JPH0641194A

JPH0641194A - ソマトスタチン類似体

Info

Publication number: JPH0641194A
Application number: JP3072935A
Authority: JP
Inventors: Andrew V Schally; ブイシャリーアンドリュー; Tamas Janaky; ジャナキータマス; Ren Zhi Cai; チーカイレン
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1991-04-05
Publication date: 1994-02-15
Also published as: AU638118B2; EP0450480A2; YU62091A; HU211612A9; ATE124054T1; NZ237704A; IE65825B1; CA2039880A1; DE69110519D1; IE911133A1; HRP921276A2; HUT59165A; EP0450480A3; HU911117D0; GR3017298T3; DK0450480T3; ES2075244T3; EP0450480B1; MC2266A1; DE69110519T2

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト癌性腫瘍の成長に影響を及ぼしているソ
マトスタチン類似体を得る。【構成】下記の式に示される構造を有する化合物。【化１】ただし、Ｒ^１はL-またはD-Phe 、D-Trp 、L-またはD-Me
l であり、Ｒ^３は Mel、 Tyrまたは Pheであり、Ｒ^６は
Thrまたは Valであり、Ｒ^８は Thr、 Trp、または Mel
であり、Ｑは水素、L およびD-Mel 、Mel-Mel のジペプ
チド、シクロプロパンアルカノイル、アジリジン−２−
カルボニル、メトトレキソイル、１，４−ナフトキノン
−５−オキシカルボニルエチル、エポキシアルキルおよ
びこれらのΩ−カルボニル−アルキルアミノ誘導体、お
よびΩ−カルボニル−アルカノイル誘導体である（Ω−
カルボニル−アルキルアミノ基は -CO-(CH₂) _n-NH-
（ nは２〜６）の構造を有し、Ω−カルボニル−アルカ
ノイル基は -CO-(CH₂) _n-CO-（ nは２〜６）の構造を
有する）。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【ソマトスタチン類似体】本発明は、Ｎ．Ｃ．Ｉ．（Ｎ
ＩＨ）によって認められた、付与番号ＣＡ４００７７で
政府の支持の元で作成されたものである。アメリカ合衆
国政府は、本出願に特定の権利を有している。

【０００２】

【発明の分野】本発明には、ヒトにおける癌性腫瘍の成
長に影響を及ぼしている新規なペプチドに関するもので
ある。さらに詳しく述べると、本発明は、細胞毒性部分
を有し、下垂体の成長ホルモンの分泌を阻害し、さらに
抗腫瘍性効果(antineoplasticeffect) を有しているソ
マトスタチン（成長ホルモン放出抑制ホルモン）の短
い、環状の類似体、およびこれらの塩、およびこれらの
類似体を使用した薬組成物および方法に関するものであ
る。

【０００３】

【発明の背景】本発明は、細胞毒性部分を有し、哺乳類
の下垂体の成長ホルモンの放出に影響を及ぼしており、
抗腫瘍化効果(antineoplastic effect) を有する新規な
短い、環状のソマトスタチン類似体に関するものであ
る。以下の構造を有するテトラデカペプチドソマトスタ
チン（ＳＳ−１４）は、成長ホルモン放出阻害剤であ
り、この結果、阻害特性、すなわち膵臓インシュリンや
グルカゴンの分泌に関する広範囲なスペクトルを有する
ことが示されている。

【０００４】

【化３】

【０００５】ソマトスタチン類似体に関する構造解析お
よび構造−機能研究によって、生化学的活性に必要な配
列はソマトスタチンの７〜１０残基であるPhe-Trp-Lys-
Thrのβターン断片からなることが示された（ディー
ベーバー(D.Veber) ら、ネイチャー(Nature)（ロンド
ン）、第２８０巻、ページ５１２、（１９７９）および
ディーベーバー(D.Veber) ら、ネイチャー(Nature)
（ロンドン）、第２９２巻、ページ５５、（１９８
１））。特異的な活性の向上した長期間安定な活性を有
する化合物が探索され、多くの短い、環状のソマトスタ
チン類似体が開発された。ベーバー(Veber) らは、ソマ
トスタチンの１４アミノ酸のうちの９番目を１つのプロ
リンまたはN-MeAla （シクロ[Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-P
he] およびシクロ[N-MeAla-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe] ）
に置換することによって得られる環状ヘキサペプチド類
似体の合成および優れた阻害活性を報告している。さら
に、新規なヘキサペプチド、シクロ(N-MeAla-Tyr-D-Phe
-Lys-Val-Phe) で合成された同様の基を用いても、高い
活性が得られた（ディーベーバー(D.Veber) ら、ライ
フサイエンス(Life Sci.) 、第３４巻、ページ１３７１
（１９８４））。バウアーら（ライフサイエンス(Lif
e Sci.) 、第３１巻、ページ１１３３（１９８２））
は、ソマトスタチンの他の種類の高い活性を有するオク
タペプチド類似体を合成した。これらのうち最も活性の
ある類似体は、D-Phe-Cys-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OLで
あった。我々は、これらの化合物に関する３００近いオ
クタペプチドアミド類似体を開発した（アールゼット
カイら、プロシーディングオブナショナルアカ
デミーオブサイエンス(Proc. Natl. Acad. Acad. S
ci.) Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８３巻、ページ１８９６，１９
８６年およびアールゼットカイら、プロシーディン
グオブナショナルアカデミーオブサイエンス
(Proc. Natl. Acad. Acad. Sci.) Ｕ．Ｓ．Ａ．、第８
４巻、ページ２５０２，１９８７年）。これのうち２つ
の化合物、 [D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH
₂およびD-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂]
がＧＨ放出阻害テストにおいてソマトスタチの１００倍
以上の活性があり、長期間安定した活性を示した。

【０００６】様々な研究によって、末端肥大症、インス
リノーマやグルカゴノーマ等の内分泌膵臓腫瘍、ガスト
リノーマ等の異所性腫瘍、およびＶＩＰ産生腫瘍にかか
っている患者におけるソマトスタチンの阻害効果が報告
されている。しかしながら、ソマトスタチンは、ソマト
スタチンの多様な作用、短期間の抗分泌効果、つまり循
環している際の半減期が約３分であるため、癌治療にお
ける治療効果がほとんどない（エーブイシャリー
(A.v.Schally) ら、アニュアルレビューオブバイオ
ケミストリー(Annu. Rev. Biochem.) 、第４７巻、ペー
ジ８９（１９７８））。ベーバー(Veber) らの仕事（１
９７９〜１９８４年）は、明らかに尿崩症Ｉ型の治療の
ための類似体を生産することを目的とするものであり、
これらの類似体は種々の動物腫瘍モデルにおいて抗腫瘍
活性を示さなかった（エーブイシャリー(A.v.Schall
y) ら、プロシソサエックスプバシオロメド(Pr
oc. Soc. Exp. Biol. Med.)、第１７５巻、ページ２５
９（１９８４））。バウアーの類似体（サンドスタチン
(Sandostatin) ）を注意深く臨床評価した（ピーマーバ
ック(P.Marbach) ら、（１９８５）、プロシシンポ
ソマトスタチン(Proc. Symp. Somatostatin)中、モント
リオール、カナダ、１９８４、著ワイシーパテル
アンドジーエスタンネンバウム(Y. C. Patel &
G. S. Tannenbaum)、エルセヴィアー(Elsevier)、アム
ステルダム、ページ３３９）。これによると、末端肥大
症、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノー
マ、ＶＩＰ産生腫瘍等の転移性の内分泌膵臓および胃腸
の腫瘍、および癌様体腫瘍の医療処置における治療材料
となると思われる（エーブイシャリー(A.v.Schall
y) ら、ニュウラルアンドエンドクラインペプチ
ドアンドレセプター(Neural and Endocrine Peptid
es and Receptors) 中、著、ティーダブルムーディ
(T. W. Moody) 、プレナムパブリッシングコーポレ
ーション(Plenum Publishing Corp.) 、ニューヨーク、
１９８６、ページ７３）。

【０００７】最近のソマトスタチン類似体を、ある種の
腫瘍の処置に使用し、さらには胸部癌におけるＬＨ−Ｒ
Ｈ類似体を用いた処置の付加物として使用することも示
されてきた（エーブイシャリー(A.v.Schally) ら、
カンサーリサーチ(CancerRes.) 、第４８巻、ページ
６９７７（１９８８））。

【０００８】理想とする抗癌剤は、理論的には、正常な
細胞を傷つけずに癌細胞を根絶するものである。抗腫瘍
化剤を含むホルモンは、レセプター含有腫瘍をターゲッ
トにした化学療法をより効率的に行うことによって問題
を解決する。ホルモンの配列中に導入しあるいは連結し
た細胞毒性基を有するホルモン類似体をターゲットとす
るため、ホルモンレセプターを有する腫瘍組織をより特
異的に殺すことが可能となった。ホルモン−薬複合体の
理想的な作用メカニズムは、上記複合体が細胞膜のレセ
プターに結合した後、ハイブリッド分子のインターナリ
ゼーションがおこり、薬または生化学的に活性化された
誘導体がエンドソームまたは二次リソソーム中の担体ホ
ルモンから放出されるものである。さらに、このように
放出された物質は、小胞膜を通ってサイトゾルにいき、
最終的なターゲット部位に到達する。このようなメカニ
ズムによって効果のある複合体では、薬とホルモン間の
結合は、ターゲットとする腫瘍細胞中への複合体のイン
ターナリゼーション前は安定でなければならないが、こ
のインターナリゼーション後は効果的に切断されなけれ
ばならない。

【０００９】高あるいは低親和性ソマトスタチンレセプ
ターは、様々なヒト組織、ヒト脳および下垂体の腫瘍、
ホルモン産生胃腸腫瘍、胸部、膵臓、前立腺および卵巣
癌において発見されてきた（ディーレイチリン(D.Rei
chlin)、エヌイングジェーメド(N. Engl. J. Me
d.)、第３０９巻、ページ１４９５（１９８３）、エー
ブイシャリー(A.v.Schally) 、カンサーリサーチ(C
ancer Res.) 、第４８巻、ページ６９７７（１９８
８））。ビグエリーエヌ(Viguerie, N.)ら、アメリカ
ンジャーナルオブフィジオロジー(Am. J. Physio
l.) 、第２５２巻、：Ｇページ５３５〜５４２、１９８
７年によると、レセプター結合ソマトスタチンは膵臓腺
房によって取り込まれ、分解されることが示された。

【００１０】この概念によると、細胞毒性ラジカルを含
むソマトスタチン類似体は、ソマトスタチン類似体の直
接あるいは間接的な抗腫瘍効果を発揮すると同時に、化
学的治療剤の担体としての役割を果たす。このようなペ
プチドは、特定のレセプターに結合できるので、化学的
治療化合物に対して特定のターゲット選択性を有し、非
特異的な毒性が減少した「細胞特異的」となることがで
きる。インターナリゼーション後、これらのハイブリッ
ド化合物は細胞の反応を阻害し、細胞を死に至らしめ
る。

【００１１】臨床で抗癌剤中に使用されている数種の化
合物は、担体ペプチド分子に連結することができる。こ
の連結は、細胞毒性部分の適当に修飾された官能基やペ
プチドの遊離アミノ−もしくはカルボキシル−基を通し
て行われる。

【００１２】癌治療において使用されているアルキル化
剤は、基本的に非選択的作用メカニズムを示す。これら
のアルキル化剤は、アルキル基を種々の細胞構成成分に
運搬することによって細胞毒性効果を発揮することによ
って作用するものである。核内におけるＤＮＡのアルキ
ル化は、細胞を死滅させるような主要な相互作用を生じ
させていると考えられる。しかし、物理学的条件下で
は、アルキル化剤がイオン化されたカルボキシル基およ
びリン酸基、ヒドロキシル基、チオールおよび電荷され
ていない窒素部分等のすべての細胞求核性試薬をアルキ
ル化することができる。ナイトロジェンマスタード類
（クロラムブシル、シクロホスファミド、およびメルフ
ァランおよびナイトロジェンマスタード）は、臨床に使
用されている最も古い抗癌剤である。これらは、すべ
て、分子内環化によって三環状のアジリジニウム（エチ
レニモニウム(ethylenimonium)）のカチオン誘導体を形
成しており、直接あるいはカルボニウムイオンの形成を
通じて、アルキル基を細胞求核性試薬に運んでいる。チ
オ−ＴＥＰＡ様の薬を含んでいるアジリジン部分は、同
様のメカニズムによって作用している。

【００１３】アルキル化メルファラン（４−［ビス｛２
−クロロエチル｝アミノ］−フェニルアラニン(4-[bis
{2-chloroethyl}amino]-phenylalanine））をアンギオ
テンシンIIに導入することによって、強力に競合する拮
抗剤となり、類似体がレセプターをアルキル化しないこ
とを明白に示している（ケーエッチシー(K. H. Hsi
eh) およびジーアールマーシャル(G. R. Marshal
l)、ジャーナルオブメディカルケミストリー(J.
Med. Chem.) 、第２４巻、ページ１３０４〜１３１０、
１９８１）。

【００１４】ヒトの胸部癌細胞株Ｔ−４７Ｄおよびラッ
ト乳腺腫瘍細胞株ＭＴ−４およびＭＴ−５の培養におけ
る高い細胞毒性活性（ [³H]チミジン導入阻害）が、Ｌ
ＨＲＨ類似体を含むD-メルファランによって示された。

【００１５】すべての臨床に使用されているアルキル化
剤のほとんどは、二価性であり、２つの別個の分子を架
橋し、または１分子の２か所の別の細胞求核部位をアル
キル化することができる。このＤＮＡとの架橋は、タン
パク質等の１本鎖内、２本の相補的鎖間、またはＤＮＡ
および他の分子間にある。アルキル化剤の細胞毒性は架
橋効果と相関性があると考えられている（ジェージェ
ーロバート(J.J.Roberts) ら、アドバラジアトバ
イオロ(Adv. Radiat. Biol.)、第７巻、ページ２１１〜
４３５、１９７８）。

【００１６】シスプラチン（シス−ジアミンジクロロプ
ラチナム(cis-diaminedichloroplatinum) ）は、長い間
癌の治療に用いられてきた物質である。側鎖の構造に関
するシスプラチンとのＬＨＲＨの類似体は、ラットの下
垂体およびヒトの胸部癌細胞の膜レセプターと高い親和
性を有する（エスバジャスツ(S.Bajusz)ら、プロシー
ディングオブナショナルアカデミーオブサイ
エンス(Proc. Natl. Acad. Acad. Sci.) Ｕ．Ｓ．
Ａ．、第８６巻、ページ６３１３〜６３１７，１９８
９）。細胞毒性のある銅（II）およびニッケル（II）錯
体を適当に修飾されたＬＨＲＨの類似体に導入すること
によって、高いホルモン活性およびヒトの胸部癌細胞膜
上のＬＨＲＨレセプターとの親和性を有する化合物とな
る。多くのこれらの金属ペプチドは、ヒトの胸部および
前立腺細胞株に対するインヴィトロ（ｉｎｖｉｔｒ
ｏ）の細胞毒性活性を有する。具体的には、 pGlu-His-
Trp-Ser-Tyr-D-Lys[Ahx- A₂bu(SAL) ₂(Cu)]-Leu-Arg-
Pro-Gly- NH ₂は、 [³H]チミジンのヒト乳腺細胞株Ｍ
ＤＡ−ＭＢ−２３１への導入を１０μｇの投与量で８７
％阻害する。

【００１７】多くの代謝拮抗剤は、細胞葉酸塩代謝にお
いて重要であるため、潜在的に化学治療のためには有効
である（アイディーゴールドマン(I.D.Goldman)
ら、著、フォリルアンドアンチフォイルポリグル
タメイト(Folyl and AntifolylPolyglutamates.) 、プ
レナムプレス(Plenum press)、ニューヨーク、１９８
３）。メトトレキセート、｛Ｎ−［ｐ［［（２，４−ジ
アミノ−６−プリテジニル）メチル］メチルアミノ］ベ
ンゾイル］｝−グルタミン酸（{N-[p[[(2,4-diamino-6-
pteridinyl)methyl]methylamino]benzoyl]}-glutamic a
cid ）は、ジヒドロ葉酸レダクターゼの機能を阻害する
葉酸拮抗剤であり、このようにしてチミジル酸、プリン
塩基、およびセリン、メチオニンのアミノ酸の合成を阻
害し、これによってＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質
の形成を阻害する。

【００１８】

【発明の概要】本発明は、高い作用活性を有し、ペプチ
ド配列中に導入され、もしくはペプチド鎖に連結された
細胞毒性部分、例えば、ナイトロジェンマスタード、代
謝拮抗剤、三員環部分、キノン類、抗腫瘍抗体、白金複
合体、あるいはチタン、バナジウム、鉄、銅、コバル
ト、金、およびニッケル、カドミウム、亜鉛等の遷移金
属を含む無機あるいは有機金属化合物によって表される
非白金族金属性抗腫瘍剤由来の金属の複合体等の細胞毒
性部分、または上記の金属の複合体として導入された細
胞毒性化合物を有する短い、環状のソマトスタチン類似
体に関するものである。

【００１９】本発明の化合物に係わるは、式Ｉに表され
るものおよびこれらの薬学上許容可能な酸や塩基との塩
である。

【００２０】

【化４】

【００２１】ただし、Ｒ^１は Phe、 Mel、 Trp、 Thr、
Val、 Gly、 Ala、 Serよりなる群から選ばれたL-、D
-、またはDL- アミノ酸であり、Ｒ^２およびＲ^７はL-、D
-、またはDL- システインであり、Ｒ^３は Tyr、 Phe、
Melよりなる群から選ばれたL-、D-、またはDL-アミノ酸
であり、Ｒ^６は Thrまたは Valであり、Ｒ^８は Thr、 T
rp、 Mel、 Val、 Pro、 Tyr、 Ala、 Gly、 MeAlaより
なる群から選ばれたL-、D-、またはDL- アミノ酸であ
り、Ｑは水素、L およびD-Mel 、Mel-Mel のジペプチ
ド、シクロプロパンアルカノイル(cyclopropanealkanoy
l)、アジリジン−２−カルボニル(aziridine-2-carbony
l)、メトトレキソイル(methotrexoyl)、１，４−ナフト
キノン−５−オキシカルボニルエチル(1,4-naphthoquin
one-5-oxycarbonylethyl) 、エポキシアルキルおよびこ
れらのΩ−カルボニル−アルキルアミノ誘導体 ( Ω-c
arbonyl-alkylamino derivative)；および２−ヒドロキ
シメチルアントラキノン(2-hydroxymethyl-anthraqui
none) 、ドキソルビシン、エスペラマイシン(esperamyc
in) 、およびマイトマシンＣのΩ−カルボニル−アルカ
ノイル誘導体 ( Ω-carbonyl-alkanoyl derivative)で
あり；この際、Ω−カルボニル−アルキルアミノ基 (
Ω-carbonyl-alkylamino group) は下記の式に示す構造
を有し、 -CO-(CH₂) _n-NH- （ nは２〜６） Ω−カルボニル−アルカノイル基 ( Ω-carbonyl-alka
noyl group)は下記の式に示す構造を有するものであ
る。

【００２２】-CO-(CH₂) _n-CO- （ nは２〜６）本発明の概念における残りの化合物は、式ＩＩに表され
るものおよびこれらの薬学上許容できる酸および塩基と
の塩である。

【００２３】

【化５】

【００２４】ただし、Ｒ^１は Phe、 Trp、 Thr、 Val、
Gly、 Ala、 Serよりなる群から選ばれたL-、D-、また
はDL- アミノ酸であり、Ｒ^２およびＲ^７はL-、D-、また
はDL- システインであり、Ｒ^３は Tyr、 Pheよりなる群
から選ばれたL-、D-、またはDL- アミノ酸であり、Ｒ^６
は Thrまたは Valであり、Ｒ^８は Thr、 Trp、 Val、 P
ro、 Tyr、 Ala、 Gly、 MeAlaよりなる群から選ばれた
L-、D-、またはDL- アミノ酸であり、Ａは下記の式に示
される構造を有するジアミノアシル、好ましくはジアミ
ノアルカノイル残基であり、-HN-CH₂-(CH₂) _m-(HN)C
H- (CH₂) _n-CO- III （ mは０または１、 nは０
または１）であり、Ｑ¹は下記の式に示される構造を有
する細胞毒性部分であり、Ｑ²（IV) または（Ｂ）₂Ｑ³(V) または（Ｑ⁴）₂(V
I) ただし、Ｑ²はＰｔ（Ｙ）₂（Ｙは薬学上許容できる酸
のアニオンである）であり、Ｑ³はチタン、バナジウ
ム、鉄、銅、コバルト、金、ニッケル、カドミウムおよ
び亜鉛等の非白金族金属であり、Ｑ⁴はL またはD-Mel
、Mel-Mel のジペプチド、シクロプロパンアルカノイ
ル(cyclopropanealkanoyl)、アジリジン−２−カルボニ
ル(aziridine-2-carbonyl)、エポキシアルキル、１，４
−ナフトキノン−５−オキシカルボニル−エチル(1,4-n
aphthoquinone-5-oxycarbonyl-ethyl)、またはこれらの
Ω−カルボニル−アルキルアミノ誘導体 ( Ω-carbony
l-alkylamino derivative)；および２−ヒドロキシメチ
ル−アントラキノン(2-hydroxymethyl-anthraquinone)
、ドキソルビシン、エスペラマイシン(esperamycin)
、およびマイトマシンＣのΩ−カルボニル−アルカノ
イル誘導体 ( Ω-carbonyl-alkanoyl derivative)であ
り、この際、Ω−カルボニル−アルキルアミノ基 ( Ω
-carbonyl-alkylamino group) は下記の式に示す構造を
有し、 -CO-(CH₂) _n-NH- （ nは２〜６） Ω−カルボニル−アルカノイル基 ( Ω-carbonyl-alka
noyl group)は下記の式に示す構造を有し、 -CO-(CH₂) _n-CO- （ nは２〜６）Ｂはハロおよびニトロフェニル低級アルキリデン類か
らなる群より選ばれた置換アラルキリデンまたはヘテロ
アラルキリデン；低級アルキルヒドロキシメチルまた
はフォスフォキシメチルピリジル低級アルキリデン
類（低級アルク(alk-)は炭素数１〜６である）である。

【００２５】官能基を含む置換酸素は部位２の位置であ
り、また、Ａのアミノ基とシッフ塩基を形成し、負に電
荷された酸素によって金属イオンと結合できる置換され
たあるいは置換されないサルチルアルデヒド(salicylal
dehyde) 、ピリドキサル(pyridoxal) 、ピリドキサル−
フォスフェート(pyridoxal-phosphate) 等の２−ヒドロ
キシ−１−オキソ化合物由来のこれらの環状化合物が特
に好ましい。

【００２６】式Ｉの化合物は、固相法または固相技術と
古典(classical) （溶液）合成との組み合わせによって
調製することができる。また、式Ｉの化合物は、式VIIA
の中間ペプチドより調製されることが好ましい。

【００２７】

【化６】

【００２８】ただし、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^６、Ｒ^７お
よびＲ^８は上記した通りであり、Ｘ^１は式Ｉがオクタペ
プチドである際は水素または炭素数２〜５のアシル基で
あり、または、式Ｉがノナペプチドまたはデカペプチド
である際には Mel、Azy、または Mel-Melであり、Ｘ^２
およびＸ^７は水素または Cysのスルフヒドリル基の保護
基であり、Ｘ^５は水素または Lysのε−アミノ基の保護
基であり、Ｘ^８は水素または Tyrのフェノール性ヒドロ
キシル基の保護基であり、Ｘ^９は水素または樹脂中に導
入されるベンズヒドリル基である。

【００２９】式IIのペプチドは、固相法によって合成さ
れることができる。式 VIIIAの中間ペプチドより調製さ
れることが好ましく、適度に保護されたＡでアシル化さ
れることによって式 VIIIA（Ｘ^１は水素である）のペプ
チド−樹脂より得られるものである。

【００３０】

【化７】

【００３１】ただし、Ａ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ
^６、Ｒ^７およびＲ^８は上記した通りであり、Ｘがジアミ
ノ酸の保護基である。

【００３２】式VIIAおよび VIIIAの構造を有する化合物
は、式Ｉの環状化合物を調製する工程における中間体で
ある。Ｒ^２とＲ^７との間の架橋は、部位２および７残基
の特性に依存しているジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ
−）、炭素／硫黄架橋（−Ｃ−Ｓ−）または炭素／炭素
架橋（−Ｃ−Ｃ−）である。環化反応は、脱保護後に行
われ、式VIIBおよび VIIIBの化合物を生じる：

【００３３】

【化８】

【００３４】ただし、Ａ、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ
^６、Ｒ^７およびＲ^８は上記した通りであり、Ｘ^５が水素
または Lys側鎖アミノ基の保護基である。

【００３５】Ｑ¹が細胞毒性部分としてＱ²（すなわち
ＰｔＣｌ₂）であり、式 VIIIB（Ｘ^５が水素である）の
ペプチドをＫ₂ＰｔＣｌ₄と反応させることよりなる式
IIの構造を有する金属ペプチドの調整工程は、必要とあ
れば、公知の方法によってＰｔＹ₂に転換することもで
きる。

【００３６】Ｑ²が（Ｂ）₂Ｑ³である式IIの化合物の
製造方法は、式VIIIB （Ｘ^５が水素である）のペプチド
をヒドロキシ−オキソＱ³化合物と非白金族金属から
予め形成された複合体と本来の位置において（in situ
）反応させることよりなる。

【００３７】Ｑがシクロプロパンアルカノイル(cyclopr
opanealkanoyl)、エポキシアルキル、１，４−ナフトキ
ノン−５−オキシカルボニルエチル(1,4-naphthoquinon
e-5-oxycarbonylethyl) 、またはメトトレキソイルであ
る式Ｉの化合物は、アルキル−またはアルカノイルハ
ライド、メトトレキセートを用いて式VIIB（Ｘ^５が Boc
またはFMOC基である）の化合物をアルキル化またはアシ
ル化することによって得られる。細胞毒性部分がアント
ラキノン、ドキソルビシン、エスペラマイシン(esperam
ycin) 、またはマイトマシンＣである式Ｉのペプチドの
合成は、二官能性のスペーサー基によって式VIIBの化合
物にこれらの化合物を連結させることによって行われ
る。

【００３８】薬組成物は、効果を遅らせるために、式Ｉ
および式IIの化合物をマイクロカプセル（微粒子(micro
spheres)）を含む薬学上使用することのできる担体と混
合することによって調製される。

【００３９】本発明の細胞毒性化合物は、成長ホルモン
の放出を阻害することが示され、また、インシュリン、
グルカゴン、ガストリン、セクレチン、コレシストキニ
ンの親ペプチドが同様に考えられたようにこれらの放出
が阻害されると考えられてきた。このように、腫瘍組織
の成長が親ペプチド、さらにはこれらに含まれている細
胞毒性部分によって制御されているホルモンの１つによ
ってコントロールされていることによって、前立腺癌、
乳癌、インスリノーマ、ガストリノーマ、軟骨肉腫、骨
肉種、膵管腫瘍、腺房腫瘍、胃癌、結腸癌、ある種の肺
癌や脳腫瘍等のホルモン感受性腫瘍の治療効果が向上す
る。

【００４０】細胞毒性基を含まない我々の化合物のうち
２化合物が、バウアーの類似体のよりＧＨ放出阻害活性
が強く、また、ラットにおけるインシュリンやグルカゴ
ンに対する阻害効果が小さい。我々の化合物のうち１化
合物が、実験ダンニングＲ３３２７のラットにおける前
立腺癌、ハムスターにおける膵臓癌、マウスにおけるＭ
ＸＴ胸部癌の成長を阻害することが示され、胸部癌、骨
肉種、軟骨肉種、膵臓および胃腸悪性腫瘍およびＧＨ分
泌下垂体腫瘍およびある種の腺癌の処置において治療効
果がある。近年のソマトスタチン類似体のレセプター結
合に関する研究によって、癌に対する正常組織において
のみならずさまざまな腫瘍中のソマトスタチンレセプタ
ー間で相違があることが発見された。

【００４１】

【好ましい実施態様の記載】本発明を簡単に記載するた
めに、通常ペプチド技術として使用されていたり、ＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢコミッションオンバイオケミカル
ノーメンクラチャー(IUPAC-IUB Commission on Bioch
emical Nomenclature)によって推奨されている［ヨーロ
ピアンジャーナルオブバイオケミストリー(Europ
ean. J. Biochem.) 、第１３８巻、ページ９〜３７（１
９８４）］アミノ酸、ペプチド、およびこれらの誘導体
の従来技術は省略する。

【００４２】個々のアミノ酸残基は、アミノ酸の普通名
称、例えば、pGluはピログルタミン酸、His はヒスチジ
ン、Trp はトリプトファン、Ser はセリン、Tyr はチロ
シン、Lys はリシン、Leu はロイシン、Arg はアルギニ
ン、Pro はプロリン、Gly はグリシン、Ala はアラニ
ン、Phe はフェニルアラニンというように省略する。ア
ミノ酸残基が同質異性体である際には、特に記載のない
限りＬ−体のアミノ酸を表している。

【００４３】本発明において通常使用されないアミノ酸
については、以下のようにして省略する： Melは、４−
［ビス（２−クロロエチル）アミノ］−フェニルアラニ
ン(4-[bis(2-chloroethyl)amino]-phenylalanine) 、 A
₂prは、２，３−ジアミノプロピオニン酸(2,3-diamino
propionic acid) である。

【００４４】ペプチド配列は、N-末のアミノ酸が左側に
あり、C-末のアミノ酸が右側にあるという従来に方法に
よって記載されている。

【００４５】他の省略事項に関しては、以下の通りであ
るＡｃＯＨ酢酸Ａｃ₂Ｏ無水酢酸Ａｚｙアジリジン−２−カルボニル(aziri
din-2-carbonyl) Ｂｏｃｔ−ブトキシカルボニル(tert.buto
xycarbonyl) Ｂｚｌベンジル(benzyl) ＣＩＳＡＬ５−クロロ−２−Ｏ−１−ベンジリ
デン(5-chloro-2-O-1-benzylidene) ＤＣＢ２，６−ジクロロベンジル(2,6-dic
hlorobenzyl) ＤＣＣＮ，Ｎ´−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド(N,N, -dicyclohexylcarbodiimide) ＤＣＭジクロロメタンＤＩＣＮ，Ｎ´−ジイソプロピルカルボジ
イミド(N,N, -diisopropylcarbodiimide) ＤＭＦジメチルホルムアミドＤＯＸドキソルビシニル（アドリアマイシ
ン）ＥＰＰエポキシ−プロピルＦＭＯＣ９−フルオレニルメチルオキシカル
ボニル(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) ＥＳＰエスペラマイシニル(Esperamyciny
l) ＨＭＡＱＧアントラキノン−２−メチル−ヘミ
グルタレート(anthraquinone-2-methyl-hemiglutarate) ＨＯＢｔ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
(1-hydroxybenzotriazole) ＨＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーＭＢｚｌメチルベンジル(methylbenzyl) ＭｅＣＮアセトニトリルＭｅＯＨメタノールＭＩＴマイトマイシンＣ−イル(Mitomycin
C-yl) ＭＴＸメトトレキセオイル（アメトプテリ
ン(amethopterin)）ＮＱＣＥ１，４−ナフトキノン−５−オキシ
カルボニルエチル(1,4-naphthoquinone-5-oxycarbonyle
thyl) ＰＯＬ 2-メチル-3-O-5- ヒドロキシメチル
-4- ピコリリデン(2-methyl-3-O-5-hydroxymethyl-4-pi
colylidene) ＰＯＬＰ 2-メチル-3-O-5- フォスフォキシメ
チル-4- ピコリリデン(2-methyl-3-O-5-phosphoxymethy
l-4-picolylidene) ＳＡＬ２−Ｏ−１−ベンジリデン(2-O-1-b
enzylidene) ＴＥＡトリエチルアミンＴＦＡトリフルオロ酢酸Ｔｒｔトリチル(trityl) ＺベンジルオキシカルボニルＺ（２−Ｂｒ）２−ブロモベンジルオキシカルボニ
ル(2-bromobenzyloxycarbonyl) Ｚ（２−Ｃｌ）２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル(2-chlorobenzyloxycarbonyl) 式Ｉのソマトスタチン類似体が特に好ましい。

【００４６】

【化９】

【００４７】ただし、Ｒ^１はL-またはD-Phe 、D-Trp 、
L-またはD-Mel であり、Ｒ^３は Mel、 Tyr、または Phe
であり、Ｒ^６は Thrまたは Valであり、Ｒ^８は Thr、 T
rp、または Melであり、Ｑは水素、L およびD-Mel 、Me
l-Mel のジペプチド、シクロプロパンカルボニル(cyclo
propanecarbonyl)、アジリジン−２−カルボニル(aziri
dine-2-carbonyl)、１，４−ナフトキノン−５−オキシ
カルボニルエチル(1,4-naphthoquinone-5-oxycarbonyle
thyl) 、エポキシアルキルおよび２−ヒドロキシメチル
−アントラキノン(2-hydroxymethyl-anthraquinone) 、
ドキソルビシン、エスペラマイシン(esperamycin) 、お
よびマイトマシンＣのΩ−カルボニル−アルカノイル誘
導体 ( Ω-carbonyl-alkanoyl derivative)である。

【００４８】短い、環状のソマトスタチン類似体の配列
に連結した細胞毒性ラジカルを含む式IIの構造を有する
化合物もまた、特に好ましい。

【００４９】

【化１０】

【００５０】ただし、Ｒ^１はL-またはD-Phe 、L-または
D-Trp であり、Ｒ^３は Pheまたは Tyrであり、Ｒ^６は V
alまたは Thrであり、Ｒ^８は Thrまたは Trpであり、Ａ
はＡ₂ｐｒであり、下記の式に示される構造を有する細
胞毒性部分の好ましい実施態様については、Ｑ² また
は（Ｂ）₂Ｑ³ または（Ｑ⁴）₂ただし、Ｑ²は
ＰｔＣｌ₂であり、Ｑ³はＣｕ⁺⁺またはＮｉ⁺⁺であり、
ＢはＳＡＬ、ＣＩＳＡＬ、ＰＯＬまたはＰＯＬＰであ
り、Ｑ⁴はL またはD-Mel 、１，４−ナフトキノン−５
−オキシカルボニルエチル(1,4-naphthoquinone-5-oxyc
arbonylethyl) 、エポキシアルキル、アントラキノン
アルコキシ、アジリジン−２−カルボニル(aziridine-2
-carbonyl)、およびシクロプロパンカルボニル(cyclopr
opanealkanoyl)である。

【００５１】特に、最も好ましい実施態様を表１および
表２に示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】

【表２】

【００５４】すべての上記した実施態様において、化合
物は、薬学上使用可能な有機もしくは無機の酸あるいは
塩基を添加した塩等としても調製できる。その実施例と
しては、以下の塩を挙げることができる：ハイドロクロ
ライド、ハイドロブロマイド、硫酸塩、リン酸塩、フマ
ル酸塩、グルコン酸塩、タンニン酸塩、マレイン酸塩、
酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、アルギ
ン酸塩、パーモエート(pamorate)、リンゴ酸塩、アスコ
ルビン酸塩、酒石酸塩および同様にアルカリおよびアル
カリ土類金属塩。ただし、上記したものに限定されるこ
とはない。

【００５５】

【アッセイ方法】本発明の化合物は、下垂体からの成長
ホルモン（ＧＨ）の放出に関して強い効果を示し、腫瘍
細胞膜に結合し、ある種の腫瘍細胞の細胞培養および成
長時における［³Ｈ］チミジンのＤＮＡへの取り込みを
阻害する。

【００５６】（ａ）成長ホルモン放出阻害活性インビトロ(in vitro)のＧＨおよびプロラクチン放出に
対する化合物の効果は、超融合(superfused)したラット
の下垂体細胞システムを用いることによってアッセイさ
れる［エスヴァイ(S.Vigh)およびエーブイシャリ
ー(A.V.Schally) 、ペプチド(Peptides)、第５版、第１
巻、ページ２４１〜２４７（１９８４）］。ホルモン
放出阻害効果を測定するために、それぞれのペプチドを
１ｎＭのＧＨＲＨと共に２０〜５００ｐＭの濃度で３分
間（１ｍｌ灌流液）、細胞を通じて灌流する。灌流液の
一定部分（アリクウォット(aliquot) ）中のラットのＧ
Ｈをラジオイムノアッセイ（放射線免疫検定法）（ニア
ムディック(NIAMDDK) 社製のＲＩＡキットを用いる）に
よって測定し、基礎のあるいは阻害された分泌量を測定
する。ペプチドの効果は、同様にして灌流された２５ｐ
Ｍのソマトスタチン（１〜１４）のときの値と比較す
る。

【００５７】（ｂ）レセプター結合ヒトの胸部癌細胞膜に対するペプチドの親和性を、¹²⁵
Ｉで標識された(Tyr¹¹) −ソマトスタチンを用いること
によって測定する。結合アッセイは、エムフェケテ
(M.Fekete)ら、ジェークリニラボアナル (J. Cri
n. Lab. Anal.)、第３巻、ページ１３７〜１４１（１９
８９）に記載されているのと同様にして行う。

【００５８】（ｃ）細胞毒性テスト本発明における化合物のインビトロ(in vitro)の細胞毒
性活性を、フィンレイ(Finlay)ら（アナルバイオケム
(Anal. Biochem.)、第１３９巻、ページ７２７（１９８
４））およびドーソン(Dawson)ら（ジャーナルオブ
インテーフェロンリサーチ(J. Interferon Res.)、第
６巻、ページ１３７（１９８６））の半自動化された方
法を修飾したものによって測定する。様々なヒト胸部癌
細胞株をＲＰＭＩ−１６４培地もしくはダルベッコ修飾
イーグル培地で培養した。ペプチドを１〜１０，０００
ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、細胞成長阻害効果（各分画の
生存％）を細胞を染色し、可溶化し、次に最適密度を測
定することによって定量化する。

【００５９】式Ｉのペプチドの単層培養の肺小細胞癌株
Ｈ−６９およびＭｉａＰａＣａ細胞株のＤＮＡへの［³
Ｈ］チミジンの導入阻害効果を、カーン(Kern)ら（カン
サーリサーチ(Cancer Res.) 、第４５巻、ページ５４３
６（１９８５））によって記載された方法によってアッ
セイする。

【００６０】

【ペプチド合成】本発明のペプチドは、ペプチドの技術
における当業者によってよく知られている方法によって
調製される。よく利用される技術の要旨は、エムボダ
ンスキー(M.Bodanszky) 、プリンプルオブペプチド
シンテシス(Principles of Peptide Synthesis) 、ス
プリンガー−バーラグ(Springer-Verlag) 、ハイデルベ
ルグ、１９８４に記載されている。古典(classical) 溶
液合成は、論文、「メソデンデルオルガニシュケ
ミー(Methoden der Organische Chemie)」（ホウベン−
ウェイル(Houben-Weyl) ）第１５巻、シンテスフォン
ペプチデン(Synthese von Peptiden) 、第１部および
第２部、ジョージティエメファーラグ(Georg Thiem
e Verlag) 、シュツトガルト(Stuttgart) 、１９７４に
詳細に記載されている。その他の固相合成技術は、ジェ
ーエムスチュワート(J.M.Stewart) およびジェー
ディーヤング(J.D.Young) 、ソリッドフェイズペ
プチドシンテシス(Solid Phase Peptide Synthesis) 、
ピアスケムコーポレーション(Pierce Chem Co.) 、
ロックフォード、イリノイ(IL)、１９８４（２版）の本
およびジーバラニー(G.Barany)ら、イントジェー
ペプチドプロテインレス(Int.J.Peptide Protein Re
s.)、第３０巻、ページ７０５〜７３９，１９８７の雑
誌に記載されている。

【００６１】本発明の中間ペプチドおよびメルファラン
を含むペプチドは、固相法によって合成される。固相合
成において、Ｃ末のアミノ酸を樹脂等の不活性固体支持
体におおよそ接触（連結）させた後、適当な保護アミノ
酸（または時には保護ペプチド）を段階的にＣ−−＞Ｎ
方向に添加する。連結工程が終了した後、Ｎ末の保護基
を新たに添加されたアミノ酸残基より取り除き、さら
に、次の新しいアミノ酸（適当に保護されている）を順
次添加していく。これらすべての目的とするアミノ酸が
適当な配列に連結された後、ペプチドを支持体より切断
し、配列中の残基をなるべく壊さないようにして、残り
の保護基より取り外していく。さらに、注意深く精製
し、目的とする構造が本当に目的とするものなのかを確
認するために、合成生成物の特性を調べなければならな
い。

【００６２】

【好ましい合成の実施態様】本発明の式Ｉの化合物を調
製する特に好ましい方法は、固相合成である。例えば、
０の位置に Melを有するペプチドは、この方法によって
調製されても、古典(classical) 方法によって（溶液中
で Boc-Melとオクタペプチド類似体を連結することによ
って）調製されてもよい。

【００６３】式Ｉのペプチドは、式VIIAの中間ペプチド
より調製されることが好ましい。

【００６４】

【化１１】

【００６５】ただし、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^６、Ｒ^７、
Ｒ^８およびＸ^１は上記した通りであり、Ｘ^２およびＸ^７
は Cysのスルフヒドリル基を保護するためのメチルベン
ジル（ＭＢｚｌ）であり、Ｘ^３は Tyrのフェノール性ヒ
ドロキシル基を保護するための２−Ｂｒ−ベンジルオキ
シカルボニル基(2-Br-benzyloxycarbonyl)［Ｚ（２−Ｂ
ｒ）］または２，６−ジクロロベンジル基(2,6-dichlor
obenzyl)（ＤＣＢ）であり、Ｘ^５は、 Lysの側鎖アミノ
基のＺ（２−Ｃｌ）またはＦＭＯＣ保護基であり、Ｘ^８
は Tyrのフェノール性ヒドロキシル基を保護するための
２−Ｂｒ−ベンジルオキシカルボニル基(2-Br-benzylox
ycarbonyl)［Ｚ（２−Ｂｒ）］または２，６−ジクロロ
ベンジル基(2,6-dichlorobenzyl)（ＤＣＢ）であり、Ｘ
^９は樹脂の支持体に導入されたアミド保護ベンゾヒドリ
ル基またはメチルベンゾヒドリル基であり、ペプチドア
ミドを合成するためには、市販のベンゾヒドリルアミノ
−ポリスチレン−２％ジビニルベンゼン共重合体が好ま
しい。

【００６６】式IIの構造を有する化合物を生産するため
に式 VIIIAのジアミノアシル基を含む中間ペプチドを調
製するために、固相ペプチド合成が特に好ましい方法で
ある。式 VIIIAの化合物は、式VIIA（Ｘ^１は水素であ
る）のペプチドを Boc₂ A₂prと連結することによって
得られ、さらに脱保護を行うことによって式IIのペプチ
ドを生じる。

【００６７】

【化１２】

【００６８】Ｒ^８、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^５、、Ｘ^７、Ｘ^８お
よびＸ^９は上記した通りであり、Ｘが A₂prのアミノ基
の Boc保護基である還元された式VIIAおよび VIIIAから式VIIBおよび VIIIB
の環状化合物を製造するために、希釈した酸性溶液中で
システインの２のスルフヒドリル基をヨウ素を用いて酸
化することが特に好ましい方法である。

【００６９】式VIIAのペプチドの固相合成は、Boc-保護
Thr、 Trpまたは MelをＣＨ₂Ｃｌ₂中でベンゾヒドリ
ルアミン樹脂に接触することによって行われる。連結
は、ＤＩＣまたはＤＩＣ／ＨＯＢｔを適度な温度で用い
て行われる。Boc 基を除去した後、連続して保護したア
ミノ酸（それぞれ３モル以上添加）の連結をＣＨ₂Ｃｌ
₂中であるいはBoc-アミノ酸の溶解性に依存したＤＭＦ
／ＣＨ₂Ｃｌ₂の混合溶液中で行われる。各合成段階で
の連続した連結反応は、カイザー(Kaiser)ら［アナル
バイオケム(Anal. Biochem.)、第３４巻、ページ５９５
（１９７０）］に記載されたニンヒドリンテストによっ
て検出するのが好ましい。連結が不完全な場合、連結工
程は次のアミノ酸との反応の前のアルファ−アミノ保護
基を除去する前に繰り返す。

【００７０】式VIIAの中間ペプチドの目的とするアミノ
酸配列が得られた後、ペプチド−樹脂をアニゾールの存
在下で液状ＨＦと処理し、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^５、Ｘ^７、Ｘ
^８およびＸ^９が水素である式VIIAのペプチドを産生する
適用な温度で６０〜８０％ＤＭＦ水溶液中で等量のＫ₂
ＰｔＣｌ₄とペプチドを反応させ、ＨＰＬＣで精製する
ことによって、式 VIIIBのペプチドを式II（Ｑ¹はＰｔ
Ｃｌ₂である）のペプチドに転換する。必要とあれば、
プラチナ含有化合物を公知の方法によってＰｔＹ₂含有
同類物に転換する。

【００７１】ＱがＭＴＸである式Ｉの化合物の調製は、
カルボジイミド法によって式VIIBの化合物をＭＴＸと連
結させることによって行われる。

【００７２】細胞毒性部分として非白金族金属原子を有
する式II（Ｑ¹が（Ｂ）₂Ｑ³である）式IIのペプチド
は、式 VIIIBの中間ペプチドを６０〜８０％ＤＭＦ水溶
液中で銅またはニッケル陽イオンとヒドロキシ−オキソ
Ｑ³化合物との予め形成された複合体と連結することに
よって式 VIIIBの中間ペプチドより得られ、さらに、目
的とするペプチド−金属−複合体をＨＰＬＣによって単
離する。

【００７３】または、Ｑ¹が（Ｂ）₂Ｑ³である式IIの
化合物は、式 VIIIB（Ｘ^５がＦＭＯＣ保護基である）の
中間ペプチドを適用なヒドロキシ−オキソ−Ｑ³化合物
と反応させ、さらに、薬学上使用可能な酸の金属塩、好
ましくはＣｕ⁺⁺、およびＮｉ⁺⁺の酢酸塩と反応させ、３
０〜５０％ピペリジン(piperidine)で脱保護し、ＨＰＬ
Ｃで単離することによっても得ることができる。

【００７４】式IIの Mel-Mel含有類似体は、 Boc-Melで
式 VIIIAのペプチドをアシル化し、さらに脱保護、酸
化、および精製をすることによって固相で得られる。

【００７５】

【ペプチドの精製】すべての保護基を除去した式VIIBお
よび VIIIBの中間ペプチドを２段階で精製する。まず、
酸化反応によって得られた溶液の凍結乾燥物をセファデ
ックスＧ１５ファイン(Sephadex G15 fine) のカラム
（１．２×１００ｃｍ）のゲル瀘過にかけ、５０％酢酸
によって溶出させることによって重合生成物、遊離ヨウ
素および塩を除去する。第２段階では、ゲル瀘過によっ
て得られた凍結乾燥物（目的とするペプチドを含む）
を、逆相カラムの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）によって精製する。半予備ＨＰＬＣを、アップル
マッキントッシュプラス(APPLE MACINTOSH PLUS)コン
ピューターによって制御されている３つのライニンラビ
ットエッチピーＨＰＬＣ(RAININ Rabbit HP HPLC)
ポンプ、レオダイン(Rheodyne)インジェクターおよびク
ナウアーモデル８７(KNAUER Model 87) 可変波長Ｕ
Ｖモニターからなるライニン(RAININ) ＨＰＬＣシス
テム（ライニン(RAININ)社製、ウォバーン(Woburn)、Ｍ
Ａ）で行う。未精製のペプチドを、粒状Ｃ１８シリカゲ
ル（ポアサイズ：３００オングストローム、粒子サイ
ズ：１２μｍ）（ライニンインクコーポレーション
(RAININ Inc., Co.,) 社製）が充填されたダイナマック
スマクロ（ＤＹＮＡＭＡＸＭＡＣＲＯ）カラム（２
１．２×２５０ｍｍ）（カラムＡ）で精製する。カラム
を(A) ０．１％ＴＦＡ水溶液および(B) ０．１％ＴＦＡ
／７０％アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムｉ
（ＨＰＬＣ溶出液の調製用、ＵＶグレードアセトニトリ
ルはバーディックアンドジャクソン(Burdick & Jackso
n) 社製、ＴＦＡおよびＡｃＯＨはＨＰＬＣ／スペクト
ログレード（ピアースケム(Pierce Chem.)社製）で
あり、水はグラス中で２回蒸留し、ミリ−Ｑ(Milli-Q)
の水精製システム（ミリポア(Millipore) 社製）を通し
たものを使用する）を用いて溶出させる。

【００７６】式Ｉおよび式IIのペプチドを含むメルファ
ランも２段階で精製される。メルファラン（すなわちペ
プチドを含むメルファラン）は容易に水溶液中で分解さ
れるので、精製はできるだけ短期間で行わなければなら
ない。酸化されたポリマー、ヨウ素および塩を除去する
ため、小さいサイズのセファデックスＧ−１５ファイン
カラム(Sephadex G15 fine column)（０．６×１０ｃ
ｍ）を用いる。分解しないように、精製は４℃で行う。
カラムを９０％のＡｃＯＨ水溶液で溶出させる。集めら
れた分画をただちに凍結乾燥し、ペプチドをＨＰＬＣで
精製する。ヴァイダックプロテインアンドペプチ
ド(VYDAC Protein & Peptide) Ｃ₁₈逆相カラム（１０×
２５０ｍｍ、ポアサイズ：３００オングストローム、粒
子サイズ：５μｍのＣ₁₈シリガゲルを充填）（アルテッ
ク(ALTECH)社製、ディーフィールド(Deefield)、イリノ
イ(IL)）（カラムＢ）を上記と同様にして用いる。カラ
ムを、(A) ０．２％酢酸水溶液および(B) ０．２％酢酸
／７０％アセトニトリル水溶液からなる溶媒システムｉ
ｉをアイソクラティック(isocratic) および濃度勾配モ
ードと組み合わせて溶出させる。カラム溶出液は、２２
０ｎｍで検出し、分画物は氷浴中に集められる。

【００７７】式IIのプラチナを含むペプチドは、１段階
のＨＰＬＣで分離できる。精製は、溶媒システムｉを用
いた１０×２５０ｍｍダブル−ポレックス(W-POREX) Ｃ
₁₈カラム（ポアサイズ：３００オングストローム、粒子
サイズ：５μｍ）（フェノメネックス(Phenomenex)社
製、ランチョパロスヴァーデス(Rancho Palos Verd
es) 、ＣＡ）（カラムＣ）によって行われる。クラマト
グラフィーは、適度な温度で行うことが効果的であり、
カラム溶出液は２２０ｎｍで検出される。

【００７８】ＣｕおよびＮｉの細胞毒性部分を有する式
IIのペプチドは、高い酸性溶液中では金属複合体は不安
定であるため、ＨＰＬＣ精製条件は緩やかにする必要が
ある。(A) ０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７．０）お
よび(B) ０．１Ｍ酢酸アンモニウム／６５％ＭｅＣＮ水
溶液からなる溶媒システムiii を用いてカラムＢを溶出
させることによって、類似体を精製する。

【００７９】

【ＨＰＬＣ分析】未精製および精製したペプチドの品質
および溶出特性は、２２０および２８０ｎｍにセットさ
れたダイオード捕獲検出器および逆相４．６×２５０ｍ
ｍダブル−ポレックス(W-POREX) Ｃ₁₈カラム（ポアサイ
ズ：３００オングストローム、粒子サイズ：５μｍ）
（カラムＤ）を備えたヒューレット−パッカード(Hewle
tt-Pckard) モデル１０９０液体クロマトグラフの分析
ＨＰＬＣを用いて行った。溶媒システムｉまたはiii の
流速を１．２ｍｌ／分に維持し、室温で分離を行った。

【００８０】

【アミノ酸分析】ペプチドサンプルを、４Ｍメタン−硫
酸を含んだ真空密閉チューブ中で１１０℃、２０時間、
加水分解した。ベックマン（ＢＥＣＫＭＡＮ）６３００
アミノ酸分析器で分析を行った。

【００８１】

【使用形態】ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコライ
ド）(poly(DL-lactide-co-glycolide)より形成されたこ
れらのペプチドのマイクロカプセルまたは微粒子は、筋
肉内もしくは経皮的投与における長期間投与システムが
確立でき好ましい。生理食塩水、リン酸バッファー溶液
等に溶解したペプチドの血管内投与も使用できる。

【００８２】好ましい薬投与形態は、ペプチドを公知の
薬学上使用できる担体と組み合わせたものである。投与
量は、血管内もしくは筋肉内投与の場合、患者の体重の
キログラム当り約１から約１００マイクログラムであ
る。これらのペプチドを用いた処置は、通常、ＬＨＲＨ
の他の作用剤および拮抗剤を用いた臨床上の処理と同様
にして行なわれる。

【００８３】これらのペプチドは、抗腫瘍効果を得るた
めに、哺乳類に血管内に、皮下に、筋肉内に、鼻腔内
に、または腟内に投与される。効果的な投与量は、投与
形態および処理対象によって変化する。効果的な投与量
は、投与形態および治療される患者の固体差によって変
化する。典型的な投与形態の例として、ペプチドを含ん
だ生理食塩水を体重ｋｇ当たり約０．１〜２．５ｍｇ、
投与できるように調製し、投与することが挙げられる。

【００８４】本発明は好ましい実施態様について記載さ
れているが、本明細書に添付した請求項に記載した本発
明の趣旨を損なわない限り、当業者にとって明白である
変更や修飾を防ぐものではないと解する。効果を余り損
なわないような公知の置換もまた、本発明において用い
ることができる。

【００８５】

【調製１】

【００８６】

【化１３】

【００８７】調製物IAを、固相合成マニュアルの反応容
器に段階的に約０．５５meq NH₂/g（アドバンスドケ
ムテック、(Advanced Chem. Tech.)、ルイスヴィル(L
ouisville)、ＫＹ）を含むベンゾヒドリルアミン(benzh
ydrylamine) HCl 樹脂上に形成させた。０．５ｇのベン
ゾヒドリルアミン(benzhydrylamine) HCl 樹脂（約０．
２７ミリモル）を、CH₂Cl₂の１０％トリエチルアミン
でそれぞれ３分間、計２回、中和後、６回、CH₂Cl₂で
洗浄する。樹脂を、ＤＭＦ中で３分間、３モル以上のBo
c-Thr(Bzl)（０．７５ミリモル）およびHOBt（０．８２
ミリモル）と混合し、CH₂Cl₂の５％ジイソプロピルカ
ルボジイミド(diisopropylcarbodiimide) （０．８２ミ
リモル）を加える。この混合物を室温で９０分間振盪す
る。このようにして得られた樹脂を、ＤＣＭで６回洗浄
し、カイザーテスト（カイザー(Kiser) ら、アナルバ
イオケム(Anal. Biochem.)、第３４巻、ページ５９５
（１９７０））を行う。

【００８８】ＤＣＭのトリフルオロ酢酸溶液（１：１）
で５分間処理することによって、Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂
からBoc-基を除去（脱保護）し、瀘過し、再度、２５分
間処理し、瀘過し、ＤＣＭで６回洗浄する。

【００８９】上記したように、ベンゾヒドリルアミン樹
脂に対して、１０％トリエチルアミンによって中和す
る。

【００９０】さらに、上記したのと同様にして、アミノ
酸残基（Boc-Cys(MBzl) 、Boc-Val、Boc-Lys[Z(2-C
l)]、Boc-D-Trp 、Boc-Tyr[Z(2-Br)]、Boc-Cys(MBzl)
およびBoc-D-Phe ）を連続して順次連結によって導入
し、Boc-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2
-Cl)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BHA樹脂の構造を有する
ペプチド樹脂が得られる。

【００９１】上記したように、Boc-Thr(Bzl)-BHA樹脂を
脱保護する。 Boc-D-Trpを導入後、５％メルカプトエタ
ノールをＤＣＭの５０％トリフルオロ酢酸に加える。

【００９２】最終的に、Boc-脱保護ペプチド樹脂をＤＣ
Ｍ、メタノール、およびＤＣＭの順で３回洗浄し、真空
乾燥する。

【００９３】５００ｍｇの保護オクタペプチドＢＨＡ樹
脂を、０．５ｍｌアニゾールと混合し、１０ｍｌ液状Ｈ
Ｆ中で０℃、１時間攪拌する。真空下でＨＦを除去後、
ペプチドおよび樹脂の混合物を乾燥酢酸エチルで洗浄す
る。さらに、ペプチドを３０％ＡｃＯＨで抽出し、瀘過
によって樹脂を分離し、凍結乾燥する。

【００９４】１００ｍｇの未精製の還元ペプチドを１０
０ｍｌの９５％の酢酸水溶液に溶解し、さらに、氷酢酸
の０．００５Ｍヨウ素溶液を黄色を呈するまで滴下す
る。酢酸を蒸発させた後、未精製のジスルフィド架橋含
有ペプチドをセファデックスＧ１５ファイン(Sephadex
G15 fine) のカラムによるゲル瀘過を行う。さらに、流
速５．０ｍｌ／分で、直線的な濃度勾配で溶媒システム
ｉを用いてカラムＡの半予備的ＨＰＬＣで精製した。

【００９５】下記の式のペプチド（調製物IB）を、第１
段階で Boc-TrpをBoc-Thr(Bzl)の代わりに樹脂に連結す
る以外は上記と同様にして、調製を行う。

【００９６】

【化１４】

【００９７】下記のペプチド（調製物IC）を、Boc-Thr
(Bzl)を Boc-Valの代わりに３番目の連結段階で導入す
る以外は調製物IAの合成方法と同様にして、合成する。
調製物IDは、最終段階で Boc-D-Trpを Boc-D-Pheの代わ
りに連結する以外は上記と同様にして、生産する。

【００９８】

【化１５】

【００９９】精製ペプチド (IA,IB,IC,ID)(28mg,21mg,3
2mg,25mg) は、直線的な濃度勾配形式で溶媒システムｉ
を用いたＨＰＬＣ分析によって精製（＞９５％）されて
いることがわかった。また、アミノ酸分析によって予想
された結果が得られた。

【０１００】

【表３】

【０１０１】

【調製２】

【０１０２】

【化１６】

【０１０３】Boc-Lys(FMOC)をBoc-Lys[Z(2-Cl)]の代わ
りに用いる以外は調製物IA記載の方法と同様にして、調
製物 IIAをＢＡＨ樹脂上に段階的に形成する。ペプチド
は、８回連続して連結反応を行うことにより調製され、
Boc-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys(FMOC)-V
al-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BHA 樹脂を生じる。さらに、Bo
c-脱保護ペプチド−樹脂は、ＨＦ／アニゾールで処理さ
れ、ヨウ素で酸化され、セファデックスＧ１５ファイン
(Sephadex G15 fine) カラムおよび溶媒システムｉで溶
出されたカラムＡで精製される。

【０１０４】

【表４】

【０１０５】

【調製３】

【０１０６】

【化１７】

【０１０７】合成を D-Pheの添加で終了しない以外は調
製物 I記載の方法と同様にして、調製物 IIIを固相技術
によってＢＡＨ樹脂（１．０ｇ、０．５５meq NH₂）上
に形成する。オクタペプチドを (Boc)₂ A₂prを用いて
アシル化し、３９１ｍｇの (Boc)₂-A₂pr-D-Phe-Cys(M
Bzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)
-Thr(Bzl)-BHA 樹脂を生成する。 Boc基を除去した後、
ペプチド−樹脂をＨＦ／アニゾールで処理し、遊離還元
ペプチドを生成させる。酸化した後、セファデックスＧ
１５ファイン(Sephadex G15 fine) カラムによる精製お
よび濃度勾配で溶媒システムｉ（６０分間で２０〜５０
％溶媒Ｂ）を用いたカラムＡのＨＰＬＣによって、調製
物IIIA(86mg)を得る。

【０１０８】合成の第１段階において Boc-TrpをBoc-Th
r(Bzl)の代わりに用いる以外は同様にして行い、調製物
IIIB(77mg)を得る。

【０１０９】直線的な濃度勾配形式（３０分間で２０〜
５０％溶媒Ｂ）で溶媒システムｉを用いた場合のＨＰＬ
Ｃ保持時間がそれぞれ１４．５分および２３．７分であ
る精製ペプチド（＞９４％）のアミノ酸組成は、予想さ
れたものであった。

【０１１０】

【調製４】

【０１１１】

【化１８】

【０１１２】４番目の連結段階で Boc-Lys(FMOC)をBoc-
Lys[Z(2-Cl)]の代わりに用いる以外は調製物 I記載の方
法と同様にして、調製物IVの合成を行う。同様にしてＨ
Ｆ切断、酸化および精製（カラムＡ、溶媒システムｉ、
濃度勾配による溶出：６０分間で５０〜８０％溶媒Ｂ）
工程を行うことによって、調製物IV(47mg)を得る。ＨＰ
ＬＣ分析によって精製ペプチドは、保持時間１２．５分
のところで１つのピークを示す。

【０１１３】

【調製５】

【０１１４】

【化１９】

【０１１５】FMOC-D-Pheを Boc-D-Pheの代わりに用いる
以外は調製物IA記載の方法と同様にして、調製物VAの調
製を行った。ペプチド−樹脂をＨＦ／アニゾールで処理
し、さらに、ジスルフィド架橋を酸化によって形成さ
せ、セファデックスＧ１５ファイン(Sephadex G15 fin
e) カラムおよびＨＰＬＣ（カラムＡ、溶媒システム
ｉ、濃度勾配による溶出：６０分間で５５〜８５％溶媒
Ｂ）を用いることによってペプチドを精製した。 FMOC-
保護ペプチドをＤＭＦに溶解し、１．２倍等量のジ−ｔ
−ブチルジカルボネイト(di-tert-butyl dicarbonat
e) および１．２倍等量のＴＥＡを加え、Boc-Lys(ε-Bo
c)-含有ペプチドを生成した。反応終了後、保護ペプチ
ドをエーテルによって沈殿させ、FMOC基を５０％ピペリ
ジン(piperidine)を用いて除去した。Boc-保護ペプチド
を溶媒システムｉ（６０分間で４５〜７５％溶媒Ｂ）を
用いたカラムＡのクロマトグラフにかけ、調製物VAを得
た。

【０１１６】Boc-TrpをBoc-Thr(Bzl)の代わりに用いる
以外同様に行って、調製VBが得られる。このようにして
得られたペプチドは、溶媒システムｉ（４０分間で４５
〜８５％溶媒Ｂ）を用いたＨＰＬＣ分析によって精製さ
れていることが分かった。

【０１１７】

【調製６】

【０１１８】

【化２０】

【０１１９】遊離N-末アミノ基を無水グルタル酸によっ
てアシル化することによって調製物IIAを合成した後、
調製物VIを生成した。ペプチド−樹脂をＨＦ／アニゾー
ルで処理し、さらに、ジスルフィド架橋を酸化によって
形成させ、セファデックスＧ１５ファイン(Sephadex G1
5 fine) カラムおよび最終的にＨＰＬＣ（カラムＡ、溶
媒システムｉ、濃度勾配による溶出：６０分間で５０〜
８０％溶媒Ｂ）を用いることによってペプチドを精製し
た。

【０１２０】

【調製７】アントラキノン−２−メチル−ヘミグルタレート (anthraquinone-2-methyl-hemiglutarate) ５７６ｍｇ（２ミリモル）の２−（ヒドロキシメチル）
−アントラキノン(2-(hydroxymethyl)-anthraquinone)
を６ｍｌの無水ピリジンに懸濁し、４５６ｍｇ（４ミリ
モル）の無水グルタル酸で２４時間還流した。ピリジン
を真空下で除去し、残存物を酸性化し、酢酸エチルで抽
出した。黄色の正生物を酢酸エチル−ヘキサン（５８０
ｍｇ、融点：１５０〜１５１℃）で再結晶した。調製物
VIIのＨＰＬＣ保持時間は、溶媒システムｉ（３０分間
で３０〜６０％溶媒Ｂの直線的な濃度勾配）を用いた場
合、１９．７分であった。

【０１２１】

【調製８】５（３−クロロ−プロピオニルオキシ）−１，４−ナフ
トキノン (5(3-Chloro-propionyloxy)-1,4-naphthoquinone) ５ｍｌのＤＣＭに溶解したトリエチルアミン（１．４ｍ
ｌ）および１．２７ｇの３−クロロプロピオニルクロラ
イドの溶液を１．７３ｇの５−ヒドロキシ−１，４−ナ
フトキノン(5-hydroxy-1,4-naphthoquinone)の溶液に加
えた。この反応混合物を室温で２時間攪拌した。この溶
液を瀘過し、少量に濃縮し、シリカゲルカラム（酢酸エ
チル−シクロヘキサン−ＤＣＭ）でクロマトグラフにか
けたところ、７４１ｍｇの目的とする生成物が得られ
た。

【０１２２】

【実施例１】

【０１２３】

【化２１】

【０１２４】ペプチド１は、調製物１に記載された方法
と同様にしてBoc-Thr(Bzl)、 Boc-Cys(MBzl)、 Boc-Va
l、Boc-Lys[Z(2-Cl)]、 Boc-D-Trp、 Boc-Tyr[Z(2-B
r]、 Boc-Cys(MBzl)および Boc-Melアミノ酸を BHA樹脂
(100mg)に連続して連結させることによって調製する。
Boc-Thr(Bzl)、 Boc-Cys(MBzl)、 Boc-Val、Boc-Lys[Z
(2-Cl)]、 Boc-D-Trp、 Boc-Tyr[Z(2-Br)] 、 Boc-Cys
(MBzl)および Boc-D-Melを BHA樹脂 (100mg)に段階的に
連結することによって、ペプチド2-樹脂が生成する。ペ
プチドを樹脂から切断した後、ペプチドを酸化し、凍結
乾燥して、さらに、８０％酢酸水溶液で洗浄した小さい
サイズのセファデックスＧ−１５ (Sephadex G-15)カラ
ムでゲル瀘過し、ヨウ素を除去する。濃度勾配による溶
出（６０分間で５５〜８５％溶媒Ｂ）を用いた溶媒シス
テムｉｉによるカラムＢのＨＰＬＣで精製することによ
って、ＨＰＬＣ分析を溶媒システムｉ（４０分間で３０
〜７０％溶媒Ｂ）を用いて行った場合のＨＰＬＣ保持時
間がそれぞれ２０．１分および２２．８分であり、９５
％以上の精製度をもつ、ペプチド１(13mg)およびペプチ
ド２(14mg)を生じる。

【０１２５】

【実施例２】

【０１２６】

【化２２】

【０１２７】ペプチド３は、調製物１に記載された方法
と同様にしてBoc-Thr(Bzl)、 Boc-Cys(MBzl)、 Boc-Va
l、Boc-Lys[Z(2-Cl)]、 Boc-D-Trp、 Boc-Mel、 Boc-Cy
s(MBzl)および Boc-D-Pheを BHA樹脂上に段階的に連結
させることによって合成する。ペプチド−樹脂をＨＦ／
アニゾールで処理した後、酸化し、さらに、小さいサイ
ズのセファデックスＧ−１５ (Sephadex G-15)カラムで
ゲル瀘過し、溶媒システムｉｉ（６０分間で５０〜８０
％溶媒Ｂ）を用いて溶出したカラムＢのＨＰＬＣで精製
することによって、９１％以上の精製度をもつ目的とす
るペプチド（１１ｍｇ）を生成する。また、溶媒システ
ムｉ（４０分間で３０〜７０％溶媒Ｂ）を用いてカラム
Ｄでクロマトグラフを行った際の、ペプチド３の保持時
間が１９．２分である。

【０１２８】

【実施例３】

【０１２９】

【化２３】

【０１３０】ペプチド３の調製は、第１段階でＢｏｃ
−ＭｅｌをBoc-Thr(Bzl)の代わりに BHA樹脂に連結する
以外は調製物１に記載された方法と同様にして予め形成
される。ペプチドをＨＦ／アニゾールを用いて樹脂より
切断した後、ヨウ素で酸化し、凍結乾燥し、さらに、小
さいサイズのセファデックスカラムでゲル瀘過し、溶媒
システムｉｉ（６０分間で５０〜８０％溶媒Ｂ）を用い
てＨＰＬＣで精製することによって、ペプチド４ (9.2m
g)を生成する。また、直線的な濃度勾配形式（４０分間
で３０〜７０％溶媒Ｂ）で溶媒システムｉを用いて試験
を行った場合のクロマトグラフィ分析によると、精製
（９２％以上）されていることが示された。保持時間
は、２０．１分である。

【０１３１】

【実施例４】

【０１３２】

【化２４】

【０１３３】D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys
[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH樹脂を調製１と
同様にして合成し、N-末を脱保護した後、 Boc-Melでア
シル化し、保護ノナペプチド５を生成する。

【０１３４】調製１に記載された方法と同様にして、Bo
c-Thr(Bzl)、 Boc-Cys(MBzl)、Boc-Thr(Bzl)、Boc-Lys
[Z(2-Cl)]、 Boc-D-Trp、 Boc-Phe、 Boc-Cys(MBzl)、
Boc-D-Pheおよび Boc-Melを連続してベンゾヒドリルア
ミン樹脂に連結することによって、保護ノナペプチド６
を生成する。

【０１３５】Boc-Thr(Bzl)、 Boc-Cys(MBzl)、Boc-Thr
(Bzl)、Boc-Lys[Z(2-Cl)]、 Boc-D-Trp、 Boc-Phe、 Bo
c-Cys(MBzl)、 Boc-Pheおよび Boc-Melを連続して BHA
樹脂に連結させることによって、ペプチド７−樹脂を生
成する。

【０１３６】Boc-Thr(Bzl)、 Boc-Cys(MBzl)、Boc-Thr
(Bzl)、Boc-Lys[Z(2-Cl)]、 Boc-D-Trp、 Boc-Phe、 Bo
c-Cys(MBzl)、 Boc-D-Trpおよび Boc-Melを連続して BH
A樹脂に添加させることによって、ペプチド８−樹脂を
生成する。

【０１３７】Mel-D-Phe-Cys(Bzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-
Lys[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)-Trp-BAH樹脂（保護ペプチ
ド９）を、調製１に記載された方法にしたがって９回連
結反応を行うことによって生成する。

【０１３８】実施例１と同様にして切断、酸化および小
さいサイズのセファデックスＧ−１５ (Sephadex G-15)
カラムでゲル瀘過し、さらにペプチド５、６、７、８お
よび９を溶媒システムｉｉを用いてカラムＢのＨＰＬＣ
によって、９２％以上の精製度で単離する（それぞれ
8.4mg、10.6mg、 9.9mg、12.4mg、 7.9mg）。

【０１３９】

【表５】

【０１４０】不安定なメルファランを配列中に導入する
ために固相ペプチド合成を使用することができるため、
ペプチド５は他の方法によっても調製できる。

【０１４１】FMOC-D-Pheを Boc-Pheの代わりに使用する
以外は調製物IAに記載されたのと同様にして、下記のペ
プチドを合成する。古典 (classical)合成方法を用い
て、 Boc-Melをこのオクタペプチドに連結する。

【０１４２】

【化２５】

【０１４３】

【表６】

【０１４４】このようにして合成されたペプチド５は、
固相により調製されたものと同一のアミノ酸組成、ＵＶ
スペクトルおよびＨＰＬＣ保持時間を有する。

【０１４５】

【実施例５】

【０１４６】

【化２６】

【０１４７】ペプチド１０の合成は、調製物３由来の A
₂pr-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-C
l)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH 樹脂 (150mg)を５倍
等量のBoc-Melと反応させることによって行われる。保
護基をＨＦ／アニゾールで除去し、未精製のペプチドを
ヨウ素で酸化し、ゲル瀘過を行う。目的とするペプチド
１０を含む凍結乾燥分画をカラムＢに注入し、溶媒シス
テムｉｉ（６０分間で６０〜９０％溶媒Ｂ）を用いて精
製する。精製ペプチド (7.6mg)のＨＰＬＣ保持時間は、
溶媒システムｉ（４０分間で４０〜８０％溶媒Ｂ）を用
いたカラムＤで分析した際、１７．１分である。

【０１４８】

【実施例６】

【０１４９】

【化２７】

【０１５０】デカペプチド１１の調製は、 D-Phe-Cys(M
Bzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)
-Thr(Bzl)-BAH 樹脂（N-末アミノ基の脱保護による調製
物IA由来）を合成した後、２連続段階で Boc-Melと連結
することによって行う。ペプチド−樹脂をＨＦ／アニゾ
ールで処理し、ジスルフィド架橋をヨウ素を用いて酸化
することによって閉環する。凍結乾燥反応混合物をゲル
瀘過、および溶媒システムｉｉ（６０分間で７０〜１０
０％溶媒Ｂ）を用いたＨＰＬＣを行い、ペプチド８ (6.
9mg)を生成する。精製ペプチドの保持時間は、直線的な
濃度勾配形式（４０分間で５０〜９０％溶媒Ｂ）で溶媒
システムｉを用いた場合、１４．９分である。

【０１５１】

【実施例７】

【０１５２】

【化２８】

【０１５３】３０ｍｇの以下の式の中間ペプチドＴＦＡ
塩（調製物 IIA）（１００μｌのＤＭＦに溶解し、水酸
化ナトリウムで中和する）を水中で 4mgの酢酸ナトリウ
ムの存在下で１００μｌの水中で塩化白金酸カリウム
(8.4mg)と４８時間反応させることによって、プラチナ
含有ペプチド１２を調製する。次いで、反応混合物を水
で希釈し、カラムＣに注入し、溶媒システムｉ（５０分
間で２５〜５０％溶媒Ｂ）を用いてクラマトグラフにか
ける。

【０１５４】

【化２９】

【０１５５】下記に示すペプチドのトリフルオロ酢酸塩
（31mg、調製物 IIB）を相当する Thr⁸誘導体（調製物
IIA）の代わりに出発原料として用いる以外同様にし
て、ペプチド１３を合成する。

【０１５６】

【化３０】

【０１５７】このようにして得られた金属ペプチド(4.8
mg、5.3mg)は、溶媒システムｉ（３０分間で３０〜６０
％溶媒Ｂ）で溶出させた際、それぞれ保持時間９．１分
および１９．５分のところにＨＰＬＣで１ピークを示
す。

【０１５８】

【実施例８】

【０１５９】

【化３１】

【０１６０】金属ペプチド１４を２つの異なる方法で製
造した結果、遊離 Lysε−アミノ基が存在しているにも
かかわらず、目的とするCu複合体を調製することがきる
ことが分かった。

【０１６１】方法Ａにおいて、下記に示すペプチド（調
製物 III）を１００μｌのＤＭＦに溶解し、ｐＨを水酸
化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムで８に調整し、さら
に、4mgのサリチルアルデヒドを加える。室温で１時間
放置後、酢酸銅(II)（ 3mgを50μｌ水に溶解したもの）
と３０分間反応させることによって金属複合体を構成す
る。FMOC保護基を除去するために、反応混合物を５０μ
ｌのピペリジンと混合し、３０分後、１００μｌの水で
希釈する。沈殿物を遠心し、緑色の上清溶液をカラムＣ
に注入し、溶媒システムｉｉ（４０分間で３５〜５５％
溶媒Ｂ）で溶出させ、金属ペプチド１４ (4.1mg)を単離
する。溶媒システムｉｉ（３０分間で４０〜８５％溶媒
Ｂ）を用いたカラムＤでテストした結果、金属ペプチド
１４は精製されており、保持時間が１１．２分であっ
た。

【０１６２】

【化３２】

【０１６３】方法Ｂによると、３０ｍｇの遊離中間ペプ
チド（調製物 IIA）を、酢酸ナトリウム (2mg)を含んだ
３００μｌの９０％ＤＭＦ水溶液中で４８時間、７．４
ｍｇの予め形成されたビス（サリチルアルデヒダト）銅
(II)(bis(salicylaldehydato)copper(II))［ワイナカ
ノおよびエーナカハラ、ブルケムソスジャパン
(Bull. Chem. Soc. Japan)、第４６巻、ページ１８７
（１９７３）］と反応させる。ペプチド−ＳＡＬ−Ｃｕ
複合体を、溶媒システムｉｉｉ（４０分間で４０〜６０
％溶媒Ｂ）を用いたカラムＣで分離する。このような方
法によって得られたペプチド１４ (7.6mg)は、方法Ａに
よって調製されたものと同じ保持時間およびＵＶスペク
トルを有している。

【０１６４】ＣＩＳＡＬを含む金属ペプチド１５を方法
Ｂによって製造する：１６ｍｇの中間ペプチドＴＦＡ塩
（調製物 IIA）を３．９ｍｇのビス（５−クロロ−サリ
チルアルデヒダト）銅(II) (bis(5-chloro-salicylalde
hydato)copper(II))と酢酸ナトリウムバッファーＤＭＦ
水溶液中で４８時間反応させる。この反応混合物を溶媒
システムｉｉｉ（５０分間で４５〜７０％溶媒Ｂ）で溶
出させたカラムＣのクロマトグラフにかける。単離した
緑色のペプチド (4.1mg)のＨＰＬＣ保持時間は、直線的
な濃度勾配形式（３０分間で４５〜９０％溶媒Ｂ）で溶
媒システムｉｉを用いたカラムＤで試験した場合、１
１．４分であった。

【０１６５】

【実施例９】

【０１６６】

【化３３】

【０１６７】ペプチド１６を含む抗代謝剤を、メトトレ
キセートで下記の式のペプチド（調製物 IIA）をアシル
化することによって合成する。５．６ｍｇのメトトレキ
セートを１００μｌのＤＭＦに溶解した溶液に、等量の
ジイソプロピル−カルボジイミドを０℃で加える。１５
分後、１４ｍｇのペプチドの中和溶液（ＤＭＦ）と混合
し、０℃、一晩放置した。FMOC保護基を５０μｌのピペ
リジンで処理することによって除去し、さらに、ペプチ
ドを溶媒システムｉ（５０分間で２５〜５０％溶媒Ｂ）
を用いて溶出させたカラムＣで精製した。溶媒システム
ｉ（２０分間で３０〜５０％溶媒Ｂ）のカラムＤで試験
した場合、２つのペプチドが検出（および単離）（保持
時間はそれぞれ１４．９分および１５．４分である）さ
れ、メトトレキセートのα−カルボキシルまたは−カル
ボキシル基のアシル化物に一致するものである。

【０１６８】

【化３４】

【０１６９】下記の式の調製物 IICおよび調製物 IIDを
出発材料として使用する以外は同様にして、ペプチド１
７および１８を調製する。

【０１７０】

【化３５】

【０１７１】

【実施例１０】

【０１７２】

【化３６】

【０１７３】D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys
[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH樹脂（調製物IA
のN-末アミノ基の脱保護によって調製）を合成した後、
Trt-Azyと連結することによって、ノナペプチドを調製
した。ペプチド−樹脂をＨＦ／アニゾールで処理し、ジ
スルフィド架橋をヨウ素を用いた酸化によって形成し
た。凍結乾燥反応混合物を溶媒システムｉｉ（６０分間
で７０〜１００％溶媒Ｂ）を用いたＨＰＬＣにかけた。

【０１７４】

【実施例１１】

【０１７５】

【化３７】

【０１７６】以下のペプチドをエピブロヒドリン(epibr
omohydrin)を用いてアルキル化することによって、上記
のペプチドを合成する。２５ｍｇのペプチド（調製物V
A）の２００μｌＤＭＦ溶液に、６μｌのＴＥＡおよび
２μｌのエピブロヒドリン(epibromohydrin)を加えた。
このようにして得られた反応混合物を２４時間、室温で
攪拌し、さらに、ペプチドをエーテルで沈殿させた。３
０％ＴＦＡ／ＤＣＭで脱保護した後、生成物を溶媒シス
テムｉｉ（６０分間で２５〜５５％溶媒Ｂ）を用いたカ
ラムＣのクロマトグラフにかけた。

【０１７７】

【化３８】

【０１７８】

【実施例１２】

【０１７９】

【化３９】

【０１８０】以下のペプチドをカルドジイミドを有する
アントラキノン−２−メチル−ヘミグルタレート(anthr
aquinone-2-methyl-hemiglutarate)と連結させることに
よって、上記のペプチドを合成する。１０．６ｍｇのア
ントラキノン−２−メチル−ヘミグルタレート(anthraq
uinone-2-methyl-hemiglutarate)および４．６ｍｇのHO
Btを３００μｌのＤＭＦに溶解させ、０℃に冷却し、
３．４μｌのＤＩＣと反応させた。１５分後、この溶液
を２５ｍｇのD-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH
₂（調製物VA）の冷却溶液（２００μｌＤＭＦ）と混合
し、０℃、２４時間放置した。ペプチドをジエチル−エ
ーテルを用いて沈殿させ、 Boc保護基を３０％ＴＦＡで
処理することによって除去した。蒸発後、反応生成物を
溶媒ｉを用いたカラムＣで精製した。

【０１８１】

【化４０】

【０１８２】

【実施例１３】

【０１８３】

【化４１】

【０１８４】以下のペプチド（調製物VA）を５（３−ク
ロロ−プロピオニルオキシ）−１，４−ナフトキノン(5
(3-chloro-propionyloxy)-1,4-naphthoquinone) を用い
てアルキル化することによって、上記のペプチドを合成
する。２５ｍｇの調製物VAを２００μｌＤＭＦに溶解
し、１．２倍等量の５（３−クロロ−プロピオニルオキ
シ）−１，４−ナフトキノン(5(3-chloro-propionylox
y)-1,4-naphthoquinone)を等量の固形Ｋ₂ＣＯ₃の存在
下で加え、室温で２４時間攪拌した。さらに、塩を瀘過
分離し、 Boc保護ペプチドをエーテルで沈殿させ、３０
％ＴＦＡ／ＤＣＭで脱保護した。未精製のペプチド−ナ
フトキノン複合体を溶媒システムｉを用いたカラムＣの
ＨＰＬＣによって精製した。

【０１８５】

【化４２】

【０１８６】

【実施例１４】

【０１８７】

【化４３】

【０１８８】以下のペプチドでマイトマイシンＣをアシ
ル化することによって、上記のペプチドを合成する。２
７．５ｍｇの調製物VIを２００μｌのＤＭＦに溶解さ
せ、２．８μｌのＴＥＡおよび３．３ｍｇのHOBtの存在
下で７ｍｇのマイトマイシンＣおよび４μｌのＤＩＣと
０℃、一晩反応させた。５０％ピペリジンで３０分間処
理することによってFMOC基を除去した。ペプチド−マイ
トマイシンＣ複合体を溶媒ｉｉを用いたカラムＣで精製
した。

【０１８９】

【化４４】

【０１９０】

【実施例１５】

【０１９１】

【化４５】

【０１９２】以下のペプチドを予め形成されたヘミグル
タリル−エスペラマイシン(hemiglutaryl-esperamicin)
（アシル化部位は特定されていない）と連結することに
よって、上記のペプチドを合成する。２ｍｇのヘミグル
タリル−エスペラマイシン(hemiglutaryl-esperamicin)
（１００μｌのＤＭＦ）および１．３ｍｇのHOBtの溶液
を０℃に冷却し、１μｌのＤＩＣと反応させた。１０分
後、１２．５ｍｇの調製物 IIAを５０μｌの中和ＤＭＦ
に加え、この反応混合物を０℃、２４時間放置した。様
々な生成物がＨＰＬＣ（カラムＣ、溶媒システムｉｉ）
で単離された。

【０１９３】

【化４６】

【０１９４】

【実施例１６】

【０１９５】

【化４７】

【０１９６】ドキソルビシンのアミノ糖部分を以下のペ
プチドのグルタル酸残基に連結することによって、上記
のペプチドを合成する。２７．５ｍｇの調製物 VIIを２
００μｌのＤＭＦに溶解し、２．８μｌのＴＥＡおよび
３．３ｍｇのHOBtの存在下で１４ｍｇのドキソルビシン
および４μｌのＤＩＣと０℃で一晩、反応させた。反応
混合物を溶媒システムｉ（６０分間で４０〜７０％溶媒
Ｂ）を用いたカラムＣのＨＰＬＣにかけた。

【０１９７】

【化４８】

【０１９８】

【実施例１７】本発明のペプチドの生物化学的効果、レ
セプター結合特性および細胞毒性活性を表７〜１０に要
約する。

【０１９９】表７は、インビトロ(in vitro)の分散した
ラットの前立腺細胞の超融合システム(superfusion sys
tem)［エスヴァイ(S.Vigh)およびエーブイシャリ
ー(A.V.Schally) 、ペプチド(Peptides)、第５巻、ペー
ジ２４１〜２４７（１９８４）］におけるソマトスタチ
ン(1-14)のものと比較した、本発明の化合物の成長ホル
モン放出阻害活性を示す。また、表１は、ラットの皮質
およびラットの前立腺腫瘍（ダンニング(Dunning) Ｒ３
３２７Ｈ）の細胞膜に対するこれらの化合物のレセプタ
ー結合親和性に関するデータをも示している。

【０２００】表８は、分光光度測定法によって測定され
た３Ｔ３繊維芽細胞の成長に関するペプチド７の効果を
示している。１０^５個の細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで予
め処理された９６穴のプレートに１０％ＮＣＳ／ＤＭＥ
で成長させ、細胞をしっかりと接着する。１〜１０，０
００ｎｇ／ｍｌ濃度で細胞毒性ペプチドを毎日変化させ
ながら、細胞を３日間処理した。培養期間が終了した
後、代謝染色剤、ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチア
ゾール−２−イル］−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テト
ラゾリウム−ブロマイド(3-[4,5-dimethylthiazol-2-y
l]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)）を加え、
生存している細胞を紫色のホルマザン色に染色させた
後、５９０ｎｍ（４日目）の吸光度を測定する。既知の
細胞数で予め標準化し、実際の生存細胞数の吸光度と比
較する。

【０２０１】表９は、培養したヒト膵臓 MiaPaCa癌細胞
株についてのソマトスタチン類似体によるＤＮＡへの³
H-チミジンの取り込みの阻害に関するデータを示すもの
である。１×１０^５個の細胞を０日に１０％ウシ胎児血
清（ＦＣＳ）を含んだＤＭＥ培地にまく。２４時間後、
培地を除去し、血清を含まないＤＭＥ培地に置換し、３
７℃で２日間培養する。さらに、培地を除去し、ソマト
スタチン類似体を含むもしくは含まない５％ＦＣＳのＤ
ＭＥ培地に置き換える。ペプチドを含んだ培地を４日
間、毎日交換する。４日目に、１μＣｉの³H-チミジン
を加え、さらに１７時間培養する。培地を除去し、細胞
をトリプシン処理することによって回収する。１Ｎの過
塩素酸でＤＮＡを抽出し、放射線活性を測定する。

【０２０２】表１０は、Ｈ−６９肺小細胞癌細胞株にお
けるソマトスタチン類似体によるＤＮＡへの³H-チミジ
ンの取り込みの阻害に関するデータを示すものである。
６．５×１０^４個の細胞を、１０％馬血清および５％ウ
シ胎児血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地の入った滅
菌済みのポリプロピレンチューブに入れる。３日後、ソ
マトスタチン類似体を加え、３７℃で５日間培養する。
４日目に、１μＣｉの³H-チミジンを加え、５日目に、
細胞を洗浄し、ガラス製の紙に回収し、１０％トリクロ
ロ酢酸水溶液およびエタノールで洗浄し、液体シンチレ
ーションカウンターで測定する。

【０２０３】

【表７】

【０２０４】

【表８】

【０２０５】

【表９】

【０２０６】

【表１０】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者タマスジャナキーハンガリー、セゲド、エッチ−6721 ヒュルムユー７エスゼット、アイアイ／10 (72)発明者レンチーカイアメリカ合衆国、ロサンゼルス70003、メタイリーグレンストリート 7024

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式に示される構造を有する化合物
およびこれらの薬学上許容可能な酸や塩基との塩。【化１】ただし、Ｒ^１はL-またはD-Phe 、D-Trp 、L-またはD-Me
l であり、Ｒ^３は Mel、 Tyr、または Pheであり、Ｒ^６は Thrまたは Valであり、Ｒ^８は Thr、 Trp、または Melであり、Ｑは水素、L およびD-Mel 、Mel-Mel のジペプチド、シ
クロプロパンアルカノイル、アジリジン−２−カルボニ
ル、メトトレキソイル、１，４−ナフトキノン−５−オ
キシカルボニルエチル、エポキシアルキルおよびこれら
のΩ−カルボニル−アルキルアミノ誘導体；および２−
ヒドロキシメチルアントラキノン、ドキソルビシン、
エスペラマイシン(esperamycin) 、およびマイトマシン
ＣのΩ−カルボニル−アルカノイル誘導体であり；この
際、Ω−カルボニル−アルキルアミノ基は下記の式に示
す構造を有し、 -CO-(CH₂) _n-NH- （ nは２〜６） Ω−カルボニル−アルカノイル基は下記の式に示す構造
を有するものである。 -CO-(CH₂) _n-CO- （ nは２〜６）
【請求項２】下記の式に示される構造を有する化合
物およびこれらの薬学上許容できる酸および塩基との
塩。【化２】ただし、Ｒ^１はL-またはD-Phe 、L-またはD-Trp であ
り、Ｒ^３は Pheまたは Tyrであり、Ｒ^６は Valまたは Thrであり、Ｒ^８は Thrまたは Trpであり、Ａは下記の式に示される構造を有するジアミノアシル残
基であり、 -HNCH2 -(CH₂) _m-CH(NH)- (CH₂) _n-CO- （ mは
０または１、 nは０または１）Ｑ¹は下記の式に示され
る構造を有する細胞毒性部分であり、Ｑ² または（Ｂ）₂Ｑ³ または（Ｑ⁴）₂ ただし、Ｑ²はＰｔ（Ｙ）₂（Ｙは薬学上許容できる酸
のアニオンである）であり、Ｑ³はチタン、バナジウム、鉄、銅、コバルト、金、ニ
ッケル、カドミウムおよび亜鉛からなる群より選ばれる
非白金族金属であり、Ｑ⁴はL またはD-Mel 、Mel-Mel のジペプチド、シクロ
プロパンアルカノイル、アジリジン−２−カルボニル、
エポキシアルキル、１，４−ナフトキノン−５−オキシ
カルボニル−エチル、またはこれらのΩ−カルボニル−
アルキルアミノ誘導体；および２−ヒドロキシメチル−
アントラキノン、ドキソルビシン、エスペラマイシン(e
speramycin) 、およびマイトマシンＣのΩ−カルボニル
−アルカノイル誘導体であり、この際、Ω−カルボニル−アルキルアミノ基は下記の式
に示す構造を有し、 -CO-(CH₂) _n-NH- （ nは２〜６） Ω−カルボニル−アルカノイル基は下記の式に示す構造
を有し、 -CO-(CH₂) _n-CO- （ nは２〜６）Ｂはハロおよびニトロフェニル低級アルキリデン類か
らなる群より選ばれた置換アラルキリデンまたはヘテロ
アラルキリデン；低級アルキルヒドロキシメチルまた
はフォスフォキシメチルピリジル低級アルキリデン
類（低級アルク(alk-)は炭素数１〜６である）である。
【請求項３】Ｒ^１が D-Pheであり、Ｒ^３が Tyrまたは
Melであり、Ｒ^６がValであり、Ｒ^８が Thrまたは Mel
であり、Ｑが水素である請求項１記載のペプチド。
【請求項４】Ｒ^１が Melであり、Ｒ^３が Tyrであり、
Ｒ^６が Valであり、Ｒ^８が Thrであり、Ｑが水素である
請求項１記載のペプチド。
【請求項５】Ｒ^１が D-Melであり、Ｒ^３が Pheであ
り、Ｒ^６が Thrであり、Ｒ^８が Thrであり、Ｑが水素で
ある請求項１記載のペプチド。
【請求項６】Ｒ^１がL-または D-Pheであり、Ｒ^３が P
heであり、Ｒ^６が Thrであり、Ｒ^８が Thrであり、Ｑが
Melである請求項１記載のペプチド。
【請求項７】Ｒ^１が D-Pheであり、Ｒ^３が Tyrであ
り、Ｒ^６が Valであり、Ｒ^８が Thrまたは Trpであり、
Ｑが Melである請求項１記載のペプチド。
【請求項８】Ｒ^１が D-Trpであり、Ｒ^３が Pheであ
り、Ｒ^６が Thrであり、Ｒ^８が Thrであり、Ｑが Melで
ある請求項１記載のペプチド。
【請求項９】Ｒ^１が D-Pheであり、Ｒ^３が Tyrであ
り、Ｒ^６が Thrであり、Ｒ^８が Thrであり、Ｑが Mel-M
elまたは MTXである請求項１記載のペプチド。
【請求項１０】Ｒ^１が D-Pheまたは D-Trpであり、Ｒ
^３が Pheであり、Ｒ^６が Thrであり、Ｒ^８が Thrであ
り、Ｑが MTXである請求項１記載のペプチド。
【請求項１１】Ｒ^１が D-Pheであり、Ｒ^３が Tyrであ
り、Ｒ^６は Valであり、Ｒ^８は Thrまたは Trpであり、
Ａが A₂prまたは A₂buであり、Ｑ¹がＱ²であり、Ｑ
²がPtCl₂である請求項２記載のペプチド。
【請求項１２】Ｒ^１が D-Pheであり、Ｒ^３が Tyrであ
り、Ｒ^６は Valであり、Ｒ^８は Thrまたは Trpであり、
Ａが A₂prまたは A₂buであり、Ｑ¹が（Ｂ₂）Ｑ³で
あり、Ｑ³が銅(II)またはニッケル(II)であり、Ｂが２
−Ｏ−ベンジリデン (2-O-benzylidene)、フルオロ−、
クロロ−、ニトロ−２−Ｏ−ベンジリデン、２−メチル
−３−Ｏ−５−ヒドロキシメチル−またはフォスフォキ
シメチル−４−ピコリリデンである請求項２記載のペプ
チド。
【請求項１３】Ｒ^１が D-Pheであり、Ｒ^３が Tyrであ
り、Ｒ^６は Valであり、Ｒ^８は Thrまたは Trpであり、
Ａが A₂prまたは A₂buであり、Ｑ¹が（Ｑ⁴）₂であ
り、Ｑ⁴がL-または D-Melである請求項２記載のペプチ
ド。