JPH05232109A - ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法 - Google Patents
ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法Info
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- JPH05232109A JPH05232109A JP17476891A JP17476891A JPH05232109A JP H05232109 A JPH05232109 A JP H05232109A JP 17476891 A JP17476891 A JP 17476891A JP 17476891 A JP17476891 A JP 17476891A JP H05232109 A JPH05232109 A JP H05232109A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 検体試料中のヒト・オステオカルシン前駆体
プロ蛋白を含む抗原の測定方法等を提供することを目的
とする。 【構成】 サイドイッチ法による免疫学的測定方法にお
いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体のいずれか
一方の抗体として、ヒト・オステオカルシン前駆体プロ
蛋白のアミノ酸配列を認識する抗体を用い、該抗体をヒ
ト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含む抗原と結合
せしめることにより、ヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白を含む抗原を測定する方法。
プロ蛋白を含む抗原の測定方法等を提供することを目的
とする。 【構成】 サイドイッチ法による免疫学的測定方法にお
いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体のいずれか
一方の抗体として、ヒト・オステオカルシン前駆体プロ
蛋白のアミノ酸配列を認識する抗体を用い、該抗体をヒ
ト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含む抗原と結合
せしめることにより、ヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白を含む抗原を測定する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・オステオカルシ
ンの前駆体プロ蛋白に特定的に結合する抗体およびヒト
・オステオカルシン前駆体プロ蛋白およびヒト・オステ
オカルシン前駆体プロ成熱蛋白の測定法に関する。
ンの前駆体プロ蛋白に特定的に結合する抗体およびヒト
・オステオカルシン前駆体プロ蛋白およびヒト・オステ
オカルシン前駆体プロ成熱蛋白の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】オルテオカルシン（別名、bone gla pro
tein（ＢＧＰ））は、骨のビタミンＫ依存性のカルシウ
ム結合性タンパクである。その分子量は５，８００であ
り４９のアミノ酸残基により構成されている。このタン
パクは、オステオブラスト（骨芽球）から産生され、骨
の非コラーゲンタンパクの構成成分の約２０％を占めて
いる。このタンパクにはγ−carboxyglutamic acid res
idues があり、ハイドロキシアパタイトと強いアフィニ
ティがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要な役
割を有しているものと推定されている。
tein（ＢＧＰ））は、骨のビタミンＫ依存性のカルシウ
ム結合性タンパクである。その分子量は５，８００であ
り４９のアミノ酸残基により構成されている。このタン
パクは、オステオブラスト（骨芽球）から産生され、骨
の非コラーゲンタンパクの構成成分の約２０％を占めて
いる。このタンパクにはγ−carboxyglutamic acid res
idues があり、ハイドロキシアパタイトと強いアフィニ
ティがあり、それゆえに骨マトリックス形成に重要な役
割を有しているものと推定されている。
【０００３】このオステオカルシンは、ニワトリと牛の
骨から見出されたのが最初であるが、（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 72, 3925 (1975) 、同73, 1447(1976))
その他、人を含めて（J.B.C. 255, 8685(1980)) 種々の
動物の骨から見出されており、その構造の類似性が言わ
れている。
骨から見出されたのが最初であるが、（Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 72, 3925 (1975) 、同73, 1447(1976))
その他、人を含めて（J.B.C. 255, 8685(1980)) 種々の
動物の骨から見出されており、その構造の類似性が言わ
れている。
【０００４】オステオカルシンは、骨芽細胞内では、
分泌機能を有するプレ配列，γ−carboxylase との結
合部位であるプロ配列、およびＧｌａ蛋白である成熱
オステオカルシン配列の３つの部分から構成されるｍ−
ＲＮＡの構造を有する。ｍ−ＲＮＡは、リボゾームにお
いて、オステオカルシン前駆体プレプロ成熱オステオカ
ルシン蛋白によまれ、プレ配列が切断された後、オステ
オカルシン前駆体プロ成熱蛋白は、ゴルジ体においてγ
−carboxylase と、プロ部分において結合し、Ｇｌａ化
された後、細胞外にプロ蛋白と成熱蛋白とが、分泌され
ると考えられている。
分泌機能を有するプレ配列，γ−carboxylase との結
合部位であるプロ配列、およびＧｌａ蛋白である成熱
オステオカルシン配列の３つの部分から構成されるｍ−
ＲＮＡの構造を有する。ｍ−ＲＮＡは、リボゾームにお
いて、オステオカルシン前駆体プレプロ成熱オステオカ
ルシン蛋白によまれ、プレ配列が切断された後、オステ
オカルシン前駆体プロ成熱蛋白は、ゴルジ体においてγ
−carboxylase と、プロ部分において結合し、Ｇｌａ化
された後、細胞外にプロ蛋白と成熱蛋白とが、分泌され
ると考えられている。
【０００５】このオステオカルシンのプロ配列に関して
は、A.J.Celeste らプレプロオステオカルシンのｃＤＮ
Ａ配列、アミノ酸配列（EMBO J. 5, 1885-1890 (1986))
を報告している。
は、A.J.Celeste らプレプロオステオカルシンのｃＤＮ
Ａ配列、アミノ酸配列（EMBO J. 5, 1885-1890 (1986))
を報告している。
【０００６】また、このプロ配列に関しては、S.K.Nish
imoto らが、骨芽細胞のオステオカルシン産生過程にお
いて、そのプロ蛋白が分泌されうることを推定してお
り、骨形成マーカーとなりうる可能性を推定している
が、その測定方法については言及されていない。
imoto らが、骨芽細胞のオステオカルシン産生過程にお
いて、そのプロ蛋白が分泌されうることを推定してお
り、骨形成マーカーとなりうる可能性を推定している
が、その測定方法については言及されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】最近、１９９０年７月
３０日 日本骨代謝学会において、笠井らは、プロ蛋
白を固定抗原を用いた競合法により測定する方法を発表
しているが、その測定値が成人で高くしかも年令と正の
相関を示すなど、一般に骨形成能は年令と共に低下する
ことを考え合わせると、このマーカーが骨形成能を示す
という推測と矛盾する。上記矛盾が発生する理由とし
て、その測定系が、不完全であることがあげられる。競
合法であるため、その測定法の定量性および再現性に問
題があることが考えられる。
３０日 日本骨代謝学会において、笠井らは、プロ蛋
白を固定抗原を用いた競合法により測定する方法を発表
しているが、その測定値が成人で高くしかも年令と正の
相関を示すなど、一般に骨形成能は年令と共に低下する
ことを考え合わせると、このマーカーが骨形成能を示す
という推測と矛盾する。上記矛盾が発生する理由とし
て、その測定系が、不完全であることがあげられる。競
合法であるため、その測定法の定量性および再現性に問
題があることが考えられる。
【０００８】競合法を用いている理由としては、このよ
うな小ペプチド蛋白（アミノ酸２６ケ，分子量約３，０
００）はサンドイッチ法で測定するには余りにも測定対
象物質が小さすぎて大きな抗体（分子量約１５万）で両
方からはさむのは一般的に困難であると考えられるから
と思われる。
うな小ペプチド蛋白（アミノ酸２６ケ，分子量約３，０
００）はサンドイッチ法で測定するには余りにも測定対
象物質が小さすぎて大きな抗体（分子量約１５万）で両
方からはさむのは一般的に困難であると考えられるから
と思われる。
【０００９】以上の理由によりオステオカルシン前駆体
プロ蛋白の定量性および再現性の高い測定法の開発も望
まれていた。
プロ蛋白の定量性および再現性の高い測定法の開発も望
まれていた。
【００１０】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、か
かる従来技術の課題に鑑みて、ヒトオステオカルシン前
駆体プロ蛋白の高感度，定量的測定系を開発すべく鋭意
検討した結果、サンドイッチ法により、この小ペプチド
蛋白を高感度に測定しうること、しかも同一のポリクロ
ーナル抗体でも測定できること、さらに骨形成能の高い
小児の血中に高濃度に存在すること、また本抗体と成熟
蛋白に対する抗体（例えば特願平１−３０００３号，同
１−２５５３０６号）を用いることにより、ヒト・オス
テオカルシン前駆体プロ成熟蛋白の高感度な測定ができ
ることを見出し、本発明に到達した。
かる従来技術の課題に鑑みて、ヒトオステオカルシン前
駆体プロ蛋白の高感度，定量的測定系を開発すべく鋭意
検討した結果、サンドイッチ法により、この小ペプチド
蛋白を高感度に測定しうること、しかも同一のポリクロ
ーナル抗体でも測定できること、さらに骨形成能の高い
小児の血中に高濃度に存在すること、また本抗体と成熟
蛋白に対する抗体（例えば特願平１−３０００３号，同
１−２５５３０６号）を用いることにより、ヒト・オス
テオカルシン前駆体プロ成熟蛋白の高感度な測定ができ
ることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】すなわち、本発明は、サンドイッチ法によ
る免疫学的測定方法において、不溶性担体に結合した抗
体と標識抗体のいずれか一方の抗体としてヒト・オステ
オカルシン前駆体プロ蛋白のアミノ酸配列を認識する抗
体を用い、該抗体をヒト・オステオカルシン前駆体プロ
蛋白を含む抗原と結合せしめることにより、ヒト・オス
テオカルシン前駆体プロ蛋白を含む抗原を測定する方法
である。
る免疫学的測定方法において、不溶性担体に結合した抗
体と標識抗体のいずれか一方の抗体としてヒト・オステ
オカルシン前駆体プロ蛋白のアミノ酸配列を認識する抗
体を用い、該抗体をヒト・オステオカルシン前駆体プロ
蛋白を含む抗原と結合せしめることにより、ヒト・オス
テオカルシン前駆体プロ蛋白を含む抗原を測定する方法
である。
【００１２】本発明のヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白に対する抗体の作成法について次に述べる。
ロ蛋白に対する抗体の作成法について次に述べる。
【００１３】１）ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋
白の合成（抗原の作成） 合成についてはＡＢＩ社ペプチド合成機を用いて下記式
［Ｉ］で表わされるペプチドを合成した。
白の合成（抗原の作成） 合成についてはＡＢＩ社ペプチド合成機を用いて下記式
［Ｉ］で表わされるペプチドを合成した。
【００１４】
【化１】 Ｈ2 Ｎ−Lys-Pro-Ser-Gly-Ala-Glu-Ser-Ser-Lys- Ala-Phe-Val-Ser-Lys-Gln-Glu-Gly-Ser-Glu- Val-Val-Lys-Arg-Pro-Arg-Arg-COOH …［Ｉ］ 以下、このペプチドの名称をOstpro−２６とする。
【００１５】２）免疫原の作成 Ｏｓｔｐｒｏ−２６の免疫源との作成は、以下の３通り
が考えられる。ＰＶＰなどの合成高分子との物理化学
的混合、キャリア蛋白（ＫＬＨ又はＢＳＡ等）との化
学結合、リポソーム，菌体等のparticleとの結合（吸
着又は化学結合）がある。
が考えられる。ＰＶＰなどの合成高分子との物理化学
的混合、キャリア蛋白（ＫＬＨ又はＢＳＡ等）との化
学結合、リポソーム，菌体等のparticleとの結合（吸
着又は化学結合）がある。
【００１６】３）免疫方法（抗体の作成） 上記にて調製した免疫源を動物（羊，山羊，兎，ラッ
ト，マウス，トリ，等）に免疫する。免疫はフロイント
完全アジェバントや、フロイント不完全アジュバント，
Ａｌ（ＯＨ）3 等があげられる。抗体価上昇後、抗体を
含んだ血清を採取し、抗体を精製する。
ト，マウス，トリ，等）に免疫する。免疫はフロイント
完全アジェバントや、フロイント不完全アジュバント，
Ａｌ（ＯＨ）3 等があげられる。抗体価上昇後、抗体を
含んだ血清を採取し、抗体を精製する。
【００１７】本発明の抗体を用いて、サンドイッチ法に
よる免疫学的測定方法により、ヒト・オステオカルシン
前駆体プロ蛋白を含む抗原を物理的かつ感度良く測定す
ることができる。
よる免疫学的測定方法により、ヒト・オステオカルシン
前駆体プロ蛋白を含む抗原を物理的かつ感度良く測定す
ることができる。
【００１８】ここでヒト・オステオカルシン前駆体プロ
蛋白を含む抗原とは、ヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白のみからなる抗原及び該プロ蛋白と成熟蛋白が融
合してなるヒト・オステオカルシン前駆体プロ成熟蛋白
等、ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白のアミノ酸
配列を認識する抗体が結合しうるものをいう。
蛋白を含む抗原とは、ヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白のみからなる抗原及び該プロ蛋白と成熟蛋白が融
合してなるヒト・オステオカルシン前駆体プロ成熟蛋白
等、ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白のアミノ酸
配列を認識する抗体が結合しうるものをいう。
【００１９】サンドイッチ法としては、例えばＥＩＡと
しては「酵素免疫測定法」（第２版、石川栄治他著、医
学書院１９８２）などに記載されているそれ自体公知の
方法を用いることができる。
しては「酵素免疫測定法」（第２版、石川栄治他著、医
学書院１９８２）などに記載されているそれ自体公知の
方法を用いることができる。
【００２０】以下、検体試料中に含まれる抗原が、ヒト
・オステオカルシン前駆体プロ蛋白である場合について
説明する。
・オステオカルシン前駆体プロ蛋白である場合について
説明する。
【００２１】サンドイッチ法によるＥＩＡでは、ヒト・
オステオカルシン前駆体プロ蛋白に対する一方の抗体
（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック
容器）に固定化する（以下これを“固相抗体”とい
う）。ついで必要な場合には不溶性担体と測定しようと
する試薬又は検体試料との非特異的結合を避けるために
適当な物質（例えば牛血清アルブミン）で不溶性担体の
表面を被覆する。
オステオカルシン前駆体プロ蛋白に対する一方の抗体
（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック
容器）に固定化する（以下これを“固相抗体”とい
う）。ついで必要な場合には不溶性担体と測定しようと
する試薬又は検体試料との非特異的結合を避けるために
適当な物質（例えば牛血清アルブミン）で不溶性担体の
表面を被覆する。
【００２２】このようにして得られた第１抗体が固定化
された不溶性担体を検体試料と一定時間及び温度で接触
させ反応させる。この間に固相抗体（第１抗体）と検体
試料中のヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含む
抗原が結合する。ついで適当な洗浄液で洗った後、適当
な標識物質（例えば酵素）で標識したヒト・オステオカ
ルシン前駆体プロ蛋白に対する他方の抗体（第２抗体）
の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固相抗
体に結合したヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白と
一定時間及び温度で接触させて、第２抗体と反応させ
る。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上の
固相抗体とヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を介
して結合して存在する第２抗体に標識された標識物質の
量を測定する。
された不溶性担体を検体試料と一定時間及び温度で接触
させ反応させる。この間に固相抗体（第１抗体）と検体
試料中のヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含む
抗原が結合する。ついで適当な洗浄液で洗った後、適当
な標識物質（例えば酵素）で標識したヒト・オステオカ
ルシン前駆体プロ蛋白に対する他方の抗体（第２抗体）
の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における固相抗
体に結合したヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白と
一定時間及び温度で接触させて、第２抗体と反応させ
る。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上の
固相抗体とヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を介
して結合して存在する第２抗体に標識された標識物質の
量を測定する。
【００２３】なお上記反応は、固相抗体、標識抗体及び
ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含有する検体
試料を同時に混合し、一定時間及び温度でこれら三者を
同時に接触させて反応させることもできる。
ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含有する検体
試料を同時に混合し、一定時間及び温度でこれら三者を
同時に接触させて反応させることもできる。
【００２４】かくしてその値から検体試料中のヒト・オ
ステオカルシン前駆体プロ蛋白の量を算出することがで
きる。
ステオカルシン前駆体プロ蛋白の量を算出することがで
きる。
【００２５】なお、本発明において、純品のプロ蛋白を
ヒト血清検体に加えた際、異常高値の回収率が得られる
場合があった（４００〜８００％）。この理由を検討す
ると、プロ蛋白と血清タンパクとの強い相互作用がこの
結果をもたらすことが判明した。すなわち、より認識さ
れやすい構成に変化するものと思われる。そのため、標
準物質に動物血清を２〜３０％の範囲で加えることも、
定量性の高いヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白の
測定法とするために好ましい態様である。
ヒト血清検体に加えた際、異常高値の回収率が得られる
場合があった（４００〜８００％）。この理由を検討す
ると、プロ蛋白と血清タンパクとの強い相互作用がこの
結果をもたらすことが判明した。すなわち、より認識さ
れやすい構成に変化するものと思われる。そのため、標
準物質に動物血清を２〜３０％の範囲で加えることも、
定量性の高いヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白の
測定法とするために好ましい態様である。
【００２６】また、抗原がヒト・オステオカルシン前駆
体プロ成熟蛋白である場合には、前記の第１抗体及び第
２抗体のいずれか他方の抗体としては、オステオカルシ
ンのアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体を用いることができる。そのような抗
体としては例えば先に本発明者らが出願したＰＣＴ出願
（ＰＣＴ／ＪＰ９０／００１５５）に記載されたヒト・
オステオカルシンのＮ末端側１〜２０や、Ｃ末端側３６
〜４９のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有す
る抗体をあげることができる。
体プロ成熟蛋白である場合には、前記の第１抗体及び第
２抗体のいずれか他方の抗体としては、オステオカルシ
ンのアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体又はポ
リクローナル抗体を用いることができる。そのような抗
体としては例えば先に本発明者らが出願したＰＣＴ出願
（ＰＣＴ／ＪＰ９０／００１５５）に記載されたヒト・
オステオカルシンのＮ末端側１〜２０や、Ｃ末端側３６
〜４９のアミノ酸配列領域中に特異的な認識部位を有す
る抗体をあげることができる。
【００２７】本発明のサンドイッチ法においては抗体と
してはＩｇＧに限らずペプシンで消化して得られたＦ
（ａｂ′）2 や、Ｆ（ａｂ′）2 を還元して得られたＦ
ａｂ′，あるいは抗体をパパインで消化して得られたＦ
ａｂなどの、抗原に結合する抗体フラグメントを固相抗
体、また、これらに標識物質を結合させて得られる標識
抗体として使用することができる。例えば、標識抗体と
してはＦ（ａｂ′）2 が好ましい。
してはＩｇＧに限らずペプシンで消化して得られたＦ
（ａｂ′）2 や、Ｆ（ａｂ′）2 を還元して得られたＦ
ａｂ′，あるいは抗体をパパインで消化して得られたＦ
ａｂなどの、抗原に結合する抗体フラグメントを固相抗
体、また、これらに標識物質を結合させて得られる標識
抗体として使用することができる。例えば、標識抗体と
してはＦ（ａｂ′）2 が好ましい。
【００２８】本発明のヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白の免疫学的測定方法等に使用される不溶性担体と
しては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹
脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分
子、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの
組合せなどを例示することができる。
ロ蛋白の免疫学的測定方法等に使用される不溶性担体と
しては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、弗素樹
脂、架橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分
子、その他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの
組合せなどを例示することができる。
【００２９】また不溶性担体の形状としては、例えばト
レイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試
験管などの種々の形状であることができる。
レイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試
験管などの種々の形状であることができる。
【００３０】本発明者らの研究によれば、本発明による
前記したヒト検体中のヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白の測定方法において、不溶性担体としてその表面
が鏡面化された平滑性のものを使用すると粗面の担体に
比べて該担体に対する検体中のタンパクあるいは標識抗
体などの非特異的吸着反応が抑制され測定感度が向上し
かつ安定性も増すことがわかった。
前記したヒト検体中のヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白の測定方法において、不溶性担体としてその表面
が鏡面化された平滑性のものを使用すると粗面の担体に
比べて該担体に対する検体中のタンパクあるいは標識抗
体などの非特異的吸着反応が抑制され測定感度が向上し
かつ安定性も増すことがわかった。
【００３１】従来、免疫学的測定系において測定感度を
高めるために、不溶性担体としては、むしろその表面を
研磨して粗面化し、表面積を多くしたものが使用されて
いた。しかしながら、ヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白の如き検体中に極く微量しか含まれていない場合
には表面の平滑性が増えるに従って、非特異的吸着が抑
えられ、測定感度が増加するのである。
高めるために、不溶性担体としては、むしろその表面を
研磨して粗面化し、表面積を多くしたものが使用されて
いた。しかしながら、ヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白の如き検体中に極く微量しか含まれていない場合
には表面の平滑性が増えるに従って、非特異的吸着が抑
えられ、測定感度が増加するのである。
【００３２】かくて不溶性担体は、その表面の中心線平
均粗さ（Ｒａ）が１．５μｍ以下の鏡面化された平滑表
面を有するものが有利である。
均粗さ（Ｒａ）が１．５μｍ以下の鏡面化された平滑表
面を有するものが有利である。
【００３３】中心線平均粗さ（Ｒａ）は、粗さ曲線から
その中心線の方向に測定長さリットルの部分を抜取り、
この抜取り部分の中心線をＸ軸、縦倍率の方向をＹ軸と
し、粗さ曲線をｙ＝ｆ（ｘ）で表わしたとき、次式で与
えられるＲａの値をミクロン単位で表わした値を意味す
る。
その中心線の方向に測定長さリットルの部分を抜取り、
この抜取り部分の中心線をＸ軸、縦倍率の方向をＹ軸と
し、粗さ曲線をｙ＝ｆ（ｘ）で表わしたとき、次式で与
えられるＲａの値をミクロン単位で表わした値を意味す
る。
【００３４】
【数１】 この中心線平均粗さ（Ｒａ）については、ＪＩＳ Ｂ０
６０１−１９８２（日本）、ＡＮＳＩ Ｂ４６．１−１
９７９（ＵＳＡ）及びＲ ４６８−１９６６（ＩＳＯ）
に説明されている。
６０１−１９８２（日本）、ＡＮＳＩ Ｂ４６．１−１
９７９（ＵＳＡ）及びＲ ４６８−１９６６（ＩＳＯ）
に説明されている。
【００３５】なお以下の本発明の実施例では、不溶性担
体は東京精密（株）製の表面粗さ計サーフコムを用いて
表面粗さを測定した。
体は東京精密（株）製の表面粗さ計サーフコムを用いて
表面粗さを測定した。
【００３６】前記平滑な表面を有する不溶性担体の材質
及び形状は特に制限されず、前記に説明したものが示さ
れる。特に好ましい例としてはポリスチレンビーズが挙
げられる。
及び形状は特に制限されず、前記に説明したものが示さ
れる。特に好ましい例としてはポリスチレンビーズが挙
げられる。
【００３７】また、標識抗体の標識物質としては、酵
素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するの
が有利である。酵素としては、ペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ），アルカリフォスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシ
アネート，フイコビリプロテイン等、発光物質としては
イソルシノール，ルシゲニン等、そして放射性物質とし
ては 125Ｉ， 131Ｉ，14Ｃ， 3Ｈ等を用いることができ
るが、これらは例示したものに限らず、免疫学的測定法
に使用し得るものであれば、他のものでも使用できる。
素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するの
が有利である。酵素としては、ペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ），アルカリフォスファターゼ，β−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ、蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシ
アネート，フイコビリプロテイン等、発光物質としては
イソルシノール，ルシゲニン等、そして放射性物質とし
ては 125Ｉ， 131Ｉ，14Ｃ， 3Ｈ等を用いることができ
るが、これらは例示したものに限らず、免疫学的測定法
に使用し得るものであれば、他のものでも使用できる。
【００３８】標識物質が酵素である場合には、その活性
を測定するために基質、必要により発色剤が用いられ
る。
を測定するために基質、必要により発色剤が用いられ
る。
【００３９】酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合
には、基質としてＨ2 Ｏ2 を用い、発色剤として２，
２′−アジノジー［３−エチルベンズチアゾリンスルホ
ン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチ
ル酸、０−フェニレンジアミン、４−アミノアンチピリ
ン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン等、
酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質と
して０−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオ
レセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド），４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
等を用いることができる。
には、基質としてＨ2 Ｏ2 を用い、発色剤として２，
２′−アジノジー［３−エチルベンズチアゾリンスルホ
ン酸］アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチ
ル酸、０−フェニレンジアミン、４−アミノアンチピリ
ン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン等、
酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基質と
して０−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオ
レセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド），４−
メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
等を用いることができる。
【００４０】検体としては、血清，血漿，その他の体液
等を挙げることができる。
等を挙げることができる。
【００４１】本発明のヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白を測定する方法に従い、かかる方法を実施するた
めの、（Ａ）ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白の
アミノ酸配列を認識する抗体を固相抗体試薬及び／又は
標識抗体試薬とする測定試薬、（Ｂ）該測定試薬と用い
るサンドイッチ法に応じて通常用いられる溶解剤，基質
液，発色剤，反応停止剤，標準物質等からなる測定キッ
トを提供することができる。
ロ蛋白を測定する方法に従い、かかる方法を実施するた
めの、（Ａ）ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白の
アミノ酸配列を認識する抗体を固相抗体試薬及び／又は
標識抗体試薬とする測定試薬、（Ｂ）該測定試薬と用い
るサンドイッチ法に応じて通常用いられる溶解剤，基質
液，発色剤，反応停止剤，標準物質等からなる測定キッ
トを提供することができる。
【００４２】
【発明の効果】本発明のヒト・オステオカルシン前駆体
プロ蛋白を認識する抗体を用いた同抗原の測定系は、骨
代謝の骨形成に関する異常疾患の診断、治療に有用と思
われる。
プロ蛋白を認識する抗体を用いた同抗原の測定系は、骨
代謝の骨形成に関する異常疾患の診断、治療に有用と思
われる。
【００４３】
【実施例】以下、実施例により本発明を詳述するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例
中の％は重量％を意味する。
発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例
中の％は重量％を意味する。
【００４４】
【実施例１】 抗体の取得；（１）抗原の作成 （ア）ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白の合成 前記［Ｉ］に示す、ヒト・オステオカルシン前駆体プロ
蛋白を合成した。合成については、ＡＢＩ社、ペプチド
合成機を用いた。ペプチドの名称をＰｒｏＯｓｔ−２６
とした。
蛋白を合成した。合成については、ＡＢＩ社、ペプチド
合成機を用いた。ペプチドの名称をＰｒｏＯｓｔ−２６
とした。
【００４５】（イ）抗原（ＰｒｏＯｓｔ−２６）とキャ
リア蛋白との結合体の作成 キーホール リンペット ヘキシアニン（ＫＬＨ）をキ
ャリア蛋白とし、ＫＬＨと ProOst-26 および水溶性カ
ルボジイミドを用いＫＬＨ−ＰｒｏＯｓｔ−２６結合体
を作成した。３時間反応後、透析し得られた生成物を抗
原として用いた。（２）抗体の作成 ＫＬＨ−ＰｋｒｏＯｓｔ−２６結合体をフロイント完全
アジュバントによりエマルジョンを作成し、家兎を２週
間おきに免疫した。２回目以降は、フロイント不完全ア
ジュバントを用いた。抗体価の上昇を確認し、全採血を
行ない抗血清をEyらの方法（P.L. Ey et al, Immunoche
mistry, 15，429, 436 (1978))により精製した。すなわ
ち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
プロテインＡ−セファロースカラム（ゲル容量５ml）
に、抗血清５mlを流し、洗浄後０．１Ｍクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ３．０）緩衝液を用いて、カラムからＩｇＧ
を精製して抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体を得た。
リア蛋白との結合体の作成 キーホール リンペット ヘキシアニン（ＫＬＨ）をキ
ャリア蛋白とし、ＫＬＨと ProOst-26 および水溶性カ
ルボジイミドを用いＫＬＨ−ＰｒｏＯｓｔ−２６結合体
を作成した。３時間反応後、透析し得られた生成物を抗
原として用いた。（２）抗体の作成 ＫＬＨ−ＰｋｒｏＯｓｔ−２６結合体をフロイント完全
アジュバントによりエマルジョンを作成し、家兎を２週
間おきに免疫した。２回目以降は、フロイント不完全ア
ジュバントを用いた。抗体価の上昇を確認し、全採血を
行ない抗血清をEyらの方法（P.L. Ey et al, Immunoche
mistry, 15，429, 436 (1978))により精製した。すなわ
ち、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した
プロテインＡ−セファロースカラム（ゲル容量５ml）
に、抗血清５mlを流し、洗浄後０．１Ｍクエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ３．０）緩衝液を用いて、カラムからＩｇＧ
を精製して抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体を得た。
【００４６】
【実施例２】 サンドイッチ法ＥＩＡによるヒト・オステオカルシン前
駆体プロ蛋白の測定； （１）抗体固定化ビーズの調製 鏡面のポリスチレン製ビーズ（直径６mm）をよく洗浄し
てから、実施例１で得た抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体の２
０μｇ／mlの濃度を有するＰＢＳ溶液中に４℃の温度で
１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中に、４℃の温度で１昼夜
放置してポストコーティング処理をして、抗ＰｒｏＯｓ
ｔ−２６抗体固定化ビーズを得た。（２）ＨＲＰ標識抗体の調製 抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体の２．０mg／mlのＰＢＳ溶液
１mlに、１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌ
と、４０μｇのペプシンを２０μｌの同緩衝液に溶解し
て加え、３７℃、４時間反応させた。
駆体プロ蛋白の測定； （１）抗体固定化ビーズの調製 鏡面のポリスチレン製ビーズ（直径６mm）をよく洗浄し
てから、実施例１で得た抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体の２
０μｇ／mlの濃度を有するＰＢＳ溶液中に４℃の温度で
１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、１％牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中に、４℃の温度で１昼夜
放置してポストコーティング処理をして、抗ＰｒｏＯｓ
ｔ−２６抗体固定化ビーズを得た。（２）ＨＲＰ標識抗体の調製 抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体の２．０mg／mlのＰＢＳ溶液
１mlに、１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌ
と、４０μｇのペプシンを２０μｌの同緩衝液に溶解し
て加え、３７℃、４時間反応させた。
【００４７】反応終了後、ＰＢＳにて平衡化したセファ
デックスＧ２５カラム（φ２cm×４５cm）を用いて分離
しＦ（ａｂ′）2 を採取した。Ｆ（ａｂ′）2 の１mg／
ml０．０１Ｍリン酸０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．
４）溶液２mlに、ＭＢＳ１０mg／mlの濃度のジメチルホ
ルムアミド溶液５０μｌを添加し、２５℃の温度で３０
分間反応させた。次いでセラデックスＧ−２５を充填し
たカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｐ
Ｂ）（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行い、マレイミド化抗
体と未反応ＭＢＳとを分離した。
デックスＧ２５カラム（φ２cm×４５cm）を用いて分離
しＦ（ａｂ′）2 を採取した。Ｆ（ａｂ′）2 の１mg／
ml０．０１Ｍリン酸０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．
４）溶液２mlに、ＭＢＳ１０mg／mlの濃度のジメチルホ
ルムアミド溶液５０μｌを添加し、２５℃の温度で３０
分間反応させた。次いでセラデックスＧ−２５を充填し
たカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（０．１Ｍ Ｐ
Ｂ）（ｐＨ６．０）でゲル濾過を行い、マレイミド化抗
体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００４８】一方、ＨＲＰの１０mg／mlの０．１Ｍ Ｐ
Ｂ（ｐＨ６．５）溶液２mlにＳ−アセチルメルカプト無
水コハク酸の６０mg／mlジメチルホルムアミド溶液１２
０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。
Ｂ（ｐＨ６．５）溶液２mlにＳ−アセチルメルカプト無
水コハク酸の６０mg／mlジメチルホルムアミド溶液１２
０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。
【００４９】次に０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を８００μｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ１６０μ
ｌ、１Ｍヒドロキシルアミン１．６mlを加え、０℃で４
分間反応させた。その後、反応液をコロジオンバッグに
入れ、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ６．０）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有溶液を用いて、４℃で３日間透析し、チオール化
ＨＲＰを得た。
７．０）を８００μｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ１６０μ
ｌ、１Ｍヒドロキシルアミン１．６mlを加え、０℃で４
分間反応させた。その後、反応液をコロジオンバッグに
入れ、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ６．０）、５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ含有溶液を用いて、４℃で３日間透析し、チオール化
ＨＲＰを得た。
【００５０】次に、マレイミド化抗体２mgとチオール化
ＨＲＰ４mgとを混合し、コロジオンバッグを用いて氷冷
下に４〜１０mg／mlの蛋白濃度になるまで濃縮し、１５
〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル濾過し、Ｈ
ＲＰ標識抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体Ｆ（ａｂ′）2 を得
た。同様にしてＨＲＰ標識抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体Ｉ
ｇＧも得た。（３）サンドイッチＥＩＡ測定系 （１）で調製した抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体Ｆ（ａ
ｂ′）2 固定化ビーズ１個と、精製したヒト・オステオ
カルシン前駆体プロ蛋白（標準物質）を０〜２０ng／ml
の範囲で含有する１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ ＴＢＳ
（ｐＨ８．０）２００μｌと（２）で作成したＨＲＰ標
識抗体の１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ ＴＢＳ（ｐＨ８．
０）溶液２００μｌとを、各試験管に添加して、４℃の
温度で16時間インキュベートした。次に試験管内の溶液
を吸引除去した後、０．０５Ｍ ＴＢＳ（ｐＨ８．０）
で洗浄してから、３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジン塩酸塩０．０２％及びＨ2 Ｏ2 ２．５ｍＭを含
有する０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）
を０．４mlずつ各試験管に加え、２５℃の温度で３０分
間反応させた後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶液を１
mlずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液
を分光光度計を用いて４５０nmの波長における吸収強度
を測定した。これを標準物質濃度０〜２０ng／mlに対応
してプロットした検量線を図１に示した。この結果か
ら、本発明の測定方法を用いれば０．０５ng／mlまで精
度よく測定可能であることがわかる。
ＨＲＰ４mgとを混合し、コロジオンバッグを用いて氷冷
下に４〜１０mg／mlの蛋白濃度になるまで濃縮し、１５
〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロゲルＡｃ
Ａ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル濾過し、Ｈ
ＲＰ標識抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体Ｆ（ａｂ′）2 を得
た。同様にしてＨＲＰ標識抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体Ｉ
ｇＧも得た。（３）サンドイッチＥＩＡ測定系 （１）で調製した抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗体Ｆ（ａ
ｂ′）2 固定化ビーズ１個と、精製したヒト・オステオ
カルシン前駆体プロ蛋白（標準物質）を０〜２０ng／ml
の範囲で含有する１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ ＴＢＳ
（ｐＨ８．０）２００μｌと（２）で作成したＨＲＰ標
識抗体の１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ ＴＢＳ（ｐＨ８．
０）溶液２００μｌとを、各試験管に添加して、４℃の
温度で16時間インキュベートした。次に試験管内の溶液
を吸引除去した後、０．０５Ｍ ＴＢＳ（ｐＨ８．０）
で洗浄してから、３，３′，５，５′−テトラメチルベ
ンジジン塩酸塩０．０２％及びＨ2 Ｏ2 ２．５ｍＭを含
有する０．１Ｍリン酸／クエン酸緩衝液（ｐＨ４．３）
を０．４mlずつ各試験管に加え、２５℃の温度で３０分
間反応させた後、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶液を１
mlずつ加えて酵素反応を停止させた。次いで、この溶液
を分光光度計を用いて４５０nmの波長における吸収強度
を測定した。これを標準物質濃度０〜２０ng／mlに対応
してプロットした検量線を図１に示した。この結果か
ら、本発明の測定方法を用いれば０．０５ng／mlまで精
度よく測定可能であることがわかる。
【００５１】また、ＨＲＰ標識抗ＰｒｏＯｓｔ−２６抗
体Ｆ（ａｂ′）2 と同ＩｇＧを各々用いて測定系を構成
し、標準物質濃度［０〜６ng／ml］に対応してプロット
することによりＮ／Ｓ比を算出した。結果を表１に示し
た。
体Ｆ（ａｂ′）2 と同ＩｇＧを各々用いて測定系を構成
し、標準物質濃度［０〜６ng／ml］に対応してプロット
することによりＮ／Ｓ比を算出した。結果を表１に示し
た。
【００５２】
【表１】
【００５３】
【実施例３】患者検体中のプロ蛋白を測定するにあたっ
て、本発明の方法が定量的な測定系であるか否かを検討
するために、標準物質（合成プロ蛋白）の血清添加回収
試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、回収
率が４００〜８００％と非常に大きな結果となった。そ
の理由として、標準物質に用いている合成プロ蛋白のas
say buffer内の構造と、実際のヒト血清中のプロ蛋白の
構造が異なることが示唆され、同時に、そのプロ蛋白
は、ヒト血清の何らかの成分とinteraction により抗体
に認識されやすい構造になることが推定された。そこ
で、標準物質の中に、交叉反応性のある物質を含まない
血清を加えることにより、回収率が８０〜１２０％と大
巾に改善された結果を得た。その結果を表３に示す。
て、本発明の方法が定量的な測定系であるか否かを検討
するために、標準物質（合成プロ蛋白）の血清添加回収
試験を行った。その結果を表２に示す。その結果、回収
率が４００〜８００％と非常に大きな結果となった。そ
の理由として、標準物質に用いている合成プロ蛋白のas
say buffer内の構造と、実際のヒト血清中のプロ蛋白の
構造が異なることが示唆され、同時に、そのプロ蛋白
は、ヒト血清の何らかの成分とinteraction により抗体
に認識されやすい構造になることが推定された。そこ
で、標準物質の中に、交叉反応性のある物質を含まない
血清を加えることにより、回収率が８０〜１２０％と大
巾に改善された結果を得た。その結果を表３に示す。
【００５４】
【表２】
【００５５】
【表３】
【００５６】
【実施例４】 患者検体中のヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白の
測定；実施例２の測定方法により、各種患者血液検体
（小児，成人）を測定した。結果を図２に示した。図の
ごとく、小児の骨形成不全，甲状腺機能亢進症，思春期
早発症にて高値を示し、糖尿病，原因不明の低身長の一
部および軟骨異栄養症で低値を示した。
測定；実施例２の測定方法により、各種患者血液検体
（小児，成人）を測定した。結果を図２に示した。図の
ごとく、小児の骨形成不全，甲状腺機能亢進症，思春期
早発症にて高値を示し、糖尿病，原因不明の低身長の一
部および軟骨異栄養症で低値を示した。
【００５７】なお、健常成人においては、高値の検体は
認められなかった。
認められなかった。
【００５８】
【実施例５】ヒト・オステオカルシン成熟蛋白のＮ末端
20残基に対する抗体（Ｃｌｏｎ−１２Ｆ）（ＰＣＴ／Ｊ
Ｐ９０／００１５５号を参照のこと）を固相化したもの
と、実施例２において作成したＨＲＰ標識抗ＯｓｔＰｒ
ｏ−２６抗体（Ｆ（ａｂ′）2 ）を用いて実施例２の方
法に準じてサンドイッチ法による免疫学的測定を行っ
た。
20残基に対する抗体（Ｃｌｏｎ−１２Ｆ）（ＰＣＴ／Ｊ
Ｐ９０／００１５５号を参照のこと）を固相化したもの
と、実施例２において作成したＨＲＰ標識抗ＯｓｔＰｒ
ｏ−２６抗体（Ｆ（ａｂ′）2 ）を用いて実施例２の方
法に準じてサンドイッチ法による免疫学的測定を行っ
た。
【００５９】この際、標準物質としては、特願平２−１
５９９０９号に記載された方法に従って作成した形質転
換体ＸＬ１−ＢｌｕｅＦ［ｐＫＯＣ２８］により得られ
た融合蛋白を用いた。その結果得られた検量線を図３に
示す。
５９９０９号に記載された方法に従って作成した形質転
換体ＸＬ１−ＢｌｕｅＦ［ｐＫＯＣ２８］により得られ
た融合蛋白を用いた。その結果得られた検量線を図３に
示す。
【００６０】図３から高感度な測定系が得られたことが
判る。
判る。
【図１】実施例２で作成したヒト・オステオカルシン前
駆体プロ蛋白の測定のための検量線を示す。
駆体プロ蛋白の測定のための検量線を示す。
【図２】本発明の方法によって患者検体中のヒト・オス
テオカルシン前駆体プロ蛋白を測定した結果を示す。
テオカルシン前駆体プロ蛋白を測定した結果を示す。
【図３】実施例５で作成したヒト・オステオカルシン前
駆体プロ成熟蛋白の測定のための検量線を示す。
駆体プロ成熟蛋白の測定のための検量線を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中本 忠克 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内
Claims (7)
- 【請求項１】 サンドイッチ法による免疫学的測定方法
において、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体のいず
れか一方の抗体としてヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ蛋白のアミノ酸配列を認識する抗体を用い、該抗体を
ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を含む抗原と結
合せしめることにより、ヒト・オステオカルシン前駆体
プロ蛋白を含む抗原を測定する方法。 - 【請求項２】 同一のポリクローナル抗体を用いること
を特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 標識抗体が酵素で標識された抗体である
請求項１記載の測定方法。 - 【請求項４】 標識抗体の抗体が、抗体のＦ（ａｂ′）
2 又はＦａｂ′分画であることを特徴とする請求項１記
載の方法。 - 【請求項５】 不溶性担体として鏡面ビーズを用いるこ
とを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 標準物質として、動物血清を加えた合成
ヒト・オステオカルシン前駆体プロ蛋白を用いることを
特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 抗原がヒト・オステオカルシン前駆体プ
ロ成熟蛋白である請求項１記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17476891A JPH05232109A (ja) | 1990-10-04 | 1991-06-20 | ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法 |
| CA 2070433 CA2070433A1 (en) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin |
| EP91917334A EP0504423A1 (en) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin |
| JP3515820A JP2845347B2 (ja) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | オステオカルシンのプロペプチド、プロオステオカルシンを免疫学的に測定するための方法及びキツト |
| PCT/JP1991/001330 WO1992006377A1 (en) | 1990-10-04 | 1991-10-03 | Method and kit for immunoassay of propeptide of osteocalcin and proosteocalcin |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-264935 | 1990-10-04 | ||
| JP26493590 | 1990-10-04 | ||
| JP17476891A JPH05232109A (ja) | 1990-10-04 | 1991-06-20 | ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05232109A true JPH05232109A (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=26496260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17476891A Pending JPH05232109A (ja) | 1990-10-04 | 1991-06-20 | ヒト・オステオカルシンプロ蛋白の測定方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0504423A1 (ja) |
| JP (1) | JPH05232109A (ja) |
| CA (1) | CA2070433A1 (ja) |
| WO (1) | WO1992006377A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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