JPH0638750A

JPH0638750A - マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素およびそれをコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH0638750A
Application number: JP3224814A
Authority: JP
Inventors: Osamu Hara; 修原; Kozo Nagaoka; 行蔵長岡; Richiyaado Hatsuchinson Shii; シー、リチャード、ハッチンソン
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1991-08-09
Filing date: 1991-08-09
Publication date: 1994-02-15

Abstract

(57)【要約】【構成】ストレプトマイセス・マイカロファシエンス
ＳＦー８３７株よりマクロライド抗生物質の３位アシル
化酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡを分離し、これ
を含むハイブリッドプラスミドでストレプトマイセス・
リビダンスを形質転換した。この形質転換株を３位が水
酸基であるマクロライド抗生物質を含む培地で培養する
ことにより、マクロライド抗生物質の３位アシル体を単
離する。【効果】本発明によれば、マクロライド抗生物質の３
位アシル化体の効率的な製造が可能となり、また本発明
は新規なマクロライド抗生物質の造出に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】［発明の背景］

【産業上の利用分野】本発明は、マクロライド抗生物質
の３位をアシル化する酵素およびそれをコードする遺伝
子、この遺伝子を組み込んだベクター、そのベクターで
形質転換された形質転換体およびその形質転換体による
３位アシル化マクロライド抗生物質の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】マクロライド抗生物質（１４員環及び１
６員環）は医薬及び動物薬として広く用いられている有
用な抗生物質である。１６員環マクロライド抗生物質に
は３位がアシル化されているものとアシル化されていな
いものが存在する。大村らによれば（発酵と工業：37,
1171(1979)) 、一般的にマクロライド抗生物質の３位が
アシル化されるとin vivo 血中濃度が上昇する。

【０００３】マクロライド抗生物質の３位のアシル化の
ための方法としては化学的方法が一般的であるが、分子
中の特定の位置を効率良くアシル化することは困難であ
った。さらに生物学的方法としては、３位アシル化能を
有する微生物を用いてアシル化する方法が知られてい
る。

【０００４】一方、遺伝子を利用した製造法に関して
は、マクロライド抗生物質の４”位のアシル化遺伝子の
報告がある(J.K.Epp et al.: Gene, 85, 293(1989)) 。
しかし、マクロライド抗生物質の３位アシル化遺伝子の
報告はない。

【０００５】マクロライド抗生物質で３位がアシル化さ
れていない、すなわち３位が水酸基であるものとして
は、スピラマイシンＩ、ロイコマイシンＡ₁，Ａ₅，Ａ
₇，Ａ₉、Ｖ、ロザミシン、タイロシン等が存在する。
従って、マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素をコ
ードする遺伝子による、これら３位にアシル基を持たな
いマクロライド抗生物質の３位アシル化法を提供するこ
とは、３位にアシル基を持つマクロライド抗生物質の効
率的な製造あるいは新規なマクロライド抗生物質の造出
に重要であるといえる。

【０００６】さらに、マクロライド抗生物質のアシル化
酵素をコードする遺伝子を含むハイブリッドプラスミド
を、マクロライド抗生物質生産菌（例えばミデカマイシ
ン生産菌）に導入すれば、３位のアシル化されたマクロ
ライド抗生物質の生産性の向上が期待できる。

【０００７】［発明の概要］

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、放線菌
を宿主として放線菌由来のプラスミドを用いた系で、３
位にアシル基をもつマクロライド抗生物質の一つである
ミデカマイシン生産菌のストレプトマイセス・マイカロ
ファシエンス（Streptomyces mycarofaciens）ＳＦ−８
３７染色体ＤＮＡからミデカマイシンの３位アシル化酵
素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離すると共
にマクロライド抗生物質の３位アシル化能を有するプラ
スミドの構築に成功した。

【０００９】すなわち、本発明によるマクロライド抗生
物質の３位アシル化酵素は、配列表の配列番号２の配列
で表されるアミノ酸配列を有するものである。

【００１０】また、本発明によるＤＮＡは、配列表の配
列番号２の配列で表されるアミノ酸配列をコードするマ
クロライド抗生物質の３位アシル化酵素遺伝子を含んで
なるもの、である。

【００１１】さらに本発明による３位アシル化マクロラ
イド抗生物質の製造法は、上記ＤＮＡを含むベクターに
よる形質転換体を３位が水酸基であるマクロライド抗生
物質を添加した培地で培養し、または、該形質転換体の
培養物と３位が水酸基であるマクロライド抗生物質とを
接触させ、培養物から３位がアシル化されたマクロライ
ド抗生物質を採取することからなるもの、である。

【００１２】［発明の具体的説明］関連微生物の寄託本発明によるマクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドｐＯＨ２３
（その詳細は後記する）によって形質転換されたストレ
プトマイセス・リビダンス６６(Streptomyces lividan
s) は、ＦＥＲＭＰ−１２３９１として工業微生物院微
生物工業研究所に寄託されている。この微生物の菌学的
性質は導入されているプラスミドｐＯＨ２３に起因する
ものを除けば、宿主微生物のストレプトマイセス・リビ
ダンス６６のそれと変わらない。このストレプトマイセ
ス・リビダンス６６の菌学的性質は、特開昭59- 175889
号公報及びJ. Virology, 9, 258(1972) に開示されてお
り、またこの微生物自体はＦＥＲＭＢＰ−７３７とし
て微工研に寄託されている。

【００１３】また、本発明によるマクロライド抗生物質
の３位アシル化酵素をコードする遺伝子の供与体（採取
源）であるストレプトマイセス・マイカロファシエンス
ＳＦ−８３７はＦＥＲＭーＰ２６２として工業微生物
院微生物工業研究所に寄託されている。また、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションにもＡＴＣＣ２
１４５４として寄託されていて分譲可能な状態にある。

【００１４】マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
およびその遺伝子本発明によるマクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
は、後記する配列表の配列番号２の配列で表されるアミ
ノ酸配列を有するタンパク質である。本発明による酵素
は、いわゆる１６員環マクロライド抗生物質の３位をア
シル化する反応を触媒する。

【００１５】本発明によるＤＮＡは、後記する配列表の
配列番号２の配列で表されるアミノ酸配列をコードする
マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素遺伝子を含ん
でなるものである。

【００１６】ここで「ＤＮＡ」という用語は、非環状の
フラグメントとしての存在の外に、それを組込んだ環状
体、すなわちプラスミド、としての存在を包含するもの
である。

【００１７】本発明によるＤＮＡの典型的な配列は、後
記する配列表の配列番号１の配列中の１２６−１２８６
位の１１６１塩基対からなるものである。

【００１８】タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば
それをコードする塩基配列はいわゆる遺伝暗号表を参照
して容易に定まり、前記したアミノ酸配列をコードする
種々の塩基配列を適宜選択することができる。従って、
本発明による配列表の配列番号２の配列で表されるアミ
ノ酸配列をコードするマクロライド抗生物質の３位アシ
ル化酵素遺伝子とは、その塩基配列が前記した配列表の
配列番号１の配列中の１１６１塩基対からなるもの並び
にその縮重異性体を包含する。ここで、「縮重異性体」
とは、縮重関係にあるコドンが使用されている以外は塩
基配列が同一で同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
を意味するものとする。

【００１９】マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
遺伝子の取得本発明によるＤＮＡは、その塩基配列が定まっているこ
とから、そのＤＮＡを取得するひとつの手段は、核酸合
成の方法に従って製造することである。

【００２０】本発明によるＤＮＡは、また、マクロライ
ド抗生物質の３位アシル化酵素を生産能を持つ菌株（例
えばストレプトマイセス（Ｓ）・マイカロファシエンス
またはその変異株）の遺伝子から切出して得ることがで
きる。このＤＮＡの取得は、遺伝子工学の分野で慣用さ
れている方法により行うことができる。その方法を簡単
に以下に説明するが、更なる具体的方法については後記
実施例を参照されたい。（１）ＤＮＡ供与体ＤＮＡの供与体（採取源）の好ましい例としては、前記
したＳ・マイカロファシエンスＳＦ−８３７株（ＦＥＲ
ＭＰ−２６２）が挙げられる。このＳ・マイカロファ
シエンスの染色体ＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分的に消
化して得られる１２．２キロベース（Ｋｂ）の断片は、
本発明によるＤＮＡを含んでおり、これを利用すること
ができる。このＤＮＡ断片は、図１に示される制限酵素
地図を与える。（２）遺伝子のクローニングＳ・マイカロファシエンスの菌体より、全ＤＮＡをＳＤ
Ｓーフェノール法（M.G.Smith et al.: Methods in Enz
ymology 12、545(1967) ）などの公知の方法で抽出す
る。抽出されたＤＮＡを制限酵素Sau3AIで部分的に消化
すれば、目的の遺伝子含有ＤＮＡ断片が各種のＤＮＡ断
片と共に得られる。このようにして得られるＤＮＡ断片
混合物から目的の遺伝子含有断片を取り出し、しかもこ
れを多量に得るために、慣用されている遺伝子組換え技
術（例えばベクターとしての適当なウィルス性または環
状プラスミドへの組み込み、および、生成ハイブリッド
プラスミドによる宿主菌への形質転換、形質導入または
トランスフェクション）を利用することができる。一般
的な遺伝子組換え技術に関しては、たとえば、高木康敬
著「遺伝子操作実験法」（講談社）を参照することがで
きる。

【００２１】そのような組換え技術の一例を挙げれば、
下記の通りである。すなわち、上記の供与体ＤＮＡをSa
u3AIで部分的に消化する。また、ベクタープラスミドは
別にSau3AIと付着末端を同じくするBamHI 、BglII 、Bc
lI等の制限酵素で切断する。これらの消化物を混合し、
適当なリガーゼたとえばＴ４リガーゼでライゲーション
処理する。これによって、ベクタープラスミドにＳ・マ
イカロファシエンスＳＦ−８３７のＤＮＡ断片を組み込
んだキメラプラスミドを含むプラスミド混合物を得るこ
とができる。ここで使用し得るベクタープラスミドとし
ては、BamHI 、BglII 、BclI等のSau3AIと同じ付着末端
を有していると共に、これらの制限酵素で切断されたと
きに増殖可能な断片を与えるものが一般に適当である。
例えば、放線菌、大腸菌、枯草菌その他の合目的的な微
生物由来のものが好ましく、具体例としては放線菌由来
のｐＩＪ７０２（John Innes研究所より入手可能。文
献：E.Katz et al.: J.General Microbiology，129, 27
03(1983))及びｐＩＪ６８０(John Innes 研究所より入
手可能。文献： D.A.Hopwood et al.: Genetic Manipul
ation of Streptomyces, A laboratory Manual (1985))
などが挙げられる。

【００２２】目的プラスミドを宿主菌から取得するに
は、上記文献の記載の技術その他遺伝子組換えに慣用さ
れているところに従えばよい。

【００２３】次に、得られたプラスミド混合物によって
宿主菌を形質転換する。宿主菌は、用いるベクターの種
類に応じて、放線菌、大腸菌、枯草菌その他の微生物の
中から適宜選択されてよい。就中形質転換効率がよく、
また後記する理由からミデカマイシンに対する感受性の
高いものを用いるのが好ましい。ベクターが放線菌プラ
スミドである場合の宿主菌としては放線菌が適当である
が、好ましい例としてはストレプトマイセス（Ｓ）・リ
ビダンス６６が挙げられる。

【００２４】Ｓ・マイカロファシエンスのＤＮＡ断片を
組み込んだベクターを宿主菌に導入する方法としては、
宿主菌やベクターの種類によって最も効率のよい方法が
選択される。放線菌のプラスミドベクターを使用する場
合は、宿主菌のプロトプラストを形質転換するのが最も
一般的な方法である。形質転換によって得られた組換え
体の選別には、用いるベクターの保有する遺伝的指標、
たとえば、抗生物質耐性、ポック形成(M.J.Bibb et a
l.: Molec.Gen.Genet., 154, 155(1977), Nature274,39
8(1978)) 等が利用できる。

【００２５】ここで、Ｓ・マイカロファシエンスＳＦ−
８３７株のマクロライド抗生物質の３位アシル化酵素を
コードする遺伝子はミデカマイシン（以下、「Mdm 」と
いう場合がある）生合成遺伝子のうちの一つであると推
定される。放線菌の抗生物質生合成遺伝子は抗生物質耐
性遺伝子とクラスターをなしているのが一般的である
(D.A.Hopwood et al.: Microbiology-1985(Ed.L.Leiv
e), 409(1985))からであり、Mdm 耐性遺伝子を選別する
ことにより、マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
をコードする遺伝子を同時に単離することができると考
えられた。従って、前記のようにして得られた組換え体
よりMdm 耐性遺伝子（特開平２ー３１６７６号公報）を
含むものを選別するためには、Mdm 耐性の発現によって
生じたMdm 耐性株の選別を行うのが最も効率的である。
そのためには、まずMdm の宿主菌に対する最小阻止濃度
を調べ、その濃度以上のMdm を含む選択培地で生育する
クローンを選別する。

【００２６】得られたMdm 耐性クローンがマクロライド
抗生物質の３位アシル化酵素をコードする遺伝子を含む
クローンであるのかの確認は、Mdm 耐性クローンを培養
し、３位が水酸基であるマクロライド抗生物質、たとえ
ばスピラマイシンＩ、ロイコマイシンＡ1 、Ａ5 、Ａ7
、Ｖ等のマクロライド抗生物質の３位をアシル化でき
るか否かを調べればよい。

【００２７】得られたMdm 耐性クローン及びマクロライ
ド抗生物質の３位アシル化酵素をコードする遺伝子を含
むクローンを培養し、菌体より公知の方法(Hansen et a
l.:J.Bacteriol.,135, 227(1978))によってプラスミド
を単離することができる。なお、Mdm 耐性及びマクロラ
イド抗生物質の３位アシル化酵素をコードする遺伝子の
クローンであることの確認は、単離したプラスミドを再
び宿主菌に導入して、Mdm 耐性及びマクロライド抗生物
質の３位アシル化活性を調べることによって行えばよ
い。

【００２８】得られたＤＮＡ断片を各種制限酵素によっ
て更に切断し、アガロースゲル電気泳動を行って各断片
の大きさを分析することにより、制限酵素切断地図を作
成することができる。さらに各断片を適当なベクターに
組み込んで、再クローニングを行うことにより、マクロ
ライド抗生物質の３位アシル化酵素をコードする遺伝子
の構造解析を行い、その特性を明らかにすることができ
る。本発明によるマクロライド抗生物質のアシル化酵素
をコードする遺伝子を含むＤＮＡの制限酵素切断地図は
図１に示される通りであることは前記したところであ
る。なお、図１中で、mdmAと表示された領域がミデカマ
イシン耐性遺伝子であり、mdmBと表示された領域がマク
ロライド抗生物質の３位アシル化酵素をコードする遺伝
子であることを示している（その特定の詳細は後記の実
施例参照）。

【００２９】マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
遺伝子の用途および３位アシル化マクロライド抗生物質
の製造法。本発明によるＤＮＡは、マクロライド抗生物
質の３位をアシル化する酵素をコードするものであるこ
とから、このＤＮＡを発現させて該酵素を得て、この酵
素を３位がアシル化されていないマクロライド抗生物質
に作用させることによって、３位アシル化マクロライド
抗生物質を製造することができる。

【００３０】さらに本発明の別の態様によれば、本発明
によるＤＮＡを３位がアシル化されていないマクロライ
ド抗生物質産生微生物に導入し発現させることにより、
３位アシル化マクロライド抗生物質を産生することがで
きる。

【００３１】本発明のさらに別の態様によれば、本発明
によるＤＮＡを３位アシル化マクロライド抗生物質産生
微生物に導入し発現させることにより、３位アシル化マ
クロライド抗生物質の産生能をさらに向上させることが
できる。

【００３２】本発明によるＤＮＡが上のような用途に用
いられるためには、適当なベクターによって宿主細胞に
導入される必要がある。本発明によるＤＮＡと組合わせ
られるベクターは、それが宿主中で本発明によるＤＮＡ
を発現させるものであれば特に限定されず、宿主として
選択される細胞に適したものが選択されて良い。

【００３３】本発明によるＤＮＡが組込まれるべきベク
タープラスミドが放線菌プラスミドである場合の好まし
い例としては、クローニングに関連して記載したものが
挙げられる。好ましいハイブリッドプラスミドの具体例
としては、後記するｐＯＨ２３、ｐＯＨ７７などが挙げ
られる。

【００３４】これらの本発明によるＤＮＡを含むプラス
ミドで宿主菌を形質転換させると、宿主にマクロライド
抗生物質の３位アシル化能を付与することができる。従
って、その形質転換体を、３位が水酸基であるマクロラ
イド抗生物質を含む培地で培養すると、３位がアシル化
されたマクロライド抗生物質を得ることができる。この
ような態様に好ましい宿主菌としては、Ｓ・リビダン
ス、ストレプトマイセス・グリゼウス(Streptomyces gr
iseus)、ストレプトマイセス・グリゼオフスカス(Strep
tomyces griseofuscus) などのストレプトマイセス属細
菌などが挙げられる。

【００３５】また、３位がアシル化されていないマクロ
ライド抗生物質産生能を有する細菌を、本発明によるＤ
ＮＡを含むプラスミドで形質転換すると、３位がアシル
化されたマクロライド抗生物質産生菌とすることができ
る。さらに、３位がアシル化されたマクロライド抗生物
質産生能を有する細菌を、本発明によるＤＮＡを含むプ
ラスミドで形質転換すると、３位アシル化マクロライド
抗生物質の産生能をさらに向上させることができる。以
上のような態様の対象として適当な細菌の例としては、
タイロシン生産菌のストレプトマイセス・フラジエ(Str
eptomyces fradise)、ロイコマイシン生産菌のストレプ
トマイセス・キタサトエンシス(Streptomyces kitasato
ensis)、スピラマイシン生産菌のストレプトマイセス・
アンボファシエンス(Streptomyces ambofaciens)、ミデ
カマイシン生産菌のストレプトマイセス・マイカロファ
シエンス(Streptomyces mycarofacins) 、カルボマイシ
ン生産菌のストレプトマイセス・サーモトレランス(Str
eptomyces themotorerans)などが挙げられる。

【００３６】なお、本発明によるＤＮＡを含むプラスミ
ドによる形質転換は、遺伝子組換えに慣用されていると
ころに従えばよい。

【００３７】

【実施例】実施例１プラスミドｐＯＨ２３の構築Ｓ・マイカロファシエンスＳＦ−８３７株（ＡＴＣＣ２
１４５４）をＴＳＢ培地(Difco Tryptic Soy Broth 3.0
%)５mlに植菌し、30℃で２４時間培養した。これを種菌
としてＳＧＧＰ培地に３％植菌量で植え継いだ。ＳＧＧ
Ｐ培地は、0.4%バクトペプトン、0.4% イーストエキス
トラクト、1.0% グルコース、0.05%MgSO₄・ 7H₂O, 0.
01M KH₂PO₄,pH7.0-7.2(50ml)にグリシン３％を添加
したものである。これを30℃で24時間振とう培養に付
し、10000Xg/10分間の遠心分離で集菌した。この菌体か
らスミス等の公知の方法(Methods in Enzymology, 12,
545(1967))で全ＤＮＡを抽出精製し、ＴＥＳＬバッファ
ー(10mM Tris-HCl pH8.0,1mM EDTA, 2.5mM NaCl) で透
析して供与体ＤＮＡとした。

【００３８】このようにして得た供与体ＤＮＡ10μg
に、総量100 μl の10mM Tris-HCl pH7.5, 50mM NaCl,
10mM MgCl₂, 1mM ジチオスレイトール組成の反応液中
で、制限酵素Sau3AI 0.4単位を加えて37℃で15分間反応
させた。反応液に、ＴＥＳＨバッファー(0.2M Tris-HCl
pH8.0, 20mM EDTA, 50mM NaCl) を飽和させたフェノー
ル溶液を等量加えて１分間振とうした。これを5000Xg/5
分間の遠心分離した後、上層（水層）をパスツールピペ
ットで取り出した。ＤＮＡを含むこの水層部をエチルエ
ーテル抽出に付し、フェノールを除去してから２倍量の
エタノール、1/10量の3M 酢酸ナトリウムを加え、 -80
℃で２時間放置後、5000Xg/10 分間の遠心分離でＤＮＡ
を沈澱させた。このＤＮＡを500 μl のエタノールで洗
浄し、減圧下で乾燥した後、30μl のＴＥＳＬバッファ
ーに溶解した。これを0.8%のアガロースゲル電気泳動に
かけ、泳動後 7-15Kb に相当するＤＮＡをアガロースゲ
ルから切り出した。切り出したゲルを透析チューブに入
れ、泳動槽中で電圧をかけＤＮＡを溶出した。このよう
にして得たＤＮＡ液に、ＴＥＳＨバッファー飽和フェノ
ール溶液を等量加えて１分間振とうした後、5000Xg/5分
間の遠心分離で上層（水層）を取り出した。この水層部
分からエチルエーテル抽出でフェノールを除去してか
ら、２倍量のエタノール、1/10量の3M酢酸ナトリウムを
加え、 -80℃で２時間放置後、5000Xg/10 分間の遠心分
離でＤＮＡを沈澱させた。このＤＮＡを500 μl のエタ
ノールで洗浄し、減圧下で乾燥した後、30μl のＴＥＳ
Ｌバッファーに溶解した。

【００３９】プラスミドｐＩＪ６８０ＤＮＡ1 μg を、
総量20μl の50mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,10mM M
gCl₂, 1mM ジチオスレイトール組成の反応液中で、制
限酵素BamHI １単位を加えて、37℃で２時間反応させ
た。これを70℃で10分間加熱して酵素を失活させてか
ら、1/20量の1M Tris-HCl pH9.0 を添加し、さらにカー
フ・インテスチン・アルカライン・ホスファターゼ(c.
i.a.p.)を２単位加えて、37℃で60分間反応を行った。
この反応液に、ＴＥＳＨバッファーを飽和させたフェノ
ール溶液を等量加えて１分間振とうし、5000Xg/5分間の
遠心分離後、上層（水層）をパスツールピペットで取り
出した。ＤＮＡを含むこの水層部分をエチルエーテル抽
出に付し、フェノールを除去してから２倍量のエタノー
ル、1/10量の3M酢酸ナトリウムを加え、 -80℃で２時間
放置後、5000Xg/10 分間の遠心分離でＤＮＡを沈澱させ
た。このようにして得たＤＮＡを500 μl のエタノール
で洗浄し、減圧下で乾燥してから、20μl のＴＥＳＬバ
ッファーに溶解した。

【００４０】供与体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡを合併
し、70℃で10分間加熱処理し、ついで室温まで徐冷し、
ライゲーションバッファー(0.66M Tris-HCl pH7.6, 66m
M MgCl₂, 0.1M ジチオスレイトール、10mM ATP) 5 μ
l とＴ４リガーゼ10単位とを加え15℃で一晩反応させ
て、ｐＩＪ６８０とＳ・マイカロファシエンスＤＮＡと
の組換え体ＤＮＡを調製した。

【００４１】このＤＮＡによる宿主菌ストレプトマイセ
ス（Ｓ）・リビダンス６６(Lomovskaya et al.: Geneti
cs, 68, 341(1971))の形質転換は、チェイター等の公知
の方法(Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96, 69(19
82))に従って行った。すなわち、50mlのＹＥＭＥ培地(3
4% ショ糖、0.3% イーストエキストラクト、0.5%バク
トペプトン、0.3% マルトエキストラクト、1% グルコ
ース、5mM MgCl₂、0.5% グリシン、pH7.0)にＳ・リビ
ダンス６６を接種して30℃で36時間振とう培養を行っ
た。10000Xg の遠心分離で菌糸を集めて、10.3％ショ糖
溶液で１回洗浄した後、10mlのＰ培地(0.3M ショ糖、1.
4mM K₂SO₄, 10mM MgCl₂, 0.4mM KH₂PO₄, 25mM
CaCl₂, 25mM ＴＥＳ緩衝液、pH7.2, 1/500量微量元
素溶液）に懸濁させた（微量元素溶液の組成（１リット
ル中： 40mg ZnCl₂, 200mg FeCl₃・ 6H₂O, 10mg CuCl
₂・ 2H₂O, 10mg MnCl₂・ 4H₂O, 10mg Na₂B ₄O ₇・
10H ₂O, 10mg (NH₄)6Mo₇O ₂₄・ 4H₂O)) 。

【００４２】ついで、最終濃度１mg/ml になるように卵
白リゾチームを加え、30℃に30分間保温してプロトプラ
ストを形成させ、プロトプラスト化しなかった菌糸は綿
濾過で除去した。800Xg/7 分間の遠心分離によってプロ
トプラストを集め、Ｐ培地で１回洗浄してから20mlのＰ
培地に懸濁させた。プロトプラスト液100 μl 、3/2濃
度に調製したＰ−マレイン酸緩衝液(2.5% ショ糖、1.4m
M K₂SO₄, 1/500 量微量元素溶液、100mM CaCl₂, 50
mM Tris-マレイン酸、pH8.0 ）100 μl 、組換え体ＤＮ
Ａ溶液50μl 及び375 μl のポリエチレングリコール溶
液（ポリエチレングリコール＃1000 33%/ Ｐ−マレイン
酸緩衝液）を混合し、１分間室温に放置した。このプロ
トプラスト液を0.1ml ずつ、６枚の直径９cmの円形プラ
スチック製ペトリ皿に調製したＲ２ＹＥ寒天培地(0.3M
ショ糖、1.4mM K₂SO₄, 50mMMgCl₂、1% グルコー
ス、0.01% カザミノ酸、1/500 量微量元素溶液、0.4m
M KH₂PO₄, 20mM CaCl₂, 0.3% プロリン、 25mM Ｔ
ＥＳ緩衝液、pH7.2, 5mMNaOH, 0.5% イーストエキスト
ラクト、2.2% 寒天) にそれぞれ塗布して、30℃で１日
培養した後、チオストレプトン200 μg/mlを含む滅菌水
１mlを重層し、さらに４日間培養した。

【００４３】プロトプラストから再生し胞子を着生した
菌を、ミデカマイシン(Mdm) 100 μg/mlを含むＮＡ培地
(Difco Nutrient Agar 2.3%)にビロード布を用いてそれ
ぞれレプリカして、30℃で２日間培養した。この結果、
３個のMdm 耐性クローン株が得られた。選択培地上のこ
れらのクローンをそれぞれエーゼでかき取り、ガラス製
ポッターホモジナイザーを用いて滅菌水0.1-0.2ml に分
散させ、これをＲ２ＹＥ培地に塗布して30℃で５日間培
養した。

【００４４】得られた３株のMdm 耐性Ｓ・リビダンス６
６をチオストレプトン5 μg/ml含有のＳ１培地(2% ソル
ブルスターチ、1% ポリペプトン、0.3% 肉エキス、0.
05%K₂HPO ₄、pH7.0)10mlに植菌し、28℃で２日間培養
した。これを種菌として、スピラマイシンＩ 100μg/ml
含有のＲ２ＹＥ培地（Ｒ２ＹＥ寒天培地より寒天を除い
たもの）80mlに4ml 植え継いだ。28℃で３日間培養し、
遠心分離で菌体を除き、濾液を水酸化ナトリウムでpH8.
5 に調整後、等量の酢酸エチルで抽出した。抽出液を濃
縮乾固し、800 μl のメタノールに溶解した。そのサン
プル１μl をスピラマイシンＩをスタンダードとしてＴ
ＬＣプレート( メルク社製 Silicagel plate Art.571
5)上にスポットし、クロロホルム：メタノール＝５：１
の展開溶媒で展開した。そのうち１株がスピラマイシン
Ｉのスポットより高いスポットを示した。ついで、ミク
ロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)を検定菌と
してバイオオートグラフィーを行った。37℃で一晩培養
後、阻止円を比較したところ上記１株がスピラマイシン
Ｉによる阻止円より上に阻止円を示した。

【００４５】得られたマクロライド抗生物質の３位アシ
ル化能を持つと推定された１株のMdm 耐性Ｓ・リビダン
ス６６を80mlのＹＥＭＥ培地に接種し、30℃で２日間振
とう培養した菌体から、ハンセン等による公知の方法
(J.Bacteriol., 135, 227(1978)) に従ってプラスミド
を抽出した。このプラスミドにより再びＳ・リビダンス
６６を形質転換させたところ、マクロライド抗生物質の
３位アシル化活性及びMdm 耐性が発現した。得られたプ
ラスミドを各種制限酵素で切断して詳しく調べたとこ
ろ、１２. ２Kbの断片がプラスミドｐＩＪ６８０に組み
込まれていた（図１）。このプラスミドをｐＯＨ２３と
した（図２）。

【００４６】実施例２プラスミドｐＯＨ７７の構築プラスミドｐＯＨ７７（図３）をｐＩＪ６８０とｐＯＨ
２３から次のように調製した。

【００４７】実施例１で調製したプラスミドｐＯＨ２３
のＤＮＡ５μg に、総量50μl の50mM Tris-HCl pH7.5,
100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM ジチオスレイトール
組成の反応液中で制限酵素BamHI １０単位を加えて、37
℃で２時間反応させた。これを0.8%アガロースゲル電気
泳動にかけ、泳動後、mdmB遺伝子を含む５. ６ＫｂのBa
mHI 断片とmdmA遺伝子を含む1.4 ＫｂのBamHI 断片をゲ
ルから切り出した。ＤＮＡ回収用フィルター付き遠心チ
ューブ（宝酒造社製）を用いて断片を精製し、それぞれ
30μl のＴＥＳＬバッファーに溶解した。

【００４８】プラスミドｐＩＪ６８０のＤＮＡ１μg を
実施例１と同様に制限酵素BamHI で切断し、c.i.a.p.処
理した。これとmdmB遺伝子を含む５．６ＫｂのBamHI 断
片を実施例１と同じ方法でライゲーションし、Ｓ・リビ
ダンス６６に形質転換した。Ｒ２ＹＥ寒天培地上に生育
したチオストレプトン耐性の形質転換コロニーをネオマ
イシン50μg/mlを含んだＮＡ培地に楊枝で移した。ｐＩ
Ｊ６８０のBamHI 部位に断片が挿入されるとネオマイシ
ンに感受性となるので、ネオマイシン感受性株を選択し
た。実施例１と同じ方法でプラスミドを調製するとプラ
スミドｐＯＨ７２（１０. ９Ｋｂ）が得られた（図
４）。

【００４９】次に、プラスミドｐＯＨ７２ＤＮＡ５μg
に、総量50μl の10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM MgCl₂,
1mM ジチオスレイトール組成の反応液中で制限酵素SstI
10単位を加え、37℃で２時間反応させた。これを０．８
% アガロースゲル電気泳動にかけ、泳動後、mdmB遺伝子
を含む３．３ＫｂのSstI断片をゲルから切り出し、ＤＮ
Ａ回収用フィルター付き遠心チューブ（宝酒造社製）を
用いて断片を精製し、それぞれ30μl のＴＥＳＬバッフ
ァーに溶解した。

【００５０】プラスミドｐＩＪ６８０のＤＮＡ１μg を
実施例１と同様に制限酵素SstIで切断し、c.i.a.p.処理
した。これとmdmB遺伝子を含む３．３ＫｂのSstI断片を
実施例１と同じ方法でライゲーションし、Ｓ・リビダン
ス６６に形質転換した。Ｒ２ＹＥ寒天培地上に生育した
チオストレプトン耐性コロニーから、実施例１と同じ方
法でプラスミドｐＯＨ７６（８．３Ｋｂ）を調製した
（図５）。

【００５１】さらにプラスミドｐＯＨ７６、１μg に、
総量20μl の50mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl, 10mM M
gCl₂, 1mM ジチオスレイトール組成の反応液中でBamHI
１単位を加えて、37℃で２時間反応させた。これを70
℃で10分間加熱し、制限酵素を失活させた後、さきに切
りだしたmdmA遺伝子を含む１．４ＫｂのBamHI 断片とと
もにライゲーションした。これをＳ・リビダンス６６に
形質転換し、Ｒ２ＹＥ寒天培地上に生育したチオストレ
プトン耐性株からMdm 耐性株を選択した。そして実施例
１と同じ方法でプラスミドｐＯＨ７７（９．７Ｋｂ）を
調製した（図２）。ｐＯＨ７７を持つＳ．リビダンス６
６の形質転換株はマクロライド抗生物質の３位アシル化
活性を持っていた。

【００５２】実施例３ mdmB遺伝子の限定。プラスミドｐＯＨ７７の結果より、mdmB遺伝子は３．１
ｋＢのSstI/BamHI断片中に存在することが判明した。さ
らにmdmB遺伝子を限定するために、実施例２で調製した
プラスミドｐＯＨ７６を用いて、プラスミドｐＯＨ９１
（９．７Ｋｂ）を構築した（図６）。すなわち、プラス
ミドｐＯＨ７６、１μg に、総量20μlの50mM Tris-HCl
pH7.5, 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM ジチオスレイ
トール組成の反応液中でBglII １単位を加えて、37℃で
２時間反応させた。これを70℃で10分間加熱し、制限酵
素を失活させた後、さきに切りだしたmdmA遺伝子を含む
１．４ＫｂのBamHI 断片とともにライゲーションした。
これをＳ・リビダンス６６に形質転換し、Ｒ２ＹＥ寒天
培地上に生育したチオストレプトン耐性株からMdm耐性
株を選択した。そして実施例１と同じ方法でプラスミド
ｐＯＨ９１（９．７Ｋｂ）を調製した。

【００５３】ｐＯＨ９１を持つＳ．リビダンス６６の形
質転換株はマクロライド抗生物質の３位アシル化活性を
示さなかった。このことはmdmB遺伝子は３．１ＫｂのSs
tI/BamHI断片のBglII 部位が必須であることを示してい
た。

【００５４】実施例４本発明のmdmB遺伝子含有のプラ
スミドで形質転換した微生物による３ーアシル化スピラ
マイシンＩの生産実施例２で得られたプラスミドｐＯＨ７７を持つＳ・リ
ビダンス６６の形質転換株を、Ｒ２ＹＥ寒天培地から１
白金耳、10μg/mlのチオストレプトンを含む10mlの種母
培地（Ｓ１培地）に接種し、28℃で２日間振とう培養し
た。ついで100μg/mlのスピラマイシンＩを含むＲ２Ｙ
Ｅ培地80mlずつを分注した500ml 容三角フラスコ１０本
に植菌し、28℃で３日間振とう培養した。培養終了後、
濾過助材として珪藻土を加えて濾過し、濾液700ml を得
た。濾液をｐＨ８．５に調整後、活性成分を酢酸エチル
700ml で抽出し、酢酸エチル層を濃縮乾固すると油状物
質80.4mgが得られた。この油状物質を分取用ＴＬＣ（展
開系：クロロホルムーメタノール、5:1 ）で精製する
と、スピラマイシンII（３ーアセチルスピラマイシン
Ｉ）とスピラマイシンIII （３ープロピオニルスピラマ
イシンＩ）の混合物（40.0mg) が得られ、スピラマイシ
ンＩ（4.6mg)が回収された。さらに、このスピラマイシ
ンIIとスピラマイシンIII の混合物（40.0mg) を再度分
取用ＴＬＣ（展開系：ヘキサン：アセトン、１：１）で
精製すると、スピラマイシンII（6.6 mg）とスピラマイ
シンIII （11.5mg）が得られた。

【００５５】単離したスピラマイシンIIの物性値（１）マススペクトル (SI-MS) : m/z 885 (M+1)⁺ （２） ¹ＨＮＭＲスペクトル (400 MHz, CDCl₃） δ(ppm): 5.15 (br d, 3-H), 2.29(s, 3-OCOCH₃), 3.5
4 (s, 4-OCH ₃), 5.63 ( dd, 10-H), 6.57 (dd, 11-
H), 6.08 (ddd, 12-H), 5.74 (ddd, 13-H), 1.27(d,16-
H₃), 9.67 (br s, 18-H), 1.00 (d,19-H₃), 4.43 (d,
1'-H), 5.08 (br d, 1"-H), 4.41 (br dd, 1"'-H) 単離したスピラマイシンIII の物性値（１）マススペクトル (SI-MS) : m/z 899 (M+1)⁺ （２） ¹ＨＮＭＲスペクトル (400 MHz, CDCl₃) δ(ppm): 5.16 (br d, 3-H), 1.23 (t, 3-COCH₂CH₃),
2.52 および2.61 (dq,3-OCOCH₂CH₃), 3.53 (s,4-OCH
₃), 5.63 (dd, 10-H), 6.58 (dd,11-H),6.08(ddd, 12-
H), 5.75 (ddd, 13-H), 1.27 (d, 16-H₃),9.66 (br s,
18-H), 1.00(d,19-H ₃), 4.42 (d, 1'-H), 5.08 (br
d, 1"-H), 4.44 (br d, 1"'-H)

【００５６】実施例５配列の決定プラスミドｐＯＨ２３のＤＮＡ５μg に、総量50μl の
50mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM
ジチオスレイトール組成の反応液中で制限酵素BamHI10
単位とBglII10 単位を加えて、37℃で２時間反応させ
た。これを0.8%アガロース電気泳動にかけ３．６ＫｂBa
mHI/BglII 断片及び２．０ＫｂBamHI/BglII 断片を実施
例２と同じ方法で切りだした。

【００５７】これらの断片をｐＴＺ１８Ｕベクター（東
洋紡績株式会社製）のBamHI 部位に両向きに組み込ん
だ。これらのプラスミドからKilo-Sequence 用Deletion
Kit（宝酒造株式会社製）を用いてそれぞれ欠失プラス
ミドを調製した。次に、これらの欠失プラスミドを、大
腸菌JM109 （Escherichia coli JM109、宝酒造株式会社
製）のコンピテントセルに形質転換し、さらにヘルパー
ファージＭ１３Ｋ０７を用いてＤＮＡ塩基配列決定用の
１本鎖ＤＮＡを調製した。

【００５８】塩基配列の決定はＤＮＡシークエンサー
（アプライドバイオシステムズ株式会社製）を用いて
行った。その結果、SalI部位からBamHI 部位の２３８１
ベースの塩基配列が決定された。その塩基配列は後記す
る配列表の配列番号１の配列に示される通りである。

【００５９】決定された塩基配列をもとにオープンリー
デイングフレーム（ＯＲＦ）を調べた。Ｂｉｂｂらの報
告(Gene, 30, 157(1984)) にしたがって検討した結果、
配列表の配列番号１の配列に示したＯＲＦを見い出し
た。このＯＲＦは実施例３で示したBglII 部位を含んで
いた。mdmBは配列表の１２６番目のＡＴＧから始まり１
２８７番目のＴＧＡに終わる。その塩基配列に相当する
アミノ酸配列も決定された。その配列は配列表の配列番
号１の配列中の１２６−１２８８位に対応するアミノ酸
配列として示されており、また、同一のアミノ酸配列は
配列番号２の配列として示されている。

【００６０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：2381 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ストレフ゜トマイセス・マイカロファシエンス(Streptomyces mycaro
faciens) 株名：SF- 837 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：126..1286 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GTCGACCGTT GACTGTGTCA TCTCCGCGTT GTCGGCCGAA TTGCTCGCGC CGCAGACTGC 60 CCTGACCGTT TCTCTGCGTT CACCCGGCCT CACTTTTCCC CCTCCAGAAG GAGAGCGAGC 120 AATCG ATG CCG CCT CGT GTC GTC CGC CTG CCG TCG CTC ACC GGC CTT CGC 170 Met Pro Pro Arg Val Val Arg Leu Pro Ser Leu Thr Gly Leu Arg 1 5 10 15 TGG TTC GCG GCC TTA GCG GTA TTC GCC TGT CAC ATT GCC CAG CAG CAA 218 Trp Phe Ala Ala Leu Ala Val Phe Ala Cys His Ile Ala Gln Gln Gln 20 25 30 TTC TTC GCT GAC CAG CAG GTC GGA ACC GCG CTG CTA CAC ATC ACC ACG 266 Phe Phe Ala Asp Gln Gln Val Gly Thr Ala Leu Leu His Ile Thr Thr 35 40 45 CTC GGT TCG ATC GCG GTC TCG GTC TTC TTC CTG CTC AGC GGT TTT GTT 314 Leu Gly Ser Ile Ala Val Ser Val Phe Phe Leu Leu Ser Gly Phe Val 50 55 60 CTG GCG TGG TCG GCC CGT GAC AAG GAC TCT GTC ACG ACT TTC TGG CGG 362 Leu Ala Trp Ser Ala Arg Asp Lys Asp Ser Val Thr Thr Phe Trp Arg 65 70 75 CGC CGA TTT GCC AAG ATC TAC CCG CTG CAC CTC GTA ACT TTC CTC ATA 410 Arg Arg Phe Ala Lys Ile Tyr Pro Leu His Leu Val Thr Phe Leu Ile 80 85 90 95 GCG GGC GTC ATC ATT TTC TCC CTC GCG GAG CCG ACT CTG CCC GGT GGT 458 Ala Gly Val Ile Ile Phe Ser Leu Ala Glu Pro Thr Leu Pro Gly Gly 100 105 110 TCC GTA TGG GAC GGT CTG GTT CCC GAT CTT CTG CTG GTG CAG TCC TGG 506 Ser Val Trp Asp Gly Leu Val Pro Asp Leu Leu Leu Val Gln Ser Trp 115 120 125 CTT CCC GAA CCC ACG ATT ATC GCC GGG TTC AAC ACC CCG AGT TGG TCG 554 Leu Pro Glu Pro Thr Ile Ile Ala Gly Phe Asn Thr Pro Ser Trp Ser 130 135 140 CTC TCC TGT GAA TTC GCT TTC TAT CTG ACG TTC CCG CTG TGG TAT CGG 602 Leu Ser Cys Glu Phe Ala Phe Tyr Leu Thr Phe Pro Leu Trp Tyr Arg 145 150 155 CTG GTG CGG AAG ATT CCG GTA CGG CGG CTG TGG TGG TGT GCC GCC GGT 650 Leu Val Arg Lys Ile Pro Val Arg Arg Leu Trp Trp Cys Ala Ala Gly 160 165 170 175 ATT GCC GCG GCC GTG ATT TGT GTA CCG TTC GTG ACG AGC CAG TTC CCG 698 Ile Ala Ala Ala Val Ile Cys Val Pro Phe Val Thr Ser Gln Phe Pro 180 185 190 GCG AGC GCC GAG ACG GCC CCC GGG ATG CCG CTC AAC GAG CTG TGG TTC 746 Ala Ser Ala Glu Thr Ala Pro Gly Met Pro Leu Asn Glu Leu Trp Phe 195 200 205 GCC TGC TGG CTG CCG CCG GTG CGG ATG CTG GAG TTC GTC CTC GGC ATC 794 Ala Cys Trp Leu Pro Pro Val Arg Met Leu Glu Phe Val Leu Gly Ile 210 215 220 GTG ATG GCG CTG ATC CTG CGC ACG GGC GTG TGG CGG GGC CCC GGA GTG 842 Val Met Ala Leu Ile Leu Arg Thr Gly Val Trp Arg Gly Pro Gly Val 225 230 235 GTG TCC TCC GCG CTG CTG CTC GCC GCG GCC TAC GGC GTC ACC CAG GTG 890 Val Ser Ser Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Val Thr Gln Val 240 245 250 255 GTG CCC CCG ATG TTC ACC ATC GCC GCG TGC TCC ATC GTG CCC GCC GCC 938 Val Pro Pro Met Phe Thr Ile Ala Ala Cys Ser Ile Val Pro Ala Ala 260 265 270 CTG CTG ATC ACC GCT TTG GCC AAT GCC GAT GTG CAG GGC CTG CGC ACC 986 Leu Leu Ile Thr Ala Leu Ala Asn Ala Asp Val Gln Gly Leu Arg Thr 275 280 285 GGT TTG CGC TCG GCG GTA CTG GTG CGG CTG GGC GAG TGG TCC TTC GCC 1034 Gly Leu Arg Ser Ala Val Leu Val Arg Leu Gly Glu Trp Ser Phe Ala 290 295 300 TTC TAT CTG GTT CAC TTC ATG GTC ATC CGC TAC GGG CAC CGG CTG ATG 1082 Phe Tyr Leu Val His Phe Met Val Ile Arg Tyr Gly His Arg Leu Met 305 310 315 GGC GGC GAA CTG GGC TAC GCG CGC CAG TGG AGC ACC GCG AGC GCG GGA 1130 Gly Gly Glu Leu Gly Tyr Ala Arg Gln Trp Ser Thr Ala Ser Ala Gly 320 325 330 335 GCG CTG GCC CTG GCG ATG CTG GCG GTC GCG ATC GTG GCC GGT GGG CTG 1178 Ala Leu Ala Leu Ala Met Leu Ala Val Ala Ile Val Ala Gly Gly Leu 340 345 350 CTG CAC ACC GTC GTG GAG AAC CCC TGC ATG CGT CTG CTC GGC CGC CGC 1226 Leu His Thr Val Val Glu Asn Pro Cys Met Arg Leu Leu Gly Arg Arg 355 360 365 CGC CCG GTC GCC ACC GCA CCA GAC CCC GCA ACC GAC GAG GCT CCG AAA 1274 Arg Pro Val Ala Thr Ala Pro Asp Pro Ala Thr Asp Glu Ala Pro Lys 370 375 380 CTC ACC CGC GCC TGAC GTCACCGAAC AAGCTTTCCT GGAAAGGACT GTGAGCGTGG 1330 Leu Thr Arg Ala 385 387 CAGACCAGAC CACTCTCAGC CCCGCGCTGC TGGACTACGC CCGAAGCGTC GCTCTGCGGG 1390 AAGACGGCCT GCTGCGGGAG CTGCACGACA TGACCGCGCA GCTCCCCGGG GGGCGTGCCA 1450 TGCAGATCAT GCCCGAGGAG GCGCAGTTCC TCGGTCTGCT GATCCGGCTC GTCGGCGCCC 1510 GGCGGGTGCT GGAGATCGGG ACGTTCACCG GTTACAGCAC GCTGTGCATG GCACGGGCAC 1570 TGCCTGCCGG CGGCCGGATC GTCACCTGCG ACATCAGCGA CAAGTGGCCC GGGATTGGCG 1630 CCCCGTTCTG GCAACGCGCC GGGGTGGACG GCCTGATCGA CCTGCGCATC GGCGACGCCG 1690 CCCGGACACT CGCCGAGCTG CGGGAGCGCG ACGGGGACGG CGCGTTCGAC CTGGTCTTCG 1750 TCGACGCCGA CAAGGCCGGG TACTTGCACT ACTACGAGCA GGCGCTGGCA CTGGTCCGCC 1810 CCGGCGGGCT GGTGGCGATC GACAACACCC TGTTCTTCGG CCGAGTGGCC GACCCGGCCG 1870 CCGACGACCC CGACACAGTG GCCGTGCGCA CCCTCAACGA CCTGCTGCGC GACGACGAGC 1930 GCGTGGACAT CGCTCTGCTG ACCGTCGCCG ATGGGATCAC CCTCGCCCGA CGACGGGAGT 1990 AAGTACCGCG ACCCGGTGCC GCGGCCGACG ACTCGGACGC CTCGCTGAAG AGGGACGACA 2050 GTTGCTGTCG ACAGGATGGT TCCGGGCCGG TGCTCAGGGC CCGTCCCCAC TCTGGTATGC 2110 GCCGCCGGTA TCGGCGGGGT GTGAAGCCCG GAGGAGAAAC CCAAGGGCTC CGCGGAGGAG 2170 AAGGCCGGCG TCTCCGCTGG CGTTCCGGAC AACCGGCCGG ATACGGGCTT CTTGCCCGGC 2230 CCCGAAAGGG TGCTTACGTG GGTCAGGTGG CCTGCGAGGA ACCGATGAAC ATCAAATGCC 2290 GGAATCCAAG GACAAGTTGG ACACCATGAC GACCGCAACC ACCACGGCAT GCTGCTGATC 2350 AAGCCGAGTA GAGCGGCCGT GCGACGGATC C 2381

【００６１】配列番号：２配列の長さ：387 配列の型：アミノ酸配列の種類：タンパク質配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ配列 Met Pro Pro Arg Val Val Arg Leu Pro Ser Leu Thr Gly Leu Arg Trp 1 5 10 15 Phe Ala Ala Leu Ala Val Phe Ala Cys His Ile Ala Gln Gln Gln Phe 20 25 30 Phe Ala Asp Gln Gln Val Gly Thr Ala Leu Leu His Ile Thr Thr Leu 35 40 45 Gly Ser Ile Ala Val Ser Val Phe Phe Leu Leu Ser Gly Phe Val Leu 50 55 60 Ala Trp Ser Ala Arg Asp Lys Asp Ser Val Thr Thr Phe Trp Arg Arg 65 70 75 80 Arg Phe Ala Lys Ile Tyr Pro Leu His Leu Val Thr Phe Leu Ile Ala 85 90 95 Gly Val Ile Ile Phe Ser Leu Ala Glu Pro Thr Leu Pro Gly Gly Ser 100 105 110 Val Trp Asp Gly Leu Val Pro Asp Leu Leu Leu Val Gln Ser Trp Leu 115 120 125 Pro Glu Pro Thr Ile Ile Ala Gly Phe Asn Thr Pro Ser Trp Ser Leu 130 135 140 Ser Cys Glu Phe Ala Phe Tyr Leu Thr Phe Pro Leu Trp Tyr Arg Leu 145 150 155 160 Val Arg Lys Ile Pro Val Arg Arg Leu Trp Trp Cys Ala Ala Gly Ile 165 170 175 Ala Ala Ala Val Ile Cys Val Pro Phe Val Thr Ser Gln Phe Pro Ala 180 185 190 Ser Ala Glu Thr Ala Pro Gly Met Pro Leu Asn Glu Leu Trp Phe Ala 195 200 205 Cys Trp Leu Pro Pro Val Arg Met Leu Glu Phe Val Leu Gly Ile Val 210 215 220 Met Ala Leu Ile Leu Arg Thr Gly Val Trp Arg Gly Pro Gly Val Val 225 230 235 240 Ser Ser Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ala Tyr Gly Val Thr Gln Val Val 245 250 255 Pro Pro Met Phe Thr Ile Ala Ala Cys Ser Ile Val Pro Ala Ala Leu 260 265 270 Leu Ile Thr Ala Leu Ala Asn Ala Asp Val Gln Gly Leu Arg Thr Gly 275 280 285 Leu Arg Ser Ala Val Leu Val Arg Leu Gly Glu Trp Ser Phe Ala Phe 290 295 300 Tyr Leu Val His Phe Met Val Ile Arg Tyr Gly His Arg Leu Met Gly 305 310 315 320 Gly Glu Leu Gly Tyr Ala Arg Gln Trp Ser Thr Ala Ser Ala Gly Ala 325 330 335 Leu Ala Leu Ala Met Leu Ala Val Ala Ile Val Ala Gly Gly Leu Leu 340 345 350 His Thr Val Val Glu Asn Pro Cys Met Arg Leu Leu Gly Arg Arg Arg 355 360 365 Pro Val Ala Thr Ala Pro Asp Pro Ala Thr Asp Glu Ala Pro Lys Leu 370 375 380 Thr Arg Ala 385 387

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるマクロライド抗生物質の３位アシ
ル化酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図。

【図２】プラスミドｐＯＨ２３の制限酵素地図。

【図３】プラスミドｐＯＨ７７の制限酵素地図。

【図４】プラスミドｐＯＨ７２の制限酵素地図。

【図５】プラスミドｐＯＨ７６の制限酵素地図。

【図６】プラスミドｐＯＨ９１の制限酵素地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/08 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者シー、リチャード、ハッチンソンアメリカ合衆国ウィスコンシン州 53706 マジソン、ノース・チャーター・ストリート425 ユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン、スクール・オブ・ファーマシー内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号２の配列で表されるアミ
ノ酸配列を有する、マクロライド抗生物質の３位アシル
化酵素。
【請求項２】配列表の配列番号２の配列で表されるアミ
ノ酸配列をコードするマクロライド抗生物質の３位アシ
ル化酵素遺伝子を含んでなる、ＤＮＡ。
【請求項３】マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素
遺伝子が、配列表の配列番号１の配列中の１２６−１２
８６位の塩基配列で表される、請求項２記載のＤＮＡ。
【請求項４】請求項２または３記載のＤＮＡを含んでな
る、ベクター。
【請求項５】請求項４記載のベクターで形質転換され
た、形質転換体。
【請求項６】宿主がストレプトマイセス・リビダンスで
ある、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】請求項５または６に記載の形質転換体を３
位が水酸基であるマクロライド抗生物質を添加した培地
で培養し、または、該形質転換体の培養物と３位が水酸
基であるマクロライド抗生物質とを接触させ、培養物か
ら３位がアシル化されたマクロライド抗生物質を採取す
ることからなる、３位アシル化マクロライド抗生物質の
製造法。