JPH05501356A

JPH05501356A - メチオニンｎ―アルファ―アセチルトランスフェラーゼの同定

Info

Publication number: JPH05501356A
Application number: JP2515647A
Authority: JP
Inventors: スミス，ジョン・エイ; リー，ファング―ジェン・エス
Original assignee: ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション
Priority date: 1989-10-25
Filing date: 1990-10-23
Publication date: 1993-03-18
Also published as: HUT64586A; CA2067757A1; IE903829A1; FI921795A7; WO1991006636A1; KR920702412A; EP0496823A1; HU9201382D0; FI921795A0; US5223421A; AU6643490A; NZ235832A; FI921795L; AU652133B2; EP0496823A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】３　酵母細胞である請求項２の細胞。

４、ａａａｌＮ’−アセチルトランスフェラーゼ活性が実質的に欠失している請求項３の酵母細胞。

５、ＡＡＡＩ遺伝子のａａａｉｌまたはａａａｉ２対立遺伝子を含有する請求項４の酵母細胞。

６、メチオニンＮ’−アセチルトランスフェラーゼをコードする組換え分子。

７、請求項６の組換え分子を発現する細胞。

８、メチオニンＮ’−アセチル化アミノ末端を欠くペプチドの生産方法であって、酵母メチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子中に、メチオニンＮ ’−アセチルトランスフェラーゼ活性の実質的な欠失を貸し、その変異を有する酵母細胞が該ペプチドの該Ｎ”−アセチル化を触媒することを不可能にする変異を有する酵母細胞中で、該ペプチドを発現させることからなる方法。

９　ａ、メチオニンＮ“−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子中に、メチオニンＮ“−アセチルトランスフェラーゼ活性の実質的な欠失を貸し、その変異を有する酵母細胞がペプチドまたはタンパク質のＮ６−アセチル化を触媒することを不可能にする変異を有する酵母細胞中で、あるペプチドまたはタンパク質を発現させ；ｂ、該ペプチドまたはタンパク質を回収し；Ｃ１該ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を決定する；ことからなる、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列決定法。

明細書発明の名称メチオニンＮ−アルファーアセチルトランスフェラーゼの同定期１世震本出願は、米国特許出願０７／４７３，２７８　（１９９０年１月３１日出願）および０７／４２６，３８２　（１９８９年１０月２５日出願）の一部継続出願である。

発明の技術分野本発明はペプチドまたはタンパク質のメチオニン残基をアセチル化することかできるＮ・−アセチルトランスフェラーゼ酵素、該酵素をコードする組換え分子、および該酵素を発現する宿主細胞に関する。本発明はまた、酵母、サツカロミセス・セレピンエ（Ｓａｃｃｈａ？ｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の種々の宿主からの該酵素の精製に関する。

さらに、本発明は該酵素の研究への使用および工業への適用に関する。

アミノ末端のアシル化は原核性および真核性細胞におけるタンパク質の重要な同時翻訳修飾（コ・トランスレーショナルモディフィケーション）である。ホルミル、ビルボイル、α−ケトブチリル、グリコリル、グルクロニル、α−アミノアシル、ｐ−グルタミル、ミリストイル、およびアンルは周知のＮ’−アシル化基であるが、アセチル化は真核性タンパク質のα−ＮＨ，基の最も一般的な化学修飾であることは明らかである［ツナサヮら（Ｔｓｕｎａｓａｗａ、Ｓ、）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０６：　１６５−１７０　（１９８４）；　ドリーセンら（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、　Ｈ，Ｐ。

Ｃ，）、　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｅ、１８：　２８１− ３２５　（１９８５）］。

］Ｎ’Ｎモーチルは正常な真核性翻訳とプロセシングに重要な役割を果し［ワルド（ｔｏｌｄ、Ｐ、）、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　９：　２５６−２５７（１９８４）］　、タンパク加水分解による分解から保護する［ジョーンホール（Ｊｏｒｎｖｏｌｌ、Ｈ，）、　Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、　５５：１−１２　（１９７５１ルーベンスタインら（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、Ｐ、）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４：　１１１４２−１１１４７　（１９７９）］。

アセチル部分がタバコモザイクウィルス［ナリタら（Ｎａ？ｉｔａ、　Ｋ、　）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２８：１８４−１９１　（１９５８）］および］α−メラニン細胞刺激ペプチドハリスら（Ｈａｒｒｉｓ、　Ｊ、　１．　）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　７１：　４５１−４５９（１９５９）］のコートタンパク質のＮ−末端保護基であることが発見されて以来、種々の生物の多くのタンパク質がアセチル化されたＮ−末端残基を有することか示された［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２５１：１００９−１０１４　（１９７６）；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｉ、　２５４：１４４７−１４４９　（１９７９）］　、例えば、マウスＬ−細胞およびエルリ、ヒ腹水細胞はその細胞内可溶性タンパク質の約８０％がＮ“−アセチル化されている［ブラウンら（Ｂ？ｏｗ＋ｉ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋。

２５１：１００９−１０１４　（１９７６）；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４・１４４７−１４４９　（１９７９）］。下下等真核性物では可溶性タンパク質の約５０％がアセチル化されている［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、　Ｌ、　）　Ｉｎｔ’　ＩＣｏｎｇｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒ、　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｒ　ＢｉｏｃｈｅｌＩｌｉｓｔｒｙ、　Ｃａｎａｄａ）　Ｖｏｌ、１１：　９０　（１９７９）］　、これらのデータはＮ”−アセチル基が非常に重要な保護基であることを証明するものである。この保護基の生物学的な機能は未成熟タンパク質のカタボリズムの防止［ジョーンボール（Ｊｏｒｎｖｏｌｌ、Ｈ，）、　Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、　５５：ｌ−１２（１９７５）］およびタンパク質のタンパク加水分解による分解［ルーベンスタイン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｐ、　）およびトイヒラ−（Ｄｅｕｃｈｌｅｒ、Ｊ、）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４：１１１４２　（１９７９））の防止にあると示唆されている。しかしマウスＬ−細胞では、そのようなＮ’−アセチル化はこのような生物学的な機能を有しないようである［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５４：１４４７　（１９７９月。

Ｎ・−アセチル化の明確な一般的機能は確実に査定されてはいなが、少数のタンパク質について、幾つかの特異的な作用が知られている。ニューロスポーラ・クラノサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏ？ａ　ｃｒａｓｓａ）の変異株が有する非アセチル化ＮＡＤＰ特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、アセチル化形のものと対照的に熱に不安定である［シデイッヒら（Ｓｉｄｄｉｇ）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３７：１２５（１９８０）］　、リポソームタンパクＳ５がアセチル化されていない大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）変異株は温度過敏性を示す［クンバーリッジ（Ｃｕｍｂｅｒｌｉｄｇｅ、Ａ、Ｇ、）　、イソメ（Ｉｓｏｎｏ、に、）　、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３１：１８９（１９７９月。前駆体タンパク質プロオピオメラノコルチンからの２つの生成物のＮａ−アセチル化はこれらポリペプチドの生物学的活性に大いに制御効果を示す：即ちＮ’−アセチル化されるとβ−エンドルフィンのオピオイド（モルヒネ様）作用は完全に抑制されるが、α−ＭＳＨのメラノトロビック（メラニン細胞刺激）作用は増大する［スミスら（Ｓａ＋ｙｔｈ）　、　Ｎａｔｕｒｅ　２７９：２５２（１９７０）　ニスミス（Ｓｍｙｔｈ、　Ｄ、　Ｇ、　）およびザカリアン（Ｚａｋａｒｉａｎ、Ｓ、）　Ｎａｔｕｒｅ２８ｇ：６１３（１９８１；　ラマンチャントラン（Ｒａｒａａｃｈａｄｔａｎ、Ｊ、）、リ　（い、Ｃ，Ｈ，）　Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、２９：３９１（１９６７）コ。培養されたンヨウジョウバエ細胞のアセチル化および非アセチル化細胞質アクチンは微小線維の集合に関与するが、後者は効果が低い［バーガーら（Ｂｅｒｇｅｒ）　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｇｅｎｅｔ、　１９：３２１　（１９８１）］　ｏさらに最近では、エビキチン依存性分解システムに触媒されるタンパク質のターンオーバーは遊離のタンパク質のＮ−末端のα−ＮＨ’の存否に依存するらしく［ハーシコら（Ｈｅｒｓｈｋｏ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８１：９０２１−９０２５（１９８４）およびバソヒマーら（Ｂａｃｈｉａｉｒ）　５ｃｉｅｎｃｅ２３４：１７９ −１８６（１９８６）　］、これはＮ”−アセチル化がタンパク質のターンオーバーを阻害するらしいことを示唆している。

Ｎ’−アセチル化は少な（とも１個のＮ１−アセチルトランスフェラーゼによって触媒される。これはアセチル補酵素Ａからタンパク質およびペプチドのα−ＮＨ″基へのアセチル基の移動を触媒する酵素である。Ｎ１−アセチルトランスフェラーゼは既に、大腸菌［プロットら（Ｂｒｏｔ、Ｎ、）　Ａｒｃｈ、ＢｉｏｃｈｅｔＢｉｏｐｈｙｓ、１５５：４７５−４７７（１９７３）］、ラット肝臓［ペスターナら（Ｐｅｓｔａｎａ、＾、）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４二１３９７−１４０３（１９７５）　；ペスターナら（Ｐｅｓｔａｎａ、Ａ、）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４：１４０４−１４１２（１９７５）　；ヤマダら（Ｙａａａｄａ、　Ｒ，）　１ｓｔ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　（１９８７）；６２５：３４］　、ラット脳［オドノヒｘ　−（０’　Ｄｏｎｏｈｕｅ、　Ｔ、　Ｌ、　）。

Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２５８：２１６３−２１６７（１９８３）］　、ラット脳下垂体［ウッドホードら（ｆｏｏｄｆｏ？ｄ、　Ｔ、　Ａ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ、　２５４　：４９９３−４９９９（１９７９）　；　ベアーゼら（Ｐｅａｓｅ、　Ｋ、　Ａ、　）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２１２：１７７−１８５（１９８１）　；ゲモツキ（Ｇｅｍｂｏｔｓｋｉ、　Ｃ，Ｃ，）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ＋、　２５７：　１０５１０５０１−１０５０９（１９；チャペルら（Ｃｈａｐｐｅｌｌ、Ｍ、Ｃ，）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ２６１：１０８８−１０９１（１９８６）コ、ウシ脳下垂体［Ｇｅｍｂｏｔｓｋｉ、　Ｃ，Ｃ，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２５７：１０５０１−１０５０９（１９８２）］　、ウシレンズ［グランガーら（Ｇｒａｎｇｅｒ、Ｍ、）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾７３：３０１０−３１４　（１９７６）］　；　雌鶏卵管［ツナサワら（Ｔｓｕｎａｓａｗａ、　Ｓ、　）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８７　：６４５−６５０（１９８０）］および小麦胚［キトら（Ｋｉｄｏ、　Ｈ，）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２０８：９５−１００（１９８１）］で示された。

しかしなから、これら供給源からのＮ”−アセチルトランスフェラーゼ酵素が４０倍以−ヒに精製されたことはない。

魚町２雫麹Ｎ’−アセチル化は真核性タンパク質のアミン末端のα−アミ７基の最も一般的な化学修飾である。Ｎ“−アセチル化はタンパク質およびペプチドの生物学的活性に著しい影響を及ぼす。さらにユビキチン依存性の分解システムに仲介されるタンパク質ターンオーバーの速度は遊離のαアミノの存在に依存しており、この依存はＮ’−アセチル化がタンパク質ターンオーバーの阻害に重大な役割を果していることを示している。

従来、アセチル補酵素Ａから、通常にアセチル化されるタンパク質内の残基（セリン、アラニン、メチオニン、グリ７ンおよびスレオニン等）へのび−アミノ酸の転移は単一のＮ’−アセチルトランスフェラーゼによると考えられていた。本発明は、メチオニン残基のアセチル化には第２のＮ’−アセチルトランスフェラーゼが関与することを明らかにするものである。このメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼの同定によって、天然に存在スる２個の異するＮａ−アセチル化タンパク質の説明ができる：開始（イニシエーター）メチオニンがアセチル化されているもの；および開始メチオニンの開裂後、２番目の残基がアセチル化されるもの。

詳しくは、本発明は実質上天然の不純物を含有しないメチオニンＮａ−アセチルトランスフェラーゼに関する。

本発明はまた改変されたメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼを発現する細胞に関する。

さらに本発明は改変されたメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼを発現する酵母、とりわけ、実質上ａａａｌＮ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠く酵母細胞に関する。

さらに本発明はメチオニンＮ’−アセチルトランスフェラーゼをコードする組換え分子をも包含する。

本発明はまたメチオニンＮ’−アセチルトランスフェラーゼをコードする組換え分子を発現する細胞を包含する。

本発明はまたＮ”−アセチル化アミノ末端を持たないペプチドの製造方法であって、酵母メチオニンＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子内に突然変異を有し、その突然変異の結果、実質上メチオニンＮ′−アセチルトランスフェラーゼ活性が失われ、細胞のペプチドＮ”−アセチル化が不可能となった酵母細胞内でペプチドを発現させることからなる方法を提供する。

本発明はまたペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列の決定法であって、Ａ、メチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子に突然変異を有し、その突然変異の結果、実質上メチオニンＮ“−アセチルトランスフェラーゼ活性が失われ、細胞のペプチドＮ”−アセチル化が不可能となった酵母細胞内で、ペプチドまたはタンパク質を発現させ。

Ｂ、ペプチドまたはタンパク質を回収し；Ｃ，ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を決定することからなる方法を提供する。

図面の簡単な説明図１はメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）および単一のＮ”−アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ”−ＡＴ）が関与する真核性タンパク質の同時翻訳修飾経路の提案図である。

図２　（Ａ）はメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼ（Ｍ−Ｎ’ＡＴ）　、メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）およびＮ”−アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ”−ＡＴ）によって触媒される真核性タンパク質の同時翻訳修飾経路の提案図、（Ｂ）はアセチル化の異なる２段階で作用する単一のＮ”ＡＴとアシルアミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＡＡＨ）の関与する別の経路に関する提案図である。

好ましい態様の説明Ａ、　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼＮ′−アセチル化は真核性タンパク質のアミノ末端のα−アミノ基の最も一般的な化学修飾であるしツナサワら（Ｔｓｕｎａｓａｖａ、Ｓ、）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０６：　１６５ −（１９８４）：　ドリーセンら（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、　Ｈ，Ｐ、Ｃ，）。

ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　ＩＳ：　２８１　（１９８５）　；ワルド（ｌｌｏｌｄ、　Ｆ、　）、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　９：　２５６　（１９８４）；ジコーンボール（Ｊｏ？ｎｖｏｌｌ、　Ｈ，）＋Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏ！、　５５：１−１２　（１９７５）ニル−ベンスタインら（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ。

Ｐ、）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌ＋、　２５４：　１１１４２　（１９７９）］　、ナリタ［（Ｎａｒｉｔａ、に、）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２８：１８４　（１９５８）］は初めてタバコモザイクウィルスのフートタンパク質にＮ”−アセチル基が存在することを示した。今日では真核性可溶性タンパク質の５０−８０％がアセチル化されていることか知られている［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、　２５１：１００９　（１９７６）；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５４：１４４８　（１９７９）　；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、　Ｌ、　）　Ｉｎｔ’　ｌ　Ｃｏｎｇｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、＾ｂｓｔｒ、　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｃａｎａｄａ）　Ｖｏｌ、　１１：　ｐｐ９Ｑ　（１９７９）］。例えば　Ｎ　ａ−アセチル化はプロオピオメラノコルチンの生物学的活性に強い制御効果を示す。β −エンドルフィンのオピオイド（モルヒネ様）作用は完全に抑制されるが、α− ＭＳＨのメラノトロピノク（メラニン細胞刺激）作用は増大する［スミスら（ＳＬＩｌｙｔｈ）　、　Ｎａｔｕｒｅ２７９：２５２（１９７０）　ニスミス（Ｓｍｙｔｈ、　Ｉ）、　Ｇ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２８８：６１３（１９８１：　ラマンチャントランら（Ｒａｔａａｃｈａｄｔａｎ、　Ｊ、　）Ａｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　２９：３９１（１９６７）］　、微小線維の集合への関与は非アセチル化アクチンの方がＮ”−アセチル化アクチンよりも少ない［バーガーら（Ｂｅｒｇｅｒ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｎｅｔ、　１９：３９１　（１９８１）コ。

正常な非アセチル化ヘモグロビンに比較して、変異体ヘモグロビンであるＲａｌｅｉｇｈ（β１バリン−−→アセチルアラニン）、マイナーヒト胎児ヘモグロビンＦ１、およびＮ’−アセチル化アミノ末端残基を有するネコヘモグロビンは、酸素に対する親和性の低下と有機りん酸コファクターとの相互作用の低下を示した［タケタら（Ｔａｋｅｔａ。

Ｆ、）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ　２４６：４４７１　（１９７１）；ムーペンら（Ｍｏｏ−ｐｅｎ、　Ｗ、　Ｆ、　）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６：４８７２（１９７７）　；ブンら（Ｂｕｎｎ、　Ｈ，Ｆ、　）　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　４９：１０ｇｇ（１９７０）フ。

さらに、エビキチン依存性分解システムに触媒されるタンパク質のターンオーバーはモデルタンパク質のアミノ末端のα−アミノ基の存否に依存し［ハーンコら（Ｈｅｒｓｈｋｏ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ５Ａ８１：９０２１（１９８４）　；バラヒマ−ら（Ｂａｃｈｍａｉｒ）　５ｃｉｅｎｃｅ２３４：１７９（１９８６）；メイヤーら（Ｍａｙｅｒ、＾、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：１４８０（１９８９）コ、これはＮ１−アセチル化がタンパク質のターンオーバーを阻害するらしいことを示唆している。このように、Ｎａ−アセチル化はタンパク質の多様な反応に重要な役割を担っている。

異なるクラスのＮ’−アセチル化タンパク質がある：１）開始メチオニンが開裂された後２番目の残基がアセチル化される。および２）開始メチオニンがアセチル化される［アーフィンら（Ａｒｆｉｎ、Ｓ。

Ｍ、）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７９７９（１９８ｇ）；スミスら（Ｓｍｉｔｈ、　Ｊ、　Ａ、　）　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　Ａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｉｅｓ、　Ｍａｒｓｈａｋ、　Ｄ、　Ｒ，編Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐｐ、６９６９−７５（１９８コ　。

アーフィンおよびブラッドショウ［（＾ｒｆ　ｉｎ、　Ｓ、　Ｍ、　）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：７９７９（１９８８）］によって提案されたメチオニンアミノベプチターゼ（ＭＡＰ）および単一のＮ’−アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ”−ＡＴ）が関与する真核性タンパク質の同時翻訳修飾経路の提案図は図１に示されている。図示の経路においてＭＡＰはあるタンパク質から開始メチオニンを除去するが他のタンパク質からは除去せず、単一のＮ”−ＡＴは各クラスの幾つかのタンパク質をアセチル化する。開始メチオニン、２番目の残基、およびα−アミ７基のアセチル基はそれぞれ、Ｍ、ＸおよびＡｃで示されている。発生期のポリペプチドは（−−−）で示されている。タンパク質基質への酵素の正（＋）および負（−）作用が示されている。

アセチル補酵素Ａからα−アミ７基へのアセチル基の転移はＮ“−アセチルトランスフェラーゼに触媒される。最近、同一の基質特異性を有するＮ“−アセチルトランスフェラーゼが酵母および雌鶏卵管から精製された［リ−ら（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６３＋１４９４８（１９８ｇ）；　カミタニら（Ｋａｍｉｔａｎｉ、　Ｋ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌ、　２６４　：１３１ｇｇ（１９８９）コB 酵母酵素は単一の遺伝子にコードされており［ＡＡＡ　１　、　ＮＡＴ　ｌとも呼ばれる］　［ムレンら（Ｍｕｌｌｅｎ、　Ｊ、　Ｒ，）、　ＥＭＢＯＪ、　８：２０６７（１９８９）　：ノーら（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４：１２３３９（１９８９）］、これはＮ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠く酵母突然変Ｘ体（ａ　ａ　ａ−１；ｎａｔｌとも呼ばれる）の生成のための遺伝子置換によって破壊された［ムレンら（Ｍｕｌｌｅｎ、Ｊ、Ｒ，）、ＥＭＢＯＪ、８：２０６７（１９８９）；　’ノーら（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　１７１：５７９５−５８０２（１９８９）、ジョン（ＪｏｈｎＡ、Ｓｍ１ｔｈ）およびり−（Ｆａｎｇ−Ｊｅｎ　Ｓ、Ｌｅｅ）の米国特許出願（１９８９年１０月５日出願）：発明の名称：　ｌ５ＯＬＡＴＩＯＮ　ＯＦ　５ＴＲＡＩＮＳ　ＯＦＳＡＣＣＨＡＲＯＭＹＣＥＳ　ＣＥＲＥＶＩＳＩＡＥ　ＨＡＶＩＮＧ　ＡＬＴＥＲＥＤ　Ｎ ”−ＡＣＥＴＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ　ＡＣＴＩＶＩＴＹ］。この突然変異体は内部栄養胞子形成欠損、熱シヨ、ツク過敏およびａ−タイプ交配欠損変異体である。

二次元ゲル電気泳動によるａａａ　１突然変異体と野生型酵母株力１らの可溶性タンパク質の分析では、ａａａｌ変異体からの可溶性タンパク質の２０％のみがＮ’−アセチル基を欠（タンＪ−ｅり質１こつ（洩で予測される電気泳動シフトを示さなかった［ノーら（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）ＰＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９８９）本明細書に引用］。これに反して約５０％の可溶性タンパク質がＮ’−アセチル化されて（入ること力く知られて０る［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５１：１００９　（１９７６）：フ゛ラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４＋１４４７−１０４９　（１９７９）　；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、　Ｌ、　）　Ｉｎｔ’　Ｉ　Ｃｏｎｇｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｂｓｔｒ、（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｃａｎａｄａ）　Ｍｏ１．比９０　（１９７９月。ａａａンスフェラーゼが存在することを示唆している。本発明は、一部、この発見に基づいている。

本発明は「実質上純粋な」または「実質上純化された」メチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼまたはその誘導体（変Ｘ体）に関する。本明細書中、「実質上純粋な」または「実質上純化された」という語句は同等に用いられ、実質上天然の酵素に付随する不純物、即ち、タンパク質、炭水化物、脂質等、を伴わないメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼを指す。また、この語句はさらに、当該技術者が用いる１またはそれ以上の純度または均一性に関する分析法で均質であるメチオニンＮ＃−アセチルトランスフェラーゼをも指す。例えば、実質上純粋なメチオニンＮ′−アセチルトランスフェラーゼは、例えば分子量、クロマトグラフ法等のパラメーターについて標準実験偏差の範囲内で一定の、再現性ある特性を示すであろう。しかしながら、「実質上純粋な」という語句は酵素と他の化合物との人工的または合成混合物を排除することを意味しない。この語句はまた、酵素の生物学的活性を干渉しない不純物であって、例えば、不完全な精製によって存在し得る不純物の存在をもυト除する意味でない。

Ｂ、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング本発明のす、カロミセス・セレビンエのＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングは様々な方法のいずれを用いて行ってもよい。そのような方法の１つはｃＤＮＡ挿入体のシャトルベクターＤＮＡライブラリー（Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼを発現する細胞から調製）をＮ“−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の存在に関して分析することを要する。そのような分析は細胞をベクターでトランスフェクションし、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼの発現に関して分析する。

この遺伝子のクローニングの好ましい方法にはＮ”−アセチルトランスフェラーゼ酵素のアミノ酸配列の決定およびこれらの配列を用いてＮａ−アセチルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズするプローブを設計する必要がある。この作業を達成するには純化（精製）Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼタンパク質または該タンパク質のフラグメント（例えば臭化シアン、またはパパイン、キモトリプシンまたはトリプシン等の酵素により得られる）の配列を決定する［オイヶら（０１ｋｅ、　Ｙ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７：９７５１−９７５８（１９８２）　：　リューら（Ｌ＋ｕ、Ｃ，）＋　１ｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔ、　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　２１：２０９−２１５（１９８３月。好ましくはそのよつ　うな配列決定は自動配列決定装置を用いて行う。１ｏアミノ酸以上のペプチドが配列決定されれば、配列情報は一般に、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子等の１個の遺伝子をクローニングするに十分である。

完全な分子または該分子の１またはそれ以上の適当なペプチドフラグメントの配列か決定されれば、それらをコードし得るＤＮＡ配列を調べる。遺伝コードの縮重のために特定のアミノ酸をコードするのに、１以上のコドンが用いられる［ワトラン（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、　Ｄ、　）　ｉｎ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　３ｒｄ　ｅｄ、Ｗ、Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、Ｉｎｃ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、　Ｃ＾（１９７７）ｐｐ、　３５６−３５月。デジェネラシー（退縮）度が最も低いオリゴヌクレオチドによってコードされている可能性のあるアミノ酸配列を同定するためにペプチドフラグメントを分析する。

好ましくは、唯１個のコドンでコードされているアミノ酸を含有する配列を同定することによって行う。時には、そのようなアミノ酸配列は単一のオリゴヌクレオチドでコードされているが、多くの場合、アミノ酸配列は幾つかの類似したオリゴヌクレオチドのいずれかでフードされている。重要なことは、セットに含まれる全メンバーが潜在的にペプチドフラグメントをコードし得るオリゴヌクレオチドを含有している、即ち、ペプチドフラグメントをコードする遺伝子と同じヌクレオチド配列を含有する可能性があるが、該セットの１個のメンバーのみがこの遺伝子のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含有することである。このメンバーがセットに含まれているので、そしてこれがセ・Ｉトの他のメンバーの存在下でもＤＮＡとハイブリクイズし得るので、ペプチドをコードする遺伝子のクローニングのための単一のオリゴヌクレオチドを用いる方法と同様に、分画されていないオリゴヌクレオチドセットを用いることができるのである。

上記と全く同様の方法でペプチドフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチド配列または配列セントに相捕的なオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドセット）を用いることとができる適当なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセット（またはそのようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットの相補鎖）を同定しく上記の方法を用い）、合成し、当業者既知の方法で　Ｎ　１１−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列を発現し得る酵母細胞から銹導したＤＮＡ、より好ましくはｃ　ＤＮＡ製品とハイブリダイズさせた。核酸ハイブリダイゼーションの方法はマニアテイスら［Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、　ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｙ　（１９ｇ２）］およびノ１ムス（Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ、　）およびヒギンス（Ｈ４ｇｇｉｎｓ＋Ｓ、　Ｊ、）［Ｉｎ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ、　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８５）］に記載されている。用いるＤＮＡまたはｃＤＮＡの供給源はＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をエン１ルノチ（豊富化）シておくことが好ましい。そのような豊富化はＮ”−アセチルトランスフェラーゼ発現によって特徴付けられる条件下で培養した細胞から抽出したＲＮＡから得られるｃＤＮＡから最も容易に得ることができる。

上記の、またはそれらに類似の方法はヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［（ｔｌｓｕ、Ｌ、Ｃ，）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２：３７７１−３７７５　（１９８５）］　；フィブロネクチン［スズキら（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｓ、　）　Ｅｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、　Ｊ、　４：２５１９−２５２４　（１９８５）］、ヒトエストロゲン受容体遺伝子［ウオルターら（胃ａｌｔｅｒ、　Ｐ、　）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２ニア８８９−７８９３（１９８５）］　；組織型プラスミノゲン活性化因子［ベニ力ら（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、　）Ｎａｔｕｒｅ　３０１：２１４−２２１　（＋９８３）］　：およびヒトターム胎盤アルカリホスファターゼ相補ＤＮＡ［カムら（Ｋａｍ、Ｗ、）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ８２：８７１５−８７１９　（１９８５）］の遺伝子のクローニングに成功を収めている。

Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングの好ましい別法ではＮ＃−アセチルトランスフェラーゼを発現し得る細胞からのＤＮＡまたは好ましくはｃＤＮＡを発現ベクターにクローニングすることにより発現ベクターのライブラリーを調製する。次いでライブラリーを抗−Ｎ＃−アセチルトランスフェラーゼ抗体と結合することができ、かつＮ’−アセチルトランスフェラーゼまたはＮ１−アセチルトランスフェラーゼのフラグメントと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得るヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現し得ることに関してスクリーニングする。

上記の方法で得られたクローン化Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現ベクターに操作可能に結合し、細菌または真核性細胞に導入しＮ”−アセチルトランスフェラーゼタンパク質を生産することができる。そのような操作の技術はマニアティスら（前掲）によって開示され、当業者に周知である。

Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列は様々な供給源から得られる。例えば、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼをコードするｍＲＮＡは酵素を産生ずる任意の種の組織がらノーザンブロノト法［アービンら（Ａｌｗｉｎｅ）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６８：２２０−２４２　（１９７９）］で単離し、オリゴヌクレオチドプローブで標識することかできる。次いでｍＲＮＡを当業者既知の方法でｃＤＮＡに変換する。

ＤＮＡプローブは検出可能な基で標識してもよい。そのような検出可能な基は検出可能な物理的または化学的性質を有する任意の物質である。そのような物質はイムノアッセイの分野で広範に開発されており、そのような方法に有用な標識の大多数が、一般に本発明に適用可能である。特に有用なのは酵素［Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅ、　２２：１２４３　（１９７６）］、酵素基質（英国特許１．５４８．７４１）　、補酵素（米国特許Ｎｏ、　４．２３４０．７９７および４．２３８．５６５）　、酵素阻害物質（米国特許Ｎｏ４．１３４．７９２）等の酵素的に活性な基１発蛍光物質（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅ、２５：３５３　（１９７９）］　；発色団：化学発光または生物発光等の発光物質（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅ、　２５：５１２　（１９７９）］；特異的に結合可能なリガンド；近位で相互作用する一対；および３Ｈ，３５３，３！ｐ、　Ｉ！ＩＩ、＋４ｃ等の放射性同位元素である。そのような標識または標識対はそれら自身の物性（例えば蛍光物質、発色団および放射性同位元素）またはそれらの反応性または結合性（例えば、酵素、基質、補酵素および阻害物質）に基づいて検出される。例えば補酵素で標識したプローブはその標識が補酵素である酵素とその酵素の基質とを加えることで検出できる。例えば、基質に作用して検出可能な物性を有する生成物を生成する酵素を用いることができる。後者の例には、ベータガラクト／ダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼが含まれるがこれに限定されない。

Ｃ，Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異体Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異体はクローン化Ｎ・−アセチルトランスフェラーゼｃＤＮＡ配列に突然変異を導入することで得られる。そのような変異には、例えばＮ・−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子にコードされているアミノ酸配列内における欠失、挿入または置換を含む。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを構成することができる。明らかに、ヌル突然変異体が望ましい場合には変異体をコードするＤＮＡ内で作られる突然変異は配列をリーディングフレームの外におくものであってはならず、第２のｍＲＮＡ構造を作成する相補性領域を創製するものでないことが好ましい（英国特許出願公開Ｎｏ、　７５．４４４）。

遺伝的レベルでは、これらの変異体は通常　Ｎ　１１−アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡのヌクレオチドに部位特異的突然変異を誘発することにより変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後ＤＮＡを組換え細胞培養内で発現させることにより得られた。

アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定していてもよいか突然変異そのものは必ずしも先に決定しておかな（でよい。例えば、特定の部位での突然変異の成果を最適化するために、標的コドンまたは標的領域でランダム突然変異誘発を行い、発現したＮ”−アセチルトランスフェラーゼ変異体を所望の活性の最適な組み合わせに関してスクリーニングする。配列が既知のＤＮＡの予め定めた部位で置換突然変異を起こす方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発として、周知である。

本発明のＮ“−アセチルトランスフェラーゼ変異体のＩ製はタンパク質の早期に調製された変異体または非変異体をコードするＤＮＡに部位特異的突然変異を誘発することによって、都合よく行うことができる。部位特異的突然変異誘発に、トラバースされる欠失連結部分の両側に安定な２本鎖を形成するに十分なサイズと、配列の複雑さとを有するプライマー配列を得る上で十分な数の隣接ヌクレオチド、並びに所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌヌクレオチド配列、を用いることで、Ｎ″−アセチルトランスフェラーゼ変異体を製造することができる。一般に、変換すべき配列の連結部分の両側に約５−１０残基を有する配列長さ２〇−２５ヌクレオチドのプライマーが好ましい。通常、部位特異的突然変異誘発の方法は既知であり、例えば本明細書に引用するアデルマンら［（Ａｄｅｌｍａｎ）、ＤＮＡ　２：１８３（１９８３）］の著書がある。

理解されるように、部位特異的突然変異誘発には、一般に、１本鎖および２本鎖形で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に有用なベクターは、例えば本明細書に引用するメノシングら［（ＭｅｓｓｉｎＬＪ、）　３ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐ、　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒｅｃｏｍｐｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ｅｄｉｔｏｒ＾、Ｗａｌｔｏｎ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｓ、　Ａ＋＋＋ｓｔｅｒｄａｍ　（１９８１）］の開示したＭ１３ファージである。これらのファージは市販品を容易に人手でき、その使用は当業者に周知である。あるいは、１本鎖ファージ複製起点を有するプラスミドベクター［ベイラら（Ｖｅｉｒａ）Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　１５３：３　（１９８７）］を用いて１本鎖ＤＮＡを得ることもできる。

一般に、本発明における部位特異的突然変異では、まずその配列内に関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する１本鎖ベクターを得る。通常、合成、例えばフレアらの方法［Ｃｒｅａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳ＾７５：５７５６　（１９７８）］により、所望の突然変異配列を含むオリゴヌクレオチドブライマーを製造する。次いで、このプライマーとタンパク質配列を含有する１本鎖ベクターとをアニーリングさせ、例えば大腸菌のポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片のようなりＮＡポリメラーゼ酵素に委ねて突然変異を含む鎖の合成を完成する。

かくして突然変異した配列と第２の鎖が所望の突然変異を含む。次いてこのへテロ２本鎖ヘクターを用いてＪＭＩＯＩのような適当な細胞を形質転換し突然変異配列アレンジメントを有する組換えベクターを含むクローンを選択する。

そのようなりローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を得、タンパク質合成のだめの適当なベクター、通常適当な宿主の形質転換に用いられる型の発現ベクターに挿入する。

アミノ酸配列欠失は一般に約１−３０残基の範囲であり、より好ましくは１−１０残基であって、通常、（必然的ではないカリ隣接している。

アミノ酸配列の挿入にはアミノおよび／またはカルボ牛シ末端での１個の残基または基本的には無制限の長さのポリペプチドの融合、並びに単一または複数アミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（即ち、完全なＮ″−アセチルトランスフェラーゼをコードする配列内への挿入）は通常、約１−１０残基、好ましくは約１−５残基の挿入である。末端挿入の例には、成熟Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼの組換え宿主からの分泌を容易にするため、宿主にとって異質または同質のシグナル配列をＮ″−アセチルトランスフェラーゼのＮ−末端に融合することも含む。

第３は　Ｎ　ａ−アセチルトランスフェラーゼ内の少な（とも１個のアミノ酸残基、好ましくは唯一の残基を除去し、異なる残基をその場所に挿入する変異である。そのような置換は、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼの特性をうまく変化させることが望まれる場合には以下の表１にしたがって行うことが好ましい。

表１元の残基　置換例Ａｌａ　Ｇｌｙ；ＳｅｒＡｒｇ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｇｌｎ；ＨｉｓＧｌｙ　Ａｌａ；Ｐｒ。

Ｈｉｓ　Ａｓｎ；Ｇ１ｎ１ｉｅ　Ｌｅｕ；ＶａｔＬｅｕ　ｌｉｅ；ＶａｌＬｙｓ　Ａｒｇ；Ｇｉｎ；ＧｌｕＭｅｔ　Ｌｅｕ；Ｔｙｒ；ｌ１ｅＰｈｅ　Ｍｅ　ｔ　；　Ｌｅｕ　；Ｔｙ　ｒＶａｌ　ｒｌｅ；Ｌｅｕ機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表１よりも保存性が低い選択置換により行う。即ち、（ａ）置換領域（エリア）での、ポリペプチドバックボーン、例えばシートまたはへリックスコンホメー／ヨン、（ｂ）標的部位での電荷または疎水性、または（Ｃ）側鎖のかさ、等を維持する上でのそれらの作用をより大きく変化させる残基を選択する。一般に、置換は、以下のいずれかが予測される。（ａ）グリシンおよび／またはプロリンを他のアミノ酸で置換する、欠失するまたは挿入する；　（ｂ）親水性残基（例えばセリルまたはスレオニル）て（を）疎水性残基（例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、アラニル）を（で）置換する。

（Ｃ）／スティン残基で（を）他の残基を（で）置換する；　（ｄ）電気陽性側鎖（例えばリンル、アルギニル、ヒスチジル）で（を）電気陰性側鎖（例えば、グルタミル、アスパルチル）を（で）置換する。または（ｅ）かさ高い側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）で（を）そのような側鎖を有する残基（例えばグリシン）を（で）置換する。

大多数の欠失および挿入、および特に置換で分子の特徴が根本的に変化するとは期待できない。しかしながら、置換、欠失または挿入を行う前にその正確な効果を予測することが困難である場合、常套的なスクリーニングアッセイによって効果を評価できることは当業者ならば理解するであろう。例えば、一般に変異体は、固有のＮ“−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸に部位特異的突然変異を誘発し、変異体核酸を組換え細胞培養で発現させ、そして所望により細胞培養から、例えばポリクローナル抗Ｎ＃−アセチルトランスフェラーゼカラム（少なくとも１個の残存エピトープがそれに結合することで、変異体を吸着させるために）への免疫親和性吸着（イムノアフィニティーアトソープション）によって、精製する。

次いで細胞ライゼートまたは精製Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ変異体の活性を、所望の特性に関する適当なスクリーニングアッセイで分析する。例えば改変Ｎ＃−アセチルトランスフェラーゼの免疫学的特性における変化、例えば特定の抗体との親和性、は競合型イムノアッセイで分析される。そのようなタンパク質の酸化還元や熱安定性、疎水性、タンパク加水分解による分解され易さ、担体との凝集傾向、またはマルチマーの形成傾向は当業者周知の方法で分析できる。

実質上Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠く変異体を同定するには、正常な（すなわち活性な）Ｎａ−アセチルトランスフェラーゼのクローンを突然変異させ、ヌル突然変異体に導入する。その後は、形質転換体の大部分はＮ′−アセチルトランスフェラーゼ活性を示すので、Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠くクローンの発見は容易である。

同様にして、強化された、または変化したＮ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するクローンを同定することができる。ヌルアレルのクローン（１−１０アミノ酸の置換または欠失を有する）を突然変異誘発しＮａ−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠く細胞（例えばヌル突然変異体）に導入する。突然変異の結果、「訂正」または「補償」突然変異を受けたＮ“−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠くクローンは細胞に導入されると、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を発現する。この活性を（上記の方法）で分析し、所望の改変変異体を得ることができる。

Ｄ、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列の発現本発明のＮ”−アセチルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡを発現ベクターに操作可能に連結し、宿主細胞に導入し、その細胞にＮ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を発現させることができる。２個のＤＮＡ配列（プロモーター領域配列と所望の酵素をコードする配列）間の結合の性質が、■）フレームシフト突然変異を起こす、２）所望の酵素をコードする遺伝子配列の転写を指令するプロモーター領域配列の作用を阻害する、または３）プロモーター領域配列による所望の酵素をコードする遺伝子配列が転写される能力を阻害する、ことがなければ、２個のＤＮＡ配列は操作可能に結合していると言われる。

Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列ヲ、結合（ｌ　ｉｇａｔ　１ｏｎ）のための平滑端または付着端、制限酵素による適当な末端の作成、適当な付着端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および適当なりガントとの結合、を含む常法に従いベクターＤＮＡと再結合させることができる。

本発明は所望の酵素の、任意の原核性細胞での発現を包含する。

１つの態様では宿主細胞の染色体に所望の遺伝子配列を導入し得るベクターを用いる。導入されたＤＮＡが染色体に安定に組み込まれた細胞は発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１またはそれ以上のマーカーをも導入することで選択することができる。マーカーは宿主細胞内の栄養要求性を補うもの（通常の酵母の栄養要求性マーカーである１ｅｕ２．　ｕｒａ３等）、殺生物剤抵抗性、例えば抗生物質または銅等の重金属、などであってよい。選択マーカー遺伝子は発現されるべきＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させるか、同じ細胞に同時形質転換によって導入してもよい。

好ましい態様では導入される配列は受容宿主内で自律的に複製可能なプラスミドまたはウィルス性ベクターに挿入される。広範な種々のベクターをこの目的のために用いることができる。特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択するに際して電要な因子は以下の点である。ベクターを含有する受容細胞を容易に認識し、ベクターを含有しない受容細胞から選択することができる；特定の宿主内でのベクターの望ましいコピー数；および宿主細胞と異なる種との間で「シャトル」可能であることが望ましいか否か。

本発明のＮ”−アセチルトランスフェラーゼは従来の条件下、例えば、抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等によって単離、精製することができる。

■、原核生物細胞における発現好ましい原核生物宿主は、Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔ　ｉａ）などの細菌である。

最も好ましい原核生物宿主はＥ、ｃｏｌｉである。特に関心のある細菌宿主は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ　１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０（Ｆ−２λ−１原栄養菌（ＡＴＣＣ２７３２５））、及びサルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）などの他の腸内細菌類、及び種々のシュードモナス種である。原核生物宿主は発現プラスミドのレプリコン及び制御配列に適合しなければならない。

原核生物細胞（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ、　Ｂ、ズブチリス、シュードモナス、ストレプトマイセスなど）において所望の酵素を発現させるためには、その所望の酵素をコードしている配列を機能的な原核生物プロモーターと作動可能に連結する必要がある。このようなプロモーターは構成又は調節（即ち、誘導性もしくは抑制性）のいずれでもよいが、後者が好ましい。構成プロモーターとしては、例えばバクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、及びｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロモーターなどがある。誘導原核生物プロモーターとしては、例えばバクテリオファージλの主要布及び左プロモーター（ＰＬ及びｐＨ）、Ｅ、ｃｏｌｉのｔｒｐ、　ｒｅｃＡ、　１ａｃＺ、　１ａｃｌ。

ｇａｌ及びｔａｃプロモーター、Ｂ、ズブチリスのα−アミラーゼ［Ｕ１ｍａｎｅテリオファーシのプロモーター［Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ、のＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　１３ｉ。

１ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツク・プレス、Ｉｎｃ、ニューヨーク（１９８２）］、ならびにストレプトマイセスプロモーター［ｆａｒｄ、　Ｊ、　Ｍ、　ラの輩ｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２０３：４６ｇ−４７８（１９８６）］が挙げられる。原核生物ブロモ原核生物細胞における適切な発現には、遺伝子コード化配列の上流にリポソーム結合部位が存在することも必要である。このようなリポソーム結合部位は例えば、Ｇｏｌｄ、　Ｌ、らのＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３５＋３６５−４０４（１９８１）に記載されている。

所望の酵素をコードしている配列及び作動可能に連結したプロモーターは、線状分子又はより好ましくは閉鎖共有環状分子のいずれかであることのできる非複製型ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子として、受容原核生物又は真核生物細胞に導入することができる。このような分子は自律的に複製することができないので、所望の酵素の発現は導入配列の一時的な発現によって起こり得る。あるいは、宿主の染色体に導入配列を組み込めば、永久発現を起こすことができる。

好ましい原核生物ベクターには、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ内で複製することのできるプラスミド、例えばｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４、πＶＸなどがある。このようなプラスミドは例えば、マニアチス［Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　１ＡａｎｕａＬ　コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）］に記載されている。

ハ／ルスのプラスミドにはｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐＴ１２７なとがある。このようなプラスミドは、Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、のＴｈｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツク・プレス、ニューヨーク（１９ｇ２）、　３０７−３２９頁が開示されている。適当なストレプトマイセスのプラスミドにはｐ　ｌ　Ｊ　１０１［Ｋｅｎｄａｌｌ、に、Ｊ、らのＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９：４１７７−４１８３（１９８７）］、及びφＣ３１などのストレプトマイセスバクテリオファージ［Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、　Ｆ、らの５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕａ＋　ｏｎ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミアイ・カイト、ブタペスト、）＼ンガリー（１９８６）、　４５−５４頁］がある。ンユードモナスプラスミドは、Ｊｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３３ニア２９２９−７４２（１９７に概説されている。

構築物を含有するベクター又はＤＮＡ配列を発現のために調製したなら、得られたＤＮＡ構築物を適当な宿主に導入すればよい。これには、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法（エレクトロポレーション）又は他の通常の方法などの種々の手法を使用することができる。融合したなら、得られた細胞を培地中で発育させ、適当な活性についてスクリーニングする。配列の発現により、基質特異的なアミノペプチダーゼが産生される。

２、真核生物細胞における発現好ましい真核生物宿主はインビボ又は組織培養物のいずれかの酵母、真菌（特にアスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、哺乳動物細胞（例えば、ヒト又は霊長類細胞）及び植物細胞などである。

所望の酵素を真核生物宿主において発現させるには、真核生物の調節領域を使用することが必要である。このような領域は一般に、ＲＮＡ合成を開始させるに見合うプロモーター領域などである。好ましい真核生物プロモーターには、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター［Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、らのＪ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　Ｉ　：２７３−２８８（１９８２月、３６５（１９８２）］、５Ｖ４Ｑ初期プロモーター［Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，らのＮａｔｕｒｅ　（Ｌ周知のように真核生物ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをコードしているコドンから開始される。そのため、真核生物プロモーターと所望の酵素（又は機能的なその誘導体）をコードするＤＮＡ配列との連結部がメチオニンをフードできる介在コドン（即ち、ＡＵＧ）を含有しないようにするのが好ましい。このようなコドンが存在すると（そのＡＵＧコドンが所望の酵素コード化ＤＮＡ配列と同し解読フレーム内にある場合）融合タンパク質が生成されるか、又は（そのＡＵＧコドンか所望の酵素コード化ＤＮＡ配列と同じ解読フレーム内にない場合）フレーム−シフト突然変異が招来される。

ａ、酵母における発現酵母は本発明の好ましい宿主である。酵母を使用することは、酵母がグリコジル化などの翻訳後ペプチド修飾をも行うことができることから実質的に有利である。所望のタンパク質を酵母で生産するために利用できる高いコピー数のプラスミド及び強いプロモーター配列を利用する多くの組換えＤＮＡ計画が存在する。酵母はクローン化された哺乳動物遺伝子産物に存在するリーダー配列を認識し、リーダー配列を担うペプチド（即ち、プレーペプチド）を分泌する。

一連のあらゆる酵母遺伝子発現系を利用できる。このような発現ベクターには例えば、酵母２−ミクロンサークル、発現プラスミドＹＥＰ１３、ＹＣＰ及びＹＲＰなど、又はそれらの誘導体がある。

このようなプラスミドは当業界周知である［Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、らのＭｉａｍｉＷｎｔｒ、　Ｓｙｍｐ、　１９：２６５−２７４（１９８２）、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，のＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。

ｇＹ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、Ｃ。

Ｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、コールド・スプリング・ハーバ−１９８２）］。ＹＥＰ１３は本発明の好ましいベクターである。

ｂ、＃４乳動物細胞での発現哺乳動物細胞は、正しい折りたたみ又は正しい部位でのグリコジル化などの翻訳後修飾をタンパク質分子に施すことができる。宿主として有用であり得る哺乳動物細胞には、ＶＥＲＯ又はＣＨＯ−に１などの線維芽細胞（フィブロブラスト）起源の細胞、及びそれらの誘導体がある。哺乳動物宿主に関連して、所望の酵素を発現させるために幾つかのあり得るベクター系を利用することができる。宿主の性質に応じて、広範な種々の転写及び翻訳調節配列を使用できる。

転写及び翻訳調節シグナルは、調節シグナルが高い発現レベルを有する個々の遺伝子と関連しているアデノウィルス、ウシパピローマウィルス、サルウィルスなどのウィルス起源から誘導することができる。あるいは、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの哺乳動物発現産物由来のプロモーターも使用できる。抑制又は活性化することができ、その結果遺伝子の発現を調整可能にする転写開始調節シグナルを選択できる。興味深い調節シグナルは、温度の変動によって発現を抑制又は活性化できる温度感受性の調節シグナル、又は例えば代謝産物なとの化学的調節を受ける調節シグナルである。

哺乳動物宿主に関する発現のためには幾つかのベクター系を利用できる。１つのクラスのベクターは、ウシパピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、又はＳＶ４０ウィルスなどの動物ウィルスから誘導される、自律的に複製する染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ要素を利用するものである。第２のクラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体への組込みに依存するものである。導入されたＤＮＡが細胞の染色体に安定に組み込まれた細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーも導入することによって選択することができる。このマーカーは栄養要求変異宿主にプロトトロピーを、例えば抗生物質又は銅などの重金属の生物致死側耐性を提供できるものである。選択マーカー遺伝子は発現させるＤＮＡ配列に直接に連結することができ、あるいは同時形質転換によって同じ細胞に導入するこ七ができる。ｍＲＮＡ合成を最適にするには、さらなる要素が必要となる場合がある。これらの要素には、スプライス・シグナル、及び転写プロモーター、エンハンサー、及び終止シグナルがある。

このような要素を包含するｃＤＮＡ発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，のＨｏｆ、　Ｃｅｌ　１．　Ｂｉｏｌ、　３：２８０（１９８３）などに記載されている。

Ｃ０植物細胞での発現本発明のＮ＃−アセチルトランスフェラーゼは遺伝子操作法によって植物に導入することができ、それによりアセチル化の速度が増大される。ある種の除草剤はアセチル化によって不活化されることが知られている。従って、除草剤耐性がより強い植物を生産することが可能である。本発明の他の態様は　Ｎ　１１−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を使用して植物を形質転換し、植物の除草剤耐性を増大させることである。

本発明に使用できるＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードしているコード化領域は植物細胞又は形質転換される植物にとって同種（ホモローガス）であっても異種（ヘテロローガス）であってもよい。しかし、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子配列は得られた植物細胞内で発現され、機能的なタンパク質又はポリペプチドとして産生される必要がある。従って、本発明は酵素を発現するホモローガスなＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子又はヘテロローガスなＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のいずれかを含有する植物をも包含している。

本発明の他の態様では、Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼは形質転換する植物とホモローガスな植物Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼを包含している。本発明の別の態様では、Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼは形質転換する植物にヘテロローガスな酵素を包含している。さらに、本発明ではＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードしているゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両者由来のＤＮＡを使用できる。また、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子はその一部をｃＤＮＡクローンから、一部をゲノムクローンから構築することができる。また　Ｎ　ａ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡは種々の種由来の部分を含有することができる。

本発明の広い思想に包含される態様は種々存在する。その１つの態様として、本発明はキメラ遺伝子配列を提供する：（ａ）　特定の植物細胞内で遺伝子が発現されるとＮ“−アセチルトランスフェラーゼについて機能的であるＮ′−アセチルトランスフェラーゼをコードする第１の遺伝子配列、（ｂ）　Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼフード化領域のいずれかの側に作動可能に連結された１つ又はそれ以上の付加的な遺伝子配列。この付加的な遺伝子配列にはプロモーター（群）又はターミネータ−（群）の配列が含有される。植物調節配列は宿主細胞にとってヘテロローガスであってもホモローガスであってもよい。

好ましい態様では、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを使用し、キメラ遺伝子配列を発現させる。この遺伝子配列に使用できる他のプロモーターはｎｏｓＳｏｃｓ、及びＣａＭＶプロモーターなどである。使用できる効率的な植物プロモーターは過剰産生性の植物プロモーターである。このプロモーターをＮ’−アセチルトランスフェラーゼの遺伝子配列と作動可能に連結すれば、該Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼの発現がプロモートされ、それにより形質転換植物が除草剤に対して増大された耐性を有することになろう。本発明に使用できる過剰産生性の植物プロモーターは大豆由来のりブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニット（ｓｓ）［Ｂｅｒｒｙ−ＬｏｖｅらのＪ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐ、　Ｇｎｅ、　、　１：４８３ −４９８（１９８２）］A 及びクロロフィルａ　／　ｂ結合タンパク質のプロモーターである。これら２つのプロモーターは、真核性植物細胞において光り誘導されることが知られている［例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｒ　Ｐｌａｎｔｓ。

ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、　Ａ、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク。

１９８３、２９−３８頁、Ｃｏｒｒｕｚｉ、　Ｇ、らのＪ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２５８：１３９９（１９８３）、及びＤｕｎｓｍｕｉｒ、　Ｐ、らのＪ、　ｏｆ　Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、　、　２：２８５（１９８３）を参照のことコ。

さらに、他の好ましい態様では　Ｎ　ＩＩ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するキメラ遺伝子配列の発現を正しい解読フレーム内で植物プロモーター及び遺伝子分泌シグナル配列と作動可能に連結する。

植物プロモーターと作動可能に連結されたＮ＃−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するキメラ遺伝子配列、及び好ましい態様として分泌シグナル配列をも含有するものを、適当なりローニングベクターに連結すればよい。一般には、宿主細胞と適合する複製及び制御配列を含有するプラスミド又はウィルス（バクテリオファージ）ベクターを使用する。クローニングベクターは通常、複製起点を含有すると共に、形質転換宿主細胞に表現型選択マーカーを、通常は抗生物質に対する耐性を付与することのできる特定の遺伝子をも有している。形質転換ベクターは、宿主細胞に形質転換した後にこれら表現型マーカーによって選択することができる。

本発明に使用できる宿主細胞はＥ、ｃｏｌｉ、　Ｓ、チフイムリウム、及びセラチア・マルセスセンスなどの細菌宿主などの原核生物である。酵母又は糸状菌なとの真核生物宿主も本発明に使用することかできる。

クローニングベクター及びそのベクターによって形質転換された宿主細胞を本発明に使用すれば、通常ベクターのコピー数が増大される。増大したコピー数にあるＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するベクターは単離することができ、例えばそれはキメラ遺伝子配列を植物細胞に導入するために使用できる。ベクター中に含有される遺伝子物質は組換えＤＮＡを機械的に移すことのできるマイクロピペットを使用し、植物細胞に直接マイクロ注入できる。

遺伝子物質はさらに、細胞に取り込まれた遺伝子物質と沈殿複合体を形成するポリエチレングリコールを使用することにより植物細胞に移すこともできる［ＰａｓｚｋｏｗｓｋｉらのＥＭＢＯＪ、　３：２７Ｌ７−２２（１９８４）］。

本発明の他の態様では、Ｎａ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、エレクトロボレーンヨンによって植物細胞に導入するこトカテきるＪＦｒｏｍｍらの”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＧｅｎｅＳＴｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　１ｎｔｏ　Ｍｏｎｏｃｏｔａｎｄ　Ｄｉｃｏｔ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ″、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｉｌ、＾ｃａｄ、　ＳｃｉA　。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、暮：５８２４（１９８５）］。この手法では、植物プロトプラストを、Ｎ″−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子構築物を含有するプラスミドの存在下にエレクトロポレートする。高電場強度の電気インパルスは生体膜を可逆的に貫通し、プラスミドの導入を行わしめる。エレクトロボレートされた植物プロトプラストは細胞壁を再構成し、分裂し、植物カルスを生成する。Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼを発現する形質転換植物細胞は、上述の表現型マーカーを使用して選択される。

Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を植物細胞に導入する他の方法は、Ｎ ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシェンスで植物細胞を感染させることである。当業者に既知の適当な条件下では、トランスフオームした植物細胞は発育して苗条、根を形成し、さらに発育して植物となる。Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、例えばアグロバクテリウム・ツメファシェンスのＴｉプラスミドによって適当な植物細胞に導入することができる。このＴｉプラスミドはアグロバクテリウム・ツメファシェンスにより感染の際に植物細胞に移行し、植物のゲノムに安定に組み込まれるＪＨｏｒｓｃｈらの”Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｏｆ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔｓ、”　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：４９６−４９８（１９８４）、ＦｒａｌｅｙらのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、＾、　８０　：４８０３（１９８３）］。

Ｔｉプラスミドはトランスフオーム細胞を産生ずるための２つの必須領域を含有する。トランスファーＤＮＡ（Ｔ　ＤＮＡ）と命名されているその１つは、腫瘍形成を誘発するものである。ビルレント領域と命名される他方のものは、腫瘍の生成に必須であるが、その維持には必要でないものである。植物のゲノムに移行するトランスファーＤＮＡ領域は酵素の遺伝子配列を挿入することによりその大きさを増大させることができるが、それにより移行能に影響を与えることはない。腫瘍誘因遺伝子を除去し、もはや妨害しなくすることによって、得られた修飾Ｔｉプラスミドは、本発明の遺伝子構築物を適当な植物細胞に移行させるためのベクターとして使用することができる。

アグロバクテリウムによって形質転換できるすべての植物細胞、及び形質転換細胞から再生された全植物を本発明によってトランスフオームすることによっても、移行したＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有しているトランスフオームされた全植物を得ることができる。

現在、アグロバクテリウムによって植物細胞を形質転換するための異なる２つの方法がある：（１）培養した単離プロトプラストと共にアグロバクテリウムを同時培養する、又は（２）細胞もしくは組織をアグロバクテリウムで形質転換する。

方法（１）では、プロトプラストを培養でき、そして培養プロトプラストから植物を再生することのできる確立された培養系が必要である。

方法（２）では、（ａ）　植物細胞又は組織をアグロバクテリウムによって形質転換できること、及び（ｂ）　形質転換細胞又は組織を誘発して全植物に再生できることが必要である。この２段階の系では、感染するために２つのプラスミドが必要である：　Ｔ−ＤＮＡ含有プラスミド及びｖｉｒプラスミド。

植物細胞又は植物を形質転換した後、Ｔｉプラスミドによってトランスフオームされて酵素を発現している得られた細胞又は植物は、適当な表現型マーカーにより選択することができる。これらの表現型マーカーには抗生物質耐性があるか、これに限定されない。他の表現型マーカーは当業者に既知であり、本発明に使用することができる。

プロトプラストを単離し、培養して全再生植物とすることのできるすべての植物を本発明によって形質転換すれば、移入されたＮ″−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する全植物を回収することができる。適当な植物は例えば、Ｆ　ｒａｇａｒｉａ（オランダイチゴ）、Ｌｏｔｕｓ、　Ｍｅｄｉｃａｇｏ（ウマゴヤシ）、Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ、　Ｔ　ｒｉｆｏｌｉｕｍ（シロツメフサ・シャジクソウ）、Ｔ　ｒｉｇｏｎｅｌｌａ、　Ｖ　ｉｇｎａ、　Ｃ１ｔｒｕｓ（レモン・ミカン）、Ｌ　ｉｎｕｍ（アマ）、Ｇ　ｅｒａｎｉｕｍ（ゲンノ７ヨウコ・ハクサンフウロ）、Ｍａｎｉｃｏｔ、　Ｄａｕｃｕｓにンジン）、Ａ　ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、　Ｂ　ｒａｓｓｉｃａ（アブラナ・ハクサイ・カブラ・キャベツ）、Ｒａｐｈａｎｕｓ（ダイコン）、５ｉｎａｐｉｓ（カラン）、Ａｔｒｏｐａ、　Ｃａｐｓｉｃｕｍ（トウガラン）、Ｄ　ａｔｕｒａ（チョウセンアサガオ）、Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ、　Ｌ　ｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ（トマト）、Ｎ　１ｃｏｔｉａｎａ（タバコ）、Ｓ　ｏｌａｎｕｍ（ナス・ジャガイモ）、Ｐ　ｅｔｕｎｉａ（ツクバネアサガオ）、Ｄ　１ｇ１ｔａｌ　ｉｓ（ジキタリス）、Ｍａｊｏｒａｎａ、　Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ（チコリ−）、Ｈｅｌ　１ａｎｔｈｕｓ（ヒマワリ）、Ｌａｃｔｕｃａ、ＢｒｏｍｕｓＳＡｓｐａｒａｇｕｓ。

Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、　ＨｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓＳＮｅｍｅｓｉａ、Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、ＰａｎｉｃｕｒｍＳＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍ、ＲａｎｕｎｃｕｌｕｓＳＳｅｎｅｃｉｏＳＳａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、　Ｃｕｃｕｍｉｓ、Ｂｒｏｗａｌｌｉａ、　Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｌｏｌｉｕｍ、Ｚｅａ、　ＴｒｉｔｉｃｕｍＳＳｏｒｇｈｕｍ。

及びＤａｔｕｒａ属由来の種などである。

例えば、すへての主要な禾穀類、サトウキビ、テンサイ、綿花、果実及び他の木、豆果及び野菜など（これらに限定されない）の培養された細胞又は組織から実際上すへての植物か再生され得ることを示す証拠が多くなっている。これらすべての植物がアグロバクテリウムによって形質転換できるか否かについて、限定的な意見が現在存在する。アグロバクテリウムのための天然の植物宿主である種はインビトロにおいて形質転換できる。単子葉植物、特に穀類及び草はアグロバクテリウムの天然の宿主でない。アグロバクテリウムを使用してこれらを形質転換しようとする試みは最近まで成功していなかった［Ｈｏｏｙｋａｓ４ａｎ　ＳｌｏｇｔｅｒｅｎらのＮａｔｕｒｅ　３１１ニア６３−７６４（１９８４）］。

現在は、特定の単子葉植物はアグロバクテリウムによって形ｉ転換することかできるという証拠が集まって来ている。ここに利用できる新規な実験手法により、穀物及び草が形質転換できる。

アグロバクテリウムによって形質転換できるさらなる植物灰は、Ｉｐｏｍｏｅａ、　ＰａｓｓｉｆｌｏｒａＳＣｙｃｌａｍｅｎ、　Ｍａｌｕｓ、　Ｐｒｕｎｕｓ、　Ｒｏｓａ、　Ｒｕｂｕｓ、　Ｐｏｐｕｌｕｓ、　Ｓａｎｔａｌｕｍ、　ＡＡｌｌｌｕ、　Ｌｉｌｉｕｍ、　Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ、　Ａｎａｎａｓ、　ＡｒａｃｈｉｓＳＰｈａｓｅｏｌｕｓ、及びＰ　ｉｓｕｍである。

培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓらの”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ″ｉｎ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　１：１２４−１７６（マクミラン出版社、ニューヨーク、１９８３）、Ｍ、　Ｒ，Ｄａｖｅｙ＋”Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒ。

ｔｏｐｌａｓｔｓ″、　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、　１９８３−Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ＋　１９−２９頁（バークハウザー、バーゼル、１９８３）、Ｐ、　Ｊ、　ＤａｌｅのＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ　Ｃｒａｐｓ”ｉｎ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　１９８３−Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、　３１−４１頁（バークハウザー、バーゼル、１９１１１３）、及びＨ，Ｂｉｎｄｉｎｇ＋” Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ″ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、２１−３７頁（ＣＲＣプレス、ポカ・ラドン、１９８５）に記載されている。

再生法は植物の種から種に応じて種々変動するが、一般にはまず始めにＮ＃−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の多重コピーを含有する形質転換プロトプラストの懸濁液を調製する。次いで、そのプロトプラスト懸濁液から、天然の胚が熟成し、発芽する段階にまで胚形成を誘発すればよい。この培養培地には一般に種々のアミノ酸、及びオーキシン及びサイトカイニン類などのホルモンを含有させる。

特にトウモロコシ及びアルファルファのような種にとっては、グルタミン酸及びプロリンをこの培地に加えると有益である。苗条及び根は通常同時に発育する。

再生の効率性は、培地、遺伝子型、及び培養の経緯に左右される。これら３つの変数を制御すれば、再生は完全な再現性をもって、繰り返すことができる。

形質転換植物細胞から発育した成熟植物は自家受粉して同系交配植物を産する。

この同系交配植物は、増大したＮ・−アセチルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子を含有する種子を産する。これらの種子を発育させれば、アセチル化の速度が増大した植物を得ることができる。

本発明の同系交配を使用すれば、除草剤耐性の雑種（ハイブリッド）を発現させることかできる。この方法では、除草剤耐性の同系交配ラインを他の同系交配ラインと交雑させれば、ハイブリッドが得られる。

再生植物から得られた、花部、種子、葉部、茎部、果実部などの部分は、これらの部分が除草剤耐性細胞を含有する限り、本発明の範囲内である。その再生植物の子孫及び変異体ならびに突然変異体も本発明の範囲内に包含される。

二倍体植物では通常、片方の親をＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列で形質転換すればよく、他方の親は野生型である。これらの親を交雑させた後の第１世代のハイブリッド（Ｆｌ）は、１／２　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ／野生型：　１／２　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ／野生型の分配を示す。この第１世代のハイブリッド（Ｆｌ）を自家受粉させると第２世代のバイブ１ルノド（Ｆ２）が得られる。このＦ２バイブ１ルノドの遺伝子分配は１／４　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ：１／２　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ／野生型：１／４野生型／野生型である。Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼの遺伝子構成物を有するＦ２ノ＼イブリ、ドを除草剤耐性植物として選択する。

本明細書に使用している変異体は、植物の子孫に有性的に伝達する遺伝性の変動などの、安定であり、遺伝性である表現型の変化を表す。但し、その変異体はアセチル化の速度増大により依然として除草剤耐性植物である。また、本明細書に記載している突然変異体は、放射線などの環境条件の成果として、又は十分に確立された遺伝の法則に従って特性が減数分裂的に伝達する遺伝子変化の成果として変化を表す。しかし、突然変異植物は本発明のアセチル化の速度増大により依然として除草剤耐性を示さなければならない。

Ｅ１本発明のＮｏ−アセチルトランスフェラーゼの使用上記のように、本発明はＮ’−アセチルトランスフェラーゼ酵素を生産するための手段、及びこの酵素をコードする遺伝子配列を種々の宿主に導入するための手段を提供するものである。

Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠いている（即ち、Ｎ″−アセチルトランスフェラーゼ活性を実質的に欠いている改変Ｎ＃−アセチルトランスフェラーゼを示す）細胞は、タンパク質のアミノ酸配列を決定するうえで非常に望ましい。既述のように、Ｎ“−アセチル基がタンパク質のアミノ酸に存在すると、このような分子のアミノ酸配列の決定が妨げられる。Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠く細胞はタンパク質のアミノ末端へのアセチル基の移行を触媒しないので、このような細胞から産生されるタンパク質は容易に配列決定できるであろう。従って、例えばそのＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のゼロ突然変異（ｎｕｌｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する細胞を使用すれば、Ｎ”−アセチル化を欠いた内生の酵母タンパク質が得られるであろう。例えば、このような細胞を使用すれば、タンパク質（又はペプチド）のα−アミ７基にアセチル基を欠いている組換えタンパク質又はペプチドを発現させることができる。このようなタンパク質は既知の方法により容易に配列決定することができょう。

同様に、このようなゼロ突然変異細胞はへテロローがスなタンバり質（即ち、このような細胞からは天然又は通常は産生されないタンパク質）の生産のための宿主として使用でき、それによりこのようなタンパク質のアミノ酸配列の解明を行うことができる。

Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼが正常のＮ“−アセチルトランスフェラーゼよりも活性であるか、又はそれよりも高いレベルで産生される突然変異細胞を生産できることは、Ｎ’−アセチル化が増大しているタンパク質を生産したい場合は望ましい。既述のように、このようなタンパク質は非−アセチル化タンノくり質よりも安定である点で望ましいものである。

所望の活性（例えば、増大又は減少した基質特異性、温度安定性など）に適合させるためにＮ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を改変できることは、Ｎ”− アセチル化の特性か改変しているタンノくり實を産生し得る宿主細胞を、発育させることかできる点で有用である。

改変したＮ”−アセチルトランスフェラーゼ酵素は、突然変異宿主細胞について既述した方法と同じ方法により精製でき、又はインビトロで使用することができる。

ここまで本発明を一般的に説明してきたが、本明細書に記載の特定の実施例を参照すれば、同等のものか容易に理解されようが、これらの実施例は単に本発明の例示を目的とするものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。

実施例１サツカロミセス・セレビシェ（Ｔ　３　Ａ−Ａ株）からのメチオニン特異的Ｎ“ −アセチルトランスフェラーゼの精製酵母（サツカロミセス・セレビシェ（ｔ３ａ−ａ株）の培養（１０ｘ１リツトル）を３０’ＣでＹＰＤ培地中２０　Ｏｒｐｍで、Ａ　ｔｏｏが６．０になるまで生育させた。酵母粗溶解液を調製し、プロテイナーゼＡインヒビター（阻害剤）３（１−２４）を基質として用いて、Ｎ” −アセチルトランスフェラーゼ活性を既述のように決定した。酵素活性の検定に用いたこれらの方法については、り一等（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６３：１４９４ｇ（１９８８）　；　Ｋａｍｉｔａｎｉ、　Ｋ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１３１ｇｇi１９８９）：これらの文献は本明細書の一部を構成する）か記述している。

Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、゛ヨード酢酸（ｒＡＡ）、ヨードアセトアミド（Ｉ　ＡＭ）、ジメチル−（２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジル）スルホニウムプロミド（ＨＮＢＳ（ＣＨ，）ｔ−Ｂ　ｒ）、Ｎ−アセチルイミダゾール、ｐ−クロロメルクリ安息香酸（ｐＣＭＢ）、Ｎ−７’ロモスクシンイミド（ＮＢＳ）、ピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）、ＨＥＰＥＳＳＭＥＳＳＣＨＥＳ、ＤＴＴ、　ヒドロキシルアミン、ウシ血清アルブミン、Ｍ、、決定用タンパク質標準、２−メルカプトエタノール、グルコース、ソルビトール、リチカーゼ、ビス＝Ｔｒｉｓ、ＴｒｉＳおよびグリセロール（酵素用）をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手した。ＤＥＡＥ−セファｃ＋−スＣＬ−６８，Ｍｏｎｏ　Ｐ（ＨＲ５１５）、ポリバッファー９６、セファロースＣＬ−６Ｂをファルマ／ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラ入手シた。ＤＥ−５２セルロースおよびＣＭ−５２セルロースをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）から入手した。タンノ寸り質検定試薬（ブラ、ノドフォード法）、ヒドロキシルアノでタイト（ノザイオゲルＨＴ）、アノイーゲル・ブルーゲル（＾ｒｆｉ−Ｇｅｌ　Ｂｌｕｅ　ｇｅｌ）および５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動試薬をバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から入手した。［３Ｈ１アセチル浦酵素Ａをアマジャム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）から入手し、未標識のアセチル補酵素ＡをＰ−Ｌバイオケミカルズ（Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。アミノ酸分析用の試薬類および溶媒類とレディーソルブＥＰシンチレーションカクテルをベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）から入手した。ＳＰ膜をクツ・インコーホレイテッド（Ｃｕｎｏ　Ｉｎｃ、）から入手した。ＰＭ−３０膜をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）から入手した。酵母エキスおよびバタローペプトンをディフコ（Ｄｉｒｃｏ）から入手した。共沸（６Ｎ）塩酸およびポリブレンをピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）から入手した。フェノールをＢＲＬから入手した。微量透析器をヘルス・プロダクツ（Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から入手した。タンパク質配列分析用の試薬類と溶媒類はアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手した。ペプチド合成用試薬類はアプライド・バイオシステムズから入手し、ペプチド合成用溶媒類はアナケム（Ａｎａｃｈｅｍ）から入手した。Ｂｏｃ−アミノ酸をベニンシュラ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ）から入手した。他の化学品はすべて試薬用またはそれ以上の等級のものを用いた。

ＵＶ（紫外線）測定はヒューレットーバソカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）８４５０Ａ　ＵＶ分光光度計を用いて行った。タンパク質検定は、ウシ血清アルブミンを標準とするブラッドフォードの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ。

舖しＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｌｌ、　７２：２４８−２５４（１９７６））によって行った。放射活性試料をベックマンＬＳ３８０１シンチレーション計数器で計数した。

Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ活性を過去に記述されているようにして決定した（Ｌｅｅ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６３：１４９４８−１４９５５（１９８ｇ））。

溶解液またはクロマトグラフィー分画の一部を、反応混合物（５０ｓＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、ｌ　５０ＩＩＩＭ　ＫＣＩ、１ｍＭ　ＤＴＴ、２５μＭ［ ″Ｈ１アセチル補酵素Ａ（０，５μＣｉ）、および５０ＭＭ合成ペプチド；最終体積１００μｌ）の入った１、ＥｚＳｌエソペンドルフ管に加えた。この検定混合物を３０°Ｃで３０分間インキュベートした。０゜５Ｍ酢酸１７μｍを加えることによりこの反応を停止し、水浴中で冷却した。この反応試料をＳＰ膜テイスク（クツ、予め０．５Ｍ酢酸中で膨潤させておく）を通して濾過した後、ミリポア１２２５サンプリング・マニホールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　１２５５　ｓａｍｐｌｉｎｇ　ｍａｎｉｆｏｌｄ）上で、０６５Ｍ酢酸１ｍｌで３回洗浄した。

不完全に乾燥した膜をシンチレーシブンカクテルに入れ、ベックマンＬＳ３８０１シンチレーシコン計数器で計数した。上記の標準的酵素検定条件下で１分間に１ｐｓｏ＋の［３Ｈ］アセチル基を［３Ｈ］アセチル補酵素Ａから合成ペプチドに転移させ得る酵素量を、活性１単位と定義した。

ＰＭ−３０限外濾過膜を用いて粗溶解液の上清溶液を体積１０＋ａｌに濃縮し、０．２ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液（２０ｄ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、０．５ｍＭ　ＤＤＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ＮａＮ５）２ｘ２リツトルに対して終夜透析した。この透析した上清液を、０．２ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（２，５ｘ　５５ｃ＋ｉ）にかけた。酵素活性を含む分画（各４　ａ＋１）を合わせ、体積５ｉ１に濃縮し、０．０５ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液２ｘ２リットルに対して終夜透析し、次に０．０５ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液で平衡化したＤＥ−５２セルロースカラム（２，５ｘ　５５ｃｍ）にかけた。このカラムを、ＨＤＧ緩衝液中のＫＣ１溶液の０．０５Ｍ（２５０ｍ１）から０．５Ｍ（２５Ｏｎ＋１）への直線的勾配で溶出させた。酵素活性を含む分画（各３．５１１１１）を合わせ、体積２．５ｍＭに濃縮し、０．０５Ｍ　ＫＣ＋を含むＭＤＧ緩衝液（２０ｍＭＭＥＳ（１）８６．７）、０．０５ｍＭ　ＤＤＴ、１０％（ｖ／ｖ）　グリセロール、０．０２％ＮａＮａ）２ｘ２リツトルに対して終夜透析し、次に０゜０５ＭＫＣｌを含むＭＤＧ緩衝液で平衡化したＣＭ−５２セルロースカラム（２，５Ｘ　５０ｃｍ）にかけた。このカラムを、ＭＤＧ緩１Ｍ中のＫＣＩ溶液の０．０５Ｍ（２５０＋＋＋１）から０．５Ｍ（２５０ｎ＋１）への直線的勾配で溶出させた。分画（各３．０ｍ１）を集め、酵素活性を含む分画（０，１５Ｍ　ＫＣｌ付近）を合わせ、体積１．Ｏｍｌに濃縮し、０゜１トノン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）、０．５ｍＭ　ＤＤＴＳ　１０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール、００２％ＮａＮ＋で平衡化したセファロースＣＬ−６Ｂカラム（２，０ｘ　９０ｃｍ）にかけた。

このカラムを同じ緩衝液で溶出させた。酵素活性を含む分画（各３．５ｍ１）を合わせ、体積０．５ｍＭに濃縮し、０．１１ノン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）、０゜５ＩＩＭＤＤＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３で平衡化したヒドロキシルアパタイト（ノイイオーラ・ノド）カラム（２、Ｏｘ１５ｃｍ）にかけた。０．５ｍＭ　ＤＤＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、００２％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）の濃度０、　Ｉ　Ｍ（１００ｍ１）から０．６Ｍ（１００ｍ１）への直線的勾配を用いて、このカラムを溶出させた。分画（各２．０ｍ１）を集め、酵素活性を含む分画（０，４５Ｍ　ＫＨ，ＰＯ４付近）を合わせ、体積０．５ｍＭに濃縮した。ブラッドフォード検定法（パイオーラッド）（３３）を用い、ウシ血清アルブミンを標準としてタンパク質量を決定した。

上述の精製の結果を次の表２に示す。

Ｌ」す、カロミセス・セレビシェからのメチオニンＮ＃−アセチルトランスフェラーゼの精製操作　活性　タンパク量　比活性　精製度　収率（単位）　（ｍｇ）　（単位／−ｇ）　（倍）　（％）１、粗抽出物　６４００　２２００　２．９　１．０　１００２、　ＤＥＡＥ−セファロース　３７６Ｇ　４１０　９．２　３．２　５９３、　ＤＥ５２−セルロース　２４５０　１１０　２２．３　７．７　３８’４、　ＣＭ５２−セルロース　１４００　２．２　８３８　２１９　２２５　アフィーゲル・ブルーゲル　９４０　０．８　１１８０　４０７　１５６、ヒドロキシルアパタイト　３８００゜０４　９５００　３２８０　６１阻害剤は見かけ上このクロマトグラフィー操作中に除去された。

異的Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼの精製メチオニン特異的Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼを、サツカロミセス・セレビシェＴＤ７１．８株からも見かけ上均−に精製した。

実施例１に記述したように酵素活性を決定した。ケムアプＡＧ発酵器（Ｃｈｅｍａｐ　ＡＧ；フォルケツビル、スイス）中で、酵母培養（ＴＤ７１゜８）１０００リツトルをＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％バタトローブトン、２％グルコース）中３０’Ｃで好気的に生育させた。培養がＯＤ、、、、、、＝　１４に達した時に細胞を回収し、アルファーラバル分離システム（Ａｌｆａ−Ｌａｖａｌ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ＡＢ；タムバ、スウェーデン）で２４リツトルに濃縮し、これを１０％（ｖ／ｖ）グリセロールと共に一２０°Ｃに保存した（この状態で４力月までは活性を失わなかった）。

細胞抽出・濃縮した酵母培養（４リツトル）を融解し、４０００ｒｐｍ２０分間の遠心分離（ＪＳ−４，０ローター（ベックマン乃て集めた。

この細胞（６００ｇ湿重量）を、リチカーゼ６０ｏ＋ｇを含む緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＣ１（ｐＨ７，８）、１０ｍＭ　ＭｇＣＩ　、、３ｍＭＤＴＴ。

１Ｍソルビトール）７５０ｍｌに再懸濁し、その細胞懸濁液を３０’Ｃで４５分分間中かに振盪した。以降の操作をすべて４°Ｃで行った。

４０００ｒｐｍ１５分間の遠心分離（ＪＳ−４，０ローター（ベックマン））でスフェロプラストを集め、緩衝液Ａ３００ｍ１に穏やかに再懸濁することにより洗浄し、遠心分離で集め、緩衝液Ｂ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、１．５１１ＩＭＭｇＣＩ　ｔ、１０ｍＭ　ＫＣＩ　、０．５＋ａＭ　ＤＴＴ）３６０ｍｌに穏やかに再懸濁した。ドウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー中、タイト・フィッティング（ぴったり密着した）乳棒で１５回、ルーズ・フィッティング（緩く密着した）乳棒で１５回突くことによって、このスフェロプラストをこの低張Ｍ？ｊ：Ｉ液中で溶解し、次いで冷ＫＣＩ　（２，０Ｍ）を加えることによりＫＣＩ最終濃度を０．２Ｍにした。このホモジネートを４５分分間中かに振盪し、１４０００ｒｐｍで４５分間遠心分離（ＪＡ１４０−ター（ベックマン））することによりデブリス（残骸）を除去した。ＰＭ−３０限外濾過膜を用いてこの上清溶液を体積８０ｍ１に濃縮し、０．２ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、０．５ｍＭ　ＤＴＴＳ１０％（Ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ＮａＮ５）２ｘ４リツトルに対して終夜透析した。

ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィー：製造者の推奨する方法に従い、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂを調製し、脱気シ、カラム（２，５ｘ　５５ｃｍ）に充填した。このカラムを０．２ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液４カラム体積で洗浄した。透析した上清液を、０．２Ｍ　ＫＣＩを含むＨＤＧＭ衝液で平衡化したＤ’Ｅ　Ａ　ＥセファロースＣＬ−６Ｂにかけた。メチオニン・アセチルトランスフェラーゼ活性を同緩衝液（２４１／時間）で溶出させた。分画（５ｍｌ）を集め、メチオニン・アセチルトランスフェラーゼ活性を含む分画を合わせ、ＰＭ−３０限外濾過膜を用いて体積３０ａｌに濃縮した。

ＤＥ−５２セルロースクロマトグラフイー：濃縮したＤＥＡＥセファロースＣＬ −６Ｂクロマトグラフイーがらのｍ出ｉ＆’；ｔ、０．０５ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液２ｘ４リットルに対して終夜透析した後、０．０５１ＫＣＩを含むＨＤＧ緩衝液で平衡化したＤＥ−５２セルロースカラム（２，５ｘ　５５ｃｍ）にかけた。このカラムを、ＨＤＧ緩衝液中のＫＣＩ溶液の濃度０．０５Ｍ（２５０ａ＋１）から０．５Ｍ（２５０＋ｎｌ）への直線的勾配（２４ｍｌ／時間）で溶出させた。分画（３，５ｍ１）を集め、メチオニン・アセチルトランスフェラーゼ活性を含む分画を合わせ、ＰＭ−３０限外濾過膜を用いて体積１５ｍ１に濃縮した。

ＣＭ−５２セルロースクロマトグラフイー：濃縮したＤＥ−５２セルロースクロマトグラフイーからの溶出液を、０．１Ｍ　ＫＣＩをａＵＭＤＧ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥ　Ｓ　（ｐ　Ｈ６，７）、０．５ｔｒｒＭ　ＤＴＴ、　１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ＮａＮ、）２ｘ４リツトルに対して終夜透析した後、０．０１１　ＫＣＩを含むＭＤＧ緩衝液で平衡化したＣＭ−５２セルロースカラム（２，５ｘ　５５ｃｍ）にかけた。このカラムを、ＭＤＧ緩衝液中のＫＣＩ溶液の濃度０．１　Ｍ（２５０１１１）がら０、５Ｍ（２５０ｍ１）への直線的勾配（２４＋ｎｌ／時間）で溶出させた。分画（３，０ｍ１）を集め、Ａｔ１１゜、伝導度およびアセチルトランスフェラーゼ活性をを上述のように分析し、メチオニン・アセチルトランスフェラーゼ活性を含む分画を合わせ、ＰＭ−３０限外濾過膜を用いて体積１．５ｍＭに濃縮した。

２セルロースクロマトグラフイーからのｍｉｌを、０．０５Ｍ　ＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液４リットルに対して終夜透析し、０．０５ＭＫＣｌを含むＨＤＧ緩衝液で平衡化したアフイーゲル・ブルーゲルカラム（１，５ｘ　２０ｃｍ）にかけた。このカラムを、ＨＤＧ緩ｆｆｉ液中のＫＣＩ溶液の濃度０．０５Ｍ（１１０ｍ１）から０．５Ｍ（１１０ｍ１）への直線的勾配（１２ｍｌ／時間）で溶出させ、Ａ　２６６、伝導度およびアセチルトランスフェラーゼ活性を上述のように分析し、メチオニン・アセチルトランスフェラーゼ活性を有する分画を合わせ、Ｐ　Ｍ−３０限外濾過膜を用いて体積０．５ｍｌに濃縮した。

ヒドロキシルアバタイトクロマトグラフイー二濃縮したアフイーゲル・ブルーゲルクロマトグラフィーからの溶出液を、０．２Ｍ！Ｊン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）、０．５ｍＭＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ＮａＮ、２ｘ２リットルに対して終夜透析し、透析に使用したものと同じ緩衝液で平衡化したヒドロキシルアバタイト力ラム（２，Ｏｘ　ｌ　５ｃｍ）にかけた。このカラムを、０．５ｍＭＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ＮａＮ、を含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，２）の濃度０．　ＩＭ（１００ｍ１）から０゜８Ｍ（１００ｍｌ）への直線的勾配（２４ｓｌ／時間）で溶出させた。分画（２，０ｍ１）を集め、Ａ２．。、伝導度およびアセチルトランスフェラーゼ活性を上述のように分析し、メチオニン・アセチルトランスフェラーゼ活性を含む分画を合わせ、ＰＭ−３０限外濾過膜を用いて体積０．５ｍｌに濃縮した。

硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動：メチオニン・アセチルトランスフェラーゼを含有するヒドロキシアノ＜タイト保存液の一部を２重蒸留水に対して透析し、これを５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（９％）にのせ、ラエム’ ）　（Ｌａｅ＊＠ｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７：６８０−６８５（１９７０））が記述したように、還元条件下で電気泳動した。精製した酵素サブユニットのＭ、を決定するために、ミオシン（２０５０００）、大腸菌β −ガラクトシダーゼ（１１６０００）、ウサギ筋肉ホスホリラーゼ（９７０００）、ウシ血清アルブミン（６６０００）、卵アルブミン（４５０００）、およびつ７牌臓カルボニ・ツクアンヒドラーゼ（２９０００）を分子量標準として使用した。タン／４．９質／　ｓｊンドをクーマシイブリリアントブルーＲで染色した。Ｍ、が６９０００±２０００の単一ハンドが観測された。

分子サイズ決定：セファロースＣＬ−６Ｂカラム（２，５ｘ　９５ｃｍ）でのゲル濾過を用いて分子量標準と比較することにより、天然のメチオニン・アセチルトランスフェラーゼのＭ、を評価した。アフイーゲル・ブルーゲルクロマトグラフィーで精製した部分精製酵素をこのカラムにかけた。このカラムをＯ，ＩＭ　ＫＣＩを含むＭＤＧ緩衝液（２０ｍｌ／時間）で溶出させた。酵素の溶出体積をＡ２８０ｎｍと酵素活性によって決定し、タンパク質標準（チログロブリン（６６９０００）、アポフェリン（４４３０００）、β−アミラーゼ（２０００００）、アルコールデヒドロケナーゼ（１５００００）、ウシ血清アルフミン（６６０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９０００））の相対的溶出体積と比較することによって、メチオニン・アセチルトランスフェラーゼの見かけ上の分子量を計算した。天然酵素のＭ、を７００００±５０００と見積もった。

ゲルクロマトグラフィーで精製した部分精製酵素を、７５ｍＭＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ９，３）で平衡化したＭｏｎｏ　Ｐ（ＨＲ５１５）カラムにかけ、４ °Ｃでポリバッファー９６（ｐＨ６０流速１ｍ］／分）で溶出させた。溶出をＡ。０１ｌｆｆｉで監視し、ｐＨと酵素活性の測定のために各０．５＋ｎｌＯ分画を集めた。

表３に示すように、酵母細胞６００ｇからの多段階精製によって２２０００倍に精製された。この酵素は全細胞タンパク質の約０゜００１％を構成していた。５ＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｍ、＝６９０００±２０００の単一のクーマシイブルー染色バンドを示した。セファロースＣＬ−６Ｂでのゲル濾過クロマトグラフィーにより、天然Ｍ−Ｎ”ＡＴのＭｌが７００００±５０００であることがわかった。これらのデータは、酵母のメチオニン特異的Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼが単量体であることを示している。Ｍｏｎｏ　Ｐでのクロマトフオーカシングは、見かけ上のｐｌ＝８．３に単一ピークを示した。

酵母のメチオニン・アセチルトランスフェラーゼに対する温度とｐＨの効果を調べた。ＦＡＩに対する酵母アセチルトランスフエラ−ゼの特異的活性を異なる温度で上述のように決定した。ＦＡＩに対する酵母アセチルトランスフェラーゼの特異的活性を、異なるｐ■４の５０ｍＭリン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ、およびＣＡＰＳ緩衝液中で上述のように決定した。Ｍ−Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼの至適温度を決定するための検定を５〜５５°Ｃで行ったところ、この酵素は２５〜３７℃の温度で最大活性を示した。６゜°Ｃ１分間で非可逆的変性が起こった。この酵素は、０．ＯＩＭＫＣｌを含むＭＤＧ緩衝液（２０ｍＭ　ＭＥ　Ｓ　（ｐ　Ｈ６，７）、０．５ｍＭＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．０２％ＮａＮ５）中４°Ｃで保存すると最も安定であった。これらの条件下で、精製酵素の半減期、は約１４日であった。この酵素は、凍結−融解サイクル１回あたり約２５％の活性損失を示した。５０ｍＭ　リン酸カリウム、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＥＳ、またはＭＥＳ緩衝液の存在下ｐ　Ｈ５〜ＩＯで検定することにより、酵母Ｍ−Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼのｐＨ依存性を測定した。最大酵素活性はｐＨ７で観測された。酵素活性はｐＨ５以下およびｐＨ９以上では２５％より低かった。０．８ＭＫＣｌまたはＮａＣｌで酵素検定を行った場合は酵素活性が５０％減少したが、０．５ＭまでのＫＣＩまたはＮａＣｌの存在は酵素活性に影響を及ぼさなかった。

表３サツカロミセス・セレビンエからのメチオニンＮ′−アセチルトランスフェラーゼの精製操作　活性　タンパク量　比活性　精製度　収率（単位）　（ｍｇ）　（単位７編ｇ）　（倍）　（％）１　粗抽出物　２６９００　１４２００　１．９　１．０　１００２、　ＤＥＡＥ−セファロース　２７５００　３１００　８．９　４，７　１０２３、ＤＥ５２−セルｏ−ス５３２００　ｇ３０　６４　３３．７　１９８’４、　ＣＭ５２−セルロース　１６８００　１２．３　１３７０　７２０　６２５、アフィーゲル・ブルーゲル　６２４Ｇ　０．６５　９６００　５０５０　２３６、ヒドロキシルアパタイト　２１００　０．０５　４２（１００２２００Ｇ　＋１１阻害剤は見かけ上このクロマトグラフィー操作中に除去された。

酵素検定に過去に使用されたペプチド基質はアミ／末端としてセリンまたはアラニンを含んでいる（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：１４９４８（１９８８）　；　Ｋａｍｉｔａｎｉ、　Ｋ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４　：　１３１８８（１９８９））ので、本発明でも、ａａａ　１変異株および野生型酵母株から得た粗溶解液を検定するために、これらのペプチド基質を使用した（表４）。

表４は、野生型株およびａａａ　１変異株から得た酵母溶解液による種々のペプチド基質のＮ”−アセチル化を示している。この野生型株（内因性Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ活性を持っている）およびａａａ　１株（内因性Ｎ・−アセチルトランスフェラーゼ活性が欠失している）は、それぞれＴ３ＡおよびＴ３Ａ−ａである（Ｌｅｅ、　ＦＪ、　Ｓ。

等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１．印刷中（１９８９））。ヒトの副腎皮質刺激性ホルモン（１−２４）、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（１−２４）、およびヒトのスーパーオキシドディスムターゼ（１−２４）は、アミノ末端残基としてセリン残基かアラニン残基を有しており、ブロティナーゼＡインヒビター３はメチオニン残基を存している。ペプチド基質の合成、粗酵母ホモジネートの調製、および酵素活性の検定は、リ一等（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１４９４ｇ（１９８ｇ）　：　Ｋａｌｌｉｔａｎｉ、　Ｋ、凵B Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｍ、　２６４：１３１８８（１９８９））が既に記述しているようにして行った。カッコ内の数字は残基番号を表しており、カッコ内の文字はアミノ酸配列を特定している。略号：Ａ（アラニン）、Ｃ（システィン）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｅ（グルタミン酸）、Ｆ（フェニルアラニン）、Ｇ（グリシン）、Ｈ（ヒスチジン）、Ｉ（インロイシン）、Ｋ（リジン）、Ｌ（ロイシン）、Ｍ（メチオニン）、Ｎ（アスパラギン）、Ｐ（プロリン）、Ｑ（グルタミン）、Ｒ（アルギニン）、Ｓ（セリン）、Ｔ（スレオニン）、■（バリン）、Ｗ（トリプトファン）。データを平均活性±５Ｄ（Ｎ＝３〜５）として記載し、ヒト副腎皮質刺激性ホルモン（１−２４）に対するホモジネートの活性に対して規格化する。

Ｎ”−アセチル化され得るタンパク質のα−アミ７基へにアセチル基転移に寄与し得るＮ″′−アセチルトランスフェラーゼは１つだけであると予想されたか（Ｔｓｕｎａｓａｗａ、　Ｓ、等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｎ＋ｏ１．１０６：１６５（１９８４）　；Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、　Ｈ，Ｐ、　Ｃ，等、　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　１８：２８１（１９８５）　；　vｏｌｄ、　Ｆ、　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　９：２５６（１９８４）　；　Ｊｏ？＋１ｖａｌｌ、　ｎ、　、　Ｊ、　Ｔ■■盾窒■煤A　Ｂｉｏｌ、　５５：１（１９７５）　；　Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、　Ｐ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２５４　：１１１４２（１９７X））、もし別のＮｏ−アセチルトランスフェラーゼが存在するとすればメチオニンに特異的なものか存在するかも知れないと仮定したので、メチオニンＮ’−アセチルトランスフェラーゼの存在を検定した。

予想どおりａａａ　ｌ変異株はセリンまたはアラニンをアミノ末端残基とするペプチド基質をアセチル化できなかったが、Ｎ’−アセチル化メチオニン残基を含むことが知られているスイスプＯット（ＳｖｉｓｓＰｒｏｔ）タンパク質配列データベース中唯−の酵母タンパク質のアミ／末端を模倣したペプチド基質ブロティナーゼＡインヒビター３（Ｂｉｅｄｅｒｍａｎ、　Ｋ、等、　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｕ＋ｕｎ、　４５：２２５（１９８０））を用いることにより、ａａａ　１変異株と野生型株が共にこの基質をアセチル化し得ることが観測されたく表４）。これらのデータは、メチオニンＮ１−アセチルトランスフェラーゼが酵母細胞中に存在することを明確に立証している。

青−工種々のペプチド基質のＮ’−アセチル化アルコールデヒドロゲナーゼ（１−２４Ｍ酵母）１ｏ２±５０（Ｓ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ −３−）１−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ”）スーパーオキシドディスムターゼ（１−２４８ヒト）　８０±６０（Ａ−丁−Ｉ−Ａ−Ｖ−Ｃ−Ｖ−Ｌ− に−Ｇ−Ｄ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｑ−Ｇ−Ｓ−１−Ｎ−Ｐ−Ｅ−Ｑ−に−Ｅ）実施例４Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼの特異性真核タンパク質配列の分析により、ヨルンホール（Ｊｏｒｎｖａｌｌ）とその共同研究者等は、５種類のアミノ酸残基（即ち、アラニン、セリン、メチオニン、グリシン、スレオニン）が真核タンパク質中でアセチル化されている全残基の９５％を占めること、およびＮ”−アセチル化メチオニンは例外な（アスパラギン酸、グルタミン酸またはアスパラキンに続いていることを既に立証している＜Ｐｅｒｒｓｏｎ、　Ｂ、等εｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５２：５２３（１９８５））。

プロテイナーゼＡインヒビター３　（Ｐ　Ａ　Ｉ　ＸＴｓｕｎａｓａ＊ａ等、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、　１０６：１６５−１７０（１９８４）　；　ｆｏｌｄ、　Ｆ、＋　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　９：２T６ − ２６７（１９８４）　：　Ｄｒｉｅｓｓｅｎ等、　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　ＢｉｏｃｈｅＩｌｌ、　１８：２８１−３２５（１９８５j ；　Ｍｕｌｌｅｎ等、　ＥＭＢＯＪ、　８：２０６７−２０７５（１９８９）　；　Ｌｅｅ等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１　：T ７９５−５８０２（１９８９）　：　ｔ（ｅｒｓｈｋＯ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１　ニアＤ２１|７０２５（１９８４）　；　Ｂａｃｈｍａｉｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４：１７９− １８６（１９８６）　；　Ａｒｆｉｎ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７：７９７９−７９８４（１９８８）　；　Ｐｅｒｓｓｏｎ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、　１５２：５２３| ５２７（１９８５）　；　Ｈｕａｎｇ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６：８２４２−８２４６（１９８７）　；　Ｌｅｅ等、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１４９４８−１４９５５（１９８８）　；　Ｋａｍｉｔａｎｉ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、@２６４　：Ｈ１８８−１３１９３（１９８９））は、ＮＨ２−末端メチオニン残基がアセチル化されている唯一既知の酵母タンパク質である。したがって、種々のイソ−１〜チトクロムＣ変異タンパク質（Ｎ”−アセチル化されているか、もしくは遊離のα−アミ７基を含有することが既に立証されている（Ｔｓｕｎａｓａｗａ、　Ｊ、　Ｗ、等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：５３ｇ２（１９８５）））およびアクチンを模倣した一連のペプチド基質を合成した（表５）。表５は、ａａａ　１変異株（内因性Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ活性が欠如している）Ｔ　３　Ａ　−ａ　（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１：５７９５−５８０２（１９８９））から得た粗酵母ホモジネートによる種々のアミノ末端メチオニン含有ペプチド基質のＮ”〜アセチル化を示している。ペプチド基質の合成、粗酵母ホモジネートの調製、および酵素活性の検定はり一等（Ｌｅｅ等。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：１４９４８（１９８ｇ）　；　Ｋａｔｉｔａｎｉ、　Ｋ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２U４：１３１８ｇ（１９８９））が過去に記述したように行った。カッコ内の数字は残基番号を表し、カッコ内の文字はアミノ酸配列を表す。略号は図１での略号と同意義である。データを平均活性±５Ｄ（Ｎ＝３〜５）として記載し、酵母プロテイナーゼＡインヒビター３に対するホモジネートの活性に対して規格化する。このタンパク質の配列はＭ−Ｎ−Ｔ−Ｄ−Ｑ−Ｑ−に−Ｖ−３−Ｅ−Ｉ−Ｆ−Ｑ−３− ５−に−Ｅ−に−Ｌ−Ｑ−Ｇ−Ｄ−Ａ−にである。各基質はアミノ末端メチオニンを含有しており、アスパラキン、アスパラギン酸、アラニン、ロイシン、またはスレオニンを第２残基としている。メチオニンのＮ”−アセチル化は、第２残基としてアスパラキンまたはアスパラギン酸を含有する基質でのみ起こることがわかった。データを平均活性±５Ｄ（Ｎ＝３〜５）として記載する。

表５合成ペプチドのＮＡ−アセチル化に関する［＾１ａ２］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［Ａｒｇｔ］プロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　Ｏ［Ａｓｐｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）５５±５ＥＣｙｓ、］プロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　０［ＧＩｎｔ］プロテイナーゼ＾インヒビター３（［ｔ）　９±３［Ｇｌｕｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　２１±３［Ｇ１ｙｔ］プロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　０［１ｌｅｔ］プロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　０［Ｌｅｕｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［Ｈｉｓｚ］プロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　０［Ｌｙｓｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　Ｏ［Ｍｅｔｙ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［ＰｈｅｔコプロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［ｐｒｏｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［５ｅｒｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［Ｔｈｒｔ］プロテイナーゼＡインヒビター３（酵母）　０［Ｔｒｐｔ］プロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　０［Ｔｙｒｔコプロテイナーゼ＾インヒビター３（酵母）　０このように、ＰＡＩ、その類縁体および他のペプチドを用いることによってＭ−Ｎ’ＡＴ基質の構造上の特徴を研究した。２番目の位置か置換されている１９種の合成ＦＡＩ類縁体を、効率良くＮ″−アセチル化されることが既に立証されているＦ　Ａ　Ｉ　（Ｌｅｅ等＋　Ｊ、　Ｂ＋ｏ１．　Ｃｈｅｍ、　２６５：３６０３−３６０６（１９９０乃と比較した（表５）。１９種の類縁体のうち３種だけがアセチル化されたが、そのアセチル化効率は９〜５５％（Ａｓｐ＞　Ｇｌｕ＞　Ｇｉｎ）の範囲で異なった。イソ−チトクロムＣ変異タンパク質類（Ｍｅｔ−１１ｅ−＾ｒｇ−−−１Ｍｅｔ−１１ｅ−Ｌｙｓ−−−１Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−＾５ｎ−−−）が生体内でＮ”−アセチル化され得ることは過去に示されていたが（Ｔｓｕｎａｓａｗａ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０：５３８２−５３９１（１９８５））、これらのイソ−チトクロムＣ変異体のＮＨ，−末端２４アミノ酸残基を模倣した合成ペプチドは酵母のＭ−Ｎ’ＡＴによってアセチル化されなかった。

本発明のメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼ（Ｍ−Ｎ“−ＡＴ）活性の相対的特異性および活性を、リー等のＡＡＡＩ　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ　”−Ａ　Ｔ　ＸＬｅｅ、　Ｆ、　−Ｊ、　Ｓ、等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７１（１９８９）　；　Ｊｏｈｎ　Ａ、Ｓｎ＋ｉｔｈおよびＦａｎ［−Ｊｅｎｓ、　Ｌｅｅの米国特許出願（出願臼１９８９年１０月２５日；標題“変化したＮ′−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するサツカロミセス・セレビ／工株の単離”　、これらの文献は本明細書の一部を構成する）の特異性および活性と比較するために、合成ペプチドを調整した。これらのペプチドを、上記２種類の酵素の基質として働く能力について評価した。この実験の結果を表６および表７に記載する。表６では活性に対するアミン末端アミノ酸の効果を調べ、表７では活性に対するアミノ末端の次のアミノ酸の効果を調べている。

表６合成ペプチドのＮ”−アセチル化に関する酵母アセチルトランスフェラーゼ（平均活性±Ｓ、Ｄ、）Ｎ”−ＡＴ　Ｍ−Ｎ”−ＡＴ［Ｒ＋コアルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）００Ｒ−１−Ｐ −Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｐ−Ｙ−Ｅ−３−）１−Ｇ　−Ｋ　−Ｌ−Ｅ −Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｎ’］アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４８酵母）０ＯＮ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ４−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−１（−Ｇ− に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｄ’］アルコールデヒドロゲナーゼ［（１− ２４）（酵母）００Ｄ−１−Ｐ−Ｅ−丁−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−５ −Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−ＰＵＣ’］アルコールデヒドロゲナーゼ巨１−２４）（酵母）００Ｃ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｐ　 −Ｙ−Ｅ−Ｓ−）１−Ｇ−Ｉ　−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−ＰＥＱ’］アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）００Ｑ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に −Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−８−）１−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｅ’］アルコールデヒドロゲナーゼｆ　（１−２４Ｘ酵母）　１ｌＱＥ−１−Ｐ −Ｅ−Ｔ　−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ　−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−Ｋ　−Ｌ−Ｅ −Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ「Ｇ１］アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）２３±３０Ｇ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｐ−Ｙ−Ｅ−Ｓ− １１−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［１’］アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）　００１−１−　Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１ −Ｆ−Ｙ−Ｅ−８−１（−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ「ＬリアルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）００Ｌ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に −Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−ＰＩｌｌリアルコールデヒドロゲナーゼ＋　（１−２４）（酵母）１９±２０Ｈ−１− Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｐ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−！（−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ −に−Ｄ−１−Ｐ［Ｋ’］アルコールデヒドロゲナーゼ！　（１−２４８酵母）００に−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−ε−５−）１−Ｇ−に −Ｌ−Ｅ−Ｙ、に−Ｄ−１−Ｐ表６（続き）［丁１コア　ルコ−）ｋデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４８酵母）１０３±５０Ｔ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｐ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ− Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［１’］フルコー／Ｌ／デヒドロゲナーゼＴ　（１−２４０酵母＞　００Ｗ−１−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｉ−Ｇ　−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−５ −Ｈ−Ｇ−Ｋ−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ表７合成ペプチドのＮ’−アセチル化に関する酵母アセチルトランスフェラーゼ（平均活性±Ｓ、Ｄ、）Ｎ’−ＡＴ　Ｍ−Ｎ’−ＡＴアルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）１０２±５０Ｓ−１−Ｐ −Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に −Ｄ−１−ＰｒＡａ　７　ル：１７−ルテヒドロゲナーゼ＋　（１−２４０酵母）１６８±８゜５−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ− Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｒ２］アルコールテヒトロケナーゼＩ　（１−２４）（酵母）１ｏ２±５０Ｓ−Ｒ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−ｖ− ＋−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ４−Ｇ−に一乙−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−Ｉ−Ｐ［Ｎ”］７　ル：＋−／ｌ／デヒドロゲナーゼｒ　（１−２４）（酵母）１工６±５Ｏ３、＋１− Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ　−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−Ｋ　−Ｌ−Ｅ −Ｙ−に−Ｄ−１−ＰＵＤ’ＪアルコールテヒトＯ’ヒトｔ−セＩ（１−２４）（酵母）１７１±９０Ｓ−Ｄ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ　−Ｖ−１−Ｆ　−Ｙ −Ｅ−３−）１−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［（：’］フルコーにデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４８酵母）１３６±７０Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ− Ｋ　−Ｇ−Ｖ−ｆ　−Ｆ−Ｙ−Ｅ−５−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１− ＰＩＱ’１７　ル：＋−ルデヒドｏゲナーゼＩ　（１−２４）（酵母）１３４＋７　０５−Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ　−Ｌ　ｌ　−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ −に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐｌｐｔｌアルコールデヒドロゲナーゼ巨１− ２４８酵母）】２】±６０Ｓ−Ｅ−Ｐ−Ｅ−Ｔ　−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ −Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−■−Ｐ［に’１フル：＋−４デヒドロゲナーゼＴ　（１−２４８酵母）８４±５Ｏ３−Ｇ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に− ＧＪ−ｔ　−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−’ｆ−に−Ｄ−１−Ｐ［し ’］フル：＋−／ｌ／デヒドロゲナーゼ！　（１−２４８酵母）１２６±５ＯＳ −Ｌ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−）１−Ｇ−に−Ｌ− Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−ＰＪｔ（’］　７　ル：７−　ルｆ　ヒ）’　ｏケナーゼＩ　（１−２４）（酵母）１２５±６゜５−Ｈ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ− １−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−１１−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｋ’３フルコールデヒドロゲナーゼ＋　（１−２４）（酵母）１５１±６Ｏ３−Ｋ　−Ｐ− Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に −Ｄ−Ｉ　Ｐ［Ｍ１］アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４８酵母）１４０±７０Ｓ−Ｍ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−Ｋ　−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−４１− Ｇ−１［−Ｌ−Ｅ−Ｙ−４−Ｄ−１−Ｐ表６（絖き）Ｓ−Ｐ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ　−Ｋ　− Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｓ”］］アルコールデヒドロゲナーゼＩ（１−２４８酵母）　１４０土６Ｏ８−８−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ− Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−ｒ−Ｐ［Ｔ”］アルコールデヒドロゲナーゼＩ　（１−２４８酵母）１４４±８０Ｓ−Ｔ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ −Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−３−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｗ″〕〕アルコールデヒドロゲナーゼ！１−２４８酵母）９１±５０Ｓ−Ｗ−Ｐ−Ｅ− Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ− １−Ｐ［Ｙ２］アルコールテヒドロゲナーゼＩ　（１−２４８酵母）１６９±８０Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−１−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−１ｆ−Ｇ−に− Ｌ　−Ｅ−Ｙ−４−Ｄ−１−Ｐ実施例６Ｎ＃−アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸分析濃縮したアフィーゲル・ブルーゲルクロマトグラフィーがらの溶出液を、１２ｃｏ＋ウエル中の１．５ｍｍ厚の９％５ＤＳ−ＰＡＧＥにのせて電気泳動し、過去に記述されたようにして電気溶出させた（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９１　：２２７−２３６（１９８３））。精製したメチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼを調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから電気溶出させた。４つの異なる酵素調製物を０．１％フェノールを含有する６ＮＨＣＩ中１１０℃で２４時間加水分解した後、ベックマン６３００アミノ酸分析機で、そのアミノ酸組成を決定した（Ｈｅｗｉｃｋ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　２５６：７９９０−７９９７（１９８１）　；　Ｍｏｏｒｅ、　Ｓ、　、　’Ｃ■■高■ ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｊ、編）、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍｌ（１９７２）、　６２９−６５２頁）。Ａｓｘ＝Ａｓｐ＋Ａｓｎ　：　Ｇｌｘ＝Ｇｌｕ十Ｇ１ｎ０各アミノ酸残基の質量を１１０と仮定し、Ｍｒ＝６９０００に基づいて酵素のサブユニットあたりの残基数を計算した。２４時間の加水分解中に破壊されたＳｅｔおよびＴｈｒ量についての補正は行わなかった。ＣｙｓおよびＴｒｐは決定しなかった。

表８サツカロミセス・セレビシェ由来のＭ−Ｎ”ＡＴ活性に対する種々の２価カチオンの効果を測定した（表９）。酵母メチオニン・アセチルトランスフェラーゼを、１ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）中で、種々の２価カチオンの存在下室温で５分間インキュベートした。その酵素活性を、ＰＡｌ（Ｎ＝３）を基質とする標準的検定条件下で上述にように測定した。

１１１１Ｍ１１１度で、Ｃａ”、Ｍ　ｇ　！　’、およびＭｎ”は効果がなかったが、他の２価カチオンでは、濃度依存性の激しい阻害が起こった（Ｚ　ｎ　” ＝Ｃｕ　”＝Ｃｄ　”＞Ｇ　ｏ　’″＝Ｆｅ″″；０．１ｍＭで酵素を不完全に不活化する）。また、ＭｇＳＯ４はＭｇＣｌ、存在下での活性と比較して酵素活性に影響を及ぼさないので、Ｃｕ５Ｏ，およびＺ　ｎ　Ｓ　Ｏ４で観測された激しい効果か５０４−″アニオンによるものではないことが立証された。さらに、Ｃａ　ＣＩ　ｔ、　Ｍ　ｇ　Ｃ＋　！、およびＭｎＣｌ。

は酵素活性に影響を及ぼさないので、ＣｄＣ１１阻害はＣ１−によるものではない。

表８サツカロミセス・セレビシェ由来のメチオニンＮＡ−アセチル濃度（ｍＭ）ＭｇＣｌ、　９８　１０５　−−− ＭｇＳ０．　９７　１０２　−−− ＭｎＣ１，９８１０３−−− ＦｅＳ０．　４０　９３　１０８ＣｏＣＩ、　３８　９５　１０６ＣｄＣ１，０７２１０３ＣｕＳ０．　Ｏ６５１０１酵素活性に対する化学修飾の効果この酵素中の異なる種類のアミノ酸残基について考え得る触媒的役割を決定するために、種々の化学修飾を行った（表９）。酵母メチオニン・アセチルトランスフェラーゼをそれぞれの試薬と共に３０℃で１５分間インキュベートし、５０Ｉｌ１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（＋）Ｈ７，４）、ｆ５０ｆｆ１Ｍ、１ｍＭＤＴＴに対して４℃で３〜４時間透析した。その酵素活性をＦＡＩ（Ｎ＝３）を用いる標準的検定条件下で上述にように検定した。

使用した略号を次に説明する。α−ＭＳＨ［α−メラニン形成細胞刺激ホルモン］　・ＣＨＥＳ　［２−（Ｎ−シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸］　、ＤＥＰＣ［ピロ炭酸ジエチル］、ＨＤＧ緩衝液［２０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）、０．５ｄ　ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）　グリセロール、０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　３コ　、ＮＢＳ［Ｎ−ブロモスクシンイミド］　；　ＨＮＢＳ（ＣＨ３）、−Ｂ　ｒ　［ジメチル−（２−ヒドロキシ−５−二トロベンジル）スルホニウムプロミド］　；ＨＥＰＥＳ　［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペランン−Ｎ’ −２−エタンスルホン酸］、ＩＡＡ［ヨード酢酸１．ＩＡＭ［ヨードアセトアミド］、ＭＤＧ緩衝液［２０＋ｎＭＭＥＳ（ｐＨ６，７）、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、００２％ＮａＮ、ｌ］　；ＭＥＳ　［２−（Ｎ −モルホリノ）エタンスルホン酸］　；Ｍ−Ｎ”ＡＴ　［メチオニン−Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ］　；　Ｎ’ＡＴ　［Ｎ”−７セ＋ルトランスフエラーゼ］　；ＮＢＳ　［Ｎ−ブロモスクシンイミド］、ＮＥＭ［Ｎ−エチルマレイミドコ　；ＰＡＩ　［プロテイナーゼＡインヒビター３］　；ｐＣＭＢ　［ｐ− クロロメルクリ安息香酸塩］　：５ＤＳ−ＰＡＧＥ　［硫酸ドデシルナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電気泳動］。

Ｍ−Ｎ’ＡＴとピロ炭酸ジエチル（ヒスチジン修飾試薬（Ｍｉｌｅｓ、　Ｅ、　ｆ、　。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｉｚｙｍｏｌ、４７：４３１−４４２（１９７７）））との反応は、この酵素のほぼ完全な失活を肩した。０．２５Ｍヒドロキシルアミン（ヒスチジン残基のトキシホルミル化（ｔｈｏｘｙｈｏ？ｍｙｌａｔｉｏｎ）を反転させ得る試薬）と共に室温で６時間インキュベートした後、元の酵素活性の約５０％が回復したが、長時間にわたってヒドロキシルアミンにさらすと酵素がゆっくり失活した。触媒的に重要なトリプトファン残基の存在を、Ｎ　Ｂ　Ｓ　（Ｓｐａｒ＋ｄｅ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｗｏｌ、　１１：５０６−５２２（１９６７））およびＨＮＢＳ（ＣＨＪｔ−Ｂ　ｒ（Ｈｏｒｔｏｎ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙａｏｌ、　２５：４６ｇ−４１１１２（１９７２））を用いる化学修飾によって調べた。

ＮＢＳは０．５１１ＭＭでこの酵素を不完全に不活化し、５ｍＭで完全に不活化した。ＨＮＢＳ（ＣＨ３）、−Ｂ　ｒはこの酵素を不完全に不活化したが、酵素活性の損失はＮＢＳより少なかった。ＮＢＳはヒスチジンおよびチロシン残基をも修飾し得るので（Ｗｉｔｋｏｐ、　Ｂ、　、＾ｄｖ、　Ｐ？ｏｔｅｉｎ　Ｃｈｅｍ、　１６：２２１−３２１（１９６３乃、この不活化は、ＤＥＰＣによって修飾されたであろうヒスチジン（単数または複数）と同じヒスチジンの化学修飾によるものであるかも知れない。スルフヒドリル還元試薬（即ち、２−メルカプトエタノールおよびＤＴＴ）は酵素活性に影響を与えなかった。スルフヒドリル修飾試薬（即ち、ヨード酢酸、ヨードアセトアミド、およびｐＣＭＢ）も１ｍＭでは影響を及ぼさなかったが、ＮＥＭは０．５ｍＭで、または他の試薬は１０ｍＭで不完全な酵素失活が認められた。Ｎ−アセチルイミダゾール（チロシン修飾試薬）も効果がなかった（Ｒｉｏｒｄａｎ等、　ｌ１ｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　２５°５００−５０６（１９７２））。

表９サツカロミセス・セレビシェ由来のメチオニンＮＡ−アセチルトランＤＥＰＣ０，０５５９ＨＮＢＳ（ＣＨ３）、−Ｂ　ｒ　１．０　９３１０．０　６２２−メルカプトエタノール　１０．０　９６ＪＡＭ　１．０　１００１０．０　８６ｐＣＭＢ　１．０　９４１０、０　２５Ｎ−アセチルイミダゾール　１．０　１００実施例８本発明はタンパク質合成におけるメチオニンＮ’−アセチルトランスフエラーセの役割を解明するものである。１つの可能性は、なぜ他のすべてのタンパク質のＮ’−アセチル化が明白に非特異的であるのかは明らかではないが、メチオニンを含有するタンパク質のＮ’−アセチル化（アセチル化されたタンパク質の５〜６％を占める（Ｐｅｒｒｓｏｎ、　Ｂ等、　Ｅｕ？、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５２：５２３（１９８５）））か、重要な生物学的機能を促進するために高度に特異的でなければならないということである。　もう１つの可能性は、メチオニンを含有するタンパク質のアセチル化が他のタンパク質のアセチル化とは異なるタンパク質合成段階で起こるということである（図２ＡおよびＢ）。図２は、（Ａ）メチオニンＮ’−アセチルトランスフェラーゼ（Ｍ−Ｎ’ＡＴ）、メチオニン・アミ／ペプチダーゼ（ＭＡＰ）、およびＮ’−アセチルトランスフェラーゼ（Ｎ“−ＡＴ）によって媒介される真核タンパク質の共翻訳修飾について提案する経路を示し、また（Ｂ）過去にウォルド（Ｔｏｌｄ、　Ｆ、　、　Ｔｒａｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　９：２５６（１９８４））が提唱した、２つの異なるアセチル化段階において作用する単一のＮ”−ＡＴおよびアシルアミノ酸・ヒドロラーゼ（ＡＡＨ）が関与する別の経路を示している。この経路はＭＡＰの作用を必要としない。記号は図１で示したものと同義である。例えば、あるタンパク質の共翻訳タンパク質プロセッシングのｉｉ段ｉが、開始（イニシェークー）メチオニンのメチオニン・アミ／ペプチダーゼによる切断（図１）ではなく、そのアセチル化（図２Ａ）であるとすれば、メチオニンＮ“−アセチルトランスフェラーゼの基質特異性が、どのタンパク質がメチオニン・アミノペプチダーゼによって切断されるかを制御し、それによって、どのタンパク質がその後にもう１つのＮ’−アセチルトランスフェラーゼによってアセチル化されるかを制御するのがもじれない。あるいは、メチオニンＮ”−アセチルトランスフェラーゼは、アミノ末端メチオニンを含有するタンパク質に対して、他のＮ’〜アセチルトランスフェラーゼが作用するのと同じ合成段階で作用するのがもしれない（図１）。

要約すると、アセチル化は、すべての考え得るアミノ末端残基に作用する単一のＮ”−アセチルトランスフェラーゼによって媒介される（図１）のではなく、また共翻訳修飾の２つの異なる段階で作用する単一のＮ”−アセチルトランスフェラーゼによって媒介される（Ｎａｒｉｔａ、　Ｋ、　、　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　２８：１８４（１９５ｇ））でもなく、２種類の異なるＮ″−アセチルトランスフェラーゼが真核タンパク質のＮ’−アセチル化を制御していることが、本発明によって明らかになった。

Ｍ−Ｎ　”Ａ　Ｔは、アセチル基をアセチル−ＣｏＡからＡｓｐ、＾ｓｎ、　Ｇｌｕ。

またはＧｌｎに隣接するＮＨ，−末端Ｍｅｔ残基に選択的に転移させる。酵母のＭ−Ｎ’ＡＴは、ＤＥＡＥ−セファ０−ス、Ｄ　Ｅ　５２−セｋａ−ス、ＣＭ５２−セルロース、アフィーゲル・ブルーゲル、オよびヒドロキシルアバタイトを用いる連続的クロマトグラフィー操作によって２２０００倍に精製され、その回収率は全体で８％であった（表３）。

この酵素のＮＨ，−末端はブロックされていた。天然型酵素のＭ、、は７００００±５０００であり、この酵素は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによってＭ、が６９０００ ±２０００の単量体であることがわかった。Ｍ−Ｎ’ＡＴはＮ’ＡＴと、Ｍｒ（７００００と２０００００）もサブユニット構造（単量体と二量体）も異なっている。さらに、Ｍ−Ｎ’ＡＴおよびＮ”ＡＴはＣｕ”およびＺｎ”によって顕著に阻害されるが、Ｍ−Ｎ’ＡＴがＣｄ”によっても阻害されるのに対し、Ｎ”ＡＴは阻害されない（表８）。

さらに、Ｍ−Ｎ″ＡＴとＮ”ＡＴはどちらも、過去に小麦麦芽Ｎ’ＡＴについて立証されたように（Ｋｉｄｏ等、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉａｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２０８：９５−１００（１９８１乃、塩素イオンによって活性化されない。

他のアセチルトランスフェラーゼが関与する研究によって、アセチル−ＣｏＡ　ニアリールアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｊｅｎｃｋｓ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４７：３７５６−３７６０（１９７２乃およびコリン・Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ、　Ｒ，、Ｊｒ、　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒｔｒ、　２４９　：２１５６−２１５９（１９７４））中のシスティンの化学修飾、あるいはアセチル−ＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｂａｍｅ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩａ、　２６１　：１０１２７−１０１３２＜１９８６＞）中のとスチレンの化学修飾が、これらの酵素を不活化することがわかっている。β−メルカプトエタノール、ＤＴＴ、ＮＥＭ、ｐＣＭＢ、ＩＡＡ、およびＪＡＭが両酵素を失活させ得ないことは、システィン残基がこの触媒機構に関与しないであろうことを示している（表９）。ＤＥＰＣ（ＮＢＳも考えられる）を用いた研究は、酵母Ｎ’ ＡＴについて過去に示唆されていたように（Ｌｅｅ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：１４９４ｇ−１４９５５（１９８８））、酵母Ｍ−Ｎ　”ＡＴの活性部位内にヒスチジン残基が位置していることを示唆している。このようなヒスチジン残基は、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼの触媒部位において、一般塩基として作用することも提唱されている（Ｌｅｓｌｉｅ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：４１３３−４１３７（１９８８））。

真核タンパク質配列の分析より、５種類のアミノ酸残基（即ち、アラニン、セリン、メチオニン、グリシン、およびスレオニン）が、真核タンパク質中の全アセチル化残基の９５％を占めることが既に立証されている（Ｔｓｕｎａｓａｗａ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０６：１６５−１７０（１９８４）；　Ｖｏｉｄ、　Ｆ、　、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　９：２５６−２６７（１９８４）　；　Ｄｒｉｅｓｇｅｎ等、　bＲＣＣｒｉｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８：２８１−３２５（１９８５）　；　Ｊｏｒｎｖａｌｌ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｔｈｅｏｒｅｔ、@Ｂｉｏｆ、　５５：１−１２（１９７５）　：＾ｒｆｉｎ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ？ｙ　２７：７９７９−７９８４（１９８８）　；　Ｐｅｒｓｓｏｎ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５２：５２３−５２７（１９８５））。ある種のアミノ酸残基がこのように主として用いられることは、ＮＡα−アセチルトランスフェラーゼにとってＮＨ，−末端残基が主要な認識シグナルであることを示唆しているが、これらのアミノ酸をそのＮＨ，−末端に有しながらこれらがアセチル化されていないタンパク質の例は数多くある。したがって、これらの酵素は、タンパク質またはペプチドのＮＨ，−末端領域内の隣接残基（例えばＮ” −アセチル化メチオニンは通常アスパラギン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸の前にある）、遠位の残基（Ｋａｍｉｔａｎｉ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６４：１３１ｇｇ−１３１９３（１９ｇ９）；　Ｌｅｅ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２８５：印刷中（１９９０）　；　Ａｕｇｅｎ等、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｓｃｉ、　１１：４９４−４９７（１９８６）　；　Ｄｉｘｏｎ等、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙａ＋ｏ１．１０６：１７０−１７９（１９８４））、あるいはその立体配座特徴をも認識しているようである。そこで、ＮＨ，−末端メチオニンがＮ１−アセチル化されることがわかっているＰ　Ａ　Ｉ　（Ｂｉｅｄｅｒｍａｎｎ等、　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｔｓｔａｕｎ、　４５：２２５−２３５（１９８０））や、イソートチトクロムＣ変種（生体内でＮ’−アセチル化されることが過去に解明されている（Ｔｓｕｎａｓａｗａ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０　：５３８２−５３９１（１９８５）））を模倣して一連の合成ペプチド基質を合成した。各基質は、第２残基に種々のアミノ酸を伴ったＮＨ，−末端メチオニンを有する。アスパラキン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはグルタミンを第２残基とする基質でのみＮ’−アセチル化が起こることがわかった（表５）。さらに、ＰＡＩとその類縁体のＮＨ，−末端Ｍｅ先のアセチル化に関する相対的活性の相違は、Ｍ−Ｎ”ＡＴによるＮ＃−アセチル化を制御する際に第２の残基が主要な役割を果すことを示した。Ｇｌｎが後に続＜Ｎ’−アセチル化ＮＨ，−末端メチオニンを含有するタンパク質は、これまで種々のタンパク質データベース中に認められていないか（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ等、　ＣＲＣｃｒｉｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８：２８１−３２５（＋９８５）　；　Ｊｏｒｎｖａｌ　Ｉ、　Ｈ，、Ｊ、　Ｔｈｅｏｒｅｔ、　Ｂｉｏｌ、　５５：　１−１２（１９７５）　；　Ｐｅｒｓ唐盾雌凵B Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５２：５２３−５２７（１９８５）　；　Ｈｕａｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ　２６：８２４２−８２４６（１９８７））、このようなタンパク質を同定できなかったのは、現在までに特徴づけられたＮ’−アセチル化されたタンパク質の数が限られているためであろう。

もう１つの合成ペプチドヒトタンパク質−チロジン−ホスファ９−ゼが酵母Ｍ− Ｎ’ＡＴによってアセチル化され得るという事実（Ｌｅｅ等。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：３６０３−３６０６（１９９０））は、Ｍ−Ｎ　”Ａ　Ｔの基質特異性が酵母とヒトの間で高度に保存されているらしいことを示している。

したがって、精製した酵母Ｍ−Ｎ’ＡＴは、酵母とヒト両酵素の触媒機構と基質特異性を研究するための便利な酵素供給源を提供し得る。

酵母Ｎ”ＡＴの遺伝子（ＡＡＡｌ　、ＮＡＴ　Ｉとも呼ばれる（Ｍｕｌｌｅｎ等、　ＥＭＢＯＪ、　８：２０６７−２０７５（１９８９）　：　Ｌｅｅ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１２３３９−）を崩壊させることによって、細胞の生育および成熟における酵母Ｎ＃ＡＴに関する生物学的機能は、まずアセチル化され、次いでそのアセチル化メチオニンが除去され（おそらくＮ−アセチルメチオニン・アミノペプチダーゼ（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１　：９５７２−９５７５（１９８６））またはアシルペプチド・ヒドロラーゼ（Ｔｓｕｎａｓａｗａ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（Ｔｏｋｙｏ）　７７：８９−１０２（１９７５）　；　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６２：１１４３T −１１４４５（１９８７））による）、次いで第２残基がアセチル化されることが過去に示されており、Ｍ−Ｎ”ＡＴが酵母アクチン（Ｌｅｅ等、　Ｊ、　Ｂｊｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：３６０３−３６０６（１９９０））のＮＨ，−末端を模倣した２４残基の合成ペプチドをアセチル化するであろうことを本発明が立証したので、Ｍｅｔの選択的アセチル化は、アクチンおよび他の真核タンパク質のＮＨ，−末端プロセノシング経路の調節に重要であると思われる。

Ｍ−Ｎ’ＡＴの部分的タンパク質配列データをトリプシンペプチドから決定し終わっており、現在コード化遺伝子をクローニングするためにこれを使用している。将来、酵母を遺伝子分析系として用いて、このクローン化遺伝子が、タンパク質のＮ’−アセチル化におけるＭ−Ｎ″ＡＴの機能的役割の直接的研究の基礎をなすであろう。

特定の態様に関連させて本発明を記述してきたが、さらにこれを改良し得ること、また本出願が、一般に、本発明の原理に基つく本発明のあらゆる変種、使用、または適用を包含し、また本発明が属する技術分野において既知または慣行となり、上述の基本的特徴に利用され得、以下に記載の請求の範囲に従うような本発明からの逸脱を包含すると見なされることは理解されるであろう。

ＦＩＧ、２ＡＦＩＧ、２Ｂ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．実質的に天然の混入物を含まないメチオニンＮα−アセチルトランスフェラーゼ。
２．改変されたメチオニンＮα−アセチルトランスフェラーゼを発現する細胞。
３．酵母細胞である請求項２の細胞。
４．ａａａ１Ｎα−アセチルトランスフェラーゼ活性が実質的に欠失している請求項３の酵母細胞。
５．ＡＡＡ１遺伝子のａａａ１−１またはａａａ１−２対立遺伝子を含有する請求項４の酵母細胞。
６．メチオニンＮα−アセチルトランスフェラーゼをコードする組換え分子。
７．請求項６の組換え分子を発現する細胞。
８．メチオニンＮα−アセチル化アミノ末端を欠くペプチドの生産方法であって、酵母メチオニンＮα−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子中に、メチオニンＮ α−アセチルトランスフェラーゼ活性の実質的な欠失を齎し、その変異を有する酵母細胞が該ペプチドの該Ｎα−アセチル化を触媒することを不可能にする変異を有する酵母細胞中で、該ペプチドを発現させることからなる方法。
９．ａ，メチオニンＮα−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子中に、メチオニンＮα−アセチルトランスフェラーゼ活性の実質的な欠失を齎し、その変異を有する酵母細胞がペプチドまたはタンパク質のＮα−アセチル化を触媒することを不可能にする変異を有する酵母細胞中で、あるペプチドまたはタンパク質を発現させ；ｂ．該ペプチドまたはタンパク質を回収し；ｃ．該ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を決定する；ことからなる、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列決定法。