂ）は比較実験の
結果を、第１図（Ｃ）は方法（Ｉ）で作成したプレート
について行った本発明方法の結果を、第２図は方法（I
I）で得られたプレートについて行った本発明方法の結
果をそれぞれ示す。

第１図（Ｂ）から明らかなように本発明によるカルジオ
リピン結合プレートを使用し、参考例の１次反応系に用
いているウシ胎児血清（ＦＢＳ）を市販の精製ウシ血清
アルブミン（ｐＢＳＡ）に置き換えること（比較実験）
で、Ｙａ血清中の抗カルジオリピン抗体（Ｙａ抗体）の
結合性が有意（２０％程度まで）に低下した。Ａｓ抗体
に関しても希釈度の高い検体（つまり、２００倍以上の
希釈液）で結合活性の消失が認められた。ｐＢＳＡを１
次反応において添加した比較実験の基本測定系に更に健
常人血清（５％程度）を加えることでＡｓ抗体価だけが
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いた従来法（参考例）と同
程度にまで回復し、Ｙａ抗体価に関しては完全に消失し
た。

なお、一次反応において添加する健常人血清の濃度を変
化させて上記と同様に反応を行い、Ａｓ血清の抗体価を
測定したところ、特に希釈度１／４０以上の高濃度に健
常人血清を添加した際に十分な吸光度が得られた（第３
図）。なお、測定したサンプルは、２４ユニット（２４
Ｕ）と１２ユニット（１２Ｕ）（ハリスらのユニットに
よる）のＡｓ血清である。

実施例２健常人血清分画添加による抗リン脂質抗体症候
群特異的抗体の検出 健常人血清をゲル濾過によって分画し、その各画分を１
次反応の反応液に添加した。カルジオリピン結合プレー
トは実施例１の方法（Ｉ）で作成したものを使用し、健
常人血清をそのゲル濾過による画分に代えた他は実施例
１と同様の操作で抗体価の指標としての吸光度（450n
m）を測定した。健常人血清の分画は、ＰＢＳ（pH７．
４）であらかじめ平衡化したウルトロゲルＡＣＡ−３４
（ＬＫＢ社製）カラム（２．０×５５cm）で３mlの健常
人血清をゲル濾過し、２mlずつ分取することによって行
った。第４図にウルトロゲルＡＣＡ−３４によるゲル濾
過のパターンとＡｓ血清およびＹａ血清の上記方法によ
って得られた抗体価の指標としての吸光度（450nm）と
の関係を示す。その結果、第４図の３本の２８０ｎｍの
吸収ピークのうち２番目に出現するピークの画分にＡｓ
抗体の結合性を高め、Ｙａ抗体の結合を消失せさる効果
を有する成分（以下、本活性成分（抗カルジオリピン・
コファクター）ということもある。）が存在することが
確認された。この画分には血清アルブミンも含まれる
が、精製ヒト血清アルブミン自身にはそれらの活性（効
果）は認められなかったことから血清アルブミンによる
効果ではないことが確認された。

また、健常人血清をＧ２０００ＳＷ（東ソー（株）製）
カラム（０．７５×３０cm）を用いたＨＰＬＣ法による
ゲル濾過で分画したところ、本活性成分を含有する画分
（活性ピーク）は血清アルブミン画分付近に出現し、僅
かに低分子側に溶出された（第５図）。

次に健常人血清を１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH９．０）
で透析した後、プロテインＡ−セファロース（ファルマ
シア社製）カラムに通し、素通り画分（非ＩｇＧ画分）
および０．１Ｍクエン酸緩衝液（pH３．０）で溶出する
画分（ＩｇＧ画分）を調製した。第６図に、その溶出パ
ターンを示す。また、各画分をＰＢＳで透析した後、そ
の１／２０血清濃度相当量をＡｓ血清（２４Ｕ）に添加
し、方法（Ｉ）で作成したプレートを用いて実施例１と
同様の方法で抗体価の指標としての吸光度（450nm）を
測定した。その結果を第１表に示す。

なお、表における数値は４５０ｎｍにおける吸光度を表
す。また、括弧中の数値はＡｓ血清を含まない検体につ
いて測定した結果を示す（対照試験）。

第１表に示すとおり、本活性成分は非ＩｇＧ画分に存在
する。

さらに、健常人血清を、ＤＥＡＥ−セルロース（ワット
マン社製、ＤＥ−５２）に通したところ、本活性成分
は、０．０１４Ｍリン酸緩衝液（pH７．４）で溶出され
る素通り画分に現れ（第７図）、また硫酸アンモニウム
を用いて塩析したところ、本活性成分は３０〜６０％飽
和濃度で沈澱した（第８図）。

なお、Ａｓ抗体の結合を高める効果は、上記成分と固相
化カルジオリピン・ミセルとの相互作用によって現れ、
Ｙａ抗体の結合を消失させる効果は液相中で因子が抗体
と反応し吸収されることによると考えられる。

実施例３界面活性剤処理抗原結合担体による抗リン脂質
抗体症候群特異的抗体の検出 基本的には実施例１（１）の方法（Ｉ）および方法（I
I）に準じてトゥイーン２０だけによって処理された抗
リン脂質抗体結合用担体を使用し、本発明方法の効果を
調べた。

すなわち、方法（Ｉ）に従ってウシ心臓カルジオリピン
を９６ウェルマイクロタイタープレーの各ウェルに結合
させた。このウェルを０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで
洗浄し、実施例１と同様に１次反応の反応液に健常人血
清を添加し（実験Ｉ−１）、または無添加で（実験Ｉ−
２）反応させ、以後は実施例１と同様に操作し、抗体価
の指標としての吸光度（450nm）を測定した。また、同
一の方法でカルジオリピンを結合させたウェルを、トゥ
イーン２０を含まないＰＢＳで洗浄し、１次反応の反応
液に健常人ヒト血清を添加し（比較Ｉ−１）、または無
添加で（比較Ｉ−２）反応させ、以後は実施例１と同様
に操作し、抗体価の指標としての吸光度（450nm）を測
定した。なお、１次反応工程後および２次反応工程後の
洗浄は、それぞれの実験区とも上記の洗浄液にそれぞれ
対応するものを使用した。

また、試験管中に乾固したカルジオリピンを０．０１％
ＢＳＡを含有するＰＢＳ（pH６．０）で懸濁する他は前
記方法（II）と同様の操作でウシ心臓カルジオリピンを
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに結合
させた。このウェルを０．０５％ｐＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ
で洗浄し、実施例１と同様に１次反応の反応液に健常人
ヒト血清を添加し（実験II−１）、または無添加で（実
験II−２）反応させ、以後は実施例１と同様に操作し、
抗体価の指標としての吸光度（450nm）を測定した。ま
た、同一の方法でカルジオリピンを結合させたウェル
を、トゥイーン２０を含まないＰＢＳで洗浄し、１次反
応の反応液に健常人血清を添加し（比較II−１）、また
は無添加で（比較II−２）反応させ、以後は実施例１と
同様に操作し、抗体価の指標としての吸光度（450nm）
を測定した。なお、１次反応工程後および２次反応工程
後の洗浄とは、それぞれの実験区ともトゥイーン２０を
含まないＰＢＳを使用した。

また、上記の実験はいずれも被検液として、Ａｓ血清お
よびＹａ血清を使用した。なお、これらの血清は、ハリ
ス（Harris,E.N.）らによって第３回キングストン抗リ
ン脂質抗体シンポジウム（ＫＡＰＳ）で提唱された抗リ
ン脂質抗体価が一定となるように希釈されたものであ
る。

これらの実験の結果を第２表に示す。

なお、表における数値は４５０ｎｍにおける吸光度を表
す。また、括弧中の数値はカルジオリピンを結合してい
ない担体を使用して測定した値である（対照試験）。

第２表に示すとおり、トゥイーン２０による洗浄処理で
カルジオリピンの抗原性発現が起こり、固相化カルジオ
リピンへのＡｓ抗体の結合性が増強されると共に免疫グ
ロブリンの非特異的なプレートへの吸着が抑えられる。
方法（Ｉ）によって作製された抗リン脂質抗体結合用担
体においては物理吸着したカルジオリピンがトゥイーン
２０のミセルにリピッドトランスファーすると考えら
れ、“界面活性剤−リン脂質・ミセル”の形成がカルジ
オリピンの抗原性を有する三次元構造をプレート表面に
発現させるために必須であり、またトゥイーン２０のミ
セル自身に免疫グロブリンの非特異的吸着を抑える作用
がある。“界面活性剤−リン脂質・ミセル”の固相化は
方法（Ｉ）のみならず方法（II）でも可能である。この
方法（II）は、最初にカルジオリピンのミセルを緩衝液
中で形成させた後、プレート中でインキュベーション
し、ミセルの脂質二重膜を介してカルジオリピンをプレ
ート表面に吸着させ、その後トゥイーン２０による洗浄
を行うという方法である。

実施例４ｐＢＳＡ処理によるカルジオリピン抗原性発現
維持の効果 上記方法（Ｉ）と同様の方法で作成したカルジオリピン
結合プレートを使用し、このプレートをｐＢＳＡで処理
した場合（本発明）と、未処理の場合（比較例）につい
て、プレートを処理するためのトゥイーン２０の添加濃
度を変えて、抗カルジオリピン抗体抗体価の指標として
の吸光度（450nm）を測定した。この結果を第３表に示
す。

なお、界面活性剤による処理は、各濃度のトゥイーン２
０を含有するＰＢＳ（pH７．４）を使用して行った。測
定したサンプルは、２４ユニット（２４Ｕ）と１２ユニ
ット（１２Ｕ）（ハリスらのユニットによる）のＡｓ血
清である。

第３表から明らかなようにトゥイーン２０の抗原性発現
の作用は、ｐＢＳＡによる処理の有無にかかわらず現わ
れた。ところが、カルジオリピンの抗原性発現は１％ｐ
ＢＳＡでの４℃、１時間の処理で有無に促進されてい
た。つまり、方法（Ｉ）でカルジオリピンのエタノール
溶液の乾固の処理の後、抗原性を有する生理的な３次元
コンフォメーションを形成させるには、トゥイーン処理
のみならずＢＳＡ処理でも起こること、さらにその両者
併用で抗原性発現が促進され、また安定性が高まり、抗
体の非特異的吸着の防止という、いわゆる“ブロッキン
グの促進効果”も得られる。

実施例５各種界面活性剤の効果 実施例４の本発明方法と同様の方法においてプレートを
処理するための界面活性剤の種類を変えてＡｓ血清（２
４Ｕ）の抗体価の指標としての吸光度（450nm）を測定
した。その結果を第４表に示す。なお、各界面活性剤は
０．０５％溶液を使用した。

第４表から明らかなように、トゥイーン２０とは疎水基
部分の長さの異なる界面活性剤でもトゥイーン２０と同
様の効果が得られた。

実施例６ヒト血清、ｐＢＳＡおよび界面活性剤を併用し
て処理された担体による抗リン脂質症候群特異的抗体の
検出 実施例１（１）の方法において、１％ｐＢＳＡを含有す
るＰＢＳによる処理に代えてカルジオリピン結合プレー
トを、５％健常人血清および１％（Ｗ／Ｖ）ｐＢＳＡを
含むＰＢＳで処理したほかは実施例１の方法（１）と同
様にして本発明の抗リン脂質抗体結合用担体を得た。

上記の担体（本発明）および実施例１の方法（１）で得
られた担体（対照）を使用し、一次反応の反応液に健常
人血清を含まない１％のＰＢＳ−ＢＳＡを使用したほか
は実施例１と同様の方法でＡｓ血清の抗体価の指標とし
ての吸光度（450nm）を測定した。その結果を第５表に
示す。

第５表から明らかなように、抗リン脂質抗体結合用担体
を健常人血清、ｐＢＳＡおよび界面活性剤を併用して処
理した際には１次反応においてヒト血清を添加しない場
合でもヒト血清を添加したときと同様の効果が得られ
た。

実施例７抗リン脂質抗体症候群患者血清の測定 実施例１の方法（Ｉ）によって作成された抗リン脂質抗
体結合用担体を使用し、実施例１と同様の方法で健常人
血清検体およびＳＬＥ患者（生産群および流産群）血清
検体の抗カルジオリピン抗体価（ユニット；unit(U)）
を測定した。その結果を第９図に示す。第９図に示され
るとおり、ＳＬＥ患者血清中の抗カルジオリピン抗体価
の指標としての吸光度（450nm）は健常人血清群に比
し、有意に高値を示した。さらに習慣性流産群において
は生産群（出産に成功した群）に比べ有意に高い抗体価
を示した。

また、ＳＬＥ患者血清を含む自己免疫疾患患者血清２４
８例について１次反応にウシ胎児血清を用いる従来法
（参考例の方法）および上記の本発明方法によって抗カ
ルジオリピン抗体価測定し、両者の相関をもとめ、結果
を第１０図に示した。第１０図中、縦軸は本発明方法に
よる抗体価（ユニット）、横軸は従来法による抗体価
（ユニット）、破線はカットオフ値（健常人血清中の抗
体価の平均＋３Ｘ標準偏差（１ユニット））をそれぞれ
示す。両者測定系間の相関係数は０．６６４であり、本
発明方法で高分別定量化が見られる。つまり、本発明方
法では陽性−陰性の振るい分けがよくなっている。この
原因としては前述のごとく感染症由来の抗体（つまりＹ
ａタイプの抗体）が陰性になるためである。

なお、ＳＬＥ患者血清４例および健常人血清２例につい
て上記本発明方法による希釈曲線（血清希釈度と抗カル
ジオリピン抗体価（ユニット）との関係を示す）をもと
めた結果を第１１図に示す。第１１図から明らかなとお
り、本発明方法は希釈直線性も極めて良好で、抗体価の
定量性が高いことが示された。

実施例８自己免疫疾患患者と感染症患者血清中の抗リン
脂質抗体価の比較 実施例１の方法（Ｉ）と同様の方法によって各種リン脂
質を担体に結合させて作成された抗リン脂質抗体結合用
担体を使用し、実施例１と同様の方法で自己免疫疾患
（ＳＬＥ）患者および感染症（結核および梅毒）患者の
血清中の抗リン脂質抗体価の指標としての吸光度（450n
m）を測定した。

それぞれの被検血清について５％健常人血清の存在下お
よび非存在下で測定した結果を第１２図に示した。Ａｓ
血清は２４Ｕ（１／２００倍濃度に希釈）とし、それ以
外の被検血清はいずれも１／１００倍濃度に希釈して実
験に供した。図中、上段から順にカルジオリピン（Ｃ
Ｌ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファ
チジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホ
スファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファ
チジルコリン（ＰＣ）を固相化抗原として用いた際の被
検血清中の抗リン脂質抗体の反応性を示している（Ｃ
Ｌ、ＰＩ、ＰＳ、ＰＡは本発明、ＰＥ、ＰＣは対照）。
この際用いた抗原量は２．５μ ｇ／５０μ １／ウェ
ルである。

第１２図から明らかなとおり陰性電荷をもつ抗原（つま
りＣＬ、ＰＩ、ＰＳ、ＰＡ）に対しては、自己免疫性抗
体（自己免疫疾患に特異的な抗体）は血清の添加によっ
て依存的に反応性の増強を示すが、感染症性抗体（感染
症に由来する抗体）は血清の添加によって依存的に反応
性が減少した。このことにより、従来分別測定が困難で
あった感染症性および自己免疫性の抗リン脂質抗体の分
別定量が可能となった。

実施例９緩衝液の効果 実施例１の方法（Ｉ）によって作成された抗リン脂質抗
体結合用担体を使用し、被検液の希釈液として１％ｐＢ
ＳＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（10mM HEPES,150mM NaC
l；pH７．４）を使用したほかは実施例１と同様の方法
でＡｓ血清の抗体価の指標としての吸光度（450nm）を
測定した。その結果を第１３図に示す。第１３図から明
らかなように１次反応の反応液（被検液の希釈液）とし
てＨＥＰＥＳを含むもの使用した場合、良好な検量線
（抗カルジオリピン抗体価（ユニット）と吸光度（450n
m）の関係を示す）が得られ、抗リン脂質抗体症候群由
来の抗リン脂質抗体の測定に有用であることが分かっ
た。

実施例１０本活性成分の精製 実施例２の健常人血清分画中の本活性成分（抗カルジオ
リピン・コファクター）を以下のようにして精製した。

（１）健常人血清のＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ−５
２）カラムによるイオン交換カラムクロマトグラフィー 健常人血清中から活性画分を精製するためＤＥＡＥ−セ
ルロース（ＤＥ−５２）によるイオン交換カラムクロマ
トグラフィーを行った。すなわち、あらかじめ常法によ
り活性化を行ったＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ−５２）
イオン交換樹脂（ワットマン社製）１５０mlを２．５×
６０cmのガラス製カラムに充填し、１４ｍＭリン酸ナト
リウム緩衝液（pH７．４）にて平衡化した。これに、同
じ緩衝液３Ｌに対して２日間透析し人血清１００mlをカ
ラム上部から加え、同じリン酸緩衝液３Ｌにて溶出を行
った。溶出液はフラクションコレクターにて１０mlずつ
分取した。各フラクションの波長２８０nmの吸収を測定
することで蛋白の溶出状況を検出し、また後述の（Ｂ）
の方法にて抗カルジオリピン・コファクターの活性を測
定した。また、健常人血清をＤＥＡＥ−セルロースカラ
ムクロマトグラフィーを行うことによりコファクター非
依存性抗カルジオリピン抗体活性が出現するため、同時
に非依存性抗カルジオリピン抗体活性を方法（Ｂ）にて
測定した。そして、そのうちコファクター活性を示す画
分を回収した（第１４図）。回収した活性画分は常法に
よる限外濾過器もしくは８０％飽和硫酸アンモニウムに
よる塩析により１００ml程度に濃縮し次に示すプロテイ
ンＡ−セルファロースカラムクロマトグラフィーを行っ
た。

（２）コファクター活性含有画分のプロテインＡセファ
ロースカラムクロマトグラフィー コファクターの活性含有画分から人ＩｇＧを取り除くた
め、プロテインＡ−セファロースカラムクロマトグラフ
ィーを行った。すなわち、予めプロテインＡ−セファロ
ース（ファルマシア社製）２０mlを１．５×２０cmのガ
ラス製のカラムに充填し、３ｍ塩化ナトリウムを含む
１．５Ｍグリシン緩衝液（pH８．９）にて平衡化した。
これに、先の活性画分１０mlを同じグリシン緩衝液１０
mlで希釈した溶液をカラム上部から加え、同じグリシン
緩衝液１００mlにて溶出した。溶出液はフラクションコ
レクターにて１０mlずつ分取した。こうして得られた各
フラクションは先に述べた方法と同様にして蛋白の吸収
を測定し、吸収のピーク部分を回収した（第１５図）。
回収した部分は、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０
ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．４）２Ｌに対して一晩透
析した後限外濾過器によって５mlに濃縮し、次に示すア
フィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。な
お、吸着したＩｇＧは１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩
衝液（pH３．０）にて溶出した。

（３）抗ヒトＩｇＧ抗体−セファロースＣＬ−４Ｂカラ
ムによるアフィニティークロマトグラフィー プロテインＡ非吸着性のＩｇＧを取り除くため、常法に
より抗ヒトＩｇＧ抗体をセファロースＣＬ−４Ｂカラム
樹脂（ファルマシア社製）に結合させて調製したカラム
によってアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行
った。すなわち、予め調製した樹脂を２．０×５cmのガ
ラス製カラムに充填し、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含
む１０ｍＭＨＥＰＥＳ−ナトリウム緩衝液（pH７．４）
にて平衡化しておき、（２）で得た溶液１mlをカラム上
部から加え、同じＨＥＰＥＳ緩衝液にて溶出した。溶出
液はフラクションコレクターにて１mlずつ分取した。各
フラクションは先に述べた方法と同様の方法により蛋白
の吸収を測定し、ピーク部分のフラクションを回収した
（第１６図）。回収したフラクションは一つに集め、常
法によってドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略
す）ポリアクリルアミド電気泳動を行い、ＩｇＧが完全
に取り除かれていることを確認した後（第１７図、Ｆｒ
１Ｎ）、限界濾過器によって２mlに濃縮した。また、吸
着したＩｇＧは０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（pH３．
０）にて溶出した。

（４）カルジオリピン・リポソームによるコファクター
の精製 （３）で得たＩｇＧを完全に取り除いた精製画分（以下
Ｆｒ．１Ｎと称する）からカルジオリピン・リポソーム
に対してアフィニティー吸着させることによりコファク
ターを完全精製した。すなわち、カルジオリピンの５mg
/mlエタノール溶液２mlを２５ml容の梨型フラスコに取
り、フラスコ壁面に薄いフイルム状になるように真空減
圧下で緩やかに乾固させた。これに１５０ｍＭ塩化ナト
リウムを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．４）２
mlを加え、ボルテックスミキサーによって、１５分間激
しく攪拌しカルジオリピン・リポソームを作製した。こ
うして作製したリポソームを（３）で得た精製コファク
ター溶液Ｆｒ．１Ｎ（１．２mg/ml同ＨＥＰＥＳ緩衝
液）に対して同容量加え、室温で１時間静置し、リポソ
ームにコファクターをアフィニティー吸着させた。つぎ
に１５，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心してリポソ
ームを回収し、同じＨＥＰＥＳ緩衝液にて３回遠心洗浄
を行った。各上清は回収し、未吸着のコファクターが無
いことを常法によるＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲ
ル電気泳動にて確認した。このとき、未吸着のコファク
ターが存在する場合は、同様の手順を繰り返してリポソ
ームに吸着させることにより回収した。このようにして
コファクターを吸着させたリポソームは、１００〜５０
０μｌの同じＨＥＰＥＳ緩衝液に懸濁し、−２０℃にて
凍結保存した。この操作によって、得られたコファクタ
ー吸着リポソームを使用した常法によるＳＤＳポリアク
リルアミドスラブゲル電気泳動にて、分子量５万付近に
きわめて隣接した２本のバンドとして出現する蛋白が得
られた（第１７図、Ｆ−１）。また、同時に、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）：カルジオリ
ピン（８０：２０、モル％）の２ｍＭリポソーム、並び
にＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミン（ＤＰＰＥ）（８０：２０、モル％）の２ｍＭリ
ポソームとを使用して、同様の手順にてコファクターの
精製を行った。その結果、ＤＰＰＣとカルジオリピンか
らなるリポソームは、カルジオリピン単独のリポソーム
と同様の効果を示した（第１７図、Ｆ−２）が、ＤＰＰ
ＣとＤＰＰＥからなるリポソームにはコファクターと思
われる成分は吸着されなかった（第１７図、Ｆ−３）。

（５）ＨＰＬＣによるリポソームに吸着したコファクタ
ーの分離 カルジオリピン・リポソームにアフィニティー吸着させ
て精製したコファクターを逆相カラムを使ったＨＰＬＣ
にて分離した。すなわち、コファクターが吸着したリポ
ソーム懸濁液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、
リポソームを回収した。これに、１％ＳＤＳ水溶液を加
え良く攪拌しリポソームを充分溶解させた。ふたたび同
じ条件で遠心して、不溶物を沈澱させた後、上清部分を
逆相カラム（ウォーターズマイクロボンダースペアーＣ
−４カラム（３．９×１５cm）；ウォーターズ社製）を
使用し、以下に示す条件によって、付属の吸光度検出器
によって２１５ｎｍの吸収を測定しながらＨＰＬＣを行
った。この様にして精製コファクターが得られた（第１
８図）。

コファクターが吸着したカルジオリピン・リポソームか
らのコファクター分離のためのＨＰＬＣの条件： 流速 １m1／分 圧力上限値 ３００ｋｇｆ／cm² 圧力下限値 ０ｋｇｆ／cm² 流速時間 ６０分 使用送液 Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液 Ｂ液 アセトニトリル：イソプロパノール（３：７、Ｖ
／Ｖ）に混合したものに０．０７％トリフルオロ酢酸を
加えたもの 送液グラジェント条件 Ａ液（％） Ｂ液（％） 時間 ０分後 １００ ０ ６０分後 ４０ ６０ （６）抗カルジオリピン・コファクターの分子量及び等
電点 コファクターの等電点並びに分子量を調べるため、Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎらの方法によるＩＳＯＤＡＬＴゲル電気泳
動を行った。まず、（３）で得られた溶液Ｆｒ．１Ｎに
ついて泳動を行った（第１９図）。第１９図に示す通り
いくつかのスポットが出現したが、カルジオリピン・リ
ポソームに吸着したコファクターは第１９図に示すスポ
ットNo.１０およびNo.１２であることが（５）で得られ
た精製コファクターのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳
動の結果（第１７図、Ｆ−１）より判明した。つまり、
第１９図よりコファクターの等電点は６．７５で分子量
４９，６００（No.１０）及び等電点６．６０、分子量
５０，０００（No.１２）であった。尚、これらの２つ
の成分はアミノ酸配列が同一でそれらの糖鎖が相異する
かもしくは部分的にアミノ酸の官能基が何等かの修飾を
受けた蛋白質に相当し、コファクターのサブタイプと考
えられる。

（Ｂ）抗カルジオリピン・コファクター活性並びにコフ
ァクター非依存性抗カルジオリピン抗体活性の測定方法 健常人血清中に含まれる、抗カルジオリピン・コファク
ター活性並びにコファクター非依存性抗カルジオリピン
抗体活性は以下の方法によって、測定された。

参考例１に示した方法とほぼ同様にして測定した。

すなわち、カルジオリピンをコートした９６穴マイクロ
プレートを、０．０５％ツイーンを含むＰＢＳ緩衝液
（pH７．４）；以下洗浄液とする）を１ウェル当り２０
０μｌにて洗浄する操作を３回繰り返し、プレートを活
性化させる。そして測定するサンプルを１ウェル当り５
０μｌずつ分注する。次に、コファクター活性を測定す
るウェルには、あらかじめ１５０ｍＭ塩化ナトリウム及
び１％ＢＳＡを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．
４；以下希釈緩衝液とする）にて２００倍に希釈してお
いてＡｓ血清を５０μｌを、一方非依存性カルジオリピ
ン抗体活性を測定するウェルには、希釈緩衝液を５０μ
ｌずつ分注し、室温で３０分間静置する。そして、これ
以降の操作は、両活性測定法とも同じ操作を行う。すな
わち、両方のウェルとも洗浄液にて３回洗浄した後、１
５０ｍＭの塩化ナトリウム、１％ＢＳＡ及び１ｍＭＥＤ
ＴＡを含む１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（pH７．４）にて
適度に希釈した西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを結
合させた抗人ＩｇＧ抗体を１００μｌずつ分注し、室温
で３０分間静置する。さらに３回洗浄液で洗浄した後、
０．３ｍＭＴＭＢＺ及び０．０３％過酸化酸素水（１０
０μｌ）を基質溶液として加え、１０分間反応させた後
に、プレートリーダーによって４５０ｎｍの吸光度を測
定した。

試験例 抗カルジオリピン・コファクターの特性を調べるため以
下の試験を行った。

（１）ビオチン化抗カルジオリピン・コファクターの調
製 免疫実験操作法（昭和５５年２月２０日、日本免疫学会
発行（細胞抗原IIIの１５−５９，ｐ２４２５））の熊
谷及び奥村らの方法に準じて、実施例１０の（３）で精
製された抗カルジオリピン・コファクター１mgをビオチ
ン化し、抗カルジオリピン・コファクターを標識化し
た。

（２）抗カルジオリピン・コファクターのカルジオリピ
ンへの結合性 ９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに２．
５μｇ／５０μｌ／ウェルずつカルジオリピン・エタノ
ール溶液を加え、減圧乾燥し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで
１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有Ｐ
ＢＳ（２００μｌ）で３回洗浄した。このカルジオリピ
ン固相化プレートに、第２０図に示す通り０〜３２μg/
mlのビオチン化抗カルジオリピン・コファクター（１０
０μｌ）を３０分室温にて反応させ、３回洗浄後アビジ
ン化ペルオキシダーゼを室温で３０分反応させた。更に
３回洗浄後、１００μｌの０．３ｍＭ ＴＭＢＺ及び
０．００３％の過酸化水素水を入れ、１０分間室温にて
反応させた後、１００μｌの２Ｎ硫酸を加えることで反
応を停止した。反応液の吸光度を測定することにより、
固相化カルジオリピンと結合した抗カルジオリピン・コ
ファクターを定量した。

第２０図に示す通り、ビオチン化抗カルジオリピン・コ
ファクターは濃度依存的に固相化カルジオリピンに結合
性を示した。

（３）各種リン脂質に対するビオチン化抗カルジオリピ
ン・コファクターの結合特異性 上記（２）と同様の方法で各種リン脂質（つまりカルジ
オリピン，ホスファチジルセリン（ＰＳ），ホスファチ
ジルイノシトール（ＰＩ），ジパルミトイルホスファチ
ジン酸（ＤＰＰＡ），ジパルミトイルホスファチジルコ
リン（ＤＰＰＣ）及びジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン（ＤＰＰＥ））を２．５μｇ／５０μｌ
／ウェルずつ固相化したプレートで、ビオチン化抗カル
ジオリピン・コファクターの結合特異性をアビジン化ペ
ルオキシダーゼを用いて調べた。第２１図に示す通り、
抗カルジオリピン・コファクターの結合は陰性荷電をも
つリン脂質（カルジオリピン、ＰＳ，ＰＩ，ＤＰＰＡ）
に特異的であった。

（４）抗カルジオリピン抗体の反応系における抗カルジ
オリピン・コファクターの依存性 上記（２）と同様のＥＬＩＳＡ法により、抗リン脂質抗
体症候群に特異的に存在する抗カルジオリピン抗体（Ａ
ｓ血清）と固相化カルジオリピンとの反応系に抗カルジ
オリピン・コファクター（２μｇ／ウェル）を添加し
て、抗カルジオリピン抗体と固相化カルジオリンとの反
応について抗カルジオリピン・コファクター依存性を調
べた。第２２図に示す通り、抗カルジオリピン抗体は添
加した抗体カルジオリピン・コファクターに依存的に反
応した。

（５）抗カルジオリピン・コファクターの種特異性 上記（２）と同様のＥＬＩＳＡ法にて種の異なる抗カル
ジオリピン・コファクター（ヒト及びウシ由来）の活性
を評価したところ、ウシ由来のコファクターを用いると
自己免疫性（Ａｓ血清）及び感染症（Ｙａ血清）の抗カ
ルジオリピン抗体の反応性を共に高めるが、ヒト由来の
コファクターを用いると自己免疫性抗体（Ａｓ抗体）の
みの反応性を高める活性が認められた。（第２３図）。

実施例１１ 健常人血清からの分画物の採取 （１）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー
による分画物の採取 １４ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．４）（以下、
ＰＢ７．４）で一晩透析した健常人血清（１ml）を予め
ＰＢ７．４にて平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラ
ム（１０ml、１．０φ×１３cm、ワットマン社製ＤＥ−
５２）にかけ、素通り画分を１mlずつ回収した。各分画
２５ｕｌを用いて、抗リン脂質抗体症候群患者血清中
（Ａｓ）に特異的に出現する抗カルジオクピン抗体と固
相化カルジオリピンとの反応性を高める活性と、梅毒患
者血清中（Ｓｙ）に存在する抗カルジオリピン抗体と固
相化カルジオクピンとの反応性を抑制する活性を、参考
例１及び実施例１０の（Ａ）の方法とほぼ同様にして測
定した。

結果は第２４図に示した。

（２）ヘパリンセファロースカラムクロマトグラフィー
による分画物の採取 ５０ｍＭ ＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液、pH７．４で平衡化したヘパリン−セファロース・カ
ラム（６ml、１．０φ×８cm、ファルマシア社製）に同
緩衝液に対して一晩透析した健常人血清１mlを吸着さ
せ、カラムを同緩衝液で十分洗浄した後、ＮａＣｌ濃度
５０ｍＭ〜１Ｍまでの濃度勾配で溶出させた。各分画１
５μｌを用いて抗リン脂質抗体症候群患者血清中（Ａ
ｓ）に特異的に出現する抗カルジオリピン抗体と固相化
カルジオリピンとの反応性を高める活性と、梅毒患者血
清中（Ｓｙ）に存在する抗カルジオリピン抗体の固相化
カルジオリピンとの反応性を抑制する活性を、参考例１
及び実施例１０の（Ａ）の方法を準じて測定した。

結果は第２５図に示した。

（３）カルジオリピン−アクリルアミドゲルカラムクロ
マトグラフィーによる分画物の採取 ｉ）カルジオリピン−ポリアクリルアミドカラムの調製 ウシ心臓カルジオリピン（５μｍｏｌｅｓ）、コレステ
ロール（５μｍｏｌｅｓ）、ジセチルフォスフェート
（０．５μｍｏｌｅｓ）をナシフラスコ中でフィルム状
に減圧乾燥させ、更に５００ｕｌのエタノールを加え６
０℃程度に加温し脂質を溶解した。次に５mlの１５％ア
クリルアミド、５％ビスアクリルアミド溶液を加え激し
くボルテックスミキサーで攪拌し、更に１００μｌの過
硫酸アンモニウム（１００mg/ml）、及び２μｌのＴＥ
ＭＥＤを加えポリマー化した。ポリマー化ゲルをホモジ
ナイズしカラム（１．０φ×３cm）に詰め５０ｍＭＮａ
Ｃｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４で
十分洗浄平衡化した。

ii）アフニテイーカラム・クロマトグラフィー ５０ｍＭＮａＣｌ含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液、pH７．４で一晩透析した健常人血清１mlをカラムに
通した後、同緩衝液で十分に洗浄し１．０ＭＮａＣｌ含
有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、pH７．４で吸着性
の蛋白を溶出した。各分画１５μｌを用いて抗リン脂質
抗体症候群患者血清中（Ａｓ）に特異的に出現する抗カ
ルジオリピン抗体と固相化カルジオリピンとの反応性を
高める活性と梅毒患者血清中（Ｓｙ）に存在する抗カル
ジオリピン抗体と固相化カルジオリピンとの反応性を抑
制する活性を参考例１及び実施例１０の（Ａ）の方法に
準じて測定した。

結果は第２６図に示した。

以上に示した通り、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマ
トグラフィー、ヘパリンセファロースカラムクロマトグ
ラフィー、あるいはカルジオリピン−アクリルアミドゲ
ルカラムクロマトグラフィーを用いて健常人血清から本
発明の分画物を得ることができる。

実施例１２ 抗カルジオリピン・コファクターの活性 抗リン脂質抗体症候群患者血清中（Ａｓ）中の抗カルジ
オリピン抗体とカルジオリピンとの反応性を高める活性
（Ａｓ↑活性）と梅毒患者血清中に存在する抗カルジオ
リピン抗体のカルジオリピンとの反応性を抑制する活性
（Ｓｙ↓活性）の発現を調べた。

カルジオリピン固相化プレートをツイーン２０含有ＰＢ
Ｓにて洗浄の後、第６表に示した各血清群の３，４群を
実施例１０の（３）で得られたコファクター（１０μｇ
／ml）で３０分間処理し、対照群についてはコファクタ
ー溶解緩衝液で処理をした。この処理の後、ツイーン２
０含有ＰＢＳにて３回洗浄し、血清Ａｓ（１／４００倍
希釈、１２５Ｕ／ml）、およびＳｙ（１／２００倍希
釈）をコファクター（１０μg/ml）存在下（２，４群）
もしくは非存在下（１，３群）で室温３０分間反応させ
た。以下の操作は参考例１及び実施例１０の（Ａ）と同
じである。

第６表に示す通り、Ａｓ↑活性を得るためにコファクタ
ーを上記のごとく前処理するか、抗体との反応系に存在
させるか、もしくはその両方に存在させる。Ｓｙ↓活性
を得るためにはコファクターが前処理の時に存在しても
よいが、抗体との反応系に存在させる必要がある。

実施例１３ 参考例１及び実施例１０の（Ａ）の方法とほぼ同様の方
法を採用して、抗リン脂質抗体症候群患者血清中（Ａ
Ｓ）の抗カルジオリン抗体とカルジオリピンとの反応性
を高める活性（Ａｓ↑活性）と梅毒患者血清中（Ｓｙ）
に存在する抗カルジオリピン抗体とカルジオリンとの反
応性を抑制する活性（Ｓｙ↓活性）に及ぼす精製ウシ血
清アルブミンの影響を調べた。

本測定法で純度の高い脂質を含まないウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）および精製コファクター（実施例１０の
（３）で得られたコファクター）を用いるときＳｙ↓活
性が反応液中のＢＳＡ濃度に依存して減少する（第２７
図）これはコファクター分子上のＳｙ↓活性発現部位が
精製アルブミン（ＢＳＡ）によってブロックされること
によると思われ、従ってＢＳＡ濃度を０−５％（特に０
−１％）の範囲で使用するのが望ましい。

実施例１４ コファクターのアミン酸配列の決定 実施例１０の（３）の方法によって得られたコファクタ
ーを、更に実施例１１の（３）で用いたカルジオリピン
−アクリルアミドゲルカラムクロマトグラフィーに付し
て吸着させ、次いで１モルＮａＣｌで溶出させて精製し
たコファクター（このコファクター中には実施例１０の
（６）で同定された２つのサブタイプが含まれている）
のＮ末端アミノ酸配列を決定した。すなわち、サンプル
３０μｌ（３００ｐｍｏｌ）をＰＶＤＦ膜（ポリビニリ
デンダイフルオライド；ミリポア社製；商品名、イモビ
ロン）に吸着させ、６０％メタノールで洗浄した後気相
プロテインシーケンサー（ＰＳＱ−１型，（株）島津製
作所製）を使用して分析を行った。以上の操作により、
コファクターのＮ末端より５個のアミノ酸配列を決定し
た。

１ ５ 結果：NH₂-Gly-Arg-Thr-X-Pro-Lys-Pro （ＸはＣｙｓ又はＨｉｓと推定される） 産業上の利用可能性 本発明により、界面活性剤単独、界面活性剤と精製血清
アルブミンとの併用、またはさらにこれらと本発明血液
成分を併用して処理された抗リン脂質抗体結合用担体を
使用し、及び／又は第１の抗原抗体反応（１次反応）に
おいて本発明血液成分（抗カルジオリピン・コファクタ
ー）を反応液に添加することによって、従来の方法では
十分に分別できなかった抗リン脂質抗体症候群由来の抗
リン脂質抗体と感染症由来の抗リン脂質抗体を再現性よ
く分別する方法を確立した。本発明方法を用いることに
よって抗リン脂質抗体症候群の診断を極めて正確に行う
ことができる。

また本発明血液成分（抗カルジオリピン・コファクタ
ー）は、抗リン脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体
とリン脂質との結合性を高め、感染症に由来する抗リン
脂質抗体とリン脂質との結合性を低下させる作用を有す
る。従って、これらの血清もしくは血漿、分画物または
蛋白質（抗カルジオリピン・コファクター）を、抗リン
脂質抗体症候群に特異的に存在する抗体の免疫学的測定
法に用いることにより、抗リン脂質抗体症候群の診断を
正確に行うことができるとともに、抗リン脂質抗体症候
群と感染症におけるそれぞれの抗リン脂質抗体を分別し
て検出できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平４−506415（ＪＰ，Ａ) ・Ｋｅｉｏ Ｊ Ｍｅｄ，ｖｏｌ．36, Ｐ．284−297（1987） ・ＴＨＲＯＭＢＯ ＳＩＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ｖｏｌ．52, Ｐ．609−619（1988） ・Ｔｈｅ Ｊｏｕ ｒｎａｌｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇ ｙ，ｖｏｌ．15，Ｐ．80−86（1988） ・ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＶＥＳ ＴＩＧＡＴＩＯＮ，ｖｏｌ．18，ＮＯ. ９，10，Ｐ．1121−1127（1989） ・Ｂｒ ｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａ ｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．73，Ｐ. 506−513（1989） ・Ｕｉｎ．ｅｘｐ，Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．80，Ｐ．171− 176（1990)

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カルジオリピンを結合させた抗カルジオリ
   ピン抗体結合用担体と被検液とを接触させて抗リン脂質
   抗体症候群由来の抗カルジオリピン抗体と感染症由来の
   抗カルジオリピン抗体とを分別検出または分別定量する
   方法であって、抗カルジオリピン抗体結合用担体と被検
   液とを接触させる際、抗カルジオリピン・コファクター
   を存在させて接触させる方法と、抗カルジオリピン・コ
   ファクターを存在させないで接触させる方法の両者を実
   施して、抗リン脂質抗体症候群由来の抗カルジオリピン
   抗体と感染症由来の抗カルジオリピン抗体とを分別検出
   または分別定量する方法。
2. 【請求項２】カルジオリピンがマイクロタイタープレー
   ト上に固定化されている、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】抗カルジオリピン・コファクターとして被
   検液と同種または類縁の動物に由来ものを用いる、請求
   項１記載の方法。
4. 【請求項４】抗カルジオリピン・コファクターとしてヒ
   ト由来ものを用いる、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】抗カルジオリピン・コファクターとして、
   抗カルジオリピン・コファクターを含む血清、血漿また
   はそれらの分画物を用いる、請求項１記載の方法。
6. 【請求項６】抗カルジオリピン・コファクターが検体希
   釈液中に含まれている、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】被検液がヒトの血液またはその分画物であ
   る、請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】構成試薬として抗カルジオリピン・コファ
   クターおよびカルジオリピンからなる、請求項１記載の
   方法を実施するためのキット。
9. 【請求項９】カルジオリピンがマイクロタイタープレー
   ト上に固定化されている、請求項８記載のキット。
10. 【請求項１０】抗カルジオリピン・コファクターとして
    被検液と同種または類縁の動物に由来のものを用いる、
    請求項８記載のキット。
11. 【請求項１１】抗カルジオリピン・コファクターとして
    ヒト由来ものを用いる、請求項８記載のキット。
12. 【請求項１２】抗カルジオリピン・コファクターとし
    て、抗カルジオリピン・コファクターを含む血清、血漿
    またはそれらの分画物を用いる、請求項８記載のキッ
    ト。
13. 【請求項１３】抗カルジオリピン・コファクターが検体
    希釈液中に含まれている、請求項８記載のキット。