JPH0638771A - ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法 - Google Patents
ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法Info
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- JPH0638771A JPH0638771A JP3114074A JP11407491A JPH0638771A JP H0638771 A JPH0638771 A JP H0638771A JP 3114074 A JP3114074 A JP 3114074A JP 11407491 A JP11407491 A JP 11407491A JP H0638771 A JPH0638771 A JP H0638771A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤ
Ｉ）遺伝子の発現、及び該遺伝子と有用ポリペプチドを
コードする外来遺伝子との共発現を提供する。 【構成】この発明は、ヒト血清アルブミンプレプロ配列
をコードするＤＮＡとヒトＰＤＩ遺伝子とから成る新規
の連結遺伝子を発現ベクターに組み込み、宿主細胞を形
質転換させ、発現させることによるＰＤＩの製造方法、
並びに、共発現可能な該連結遺伝子と有用ポリペプチド
をコードする外来遺伝子とを含む形質転換体を共発現さ
せることによる該ポリペプチドの製造方法を特徴とす
る。 【効果】ヒトＰＤＩの大量生産法が確立され、及び同一
細胞内でのヒトＰＤＩ遺伝子との共発現により有用ポリ
ペプチドの産生効率の向上が可能となった。
Ｉ）遺伝子の発現、及び該遺伝子と有用ポリペプチドを
コードする外来遺伝子との共発現を提供する。 【構成】この発明は、ヒト血清アルブミンプレプロ配列
をコードするＤＮＡとヒトＰＤＩ遺伝子とから成る新規
の連結遺伝子を発現ベクターに組み込み、宿主細胞を形
質転換させ、発現させることによるＰＤＩの製造方法、
並びに、共発現可能な該連結遺伝子と有用ポリペプチド
をコードする外来遺伝子とを含む形質転換体を共発現さ
せることによる該ポリペプチドの製造方法を特徴とす
る。 【効果】ヒトＰＤＩの大量生産法が確立され、及び同一
細胞内でのヒトＰＤＩ遺伝子との共発現により有用ポリ
ペプチドの産生効率の向上が可能となった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ポリペプチド中のジス
ルフィド結合の交換反応を触媒することによりポリペプ
チドの高次構造形成を促進する酵素プロテインジスルフ
ィドイソメラーゼをコードする遺伝子の発現に関する。
さらに本発明は、該遺伝子と有用ポリペプチドをコード
する外来遺伝子との共発現に関する。
ルフィド結合の交換反応を触媒することによりポリペプ
チドの高次構造形成を促進する酵素プロテインジスルフ
ィドイソメラーゼをコードする遺伝子の発現に関する。
さらに本発明は、該遺伝子と有用ポリペプチドをコード
する外来遺伝子との共発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】in vitro での変性蛋白質の再構成(Ref
olding）実験の結果より、ポリペプチドのフォールディ
ング速度を律速する反応として、ジスルフィルド結合の
異性化とプロリンペプチドの異性化反応があることが知
られ（Freedman, Cell 57, 1069-1072, 1989;Fisher &
Schmid,Biochemistry 29, 2205-2212,1990）、フォー
ルディング反応におけるこれらの遅い反応を触媒する酵
素として、後者には、ペプチジルプロリルシストランス
イソメラーゼ（ＰＰＩ）が、前者にはプロテインジスル
フィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）とチオレドキシンなどが
見い出されている。In vitro の実験では、これらの酵
素が、変性蛋白質の再構成の速度を促進することが示さ
れ、遺伝子工学的に生産された不活性蛋白質のin vitr
o での再構成への利用が考えられている（Schein, Bio
／Technology 7, 1141-1148,1989；鵜高重三、日本農
芸化学会誌 64, 1035-1038, 1990）。
olding）実験の結果より、ポリペプチドのフォールディ
ング速度を律速する反応として、ジスルフィルド結合の
異性化とプロリンペプチドの異性化反応があることが知
られ（Freedman, Cell 57, 1069-1072, 1989;Fisher &
Schmid,Biochemistry 29, 2205-2212,1990）、フォー
ルディング反応におけるこれらの遅い反応を触媒する酵
素として、後者には、ペプチジルプロリルシストランス
イソメラーゼ（ＰＰＩ）が、前者にはプロテインジスル
フィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）とチオレドキシンなどが
見い出されている。In vitro の実験では、これらの酵
素が、変性蛋白質の再構成の速度を促進することが示さ
れ、遺伝子工学的に生産された不活性蛋白質のin vitr
o での再構成への利用が考えられている（Schein, Bio
／Technology 7, 1141-1148,1989；鵜高重三、日本農
芸化学会誌 64, 1035-1038, 1990）。
【０００３】ＰＤＩは、可溶性で、哺乳類の肝臓から比
較的容易に単離され、その触媒としての性質が詳細に調
べられている。ＰＤＩは、チオール／ジスルフィド結合
の交換反応を触媒し、蛋白質基質のジスルフィド結合の
形成・異性化・あるいは還元を行うことができる（Free
dman, Cell 57,1069-1072, 1989）。ＰＤＩはIn vitr
o では RNaseなどの単一ドメインからなる蛋白質や、血
清アルブミンなどの多重ドメインからなる蛋白質などの
分子内でのジスルフィド結合の形成や交換反応を促進し
たり、又は免疫グロブリンやプロコラーゲンなどのよう
なサブユニット構造を持つ蛋白質の分子間でのジスルフ
ィド結合の形成などの反応を促進することが知られてい
る（Freedman, Nature 329, 196, 1987)。
較的容易に単離され、その触媒としての性質が詳細に調
べられている。ＰＤＩは、チオール／ジスルフィド結合
の交換反応を触媒し、蛋白質基質のジスルフィド結合の
形成・異性化・あるいは還元を行うことができる（Free
dman, Cell 57,1069-1072, 1989）。ＰＤＩはIn vitr
o では RNaseなどの単一ドメインからなる蛋白質や、血
清アルブミンなどの多重ドメインからなる蛋白質などの
分子内でのジスルフィド結合の形成や交換反応を促進し
たり、又は免疫グロブリンやプロコラーゲンなどのよう
なサブユニット構造を持つ蛋白質の分子間でのジスルフ
ィド結合の形成などの反応を促進することが知られてい
る（Freedman, Nature 329, 196, 1987)。
【０００４】哺乳類由来のＰＤＩは、通常分子量約５万
７千からなるポリペプチドのホモダイマーとして存在
し、きわめて酸性度の高いｐＩ値（pI 4.2〜4.3 ）を持
っている。
７千からなるポリペプチドのホモダイマーとして存在
し、きわめて酸性度の高いｐＩ値（pI 4.2〜4.3 ）を持
っている。
【０００５】ラットの肝臓由来のＰＤＩについて、その
遺伝子が単離され、その遺伝子の塩基配列よりＰＤＩの
アミノ酸配列が推定され、ＰＤＩが２種類の相同性単位
からなる分子内重複構造を持つことが示されている。２
種の相同性単位のうち一種については、チオレドキシン
のアミノ酸配列と相同性があることが見い出され、類似
の活性部位アミノ酸配列を持つと考えられている（Edma
n et al., Nature 317, 267-270, 1985)。チオレドキ
シンは、in vivoでインシュリンのジスルフィド結合を
還元したり、RNase のジスルフィド結合の交換反応を促
進することができ、in vivoでの蛋白質のフォールディ
ング過程でＰＤＩと同様の働きをすることが示唆されて
いる（Pigict & Schuster, Proc. Natl. Acad．Sci .
USA 83, 7643-7647, 1986)。
遺伝子が単離され、その遺伝子の塩基配列よりＰＤＩの
アミノ酸配列が推定され、ＰＤＩが２種類の相同性単位
からなる分子内重複構造を持つことが示されている。２
種の相同性単位のうち一種については、チオレドキシン
のアミノ酸配列と相同性があることが見い出され、類似
の活性部位アミノ酸配列を持つと考えられている（Edma
n et al., Nature 317, 267-270, 1985)。チオレドキ
シンは、in vivoでインシュリンのジスルフィド結合を
還元したり、RNase のジスルフィド結合の交換反応を促
進することができ、in vivoでの蛋白質のフォールディ
ング過程でＰＤＩと同様の働きをすることが示唆されて
いる（Pigict & Schuster, Proc. Natl. Acad．Sci .
USA 83, 7643-7647, 1986)。
【０００６】ＰＤＩの生体内での存在量は、組織の種類
や細胞の分化段階の違いによって異なるが、このこと
と、分泌するある特定の蛋白質の存在との間に相関性が
あること、そして、蛋白質の分泌の際に通過することが
知られている小胞体内部にＰＤＩが豊富に局在化してい
ることなどから、細胞内においてもＰＤＩが、新しく合
成される分泌蛋白質のジスルフィド結合の形成に関与し
ていると推定されている。このことは、無細胞蛋白質合
成系を用い、モデル系としてγ−グリアジンの生合成を
行い、この時、ＰＤＩを洗い流した小胞体分画だけでは
γ−グリアジンの翻訳に共役したジスルフィド結合の形
成はほとんど起らないが、ＰＤＩを加えると、ジスルフ
ィド結合の形成能が回復するという結果によって支持さ
れている（Bulleid & Freedman, Nature, 335 649-65
1, 1988）。
や細胞の分化段階の違いによって異なるが、このこと
と、分泌するある特定の蛋白質の存在との間に相関性が
あること、そして、蛋白質の分泌の際に通過することが
知られている小胞体内部にＰＤＩが豊富に局在化してい
ることなどから、細胞内においてもＰＤＩが、新しく合
成される分泌蛋白質のジスルフィド結合の形成に関与し
ていると推定されている。このことは、無細胞蛋白質合
成系を用い、モデル系としてγ−グリアジンの生合成を
行い、この時、ＰＤＩを洗い流した小胞体分画だけでは
γ−グリアジンの翻訳に共役したジスルフィド結合の形
成はほとんど起らないが、ＰＤＩを加えると、ジスルフ
ィド結合の形成能が回復するという結果によって支持さ
れている（Bulleid & Freedman, Nature, 335 649-65
1, 1988）。
【０００７】ＰＤＩについては、ジスルフィド結合の形
成への関与以外に、蛋白質の翻訳後の他の修飾反応にも
関わっている証拠が得られている。例えば、ＰＤＩは、
プロコラーゲンのプロリン残基を水酸化するプロリル−
4 −ハイドロキシラーゼの触媒ユニットであるβサブユ
ニットや、合成蛋白質のＮ−グリコシル化の過程で、糖
鎖を付加されるペプチドのシグナル配列 Asn-X-Ser/Thr
を認識するグリコシル化部位結合蛋白質(Pihlajaniemi
et al., EMBO J. 6, 643-649 1987；Geetha-Habib e
t al., Cell 54, 1053-1060 1988）、さらにまた、甲
状腺ホルモン結合蛋白質(triiodo-L-thyronine binding
protein)(Cheng et al. J.Biol. Chem. 262, 11221-
11227, 1987)などとの同一性が示され、ＰＤＩ分子の蛋
白質の修飾反応における多機能性が示唆されている。こ
れらの事実に加え、ＰＤＩ分子とは異なる分子種である
が、アミノ酸配列上において相同性がある分子種も見い
出されている。それらの例としてはＰＤＩの活性部位と
考えられているアミノ酸配列と相同性がある配列を持
ち、ジスルフィド結合の異性化を触媒することが見い出
されたフォリトロピン(Follitropin) やルトロピン（Lu
tropin）などの性腺刺激ホルモンや(Boniface & Reiche
rt et al., Science 247, 61-64, 1990)、ホスファ
チジルイノシトール4,5-ビスホスフェイトを1,2-ジアシ
ルグリセロールとイノシトール1,4,5-トリホスフェート
に加水分解する酵素でありその分子内にＰＤＩと相同性
を持つ領域が存在するホスホリパーゼＣなども知られ
（Bennettet al., Nature 334, 268-270, 1988 ）、
ＰＤＩやＰＤＩ様分子の細胞内外でのきわめて広範な生
命現象への関りが考えられている。
成への関与以外に、蛋白質の翻訳後の他の修飾反応にも
関わっている証拠が得られている。例えば、ＰＤＩは、
プロコラーゲンのプロリン残基を水酸化するプロリル−
4 −ハイドロキシラーゼの触媒ユニットであるβサブユ
ニットや、合成蛋白質のＮ−グリコシル化の過程で、糖
鎖を付加されるペプチドのシグナル配列 Asn-X-Ser/Thr
を認識するグリコシル化部位結合蛋白質(Pihlajaniemi
et al., EMBO J. 6, 643-649 1987；Geetha-Habib e
t al., Cell 54, 1053-1060 1988）、さらにまた、甲
状腺ホルモン結合蛋白質(triiodo-L-thyronine binding
protein)(Cheng et al. J.Biol. Chem. 262, 11221-
11227, 1987)などとの同一性が示され、ＰＤＩ分子の蛋
白質の修飾反応における多機能性が示唆されている。こ
れらの事実に加え、ＰＤＩ分子とは異なる分子種である
が、アミノ酸配列上において相同性がある分子種も見い
出されている。それらの例としてはＰＤＩの活性部位と
考えられているアミノ酸配列と相同性がある配列を持
ち、ジスルフィド結合の異性化を触媒することが見い出
されたフォリトロピン(Follitropin) やルトロピン（Lu
tropin）などの性腺刺激ホルモンや(Boniface & Reiche
rt et al., Science 247, 61-64, 1990)、ホスファ
チジルイノシトール4,5-ビスホスフェイトを1,2-ジアシ
ルグリセロールとイノシトール1,4,5-トリホスフェート
に加水分解する酵素でありその分子内にＰＤＩと相同性
を持つ領域が存在するホスホリパーゼＣなども知られ
（Bennettet al., Nature 334, 268-270, 1988 ）、
ＰＤＩやＰＤＩ様分子の細胞内外でのきわめて広範な生
命現象への関りが考えられている。
【０００８】以上のように広範な働きが示唆されている
が、ＰＤＩの主な効果は分子内及び分子間のジスルフィ
ド結合の異性化を触媒し、天然の高次構造を持った蛋白
質（及び集合体）を生じさせることと考えられている。
しかししばしば、ほとんど化学量論的な量のＰＤＩが最
適な反応速度を実現するために必要とされる。従って、
ジスルフィドイソメラーゼ活性が低い場合には、蛋白質
分子内及び分子間でのジスルフィド異性化速度が低く、
従って適切なジスルフィド結合を有する蛋白質の形成の
効率が低いことが予想される。種々の真核生物由来の蛋
白質（特に分泌蛋白質類）が、大腸菌内で不溶化分子集
合体を形成する原因の１つがこのジスルフィドイソメラ
ーゼ活性の低さにあると考えることも可能である。大腸
菌では、ジスルフィド還元酵素としてチオレドキシシン
を含むが、チオレドキシンはジスルフィド還元酵素とし
てはＰＤＩよりも強力であるが、イソメラーゼとしての
効率はよくない。一方、分子内ジスルフィド結合は、分
泌蛋白質に高頻度にみられることから、分泌能の高い細
胞あるいは組織においてジスルフィド異性化を介したジ
スルフィド結合活性が高いことが予想されるが、実際に
ラットの種々の組織の相対的なＰＤＩ mＲＮＡ含量の比
較（肝臓＞膵臓、腎臓＞肺＞精巣、脾臓＞心臓＞脳の
順）からこのことが強く示唆されている（Edman ら、 N
ature 314,267-270, 1985）。
が、ＰＤＩの主な効果は分子内及び分子間のジスルフィ
ド結合の異性化を触媒し、天然の高次構造を持った蛋白
質（及び集合体）を生じさせることと考えられている。
しかししばしば、ほとんど化学量論的な量のＰＤＩが最
適な反応速度を実現するために必要とされる。従って、
ジスルフィドイソメラーゼ活性が低い場合には、蛋白質
分子内及び分子間でのジスルフィド異性化速度が低く、
従って適切なジスルフィド結合を有する蛋白質の形成の
効率が低いことが予想される。種々の真核生物由来の蛋
白質（特に分泌蛋白質類）が、大腸菌内で不溶化分子集
合体を形成する原因の１つがこのジスルフィドイソメラ
ーゼ活性の低さにあると考えることも可能である。大腸
菌では、ジスルフィド還元酵素としてチオレドキシシン
を含むが、チオレドキシンはジスルフィド還元酵素とし
てはＰＤＩよりも強力であるが、イソメラーゼとしての
効率はよくない。一方、分子内ジスルフィド結合は、分
泌蛋白質に高頻度にみられることから、分泌能の高い細
胞あるいは組織においてジスルフィド異性化を介したジ
スルフィド結合活性が高いことが予想されるが、実際に
ラットの種々の組織の相対的なＰＤＩ mＲＮＡ含量の比
較（肝臓＞膵臓、腎臓＞肺＞精巣、脾臓＞心臓＞脳の
順）からこのことが強く示唆されている（Edman ら、 N
ature 314,267-270, 1985）。
【０００９】また、還元された状態の環境が蛋白質合成
の場として与えられた場合には、適切なフォールディン
グのために必要とされるジスルフィド結合の形成は阻害
されるであろう。このような環境は、例えば、コンパー
トメントがないような原核生物の細胞内で生じる。この
ような点を考えると、原核生物細胞と真核生物細胞で
は、ジスルフィド結合形成に関わる因子とそれを可能に
させる環境とが異なるのかもしれない。組換えＤＮＡ技
術を用いて、有用な蛋白質（その多くは分泌性の蛋白質
である）を産生させようとするとき、その蛋白質に適し
た条件でジスルフィド結合の形成をおこなわせる必要が
ある。そのためには、宿主細胞内の環境（適切なコンパ
ートメント）が実現しなければならないであろうし、そ
の環境（コンパートメント）に親和性の高いジスルフィ
ド形成（ジスルフィド異性化）酵素が多量に存在しなけ
ればならないであろう。
の場として与えられた場合には、適切なフォールディン
グのために必要とされるジスルフィド結合の形成は阻害
されるであろう。このような環境は、例えば、コンパー
トメントがないような原核生物の細胞内で生じる。この
ような点を考えると、原核生物細胞と真核生物細胞で
は、ジスルフィド結合形成に関わる因子とそれを可能に
させる環境とが異なるのかもしれない。組換えＤＮＡ技
術を用いて、有用な蛋白質（その多くは分泌性の蛋白質
である）を産生させようとするとき、その蛋白質に適し
た条件でジスルフィド結合の形成をおこなわせる必要が
ある。そのためには、宿主細胞内の環境（適切なコンパ
ートメント）が実現しなければならないであろうし、そ
の環境（コンパートメント）に親和性の高いジスルフィ
ド形成（ジスルフィド異性化）酵素が多量に存在しなけ
ればならないであろう。
【００１０】これら二つの点は組換えＤＮＡ技術を用い
て、ジスルフィド結合を有する蛋白質を効率よく産生さ
せる際に最も注意しなければならない点と考えられる。
て、ジスルフィド結合を有する蛋白質を効率よく産生さ
せる際に最も注意しなければならない点と考えられる。
【００１１】しかしながら、いままでin vivoの系でプ
ロテインジスルフィドイソメラーゼを適切なコンパート
メントで多量にそして、目的とする有用蛋白質と共存さ
せつつそれに働かせる系は存在していない。
ロテインジスルフィドイソメラーゼを適切なコンパート
メントで多量にそして、目的とする有用蛋白質と共存さ
せつつそれに働かせる系は存在していない。
【００１２】
【発明が解決しようとする問題点】in vitro での変性
蛋白質の再構成への利用又は、細胞内での分泌蛋白質の
産生率向上への利用等が考えられているにもかかわら
ず、該酵素の入手は臓器からの直接的精製に限られてい
た。各種細胞での他種由来のＰＤＩの発現はいまだなさ
れておらず、遺伝子工学的に産生する手段、他の有用ポ
リペプチドの遺伝子と共役させることによってその産生
効率を挙げる手段等は確立されていなかった。
蛋白質の再構成への利用又は、細胞内での分泌蛋白質の
産生率向上への利用等が考えられているにもかかわら
ず、該酵素の入手は臓器からの直接的精製に限られてい
た。各種細胞での他種由来のＰＤＩの発現はいまだなさ
れておらず、遺伝子工学的に産生する手段、他の有用ポ
リペプチドの遺伝子と共役させることによってその産生
効率を挙げる手段等は確立されていなかった。
【００１３】本発明は、ヒトＰＤＩ発現用のヒト血清ア
ルブミンプレプロ配列をコードするＤＮＡとヒトＰＤＩ
遺伝子とから成る連結遺伝子、該連結遺伝子を宿主内で
発現させ得る発現ベクター、該ベクターで宿主が形質転
換された形質転換体、該形質転換体内で該連結遺伝子を
発現させることによる組換えヒトＰＤＩの製造方法及び
組換えＰＤＩを提供することを目的とする。
ルブミンプレプロ配列をコードするＤＮＡとヒトＰＤＩ
遺伝子とから成る連結遺伝子、該連結遺伝子を宿主内で
発現させ得る発現ベクター、該ベクターで宿主が形質転
換された形質転換体、該形質転換体内で該連結遺伝子を
発現させることによる組換えヒトＰＤＩの製造方法及び
組換えＰＤＩを提供することを目的とする。
【００１４】さらにまた、本発明は、共発現可能な該連
結遺伝子と生産を目的とするポリペプチドをコードする
外来遺伝子とを含む形質転換体、及び該形質転換体内で
ヒトＰＤＩ及び該外来遺伝子を共発現させることによる
該ポリペプチドの製造方法を提供することを目的とす
る。
結遺伝子と生産を目的とするポリペプチドをコードする
外来遺伝子とを含む形質転換体、及び該形質転換体内で
ヒトＰＤＩ及び該外来遺伝子を共発現させることによる
該ポリペプチドの製造方法を提供することを目的とす
る。
【００１５】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、上記目
的を達成するために鋭意研究した結果、ヒト血清アルブ
ミンプレプロ配列をコードするＤＮＡとヒトプロテイン
ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子とを連結した遺伝子を
作製し、これを組み込んだ発現用ベクターを見出したこ
とにより本発明を完成させた。
的を達成するために鋭意研究した結果、ヒト血清アルブ
ミンプレプロ配列をコードするＤＮＡとヒトプロテイン
ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子とを連結した遺伝子を
作製し、これを組み込んだ発現用ベクターを見出したこ
とにより本発明を完成させた。
【００１６】以下に本発明の詳細を説明する。
【００１７】ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ
（protein disulphide isomerase；「ＰＤＩ」と略称す
る） cＤＮＡをコードするクローンは、ヒト肝臓λgt11
cＤＮＡライブラリー及びヒト胎盤λgt11 cＤＮＡライ
ブラリー（Clontech社）から次のようにして分離され
る。
（protein disulphide isomerase；「ＰＤＩ」と略称す
る） cＤＮＡをコードするクローンは、ヒト肝臓λgt11
cＤＮＡライブラリー及びヒト胎盤λgt11 cＤＮＡライ
ブラリー（Clontech社）から次のようにして分離され
る。
【００１８】ヒト肝臓及びヒト胎盤λgt11 cＤＮＡライ
ブラリーを大腸菌にファージ感染させ、増殖させ、ファ
ージＤＮＡをフィルターに固定する。一方、ヒトプロリ
ン 4−水酸化酵素（ＰＤＩと同一タンパク質） cＤＮＡ
［Pihlajaniemi,T. ら（1987）EMBO J. 6, 643]の 243
番目から 282番目の塩基配列の相補鎖に対応する40 mer
の合成オリゴマーＤＮＡをプローブとするハイブリダイ
ゼーションにより陽性クローンをスクリーニングし、そ
のファージＤＮＡをEcoRI 消化し、得られた約150 bpの
インサートＤＮＡをPDI cDNAスクリーニング用プローブ
とする。このプローブを用いて、フィルターに固定され
た上記ファージＤＮＡをスクリーニングして、陽性クロ
ーンを分離する。
ブラリーを大腸菌にファージ感染させ、増殖させ、ファ
ージＤＮＡをフィルターに固定する。一方、ヒトプロリ
ン 4−水酸化酵素（ＰＤＩと同一タンパク質） cＤＮＡ
［Pihlajaniemi,T. ら（1987）EMBO J. 6, 643]の 243
番目から 282番目の塩基配列の相補鎖に対応する40 mer
の合成オリゴマーＤＮＡをプローブとするハイブリダイ
ゼーションにより陽性クローンをスクリーニングし、そ
のファージＤＮＡをEcoRI 消化し、得られた約150 bpの
インサートＤＮＡをPDI cDNAスクリーニング用プローブ
とする。このプローブを用いて、フィルターに固定され
た上記ファージＤＮＡをスクリーニングして、陽性クロ
ーンを分離する。
【００１９】このようにして得られた複数の陽性クロー
ンをEcoRI 消化してEcoRI インサートＤＮＡ断片を得
て、各クローンのインサートについて制限酵素地図を作
成し、Pihlajaniemiらによる制限酵素地図と比較した結
果、肝臓由来のクローン(pHPDIl6) と胎盤由来のクロー
ン(pHPDIp4) とでヒトＰＤＩ cＤＮＡの全長をカバーし
ていることが推測された。
ンをEcoRI 消化してEcoRI インサートＤＮＡ断片を得
て、各クローンのインサートについて制限酵素地図を作
成し、Pihlajaniemiらによる制限酵素地図と比較した結
果、肝臓由来のクローン(pHPDIl6) と胎盤由来のクロー
ン(pHPDIp4) とでヒトＰＤＩ cＤＮＡの全長をカバーし
ていることが推測された。
【００２０】両クローンのＤＮＡ塩基配列を決定した結
果、これらのクローンが配列番号１に示される全長2454
塩基対から成るヒトPDI cDNAをコードしていることが判
明した。また、その塩基配列から推定されたアミノ酸配
列は配列番号１に示すとおりであった。配列中、成熟タ
ンパク質は Asp1 から Leu491 の 491個のアミノ酸から
構成されていると考えられ、 Asp1 に先行する17個のア
ミノ酸から成るペプチドはシグナルペプチドを表わして
いると考えられる。
果、これらのクローンが配列番号１に示される全長2454
塩基対から成るヒトPDI cDNAをコードしていることが判
明した。また、その塩基配列から推定されたアミノ酸配
列は配列番号１に示すとおりであった。配列中、成熟タ
ンパク質は Asp1 から Leu491 の 491個のアミノ酸から
構成されていると考えられ、 Asp1 に先行する17個のア
ミノ酸から成るペプチドはシグナルペプチドを表わして
いると考えられる。
【００２１】本発明は、ＰＤＩを発現・産生させるため
の、ヒト血清アルブミン遺伝子プレプロ配列をコードす
るＤＮＡと前記ヒトＰＤＩ遺伝子とから成る連結遺伝子
を提供する。
の、ヒト血清アルブミン遺伝子プレプロ配列をコードす
るＤＮＡと前記ヒトＰＤＩ遺伝子とから成る連結遺伝子
を提供する。
【００２２】該連結遺伝子は、例えば第１図Ｃに示すよ
うに、通常ＰＤＩ遺伝子の上流に該プレプロ配列をコー
ドするＤＮＡを配置させることによって作製され得る。
但し、ヒトＰＤＩを適切なコンパートメント（小胞体と
考えられている）に輸送するためのリーダー配列として
はヒト血清アルブミンのプレプロ配列に限定する必要は
なく、他のシグナル配列やプレプロ配列であってもよ
い。
うに、通常ＰＤＩ遺伝子の上流に該プレプロ配列をコー
ドするＤＮＡを配置させることによって作製され得る。
但し、ヒトＰＤＩを適切なコンパートメント（小胞体と
考えられている）に輸送するためのリーダー配列として
はヒト血清アルブミンのプレプロ配列に限定する必要は
なく、他のシグナル配列やプレプロ配列であってもよ
い。
【００２３】具体的には、前記クローン pHPDIl6及び p
HPDIp4 DNAを、夫々EcoRI/PstI、PstI/BamHIで消化し、
約490bp 及び約1.3kbpのＤＮＡ断片を得、両断片をEcoR
I/BamHI 消化プラスミドベクターpUC119に連結し (phPD
IEB)、Kunkel法［Kunkel,T.A. (1985)Proc.Natl.Acad.S
ci. USA 82, 488 ］により cＤＮＡ上のＰＤＩシグナル
配列とＰＤＩ本体との境界部分に制限酵素NaeI切断部位
を導入し(phPDINae)、NaeI/Hind III 消化によりＰＤＩ
シグナル配列を含まない約1.7kb のPDI DNA 断片を得
る。
HPDIp4 DNAを、夫々EcoRI/PstI、PstI/BamHIで消化し、
約490bp 及び約1.3kbpのＤＮＡ断片を得、両断片をEcoR
I/BamHI 消化プラスミドベクターpUC119に連結し (phPD
IEB)、Kunkel法［Kunkel,T.A. (1985)Proc.Natl.Acad.S
ci. USA 82, 488 ］により cＤＮＡ上のＰＤＩシグナル
配列とＰＤＩ本体との境界部分に制限酵素NaeI切断部位
を導入し(phPDINae)、NaeI/Hind III 消化によりＰＤＩ
シグナル配列を含まない約1.7kb のPDI DNA 断片を得
る。
【００２４】 一方、pUC119をEcoRI 消化し、これにXhoIリンカー： ５′-AATTCTCGAG GAGCTCTTAA-５′ を連結し、XhoI/BamHI消化し、これにヒト血清アルブミ
ン（以下「ＨＳＡ」と略称する）プレプロ配列を連結し
(pUC 119 Sig) 、StuI/Hind III 消化し3.2kb のＤＮＡ
断片を得る（ＨＳＡプレプロ配列の合成法は後述の実施
例に示される）。
ン（以下「ＨＳＡ」と略称する）プレプロ配列を連結し
(pUC 119 Sig) 、StuI/Hind III 消化し3.2kb のＤＮＡ
断片を得る（ＨＳＡプレプロ配列の合成法は後述の実施
例に示される）。
【００２５】phPDINae由来の1.7kb DNA 断片とpUC 119
Sig 由来の3.2kb DNA 断片を連結し(phPDILy1)、EcoRI
消化、Klenow断片による平滑化、BamHI 消化を順次行っ
てＨＳＡプレプロ配列下流にヒトＰＤＩ本体を接続した
（第２図）、リーダー配列改変型の連結遺伝子を得るこ
とができる。
Sig 由来の3.2kb DNA 断片を連結し(phPDILy1)、EcoRI
消化、Klenow断片による平滑化、BamHI 消化を順次行っ
てＨＳＡプレプロ配列下流にヒトＰＤＩ本体を接続した
（第２図）、リーダー配列改変型の連結遺伝子を得るこ
とができる。
【００２６】本発明の連結遺伝子の作製方法及びその構
成遺伝子間の配置は、上述の方法に限定されるものでは
なく、ＰＤＩを発現させ得る能力を有するものは全て包
含される。また、該連結遺伝子の類似体は本発明の範囲
外であるが、ヒト以外の他の動物由来の対応遺伝子から
容易に作製され得ることは自明であろう。
成遺伝子間の配置は、上述の方法に限定されるものでは
なく、ＰＤＩを発現させ得る能力を有するものは全て包
含される。また、該連結遺伝子の類似体は本発明の範囲
外であるが、ヒト以外の他の動物由来の対応遺伝子から
容易に作製され得ることは自明であろう。
【００２７】本発明はまた、配列番号２に示される−２
４番目〜＋４９１番目のアミノ酸配列をコードする塩基
配列から成る該連結遺伝子を提供する。この場合、この
塩基配列と実質的に同様の作用を示す遺伝子、例えば遺
伝子コードの縮重に基づく該塩基配列の誘導体は全て本
発明に包含される。例えば、本発明の実施態様により、
本発明は配列番号２に示される全塩基配列からなる該連
結遺伝子を提供する。
４番目〜＋４９１番目のアミノ酸配列をコードする塩基
配列から成る該連結遺伝子を提供する。この場合、この
塩基配列と実質的に同様の作用を示す遺伝子、例えば遺
伝子コードの縮重に基づく該塩基配列の誘導体は全て本
発明に包含される。例えば、本発明の実施態様により、
本発明は配列番号２に示される全塩基配列からなる該連
結遺伝子を提供する。
【００２８】本発明はさらに、本発明連結遺伝子を宿主
内で発現させ得る複製可能な発現ベクターを提供する。
内で発現させ得る複製可能な発現ベクターを提供する。
【００２９】本発明連結遺伝子を組み込むためのベクタ
ーは、宿主内で発現可能であり且つ複製能を有するもの
である。一般的には、宿主細胞と適合し得る種から誘導
されたレプリコン及び制御配列を含むベクターが、宿主
と関連して使用される。ベクターは、通常、形質転換さ
れた細胞中での表現型選択を可能にするマーカー配列と
複製部位とを保有している。
ーは、宿主内で発現可能であり且つ複製能を有するもの
である。一般的には、宿主細胞と適合し得る種から誘導
されたレプリコン及び制御配列を含むベクターが、宿主
と関連して使用される。ベクターは、通常、形質転換さ
れた細胞中での表現型選択を可能にするマーカー配列と
複製部位とを保有している。
【００３０】本発明の発現ベクターを構築するためのベ
クターとしては、例えば本出願人による特開平 2−1173
84号公報に開示のプラスミド pJDB-ADH-HSA-A （第１図
−Ｃ参照）が使用される。このプラスミドはHSA cDNAを
含み、また酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ
Ｉ）プロモーター、ＡＤＨターミネーター、アンピシリ
ン耐性遺伝子(Ampr ) 、及びLeu2遺伝子を含んでいる。
そのため、このプラスミドを、XhoI消化し、Klenow断片
により平滑し、BamHI 消化してHSA cDNAを除去する。得
られた約8kb DNA 断片の５′端を脱リン酸化した後、前
述の本発明連結遺伝子を連結することにより、発現プラ
スミド(pAHhPDILy1)を得ることができる。もちろん、本
発明の連結遺伝子を発現させ得る同等の機能を果すこと
ができる別の種類のベクターを使用することもできる。
クターとしては、例えば本出願人による特開平 2−1173
84号公報に開示のプラスミド pJDB-ADH-HSA-A （第１図
−Ｃ参照）が使用される。このプラスミドはHSA cDNAを
含み、また酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ
Ｉ）プロモーター、ＡＤＨターミネーター、アンピシリ
ン耐性遺伝子(Ampr ) 、及びLeu2遺伝子を含んでいる。
そのため、このプラスミドを、XhoI消化し、Klenow断片
により平滑し、BamHI 消化してHSA cDNAを除去する。得
られた約8kb DNA 断片の５′端を脱リン酸化した後、前
述の本発明連結遺伝子を連結することにより、発現プラ
スミド(pAHhPDILy1)を得ることができる。もちろん、本
発明の連結遺伝子を発現させ得る同等の機能を果すこと
ができる別の種類のベクターを使用することもできる。
【００３１】本発明はさらに、本発明の発現ベクターで
宿主を形質転換して得られる形質転換体を提供する。
宿主を形質転換して得られる形質転換体を提供する。
【００３２】宿主としては、大腸菌、枯草菌などの原核
細胞、及び酵母が挙げられ、特にプロセシングを介して
成熟型ＰＤＩを分泌し得る宿主が好ましい。好適な宿主
は酵母である。宿主酵母としては、Saccharomyces ce
revisiae等が挙げられ、本発明の形質転換体の作製にあ
たっては特に酵母ＡＨ22株が好適に使用される。本発明
の範囲外であるが、酵母以外の真核細胞（例えば、動物
細胞）も宿主として使用し得ることは自明であろう。宿
主細胞への発現ベクターの移入は慣用的方法で実施さ
れ、例えば、塩化カルシウム処理法、プロトプラスト
（又はスフェロプラスト）−ポリエチレングリコール
法、電気穿孔法などにより容易に実施され得る。目的の
形質転換体は、発現ベクターがpAHhPDILy1の場合、得ら
れた菌体をＳＤ(-Leu)プレート上で培養することによっ
てスクリーニングし、取得される。
細胞、及び酵母が挙げられ、特にプロセシングを介して
成熟型ＰＤＩを分泌し得る宿主が好ましい。好適な宿主
は酵母である。宿主酵母としては、Saccharomyces ce
revisiae等が挙げられ、本発明の形質転換体の作製にあ
たっては特に酵母ＡＨ22株が好適に使用される。本発明
の範囲外であるが、酵母以外の真核細胞（例えば、動物
細胞）も宿主として使用し得ることは自明であろう。宿
主細胞への発現ベクターの移入は慣用的方法で実施さ
れ、例えば、塩化カルシウム処理法、プロトプラスト
（又はスフェロプラスト）−ポリエチレングリコール
法、電気穿孔法などにより容易に実施され得る。目的の
形質転換体は、発現ベクターがpAHhPDILy1の場合、得ら
れた菌体をＳＤ(-Leu)プレート上で培養することによっ
てスクリーニングし、取得される。
【００３３】従って、本発明はまた、上述のようにして
作製した形質転換体内で本発明の連結遺伝子を発現させ
ることによる組換えヒトＰＤＩの製造方法を提供する。
本発明の実施態様によれば、本発明の製造方法は以下に
示す段階を含む。
作製した形質転換体内で本発明の連結遺伝子を発現させ
ることによる組換えヒトＰＤＩの製造方法を提供する。
本発明の実施態様によれば、本発明の製造方法は以下に
示す段階を含む。
【００３４】即ち、本発明連結遺伝子を宿主内で発現さ
せ得る複製可能な発現ベクターを構築する段階と、宿主
を前記発現ベクターで形質転換して形質転換体を得る段
階と、前記連結遺伝子を発現させ得る条件下で、前記形
質転換体を培養して組換えヒトＰＤＩを分泌させる段階
と、前記組換えＰＤＩを回収する段階と、を包含する。
せ得る複製可能な発現ベクターを構築する段階と、宿主
を前記発現ベクターで形質転換して形質転換体を得る段
階と、前記連結遺伝子を発現させ得る条件下で、前記形
質転換体を培養して組換えヒトＰＤＩを分泌させる段階
と、前記組換えＰＤＩを回収する段階と、を包含する。
【００３５】宿主として酵母を用いる場合には、ヒトＰ
ＤＩ前駆体タンパク質がプロセシングを受けて、組換え
ヒトＰＤＩが遺伝子産物として分泌される。もし宿主と
して酵母以外の例えば大腸菌、枯草菌等の微生物が用い
られる場合には、プロセシングを受けていないヒトＰＤ
Ｉ前駆体タンパク質が得られるだろう。
ＤＩ前駆体タンパク質がプロセシングを受けて、組換え
ヒトＰＤＩが遺伝子産物として分泌される。もし宿主と
して酵母以外の例えば大腸菌、枯草菌等の微生物が用い
られる場合には、プロセシングを受けていないヒトＰＤ
Ｉ前駆体タンパク質が得られるだろう。
【００３６】遠心分離により細胞と培養培地とを分離
し、必要に応じて細胞を破砕し、次に例えば限外濾過に
より濃縮した濃縮液を疎水性カラムクロマクトグラフィ
ーに掛けることにより組換えヒトＰＤＩを容易に精製単
離することができる。このクロマトグラフィーに使用し
得る疎水性カラムは特定のものに限定されるものではな
いが、例えばTSK-gel Phenyl-5PW疎水性カラム（東ソー
製）が使用され得、この場合組換えヒトＰＤＩはＫＣｌ
含有ホウ酸緩衝液（pH 8.0）中0.85Ｍから 0Ｍ硫酸アン
モニウムへの直線的濃度勾配により溶出され得る（第４
図）。ＳＤＳ電気泳動分析（第５図）から組換えヒトＰ
ＤＩは、約55kDa の分子量を有し、またスクランブルド
リボヌクレアーゼＡの再構成の程度を指標として定量す
ることにより、得られた組換えヒトＰＤＩはＰＤＩ活性
をもつことも確認された（後述の実施例参照）。
し、必要に応じて細胞を破砕し、次に例えば限外濾過に
より濃縮した濃縮液を疎水性カラムクロマクトグラフィ
ーに掛けることにより組換えヒトＰＤＩを容易に精製単
離することができる。このクロマトグラフィーに使用し
得る疎水性カラムは特定のものに限定されるものではな
いが、例えばTSK-gel Phenyl-5PW疎水性カラム（東ソー
製）が使用され得、この場合組換えヒトＰＤＩはＫＣｌ
含有ホウ酸緩衝液（pH 8.0）中0.85Ｍから 0Ｍ硫酸アン
モニウムへの直線的濃度勾配により溶出され得る（第４
図）。ＳＤＳ電気泳動分析（第５図）から組換えヒトＰ
ＤＩは、約55kDa の分子量を有し、またスクランブルド
リボヌクレアーゼＡの再構成の程度を指標として定量す
ることにより、得られた組換えヒトＰＤＩはＰＤＩ活性
をもつことも確認された（後述の実施例参照）。
【００３７】本発明方法によって産生される組換えヒト
ＰＤＩは、天然型のヒトＰＤＩと比較してＮ末端アミノ
酸が AspからGly に改変されたものであった。従って、
本発明は 491個のアミノ酸から成る配列番号３に示され
る Gly1 ………… Leu491 のアミノ酸配列から構成され
る組換えヒトＰＤＩをも提供する。
ＰＤＩは、天然型のヒトＰＤＩと比較してＮ末端アミノ
酸が AspからGly に改変されたものであった。従って、
本発明は 491個のアミノ酸から成る配列番号３に示され
る Gly1 ………… Leu491 のアミノ酸配列から構成され
る組換えヒトＰＤＩをも提供する。
【００３８】本発明はさらに、共発現可能な、ヒトＰＤ
Ｉ遺伝子とヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードす
るＤＮＡとから成る連結遺伝子と、生産を目的とするポ
リペプチドをコードする外来遺伝子とを含む形質転換体
を提供する。
Ｉ遺伝子とヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードす
るＤＮＡとから成る連結遺伝子と、生産を目的とするポ
リペプチドをコードする外来遺伝子とを含む形質転換体
を提供する。
【００３９】形質転換体中の該連結遺伝子と該外来遺伝
子は、互いに共発現可能な状態であれば、同一ゲノム上
にあってもよく、又は異なるゲノム上にあってもよい。
宿主細胞の形質転換は、例えば、該連結遺伝子及び該外
来遺伝子を同一の又は異なるベクター内に組み込み、得
られたベクターを塩化カルシウム処理法、プロトプラス
ト（又はスフェロプラスト）−ポリエチレングリコール
法、電気穿孔法などの慣用的方法で宿主内に移入するこ
とによって実施され得る。
子は、互いに共発現可能な状態であれば、同一ゲノム上
にあってもよく、又は異なるゲノム上にあってもよい。
宿主細胞の形質転換は、例えば、該連結遺伝子及び該外
来遺伝子を同一の又は異なるベクター内に組み込み、得
られたベクターを塩化カルシウム処理法、プロトプラス
ト（又はスフェロプラスト）−ポリエチレングリコール
法、電気穿孔法などの慣用的方法で宿主内に移入するこ
とによって実施され得る。
【００４０】該外来遺伝子によってコードされるポリペ
プチドは、増幅発現されたＰＤＩの触媒作用（即ちポリ
ペプチド中のジスルフィド結合の形成、交換反応等を促
進する）が直接的に発揮されるために、その構造中にジ
スルフィド結合を含むものであれば如何なる種類のポリ
ペプチドであってもよい。さらに、本発明は、増幅発現
されたＰＤＩ活性の効果が遺伝子発現、ポリペプチドの
フォールディング、輸送等に関与する蛋白質に対して発
揮され、それにより間接的に生産性が増大するような場
合にも適用される。本発明の実施態様により、本発明は
また該外来遺伝子としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
をコードする遺伝子を提供する。
プチドは、増幅発現されたＰＤＩの触媒作用（即ちポリ
ペプチド中のジスルフィド結合の形成、交換反応等を促
進する）が直接的に発揮されるために、その構造中にジ
スルフィド結合を含むものであれば如何なる種類のポリ
ペプチドであってもよい。さらに、本発明は、増幅発現
されたＰＤＩ活性の効果が遺伝子発現、ポリペプチドの
フォールディング、輸送等に関与する蛋白質に対して発
揮され、それにより間接的に生産性が増大するような場
合にも適用される。本発明の実施態様により、本発明は
また該外来遺伝子としてヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
をコードする遺伝子を提供する。
【００４１】本明細書中、「ポリペプチド」なる用語
は、短鎖及び長鎖ペプチド並びに蛋白質を含むことを意
味する。
は、短鎖及び長鎖ペプチド並びに蛋白質を含むことを意
味する。
【００４２】また宿主としては、大腸菌、枯草菌などの
原核細胞、酵母、動物細胞などの真核細胞が挙げられ
る。特に、翻訳後修飾やプロセシングを介して成熟ポリ
ペプチドを分泌し得る宿主、例えば真核細胞が好まし
く、特に酵母が好ましい。
原核細胞、酵母、動物細胞などの真核細胞が挙げられ
る。特に、翻訳後修飾やプロセシングを介して成熟ポリ
ペプチドを分泌し得る宿主、例えば真核細胞が好まし
く、特に酵母が好ましい。
【００４３】本発明はさらに、上記形質転換体内で、ヒ
トＰＤＩ遺伝子と他のポリペプチドをコードする外来遺
伝子とを共発現させて該ポリペプチドを産生させ、及び
該ポリペプチドを回収することから成るポリペプチドの
製造方法を提供する。
トＰＤＩ遺伝子と他のポリペプチドをコードする外来遺
伝子とを共発現させて該ポリペプチドを産生させ、及び
該ポリペプチドを回収することから成るポリペプチドの
製造方法を提供する。
【００４４】本発明の実施態様により、ヒトＰＤＩ発現
プラスミドを用いてＨＳＡ生産酵母を形質転換して得ら
れた酵母内でＨＳＡ及びＰＤＩを任意の培地中で共発現
させた場合には、単独に発現させた場合と比べて、ＨＳ
Ａの分泌量は平均で約６０％増加した（第８図）。
プラスミドを用いてＨＳＡ生産酵母を形質転換して得ら
れた酵母内でＨＳＡ及びＰＤＩを任意の培地中で共発現
させた場合には、単独に発現させた場合と比べて、ＨＳ
Ａの分泌量は平均で約６０％増加した（第８図）。
【００４５】理論に拘束されるつもりはないが、共発現
によるＨＳＡ分泌量の増加に関しては以下のように考え
られる。
によるＨＳＡ分泌量の増加に関しては以下のように考え
られる。
【００４６】ＨＳＡは、１７個のジスルフィド結合を持
つ蛋白質であり、かつ、in vitroでの変性蛋白質から
の再構成実験において化学量論的量のＰＤＩの存在によ
り、その高次構造形成が促進されることが知られてい
る。
つ蛋白質であり、かつ、in vitroでの変性蛋白質から
の再構成実験において化学量論的量のＰＤＩの存在によ
り、その高次構造形成が促進されることが知られてい
る。
【００４７】酵母ＨＩＳ２３株によって、ＨＳＡは可溶
性分子として分泌されるが、同菌体の細胞内にもＨＳＡ
分子が検出されている。ＳＤＳ電気泳動法により、細胞
内のＨＳＡを分析すると、還元剤存在下ではゲル上で単
一バンドとして正常なＨＳＡ分子と同一の挙動を示すの
に対し、還元剤非存在下では、より分子量の大きい不連
続なバンド群として検出され、明らかに正常なＨＳＡと
は異なる挙動を示す。これらの結果は、細胞内に存在す
るＨＳＡ分子は、分子内ジスルフィド結合が不完全に形
成されているため生じると推定される。一方、ＰＤＩを
共発現させた細胞では、細胞内のＨＳＡの還元剤非存在
下でのＳＤＳ電気泳動では、ＨＳＡ分子は外来のＰＤＩ
ｃＤＮＡを共発現させていない酵母菌から得た細胞内Ｈ
ＳＡ試料と比較してよりまとまったバンドとして検出さ
れることから、ＰＤＩはＨＳＡ分子内の正常なジスルフ
ィド結合の形成を促進し、より効率的にＨＳＡ分子の高
次構造形成を補助していると推定される。このことによ
って、例えば、不安定な構造を持つＨＳＡの細胞内での
会合や、プロテアーゼによる分解がより少なくなるため
に分泌量が増加していると思われる。
性分子として分泌されるが、同菌体の細胞内にもＨＳＡ
分子が検出されている。ＳＤＳ電気泳動法により、細胞
内のＨＳＡを分析すると、還元剤存在下ではゲル上で単
一バンドとして正常なＨＳＡ分子と同一の挙動を示すの
に対し、還元剤非存在下では、より分子量の大きい不連
続なバンド群として検出され、明らかに正常なＨＳＡと
は異なる挙動を示す。これらの結果は、細胞内に存在す
るＨＳＡ分子は、分子内ジスルフィド結合が不完全に形
成されているため生じると推定される。一方、ＰＤＩを
共発現させた細胞では、細胞内のＨＳＡの還元剤非存在
下でのＳＤＳ電気泳動では、ＨＳＡ分子は外来のＰＤＩ
ｃＤＮＡを共発現させていない酵母菌から得た細胞内Ｈ
ＳＡ試料と比較してよりまとまったバンドとして検出さ
れることから、ＰＤＩはＨＳＡ分子内の正常なジスルフ
ィド結合の形成を促進し、より効率的にＨＳＡ分子の高
次構造形成を補助していると推定される。このことによ
って、例えば、不安定な構造を持つＨＳＡの細胞内での
会合や、プロテアーゼによる分解がより少なくなるため
に分泌量が増加していると思われる。
【００４８】また、ＰＤＩを共発現させた場合とさせな
い場合でのＨＩＳ２３株細胞内のＨＳＡのｍＲＮＡ存在
量をNorthernブロット法により比較すると、ＰＤＩ遺伝
子を発現させた場合にＨＳＡのｍＲＮＡ量が増加してい
る。このことは、ＰＤＩが直接ＨＳＡ分子に作用してい
る可能性だけでなく、ＨＳＡ遺伝子の転写レベルにも影
響を与えている可能性をも示唆している。しかし、小胞
体への膜移行過程を介する細胞内輸送に働くヒト血清ア
ルブミンのリーダー配列の融合によってヒトＰＤＩが多
量に酵母菌から分泌されたこととＨＳＡの分泌量が増加
したこととが相関していることから、ＰＤＩは、小胞体
においてＨＳＡと共存し、直接ＨＳＡに作用したことが
ＨＳＡの産生レベルを上昇させた主要因であると考えた
ほうがより単純であるようにみえる。さらに、ＨＩＳ２
３株より分泌されたＨＳＡとＰＤＩの量をみると、ＰＤ
ＩはＨＳＡの数倍分泌されており、さらに細胞内に検出
されるヒトＰＤＩレベルも高いことから、変性ＨＳＡの
in vitro での再構成において促進効果を示すのに必要
とされるＰＤＩ量が十分に該酵母菌小胞体内でも確保さ
れているものと推定される。このこともまた、ＰＤＩが
ＨＳＡに直接作用していることを支持しているようにみ
える。
い場合でのＨＩＳ２３株細胞内のＨＳＡのｍＲＮＡ存在
量をNorthernブロット法により比較すると、ＰＤＩ遺伝
子を発現させた場合にＨＳＡのｍＲＮＡ量が増加してい
る。このことは、ＰＤＩが直接ＨＳＡ分子に作用してい
る可能性だけでなく、ＨＳＡ遺伝子の転写レベルにも影
響を与えている可能性をも示唆している。しかし、小胞
体への膜移行過程を介する細胞内輸送に働くヒト血清ア
ルブミンのリーダー配列の融合によってヒトＰＤＩが多
量に酵母菌から分泌されたこととＨＳＡの分泌量が増加
したこととが相関していることから、ＰＤＩは、小胞体
においてＨＳＡと共存し、直接ＨＳＡに作用したことが
ＨＳＡの産生レベルを上昇させた主要因であると考えた
ほうがより単純であるようにみえる。さらに、ＨＩＳ２
３株より分泌されたＨＳＡとＰＤＩの量をみると、ＰＤ
ＩはＨＳＡの数倍分泌されており、さらに細胞内に検出
されるヒトＰＤＩレベルも高いことから、変性ＨＳＡの
in vitro での再構成において促進効果を示すのに必要
とされるＰＤＩ量が十分に該酵母菌小胞体内でも確保さ
れているものと推定される。このこともまた、ＰＤＩが
ＨＳＡに直接作用していることを支持しているようにみ
える。
【００４９】このように、ＨＳＡの例でＰＤＩの共発現
によってその分泌量の増加効果が得られ、その効果がＰ
ＤＩが直接ＨＳＡの高次構造形成に働いている可能性が
高いことから、より一般的に、ジスルフィド結合の形成
が、高次構造の形成や安定化に寄与している分泌蛋白質
全般についても同一細胞内でＰＤＩを高度に増幅発現さ
せることにより同様の分泌量の増加効果が期待できると
考えられる。
によってその分泌量の増加効果が得られ、その効果がＰ
ＤＩが直接ＨＳＡの高次構造形成に働いている可能性が
高いことから、より一般的に、ジスルフィド結合の形成
が、高次構造の形成や安定化に寄与している分泌蛋白質
全般についても同一細胞内でＰＤＩを高度に増幅発現さ
せることにより同様の分泌量の増加効果が期待できると
考えられる。
【００５０】以下の実施例により、さらに本発明を説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。
【００５１】
【実施例】ヒトＰＤＩ(protein disulphide isomerase)cDNAのクロ
ーン化 ヒト肝臓λgt11cDNAライブラリー（Clontech社）約100,
000 クローンを 0.2％のマルトースを含むＬＢ培地（1%
バクトトリプトン、 1% NaClおよび 0.5％イーストエキ
ストラクト）で37℃一晩培養した大腸菌Ｙ1090株培養液
500μl と混合し、これに 1M MgCl2 ５μl を加え37℃
で10分間加温することによりファージを大腸菌に感染さ
せた。これを50mlのＬＢ上層寒天培地（ＬＢ培地、 10m
M MgCl2および 0.7％アガロース）に加え混合後、23cm
×23cmプレート中のＬＢ寒天培地上にまいた。上層寒天
培地を固めた後、37℃で一晩培養しファージを増殖させ
た。得られたファージをフィルター（Hybond-N, Amersh
am社）に移し、アルカリ溶液（0.5N NaOH および0.15M
NaCl）に浸した3MM 濾紙（Whatman 社）上に、ファージ
の付着面を上に向けて１分間置き、続いて中和溶液［1M
Tris-HCl(pH7.5)および1.5M NaCl ］に浸した同濾紙上
に１分間置いた。さらにフィルターを 2×SSC 溶液（20
×SSC ＝3M NaCl および 0.3Ｍクエン酸三ナトリウム）
で洗浄、風乾後、ＵＶ照射を２分間行うことによりファ
ージＤＮＡをフィルターに固定した。こうして得られた
フィルターを用いて以下の手順に従ってヒトPDI cDNAの
スクリーニングを行った。
ーン化 ヒト肝臓λgt11cDNAライブラリー（Clontech社）約100,
000 クローンを 0.2％のマルトースを含むＬＢ培地（1%
バクトトリプトン、 1% NaClおよび 0.5％イーストエキ
ストラクト）で37℃一晩培養した大腸菌Ｙ1090株培養液
500μl と混合し、これに 1M MgCl2 ５μl を加え37℃
で10分間加温することによりファージを大腸菌に感染さ
せた。これを50mlのＬＢ上層寒天培地（ＬＢ培地、 10m
M MgCl2および 0.7％アガロース）に加え混合後、23cm
×23cmプレート中のＬＢ寒天培地上にまいた。上層寒天
培地を固めた後、37℃で一晩培養しファージを増殖させ
た。得られたファージをフィルター（Hybond-N, Amersh
am社）に移し、アルカリ溶液（0.5N NaOH および0.15M
NaCl）に浸した3MM 濾紙（Whatman 社）上に、ファージ
の付着面を上に向けて１分間置き、続いて中和溶液［1M
Tris-HCl(pH7.5)および1.5M NaCl ］に浸した同濾紙上
に１分間置いた。さらにフィルターを 2×SSC 溶液（20
×SSC ＝3M NaCl および 0.3Ｍクエン酸三ナトリウム）
で洗浄、風乾後、ＵＶ照射を２分間行うことによりファ
ージＤＮＡをフィルターに固定した。こうして得られた
フィルターを用いて以下の手順に従ってヒトPDI cDNAの
スクリーニングを行った。
【００５２】プローブには、ヒトプロリン 4−水酸化酵
素（ＰＤＩと同一タンパク質）cDNA［Pihlajaniemi，T.
et al. (1987) EMBO J., 6, 643 ］の 243番目から 2
82番目の塩基配列の相補鎖に対応する40mer のオリゴマ
ーＤＮＡ（５′-TGGCGTCCACCTTGGCCAACCTGATCTCGGAACCT
TCTGC-３′）を、自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosyste
ms社モデル380B）により合成したものを用いた。
素（ＰＤＩと同一タンパク質）cDNA［Pihlajaniemi，T.
et al. (1987) EMBO J., 6, 643 ］の 243番目から 2
82番目の塩基配列の相補鎖に対応する40mer のオリゴマ
ーＤＮＡ（５′-TGGCGTCCACCTTGGCCAACCTGATCTCGGAACCT
TCTGC-３′）を、自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosyste
ms社モデル380B）により合成したものを用いた。
【００５３】合成ＤＮＡ（20pmoles）を 50mM Tris-HCl
（pH7.5)；10mM MgCl2 、 5mMジチオスレイトール、10
0 μCi［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（〜3000Ci／mmol, Amersham
社）および12単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造社）を含む溶液50μl 中で37℃60分間反応させるこ
とによりその 5′端をリン酸化標識した。上記のフィル
ターをプレハイブリダイゼーション溶液［５×デンハル
ト溶液(100×デンハルト溶液＝２％ウシ血清アルブミ
ン、２％フィコール 400および２％ポリビニルピロリド
ン）、1M NaCl 、 50mM Tris-HCl(pH 7.5)、 10mM EDTA
(pH8.0）、 0.1％ドデシルザルコシン酸ナトリウムおよ
び20μｇ／mlの超音波処理をしたサケ精子ＤＮＡ］に37
℃１時間浸したあと、ハイブリダイゼーション溶液（プ
レハイブリダイゼーション溶液に約106 cpm/mlの上記標
識ＤＮＡを含む溶液）中に37℃15時間浸した。このフィ
ルターを 2×SSC 溶液を用いて室温で洗浄し、さらに２
×ＳＳＣ、0.1 ％ドデシルザルコシン酸ナトリウム溶液
で42℃30分間洗浄した後Ｘ線フィルム(XAR-5、Kodak
社）に−80℃で一晩露光させた。フィルムの現像の結
果、１次スクリーニングで８つの陽性シグナルを得た。
これらのシグナルに対応する位置にあるファージを上記
プレートからゲル切片として切り取り１mlのＳＭ緩衝液
［100mM NaCl, 10mM MgCl2 ，50mM Tris-HCl(pH7.5)
および0.01％ゼラチン］に浸し、４℃で一晩静置するこ
とにより、ゲル中のファージを溶液中に回収した。この
ようにして得られた８種の１次スクリーニング陽性ファ
ージについて、それぞれ１次スクリーニングと同様の条
件で２次スクリーニングを行った結果１つのみが陽性ク
ローンとして残った。このクローンについてさらに３次
スクリーニングを行い完全に単一の陽性クローンとして
分離した。
（pH7.5)；10mM MgCl2 、 5mMジチオスレイトール、10
0 μCi［γ−32Ｐ］ＡＴＰ（〜3000Ci／mmol, Amersham
社）および12単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝
酒造社）を含む溶液50μl 中で37℃60分間反応させるこ
とによりその 5′端をリン酸化標識した。上記のフィル
ターをプレハイブリダイゼーション溶液［５×デンハル
ト溶液(100×デンハルト溶液＝２％ウシ血清アルブミ
ン、２％フィコール 400および２％ポリビニルピロリド
ン）、1M NaCl 、 50mM Tris-HCl(pH 7.5)、 10mM EDTA
(pH8.0）、 0.1％ドデシルザルコシン酸ナトリウムおよ
び20μｇ／mlの超音波処理をしたサケ精子ＤＮＡ］に37
℃１時間浸したあと、ハイブリダイゼーション溶液（プ
レハイブリダイゼーション溶液に約106 cpm/mlの上記標
識ＤＮＡを含む溶液）中に37℃15時間浸した。このフィ
ルターを 2×SSC 溶液を用いて室温で洗浄し、さらに２
×ＳＳＣ、0.1 ％ドデシルザルコシン酸ナトリウム溶液
で42℃30分間洗浄した後Ｘ線フィルム(XAR-5、Kodak
社）に−80℃で一晩露光させた。フィルムの現像の結
果、１次スクリーニングで８つの陽性シグナルを得た。
これらのシグナルに対応する位置にあるファージを上記
プレートからゲル切片として切り取り１mlのＳＭ緩衝液
［100mM NaCl, 10mM MgCl2 ，50mM Tris-HCl(pH7.5)
および0.01％ゼラチン］に浸し、４℃で一晩静置するこ
とにより、ゲル中のファージを溶液中に回収した。この
ようにして得られた８種の１次スクリーニング陽性ファ
ージについて、それぞれ１次スクリーニングと同様の条
件で２次スクリーニングを行った結果１つのみが陽性ク
ローンとして残った。このクローンについてさらに３次
スクリーニングを行い完全に単一の陽性クローンとして
分離した。
【００５４】得られた陽性クローンのファージDNA をLe
der らの方法［Leder,P., Tiemeir,D. & Enquist L. (1
977) Science 196, 175 ］により調製した。得られた
ファージＤＮＡの 1/5量を溶液［100mM Tris-HCl(pH7.
5) 、 100mM NaCl、6mM MgCl2 、6mM メルカプトエタ
ノール、 0.1％ゼラチン、20μｇ／mlリボヌクレアーゼ
Ａおよび20単位の EcoRI（ニッポンジーン社）］50μl
中で37℃１時間消化後、0.8％アガロースゲルで電気泳
動を行った結果、この陽性クローンが約150 bpのインサ
ートＤＮＡを含むことが分かった。グラスパウダー（Ge
ne CleanTM、Bio-101 社）を用いてインサートＤＮＡを
分離・精製した。回収したＤＮＡ断片約20ngと EcoRIで
消化したpUC19 ベクター約100 ngとをＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造社）Ａ液20μl 、Ｂ液４μl の混合
液中で16℃15時間反応させることにより両ＤＮＡを連結
させた組換えプラスミドを得た。この反応液10μl を用
いてMandel法［Mandel,M. & Higa,A.(1970) J.Mol.Bio
l. 53, 154 ］により大腸菌ＴＧ１株を形質転換した。
得られた形質転換体を25μｇ／mlアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地 100mlで37℃一晩培養し、アルカリ溶菌法［Birn
boim,H.C.& Doly J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 15
13］によりプラスミドＤＮＡを精製した。このプラスミ
ドＤＮＡ10μｇを溶液[100mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM
NaCl、6mM MgCl2、6mM メルカプトエタノール、 0.1％
ゼラチンおよび 100単位の EcoRI（ニッポンジーン
社）] 200 μl 中で37℃１時間消化後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行い濃縮し、 0.8％アガロースゲ
ル電気泳動行った。約150bp のインサートＤＮＡをグラ
スパウダーで回収し、以下に記すPDI cDNAのスクリーニ
ングに用いるプローブとした。
der らの方法［Leder,P., Tiemeir,D. & Enquist L. (1
977) Science 196, 175 ］により調製した。得られた
ファージＤＮＡの 1/5量を溶液［100mM Tris-HCl(pH7.
5) 、 100mM NaCl、6mM MgCl2 、6mM メルカプトエタ
ノール、 0.1％ゼラチン、20μｇ／mlリボヌクレアーゼ
Ａおよび20単位の EcoRI（ニッポンジーン社）］50μl
中で37℃１時間消化後、0.8％アガロースゲルで電気泳
動を行った結果、この陽性クローンが約150 bpのインサ
ートＤＮＡを含むことが分かった。グラスパウダー（Ge
ne CleanTM、Bio-101 社）を用いてインサートＤＮＡを
分離・精製した。回収したＤＮＡ断片約20ngと EcoRIで
消化したpUC19 ベクター約100 ngとをＤＮＡライゲーシ
ョンキット（宝酒造社）Ａ液20μl 、Ｂ液４μl の混合
液中で16℃15時間反応させることにより両ＤＮＡを連結
させた組換えプラスミドを得た。この反応液10μl を用
いてMandel法［Mandel,M. & Higa,A.(1970) J.Mol.Bio
l. 53, 154 ］により大腸菌ＴＧ１株を形質転換した。
得られた形質転換体を25μｇ／mlアンピシリンを含むＬ
Ｂ培地 100mlで37℃一晩培養し、アルカリ溶菌法［Birn
boim,H.C.& Doly J. (1979) Nucleic Acids Res. 7, 15
13］によりプラスミドＤＮＡを精製した。このプラスミ
ドＤＮＡ10μｇを溶液[100mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM
NaCl、6mM MgCl2、6mM メルカプトエタノール、 0.1％
ゼラチンおよび 100単位の EcoRI（ニッポンジーン
社）] 200 μl 中で37℃１時間消化後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行い濃縮し、 0.8％アガロースゲ
ル電気泳動行った。約150bp のインサートＤＮＡをグラ
スパウダーで回収し、以下に記すPDI cDNAのスクリーニ
ングに用いるプローブとした。
【００５５】ヒトPDI cDNAの全長を含むクローンを得る
ために、改めてヒト肝臓λgt11cDNAライブラリー（Clon
tech社）約50,000クローンおよびヒト胎盤λgt11cDNAラ
イブラリー（同社）約50,000クローンについてのスクリ
ーニングを行った。上記の手順と同様に両ライブラリー
のファージＤＮＡを固定したフィルターを作製した。上
記150bp ヒトPDI cDNA断片約100 ngを［α−32Ｐ］dCTP
（>400Ci/mmol, Amersham 社）およびニックトランスレ
ーションキット（同社）を用いて放射性標識したものを
本スクリーニングに用いた。上記の両フィルターをプレ
ハイブリダイゼーション溶液に60℃１時間浸した後、ハ
イブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーショ
ン溶液に約106 cpm/mlの上記標識ＤＮＡを含む溶液）中
に60℃15時間浸した。このフィルターを 2×SSC 溶液を
用いて室温で洗浄し、さらに 0.5×SSC 、 0.1％ドデシ
ルザルコシン酸ナトリウム溶液で65℃１時間洗浄した後
Ｘ線フィルム（XAR-5, Kodak社）に−80℃で一晩露光さ
せた。フィルムの現像の結果、肝臓 cＤＮＡライブラリ
ーより６個、胎盤 cＤＮＡライブラリーより５個の陽性
シグナルを得た。これらをさらに２次、３次のスクリー
ニングにかけることにより最終的に肝臓 cＤＮＡライブ
ラリーより４個、胎盤 cＤＮＡライブラリーより３個の
陽性クローンを単離した。得られた７つのクローンの E
coRIインサートＤＮＡ断片を前述と同様の方法に従って
プラスミドベクターpUC19 のEcoRI 部位にサブクローン
化した後、７クローンのインサートについての制限酵素
地図を作成した。その結果、肝臓 cＤＮＡの４つおよび
胎盤 cＤＮＡの２つが互いにオーバーラップしており、
かつ、そのうちの肝臓由来のクローン１つ(pHPDIl6) と
胎盤由来のクローン１つ(pHPDIp4) の２つで目的とする
ヒトPDI cDNAの全長をカバーしていることが、これらの
クローンとPihlajaniemiらのクローンの制限酵素地図の
比較から予想された。両クローンについて M13 SEQUENC
ING KIT （東洋紡績社）、M13 Sequencing Kit（宝酒造
社）および自動ＤＮＡシークエンサー（370A, Applied
Biosystems社）によりＤＮＡ塩基配列を決定した。Pihl
ajaniemiらのデータとの比較により両クローンは全長24
54塩基対から成るヒトPDI cDNAをコードすることが明ら
かとなった（配列番号１）。
ために、改めてヒト肝臓λgt11cDNAライブラリー（Clon
tech社）約50,000クローンおよびヒト胎盤λgt11cDNAラ
イブラリー（同社）約50,000クローンについてのスクリ
ーニングを行った。上記の手順と同様に両ライブラリー
のファージＤＮＡを固定したフィルターを作製した。上
記150bp ヒトPDI cDNA断片約100 ngを［α−32Ｐ］dCTP
（>400Ci/mmol, Amersham 社）およびニックトランスレ
ーションキット（同社）を用いて放射性標識したものを
本スクリーニングに用いた。上記の両フィルターをプレ
ハイブリダイゼーション溶液に60℃１時間浸した後、ハ
イブリダイゼーション溶液（プレハイブリダイゼーショ
ン溶液に約106 cpm/mlの上記標識ＤＮＡを含む溶液）中
に60℃15時間浸した。このフィルターを 2×SSC 溶液を
用いて室温で洗浄し、さらに 0.5×SSC 、 0.1％ドデシ
ルザルコシン酸ナトリウム溶液で65℃１時間洗浄した後
Ｘ線フィルム（XAR-5, Kodak社）に−80℃で一晩露光さ
せた。フィルムの現像の結果、肝臓 cＤＮＡライブラリ
ーより６個、胎盤 cＤＮＡライブラリーより５個の陽性
シグナルを得た。これらをさらに２次、３次のスクリー
ニングにかけることにより最終的に肝臓 cＤＮＡライブ
ラリーより４個、胎盤 cＤＮＡライブラリーより３個の
陽性クローンを単離した。得られた７つのクローンの E
coRIインサートＤＮＡ断片を前述と同様の方法に従って
プラスミドベクターpUC19 のEcoRI 部位にサブクローン
化した後、７クローンのインサートについての制限酵素
地図を作成した。その結果、肝臓 cＤＮＡの４つおよび
胎盤 cＤＮＡの２つが互いにオーバーラップしており、
かつ、そのうちの肝臓由来のクローン１つ(pHPDIl6) と
胎盤由来のクローン１つ(pHPDIp4) の２つで目的とする
ヒトPDI cDNAの全長をカバーしていることが、これらの
クローンとPihlajaniemiらのクローンの制限酵素地図の
比較から予想された。両クローンについて M13 SEQUENC
ING KIT （東洋紡績社）、M13 Sequencing Kit（宝酒造
社）および自動ＤＮＡシークエンサー（370A, Applied
Biosystems社）によりＤＮＡ塩基配列を決定した。Pihl
ajaniemiらのデータとの比較により両クローンは全長24
54塩基対から成るヒトPDI cDNAをコードすることが明ら
かとなった（配列番号１）。
【００５６】ヒトＰＤＩの酵母発現プラスミドの構築 上記のヒトPDI cDNAをコードする２つのクローンpHPDIl
6 およびpHPDIp4 をもとにしてヒトＰＤＩの酵母におけ
る発現用プラスミドを以下の手順で構築した（第１図
Ａ、ＢおよびＣ）。
6 およびpHPDIp4 をもとにしてヒトＰＤＩの酵母におけ
る発現用プラスミドを以下の手順で構築した（第１図
Ａ、ＢおよびＣ）。
【００５７】アルカリ溶菌法により調製したpHPDIl6 DN
A 約１μｇを溶液［10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaC
l，6mM MgCl2 、6mM メルカプトエタノール、 0.1％ゼ
ラチン、10単位の EcoRI（ニッポンジーン社）および10
単位のPstI（同社）］20μl 中で37℃１時間消化後、0.
8%アガロースゲルで電気泳動を行い、PDI cDNAの５端側
EcoRIからPstI部分の約490bp の長さのＤＮＡ断片をグ
ラスパウダーにより分離・精製した。一方 pHPDIp4 DNA
約１μｇを溶液［10mM Tris-HCl(pH7.5), 100mMNaCl, 6
mM MgCl2 ,6mMメルカプトエタノール、 0.1％ゼラチ
ン、10単位のPstI（ニッポンジーン社）および10単位の
BamHI（同社）］20μl 中で37℃１時間消化後同様にし
てPDI cDNAの 3′端側PstIから BamHI部分の約1.3kb の
長さのＤＮＡ断片を分離・精製した。このようにして回
収した両ＤＮＡ断片それぞれ約50ngおよび EcoRIおよび
BamHI で消化し、線状にしたプラスミドベクターpUC119
DNA約20ngを宝酒造社のＤＮＡライゲーションキットＡ
液25μl およびＢ液５μl 中で16℃15時間反応させるこ
とにより連結させた。この反応液10μl を用いてカルシ
ウム法により大腸菌ＭＶ1190株コンピテントセルを形質
転換した。大腸菌は、直径90mmのX-Gal プレート（50μ
ｇ／ml 5−ブロモ−4 −クロロ−3 −インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、80μｇ／mlイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド、25μｇ／mlアンピシリ
ン、ＬＢ培地および 1.5％寒天）にまいた。37℃で一晩
培養後、得られた白色コロニーを拾い、アルカリ溶菌法
でプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素を用いた解析を
行い目的とするプラスミドを保持する形質転換体を選択
した。得られたプラスミドを phPDIEBと名付けた。
A 約１μｇを溶液［10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaC
l，6mM MgCl2 、6mM メルカプトエタノール、 0.1％ゼ
ラチン、10単位の EcoRI（ニッポンジーン社）および10
単位のPstI（同社）］20μl 中で37℃１時間消化後、0.
8%アガロースゲルで電気泳動を行い、PDI cDNAの５端側
EcoRIからPstI部分の約490bp の長さのＤＮＡ断片をグ
ラスパウダーにより分離・精製した。一方 pHPDIp4 DNA
約１μｇを溶液［10mM Tris-HCl(pH7.5), 100mMNaCl, 6
mM MgCl2 ,6mMメルカプトエタノール、 0.1％ゼラチ
ン、10単位のPstI（ニッポンジーン社）および10単位の
BamHI（同社）］20μl 中で37℃１時間消化後同様にし
てPDI cDNAの 3′端側PstIから BamHI部分の約1.3kb の
長さのＤＮＡ断片を分離・精製した。このようにして回
収した両ＤＮＡ断片それぞれ約50ngおよび EcoRIおよび
BamHI で消化し、線状にしたプラスミドベクターpUC119
DNA約20ngを宝酒造社のＤＮＡライゲーションキットＡ
液25μl およびＢ液５μl 中で16℃15時間反応させるこ
とにより連結させた。この反応液10μl を用いてカルシ
ウム法により大腸菌ＭＶ1190株コンピテントセルを形質
転換した。大腸菌は、直径90mmのX-Gal プレート（50μ
ｇ／ml 5−ブロモ−4 −クロロ−3 −インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド、80μｇ／mlイソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド、25μｇ／mlアンピシリ
ン、ＬＢ培地および 1.5％寒天）にまいた。37℃で一晩
培養後、得られた白色コロニーを拾い、アルカリ溶菌法
でプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素を用いた解析を
行い目的とするプラスミドを保持する形質転換体を選択
した。得られたプラスミドを phPDIEBと名付けた。
【００５８】phPDIEBをもとにして、Kunkel法［Kunkel,
T.A．(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82, 488 ］によ
り、 cＤＮＡ上のＰＤＩシグナル配列とＰＤＩの本体と
の境界部分に制限酵素NaeI切断部位を導入した。phPDIE
B DNA を用いてカルシウム法により大腸菌BW313 株コン
ピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の単
コロニーを 150μｇ／mlのアンピシリンを含む２×ＹＴ
培地（1.6%バクトトリプトン、 0.5％ NaCl および 1％
バクトイーストエキストラクト）で37℃一晩前培養を行
った。この培養液１mlを 150μｇ／mlのアンピシリンを
含む２×ＹＴ培地50mlに接種し37℃でさらに培養した。
濁度（OD600 ）が 0.3程度に達したところで M13KO7 フ
ァージをm.o.i.＝2 程度で加え37℃30分間静置し感染さ
せた。これに70μｇ／mlの濃度になるようにカナマイシ
ンを加え37℃20時間振盪培養を行った。培養液を遠心分
離にかけ得られた上清に1/5 容の 2.5M NaCl、20％ポリ
エチレングリコール＃6000溶液を加え攪拌した後室温で
15分間静置した。遠心分離にかけ得られた沈殿を５mlの
ＴＥ緩衝液［10mM Tris-HCl 、1mM EDTA (pH8.0)］に溶
かし等容の中和フェノールを加え攪拌後遠心分離にかけ
て水層を回収した。これに等容のクロロホルムを加え攪
拌後遠心分離にかけて水層を回収した。得られた溶液に
1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび 2.5容のエタノール
を加え攪拌後−80℃で30分間静置し遠心分離によりＤＮ
Ａを沈殿として回収した。これを70％エタノールで洗浄
し減圧乾燥後 100μl のＴＥ緩衝液に溶解した。以上の
方法で調製したｄＵを含むphPDIEB 由来の一本鎖ＤＮＡ
を用いて以下の手順で目的とする変異即ちNaeI部位の導
入を行った。変異導入用合成オリゴヌクレオチド(5′-C
GGGGGCGCCGGCGCGC-3′，宝酒造社）］10pmolを溶液［10
0mM Tris-HCl(pH8.0) 、10mM MgCl2 、 7mMジチオスレ
イトール、 1mM ATP および10単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造社）］10μl 中で37℃15分間反応
後70℃10分間加温してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
失活させた。上記phPDIEB 由来の一本鎖ＤＮＡ 0.2pmol
および１μl のアニーリング緩衝液（Site-directed mu
tagenesissystem MutanTM-K, 宝酒造社）に滅菌水を加
え最終容量を10μl とし、そのうちの１μl と上記リン
酸化変異導入用合成オリゴヌクレオチド溶液１μl を混
合し、65℃15分、37℃15分静置後、25μl の伸長緩衝液
（上記 MutanTM-K，同社）60単位の大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ(MutanTM-K，同社）および１単位のＴ4 ＤＮＡポリメ
ラーゼ(MutanTM-K，同社）を加え25℃２時間反応させる
ことにより相補鎖合成を行った。この溶液に３μl の
0.2M EDTA(pH8.0) を加え、65℃で５分間加温すること
により相補鎖合成を停止させた。得られたＤＮＡ溶液３
μl を30μl の大腸菌BMH71-18mutSコンピテントセルと
混合し、氷中30分、42℃45秒さらに氷中１分間静置し
た。これに 300μl のＳＯＣ培地（２％バクトトリプト
ン、 0.5％イーストエキストラクト、 10mM NaCl、 2.5
mM KCl、 10mM MgSO4 、 10mM MgCl2および20mMグルコ
ース）を加え37℃１時間振盪した。さらに10μl のM13K
O7ファージを加え37℃で30分間静置後、 150μｇ／mlの
アンピシリンおよび70μｇ／mlのカナマイシンを含む２
×ＹＴ培地１mlを加え、37℃20時間振盪した。得られた
培養液を遠心分離し、上清20μl を回収し、大腸菌ＭＶ
1190培養液80μl と混合し、37℃10分間加温後、 150μ
ｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレートにまき37℃で
一晩培養した。得られた形質転換体のうち、目的とする
NaeI部位導入プラスミドを保持するものをM13 SEQUENCI
NG KIT（東洋紡績社）を用いたＤＮＡ塩基配列解析によ
り同定した。このプラスミドをphPDINaeと名付けた。
T.A．(1985) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82, 488 ］によ
り、 cＤＮＡ上のＰＤＩシグナル配列とＰＤＩの本体と
の境界部分に制限酵素NaeI切断部位を導入した。phPDIE
B DNA を用いてカルシウム法により大腸菌BW313 株コン
ピテントセルを形質転換した。得られた形質転換体の単
コロニーを 150μｇ／mlのアンピシリンを含む２×ＹＴ
培地（1.6%バクトトリプトン、 0.5％ NaCl および 1％
バクトイーストエキストラクト）で37℃一晩前培養を行
った。この培養液１mlを 150μｇ／mlのアンピシリンを
含む２×ＹＴ培地50mlに接種し37℃でさらに培養した。
濁度（OD600 ）が 0.3程度に達したところで M13KO7 フ
ァージをm.o.i.＝2 程度で加え37℃30分間静置し感染さ
せた。これに70μｇ／mlの濃度になるようにカナマイシ
ンを加え37℃20時間振盪培養を行った。培養液を遠心分
離にかけ得られた上清に1/5 容の 2.5M NaCl、20％ポリ
エチレングリコール＃6000溶液を加え攪拌した後室温で
15分間静置した。遠心分離にかけ得られた沈殿を５mlの
ＴＥ緩衝液［10mM Tris-HCl 、1mM EDTA (pH8.0)］に溶
かし等容の中和フェノールを加え攪拌後遠心分離にかけ
て水層を回収した。これに等容のクロロホルムを加え攪
拌後遠心分離にかけて水層を回収した。得られた溶液に
1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび 2.5容のエタノール
を加え攪拌後−80℃で30分間静置し遠心分離によりＤＮ
Ａを沈殿として回収した。これを70％エタノールで洗浄
し減圧乾燥後 100μl のＴＥ緩衝液に溶解した。以上の
方法で調製したｄＵを含むphPDIEB 由来の一本鎖ＤＮＡ
を用いて以下の手順で目的とする変異即ちNaeI部位の導
入を行った。変異導入用合成オリゴヌクレオチド(5′-C
GGGGGCGCCGGCGCGC-3′，宝酒造社）］10pmolを溶液［10
0mM Tris-HCl(pH8.0) 、10mM MgCl2 、 7mMジチオスレ
イトール、 1mM ATP および10単位のＴ４ポリヌクレオ
チドキナーゼ（宝酒造社）］10μl 中で37℃15分間反応
後70℃10分間加温してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを
失活させた。上記phPDIEB 由来の一本鎖ＤＮＡ 0.2pmol
および１μl のアニーリング緩衝液（Site-directed mu
tagenesissystem MutanTM-K, 宝酒造社）に滅菌水を加
え最終容量を10μl とし、そのうちの１μl と上記リン
酸化変異導入用合成オリゴヌクレオチド溶液１μl を混
合し、65℃15分、37℃15分静置後、25μl の伸長緩衝液
（上記 MutanTM-K，同社）60単位の大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ(MutanTM-K，同社）および１単位のＴ4 ＤＮＡポリメ
ラーゼ(MutanTM-K，同社）を加え25℃２時間反応させる
ことにより相補鎖合成を行った。この溶液に３μl の
0.2M EDTA(pH8.0) を加え、65℃で５分間加温すること
により相補鎖合成を停止させた。得られたＤＮＡ溶液３
μl を30μl の大腸菌BMH71-18mutSコンピテントセルと
混合し、氷中30分、42℃45秒さらに氷中１分間静置し
た。これに 300μl のＳＯＣ培地（２％バクトトリプト
ン、 0.5％イーストエキストラクト、 10mM NaCl、 2.5
mM KCl、 10mM MgSO4 、 10mM MgCl2および20mMグルコ
ース）を加え37℃１時間振盪した。さらに10μl のM13K
O7ファージを加え37℃で30分間静置後、 150μｇ／mlの
アンピシリンおよび70μｇ／mlのカナマイシンを含む２
×ＹＴ培地１mlを加え、37℃20時間振盪した。得られた
培養液を遠心分離し、上清20μl を回収し、大腸菌ＭＶ
1190培養液80μl と混合し、37℃10分間加温後、 150μ
ｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレートにまき37℃で
一晩培養した。得られた形質転換体のうち、目的とする
NaeI部位導入プラスミドを保持するものをM13 SEQUENCI
NG KIT（東洋紡績社）を用いたＤＮＡ塩基配列解析によ
り同定した。このプラスミドをphPDINaeと名付けた。
【００５９】アルカリ溶菌法で調製したphPDINae DNA 2
μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH8.0), 20mM NaCl, 7mM
MgCl2 ，７単位のNaeI（ニッポンジーン社）および10単
位のHind III（宝酒造社）］30μl 中で37℃４時間消化
後0.8%アガロースゲル電気泳動を行い約1.7kb の長さの
ＤＮＡ断片をグラスパウダーにより分離・精製した。ヒ
ト血清アルブミンのプレプロ配列を酵母において使用頻
度の高いコドンによりコードするＤＮＡ断片をクローン
化したプラスミドpUC119Sig の構築を以下の手順で行っ
た（第１図Ａ）。
μｇを溶液［10mM Tris-HCl (pH8.0), 20mM NaCl, 7mM
MgCl2 ，７単位のNaeI（ニッポンジーン社）および10単
位のHind III（宝酒造社）］30μl 中で37℃４時間消化
後0.8%アガロースゲル電気泳動を行い約1.7kb の長さの
ＤＮＡ断片をグラスパウダーにより分離・精製した。ヒ
ト血清アルブミンのプレプロ配列を酵母において使用頻
度の高いコドンによりコードするＤＮＡ断片をクローン
化したプラスミドpUC119Sig の構築を以下の手順で行っ
た（第１図Ａ）。
【００６０】プラスミドベクターpUC119 DNA 1μｇを溶
液[100mM Tris ・HCl (pH7.5), 10mM MgCl2 ,50mM NaCl
および12単位の EcoRI（ニッポンジーン社）］20μl 中
で37℃１時間消化した後、70℃５分間加熱して酵素を失
活させた。次に滅菌水38μlおよびバクテリアアルカリ
性ホスファターゼ１単位（宝酒造社）を加えて37℃１時
間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた水層を
エタノール沈殿に用いＤＮＡを回収した。このＤＮＡ
と、 ５′-AATTCTCGAG GAGCTCTTAA-５′ の配列から成るXhoI部位を含むXhoIリンカー等モルとを
溶液［66mM Tris ・HCl(pH 7.5) 、6.6mM MgCl2 、10mM
ジチオスレイトール、0.1mM ATP および 300単位のＴ4
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社）］30μl 中で16℃一晩保温
した。この溶液10μl を用いて大腸菌ＪＭ107 株コンピ
テントセルをカルシウム法に従い形質転換し、50μｇ／
mlのアンピシリンを含むＬＢプレートにまき37℃一晩保
温した。得られたコロニーについて、アルカリ溶菌法を
用いてプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素解析を行う
ことにより目的とするXhoIリンカーがpUC119 EcoRI部位
に挿入されたプラスミドＤＮＡを選択取得した。
液[100mM Tris ・HCl (pH7.5), 10mM MgCl2 ,50mM NaCl
および12単位の EcoRI（ニッポンジーン社）］20μl 中
で37℃１時間消化した後、70℃５分間加熱して酵素を失
活させた。次に滅菌水38μlおよびバクテリアアルカリ
性ホスファターゼ１単位（宝酒造社）を加えて37℃１時
間保温した後、フェノール抽出を行い、得られた水層を
エタノール沈殿に用いＤＮＡを回収した。このＤＮＡ
と、 ５′-AATTCTCGAG GAGCTCTTAA-５′ の配列から成るXhoI部位を含むXhoIリンカー等モルとを
溶液［66mM Tris ・HCl(pH 7.5) 、6.6mM MgCl2 、10mM
ジチオスレイトール、0.1mM ATP および 300単位のＴ4
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社）］30μl 中で16℃一晩保温
した。この溶液10μl を用いて大腸菌ＪＭ107 株コンピ
テントセルをカルシウム法に従い形質転換し、50μｇ／
mlのアンピシリンを含むＬＢプレートにまき37℃一晩保
温した。得られたコロニーについて、アルカリ溶菌法を
用いてプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素解析を行う
ことにより目的とするXhoIリンカーがpUC119 EcoRI部位
に挿入されたプラスミドＤＮＡを選択取得した。
【００６１】以下の配列をもつ４種類のオリゴヌクレオ
チド： 1. 5′- TCGAGAATTCATGAAGTGGGTTACCTTCATCTCTTTGTTGTT-3′、 2. 5′- AACAAGAACAACAAAGAGATGAAGGTAACCCACTTCATGAATTC-3′、 3. 5′- CTTGTTCTCTTCTGCTTACTCTAGAGGTGTTTTCAGAAGGCCTG-3′、 4. 5′- GATCCAGGCCTTCTGAAAACACCTCTAGAGTAAGCAGAAGAG-3′ を自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems社、モデル38
0B）を用いて合成した。これら各々約30 pmol を、溶液
［50mM Tris ・HCl(pH7.6)、 10mM MgCl2 、5mMジチオ
スレイトール、0.2mM ATP 及び６単位のＴ4 ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社）］25μl 中で37℃１時間反
応させることにより５′端をリン酸化した。得られたオ
リゴヌクレオチドを含む溶液を混ぜ（計 100μl ） 100
℃の水浴に５分間放置した後室温で放冷しアニーリング
を行った。これに 600単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社）を加え16℃で一晩保温し、フラグメント間の連結
を行い二本鎖フラグメントにした。この二本鎖ＤＮＡを
フェノール抽出による除タンパク質後、エタノール沈殿
により回収した。
チド： 1. 5′- TCGAGAATTCATGAAGTGGGTTACCTTCATCTCTTTGTTGTT-3′、 2. 5′- AACAAGAACAACAAAGAGATGAAGGTAACCCACTTCATGAATTC-3′、 3. 5′- CTTGTTCTCTTCTGCTTACTCTAGAGGTGTTTTCAGAAGGCCTG-3′、 4. 5′- GATCCAGGCCTTCTGAAAACACCTCTAGAGTAAGCAGAAGAG-3′ を自動ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems社、モデル38
0B）を用いて合成した。これら各々約30 pmol を、溶液
［50mM Tris ・HCl(pH7.6)、 10mM MgCl2 、5mMジチオ
スレイトール、0.2mM ATP 及び６単位のＴ4 ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社）］25μl 中で37℃１時間反
応させることにより５′端をリン酸化した。得られたオ
リゴヌクレオチドを含む溶液を混ぜ（計 100μl ） 100
℃の水浴に５分間放置した後室温で放冷しアニーリング
を行った。これに 600単位のＴ4 ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社）を加え16℃で一晩保温し、フラグメント間の連結
を行い二本鎖フラグメントにした。この二本鎖ＤＮＡを
フェノール抽出による除タンパク質後、エタノール沈殿
により回収した。
【００６２】上述のXhoIリンカーを導入したベクタープ
ラスミド１μｇを溶液［100mM Tris・HCl(pH7.5)、 10m
M MgCl2 、100mM NaCl、10単位の BamHI（ニッポンジー
ン社）および12単位のXhoI（宝酒造社）］20μl 中で37
℃１時間消化した後、フェノール抽出を行い、得られた
水層からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。この
ＤＮＡと上述の４つのオリゴヌクレオチドの連結により
得られた二本鎖ＤＮＡフラグメント等モルを溶液［66mM
Tris-HCl(pH7.5 ）、6.6mM MgCl2 、10mMジチオスレイ
トール、0.1mM ATP および 300単位のＴ4 ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社）］30μl 中で16℃一晩保温した。この溶
液10μl を用いて大腸菌ＪＭ107 株コンピテントセルを
カルシウム法に従い形質転換し、50μｇ／mlのアンピシ
リンを含むＬＢプレート上にまき37℃一晩保温した。得
られたコロニーについて、それらの保持するプラスミド
ＤＮＡの塩基配列解析を行うことにより目的とする組換
えプラスミドをもつ形質転換体を選択した。このプラス
ミドを pUC119Sigと名付けた。
ラスミド１μｇを溶液［100mM Tris・HCl(pH7.5)、 10m
M MgCl2 、100mM NaCl、10単位の BamHI（ニッポンジー
ン社）および12単位のXhoI（宝酒造社）］20μl 中で37
℃１時間消化した後、フェノール抽出を行い、得られた
水層からエタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。この
ＤＮＡと上述の４つのオリゴヌクレオチドの連結により
得られた二本鎖ＤＮＡフラグメント等モルを溶液［66mM
Tris-HCl(pH7.5 ）、6.6mM MgCl2 、10mMジチオスレイ
トール、0.1mM ATP および 300単位のＴ4 ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造社）］30μl 中で16℃一晩保温した。この溶
液10μl を用いて大腸菌ＪＭ107 株コンピテントセルを
カルシウム法に従い形質転換し、50μｇ／mlのアンピシ
リンを含むＬＢプレート上にまき37℃一晩保温した。得
られたコロニーについて、それらの保持するプラスミド
ＤＮＡの塩基配列解析を行うことにより目的とする組換
えプラスミドをもつ形質転換体を選択した。このプラス
ミドを pUC119Sigと名付けた。
【００６３】上記の手順で作製したプラスミド pUC119S
ig DNAをアルカリ溶菌法で調製した。このＤＮＡ２μｇ
を溶液［10mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、7mM MgCl
2 、８単位のStuI（ニッポンジーン社）および10単位の
Hind III（宝酒造社）］中で37℃４時間消化後 0.8％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約3.2kb の長さのＤＮＡ
断片をグラスパウダーで分離・精製した。このようにし
て得られたphPDINae由来の1.7kb DNA 断片約50ngとpUC1
19 Sig由来の3.2kb DNA 断片約50ngを宝酒造社ライゲー
ションキットＡ液30μl Ｂ液 6μl 中で16℃30分間反応
後、10μl を用いてカルシウム法により大腸菌株HB101
コンピテントセル（宝酒造社）を形質転換し、50μl ／
mlのアンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。このプ
レートを37℃一晩静置することにより得られたコロニー
について、アルカリ溶菌法を用いてプラスミドＤＮＡを
調製し、制限酵素を用いた解析を行うことにより、ヒト
血清アルブミンのプレプロ配列下流にヒトＰＤＩ本体を
接続した形の（第２図）組換えプラスミドを選択し取得
した。このプラスミドをphPDILy1と名付けた。
ig DNAをアルカリ溶菌法で調製した。このＤＮＡ２μｇ
を溶液［10mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、7mM MgCl
2 、８単位のStuI（ニッポンジーン社）および10単位の
Hind III（宝酒造社）］中で37℃４時間消化後 0.8％ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、約3.2kb の長さのＤＮＡ
断片をグラスパウダーで分離・精製した。このようにし
て得られたphPDINae由来の1.7kb DNA 断片約50ngとpUC1
19 Sig由来の3.2kb DNA 断片約50ngを宝酒造社ライゲー
ションキットＡ液30μl Ｂ液 6μl 中で16℃30分間反応
後、10μl を用いてカルシウム法により大腸菌株HB101
コンピテントセル（宝酒造社）を形質転換し、50μl ／
mlのアンピシリンを含むＬＢプレートにまいた。このプ
レートを37℃一晩静置することにより得られたコロニー
について、アルカリ溶菌法を用いてプラスミドＤＮＡを
調製し、制限酵素を用いた解析を行うことにより、ヒト
血清アルブミンのプレプロ配列下流にヒトＰＤＩ本体を
接続した形の（第２図）組換えプラスミドを選択し取得
した。このプラスミドをphPDILy1と名付けた。
【００６４】以上のようにして得られたリーダー配列改
変型ＰＤＩを酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子
のプロモーター支配下で発現させるべく、以下の手順に
よりヒトＰＤＩ発現プラスミドを構築した。アルカリ溶
菌法により調製した上記 phPDILy1 DNA ７μl を溶液
［100mM Tris・HCl (pH8.0) 、100mM NaCl、7mM MgCl2
および40単位の EcoRI（ニッポンジーン社）］ 100μl
中で37℃２時間消化後、等容のフェノール／クロロホル
ム混液（飽和フェノールとクロロホルムを等容混合した
溶液）を加え攪拌し、遠心分離後水層を回収した。この
フェノール／クロロホルム抽出を繰返し、得られた水層
に1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム(pH5.3) および 2.5容の
エタノールを加え混合し、−40℃２時間静置した。遠心
により得られた沈殿を70％エタノールで洗浄後減圧乾燥
し50μl のKlenow緩衝液（Kilo-Sequence 用Deletion K
it, 宝酒造社）に溶解し、４単位のKlenow fragment 緩
衝液（宝酒造社）を加え37℃45分間反応させることによ
りEcoRI 切断部分の平滑化を行った。この溶液について
２回のフェノール／クロロホルム抽出を行ない、得られ
た水層に1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.3 ）および
2.5容のエタノールを加え混合し、−40℃１時間静置し
た。遠心により得られた沈殿を70％エタノールで洗浄後
減圧乾燥し、50μl のKlenow緩衝液（Kilo-Sequence 用
Deletion Kit,宝酒造社）に溶解し、４単位の Klenow f
ragment（宝酒造社）を加え37℃45分間反応させること
により EcoRI切断部分の平滑化を行った。この溶液につ
いて２回のフェノール／クロロホルム抽出を行ない、得
られた水層に1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.3 ）お
よび 2.5容のエタノールを加え混合し、−40℃１時間静
置した。遠心により得られた沈殿を70％エタノールで洗
浄後減圧乾燥し、溶液[10mM Tris・HCl(pH8.0)、 60mM
NaCl、7mM MgCl2 および10単位のBamHI(ニッポンジーン
社）］40μl に溶かし37℃３時間反応させた。得られた
ＤＮＡ溶液を 0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
1.8kb のＤＮＡ断片をグラスパウダーで分離・精製し
た。一方、アルカリ溶菌法で調製したpJDB-ADH-HSA-A
（特開平2-117384号公報）DNA5μl を溶液［10mM Tris
HCl(pH 8.0), 100mM NaCl,7mM MgCl2 および24単位のXh
oI（宝酒造社）］ 100μl 中で37℃ 2時間消化後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を 2回行い得られた水層に、
1／10容の3M酢酸ナトリウム(pH5.3) および 2.5容のエ
タノールを加え混合し、−40℃ 2時間静置後遠心により
沈澱としてDNA を回収した。このDNA 沈澱を70％エタノ
ールで洗浄後減圧乾燥し、50μl のKlenow緩衝液（Kilo
-Sequence Deletion Kit. 宝酒造社）に溶解し、４単位
の Klenow fragment（宝酒造社）を加え37℃45分間反応
させることによりXhoI切断部分の平滑化を行った。この
溶液について２回のフェノール／クロロホルム抽出を行
ない、得られた水層に1/10容の3M酢酸ナトリウム（pH
5.3）および 2.5容のエタノールを加え混合し、−40℃
１時間静置後、遠心により沈澱としてDNAを回収した。
得られたDNA を70% エタノールで洗浄後減圧乾燥し、溶
液［10mM Tris ・HCl(pH8.0)、60mM NaCl,7mM MgCl2 お
よび10単位のBamHI(ニッポンジーン社）］40μl に溶か
し、37℃75分間消化した。この溶液に10μl の 2M Tris
・HCl(pH8.0)、 110μl の滅菌水および 1単位の大腸菌
C75 株由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社）を加
え混合し、60℃ 1時間加温することにより酵素切断部の
５′脱リン酸化反応を行った。得られた溶液に1/10容の
3M酢酸ナトリウム(pH5.3) および 2.5容のエタノールを
加え混合し、−40℃ 1時間静置した。遠心により沈澱と
してDNA を回収し減圧乾燥後20μl のTEに溶解し 0.8％
アガロースゲル電気泳動にかけた。約8kb のDNA 断片を
グラスパウダーを用いて回収した。以上のようにして得
られたphPDILy1由来の1.8kb DNA 断片約50ngおよびpJDB
-ADH-HSA-A由来の8kbDNA断片約50ngを宝酒造社DNA ライ
ゲーションキットＡ液30μl 、Ｂ液 6μl と混合し、16
℃ 2.5時間反応させ両DNA を連結させた。得られたDNA
溶液10μl を用いてカルシウム法により大腸菌C600株を
形質転換し、50μl ／μlのアンピシリンを含むLBプレ
ートにまき37℃で一晩培養した。得られたコロニーにつ
いてアルカリ溶菌法によりプラスミドDNA を調製し、制
限酵素解析を行なうことにより目的とするアルコールヒ
ドロゲナーゼＩプロモーター下流にリーダー配列改変型
PDI を連結したプラスミドを保持する形質転換体を選択
した。このようにして構築したPDI 発現プラスミドをpA
HhPDILy1と名付けた。また、この構築の結果、成熟型PD
I のＮ末端アミノ酸はAsp からGly に改変された。
変型ＰＤＩを酵母アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子
のプロモーター支配下で発現させるべく、以下の手順に
よりヒトＰＤＩ発現プラスミドを構築した。アルカリ溶
菌法により調製した上記 phPDILy1 DNA ７μl を溶液
［100mM Tris・HCl (pH8.0) 、100mM NaCl、7mM MgCl2
および40単位の EcoRI（ニッポンジーン社）］ 100μl
中で37℃２時間消化後、等容のフェノール／クロロホル
ム混液（飽和フェノールとクロロホルムを等容混合した
溶液）を加え攪拌し、遠心分離後水層を回収した。この
フェノール／クロロホルム抽出を繰返し、得られた水層
に1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム(pH5.3) および 2.5容の
エタノールを加え混合し、−40℃２時間静置した。遠心
により得られた沈殿を70％エタノールで洗浄後減圧乾燥
し50μl のKlenow緩衝液（Kilo-Sequence 用Deletion K
it, 宝酒造社）に溶解し、４単位のKlenow fragment 緩
衝液（宝酒造社）を加え37℃45分間反応させることによ
りEcoRI 切断部分の平滑化を行った。この溶液について
２回のフェノール／クロロホルム抽出を行ない、得られ
た水層に1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.3 ）および
2.5容のエタノールを加え混合し、−40℃１時間静置し
た。遠心により得られた沈殿を70％エタノールで洗浄後
減圧乾燥し、50μl のKlenow緩衝液（Kilo-Sequence 用
Deletion Kit,宝酒造社）に溶解し、４単位の Klenow f
ragment（宝酒造社）を加え37℃45分間反応させること
により EcoRI切断部分の平滑化を行った。この溶液につ
いて２回のフェノール／クロロホルム抽出を行ない、得
られた水層に1/10容の３Ｍ酢酸ナトリウム（pH5.3 ）お
よび 2.5容のエタノールを加え混合し、−40℃１時間静
置した。遠心により得られた沈殿を70％エタノールで洗
浄後減圧乾燥し、溶液[10mM Tris・HCl(pH8.0)、 60mM
NaCl、7mM MgCl2 および10単位のBamHI(ニッポンジーン
社）］40μl に溶かし37℃３時間反応させた。得られた
ＤＮＡ溶液を 0.8％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
1.8kb のＤＮＡ断片をグラスパウダーで分離・精製し
た。一方、アルカリ溶菌法で調製したpJDB-ADH-HSA-A
（特開平2-117384号公報）DNA5μl を溶液［10mM Tris
HCl(pH 8.0), 100mM NaCl,7mM MgCl2 および24単位のXh
oI（宝酒造社）］ 100μl 中で37℃ 2時間消化後、フェ
ノール／クロロホルム抽出を 2回行い得られた水層に、
1／10容の3M酢酸ナトリウム(pH5.3) および 2.5容のエ
タノールを加え混合し、−40℃ 2時間静置後遠心により
沈澱としてDNA を回収した。このDNA 沈澱を70％エタノ
ールで洗浄後減圧乾燥し、50μl のKlenow緩衝液（Kilo
-Sequence Deletion Kit. 宝酒造社）に溶解し、４単位
の Klenow fragment（宝酒造社）を加え37℃45分間反応
させることによりXhoI切断部分の平滑化を行った。この
溶液について２回のフェノール／クロロホルム抽出を行
ない、得られた水層に1/10容の3M酢酸ナトリウム（pH
5.3）および 2.5容のエタノールを加え混合し、−40℃
１時間静置後、遠心により沈澱としてDNAを回収した。
得られたDNA を70% エタノールで洗浄後減圧乾燥し、溶
液［10mM Tris ・HCl(pH8.0)、60mM NaCl,7mM MgCl2 お
よび10単位のBamHI(ニッポンジーン社）］40μl に溶か
し、37℃75分間消化した。この溶液に10μl の 2M Tris
・HCl(pH8.0)、 110μl の滅菌水および 1単位の大腸菌
C75 株由来アルカリフォスファターゼ（宝酒造社）を加
え混合し、60℃ 1時間加温することにより酵素切断部の
５′脱リン酸化反応を行った。得られた溶液に1/10容の
3M酢酸ナトリウム(pH5.3) および 2.5容のエタノールを
加え混合し、−40℃ 1時間静置した。遠心により沈澱と
してDNA を回収し減圧乾燥後20μl のTEに溶解し 0.8％
アガロースゲル電気泳動にかけた。約8kb のDNA 断片を
グラスパウダーを用いて回収した。以上のようにして得
られたphPDILy1由来の1.8kb DNA 断片約50ngおよびpJDB
-ADH-HSA-A由来の8kbDNA断片約50ngを宝酒造社DNA ライ
ゲーションキットＡ液30μl 、Ｂ液 6μl と混合し、16
℃ 2.5時間反応させ両DNA を連結させた。得られたDNA
溶液10μl を用いてカルシウム法により大腸菌C600株を
形質転換し、50μl ／μlのアンピシリンを含むLBプレ
ートにまき37℃で一晩培養した。得られたコロニーにつ
いてアルカリ溶菌法によりプラスミドDNA を調製し、制
限酵素解析を行なうことにより目的とするアルコールヒ
ドロゲナーゼＩプロモーター下流にリーダー配列改変型
PDI を連結したプラスミドを保持する形質転換体を選択
した。このようにして構築したPDI 発現プラスミドをpA
HhPDILy1と名付けた。また、この構築の結果、成熟型PD
I のＮ末端アミノ酸はAsp からGly に改変された。
【００６５】一方、ヒトPDI 発現実験用のコントロール
プラスミドを以下の手順で作製した。アルカリ溶菌法で
調製したpJDB-ADH-HSA-A DNA 5μl を溶液［10mM Tris-
HCl,100mM NaCl, 7mM MgCl2 , 24単位のXhoI（宝酒造
社）および29単位の BamHI（ニッポンジーン社）］ 100
μl 中で37℃ 2時間消化後、フェノール／クロロホルム
抽出を 2回行い得られた水槽に1/10容の3M酢酸ナトリウ
ム(pH5.3) および 2.5容のエタノールを加え混合し、−
40℃２時間静置後遠心によりDNA を沈澱として回収し
た。このDNA を70％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、
50μl のKlenow緩衝液（Kilo-Sequence Deletion Kit，
宝酒造社）に溶解し、４単位の Klenow fragment（宝酒
造社）を加えて37℃45分間反応させることによりXhoIお
よびBamHI 切断部分の平滑化を行った。この溶液につい
て 2回のフェノール／クロロホルム抽出を行い得られた
水層に1/10容の3M酢酸ナトリウム(pH 5.3)および 2.5容
のエタノールを加え混合し、−40℃１時間静置後遠心に
より沈澱としてDNA を回収した。これを減圧乾燥後20μ
l のTEに溶解し、 0.8％アガロース電気泳動にかけ、約
8kb のDNA 断片をグラスパウダーで回収した。得られた
DNA 断片約50ngを宝酒造社DNA ライゲーションキットの
Ａ液30μl 、Ｂ液 6μl と混合し、16℃一晩反応させ、
自己連結により環状化した。このDNA 溶液10μl を用い
て大腸菌 101株コンピテントセル（宝酒造社）をカルシ
ウム法により形質転換し、50μl ／mlのアンピシリンを
含むLBプレートにまき37℃一晩培養した。得られたコロ
ニーについてアルカリ溶菌法によりプラスミドDNA を調
製し、制限酵素解析を行い、目的とするコントロール用
プラスミドを選択取得した。得られたプラスミドをpAH
と名付けた。
プラスミドを以下の手順で作製した。アルカリ溶菌法で
調製したpJDB-ADH-HSA-A DNA 5μl を溶液［10mM Tris-
HCl,100mM NaCl, 7mM MgCl2 , 24単位のXhoI（宝酒造
社）および29単位の BamHI（ニッポンジーン社）］ 100
μl 中で37℃ 2時間消化後、フェノール／クロロホルム
抽出を 2回行い得られた水槽に1/10容の3M酢酸ナトリウ
ム(pH5.3) および 2.5容のエタノールを加え混合し、−
40℃２時間静置後遠心によりDNA を沈澱として回収し
た。このDNA を70％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、
50μl のKlenow緩衝液（Kilo-Sequence Deletion Kit，
宝酒造社）に溶解し、４単位の Klenow fragment（宝酒
造社）を加えて37℃45分間反応させることによりXhoIお
よびBamHI 切断部分の平滑化を行った。この溶液につい
て 2回のフェノール／クロロホルム抽出を行い得られた
水層に1/10容の3M酢酸ナトリウム(pH 5.3)および 2.5容
のエタノールを加え混合し、−40℃１時間静置後遠心に
より沈澱としてDNA を回収した。これを減圧乾燥後20μ
l のTEに溶解し、 0.8％アガロース電気泳動にかけ、約
8kb のDNA 断片をグラスパウダーで回収した。得られた
DNA 断片約50ngを宝酒造社DNA ライゲーションキットの
Ａ液30μl 、Ｂ液 6μl と混合し、16℃一晩反応させ、
自己連結により環状化した。このDNA 溶液10μl を用い
て大腸菌 101株コンピテントセル（宝酒造社）をカルシ
ウム法により形質転換し、50μl ／mlのアンピシリンを
含むLBプレートにまき37℃一晩培養した。得られたコロ
ニーについてアルカリ溶菌法によりプラスミドDNA を調
製し、制限酵素解析を行い、目的とするコントロール用
プラスミドを選択取得した。得られたプラスミドをpAH
と名付けた。
【００６６】ヒトPDI の酵母による発現 上記の手順で構築したヒトPDI 発現プラスミドpAHhPDIL
y1を用いて以下に示す方法でヒトPDI の酵母による発現
を行った。
y1を用いて以下に示す方法でヒトPDI の酵母による発現
を行った。
【００６７】ＹＰＤプレート（2%バクトペプトン、1%イ
ーストエキストラクト、2%ブドウ糖および 1.5％寒天）
上で培養した酵母AH22株の単コロニーを 5mlのＹＰＤ培
地（2%バクトペプトン、1%イーストエキストラクトおよ
び 2％ブドウ糖）に接種し30℃24時間振盪培養した。こ
の前培養液 0.9mlを45mlのＹＰＤ培地に接種し30℃で振
盪培養し、ＯＤ600 （濁度）が約 0.5に達したところで
低速遠心にかけ沈澱として菌を回収した。得られた菌体
を 3mlの 0.2MLiSCNに懸濁し、そのうちの 1mlを遠心に
かけ沈殿として菌体を回収した。この菌体に46μl の50
％ PEG＃4000、10μl のLiSCN およびアルカリ溶菌法で
調製したpAHhPDILy1 DNA溶液10μl(DNA27μl 分) を加
えピペッティングにより混合し、30℃で一晩静置した。
これに 1mlの滅菌水を加え懸濁後遠心により菌体を沈澱
として回収した。この菌体を100μl の滅菌水で懸濁
し、SD（-Leu）プレート［SD(-Leu)培地（0.67％バクト
ニトロゲンベース、2%ブドウ糖、20mg／l のアデニン、
同ウラシル、同トリプトファン、同ヒスチジン、同アル
ギニン、同メチオニン、30mg／l のチロシン、同イソロ
イシン、同リジン、50mg／l のフェニルアラニン、100m
g ／l のアスパラギン酸、同グルタミン酸、150mg ／l
のバリン、 200mg／l のスレオニンおよび 375mg／l の
セリン（以上のアミノ酸は和光純薬製））および 1.5％
寒天］上にまき、30℃で培養した。培養 5日目に得られ
た形質転換体を 5mlのSD（-Leu）培地に接種し30℃２日
間振盪培養した。この前培養液 100μl を 5mlのＹＰＤ
培地に接種し30℃24時間振盪培養した。得られた培養液
1.5mlを遠心分離にかけ上清 500μl を回収し、これに
等容のエタノールを加え混合後氷中に１時間静置した。
これを遠心分離にかけ培地中の酵母細胞からの分泌物を
沈澱として回収し減圧乾燥した。得られた沈澱を10μl
のSDS-PAGE用サンプル緩衝液（125mM Tris−HCl(pH6.8)
、4%SDS 、20％グリセリン、10％β−メルカプトエタ
ノールおよび0.01％ブロモフェノールブルー）に溶解
し、５分間煮沸後SDS-PAG プレート10／20（第一化学薬
品）にて電気泳動を行った。このゲルを染色液（0.15％
クマシーブリリアントブルー，10％酢酸および40％メタ
ノール）で染色後、脱色液（10％酢酸および40％メタノ
ール）に浸し、発現物を視覚化した。この際コントロー
ルとして上記pAH を出発点として上述のpAHhPDILy1につ
いてと全く同様の操作により得られた培地サンプルを同
時に泳動した。分子量標準としてフォスフォリラーゼb
（分子量94.000）、ウシ血清アルブミン（67,000）、オ
ボアルブミン（43,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（30,000）、大豆トリプシンインヒビター（20,000）お
よびα−ラクトアルブミン（14,000）を用いた（第３
図）。その結果、分子量約55K の発現物を見出すことが
できた。この分子量は、成熟PDI の分子量と一致してお
り目的とするヒトPDI が発現分泌したものと期待され
た。そこで発現分泌物のタンパク質化学的特性を調べる
ことを目的として以下の手順で大量培養を行った。
ーストエキストラクト、2%ブドウ糖および 1.5％寒天）
上で培養した酵母AH22株の単コロニーを 5mlのＹＰＤ培
地（2%バクトペプトン、1%イーストエキストラクトおよ
び 2％ブドウ糖）に接種し30℃24時間振盪培養した。こ
の前培養液 0.9mlを45mlのＹＰＤ培地に接種し30℃で振
盪培養し、ＯＤ600 （濁度）が約 0.5に達したところで
低速遠心にかけ沈澱として菌を回収した。得られた菌体
を 3mlの 0.2MLiSCNに懸濁し、そのうちの 1mlを遠心に
かけ沈殿として菌体を回収した。この菌体に46μl の50
％ PEG＃4000、10μl のLiSCN およびアルカリ溶菌法で
調製したpAHhPDILy1 DNA溶液10μl(DNA27μl 分) を加
えピペッティングにより混合し、30℃で一晩静置した。
これに 1mlの滅菌水を加え懸濁後遠心により菌体を沈澱
として回収した。この菌体を100μl の滅菌水で懸濁
し、SD（-Leu）プレート［SD(-Leu)培地（0.67％バクト
ニトロゲンベース、2%ブドウ糖、20mg／l のアデニン、
同ウラシル、同トリプトファン、同ヒスチジン、同アル
ギニン、同メチオニン、30mg／l のチロシン、同イソロ
イシン、同リジン、50mg／l のフェニルアラニン、100m
g ／l のアスパラギン酸、同グルタミン酸、150mg ／l
のバリン、 200mg／l のスレオニンおよび 375mg／l の
セリン（以上のアミノ酸は和光純薬製））および 1.5％
寒天］上にまき、30℃で培養した。培養 5日目に得られ
た形質転換体を 5mlのSD（-Leu）培地に接種し30℃２日
間振盪培養した。この前培養液 100μl を 5mlのＹＰＤ
培地に接種し30℃24時間振盪培養した。得られた培養液
1.5mlを遠心分離にかけ上清 500μl を回収し、これに
等容のエタノールを加え混合後氷中に１時間静置した。
これを遠心分離にかけ培地中の酵母細胞からの分泌物を
沈澱として回収し減圧乾燥した。得られた沈澱を10μl
のSDS-PAGE用サンプル緩衝液（125mM Tris−HCl(pH6.8)
、4%SDS 、20％グリセリン、10％β−メルカプトエタ
ノールおよび0.01％ブロモフェノールブルー）に溶解
し、５分間煮沸後SDS-PAG プレート10／20（第一化学薬
品）にて電気泳動を行った。このゲルを染色液（0.15％
クマシーブリリアントブルー，10％酢酸および40％メタ
ノール）で染色後、脱色液（10％酢酸および40％メタノ
ール）に浸し、発現物を視覚化した。この際コントロー
ルとして上記pAH を出発点として上述のpAHhPDILy1につ
いてと全く同様の操作により得られた培地サンプルを同
時に泳動した。分子量標準としてフォスフォリラーゼb
（分子量94.000）、ウシ血清アルブミン（67,000）、オ
ボアルブミン（43,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（30,000）、大豆トリプシンインヒビター（20,000）お
よびα−ラクトアルブミン（14,000）を用いた（第３
図）。その結果、分子量約55K の発現物を見出すことが
できた。この分子量は、成熟PDI の分子量と一致してお
り目的とするヒトPDI が発現分泌したものと期待され
た。そこで発現分泌物のタンパク質化学的特性を調べる
ことを目的として以下の手順で大量培養を行った。
【００６８】pAHhPDILy1を保持する酵母ＡＨ22株の単コ
ロニーを80mlのSD（-Leu）培地に接種し、30℃ 2日間振
盪培養した。得られた前培養液を80mlずつ4lのＹＰＤ・
リン酸培地（ＹＰＤ培地、 6ｇ／l のＮａ2 ＨＰＯ4 お
よび 3ｇ／l のＫＨ2 ＰＯ4、pH 7.0）に接種し、30℃2
4時間振盪培養を行った。この培養液を遠心分離にかけ
上清を回収し以下の分泌発現物の精製に用いた。
ロニーを80mlのSD（-Leu）培地に接種し、30℃ 2日間振
盪培養した。得られた前培養液を80mlずつ4lのＹＰＤ・
リン酸培地（ＹＰＤ培地、 6ｇ／l のＮａ2 ＨＰＯ4 お
よび 3ｇ／l のＫＨ2 ＰＯ4、pH 7.0）に接種し、30℃2
4時間振盪培養を行った。この培養液を遠心分離にかけ
上清を回収し以下の分泌発現物の精製に用いた。
【００６９】培地からの組換えヒトＰＤＩの単離とその特性化 上記のようにして得られた形質転換酵母培養培地４l
を、ミリポア−ミリタン限外濾過器（排除分子量30,00
0）を用い、40倍濃縮を行った(100ml）後、TSK-gel Phe
nyl-5PW疎水性カラムにより、ヒトＰＤＩを単離した。
疎水性カラムは0.85Ｍ硫安、0.05％ NaN3 を含む10mMホ
ウ酸−10mM KCl緩衝液pH 8.0で平衡化したものから、 1
25分間で、硫安を含まない同緩衝液へと直線的濃度勾配
を形成させることによって溶出した。この時の流速は 2
ml／min である。この結果を第４図に示す。第５図に
は、単離されたヒトＰＤＩのＳＤＳ電気泳動図を示す。
図に示されるように、疎水性カラムクロマトグラフィー
によってヒトＰＤＩはほぼ単一の成分にまで分離され、
かつ、ＰＤＩ活性を保持していることが明らかになっ
た。ＹＰＤ培地に由来する紫外部吸収物質は、このクロ
マトグラフィーによってきわめて効率よく除去できるこ
とが分かる。
を、ミリポア−ミリタン限外濾過器（排除分子量30,00
0）を用い、40倍濃縮を行った(100ml）後、TSK-gel Phe
nyl-5PW疎水性カラムにより、ヒトＰＤＩを単離した。
疎水性カラムは0.85Ｍ硫安、0.05％ NaN3 を含む10mMホ
ウ酸−10mM KCl緩衝液pH 8.0で平衡化したものから、 1
25分間で、硫安を含まない同緩衝液へと直線的濃度勾配
を形成させることによって溶出した。この時の流速は 2
ml／min である。この結果を第４図に示す。第５図に
は、単離されたヒトＰＤＩのＳＤＳ電気泳動図を示す。
図に示されるように、疎水性カラムクロマトグラフィー
によってヒトＰＤＩはほぼ単一の成分にまで分離され、
かつ、ＰＤＩ活性を保持していることが明らかになっ
た。ＹＰＤ培地に由来する紫外部吸収物質は、このクロ
マトグラフィーによってきわめて効率よく除去できるこ
とが分かる。
【００７０】ＰＤＩ活性の測定 ＰＤＩ活性の測定は、還元・変性・再酸化による方法で
作製したスクランブルドリボヌクレアーゼＡ(RNase A)
の再構成への促進効果を見ることによって行った。リボ
ヌクレアーゼＡの再構成の程度は、その酵素活性の回復
の程度を指標として定量化した。具体的方法を以下に示
す。
作製したスクランブルドリボヌクレアーゼＡ(RNase A)
の再構成への促進効果を見ることによって行った。リボ
ヌクレアーゼＡの再構成の程度は、その酵素活性の回復
の程度を指標として定量化した。具体的方法を以下に示
す。
【００７１】スクランブルドRNase A の調製：120mgのR
Nase A を6Mグアニジン塩酸、0.15Ｍジチオスレイトー
ルを含む３mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液pH8.6 に溶解した
後、窒素気流下で、15時間室温で還元を行った。還元物
を0.01N HCl で平衡化させたセファデックスG-25カラム
（15mmφ×38cm）で還元剤を除去した。この脱塩物にグ
アニジン塩酸を最終濃度6Mとなるように加え、更にトリ
スを加えpHを9.0 に合せ、Ｓ−Ｓ結合の交換反応を暗
所、４℃で14日間行なわせた。この試料を−80℃で保存
したものをスクランブルドRNase A として使用した。
Nase A を6Mグアニジン塩酸、0.15Ｍジチオスレイトー
ルを含む３mlの0.1Mトリス塩酸緩衝液pH8.6 に溶解した
後、窒素気流下で、15時間室温で還元を行った。還元物
を0.01N HCl で平衡化させたセファデックスG-25カラム
（15mmφ×38cm）で還元剤を除去した。この脱塩物にグ
アニジン塩酸を最終濃度6Mとなるように加え、更にトリ
スを加えpHを9.0 に合せ、Ｓ−Ｓ結合の交換反応を暗
所、４℃で14日間行なわせた。この試料を−80℃で保存
したものをスクランブルドRNase A として使用した。
【００７２】ＰＤＩ活性の測定：窒素置換を施した55mM
リン酸緩衝液（pH 7.5）20mlに、10μl の1Mジチオスレ
イトールを加えたものを調製し、この溶液から10μl を
取り、20μl の酵素試料とまぜた55mMリン酸緩衝液(pH
7.5) 420μl に加え30℃で５分半放置する。これに上記
スクランブルドRNase 溶液50μl を加え30℃、15分半反
応させる。ここで、 1.945mlの脱気した50mMトリス塩
酸、5mM 塩化マグネシウム、25mM塩化カリウムを含む緩
衝液pH7.5 に、50μl のイーストＲＮＡ溶液（10mMトリ
ス塩酸緩衝液pH7.5/1mM EDTA,280nmの吸光度80になるよ
うに調節したもの）を１cm角石英セルに加え、攪拌しな
がら温度を45℃になるように平衡化させる。このとき26
0nm での吸光度が変化しないことを確認しておく。ジチ
オスレイトール処理したスクランブルド RNase A溶液か
ら５μl 取り、これをセル中の溶液とまぜながら、 0.2
分毎に２分間260nm での吸光度を測る。ＰＤＩ活性は26
0nm での吸光変化速度の初速から求められる。
リン酸緩衝液（pH 7.5）20mlに、10μl の1Mジチオスレ
イトールを加えたものを調製し、この溶液から10μl を
取り、20μl の酵素試料とまぜた55mMリン酸緩衝液(pH
7.5) 420μl に加え30℃で５分半放置する。これに上記
スクランブルドRNase 溶液50μl を加え30℃、15分半反
応させる。ここで、 1.945mlの脱気した50mMトリス塩
酸、5mM 塩化マグネシウム、25mM塩化カリウムを含む緩
衝液pH7.5 に、50μl のイーストＲＮＡ溶液（10mMトリ
ス塩酸緩衝液pH7.5/1mM EDTA,280nmの吸光度80になるよ
うに調節したもの）を１cm角石英セルに加え、攪拌しな
がら温度を45℃になるように平衡化させる。このとき26
0nm での吸光度が変化しないことを確認しておく。ジチ
オスレイトール処理したスクランブルド RNase A溶液か
ら５μl 取り、これをセル中の溶液とまぜながら、 0.2
分毎に２分間260nm での吸光度を測る。ＰＤＩ活性は26
0nm での吸光変化速度の初速から求められる。
【００７３】ヒトＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1によ
る酵母ＨＩＳ２３株の形質転換 ヒトＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1を用いて、以下の
手順に従いＨＳＡ生産酵母ＨＩＳ２３株［特願平２−57
885 号／微工研菌寄第11351 号（ＦＥＲＭ Ｐ−113
8）］を形質転換した。
る酵母ＨＩＳ２３株の形質転換 ヒトＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1を用いて、以下の
手順に従いＨＳＡ生産酵母ＨＩＳ２３株［特願平２−57
885 号／微工研菌寄第11351 号（ＦＥＲＭ Ｐ−113
8）］を形質転換した。
【００７４】ＹＰＤプレート（２％バクトトリプトン、
１％バクトイーストエキストラクト、２％ブドウ糖およ
び 1.5％寒天）上で培養したＨＳＡ発現酵母ＨＩＳ２３
株の単一コロニーを５mlのＹＰＤ培地（２％バクトトリ
プトン、１％イーストエキストラクトおよび２％ブドウ
糖）に接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。この培
養液１mlを５０mlのＹＰＤ培地に接種後３０℃で振盪培
養し、ＯＤ600 （濁度）が 0.5程度に達したところで菌
体を低速遠心により沈殿として回収した。集めた菌体に
４６μl の５０％ポリエチレングリコール＃4000、１０
μl のＬｉＳＣＮおよびアルカリ溶菌法［Birnboim, H.
C. & Doly, J. (1979) Nucleic AcidsRes . 7, 151
3.]で調製したヒトＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1 DN
A溶液１０μl （ＤＮＡ約２０μｇ分）を加えピペッテ
ィングにより混合し、３０℃で一晩静置した。これに１
mlの滅菌水を加え懸濁後、遠心分離により菌体を沈殿と
して回収した。この菌体を１００μl の滅菌水で懸濁
し、ＳＤ（−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ）プレート［ＳＤ（−Ｈ
ｉｓ、−Ｌｅｕ）培地（0.67％バクトニトロゲンベー
ス、２％ブドウ糖、２０mg／l のアデニン、同ウラシ
ル、同トリプトファン、同アルギニン、同メチオニン、
３０mg／l のチロシン、同イソロイシン、同リジン、５
０mg／l のフェニルアラニン、１００mg／l のアスパラ
ギン酸、同グルタミン酸、１５０mg／l のバリン、２０
０mg／l のトレオニンおよび３７５mg／l のセリン（以
上のアミノ酸は和光純薬株式会社製））および 1.5％寒
天］上にまき３０℃で培養した。培養５日目でプレート
上にコロニーとして形質転換体を得た。
１％バクトイーストエキストラクト、２％ブドウ糖およ
び 1.5％寒天）上で培養したＨＳＡ発現酵母ＨＩＳ２３
株の単一コロニーを５mlのＹＰＤ培地（２％バクトトリ
プトン、１％イーストエキストラクトおよび２％ブドウ
糖）に接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。この培
養液１mlを５０mlのＹＰＤ培地に接種後３０℃で振盪培
養し、ＯＤ600 （濁度）が 0.5程度に達したところで菌
体を低速遠心により沈殿として回収した。集めた菌体に
４６μl の５０％ポリエチレングリコール＃4000、１０
μl のＬｉＳＣＮおよびアルカリ溶菌法［Birnboim, H.
C. & Doly, J. (1979) Nucleic AcidsRes . 7, 151
3.]で調製したヒトＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1 DN
A溶液１０μl （ＤＮＡ約２０μｇ分）を加えピペッテ
ィングにより混合し、３０℃で一晩静置した。これに１
mlの滅菌水を加え懸濁後、遠心分離により菌体を沈殿と
して回収した。この菌体を１００μl の滅菌水で懸濁
し、ＳＤ（−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ）プレート［ＳＤ（−Ｈ
ｉｓ、−Ｌｅｕ）培地（0.67％バクトニトロゲンベー
ス、２％ブドウ糖、２０mg／l のアデニン、同ウラシ
ル、同トリプトファン、同アルギニン、同メチオニン、
３０mg／l のチロシン、同イソロイシン、同リジン、５
０mg／l のフェニルアラニン、１００mg／l のアスパラ
ギン酸、同グルタミン酸、１５０mg／l のバリン、２０
０mg／l のトレオニンおよび３７５mg／l のセリン（以
上のアミノ酸は和光純薬株式会社製））および 1.5％寒
天］上にまき３０℃で培養した。培養５日目でプレート
上にコロニーとして形質転換体を得た。
【００７５】得られた形質転換体（pAHhPDILy1/HIS23）
について以下の手順によりＰＤＩの発現を調べた。この
際コントロール実験として、pAHhPDILy1からPDIcDNA 部
分を除いたコントロールプラスミドｐＡＨを用いて得ら
れた形質転換体(pAH／HIS23)を以下使用した。プレート
上のコロニーを５mlのＳＤ（−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ）培地
に接種し３０℃で２日間振盪培養した。この前培養液１
００μl を５mlのＹＰＤ培地に接種後３０℃２４時間振
盪培養し、得られた培養液 1.5mlを遠心分離にかけその
上清５００μl を回収し、これに等容のエタノールを加
え混合後氷中で１時間静置した。これを遠心分離にかけ
培地中の酵母からの発現分泌物を沈殿として回収し遠心
エバポレーターにより減圧乾燥した。得られた沈殿を１
０μl のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液［62.5mM T
ris-HCl(pH6.8)、２％ＳＤＳ、、５％β−メルカプトエ
タノール、 0.005％ブロモフェノールブルーおよび２０
％グリセリン］に溶解し、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧ
プレート４／２０−1010（第一化学薬品株式会社製）で
電気泳動を行った。泳動後のゲルを染色液（0.15％クマ
シーブリリアントブルー、１０％酢酸および４０％メタ
ノール）で染色後、脱色液（１０％酢酸および４０％メ
タノール）に浸し培地中の発現分泌物を視覚化した。こ
の際、分子量標準としてフォスフォリラーゼｂ（分子量
94,000ダルトンよ、ウシ血清アルブミン（67,000）、オ
ボアルブミン（43,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（30,000）、大豆トリプシンインヒビター（20,000）お
よびα−ラクトアルブミン（14,000）を用いた（第６
図）。その結果、pAHhPDILy1によって形質転換した酵母
ＨＩＳ２３株で、分子量約55,000ダルトンのＰＤＩの発
現分泌が検出された。
について以下の手順によりＰＤＩの発現を調べた。この
際コントロール実験として、pAHhPDILy1からPDIcDNA 部
分を除いたコントロールプラスミドｐＡＨを用いて得ら
れた形質転換体(pAH／HIS23)を以下使用した。プレート
上のコロニーを５mlのＳＤ（−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ）培地
に接種し３０℃で２日間振盪培養した。この前培養液１
００μl を５mlのＹＰＤ培地に接種後３０℃２４時間振
盪培養し、得られた培養液 1.5mlを遠心分離にかけその
上清５００μl を回収し、これに等容のエタノールを加
え混合後氷中で１時間静置した。これを遠心分離にかけ
培地中の酵母からの発現分泌物を沈殿として回収し遠心
エバポレーターにより減圧乾燥した。得られた沈殿を１
０μl のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプル緩衝液［62.5mM T
ris-HCl(pH6.8)、２％ＳＤＳ、、５％β−メルカプトエ
タノール、 0.005％ブロモフェノールブルーおよび２０
％グリセリン］に溶解し、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧ
プレート４／２０−1010（第一化学薬品株式会社製）で
電気泳動を行った。泳動後のゲルを染色液（0.15％クマ
シーブリリアントブルー、１０％酢酸および４０％メタ
ノール）で染色後、脱色液（１０％酢酸および４０％メ
タノール）に浸し培地中の発現分泌物を視覚化した。こ
の際、分子量標準としてフォスフォリラーゼｂ（分子量
94,000ダルトンよ、ウシ血清アルブミン（67,000）、オ
ボアルブミン（43,000）、カーボニックアンヒドラーゼ
（30,000）、大豆トリプシンインヒビター（20,000）お
よびα−ラクトアルブミン（14,000）を用いた（第６
図）。その結果、pAHhPDILy1によって形質転換した酵母
ＨＩＳ２３株で、分子量約55,000ダルトンのＰＤＩの発
現分泌が検出された。
【００７６】ヒトＰＤＩのＨＳＡ発現分泌に対する効果 上記の酵母におけるＨＳＡおよびＰＤＩの共発現系を用
いて、ヒトＰＤＩのＨＳＡ発現分泌に対する効果を以下
の手順によって調べた。
いて、ヒトＰＤＩのＨＳＡ発現分泌に対する効果を以下
の手順によって調べた。
【００７７】コントロールプラスミドｐＡＨおよびヒト
ＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1それぞれによって形質
転換した酵母ＨＩＳ２３株、即ちｐＡＨ／ＨＩＳ２３株
およびpAHhPDILy1／HIS23 株の独立したコロニー５つず
つを各々５mlのＳＤ（−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ）培地に接種
し３０℃で２４時間前培養を行った。この前培養液１０
０μl をそれぞれ５mlのＹＰＤ培地に接種し３０℃で２
４時間振盪培養を行ない、各培養液から前項で述べた方
法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を調製しＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行なった（第７図）。得られたゲルを用いて、
各株のＨＳＡ分泌量をデンシトメーター（IMAGE ANALYS
IS SYSTEM 、テフコ株式会社製）で定量化し、ＰＤＩの
共発現によるＨＳＡの発現分泌量の変化を調べた（第８
図）。その結果、ｐＡＨ／ＨＩＳ２３株で平均0.93mg／
l またpAHhPDILy1／HIS23 株で同じく1.50mg／l のＨＳ
Ａを分泌しており、酵母ＨＩＳ２３株におけるヒトＰＤ
Ｉの共発現により、ＨＳＡの分泌量は平均で約６０％の
増加を示した。
ＰＤＩ発現プラスミドpAHhPDILy1それぞれによって形質
転換した酵母ＨＩＳ２３株、即ちｐＡＨ／ＨＩＳ２３株
およびpAHhPDILy1／HIS23 株の独立したコロニー５つず
つを各々５mlのＳＤ（−Ｈｉｓ、−Ｌｅｕ）培地に接種
し３０℃で２４時間前培養を行った。この前培養液１０
０μl をそれぞれ５mlのＹＰＤ培地に接種し３０℃で２
４時間振盪培養を行ない、各培養液から前項で述べた方
法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料を調製しＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行なった（第７図）。得られたゲルを用いて、
各株のＨＳＡ分泌量をデンシトメーター（IMAGE ANALYS
IS SYSTEM 、テフコ株式会社製）で定量化し、ＰＤＩの
共発現によるＨＳＡの発現分泌量の変化を調べた（第８
図）。その結果、ｐＡＨ／ＨＩＳ２３株で平均0.93mg／
l またpAHhPDILy1／HIS23 株で同じく1.50mg／l のＨＳ
Ａを分泌しており、酵母ＨＩＳ２３株におけるヒトＰＤ
Ｉの共発現により、ＨＳＡの分泌量は平均で約６０％の
増加を示した。
【００７８】
【発明の効果】本発明は、ヒト血清アルブミンプレプロ
配列をコードするＤＮＡとヒトプロテインジスルフィド
イソメラーゼ遺伝子とから成る連結遺伝子を用いること
により、ヒトＰＤＩの大量生産法の手段を初めて確立し
たものである。これにより、この方法は、Ｓ−Ｓ結合の
掛け違い等の理由で高次構造形成が不完全な蛋白質の活
性化を促進するために大量かつ安価な手段として用いる
ことができる。主に遺伝子工学的に産生された不活性蛋
白質の活性化に効果的であると考えられ、この酵素の発
現を他の有用ポリペプチドの発現と共役させることによ
り、その有用ポリペプチドの宿主細胞による産生効率を
上昇させることが可能となった。その他、研究用試薬と
しても使用できる。
配列をコードするＤＮＡとヒトプロテインジスルフィド
イソメラーゼ遺伝子とから成る連結遺伝子を用いること
により、ヒトＰＤＩの大量生産法の手段を初めて確立し
たものである。これにより、この方法は、Ｓ−Ｓ結合の
掛け違い等の理由で高次構造形成が不完全な蛋白質の活
性化を促進するために大量かつ安価な手段として用いる
ことができる。主に遺伝子工学的に産生された不活性蛋
白質の活性化に効果的であると考えられ、この酵素の発
現を他の有用ポリペプチドの発現と共役させることによ
り、その有用ポリペプチドの宿主細胞による産生効率を
上昇させることが可能となった。その他、研究用試薬と
しても使用できる。
【００７９】
配列番号：１ 配列の長さ：2454 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源：ヒト肝臓又は胎盤λgt 11 cDNAライブラリー（Cl
ontech社） 配列 GAATTCCGGG GGCGACGAGA GAAGCGCCCC GCCTGATCCG TGTCCGAC ATG CTG CGC 57 Met Leu Arg -15 CGC GCT CTG CTG TGC CTG GCC GTG GCC GCC CTG GTG CGC GCC GAC GCC 105 Arg Ala Leu Leu Cys Leu Ala Val Ala Ala Leu Val Arg Ala Asp Ala -10 -5 1 CCC GAG GAG GAG GAC CAC GTC CTG GTG CTG CGG AAA AGC AAC TTC GCG 153 Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser Asn Phe Ala 5 10 15 GAG GCG CTG GCG GCC CAC AAG TAC CTG CTG GTG GAG TTC TAT GCC CCT 201 Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe Tyr Ala Pro 20 25 30 TGG TGT GGC CAC TGC AAG GCT CTG GCC CCT GAG TAT GCC AAA GCC GCT 249 Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala 35 40 45 50 GGG AAG CTG AAG GCA GAA GGT TCC GAG ATC AGG TTG GCC AAG GTG GAC 297 Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys Val Asp 55 60 65 GCC ACG GAG GAG TCT GAC CTG GCC CAG CAG TAC GGC GTG CGC GGC TAT 345 Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg Gly Tyr 70 75 80 CCC ACC ATC AAG TTC TTC AGG AAT GGA GAC ACG GCT TCC CCC AAG GAA 393 Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro Lys Glu 85 90 95 TAT ACA GCT GGC AGA GAG GCT GAT GAC ATC GTG AAC TGG CTG AAG AAG 441 Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu Lys Lys 100 105 110 CGC ACG GGC CCG GCT GCC ACC ACC CTG CCT GAC GGC GCA GCT GCA GAG 489 Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala Ala Ala Glu 115 120 125 130 TCC TTG GTG GAG TCC AGC GAG GTG GCT GTC ATC GGC TTC TTC AAG GAC 537 Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe Lys Asp 135 140 145 GTG GAG TCG GAC TCT GCC AAG CAG TTT TTG CAG GCA GCA GAG GCC ATC 585 Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ala Ile 150 155 160 GAT GAC ATA CCA TTT GGG ATC ACT TCC AAC AGT GAC GTG TTC TCC AAA 633 Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe Ser Lys 165 170 175 TAC CAG CTC GAC AAA GAT GGG GTT GTC CTC TTT AAG AAG TTT GAT GAA 681 Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu 180 185 190 GGC CGG AAC AAC TTT GAA GGG GAG GTC ACC AAG GAG AAC CTG CTG GAC 729 Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn Leu Leu Asp 195 200 205 210 TTT ATC AAA CAC AAC CAG CTG CCC CTT GTC ATC GAG TTC ACC GAG CAG 777 Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr Glu Gln 215 220 225 ACA GCC CCG AAG ATT TTT GGA GGT GAA ATC AAG ACT CAC ATC CTG CTG 825 Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile Leu Leu 230 235 240 TTC TTG CCC AAG AGT GTG TCT GAC TAT GAC GGC AAA CTG AGC AAC TTC 873 Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu Ser Asn Phe 245 250 255 AAA ACA GCA GCC GAG AGC TTC AAG GGC AAG ATC CTG TTC ATC TTC ATC 921 Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile Phe Ile 260 265 270 GAC AGC GAC CAC ACC GAC AAC CAG CGC ATC CTC GAG TTC TTT GGC CTG 969 Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe Gly Leu 275 280 285 290 AAG AAG GAA GAG TGC CCG GCC GTG CGC CTC ATC ACC CTG GAG GAG GAG 1017 Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu Glu Glu 295 300 305 ATG ACC AAG TAC AAG CCC GAA TCG GAG GAG CTG ACG GCA GAG AGG ATC 1065 Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala Glu Arg Ile 310 315 320 ACA GAG TTC TGC CAC CGC TTC CTG GAG GGC AAA ATC AAG CCC CAC CTG 1113 Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro His Leu 325 330 335 ATG AGC CAG GAG CTG CCG GAG GAC TGG GAC AAG CAG CCT GTC AAG GTG 1161 Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val Lys Val 340 345 350 CTT GTT GGG AAG AAC TTT GAA GAC GTG GCT TTT GAT GAG AAA AAA AAC 1209 Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu Lys Lys Asn 355 360 365 370 GTC TTT GTG GAG TTC TAT GCC CCA TGG TGT GGT CAC TGC AAA CAG TTG 1257 Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Gln Leu 375 380 385 GCT CCC ATT TGG GAT AAA CTG GGA GAG ACG TAC AAG GAC CAT GAG AAC 1305 Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His Glu Asn 390 395 400 ATC GTC ATC GCC AAG ATG GAC TCG ACT GCC AAC GAG GTG GAG GCC GTC 1353 Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val Glu Ala Val 405 410 415 AAA GTG CAC AGC TTC CCC ACA CTC AAG TTC TTT CCT GCC AGT GCC GAC 1401 Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Ser Ala Asp 420 425 430 AGG ACG GTC ATT GAT TAC AAC GGG GAA CGC ACG CTG GAT GGT TTT AAG 1449 Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp Gly Phe Lys 435 440 445 450 AAA TTC CTG GAG AGC GGT GGC CAG GAT GGG GCA GGG GAT GAT GAC GAT 1497 Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp Asp Asp Asp 455 460 465 CTC GAG GAC CTG GAA GAA GCA GAG GAG CCA GAC ATG GAG GAA GAC GAT 1545 Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu Glu Asp Asp 470 475 480 GAT CAG AAA GCT GTG AAA GAT GAA CTG TAA TACGCAAAGC CAGACCCGGG 1595 Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu * 485 490 CGCTGCCGAG ACCCCTCGGG GGCTGCACAC CCAGCAGCAG CGCACGCCTC CGAAGCCTGC 1655 GGCCTCGCTT GAAGGAGGGC GTCGCCGGAA ACCCAGGGAA CCTCTCTGAA GTGACACCTC 1715 ACCCCTACAC ACCGTCCGTT CACCCCCGTC TCTTCCTTCT GCTTTTCGGT TTTTGGAAAG 1775 GGATCCATCT CCAGGCAGCC CACCCTGGTG GGGCTTGTTT CCTGAAACCA TGATGTACTT 1835 TTTCATACAT GAGTCTGTCC AGAGTGCTTG CTACCGTGTT CGGAGTCTCG CTGCCTCCCT 1895 CCCGCGGGAG GTTTCTCCTC TTTTTGAAAA TTCCGTCTGT GGGATTTTTA GACATTTTTC 1955 GACATCAGGG TATTTGTTCC ACCTTGGCCA GGCCTCCTCG GAGAAGCTTG TCCCCCGTGT 2015 GGGAGGGACG GAGCCGGACT GGACATGGTC ACTCAGTACC GCCTGCAGTG TCGCCATGAC 2075 TGATCATGGC TCTTGCATTT TTGGGTAAAT GGAGACTTCC GGATCCTGTC AGGGTGTCCC 2135 CCATGCCTGG AAGAGGAGCT GGTGGCTGCC AGCCCTGGGG CCCGGCACAG GCCTGGGCCT 2195 TCCCCTTCCC TCAAGCCAGG GCTCCTCCTC CTGTCGTGGG CTCATTGTGA CCACTGGCCT 2255 CTCTACAGCA CGGCCTGTGG CCTGTTCAAG GCAGAACCAC GACCCTTGAC TCCCGGGTGG 2315 GGAGGTGGCC AAGGATGCTG GAGCTGAATC AGACGCTGAC AGTTCTTCAG GCATTTCTAT 2375 TTCACAATCG AATTGAACAC ATTGGCCAAA TAAAGTTGAA ATTTTACCCA CCCAAAAAAA 2435 AAAAAAAAAA CCCGAATTC 2454 配列番号：２ 配列の長さ：1545 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（半合成ＤＮＡ） 配列 ATG AAG TGG GTT ACC TTC ATC TCT TTG TTG 30 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu -20 -15 TTC TTG TTC TCT TCT GCT TAC TCT AGA GGT GTT TTC AGA AGG GGC GCC 78 Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Gly Ala -10 -5 1 CCC GAG GAG GAG GAC CAC GTC CTG GTG CTG CGG AAA AGC AAC TTC GCG 126 Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser Asn Phe Ala 5 10 15 GAG GCG CTG GCG GCC CAC AAG TAC CTG CTG GTG GAG TTC TAT GCC CCT 174 Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe Tyr Ala Pro 20 25 30 TGG TGT GGC CAC TGC AAG GCT CTG GCC CCT GAG TAT GCC AAA GCC GCT 222 Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala 35 40 45 50 GGG AAG CTG AAG GCA GAA GGT TCC GAG ATC AGG TTG GCC AAG GTG GAC 270 Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys Val Asp 55 60 65 GCC ACG GAG GAG TCT GAC CTG GCC CAG CAG TAC GGC GTG CGC GGC TAT 318 Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg Gly Tyr 70 75 80 CCC ACC ATC AAG TTC TTC AGG AAT GGA GAC ACG GCT TCC CCC AAG GAA 366 Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro Lys Glu 85 90 95 TAT ACA GCT GGC AGA GAG GCT GAT GAC ATC GTG AAC TGG CTG AAG AAG 414 Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu Lys Lys 100 105 110 CGC ACG GGC CCG GCT GCC ACC ACC CTG CCT GAC GGC GCA GCT GCA GAG 462 Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala Ala Ala Glu 115 120 125 130 TCC TTG GTG GAG TCC AGC GAG GTG GCT GTC ATC GGC TTC TTC AAG GAC 510 Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe Lys Asp 135 140 145 GTG GAG TCG GAC TCT GCC AAG CAG TTT TTG CAG GCA GCA GAG GCC ATC 558 Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ala Ile 150 155 160 GAT GAC ATA CCA TTT GGG ATC ACT TCC AAC AGT GAC GTG TTC TCC AAA 606 Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe Ser Lys 165 170 175 TAC CAG CTC GAC AAA GAT GGG GTT GTC CTC TTT AAG AAG TTT GAT GAA 654 Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu 180 185 190 GGC CGG AAC AAC TTT GAA GGG GAG GTC ACC AAG GAG AAC CTG CTG GAC 702 Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn Leu Leu Asp 195 200 205 210 TTT ATC AAA CAC AAC CAG CTG CCC CTT GTC ATC GAG TTC ACC GAG CAG 750 Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr Glu Gln 215 220 225 ACA GCC CCG AAG ATT TTT GGA GGT GAA ATC AAG ACT CAC ATC CTG CTG 798 Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile Leu Leu 230 235 240 TTC TTG CCC AAG AGT GTG TCT GAC TAT GAC GGC AAA CTG AGC AAC TTC 846 Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Try Asp Gly Lys Leu Ser Asn Phe 245 250 255 AAA ACA GCA GCC GAG AGC TTC AAG GGC AAG ATC CTG TTC ATC TTC ATC 894 Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile Phe Ile 260 265 270 GAC AGC GAC CAC ACC GAC AAC CAG CGC ATC CTC GAG TTC TTT GGC CTG 942 Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe Gly Leu 275 280 285 290 AAG AAG GAA GAG TGC CCG GCC GTG CGC CTC ATC ACC CTG GAG GAG GAG 990 Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu Glu Glu 295 300 305 ATG ACC AAG TAC AAG CCC GAA TCG GAG GAG CTG ACG GCA GAG AGG ATC 1038 Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala Glu Arg Ile 310 315 320 ACA GAG TTC TGC CAC CGC TTC CTG GAG GGC AAA ATC AAG CCC CAC CTG 1086 Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro His Leu 325 330 335 ATG AGC CAG GAG CTG CCG GAG GAC TGG GAC AAG CAG CCT GTC AAG GTG 1134 Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val Lys Val 340 345 350 CTT GTT GGG AAG AAC TTT GAA GAC GTG GCT TTT GAT GAG AAA AAA AAC 1182 Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu Lys Lys Asn 355 360 365 370 GTC TTT GTG GAG TTC TAT GCC CCA TGG TGT GGT CAC TGC AAA CAG TTG 1230 Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Gln Leu 375 380 385 GCT CCC ATT TGG GAT AAA CTG GGA GAG ACG TAC AAG GAC CAT GAG AAC 1278 Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His Glu Asn 390 395 400 ATC GTC ATC GCC AAG ATG GAC TCG ACT GCC AAC GAG GTG GAG GCC GTC 1326 Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val Glu Ala Val 405 410 415 AAA GTG CAC AGC TTC CCC ACA CTC AAG TTC TTT CCT GCC AGT GCC GAC 1374 Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Ser Ala Asp 420 425 430 AGG ACG GTC ATT GAT TAC AAC GGG GAA CGC ACG CTG GAT GGT TTT AAG 1422 Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp Gly Phe Lys 435 440 445 450 AAA TTC CTG GAG AGC GGT GGC CAG GAT GGG GCA GGG GAT GAT GAC GAT 1470 Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp Asp Asp Asp 455 460 465 CTC GAG GAC CTG GAA GAA GCA GAG GAG CCA GAC ATG GAG GAA GAC GAT 1518 Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu Glu Asp Asp 470 475 480 GAT CAG AAA GCT GTG AAA GAT GAA CTG 1545 Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu 485 490 配列番号：３ 配列の長さ： 491 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser Asn 1 5 10 15 Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe Tyr 20 25 30 Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys 35 40 45 Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys 50 55 60 Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro 85 90 95 Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu 100 105 110 Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe 130 135 140 Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe 165 170 175 Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe 180 185 190 Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn Leu 195 200 205 Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr 210 215 220 Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu Ser 245 250 255 Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe 275 280 285 Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu 290 295 300 Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala Glu 305 310 315 320 Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro 325 330 335 His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val 340 345 350 Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu Lys 355 360 365 Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys 370 375 380 Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His 385 390 395 400 Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val Glu 405 410 415 Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Ser 420 425 430 Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp Gly 435 440 445 Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp Asp 450 455 460 Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu Glu 465 470 475 480 Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu 485 490
ontech社） 配列 GAATTCCGGG GGCGACGAGA GAAGCGCCCC GCCTGATCCG TGTCCGAC ATG CTG CGC 57 Met Leu Arg -15 CGC GCT CTG CTG TGC CTG GCC GTG GCC GCC CTG GTG CGC GCC GAC GCC 105 Arg Ala Leu Leu Cys Leu Ala Val Ala Ala Leu Val Arg Ala Asp Ala -10 -5 1 CCC GAG GAG GAG GAC CAC GTC CTG GTG CTG CGG AAA AGC AAC TTC GCG 153 Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser Asn Phe Ala 5 10 15 GAG GCG CTG GCG GCC CAC AAG TAC CTG CTG GTG GAG TTC TAT GCC CCT 201 Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe Tyr Ala Pro 20 25 30 TGG TGT GGC CAC TGC AAG GCT CTG GCC CCT GAG TAT GCC AAA GCC GCT 249 Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala 35 40 45 50 GGG AAG CTG AAG GCA GAA GGT TCC GAG ATC AGG TTG GCC AAG GTG GAC 297 Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys Val Asp 55 60 65 GCC ACG GAG GAG TCT GAC CTG GCC CAG CAG TAC GGC GTG CGC GGC TAT 345 Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg Gly Tyr 70 75 80 CCC ACC ATC AAG TTC TTC AGG AAT GGA GAC ACG GCT TCC CCC AAG GAA 393 Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro Lys Glu 85 90 95 TAT ACA GCT GGC AGA GAG GCT GAT GAC ATC GTG AAC TGG CTG AAG AAG 441 Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu Lys Lys 100 105 110 CGC ACG GGC CCG GCT GCC ACC ACC CTG CCT GAC GGC GCA GCT GCA GAG 489 Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala Ala Ala Glu 115 120 125 130 TCC TTG GTG GAG TCC AGC GAG GTG GCT GTC ATC GGC TTC TTC AAG GAC 537 Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe Lys Asp 135 140 145 GTG GAG TCG GAC TCT GCC AAG CAG TTT TTG CAG GCA GCA GAG GCC ATC 585 Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ala Ile 150 155 160 GAT GAC ATA CCA TTT GGG ATC ACT TCC AAC AGT GAC GTG TTC TCC AAA 633 Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe Ser Lys 165 170 175 TAC CAG CTC GAC AAA GAT GGG GTT GTC CTC TTT AAG AAG TTT GAT GAA 681 Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu 180 185 190 GGC CGG AAC AAC TTT GAA GGG GAG GTC ACC AAG GAG AAC CTG CTG GAC 729 Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn Leu Leu Asp 195 200 205 210 TTT ATC AAA CAC AAC CAG CTG CCC CTT GTC ATC GAG TTC ACC GAG CAG 777 Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr Glu Gln 215 220 225 ACA GCC CCG AAG ATT TTT GGA GGT GAA ATC AAG ACT CAC ATC CTG CTG 825 Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile Leu Leu 230 235 240 TTC TTG CCC AAG AGT GTG TCT GAC TAT GAC GGC AAA CTG AGC AAC TTC 873 Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu Ser Asn Phe 245 250 255 AAA ACA GCA GCC GAG AGC TTC AAG GGC AAG ATC CTG TTC ATC TTC ATC 921 Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile Phe Ile 260 265 270 GAC AGC GAC CAC ACC GAC AAC CAG CGC ATC CTC GAG TTC TTT GGC CTG 969 Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe Gly Leu 275 280 285 290 AAG AAG GAA GAG TGC CCG GCC GTG CGC CTC ATC ACC CTG GAG GAG GAG 1017 Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu Glu Glu 295 300 305 ATG ACC AAG TAC AAG CCC GAA TCG GAG GAG CTG ACG GCA GAG AGG ATC 1065 Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala Glu Arg Ile 310 315 320 ACA GAG TTC TGC CAC CGC TTC CTG GAG GGC AAA ATC AAG CCC CAC CTG 1113 Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro His Leu 325 330 335 ATG AGC CAG GAG CTG CCG GAG GAC TGG GAC AAG CAG CCT GTC AAG GTG 1161 Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val Lys Val 340 345 350 CTT GTT GGG AAG AAC TTT GAA GAC GTG GCT TTT GAT GAG AAA AAA AAC 1209 Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu Lys Lys Asn 355 360 365 370 GTC TTT GTG GAG TTC TAT GCC CCA TGG TGT GGT CAC TGC AAA CAG TTG 1257 Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Gln Leu 375 380 385 GCT CCC ATT TGG GAT AAA CTG GGA GAG ACG TAC AAG GAC CAT GAG AAC 1305 Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His Glu Asn 390 395 400 ATC GTC ATC GCC AAG ATG GAC TCG ACT GCC AAC GAG GTG GAG GCC GTC 1353 Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val Glu Ala Val 405 410 415 AAA GTG CAC AGC TTC CCC ACA CTC AAG TTC TTT CCT GCC AGT GCC GAC 1401 Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Ser Ala Asp 420 425 430 AGG ACG GTC ATT GAT TAC AAC GGG GAA CGC ACG CTG GAT GGT TTT AAG 1449 Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp Gly Phe Lys 435 440 445 450 AAA TTC CTG GAG AGC GGT GGC CAG GAT GGG GCA GGG GAT GAT GAC GAT 1497 Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp Asp Asp Asp 455 460 465 CTC GAG GAC CTG GAA GAA GCA GAG GAG CCA GAC ATG GAG GAA GAC GAT 1545 Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu Glu Asp Asp 470 475 480 GAT CAG AAA GCT GTG AAA GAT GAA CTG TAA TACGCAAAGC CAGACCCGGG 1595 Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu * 485 490 CGCTGCCGAG ACCCCTCGGG GGCTGCACAC CCAGCAGCAG CGCACGCCTC CGAAGCCTGC 1655 GGCCTCGCTT GAAGGAGGGC GTCGCCGGAA ACCCAGGGAA CCTCTCTGAA GTGACACCTC 1715 ACCCCTACAC ACCGTCCGTT CACCCCCGTC TCTTCCTTCT GCTTTTCGGT TTTTGGAAAG 1775 GGATCCATCT CCAGGCAGCC CACCCTGGTG GGGCTTGTTT CCTGAAACCA TGATGTACTT 1835 TTTCATACAT GAGTCTGTCC AGAGTGCTTG CTACCGTGTT CGGAGTCTCG CTGCCTCCCT 1895 CCCGCGGGAG GTTTCTCCTC TTTTTGAAAA TTCCGTCTGT GGGATTTTTA GACATTTTTC 1955 GACATCAGGG TATTTGTTCC ACCTTGGCCA GGCCTCCTCG GAGAAGCTTG TCCCCCGTGT 2015 GGGAGGGACG GAGCCGGACT GGACATGGTC ACTCAGTACC GCCTGCAGTG TCGCCATGAC 2075 TGATCATGGC TCTTGCATTT TTGGGTAAAT GGAGACTTCC GGATCCTGTC AGGGTGTCCC 2135 CCATGCCTGG AAGAGGAGCT GGTGGCTGCC AGCCCTGGGG CCCGGCACAG GCCTGGGCCT 2195 TCCCCTTCCC TCAAGCCAGG GCTCCTCCTC CTGTCGTGGG CTCATTGTGA CCACTGGCCT 2255 CTCTACAGCA CGGCCTGTGG CCTGTTCAAG GCAGAACCAC GACCCTTGAC TCCCGGGTGG 2315 GGAGGTGGCC AAGGATGCTG GAGCTGAATC AGACGCTGAC AGTTCTTCAG GCATTTCTAT 2375 TTCACAATCG AATTGAACAC ATTGGCCAAA TAAAGTTGAA ATTTTACCCA CCCAAAAAAA 2435 AAAAAAAAAA CCCGAATTC 2454 配列番号：２ 配列の長さ：1545 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（半合成ＤＮＡ） 配列 ATG AAG TGG GTT ACC TTC ATC TCT TTG TTG 30 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu -20 -15 TTC TTG TTC TCT TCT GCT TAC TCT AGA GGT GTT TTC AGA AGG GGC GCC 78 Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Gly Ala -10 -5 1 CCC GAG GAG GAG GAC CAC GTC CTG GTG CTG CGG AAA AGC AAC TTC GCG 126 Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser Asn Phe Ala 5 10 15 GAG GCG CTG GCG GCC CAC AAG TAC CTG CTG GTG GAG TTC TAT GCC CCT 174 Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe Tyr Ala Pro 20 25 30 TGG TGT GGC CAC TGC AAG GCT CTG GCC CCT GAG TAT GCC AAA GCC GCT 222 Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys Ala Ala 35 40 45 50 GGG AAG CTG AAG GCA GAA GGT TCC GAG ATC AGG TTG GCC AAG GTG GAC 270 Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys Val Asp 55 60 65 GCC ACG GAG GAG TCT GAC CTG GCC CAG CAG TAC GGC GTG CGC GGC TAT 318 Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg Gly Tyr 70 75 80 CCC ACC ATC AAG TTC TTC AGG AAT GGA GAC ACG GCT TCC CCC AAG GAA 366 Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro Lys Glu 85 90 95 TAT ACA GCT GGC AGA GAG GCT GAT GAC ATC GTG AAC TGG CTG AAG AAG 414 Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu Lys Lys 100 105 110 CGC ACG GGC CCG GCT GCC ACC ACC CTG CCT GAC GGC GCA GCT GCA GAG 462 Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala Ala Ala Glu 115 120 125 130 TCC TTG GTG GAG TCC AGC GAG GTG GCT GTC ATC GGC TTC TTC AAG GAC 510 Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe Lys Asp 135 140 145 GTG GAG TCG GAC TCT GCC AAG CAG TTT TTG CAG GCA GCA GAG GCC ATC 558 Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala Glu Ala Ile 150 155 160 GAT GAC ATA CCA TTT GGG ATC ACT TCC AAC AGT GAC GTG TTC TCC AAA 606 Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe Ser Lys 165 170 175 TAC CAG CTC GAC AAA GAT GGG GTT GTC CTC TTT AAG AAG TTT GAT GAA 654 Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe Asp Glu 180 185 190 GGC CGG AAC AAC TTT GAA GGG GAG GTC ACC AAG GAG AAC CTG CTG GAC 702 Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn Leu Leu Asp 195 200 205 210 TTT ATC AAA CAC AAC CAG CTG CCC CTT GTC ATC GAG TTC ACC GAG CAG 750 Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr Glu Gln 215 220 225 ACA GCC CCG AAG ATT TTT GGA GGT GAA ATC AAG ACT CAC ATC CTG CTG 798 Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile Leu Leu 230 235 240 TTC TTG CCC AAG AGT GTG TCT GAC TAT GAC GGC AAA CTG AGC AAC TTC 846 Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Try Asp Gly Lys Leu Ser Asn Phe 245 250 255 AAA ACA GCA GCC GAG AGC TTC AAG GGC AAG ATC CTG TTC ATC TTC ATC 894 Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile Phe Ile 260 265 270 GAC AGC GAC CAC ACC GAC AAC CAG CGC ATC CTC GAG TTC TTT GGC CTG 942 Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe Gly Leu 275 280 285 290 AAG AAG GAA GAG TGC CCG GCC GTG CGC CTC ATC ACC CTG GAG GAG GAG 990 Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu Glu Glu 295 300 305 ATG ACC AAG TAC AAG CCC GAA TCG GAG GAG CTG ACG GCA GAG AGG ATC 1038 Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala Glu Arg Ile 310 315 320 ACA GAG TTC TGC CAC CGC TTC CTG GAG GGC AAA ATC AAG CCC CAC CTG 1086 Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro His Leu 325 330 335 ATG AGC CAG GAG CTG CCG GAG GAC TGG GAC AAG CAG CCT GTC AAG GTG 1134 Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val Lys Val 340 345 350 CTT GTT GGG AAG AAC TTT GAA GAC GTG GCT TTT GAT GAG AAA AAA AAC 1182 Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu Lys Lys Asn 355 360 365 370 GTC TTT GTG GAG TTC TAT GCC CCA TGG TGT GGT CAC TGC AAA CAG TTG 1230 Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Gln Leu 375 380 385 GCT CCC ATT TGG GAT AAA CTG GGA GAG ACG TAC AAG GAC CAT GAG AAC 1278 Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His Glu Asn 390 395 400 ATC GTC ATC GCC AAG ATG GAC TCG ACT GCC AAC GAG GTG GAG GCC GTC 1326 Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val Glu Ala Val 405 410 415 AAA GTG CAC AGC TTC CCC ACA CTC AAG TTC TTT CCT GCC AGT GCC GAC 1374 Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Ser Ala Asp 420 425 430 AGG ACG GTC ATT GAT TAC AAC GGG GAA CGC ACG CTG GAT GGT TTT AAG 1422 Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp Gly Phe Lys 435 440 445 450 AAA TTC CTG GAG AGC GGT GGC CAG GAT GGG GCA GGG GAT GAT GAC GAT 1470 Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp Asp Asp Asp 455 460 465 CTC GAG GAC CTG GAA GAA GCA GAG GAG CCA GAC ATG GAG GAA GAC GAT 1518 Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu Glu Asp Asp 470 475 480 GAT CAG AAA GCT GTG AAA GAT GAA CTG 1545 Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu 485 490 配列番号：３ 配列の長さ： 491 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Gly Ala Pro Glu Glu Glu Asp His Val Leu Val Leu Arg Lys Ser Asn 1 5 10 15 Phe Ala Glu Ala Leu Ala Ala His Lys Tyr Leu Leu Val Glu Phe Tyr 20 25 30 Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Lys 35 40 45 Ala Ala Gly Lys Leu Lys Ala Glu Gly Ser Glu Ile Arg Leu Ala Lys 50 55 60 Val Asp Ala Thr Glu Glu Ser Asp Leu Ala Gln Gln Tyr Gly Val Arg 65 70 75 80 Gly Tyr Pro Thr Ile Lys Phe Phe Arg Asn Gly Asp Thr Ala Ser Pro 85 90 95 Lys Glu Tyr Thr Ala Gly Arg Glu Ala Asp Asp Ile Val Asn Trp Leu 100 105 110 Lys Lys Arg Thr Gly Pro Ala Ala Thr Thr Leu Pro Asp Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Glu Ser Leu Val Glu Ser Ser Glu Val Ala Val Ile Gly Phe Phe 130 135 140 Lys Asp Val Glu Ser Asp Ser Ala Lys Gln Phe Leu Gln Ala Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ile Asp Asp Ile Pro Phe Gly Ile Thr Ser Asn Ser Asp Val Phe 165 170 175 Ser Lys Tyr Gln Leu Asp Lys Asp Gly Val Val Leu Phe Lys Lys Phe 180 185 190 Asp Glu Gly Arg Asn Asn Phe Glu Gly Glu Val Thr Lys Glu Asn Leu 195 200 205 Leu Asp Phe Ile Lys His Asn Gln Leu Pro Leu Val Ile Glu Phe Thr 210 215 220 Glu Gln Thr Ala Pro Lys Ile Phe Gly Gly Glu Ile Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ser Val Ser Asp Tyr Asp Gly Lys Leu Ser 245 250 255 Asn Phe Lys Thr Ala Ala Glu Ser Phe Lys Gly Lys Ile Leu Phe Ile 260 265 270 Phe Ile Asp Ser Asp His Thr Asp Asn Gln Arg Ile Leu Glu Phe Phe 275 280 285 Gly Leu Lys Lys Glu Glu Cys Pro Ala Val Arg Leu Ile Thr Leu Glu 290 295 300 Glu Glu Met Thr Lys Tyr Lys Pro Glu Ser Glu Glu Leu Thr Ala Glu 305 310 315 320 Arg Ile Thr Glu Phe Cys His Arg Phe Leu Glu Gly Lys Ile Lys Pro 325 330 335 His Leu Met Ser Gln Glu Leu Pro Glu Asp Trp Asp Lys Gln Pro Val 340 345 350 Lys Val Leu Val Gly Lys Asn Phe Glu Asp Val Ala Phe Asp Glu Lys 355 360 365 Lys Asn Val Phe Val Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys 370 375 380 Gln Leu Ala Pro Ile Trp Asp Lys Leu Gly Glu Thr Tyr Lys Asp His 385 390 395 400 Glu Asn Ile Val Ile Ala Lys Met Asp Ser Thr Ala Asn Glu Val Glu 405 410 415 Ala Val Lys Val His Ser Phe Pro Thr Leu Lys Phe Phe Pro Ala Ser 420 425 430 Ala Asp Arg Thr Val Ile Asp Tyr Asn Gly Glu Arg Thr Leu Asp Gly 435 440 445 Phe Lys Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gln Asp Gly Ala Gly Asp Asp 450 455 460 Asp Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Ala Glu Glu Pro Asp Met Glu Glu 465 470 475 480 Asp Asp Asp Gln Lys Ala Val Lys Asp Glu Leu 485 490
【図１】第１図Ａは、発現プラスミド pAHhPDILy1 の構
築工程図を示す。
築工程図を示す。
【図２】第１図Ｂは、発現プラスミド pAHhPDILy1 の構
築工程図を示す。
築工程図を示す。
【図３】第１図Ｃは、発現プラスミド pAHhPDILy1 の構
築工程図を示す。
築工程図を示す。
【図４】第２図は、ヒト発現プラスミド上のＨＳＡプレ
プロ配列とＰＤＩの境界部を示す図である。
プロ配列とＰＤＩの境界部を示す図である。
【図５】第３図は、発現・分泌された粗組換えヒトＰＤ
ＩのＳＤＳ電気泳動結果を示す写真であり、ここでレー
ン１は分子量マーカー、レーン２はpAH/AH22（コントロ
ール）、レーン３は pAHhPDILy1/AH22を示す。
ＩのＳＤＳ電気泳動結果を示す写真であり、ここでレー
ン１は分子量マーカー、レーン２はpAH/AH22（コントロ
ール）、レーン３は pAHhPDILy1/AH22を示す。
【図６】第４図は、疎水性カラムクロマトグラフィーに
よる組換えヒトＰＤＩの分離を示す図である。
よる組換えヒトＰＤＩの分離を示す図である。
【図７】第５図は、精製組換えヒトＰＤＩのＳＤＳ電気
泳動結果を示す図であり、図面中、下側の数字は第４図
に示す疎水性カラムクロマトグラフィーの分画番号を、
またＭは分子量マーカーを示す。
泳動結果を示す図であり、図面中、下側の数字は第４図
に示す疎水性カラムクロマトグラフィーの分画番号を、
またＭは分子量マーカーを示す。
【図８】第６図は、酵母ＨＩＳ２３におけるヒトＰＤＩ
の発現を示す電気泳動写真である。
の発現を示す電気泳動写真である。
【図９】第７図は、酵母ＨＩＳ２３におけるヒトＰＤＩ
とＨＳＡとの共発現によるＨＳＡ分泌を示すＳＤＳ電気
泳動写真である。
とＨＳＡとの共発現によるＨＳＡ分泌を示すＳＤＳ電気
泳動写真である。
【図１０】第８図は、第７図のＳＤＳ電気泳動ゲルを用
いてＨＳＡ分泌量をデンシトメーターで定量化した結果
を示す図である。
いてＨＳＡ分泌量をデンシトメーターで定量化した結果
を示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 第１図Ａは、発現プラスミドｐＡＨｈＰＤ
ＩＬｙｌの構築工程図を示す。
ＩＬｙｌの構築工程図を示す。
【図１Ｂ】 第１図Ｂは、発現プラスミドｐＡＨｈＰＤ
ＩＬｙｌの構築工程図を示す。
ＩＬｙｌの構築工程図を示す。
【図１Ｃ】 第１図Ｃは、発現プラスミドｐＡＨｈＰＤ
ＩＬｙｌの構築工程図を示す。
ＩＬｙｌの構築工程図を示す。
【図２】 第２図は、ヒト発現プラスミド上のＨＳＡ
プレプロ配列とＰＤＩの境界部を示す図である。
プレプロ配列とＰＤＩの境界部を示す図である。
【図３】 第３図は、発現・分泌された粗組換えヒト
ＰＤＩのＳＤＳ電気泳動結果を示す写真であり、ここで
レーン１は分子量マーカー、レーン２はｐＡＨ／ＡＨ２
２（コントロール）、レーン３はｐＡＨｈＰＤＩＬｙｌ
／Ａ２２を示す。
ＰＤＩのＳＤＳ電気泳動結果を示す写真であり、ここで
レーン１は分子量マーカー、レーン２はｐＡＨ／ＡＨ２
２（コントロール）、レーン３はｐＡＨｈＰＤＩＬｙｌ
／Ａ２２を示す。
【図４】 第４図は、疎水性カラムクロマトグラフィ
ーによる組換えヒトＰＤＩの分離を示す図である。
ーによる組換えヒトＰＤＩの分離を示す図である。
【図５】 第５図は、精製組換えヒトＰＤＩのＳＤＳ
電気泳動結果を示す図であり、図面中、下側の数字は第
４図に示す疎水性カラムクロマトグラフィーの分画番号
を、またＭは分子量マーカーを示す。
電気泳動結果を示す図であり、図面中、下側の数字は第
４図に示す疎水性カラムクロマトグラフィーの分画番号
を、またＭは分子量マーカーを示す。
【図６】 第６図は、酵母ＨＩＳ２３におけるヒトＰ
ＤＩの発現を示す電気泳動写真である。
ＤＩの発現を示す電気泳動写真である。
【図７】 第７図は、酵母ＨＩＳ２３におけるヒトＰ
ＤＩとＨＳＡとの共発現によるＨＳＡ分泌を示すＳＤＳ
電気泳動写真である。
ＤＩとＨＳＡとの共発現によるＨＳＡ分泌を示すＳＤＳ
電気泳動写真である。
【図８】 第８図は、第７図のＳＤＳ電気泳動ゲルを
用いてＨＳＡ分泌量をデンシトメーターで定量化した結
果を示す図である。
用いてＨＳＡ分泌量をデンシトメーターで定量化した結
果を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【図４】
【図５】
【図１Ａ】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図７】
【図８】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ // Ｇ０１Ｎ 30/00 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 鈴木 正則 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡一丁目３番１ 号 東燃株式会社総合研究所内
Claims (15)
- 【請求項１】 ヒトプロテインジスルフィドイソメラー
ゼ発現用の、ヒト血清アルブミンプレプロ配列をコード
するＤＮＡとヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ
遺伝子とから成る連結遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号２に示される−２４番目〜＋４
９１番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列から成
る、ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ発現用
の、ヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするＤＮ
Ａとヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子と
から成る連結遺伝子。 - 【請求項３】 前記塩基配列が配列番号２に示される１
番目〜１５４５番目の配列から成ることを特徴とする請
求項２記載の連結遺伝子。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の連
結遺伝子を宿主内で発現させ得る複製可能な発現ベクタ
ー。 - 【請求項５】 請求項４記載の発現ベクターで宿主を形
質転換して得られる形質転換体。 - 【請求項６】 宿主が酵母である請求項５記載の形質転
換体。 - 【請求項７】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の連
結遺伝子を請求項５又は６記載の形質転換体内で発現さ
せることを特徴とする組換えヒトプロテインジスルフィ
ドイソメラーゼの製造方法。 - 【請求項８】 請求項１〜３のいずれか一項に記載の連
結遺伝子を宿主内で発現させ得る複製可能な発現ベクタ
ーを構築し、 宿主を前記発現ベクターで形質転換して形質転換体を
得、 前記連結遺伝子を発現させ得る条件下で、前記形質転換
体を培養して組換えヒトプロテインジスルフィドイソメ
ラーゼを分泌させ、 前記組換えヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼを
回収する、ことを特徴とする請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 分泌された前記組換えヒトプロテインジ
スルフィドイソメラーゼを、疎水性カラムクロマトグラ
フィーによって分離回収することを特徴とする請求項８
記載の方法。 - 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか一項に記載の
方法によって得られる、配列番号３に示される１番目〜
４９１番目のアミノ酸配列から成る組換えヒトプロテイ
ンジスルフィドイソメラーゼ。 - 【請求項１１】 共発現可能な請求項１〜３のいずれか
一項に記載の連結遺伝子と生産を目的とするポリペプチ
ドをコードする外来遺伝子とを含む形質転換体。 - 【請求項１２】 形質転換体が形質転換酵母である請求
項１１記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 外来遺伝子がヒト血清アルブミンをコ
ードする遺伝子である請求項１１記載の形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１１〜１３のいずれか一項に記
載の形質転換体内で、ヒトプロテインジスルフィドイソ
メラーゼ遺伝子と生産を目的とするポリペプチドをコー
ドする外来遺伝子とを共発現させて該ポリペプチドを産
生させ、及び該ポリペプチドを回収することを特徴とす
るポリペプチドの製造方法。 - 【請求項１５】 ポリペプチドがヒト血清アルブミンで
ある請求項１４記載の方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3114074A JPH0638771A (ja) | 1990-10-31 | 1991-04-18 | ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法 |
| EP19920303492 EP0509841A3 (en) | 1991-04-18 | 1992-04-16 | Co-expression system of protein disulfide isomerase gene and useful polypeptide gene and process for producing the polypeptide using its system |
| US07/872,673 US5578466A (en) | 1991-04-18 | 1992-04-17 | Recombinant co-expression system of protein disulfide isomerase gene, yeast receptor protein ERD2 gene and a foreign product polypeptide gene, and a process for producing the foreign polypeptide using such system |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-295017 | 1990-10-31 | ||
| JP29501790 | 1990-10-31 | ||
| JP3114074A JPH0638771A (ja) | 1990-10-31 | 1991-04-18 | ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0638771A true JPH0638771A (ja) | 1994-02-15 |
Family
ID=26452915
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3114074A Pending JPH0638771A (ja) | 1990-10-31 | 1991-04-18 | ヒトプロテインジスルフィドイソメラーゼ遺伝子の発現方法および該遺伝子との共発現によるポリペプチドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0638771A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639635A (en) * | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US5789199A (en) * | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US5965426A (en) * | 1996-09-04 | 1999-10-12 | Suntory Limited | Protein disulfide isomerase gene derived from strain of methylotrophic yeast |
| WO2001068884A1 (fr) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Itoham Foods Inc. | Procede de preparation d'un polypeptide comprenant une liaison disulfure |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| JP2008271976A (ja) * | 1992-06-12 | 2008-11-13 | Merck & Co Inc | サッカロミセスセレビシアエによるジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の産生を増加させる方法 |
| JP2019516401A (ja) * | 2016-05-04 | 2019-06-20 | シェンチェン、プロトゲン、リミテッドＳｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｒｏｔｇｅｎ Ｌｔｄ． | 組換えヒト血清アルブミンの高発現のための遺伝子工学操作された細菌の構築 |
-
1991
- 1991-04-18 JP JP3114074A patent/JPH0638771A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008271976A (ja) * | 1992-06-12 | 2008-11-13 | Merck & Co Inc | サッカロミセスセレビシアエによるジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の産生を増加させる方法 |
| US5639635A (en) * | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
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| WO2001068884A1 (fr) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Itoham Foods Inc. | Procede de preparation d'un polypeptide comprenant une liaison disulfure |
| US7037684B2 (en) | 2000-03-14 | 2006-05-02 | Itoham Foods Inc. | Process for producing polypeptide having disulfide bond |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| JP2019516401A (ja) * | 2016-05-04 | 2019-06-20 | シェンチェン、プロトゲン、リミテッドＳｈｅｎｚｈｅｎ Ｐｒｏｔｇｅｎ Ｌｔｄ． | 組換えヒト血清アルブミンの高発現のための遺伝子工学操作された細菌の構築 |
| JP2022043355A (ja) * | 2016-05-04 | 2022-03-15 | シェンチェン、プロトゲン、リミテッド | 組換えヒト血清アルブミンの高発現のための遺伝子工学操作された細菌の構築 |
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