ES2276427T3 - Aislamiento de los genes de biosintesis de seudo-oligosacaridos de streptomyces glaucescens gla.o y su uso. - Google Patents
Aislamiento de los genes de biosintesis de seudo-oligosacaridos de streptomyces glaucescens gla.o y su uso. Download PDFInfo
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UNA MOLECULA DE DNA QUE CONTIENE GENES PARA LA BIOSINTESIS DE ACARBOSA Y PSEUDO - OLIGOSACARIDOS HOMOLOGOS; INICIADOR DE OLIGONUCLEOTIDO PARA LA AMPLIFICACION POR PCR DE LA MOLECULA; PROTEINAS QUE SE OBTIENEN POR LA EXPRESION DE LOS GENES LOCALIZADOS EN LA MOLECULA; VECTORES Y CELULAS HOSPEDADORAS QUE CONTIENEN LA MOLECULA DE DNA ANTES CITADA; PROTEINAS QUE SE CODIFICAN MEDIANTE LA MOLECULA DE DNA; PROTEINAS QUE SE EXPRESAN MEDIANTE LOS CITADOS VECTORES EN LAS CITADAS CELULAS HOSPEDADORAS; PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE ACARBOSA MEDIANTE LA INCLUSION Y/O EXCLUSION DE LOS GENES CARACTERIZADOS EN LOS CORRESPONDIENTES ORGANISMOS HOSPEDADORES; PROCEDIMIENTO PARA COMPLETAR EL CONJUNTO GENICO DE LOS GENES DE BIOSINTESIS PARA LA ACARBOSA; PROCEDIMIENTO PARA EL AISLAMIENTO DE LOS CONJUNTOS DE GENES ANALOGOS EN OTROS ORGANISMOS COMO STREPTOMYCES GLAUCESCENS GLA.O, PROCEDIMIENTO PARA HACER MUTAR LOS PROMOTORES DE LOS GENES ENDOGENOS DE BIOSINTESIS DE LA ACARBOSA PARA AUMENTAR EL RENDIMIENTO DE ACARBOSA, UTILIZACION DE STREPTOMYCES GLAUCESCENS PARA LA FABRICACION DE ACARBOSA, Y PARA LA PREPARACION DE MUTANTES OPTIMIZADOS DE STREPTOMYCES GLAUCESCENS GLA.O EN RELACION CON LA PRODUCCION DE ACARBOSA.
Description
Aislamiento de los genes de biosíntesis de
seudo-oligosacáridos de Streptomyces
glaucescens GLA.O y su uso.
La presente invención se refiere al aislamiento
de genes que codifican enzimas para la biosíntesis de inhibidores
de la \alpha-amilasa, los denominados
seudo-oligosacáridos. En particular, se trata de
genes procedentes de la cepa de estreptomicetos, Streptomyces
glaucescens GLA.O (DSM 40716). Además, describe el uso de estos
genes para producir acarbosa y sustancias homólogas con ayuda de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716), la expresión
heteróloga de estos genes en otras cepas que producen
seudo-oligosacáridos (p. ej., Actinoplanes
sp. SE50/100) con el fin de incrementar y estabilizar la producción
y también su expresión heteróloga en otros microorganismos, tales
como E. coli, Bacillus subtilis, Actinomycetales, como p.
ej., las cepas de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella,
Streptoporangium, Streptomyces hygroscopicus var. limoneus,
Streptomyces glaucescens, así como los hongos relevantes
biotecnológicamente (p. ej., Aspergillus niger, Penicillium
chrysogenum) y levaduras (p. ej., Saccharomyces
cerevisiae). La invención también se refiere a genes homólogos
en otros microorganismos y a métodos para
aislarlos.
aislarlos.
Streptomyces glaucescens (DSM 40716) que
en la bibliografía también se denomina Streptomyces
glaucescens GLA.O, produce ambos antibióticos,
hidroxiestreptomicina (Hütter (1967) Systematik der Streptomyceten.
Basel Karger Verlag) y tetradenomicina (Weber y col. (1979) Arch.
Microbiol. 121:111-116). Es conocido que los
estreptomicetos son capaces de sintetizar productos naturales
estructuralmente distintos. Sin embargo, las condiciones bajo las
cuales se producen estos compuestos, son frecuentemente desconocidas
o las sustancias sólo se producen en cantidades muy pequeñas y no
se detectan.
El inhibidor de la
\alpha-amilasa, la acarbosa, ha sido aislado a
partir de una variedad de cepas de Actinoplanes (SE50, SE82
y SE18) (Schmidt y col. (1977) Naturwissenschaften
64:535-536). La sustancia activa se descubrió en
asociación con un escrutinio de los inhibidores de la
\alpha-amilasa, procedentes de organismos de los
géneros Actinoplanes, Ampullariella y Streptosporangium. En
el caso de la acarbosa, se trata de un
seudo-tetrasacárido que está compuesto por una
unidad inusual de ciclitol insaturado a la que se une un amino
azúcar 4,6
didesoxi-4-amino-D-glucopiranosa.
Unidades de D-glucopiranosa adicionales, unidas de
forma \alpha-1,4-glicosídica se
pueden unir al amino azúcar. De este modo, la acarbosa contiene, p.
ej., dos moléculas adicionales de D-glucosa. La cepa
productora sintetiza una mezcla de productos de
seudo-oligosacáridos que poseen cadenas laterales de
azúcar de longitudes diferentes (Schmidt y col. (1977)
Naturwissenschaften 64:535-536). El radical ciclitol
de la acarbosa es idéntico al compuesto valienamina, que es un
componente del antibiótico validamicina A (Iwasa y col. (1979) J.
Antibiot. 32: 595-602) procedente de Streptomyces
hygroscopicus var. limoneus.
La acarbosa se puede producir por fermentación
empleando una cepa de Actinoplanes y ha conseguido una gran
importancia económica como agente terapéutico para los diabéticos.
Aunque Actinoplanes sintetiza una mezcla de los productos
inhibidores de la \alpha-amilasa, sólo el
compuesto que tiene el peso molecular relativo de 645,5
(acarviosina con dos unidades de glucosa (Truscheit (1984) VIIIth
International Symposium on Medicinal Chemistry, Proc. Vol. I.
Swedisch Academy of Pharmaceutical Sciences, Estocolmo, Suecia), se
emplea con el nombre genérico de acarbosa. Las condiciones de
fermentación se seleccionan para asegurar que la acarbosa es el
producto principal de la fermentación. Alternativamente, se emplean
agentes de selección y cepas determinadas en las que se forma
acarbosa como producto principal o se emplean en procesos de
purificación para el aislamiento selectivo (Truscheit (1984) Vlllth
International Symposium on Medicinal Chemistry, Proc. Vol. I.
Swedisch Academy of Pharmaceutical Sciences, Estocolmo, Suecia).
También es posible transformar químicamente la mezcla del producto
para obtener finalmente el producto deseado de acarbosa.
En el documento de solicitud de patente alemán,
con número de publicación 2 209 834, se describe un procedimiento
para la preparación de inhibidores de la sacarosa a partir de la
cepa Actinoplanes SE 50. Stockmann y Piepersberg describían
sondas génicas para la detección del metabolismo de la
6-desoxihexosa en estreptomicetos que producen
metabolitos secundarios (FEMS Microbiology Letters 90, (1992),
185-190).
Al contrario que el género Streptomyces,
el género Actinoplanes no se ha investigado hasta la fecha
genéticamente a fondo. Los métodos que se establecieron para el
género Streptomyces, no son transferibles o no son siempre
transferibles al género Actinoplanes. Para mejorar la
producción de acarbosa de forma deliberada, con métodos de biología
molecular, se tienen que aislar y caracterizar los genes de la
biosíntesis de acarbosa. En este contexto, se sugiere el intentar
establecer un sistema de hospedador-vector para
Actinoplanes sp. Sin embargo, esto es muy tedioso y
complicado debido a las escasas investigaciones sobre
Actinoplanes.
La invención descrita en la presente solicitud
de patente consigue el objetivo de clonar los genes de la
biosíntesis de acarbosa y de seudo-oligosacáridos
homólogos, clonándose estos genes a partir de Streptomyces
glaucescens GLA.O, que es un estreptomiceto que está bien
investigado genéticamente (Crameri y col. (1983) J. Gen. Microbiol.
129:519-527; Hintermann y col. (1984) Mol. Gen.
Genet. 196:513-520; Motamedi y Hutchinson (1987)
PNAS USA 84:4445-4449; Geistlich y col. (1989) Mol.
Microbiol. 3:1061-1069) y que, sorprendentemente, es
un productor de acarbosa. En un medio que contiene almidón,
Streptomyces glaucescens GLA.O produce
seudo-oligosacáridos que tienen los pesos
moleculares 645, 807 y 970.
\newpage
Un objeto de la invención también es el
aislamiento de los genes correspondientes para la biosíntesis,
procedentes de Streptomyces glaucescens GLA.O y su empleo
para aislar las regiones colindantes de ADN para completar la
agrupación génica de dichos genes de la biosíntesis.
El aislamiento de los genes para la biosíntesis
de los seudo-oligosacáridos y la caracterización de
estos genes, tienen gran importancia para conseguir una mejor
comprensión de la biosíntesis y de su regulación. Este conocimiento
se puede utilizar para incrementar la productividad de la cepa de
Streptomyces glaucescens GLA.O, en relación con la
producción de acarbosa, mediante métodos establecidos clásicos y de
biología molecular. Adicionalmente, la agrupación génica completa
que codifica la síntesis de los seudo-oligosacáridos
o genes individuales, también se puede expresar en otros
microorganismos de importancia biotecnológica, para conseguir un
mayor incremento en la producción o una simplificación de la
preparación de los seudo-oligosacáridos, como p.
ej., la acarbosa. La modificación específica de los genes de la
biosíntesis también se puede utilizar para preparar una cepa que
produzca exclusivamente acarbosa con un peso molecular de 645.
Puesto que los genes para biosintetizar antibióticos están siempre
presentes en agrupaciones y frecuentemente están muy conservados
(Stockmann y Piepersberg (1992) FEMS Microbiol. Letters
90:185-190; Malpartida y col. (1987) Nature
314:642-644), los genes de Streptomyces
glaucescens GLA.O también se pueden emplear como sonda para
aislar los genes que codifican la acarbosa procedentes de, p. ej.,
Actinoplanes sp. La expresión de los genes reguladores o de
los genes que codifican etapas limitantes de la biosíntesis, puede
dar como resultado un aumento de la productividad en Streptomyces
glaucescens GLA.O, en Actinoplanes sp. o en las cepas
productoras correspondientes. Asimismo, un incremento de la
productividad también se puede conseguir desconectando ("knock
out" o mutagénesis) los genes de la biosíntesis de acarbosa que
tienen un efecto inhibidor en la biosíntesis.
Una estrategia posible para clonar los genes de
la biosíntesis de antibióticos que no se han aislado previamente,
es la de emplear sondas específicas del gen (Stockmann y Piepersberg
(1992) FEMS Microbiol. Letters 90:185-190;
Malpartida y col. (1987) Nature 314:642-644). Estas
sondas pueden ser fragmentos de ADN que están marcados con P^{32}
o que están marcadas de otro modo o los genes adecuados se pueden
amplificar directamente a partir de las cepas que se van a
investigar, empleando cebadores degenerados para PCR y ADN
cromosómico aislado como el molde.
El procedimiento mencionado en último lugar, se
ha empleado en el presente estudio. Los
seudo-oligosacáridos como la acarbosa contienen una
unidad de 4,6-desoxiglucosa como elemento
estructural. Se conoce que la enzima
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa
está implicada en la biosíntesis de la
4,6-desoxiglucosa (Stockmann y Piepersberg (1992)
FEMS Microbiol. Letters 90:185-190). Puesto que los
desoxiazúcares son un componente frecuente de los productos
naturales y antibióticos, esta enzima puede ser posiblemente un
medio para aislar los genes correspondientes para la biosíntesis de
antibióticos. Puesto que estos genes están siempre presentes en
forma de agrupaciones, inicialmente es suficiente aislar un gen; el
aislamiento y la caracterización de las regiones adyacentes del ADN
se puede realizar posteriormente.
Por ejemplo, una
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa
cataliza una etapa de la biosíntesis de la hidroxiestreptomicina en
Streptomyces glaucescens GLA.O (Retzlaff y col. (1993)
Industrial Microorganisms. Basic and applied molecular genetics ASM,
Washington DC, EE.UU). Otras 4,6-deshidratasas de
dTDP-glucosa se han aislado a partir de otros
microorganismos, por ejemplo, a partir de Streptomyces
griseus (Pissowotzki y col. (1991) Mol. Gen. Genet.
231:113-123), Streptomyces fradiae
(Merson-Davies y Cundcliffe (1994) Mol. Microbiol.
13:349-355) y Streptomyces violaceoruber
(Bechthold, y col. (1995) Mol. Gen. Genet.
248:610-620).
Por ello fue posible deducir las secuencias de
los cebadores de la PCR, para amplificar una
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa a
partir de las secuencias de aminoácidos de los genes de biosíntesis
que ya se conocían. Para ello, se seleccionaron las regiones
conservadas en las secuencias proteicas de estas enzimas y se
tradujo la secuencia de aminoácidos en una secuencia de ácidos
nucleicos, de acuerdo con el código genético. Las secuencias
proteicas se obtuvieron de las bases de datos del EMBL y de Genbank.
Se emplearon las siguientes secuencias: Streptomyces
griseus; número de orden: X62567: gen strE (de fecha
30-10-1993); Streptomyces
violaceoruber; número de orden: L37334: gen graE (de fecha
10-04-1995); Saccharopolyspora
etythraea; número de orden: L37354: gen gdh (de fecha
09-11-1994). Se obtiene un gran
número de posibles secuencias de cebadores como resultado de la
degeneración del código genético. Ya que los estreptomicetos
contienen generalmente una G o una C en la tercera posición de un
codón (Wright y Bibb (1992) Gene 113:55-65), se
reduce el número de cebadores que se tienen que sintetizar. Estas
mezclas de cebadores se pueden emplear a continuación para llevar a
cabo una amplificación con la PCR, del ADN procedente de las cepas
que se van a investigar, lo que conduce de forma ideal a un
fragmento de ADN amplificado. En el caso de proteínas altamente
conservadas, este fragmento muestra una longitud pronosticable que
es el resultado de la distancia entre los cebadores en la secuencia
de ácido nucleico del gen correspondiente. Sin embargo, una mezcla
experimental de esta naturaleza no da obligatoriamente como
resultado un fragmento amplificado. Los cebadores pueden ser
demasiado inespecíficos y amplificar un gran número de fragmentos o
bien no obtenerse ningún producto de la PCR si no hay ningún sitio
de unión complementaria para los cebadores de la PCR en el
cromosoma.
La investigación de las cepas de estreptomicetos
Streptomyces glaucescens GLA.0 aportó un fragmento de ADN
amplificado (acbD*) con la longitud esperada de 550 pb. Una
investigación posterior mostraba que, además de contener un gen de
la 4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa
para biosintetizar hidroxiestreptomicina, esta cepa contiene
sorprendentemente un segundo gen de la
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa
para la biosíntesis de seudo-oligosacáridos, tales
como la acarbosa. Aunque ambos genes muestran un alto grado de
homología, sólo son idénticos en un 65% a nivel de aminoácidos.
La sonda acbD* (véase el Ejemplo 2 y la Tabla
2A) se empleó para aislar, un fragmento de ADN con PstI de 6,8 kb
de longitud procedente de Streptomyces glaucescens GLA.O, que
codifica una variedad de genes (acbA, acbB, acbC, acbD, acbE,
acbF), que participan en la biosíntesis de los
seudo-oligosacáridos.
Mediante la deleción de los genes acbBCD
(aminotransferasa acbB,
dTDP-glucosa-sintetasa acbC,
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa
acbD, véase el Ejemplo 6) se produjo un mutante de Streptomyces
glaucescens GLA.O, que ya no producía ningún
seudo-oligosacárido más en el medio de producción.
La participación de los genes acbBCD en la síntesis de
seudo-oligosacáridos se verificó por tanto
delecionando los loci correspondientes.
Los dos genes, es decir, la
dTDP-glucosa-sintetasa y la
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa
podrían participar en la biosíntesis del desoxiazúcar de los
seudo-oligosacáridos, lo que se puede concluir por
la función de las enzimas homólogas estudiadas a fondo (véase más
arriba). La aminotransferasa (codificada por el gen acbB) es
responsable probablemente de transferir el grupo amino del radical
azúcar o del radical ciclitol. Analizando la secuencia de proteínas
de acbB, se encontró un motivo de aminoácido que está implicado en
la unión del piridoxal-fosfato. Este motivo es
típico de las aminotransferasas de la clase III (EC 2.6.1.11; EC
2.6.1.13; EC 2.6.1.18; EC 2.6.1.19; EC 2.6.1.62; EC 2.6.1.64; EC
5.4.3.8). La función enzimática exacta de acbB sólo se puede
aclarar con la investigación adicional de la biosíntesis de los
seudo-oligosacáridos. acbE codifica una proteína
reguladora de la transcripción que muestra gran similitud con las
proteínas que se unen al ADN que poseen un motivo de
hélice-giro-hélice (p. ej.,
Bacillus subtilis DegA, P37947: Base de datos SwissProt). De
este modo, el activador de la transcripción CcpA procedente de
Bacillus subtilis inhibe la formación de
\alpha-amilasa, en presencia, p. ej., de glucosa
(Henkin y col. (1991) Mol. Microbiol. 5:575-584).
Otros representantes de este grupo son proteínas que reconocen
unidades de azúcar y son capaces de mostrar un efecto positivo o
negativo sobre la biosíntesis de las rutas metabólicas. La
biosíntesis de los seudo-oligosacáridos también
está regulada en Streptomyces glaucescens GLA.O. La síntesis
de los seudo-oligosacáridos sólo se podía
demostrar hasta la fecha, en medios que contenían almidón. Por
tanto, acbE podría ser responsable de la regulación de la síntesis
de seudo-oligosacáridos, pero el mecanismo preciso
no se conoce todavía. Pero el gen se puede modificar
específicamente para obtener una tasa incrementada de biosíntesis de
seudo-oligosacáridos, por métodos de la biología
molecular. Además, el sitio del ADN al que se une acbE se puede
identificar mediante los ensayos denominados de retardo en gel (del
inglés, "gel shift") (Miwa y col. (1994) Microbiology
140:2567-2575). Después de la identificación y la
posterior modificación de los promotores y de otras regiones
reguladoras del ADN que son responsables de la transcripción
de los genes de los seudo-oligosacáridos, se puede conseguir un incremento de la tasa de biosíntesis de la acarbosa.
de los genes de los seudo-oligosacáridos, se puede conseguir un incremento de la tasa de biosíntesis de la acarbosa.
Hasta la fecha, la función de acbF no está bien
definida. El producto génico correspondiente muestra homologías con
proteínas de unión a azúcares, tales como la proteína que se une al
azúcar de Streptococcus mutans (MsmE; Q00749: base de datos
de SwissProt), siendo probable que esté implicado en la biosíntesis
de los seudo-oligosacáridos. El producto génico del
gen acbA muestra homologías con proteínas bacterianas conocidas para
la unión a ATP (p. ej., de Streptomyces peucitus DrrA,
P32010: base de datos de SwissProt). La proteína AcbA posee el
típico motivo de unión a ATP/GTP, el denominado bucle P. Estas
proteínas constituyen un componente importante de los denominados
transportadores ABC que están implicados en el transporte activo de
metabolitos en membranas biológicas (Higgins (1995) Cell
82:693-696). Por tanto, AcbA podría ser responsable
de la exportación de seudo-oligosacáridos fuera de
la célula o estar implicada en la importación de unidades de azúcar
para biosintetizar inhibidores de la
\alpha-amilasa, tales como p. ej., la maltosa.
Todos los genes analizados hasta la fecha de la
biosíntesis de metabolitos secundarios, están dispuestos en una
agrupación. Por ello, se asume que los genes de la biosíntesis de
acarbosa, de acuerdo con la solicitud, también están dispuestos en
una agrupación génica tal. Los genes restantes que tienen
importancia en la biosíntesis de
seudo-oligosacáridos, se pueden aislar de este modo
aislando las regiones de ADN colindantes con el fragmento de ADN
PstI de 6,8 kb, de acuerdo con la invención. Tal y como se ha
mencionado anteriormente, se pueden aislar sin dificultad
agrupaciones de genes homólogos, a partir de microorganismos
distintos de Streptomyces glaucescens (DSM 40716).
Por ello, es un objeto de la invención una
molécula de ADN recombinante que contiene los genes para la
biosíntesis de acarbosa, la cual
- (a)
- contiene una secuencia de ADN según la Tabla 4;
- (b)
- contiene una secuencia de ADN que es capaz de hibridarse con la molécula de ADN, de acuerdo con (a)
- (a)
- bajo condiciones rigurosas; o
- (c)
- contiene una secuencia de ADN que debido a la degeneración del código genético, difiere de las moléculas de ADN según (a) y (b), pero permite la expresión de las proteínas que se pueden expresar correspondientes a las moléculas de ADN según (a) y (b).
La invención se refiere adicionalmente a una
molécula de ADN recombinante que comprende el gen acbA, en
particular que se caracteriza porque comprende la secuencia de ADN
de los nucleótidos 1 a 720 según la Tabla 4 o partes de la misma; a
una molécula de ADN recombinante que comprende el gen acbB, en
particular que está caracterizada porque comprende la secuencia de
ADN de los nucleótidos 720 a 2006 según la Tabla 4, o partes de la
misma; a una molécula de ADN recombinante que comprende el gen
acbC, en particular que está caracterizada porque comprende la
secuencia de ADN de los nucleótidos 2268 a 3332 según la Tabla 4, o
partes de la misma; a una molécula de ADN recombinante que
comprende el gen acbD, en particular que está caracterizada porque
comprende la secuencia de ADN de los nucleótidos 3332 a 4306 según
la Tabla 4, o partes de la misma; a una molécula de ADN
recombinante que comprende el gen acbE, en particular que está
caracterizada porque comprende la secuencia de ADN de los
nucleótidos 4380 a 5414 según la Tabla 4, o partes de la misma; a
una molécula de ADN recombinante que comprende el gen acbF, en
particular que está caracterizada porque comprende la secuencia de
ADN de los nucleótidos 5676 a 6854 según la Tabla 4, o partes de la
misma;
La invención se refiere adicionalmente a un
cebador de oligonucleótidos para la amplificación con PCR de una
molécula de ADN recombinante que es tal y como se ha descrito
anteriormente y que comprende genes para biosintetizar acarbosa,
teniendo el cebador en particular la secuencia según la Tabla 1.
La invención se refiere adicionalmente a un
vector que comprende una molécula de ADN recombinante que comprende
una molécula de ADN tal y como se ha descrito en el penúltimo y
antepenúltimo párrafos, en particular la que está caracterizada
porque el vector es un vector de expresión y dicha molécula de ADN
está ligada funcionalmente a una secuencia de promotor, siendo
adecuado el vector para la expresión en organismos hospedadores que
se seleccionan a partir del grupo consistente en E. coli,
Bacillus subtilis, Actinomycetales, como, p. ej., las
cepas de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella,
Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var. limoneus,
Streptomyces glaucescens, así como hongos con importancia
biotecnológica (p. ej., Aspergillus niger, Penicillium
chrysogenum) y levaduras (p. ej., Saccharomyces
cerevisiae), estando particularmente preferidos Streptomyces
glaucescens (DSM 40716) o Actinoplanes sp. Dado que esta
molécula de ADN está ligada funcionalmente a secuencias de promotor
del vector, es sólo una realización preferida de la invención,
también es posible una expresión empleando secuencias de promotor
que son endógenas de la molécula de ADN, p. ej., los promotores que
son en cada caso los naturales o los promotores naturales que se
han mutado para mejorar el rendimiento de acarbosa. Tales
promotores naturales son parte de la molécula de ADN de acuerdo con
la invención.
Otro objeto de la invención es un vector que
contiene una molécula de ADN de acuerdo con la invención, para uso
en un procedimiento para inactivar o modificar los genes naturales
de la biosíntesis de acarbosa, en un microorganismo productor de
acarbosa. Un vector tal se selecciona preferentemente a partir del
grupo consistente en pGM160 y de vectores tales como los descritos
en los documentos de patente europea EP 0 334 282 y EP 0 158
872.
Otro objeto de la invención es una célula
hospedadora que se transforma con una de las moléculas de ADN o los
vectores descritos anteriormente, caracterizada en particular porque
dicha célula hospedadora se selecciona entre el grupo consistente
en E. coli, Bacillus subtilis, Actinomycetales,
tales como p. ej., las cepas de Streptomyces, Actinoplanes,
Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus, Streptomyces glaucescens, así como hongos de
importancia biotecnológica (p. ej., Aspergillus niger,
Penicillium chrysogenum) y levaduras (p. ej., Saccharomyces
cerevisiae); se prefiere particularmente que se escoja a partir
del grupo compuesto por Streptomyces glaucescens (DSM 40716)
y Actinoplanes sp.
Otro objeto de la invención son proteínas
aisladas que se pueden obtener expresando los genes que son
codificados por la molécula de ADN descrita en el párrafo
anterior.
Las siguientes declaraciones se aplican a todos
los genes individuales, identificados en el contexto de la presente
invención y únicamente se reúnen por razones de claridad: otro
objeto de la invención es una proteína, codificada por una molécula
de ADN recombinante, tal y como se ha descrito en el párrafo
anterior, caracterizada en particular porque comprende la secuencia
de ADN de los nucleótidos 1 a 720 o 720 a 2006 o 2268 a 3332 o 3332
a 4306 o 4380 a 5414 o 5676 a 6854, según la Tabla 4 o partes de la
misma; se prefiere muy especialmente una proteína que está
codificada por el gen acbA o el gen acbB o el gen acbC o el gen acbD
o el gen acbE o el gen acbF, que contiene la secuencia de
aminoácidos según la Tabla 4 o partes de la misma.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para obtener las proteínas que se han descrito anteriormente como
parte del objeto de la invención, caracterizado porque
- (a)
- las proteínas se expresan en una célula hospedadora adecuada, en particular las que se caracterizan porque dicha célula hospedadora se selecciona entre el grupo consistente en E. coli, Bacillus subtilis, Actinomycetales, tales como las cepas de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, Streptomyces glaucescens, así como hongos de importancia biotecnológica (p. ej., Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum) y levaduras (p. ej., Saccharomyces cerevisiae); se prefiere especialmente que se seleccione entre el grupo consistente en Streptomyces glaucescens (DSM 40716) y Actinoplanes sp. y
- (b)
- se aíslan.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la preparación de acarbosa, caracterizado porque
- (a)
- uno o varios genes de la molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la Tabla 4 o partes de la misma o que comprende una secuencia de ADN que es capaz de hibridarse, bajo condiciones rigurosas, con la molécula de ADN de acuerdo con la Tabla 4 o partes de la misma, o que comprende una secuencia de ADN que debido a la degeneración del código genético, difiere de las moléculas de ADN que se acaban de describir, pero que permite la expresión de las proteínas que se pueden expresar que se corresponden con estas moléculas de ADN o con partes de las mismas, se emplean para la expresión en una célula hospedadora adecuada, que se selecciona en particular, a partir del mismo grupo que el descrito en el párrafo anterior, y
- (b)
- la acarbosa se aísla a partir del material sobrenadante del cultivo de dicha célula hospedadora.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la preparación de acarbosa, caracterizado porque
- (a)
- uno o varios genes de la molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN de acuerdo con la Tabla 4 o con partes de la misma o que comprende una secuencia de ADN que es capaz de hibridarse, bajo condiciones rigurosas, con la molécula de ADN de acuerdo con la Tabla 4 o con partes de la misma, o que comprende una secuencia de ADN que, debido a la degeneración del código genético, difiere de las moléculas de ADN que se acaban de describir, pero que permite la expresión de las proteínas que se pueden expresar de forma correspondiente empleando las moléculas de ADN o partes de las mismas, se inactivan en una célula hospedadora productora de acarbosa, en particular de Streptomyces glaucescens (DSM 40716) y de Actinoplanes sp. y
- (b)
- la acarbosa se aísla a partir de dicha célula hospedadora.
En este contexto la inactivación de uno o varios
genes se puede efectuar mediante métodos convencionales de la
biología molecular, por ejemplo, empleando los vectores descritos
anteriormente (pGM160 y otros). Un gen que se va a inactivar podría
ser, p. ej., el gen acbE que tiene probablemente una función
reguladora. Del mismo modo se podrían inactivar genes con el fin de
obtener acarbosa pura como el único producto de la fermentación y
no obtener más una mezcla de de seudo-oligosacáridos
homólogos (véase, más arriba). La inactivación de esos genes se
consigue preferentemente empleando los vectores que se han descrito
anteriormente con este fin.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la preparación de acarbosa, caracterizado porque los procesos
para preparar la acarbosa que se han descrito en los dos párrafos
anteriores, se combinan entre sí, de modo que uno o varios de
dichos genes se expresa artificialmente y uno o varios de dichos
genes se inactiva.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para modificar la expresión génica de los genes endógenos de la
biosíntesis de acarbosa, mutando el gen promotor respectivo para
obtener rendimientos mejorados de acarbosa. En este contexto, se
pueden emplear métodos conocidos de recombinación homóloga, para
introducir las mutaciones en la cepa de producción que se va a
mejorar. Tales mutaciones pueden ser transiciones, deleciones y/o
adiciones. Una "adición" puede indicar, por ejemplo, la
adición de un solo nucleótido o de varios nucleótidos o de una o
varias secuencias de ADN que tienen un efecto regulador positivo y
que producen una mejora de la expresión de un gen endógeno para la
biosíntesis de acarbosa. También el caso inverso, es decir, la
adición de una secuencia de ADN que tiene un efecto regulador
negativo sobre la represión de un gen endógeno para la biosíntesis
de acarbosa, es una forma preferida de adición. Las
"transiciones" pueden ser, p. ej., intercambios de nucleótidos
que reducen o aumentan el efecto de los elementos reguladores que
actúan negativa o positivamente. Con las "deleciones" se
pueden eliminar elementos reguladores positivos o negativos. Los
genes endógenos de este procedimiento están presentes
preferentemente en los Actinomycetales, como p. ej., las
cepas de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella,
Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var. limoneus,
Streptomyces glaucescens; muy especialmente están presentes
en Streptomyces glaucescens (DSM 40716) y Actinoplanes
sp.
Otro objeto de la invención es el uso de
Streptomyces (DSM 40716) para la obtención de acarbosa.
Otro objeto de la invención es el uso de
Streptomyces (DSM 40716) para la preparación de mutantes de
esta cepa por la "vía clásica", con la que se consigue una
producción de acarbosa más abundante. Los procedimientos para la
preparación de productores mejorados de productos naturales de este
tipo se conocen desde hace tiempo y se emplean frecuentemente
etapas clásicas de la mutagénesis y de la selección.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para completar la agrupación génica para biosintetizar acarbosa y
polisacáridos homólogos, de acuerdo con la Tabla 4, caracterizado
porque
- (a)
- se preparan las sondas para la hibridación que se obtienen a partir de la molécula de ADN, de acuerdo con la Tabla 4,
- (b)
- estas sondas para la hibridación se emplean en el escrutinio genómico de las genotecas de ADN obtenidas a partir de Streptomyces glaucescens (DSM 40716), bajo condiciones rigurosas y
- (c)
- los clones encontrados se aíslan y se caracterizan.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para completar la agrupación génica para biosintetizar acarbosa y
seudo-oligosacáridos homólogos de acuerdo con la
Tabla 4, caracterizado porque partiendo de la molécula de ADN
recombinante, de acuerdo con la Tabla 4,
- (a)
- se preparan cebadores para la PCR,
- (b)
- estos cebadores para la PCR se emplean para acumular fragmentos de ADN del ADN genómico procedente de Streptomyces glaucescens (DSM 40716), combinándose estos cebadores con los cebadores que se hibridan con las secuencias del sistema del vector empleado,
- (c)
- los fragmentos acumulados se aíslan y se caracterizan.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para aislar una agrupación génica para la biosíntesis de acarbosa y
seudo-oligosacáridos homólogos a partir de
microorganismos productores de acarbosa que son diferentes de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716), caracterizado porque partiendo de la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 4
Streptomyces glaucescens (DSM 40716), caracterizado porque partiendo de la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 4
- (a)
- se preparan las sondas para la hibridación,
- (b)
- estas sondas para la hibridación se emplean para el escrutinio del ADN genómico o del ADNc de las genotecas de ADN que se han obtenido a partir del microorganismo correspondiente y
- (c)
- los clones que se han encontrado se aíslan y se caracterizan.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para aislar una agrupación génica para la biosíntesis de acarbosa y
de seudo-oligosacáridos homólogos, a partir de
microorganismos productores de acarbosa que sean diferentes de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716), caracterizado porque
partiendo de la molécula de ADN recombinante según la reivindicación
4
- (a)
- se preparan cebadores para la PCR,
- (b)
- estos cebadores para la PCR se emplean para acumular fragmentos de ADN de ADN genómico o de ADNc de un microorganismo correspondiente,
- (c)
- los fragmentos acumulados se aíslan y se caracterizan y
- (d)
- eventualmente, se emplean en un procedimiento tal y como se ha descrito en el párrafo anterior.
Los procedimientos descritos para aislar una
agrupación génica para la biosíntesis de acarbosa y de
seudo-oligosacáridos homólogos a partir de
microorganismos productores de acarbosa que sean distintos de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716), se caracterizan porque
los microorganismos se seleccionan a partir del grupo consistente en
Actinomycetales, tales como, p. ej., las cepas de
Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium,
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, Streptomyces
glaucescens, preferentemente a partir del grupo consistente en
Streptomyces glaucescens (DSM 40716) y Actinoplanes
sp.
Otro objeto de la invención es el uso de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716) para aislar
acarbosa.
A continuación, se explica la invención con
mayor detalle con ayuda de los ejemplos, las tablas y las figuras
sin estar restringida a los mismos.
Todos los aislamientos de plásmidos se
realizaron empleando un equipo de reactivos para el
aislamiento
(Nucleobond®) de la firma Macherey and Nagel (Düren, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las etapas de trabajo de biología molecular se realizaron según protocolos convencionales (Sambrock y col. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, EE.UU.) o según indicaciones de los respectivos fabricantes. Las secuencias de ADN y proteicas se examinaron empleando el programa informático de Genetics Computer Group, versión 8 (programas: FastA, TFastA, BlastX, Motifs, GAP, CODONPREFERENCE) y las bases de datos Swiss-Prot (versión 32), EMBL (versión 46) y Prosite (versión 12.2). La manipulación con técnicas de biología molecular de Streptomyces glaucescens y de Actinoplanes (aislamiento del ADN, transformaciones del ADN) se realizaron tal y como describen Hopwood y col.: Genetic Manipulation of Streptomycetes: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985 y Motamedi y Hutchinson: Cloning and heterologous expression of a gene cluster for the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antibiotic of Streptomyces glaucescens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4445-4449 (1987).
(Nucleobond®) de la firma Macherey and Nagel (Düren, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las etapas de trabajo de biología molecular se realizaron según protocolos convencionales (Sambrock y col. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, EE.UU.) o según indicaciones de los respectivos fabricantes. Las secuencias de ADN y proteicas se examinaron empleando el programa informático de Genetics Computer Group, versión 8 (programas: FastA, TFastA, BlastX, Motifs, GAP, CODONPREFERENCE) y las bases de datos Swiss-Prot (versión 32), EMBL (versión 46) y Prosite (versión 12.2). La manipulación con técnicas de biología molecular de Streptomyces glaucescens y de Actinoplanes (aislamiento del ADN, transformaciones del ADN) se realizaron tal y como describen Hopwood y col.: Genetic Manipulation of Streptomycetes: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, GB, 1985 y Motamedi y Hutchinson: Cloning and heterologous expression of a gene cluster for the biosynthesis of tetracenomycin C, the anthracycline antitumor antibiotic of Streptomyces glaucescens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4445-4449 (1987).
En general, las hibridaciones se realizaron
empleando un equipo de reactivos para marcar el ADN de forma no
radiactiva de Boehringer Mannheim (nº de cat. 1175033). La
visualización tenía lugar con el equipo de reactivos para detectar
luminiscencia de Boehringer Mannheim (nº de cat. 1363514). En todos
los ejemplos aportados en esta solicitud de patente, la hibridación
se realizó bajo condiciones rigurosas: 68°C, 16 h, 5 x SSC, 0,1% de
N-laurilsarcosina, 0,02% de SDS, 1% de reactivo de
bloqueo (Boehringer Mannheim). SSC significa NaCl 0,15 M/citrato
sódico 0,015 M. La definición de "condiciones rigurosas"
empleada en esta memoria, se aplica a todos los aspectos de la
presente invención en los que se hace referencia a "condiciones
rigurosas". En este contexto, la forma de conseguir este rigor,
es decir, las condiciones de hibridación citadas, no deben tener un
efecto limitante, ya que el experto en la técnica puede seleccionar
también otras condiciones para obtener las mismas condiciones
rigurosas, por ejemplo, mediante el uso de otras soluciones para la
hibridación, junto con otras temperaturas.
La PCR se realizó bajo condiciones
convencionales empleando en cada caso 100 pmol de cebador 1 y 2 en
100 \mul de mezcla de reacción
| Tampón para PCR^{1} | 10 \mul | |
| Cebador para PCR | en cada caso 2,5 \mul | |
| dNTPs | en cada caso 0,2 mM | |
| BSA (10 mg/ml) | 1 \mul | |
| ADN molde | 1 \mug (1 \mul) | |
| Polimerasa Taq^{2} (5 unidades/ml) | 1,5 \mul | |
| H_{2}O | rellenar hasta 100 \mul | |
| ^{1}: Promega | ||
| ^{2}: Boehringer Mannheim |
Las muestras se recubren con 75 \mul de aceite
mineral y la amplificación se realiza empleando un ciclador térmico
de ADN TC1 de la firma Perkin Elmer.
| Ciclos | Temperatura | Duración |
| 1 | 96ºC | 5 min |
| 74ºC | 5 min | |
| 30 | 95ºC | 1,5 min |
| 74ºC | 1,5 min | |
| 1 | 74ºC | 5 min |
En la Tabla 1 se
presentan-introducen las secuencias de los cebadores
degenerados que se deberían utilizar para amplificar las
deshidratas de dTDP-glucosa procedentes de
diferentes estreptomicetos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Cebador 1: | CSGGSGSSGCSGGSTTCATSGG | (SEQ ID NO.: 1) |
| Cebador 2: | GGGWVCTGGYVSGGSCCGTAGTTG | (SEQ ID NO.: 2) |
| En esta tabla, S= G o C, W= A o T, V= A o G, Y= T o C. |
\vskip1.000000\baselineskip
La secuenciación tuvo lugar por el método de
terminación de cadena didesoxi según Sanger y col. (PNAS USA,
74:5463-5467 (1977)). Las reacciones se realizaron
empleando el equipo de reactivos para secuenciación Auto Read
Sequenzing Kit® de la firma Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania)
según las instrucciones del fabricante. Para la separación y la
detección se empleó un secuenciador de ADN, ALF DNA Sequencer® de la
firma Pharmacia Biotech (Freiburg, Alemania).
La posterior clonación de los fragmentos de la
PCR (Sure Clone Kit®, Pharmacia Biotech, Freiburg) en el vector de
E. coli pUC18 y la secuenciación del fragmento, apoyaban la
sospecha de que el fragmento codificaba una
4,6-deshidratasa de dTDP-glucosa.
Sin embargo, se aislaron 2 genes diferentes, mostrando ambos un alto
grado de homología con la 4,6-deshidratasa de
dTDP-glucosa, pero que no eran idénticos. Los
fragmentos de la PCR se designan de aquí en adelante acbD* y
HstrE*.
Las secuencias de los fragmentos aislados de la
PCR se muestran en la Tabla 2A y 2B y la comparación de la
homología de las secuencias de aminoácidos deducidas de HstrE* y
acbD*, se muestra en la Tabla 2C. Las dos proteínas muestran una
identidad de sólo el 65%.
| Calidad: | 196,3 | Longitud: | 182 | |
| Proporción: | 1,091 | Intersticios: | 0 | |
| Porcentaje de similitud: | 77,654 | Porcentaje de identidad: | 65,363 |
\vskip1.000000\baselineskip
en cada caso, la línea superior:
SEQ ID NO.:
5
en cada caso, la línea inferior:
SEQ ID NO.:
6
\vskip1.000000\baselineskip
Las células se dejaron crecer en medio R2YENG y
se recogieron para aislar el ADN después de 30 h. El ADN cromosómico
se aisló a partir de S. glaucescens (DSM 40716) tal y como
describen Hopwood y col. ((1985) Genetic manipulations of
Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation,
Norwich GB).
Se realizó un análisis de transferencia de tipo
Southern, empleando ADN cromosómico de la cepa productora S.
glaucescens (DSM 40716) que se había digerido con Pstl, BgIII y
BamHI, empleando las sondas marcadas de los fragmentos de la PCR
acbD* y HstrE*. Los dos fragmentos de la PCR se marcaron con
digoxigenina, de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(Boehringer Mannheim; Mannheim) y se separó un producto de la
digestión del ADN cromosómico de la cepa productora Streptomyces
glaucescens (DSM 40716), sobre un gel de agarosa. El ADN se
transfirió mediante transferencia capilar a membranas de nilón y las
regiones de ADN que eran homólogas a las sondas marcadas se
visualizaron posteriormente después de la hibridación.
Los dos genes marcaban regiones de ADN
diferentes (Fig. 1 y Fig. 2), debiéndose tratar en el caso de los
fragmentos marcados con HstrE*, de fragmentos génicos procedentes
de la biosíntesis de hidroxiestreptomicina de Streptomyces
glaucescens (DSM 40716). Aunque la secuencia de ADN no está
publicada, el alto grado de homología de la secuencia proteica
deducida a partir de HstrE* con StrE (Pissowotzki y col. (1991) Mol.
Gen. Genet. 231: 113-123) procedente de la
biosíntesis de estreptomicina de Streptomyces griseus
N2-3-11 (82% de identidad) y la
concordancia de los fragmentos de ADN marcados con HstrE* (Fig. 1)
con el mapa de restricción publicado de la agrupación génica de
hidroxiestreptomicina procedente de Streptomyces glaucescens
(DSM 40716) (Retzlaff y col. (1993) Industrial Microorganisms.
Basic and applied molecular genetics ASM, Washington DC, EE.UU.)
permite esta conclusión. Los fragmentos que se marcaron con la
sonda acbD* (Fig. 2) pertenecen a una región de ADN que no se ha
investigado previamente. Esta región codifica las enzimas para la
biosíntesis de los seudo-oligosacáridos procedentes
de Streptomyces glaucescens (DSM 40716).
Entre otros, mediante el fragmento de PCR acbD*,
se marca un fragmento de ADN PstI de 6,8 kb de longitud (Fig. 2).
Este fragmento de ADN se aisló del modo siguiente. La región del gel
se escindió con una cuchilla de afeitar y el ADN se aisló del gel
empleando un equipo de reactivos para aislamiento de la firma
Pharmacia Biotech y se clonó en el plásmido pUC19 (plásmido pacb1)
cortado con la enzima de restricción PstI y se transformó en la
cepa DH5\alpha de E. coli. Los clones individuales se
subcultivaron a partir de estas placas y se realizó el aislamiento
del ADN plasmídico empleando estos clones. Se realizó una
amplificación con PCR, con los cebadores 1 y 2, descritos
anteriormente (Tab. 1), empleando el ADN procedente de estos clones.
De este modo, se aisló el clon adecuado de E. coli, que
contenía el fragmento PstI con una longitud de 6,8 kb.
El ADN se digirió con diversas enzimas de
restricción y los fragmentos de ADN aislados se clonaron en pUC19.
A continuación, se determinó la secuencia de ADN del fragmento
completo, que se muestra en la Tab. 4 (SEQ ID NO.: 7). La secuencia
de ADN del fragmento PstI de 6,8 kb de longitud se confirmó sólo
parcialmente, mediante secuenciación suplementaria de la cadena
opuesta. Se encontraron varios marcos de lectura abiertos que
codificaban diversas proteínas (programas: CODONPREFERENCE y
BlastX). Se encontró un total de 6 regiones codificadoras. Un gen
que tenía un alto grado de homología con la proteína que se une a
ATP, acbA, una aminotransferasa, acbB, una
dTDP-glucosa-sintetasa, acbC, una
dTDP-glucosa-deshidratasa, acbD, un
gen regulador con homologías con la familia de proteínas LacI, acbE
y una proteína con similitudes con las proteínas que se unen a
azúcar, acbF. La secuencia de los genes acbA y acbF sólo se
determinó parcialmente. Las homologías con otras proteínas
procedentes de bases de datos y las propiedades de las proteínas
putativas, se sumarizan en la Tab. 3. La Fig. 3 muestra, de forma
resumida, un mapa de restricción del fragmento que contiene los
sitos de corte de restricción más importantes, mencionados en el
texto, y la disposición de los marcos de lectura abiertos
identificados.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una prueba de que el fragmento de ADN
identificado codificaba los genes para la biosíntesis de
seudo-oligosacáridos, se realizó del modo
siguiente. Una región génica de 3,4 kb (fragmento b
EcoRI-SstI, Fig. 3) se sustituyó con el gen de
resistencia a la eritromicina (1,6 kb) y se clonó con las regiones
de ADN flanqueantes del fragmento PstI de 6,8 kb (pacb1) en el
plásmido pGM160 sensible a la temperatura. El plásmido se construyó
tal y como se describe a continuación: el fragmento
EcoRI-HindIII de 2,2 kb de longitud (c, Fig. 3)
procedente del plásmido pacb1, se clonó en pGEM7zf (Promega,
Madison, WI, EE.UU.; plásmido pacb2), así como el fragmento SstI de
1 kb de longitud procedente de pacb1 (a, Fig. 3) se clonó en pUC19
(plásmido pacb3). A continuación se realizó una ligación empleando
los siguientes fragmentos. El plásmido pGM160 (Muth y col. (1989)
Mol. Gen Genet. 219:341-348) se cortó con
BamHI/HindIII, el plásmido pacb2 con XbaI/BamHI (c, Fig. 3), el
plásmido pacb3 con EcoRI/HindIII (a, Fig. 3) y el plásmido pIJ4026
(Bibb y col. (1985) Gene 38:215-226) se cortó con
EcoRI/XbaI para aislar el gen de resistencia ermE de 1,6 kb de
longitud. Los fragmentos se ligaron en una mezcla y se transformaron
en E. coli DH5\alpha y se seleccionaron sobre ampicilina.
El plásmido pacb4 resultante se aisló a partir de E. coli
DH5\alpha, se verificó si era correcto mediante digestión con
restricción y a continuación se transfirió mediante transformación
con protoplastos en S. glaucescens (DSM 40716). Los
transformantes se seleccionaron con tioestreptona a 27°C, sobre
agar R2YENG. A continuación, los transformantes se incubaron a la
temperatura no permisiva de 39°C y de este modo, se dirigió la
integración del plásmido en el genoma mediante recombinación
homóloga (selección con tioestreptona (25 \mug/ml) y eritromicina
(50 \mug/ml)). Bajo esas condiciones, sólo podían crecer los
clones en los que se había integrado el plásmido en el genoma. Los
clones correspondientes se aislaron, se llevaron a esporulación
(medio 1, véase a continuación) y se extendieron en placas sobre
agar que contenía eritromicina (medio 1). Los clones individuales
se aislaron de nuevo desde esas placas y se extendieron en medio
que contenía tioestreptona y en medio que contenía eritromicina. Los
clones que eran resistentes a la eritromicina pero ya no eran
resistentes a la tioestreptona, se analizaron. En esos clones, los
genes acbBCD se reemplazaron por ermE. Se examinaron diversos
clones y la cepa S. glaucescens (DSM 40716) \Deltaacb se
seleccionó finalmente como cepa de referencia (resistente a la
eritromicina, sensible a la tioestreptona) para una investigación
posterior.
Medio
1
| Extracto levadura | de 4 g/L | |
| Extracto malta | de 10 g/L | |
| Glucosa | 4 g/L | |
| Agar | 15 g/L | |
| pH | 7,2 \hskip0,5cm |
En otro experimento se examinó si la cepa
correspondiente todavía producía acarbosa. Algunos clones se dejaron
crecer y se investigó la formación del inhibidor de la
\alpha-amilasa, pero no se encontró actividad. A
continuación, los mutantes se caracterizaron adicionalmente mediante
hibridación de tipo Southern. La integración del gen ermE había
tenido lugar en el sitio pronosticado. La Fig. 4 muestra una
hibridación de tipo Southern que se había realizado con el tipo
silvestre y con el mutante por deleción \Deltaacb de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716). Como sonda se empleó
el fragmento SstI de pacb3. El ADN cromosómico se aisló a partir del
tipo silvestre y de los mutantes y se digirió con las enzimas PstI
y PstI/HindIII. El patrón del fragmento obtenido para el mutante
por deleción se corresponde con el acontecimiento de recombinación
pronosticado. El tipo silvestre muestra un fragmento PstI
invariable de 6,8 kb de longitud, mientras que el mutante muestra un
fragmento que está reducido en 1,8 kb (comparar la pista 1 y la 3,
Fig. 4). Con la integración del gen de resistencia ermE, se
introducía adicionalmente un sitio de corte interno para HindIII en
el fragmento PstI (comparar la pista 2 y la 4, Fig. 4).
Empleando un ensayo enzimático para detectar
almidón (TC-Starch,
Boehringer-Mannheim, nº de cat. 297748) era posible
mostrar que el compuesto aislado a partir de Streptomyces
glaucescens (DSM 40716) inhibe la
\alpha-amilasa. Principio del ensayo: el almidón
se escinde en D-glucosa mediante la
amiloglucosidasa. A continuación, la glucosa se convierte con
hexoquinasa en glucosa-6-fosfato y
ésta se convierte con
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
en
D-gluconato-6-fosfato.
Esta reacción produce NADPH, cuya formación se puede determinar
fotométricamente. La acarbosa inhibe la
\alpha-amilasa e impide de este modo la formación
de D-glucosa y finalmente también la formación de
NADPH.
La fermentación se realizó a 27ºC en un agitador
por rotación a 120 rpm, en frascos Erlenmeyer de 500 ml con una
punción lateral y 100 ml de medio 2. La fermentación se interrumpió
al cabo de 2 o 3 días. Los seudo-oligosacáridos se
detectaron en un ensayo de difusión en placa, tal y como se describe
en el Ejemplo 9. No se produjeron inhibidores de la
\alpha-amilasa cuando se empleó el medio 3. Esto
significa que la glucosa inhibe la producción de los
seudo-oligosacáridos. También otros azúcares, tales
como maltosa o sacarosa, o fuentes complejas de azúcar (extracto de
malta) se pueden tomar en consideración para producir
seudo-oligosacáridos con S. glaucescens (DSM
40716).
Medio
2
| Harina de soja | 20 g/L | |
| Almidón | 20 g/L | |
| pH | 7,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
Medio
3
| Harina de soja | 20 g/L | |
| Glucosa | 20 g/L | |
| pH | 7,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
Una suspensión de esporas de la cepa Mucor
miehei se vertió en agar (medio 5) (10^{5} esporas/ml) y 10 ml
de esta mezcla se vertieron en cada caso en placas de Petri. Se
cargaron discos de papel para ensayo (diámetro 6 mm) con 10 \mul
de acarbosa (1 mg/ml) o con una muestra procedente del cultivo de
S. glaucescens y se depositaron sobre las placas del ensayo.
La incubación de las placas tuvo lugar a 37°C. Se observaron halos
de inhibición sobre el medio 5 que contenía almidón. Como testigo
se empleó una placa que se había preparado con glucosa (medio 4) en
lugar de almidón. Sobre este medio no se formaba ningún halo de
inhibición alrededor de los discos de filtro cargados con el
compuesto activo.
Medios 4 y
5
| KH_{2}PO_{4} x 3 H_{2}O | 0,5 g | |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 0,2 g | |
| NaCl | 0,1 g | |
| Sulfato de amonio | 5 g | |
| Base de levadura nitrogenada | 1,7 g | |
| Glucosa (4) o almidón (5) | 5 g | |
| Agar | 15 g |
\vskip1.000000\baselineskip
Los protoplastos de la cepa de Streptomyces
glaucescens se aislaron tal y como describen Motamedi y
Hutchinson ((1987) PNAS USA 84:4445-4449) y el ADN
plasmídico aislado se transfirió a las células mediante
transformación PEG, tal y como describen Hopwood y col. ((1985)
Genetic manipulations of Streptomyces: A Laboratory Manual. The
John Innes Foundation, Norwich GB). Los protoplastos se regeneraron
sobre medio R2YENG a 30°C (Motamedi y Hutchinson (1987) PNAS USA
84:4445-4449). Las placas de agar se recubrieron
después de 18 h con una solución que contenía tioestreptona y se
incubaron a 30°C (concentración final de tioestreptona: 20
\mug/ml).
El caldo de cultivo se separó del micelio por
filtración. El material filtrado del cultivo obtenido de este modo,
se cargó a continuación en una columna XAD16, después de lo cual, la
columna se lavó con agua y los componentes activos se eluyeron con
metanol al 30%. El material eluido se concentró hasta la fase acuosa
y se extrajo con acetato de etilo para eliminar las impurezas
lipofílicas. La fase acuosa se concentró a continuación y los
componentes activos se purificaron adicionalmente en metanol al 5%
empleando una columna P2 de biogel. Las fracciones individuales se
recogieron en un recolector de fracciones. Las fracciones
individuales se analizaron con bioensayo con Mucor miehei.
El material eluido activo se cromatografió de nuevo para purificar
adicionalmente, en metanol al 5% sobre biogel P2. El material
aislado de este modo se investigó adicionalmente con HPLC y MS.
- Columna: Nucleosil® 100 C-18
- Eluyente ácido fosfórico al 0,1% = A /acetonitrilo = B
- Gradiente: de 0-100% de B en 15 min
- Detección: 215 nm
- Flujo 2 ml/min
- Volumen de inyección: 10-20 \mul
\vskip1.000000\baselineskip
Empleando HPLC no era posible distinguir la
preparación de seudo-oligosacárido de S.
glaucescens (DSM 40716) de la acarbosa auténtica. El tiempo de
retención y el espectro de absorción de rayos UV de los dos
componentes eran idénticos en este sistema de eluyente. La mezcla
de seudo-oligosacáridos no se fraccionó bajo estas
condiciones.
Los pesos moleculares y el patrón de
fragmentación de la acarbosa auténtica y de los
seudo-oligosacáridos aislados a partir de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716) se determinaron mediante
MS con electrovaporización. El análisis de la acarbosa que se puede
obtener comercialmente en Bayer (Glucobay), proporcionó un pico de
masa a 645,5 (acarbosa). Las muestras purificadas procedentes de
S. glaucescens (DSM 40716) contienen una mezcla de
diferentes seudo-oligosacáridos cuyas cadenas
laterales de azúcar tienen longitudes diferentes: 969 (acarbosa + 2
unidades de glucosa), 807 (acarbosa + 1 unidad de glucosa), 645 (se
corresponde con la acarbosa auténtica). Cuando la acarbosa y el
compuesto que se aísla a partir de S. glaucescens (DSM 40716)
y que tiene un peso molecular de 645 se fragmentan, se forman los
mismos fragmentos de moléculas: 145
(4-amino-4,6-desoxiglucosa)
303 (acarviosina) y 465 (303 con una unidad de glucosa).
Actinoplanes sp. SE50 también produce una
mezcla de moléculas de acarbosa que tienen cadenas laterales de
azúcar con longitudes diferentes (Truscheit (1984) VIIIth
International Symposium on Medicinal Chemistry, Proc. Vol. I.
Swedish Academy of Pharmaceutical Sciences, Estocolmo, Suecia). La
longitud de las cadenas laterales de azúcar se pueden influir con
la elección de los parámetros de la fermentación y del sustrato en
la solución del nutriente.
El ADN cromosómico se aisló a partir de la cepa
Actinoplanes sp. SE50/100 y se digirió con las enzimas de
restricción (PstI y BamHI). A continuación, se realizó una
hibridación Southern empleando una sonda que incluye la región
codificadora acbD de la 4,6-deshidratasa de
dTDP-glucosa procedente de Streptomyces
glaucescens (DSM 40716) (fragmento d, Fig. 3). La sonda se
hibrida con distintas bandas de Actinoplanes sp. SE50/110
(Fig. 5, pistas 1 y 2). Esto ofrece la posibilidad de aislar los
fragmentos correspondientes de Actinoplanes sp. SE50/100 y
de otras líneas celulares. El que estas regiones de ADN estén de
hecho implicadas en la biosíntesis de acarbosa se tiene que mostrar
todavía en investigaciones adicionales. Alternativamente, los
cebadores 1 y 2 de la PCR (Tab. 1) también podrían utilizarse para
amplificar la 4,6-deshidratasa de
dTDP-glucosa procedente de Actinoplanes
sp.
Fig. 1: Hibridación Southern con S.
glaucescens (DSM 40716). Pista 1: PstI, pista 2: BamHI, pista
3: BglII. Como sonda se empleó el fragmento de PCR HstrE* marcado.
Marcación de los fragmentos de ADN que están implicados en la
biosíntesis de hidroxiestreptomicina.
Fig. 2: Hibridación Southern con S.
glaucescens (DSM 40716). Pista 1: PstI, pista 2: BamHI, pista
3: BglII. Como sonda se empleó el fragmento de PCR acbD* marcado.
Marcación de fragmentos de ADN que participan en la biosíntesis de
los acbD* seudo-oligosacáridos.
Fig. 3: Mapa de restricción del fragmento PstI
de 6,8 kb de longitud procedente de Streptomyces glaucescens
(DSM 40716). Los marcos de lectura abiertos y la dirección en la que
se transcribe cada uno, se indican con flechas. Los fragmentos a, b,
c y d identifican las regiones de ADN que se explican con más
detalle en el texto.
Fig. 4: Hibridación Southern que emplea
\Deltaacb de Streptomyces glaucescens: pista 1: PstI,
pista 2: PstI/HindIII y Streptomyces glaucescens (DSM 40716)
pista 3: PstI, pista: 4: PstI/HindIII. Como sonda se empleó el
fragmento a SstI marcado de 1,0 kb de longitud (Fig. 3).
\newpage
Fig. 5: Hibridación Southern empleando
Actinoplanes sp. SE50/100: pista 1: PstI, pista 2: BamHI y
Streptomyces glaucescens (DSM 40716) pista 3: PstI. Como
sonda se empleó el fragmento d marcado SmaI/EcoRI de 1,0 kb de
longitud (4,6-deshidratasa de
dTDP-glucosa, Fig. 3). Las flechas indican los
fragmentos de ADN marcados (BamHI: 2,1 y 0,7 kb, PstI:
\sim11-12 kb)
Tab. 4: Secuencia de ADN del fragmento PstI de
6,8 kb de longitud procedente de Streptomyces glaucescens
(DSM 40716) (SEQ ID NO.: 7). Las secuencias de aminoácidos deducidas
(SEQ ID NO.: 8-13) de los marcos de lectura abiertos
identificados
se indican debajo de la secuencia de ADN. Los
codones de inicio, de detención y los sitios potenciales de unión a
ribosomas, están subrayados.
acbA: SEQ ID NO.: 8
acbB: SEQ ID NO.: 9
acbC: SEQ ID NO.: 10
acbD: SEQ ID NO.: 11
acbE: SEQ ID NO.: 12
acbF: SEQ ID NO.: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Hoechst Aktiengesellschaft
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- LUGAR: Frankfurt
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO FEDERADO: -
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 65926
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 069-305-3005
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 069-35-7175
\vskip0.500000\baselineskip
- (I)
- TELEX: -
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA SOLICITUD: Aislamiento de genes para la biosíntesis de seudo-oligosacáridos procedentes de Streptomyces glaucescens GLA.O y su uso
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Patent In Release nº 1.0, versión nº 1.25 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE LA CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..22
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCSGGSGSSGC SGGSTTCATS GG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..24
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGWVCTGGY VSGGSCCGTA GTTG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 546 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..546
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 541 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: exón
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..541
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 180 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: PCRstrE.Pep
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..180
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 181 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: PCR acbD.Pep
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..181
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6854 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Agrupación de genes de la biosíntesis "acarbosa"
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..6854
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 240 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: acbA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..240
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 429 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: acbB
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..429
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 355 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: acbC
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..355
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 325 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: acbD
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..325
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 345 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: acbE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..345
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 393 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: acbF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- UBICACIÓN: 1..393
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (40)
1. Molécula de ADN que comprende los genes para
la biosíntesis de acarbosa, caracterizada porque
- (a)
- comprende una secuencia de ADN según la Tabla 4; o
- (b)
- comprende una secuencia de ADN que es capaz de hibridarse, bajo condiciones rigurosas, con la molécula de ADN según (a), o
- (c)
- contiene una secuencia de ADN que, debido a la degeneración del código genético, difiere de las moléculas de ADN según (a) y (b), pero permite la expresión de las proteínas que se pueden expresar que se corresponden con las moléculas de ADN según (a) y (b).
2. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como secuencia mencionada en
(a), la secuencia de ADN de los nucleótidos 1 a 720 (gen acbA) de
acuerdo con la Tabla 4.
3. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como secuencia mencionada en
(a), la secuencia de ADN de los nucleótidos 720 a 2006 (gen acbB) de
acuerdo con la Tabla 4.
4. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como secuencia mencionada en
(a), la secuencia de ADN de los nucleótidos 2268 a 3332 (gen acbC)
de acuerdo con la Tabla 4.
5. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como secuencia mencionada en
(a), la secuencia de ADN de los nucleótidos 3332 a 4306 (gen acbD)
de acuerdo con la Tabla 4.
6. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como secuencia mencionada en
(a), la secuencia de ADN de los nucleótidos 4380 a 5414 (gen acbE)
de acuerdo con la Tabla 4.
7. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
caracterizada porque comprende como secuencia mencionado en
(a), la secuencia de ADN de los nucleótidos 5676 a 6854 (gen acbF)
de acuerdo con la Tabla 4.
8. Cebador oligonucleótido para la amplificación
con PCR de la molécula de ADN según la reivindicación 1.
9. Vector que contiene una molécula de ADN según
una o varias de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector según la reivindicación 9, para uso
en un procedimiento de inactivación o de modificación de los genes
naturales para la biosíntesis de acarbosa en un microorganismo
productor de acarbosa.
11. Vector según la reivindicación 10,
caracterizado porque se selecciona a partir del grupo
consistente en pGM160 o vectores relacionados.
12. Vector según la reivindicación 9,
caracterizado porque es un vector de expresión y dicha
molécula de ADN está ligada funcionalmente con una secuencia
promotora.
13. Vector según la reivindicación 12, que es
adecuado para la expresión en organismos hospedadores que se
seleccionan entre el grupo consistente en E. coli,
Bacillus subtilis, cepas de Streptomyces, Actinoplanes,
Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus, Streptomyces glaucescens, así como
Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum y Saccharomyces
cerevisiae.
14. Vector según la reivindicación 12, que es
adecuado para la expresión en Streptomyces glaucescens (DSM
40716) o en Actinoplanes sp.
15. Célula hospedadora que se transforma con un
vector según una de las reivindicaciones 9 a 14.
16. Célula hospedadora según la reivindicación
15, caracterizada porque se selecciona a partir del grupo
consistente en E. coli, Bacillus subtilis, las cepas
de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium,
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, Streptomyces
glaucescens, así como Aspergillus niger, Penicillium
chrysogenum y Saccharomyces cerevisiae.
17. Célula hospedadora según la reivindicación
16, caracterizada porque se selecciona a partir del grupo
consistente en Streptomyces glaucescens (DSM 40716) y
Actinoplanes sp.
18. Proteína (producto del gen acbA), codificada
por un ADN según la reivindicación 2.
19. Proteína (producto del gen acbB), codificada
por un ADN según la reivindicación 3.
20. Proteína (producto del gen acbC), codificada
por un ADN según la reivindicación 4.
21. Proteína (producto del gen acbD), codificada
por un ADN según la reivindicación 5.
22. Proteína (producto del gen acbE), codificada
por un ADN según la reivindicación 6.
23. Proteína (producto del gen acbF), codificada
por un ADN según la reivindicación 7.
24. Procedimiento para obtener las proteínas
según una de las reivindicaciones 18 bis 23, caracterizado
porque
- (a)
- las proteínas se expresan en una célula hospedadora adecuada y
- (b)
- se aíslan.
25. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona a
partir del grupo consistente en E. coli, Bacillus
subtilis, las cepas de Streptomyces, Actinoplanes,
Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var.
limoneus, Streptomyces glaucescens, así como
Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum y Saccharomyces
cerevisiae.
26. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque la célula hospedadora se selecciona a
partir del grupo consistente en Streptomyces glaucescens (DSM
40716) y Actinoplanes sp.
27. Procedimiento para la preparación de
acarbosa, caracterizado porque
- (a)
- uno o varios genes según una o varias de las reivindicaciones 2 a 7, se emplean para la expresión en una célula hospedadora adecuada y
- (b)
- la acarbosa se aísla a partir del material sobrenadante del cultivo de dicha célula hospedadora.
28. Procedimiento para la preparación de
acarbosa según la reivindicación 27, caracterizado porque las
células hospedadoras se seleccionan según una de las
reivindicaciones 16 o 17.
29. Procedimiento para la preparación de
acarbosa, caracterizado porque
- (a)
- uno o varios genes según una o varias de las reivindicaciones 2 a 7, se inactivan en una célula hospedadora productora natural de acarbosa y
- (b)
- se aísla la acarbosa a partir de dicha célula hospedadora.
30. Procedimiento para la preparación de
acarbosa según la reivindicación 29, caracterizado porque se
seleccionan las células hospedadoras según la reivindicación 17.
31. Procedimiento para la preparación de
acarbosa, caracterizado porque un procedimiento según una de
las reivindicaciones 27 a 28, se combina con un procedimiento según
una de las reivindicaciones 29 a 30.
32. Procedimiento para completar la agrupación
génica para biosintetizar acarbosa según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- (a)
- las regiones colindantes de ADN genómico se aíslan por métodos de hibridación empleando sondas de hibridación que se hibridan, bajo condiciones rigurosas, con la molécula de ADN según la reivindicación 1 y
- (b)
- se secuencian.
33. Procedimiento para completar la agrupación
génica para la biosíntesis de acarbosa según la reivindicación 1,
caracterizado porque
- a)
- se aíslan las regiones de ADN genómico adyacentes mediante PCR, empleando cebadores de PCR que se hibridan, bajo condiciones rigurosas, con las secuencias de ADN procedentes de la molécula de ADN según la reivindicación 1 y los cebadores que poseen una secuencia que permite la hibridación con secuencias del sistema del vector empleado y
- b)
- se secuencian.
34. Procedimiento para aislar una agrupación
génica para la biosíntesis de acarbosa y de
seudo-oligosacáridos homólogos procedentes de
microorganismos productores de acarbosa distintos de Streptomyces
glaucescens (DSM 40716), caracterizado porque
- a)
- se preparan las sondas de la hibridación que se hibridan, bajo condiciones rigurosas, con la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1,
- b)
- estas sondas de hibridación se emplean para el escrutinio del ADN genómico o del ADNc que se ha obtenido a partir del microorganismo correspondiente, y
- c)
- los clones encontrados se aíslan y se caracterizan.
35. Procedimiento para aislar una agrupación
génica para la biosíntesis de acarbosa y de
seudo-oligosacáridos homólogos procedentes de
microorganismos productores de acarbosa, distintos de
Streptomyces glaucescens (DSM 40716), caracterizado
porque
- a)
- se preparan los cebadores de la PCR que se hibridan, bajo condiciones rigurosas, con la molécula de ADN recombinante según la reivindicación 1,
- b)
- estos cebadores para la PCR se emplean para acumular fragmentos de ADN genómico o del ADNc de un microorganismo correspondiente,
- c)
- los fragmentos acumulados se aíslan y se caracterizan y
- d)
- eventualmente se emplean para un procedimiento según la reivindicación 34.
36. Procedimiento según las reivindicaciones 34
o 35, caracterizado porque los microorganismos se
seleccionan
a partir del grupo consistente en Actinomycetales, las cepas de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, Streptomyces glaucescens.
a partir del grupo consistente en Actinomycetales, las cepas de Streptomyces, Actinoplanes, Ampullariella, Streptosporangium, Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, Streptomyces glaucescens.
37. Procedimiento según la reivindicación 36,
caracterizado porque los microorganismos se seleccionan, en
particular, a partir del grupo consistente en Streptomyces
glaucescens (DSM 40716) y Actinoplanes sp.
38. Uso de Streptomyces glaucescens (DSM
40716) para obtener acarbosa.
39. Procedimiento para modificar la expresión
génica de los genes para la biosíntesis endógena de acarbosa, para
obtener un rendimiento mejorado de acarbosa, en donde
- a)
- se introducen mutaciones en uno o en varios de los promotores génicos respectivos y
- b)
- el rendimiento en acarbosa de la cepa productora así obtenida se compara con el de la cepa de partida.
40. Procedimiento según la reivindicación 39,
caracterizado porque las mutaciones son
- a)
- transiciones
- b)
- deleciones y/o
- c)
- adiciones.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19622783 | 1996-06-07 | ||
| DE19622783A DE19622783A1 (de) | 1996-06-07 | 1996-06-07 | Isolierung der Biosynthesegene für Pseudo-Oligosaccharide aus Streptomyces glaucescens GLA.O und ihre Verwendung |
Publications (1)
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