MC2266A1 - Analogues de la somatostatine - Google Patents

Description

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ANALOGUES DE LA SOMATOSTATINE

La présente invention a été faite avec l'aide du gouvernement dans le cadre de la subvention N° CA 40077, 5 attribuée par le N.C.I. (NIH). Le gouvernement des E.U.A possède certains droits sur cette demande de brevet.

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne de nouveaux peptides ayant une influence sur la croissance des tumeurs cancéreuses chez l'homme. Elle concerne plus particulièrement des analogues courts, cycliques de la somatostatine contenant des parties cytotoxiques qui inhibent la sécrétion de l'hormone de croissance hypophysaire et qui ont un effet antinéoplasique; leurs sels, et des compositions pharmaceutiques et procédés d'utilisation concernant ces analogues.

DEMANDES DE BREVETS APPARENTEES

20 Cette demande de brevet est une suite partielle de la demande de brevet US en cours d'examen de la Demanderesse, s.n. 07/404 667, déposée le 09/07/1989.

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BASES DE L'INVENTION 25 La présente invention concerne de nouveaux analogues de la somatostatine courts cycliques, contenant des parties cytotoxiques, qui ont une influence sur la libération .de l'hormone de croissance hypophysaire chez les mammifères et qui ont des effets antinéoplasiques. Le tétradécapeptide 30 somatostatine (SS-14) ayant la structure :

l 1

Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 est un inhibiteur de la libération de l'hormone de 35 croissance et il a été montré ultérieurement qu'il possédait un large spectre de propriétés inhibitrices, notamment sur la sécrétion de l'insuline et du glucagon pancréatiques. L'analyse conformationnelle et des études structure-fonction

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sur des analogues de la somatostatine indiquent que la séquence nécessaire pour l'activité biologique est constituée du fragment Phe-Trp-Lys-Thr de la spire j3 correspondant aux résidus 7-10 de la somatostatine (D.Veber 5 et coll., Nature (Londres) 2 80. 512 (1979) et D. Veber et coll., Nature (Londres) 292. 55 (1981). En vue de découvrir des composés ayant une activité sélective, améliorée et prolongée , on a préparé de nombreux analogues courts, cycliques de la somatostatine. Veber et coll. ont rendu 10 compte de la synthèse et de l'activité inhibitrice marquée d'analogues hexapeptidiques cycliques obtenus en remplaçant 9 des 14 amino acides de la somatostatine par une proline unique ou par le N-MeAla (cyclo [Pro-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe] et le cyclo[N-MeAla-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe]). En outre, le 15 même groupe a préparé par synthèse un nouvel hexapeptide, le cyclo (N-MeAla-Tyr-D-Phe-Lys-Val - Phe ) , doué d'une forte activité (D. Veber et coll. Life Sci. 34., 1371 (1984)). Bauer et coll., (Life Sci. ,31, 1133 (1982)) ont préparé par synthèse une autre série d'analogues octapeptidiques de la 20 somatostatine extrêmement actifs. Leur analogue le plus actif a été le D-Phe-Cys-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OL. La Demanderesse a préparé près de 300 analogues amidés octapeptidiques apparentés à leur composé (R.-Z. Cai et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83., 1896 (1986) et R.-Z. 25 Cai et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2502 (1987)). Deux de ces composés, le [D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 et le D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys~Thr-NH2, se sont révélés être plus de 100 fois plus actifs que la somatostatine dans l'essai d ' inhibition de la libération de 30 l'hormone de croissance et ont présenté une durée d'action prolongée.

Diverses études ont démontré les effets inhibiteurs de la somatostatine chez des malades souffrant d'acromégalie, de tumeurs pancréatiques endocrines telles 35 que des insulinomes et des glucagonomes, de tumeurs ectopiques telles que les gastrinomes, et des tumeurs produisant le polypeptide intestinal vasoactif (VIP).

Cependant, la somatostatine a peu de valeur thérapeutique dans le traitement du cancer, en raison de ses actions multiples et de la courte durée de ses effets antisécrétoires; sa demi-vie dans la circulation étant d'environ 3 minutes (A.V. Schally et coll., Annu. Rev. Biochem. 4,7, 89 (1978) ) . Le travail de Veber et coll (1979-1984} avait apparemment pour but de préparer des analogues pour le traitement de diabètes du type I et leurs analogues n'ont pas révélé d'activités antitumorales sur divers modèles de tumeurs animales (A.V. Schally et coll., Proc.Soc. Exp. Biol. Med., 175. 259 (1984)). L'analogue de Bauer (Sandostatine) a été soumis à une évaluation clinique soignée (P. Marbach et coll., (1985) dans: Proc. Symp. Somatostatin, Montréal, Canada, 1984, Y.C. Patel & G. S. Tannenbaum éd., Elsevier, Amsterdam, p. 339). Il parait être un outil thérapeutique prometteur dans le traitement médical de 1'acromégalie, des tumeurs métastatiques endocrines pancréatiques et gastrointestinales telles que les insulinomes, les glucagonomes, les gastrinomes, les VIPomes, et les tumeurs carcinoides (A.V. Schally et coll., dans: "Neural and Endocrine Peptides and Receptors", T.W. Moody, Plénum Publishing Corp. éd. New York, 1986, p. 73).

Des analogues modernes de la somatostatine ont été indiqués comme ayant une utilité pour le traitement de certaines tumeurs, ainsi que comme appoints pour le traitement par les analogues de la LH-RH dans le cancer du sein (A.V. Schally, Cancer Res. 48/ 6977 (1988).

Les médicaments anticoncéreux idéaux seraient théoriquement ceux qui élimineraient les cellules cancéreuses sans nuire aux cellules normales. Des hormones portant des agents antinéoplasiques résoudraient le problème en permettant d'obtenir une chimiothérapie ciblée d'une manière plus efficace des tumeurs contenant des récepteurs. Un analogue hormonal qui contient un groupe cytotoxique incorporé ou lié à la séquence de l'hormone pourrait éventuellement être ciblé, et par conséquent être plus sélectif pour détruire le tissu cancéreux portant des

récepteurs d'hormones. Un mécanisme idéal de l'action de conjugués hormone -médicament serait leur liaison à un récepteur de membrane cellulaire, suivie d'une internalisation des molécules hybrides et d'une libération des médicaments ou de leurs dérivés biologiquement actifs de l'hormone de support dans les endosomes ou les lysosomes secondaires. Les substances libérées passeraient alors à travers la membrane des vésicules dans le cytosol et atteindraient les. sites constituant leur cible finale. Pour que les conjugués soient efficaces par ce mécanisme, la liaison entre le médicament et l'hormone doit être stable avant 1'internalisation des conjugués dans les cellules tumorales cibles, mais doit être coupée efficacement après cette internalisation.

Des récepteurs de la somatostatine ayant une activité élevée ou faible ont été trouvés dans divers tissus humains, dans le cerveau humain et les tumeurs hypophysaires, dans les tumeurs gastointestinales produisant des hormones, dans les cancers du sein, du pancréas, de la prostate et de l'ovaire (D. Reichlin, N. Engl. J. Med., 309, 1495 (1983), A.V. Schally, Cancer Res., 4j3' 6977 (1988). lia été démontré (Viguerie, N. et coll., Am. J. Physiol. 2 52: G 535-542, 1987), que la somatostatine liée au récepteur était internalisée et dégradée par les acini pancréatiques.

Conformément à ce concept, des analogues de la somatostatine contenant des radicaux cytotoxiques pourraient exercer les effets antitumoraux directs ou indirects des analogues de la somatostatine, et en même temps pourraient servir de support aux agents chimiothérapiques. Comme ces peptides peuvent se lier à des récepteurs spécifiques, ceci peut fournir une certaine sélectivité pour la cible au composé chimiothérapique et le rendre "spécifique des cellules" en abaissant sa toxicité non spécifique. Après internalisation, ces composés hybrides pourraient interférer avec les événements cellulaires en causant la mort des cellules.

Il existe plusieurs composés parmi les médicaments anticancéreux cliniquement utilisés qui ont la possibilité de se coupler à une molélcule peptidique de support. Le couplage pourrait être effectué par l'intermédiaire du groupe fonctionnel convenablement modifié de la partie cytotoxique et du groupe amino ou carboxyle libre d'un peptide.

Les agents d'alkylation utilisés dans le traitement du cancer ont fondamentalement un mécanisme d'action non sélectif. Ils agissent en exerçant des effets cytotoxiques par transfert de leurs groupes alkyle à divers constituants des cellules. L'alkylation de 1'ADN présent dans le noyau représente probablement les principales interactions qui conduisent à la mort des cellules. Cependant, dans des conditions physiologiques, ils peuvent alkyler tous les nucléophiles cellulaires tels que les groupes acides carboxylique et phosphorique ionisés, les groupes hydroxyle, les thiols et les parties azotées non chargées. Les moutardes azotées (chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan et moutarde azotée) sont parmi les médicaments anticancéreux les plus anciens utilisés en clinique. Ils forment spontanément des dérivés à cation aziridinium tricyclique (éthylènimonium) par cyclisation intramoléculaire, qui peuvent transférer directement ou par formation d'un ion carbonium, un groupe alkyle à un nucléophile cellulaire. La partie aziridine contenant des médicaments comme le thio-TEPA agit par le même mécanisme.

L'incorporation d'un melphalan alkylant (4-[bis{2-chloréthyl}amino] -phénylalanine ) à 1 ' angiotensine II a conduit à un antagoniste compétitif puissant, ce qui indique clairement que l'analogue n'a pas alkylé le récepteur (K.-H. Hsieh et G.R. Marshall, J. Med. Chem. 24. 1304-1310, 1981) .

Une activité cytotoxique significative (inhibition de l'incorporation de la [3H]thymidine) dans des cultures d'une lignée cellulaire de cancer du sein humain T-47D et d'une lignée cellulaire de tumeur mammaire de rat MT-4 et MT-5 a

t

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été démontrée avec des analogues de la LHRH contenant du D-melphalan.

Presque tous les agents d'alkylation utilisés en clinique sont bifonctionnels et sont capables de réticuler 5 deux molécules séparées, ou d'alkyler une molécule au niveau de deux sites nucléophiliques séparés. Les liaisons transversales avec 11 ADN peuvent être dans un brin unique, entre deux brins complémentaires ou entre l'ADN et d'autres molécules, telles que les protéines.

10 On pense que la cytotoxicité des agents d'alkylation est en corrélation avec leur efficacité de réticulation (J.J. Roberts et coll., Adv. Radiat. Biol. 2 211-435, 1978).

Le cisplatine (cis-diaminedichloroplatine) a été utilisé depuis longtemps dans le traitement du cancer. Les 15 analogues de la LHRH ayant une structure apparentée à celle du cisplatine dans la chaine latérale ont de fortes affinités pour les récepteurs de membrane des cellules du cancer de l'hypophyse du rat et du cancer du sein humain (S. Bajusz et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8J5 6313-6317, 20 1989). L'incorporation de complexes du cuivre (II) et du nickel (II) cytotoxiques dans des analogues de la LHRH convenablement modifiés a conduit à des composés ayant une activité hormonale1 élevée et une forte affinité pour les récepteurs de la LHRH sur la membrane de la cellule du 25 cancer du sein humain. Plusieurs de ces métallopeptides ont une activité cytotoxique sur les lignées cellulaires du sein et de la prostate humains in vitro, par exemple le pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys [Ahx-A2bu (SAL) 2 (Cu) ] -Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 inhibe l'incorporation de [3H]thymidine dans l'ADN de la 30 lignée cellulaire mammaire humaine MDA-MB-231 de 87 % à la dose de 10 fig.

Plusieurs antimétabo1ites ont un intérêt chimiothérapique potentiel en raison de leur importance dans le métabolisme du folate cellulaire (I.D. Goldman, et coll. 35 éd., Folyl et Antifolyl Polyglutamates. Plénum press, New York, 1983). Le méthotrexate, (acide [N-[p [ [ (2,4-diamino-6-ptéridinyl)méthyl]méthylamino]benzoyl] glutamique) est un

t

I

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antagoniste de l'acide folique qui inhibe la fonction de la dihydrofolate réductase et interrompt de cette manière la synthèse du thymidilate, des nucléotides de la purine, et des amino acides sérine et méthionine, interférant ainsi 5 avec la formation de l'ADN, de l'ARN et des protéines.

RESUME DE L'INVENTION

La présente 'invention concerne des analogues courts,

cycliques de la somatostatine qui possèdent une forte

10 activité agoniste et qui comprennent une partie cytotoxique incorporée à la séquence peptidique ou liée à la chaîne peptidique. Des parties cytotoxiques telles qu'une moutarde azotée, des antimétabolites, des parties cycliques à trois maillons, des quinones, des antibiotiques antitumoraux, des

15 complexes du platine ou des complexes de métaux dérivant d'agents antitumoraux de métaux n'appartenant pas au groupe du platine qui sont représentés par des composés minéraux ou organométalliques contenant des métaux de transition, tels que le titane, le vanadium, le fer, le cuivre, le cobalt, et

20 l'or, et aussi le nickel, le cadmium et le zinc, ou un composé cytotoxique incorporé sous forme de complexe des métaux ci-dessus.

Certains composés de l'invention sont représentés par la formule I 25 I !

Q-Ri-R2 -R3-D-Trp-Lys-R6-R7-R8-NH2 I

dans laquelle

R1 est un L-, D- ou DL-amino acide choisi parmi Phe, Mel, Trp, Thr, Val, Gly, Ala, Ser,

30 R2 et R7 sont la L-, D- ou DL-cystéine,

R3 est un L-, D- ou DL- amino acide choisi parmi Tyr, Phe, Mel,

R6 est Thr ou Val,

R8 est un L-, D- ou DL-amino acide choisi parmi Thr, Trp, 35 Mel, Val, Pro, Tyr, Ala, Gly, MeAla,

Q est choisi parmi l'atome d'hydrogène, L et D-Mel, le dipeptide Mel-Mel, les cyclopropanealcanoyles, l'aziridine-2-carbonyle, le méthotrexoyle, le 1,4-naphtoquinone-5-

oxycarbonyléthyle, les époxyalkyles et leurs dérivés £2-carbonyl-alkylaminés; et leâ dérivés £2-carbonyl-alcanoylés de la 2-hydroxyméthyl-anthraquinone, de la doxorubicine, de 1'espéramycine, et de la mitomycine C;

dans lesquels le groupe £2-carbonyl-alkylamino répond à la formule

-C0- (CH2) n-NH~ dans laquelle n est 2-6, et le groupe Q.-carbonyl -alcan oy 1 e répond à la formule

-C0- (CH2) n~co~ dans laquelle n est 2-6, et leurs sels avec des acides et des bases pharmaceutiquement acceptables.

Les autres composés entrant dans le domaine de l'invention sont représentés par la formule II

I ~ 1

Ql-A-Ri-R2 -R3-D-Trp-Lys-R°-R7-R8-NH2 II

dans laquelle

R1 est un L-, D- ou DL-amino acide choisi parmi Phe, Trp,

Thr, Val, Gly, Ala, Ser,

R2 et R7 sont la L-, D- ou DL-cystéine,

R3 est un L-, D- ou DL- amino acide choisi parmi Tyr, Phe, R6 est Thr ou Val,

R8 est un L-, D- ou DL-amino acide choisi parmi Thr, Trp, Val, Pro, Tyr, Ala, Gly, MeAla,

A est un diaminoacyle, de préférence un diaminoalcanoyle répondant à la formule

-HN-CH2- (CH2)m~ (HN) CH- (CH2} n~CO III:

dans laquelle m est 0 ou 1 et n est 0 ou 1,

Q1 est une partie cytotoxique répondant à la formule

Q2(IV) ou (B)2Q3 (V) ou (Q4) 2 (VI)

dans laquelle q2 est Pt(Y)2, ou Y est un anion d'un acide pharmaceutiquement acceptable,

Q3 est un métal n'appartenant pas au groupe du platine, tel que le titane, le vanadium, le fer, le cuivre, le cobalt, l'or, le nickel, le cadmium et le zinc,

Q4 est choisi parmi L ou D-Mel, le dipeptide Mel-Mel, un cyclopropanealcanoyle, 1'azidiridine-2-carbonyle, un

époxyalkyle, le 1,4-naphtoquinone-5-oxycarbonyléthyle, ou leurs dérivés £2-carbonyl-alkylaminés; les dérivés Q.-carbonyl-alcanoylés de la 2-hydroxyméthyl-anthraquinone, de la doxorubicine, de 1'espéramicine et de la mitomycine C, dans lesquels le groupe fl-carbonyl-alkylamino répond à la formule

-C0-(CH2)n-NH- où n est 2-6;

et le groupe £2-carbonyl-alkanoyle répond à la formule -C0-(CH2)n-CO- où n est 2-6.

B est un groupe aralkylidène ou hétéroaralkylidène substitué choisi parmi les halo- et nitrophénylalkylidènes inférieurs; les (alkyle inférieur) hydroxyméthy1- ou phosphooxyméthyl pyridyle alkylidènes inférieurs dans lesquels 1'alkyle inférieur a 1-6 atomes de carbone, et leurs sels avec des acides et des bases pharmaceutiquement acceptables.

On préfère particulièrement les composés cycliques dans lesquels la fonction oxygénée substituante est à la position 2 -, et qui dérive d'un composé 2-hydroxy-l-oxo tels qu'un salicyaldéhyde substitué ou non substitué, le pyridoxal , le pyridoxal-phosphate, qui forme une base de Schiff avec le groupe amino de A et peut se combiner avec un ion métallique par son oxygène négativement chargé.

Les composés répondant à la formule I peuvent se préparer par un procédé en phase solide ou par une combinaison de la technique en phase solide et de la synthèse classique (en solution). Ils sont de préférence préparés à partir de peptides intermédiaires répondant à la formule VIIA

x1-r1-r2 (X2) -R3 (X3)-D-Trp-Lys (X5 ) -Rs-R7) -R8 (X8) -NH-X9 VIIA

dans laquelle

I

R1, R2, R3, R6, R7 et R8 sont tels que définis ci-dessus,

X1 est un atome d'hydrogène ou un groupe acyle en C2-C5 sous réserve que la formule I soit un octapeptide ou Mel, Azy ou Mel-Mel sous réserve que la formule I soit un nonapeptide ou un décapeptide, respectivement,

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X2 et X7 sont des atomes d'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe sulfhydryle de Cys,

X3 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

5 X5 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe e-amino de Lys,

X8 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

X9 est un atome d'hydrogène ou un groupe benzhydryle 10 incorporé à une résine.

Les peptides répondant à la formule II peuvent se préparer par un procédé en phase solide. Ils sont de préférence préparés à partir de peptides intermédiaires répondant à la formule VIIIA qui peuvent être obtenus à 15 partir d'une résine de peptide répondant à la formule VIIA (dans laquelle X1 est un atome d'hydrogène) par acylation avec un A convenablement protégé:

X-A-R^-R2 (X2) -R3 (X3) -D-Trp-Lys-R6-R7 (X7 ) -R8 (X8) -NH-X9 VIIIA dans laquelle

20 A, R1, R2, R3, R6, R7 et R8 sont tels que définis ci-dessus, et les X sont des groupes protecteurs sur le diamino acide.

Les composés répondant aux formules VIIA et VIIIA sont des intermédiaires dans le processus de préparation des composés cycliques répondant à la formule I. Le pont entre 25 R2 et R7 peut être un pont disulfure (-S-S-), un pont carbone/soufre (-C-S-) ou un pont carbone-carbone (-C-C-), suivant les caractéristiques du radical aux positions 2 et 7. La réaction de cyclisation effectuée après déprotection donnant des composés répondant aux formules VIIB et VIIIB:

30

I 1

r1_r2 -r3-D-Trp-Lys (X5) -R6-R7-R8-NH2 VIIB

et

I 1

35 A-Rx-R2 -R3-D-Trp-Lys (X5)-R6-R7-R8-NH2 VIIIB

dans lesquelles A, R1,R2 ,R3 ,R4'R6,R7 et R8 sont tels que définis ci-dessus,

X5 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur peur le groupe amino de la chaîne latérale Lys,

Le processus de préparation des métallopeptides répondant à la formule XI comprend la réaction d'un peptide répondant à la formule VIIIB (dans laquelle X5 est un atome d'hydrogène) avec î^PtCl^ dans laquelle Q1 est Q2, c'est-à-dire PtCl2) comme partie cytotoxique, laquelle peut, si on le désire être transformée en PtY2 par des procédés connus.

Le procédé de préparation du composé répondant à la formule II dans laquelle Q2 est (B)2Q3 comprend la réaction d'un peptide répondant à la formule VIIIB (dans laquelle Ks est un atome d'hydrogène) avec un complexe préformé in situ è partir d'un composé Q3 hydroxy-oxo et d'un métal n'appartenant pas au groupe du platine.

Un composé répondant à la formule X dans laquelle C est un cyclopropanealkanoyle, un époxyalkyle, la 1-4-naphtoquinone-S-ovyrarhnny1éthy1e ou le méthotrexoyle peut être obtsnu po-^ alkyls.tion ou a.ey la t t on rin composé VII B (dans lequel X5 est un groupe Boc ou FMOC) avec un halogénure d'alkyle ou d'alkanoyle, le méthotrexate. La synthèse de peptides répondant à la formule I, dans laquelle la partie cytoxique est 1 ' anthraquinone, la doxorubicine, 1 ' espéramycine ou la mitomycine C, est effectuée par couplayy de ces composés à VUS par l'intermédiaire d'un groupe d'espacement bifonctionnel.

Une composition pharmaceutique est obtenue en mélangeant le composé répondant à la formule i et/ou celui répondant à la formule II avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, tel que des microcapsules (microsphères) pour une délivrance retardée.

On a montré que les composés cytotoxiques de la présente invention inhibaient la libération de l'hormone de croissance et ils sont supposés inhiber la libération de d'insuline, de glucagon, de gastrine, de secrétine et de cholécystokinine comme le font les peptides qui leur sont apparentés. Ainsi, lorsque la croissance du tissu tumoral est affectée par une des hormones régulées par les peptides

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apparentés, la partie cytotoxique supplémentaire qu'ils portent doit augmenter leur efficacité dans le traitement de tumeurs sensibles aux hormones telles que les adénocarcinomes prostatiques, les carcinomes mammaires, les 5 insulinomes, les gastrinomes, les chondrosarcomes, les ostéosarcomes, les tumeurs du canal pancréatique, les tumeurs acinaires du pancréas, les cancers gastriques, les cancers du colon, certains cancers du poumon, et les tumeurs du cerveau.

10 Deux des composés de l'invention, qui ne contiennent pas de groupes cytotoxiques, ont une activité plus élevée pour l'inhibition du déversement de l'hormone de croissance que celle de l'analogue de Bauer et leurs pouvoirs inhibiteurs pour l'insuline et le glucagon chez le rat sont 15 plus faibles. L'un des composés de l'invention s'est révélé inhiber la croissance d'un cancer expérimental de la prostate Dunning R3327 chez le rat, du cancer pancréatique chez le hamster, du cancer du sein MXT chez la souris, et il a pu trouver une application thérapeutique potentielle dans 20 le traitement du cancer du sein, des ostéo- et condrosarcomes, des tumeurs malignes pancréatiques et gastrointestinales, et des tumeurs hypophysaires sécrétant l'hormone de croissance et de certains adénomes. Des découvertes récentes sur les sites de liaison au récepteur 25 des analogues de la somatostatine ont révélé qu'il peut exister des différences entre les récepteurs de la somatostatine non seulement par rapport au tissu cancéreux, mais également entre diverses tumeurs.

30 DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION PREFERES

Pour plus de commodité dans la description de l'invention, on a utilisé ici les abréviations conventionnelles pour les aminoacides, les peptides et leurs dérivés telles qu'elles sont généralement acceptées dans la 35 technique des peptides et recommandées par la IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature [European J. Biochem., 138. 9-37 (1984)].

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Les abréviations pour les radicaux d1aminoacides individuels sont basés sur le nom trivial de 1 ' aminoacide, par exemple pGlu est l'acide pyroglutamique, His est l'histidine, Trp est le tryptophane, Ser est la sérine, Tyr est la tyrosine, Lys est la lysine, Leu est la leucine, Arg est l'arginine, Pro la proline, Gly est la glycine, Ala est l'alanine et Phe est la phénylalanine. Lorsque le radical aminoacide a des formes isomères, c'est la forme L de 1'aminoacide qui est représentée, sauf indication contraire.

Les abréviations des aminoacides non communs utilisés dans la présente invention sont les suivantes : Mel est la 4-[bis(2-chloréthyl)amino]-phénylalanine, A2pr est l'acide 2,3-diaminopropionique.

Les séquences peptidiques sont écrites conformément à la convention selon laquelle 1'aminoacide N-terminal est sur la gauche et 1'amino acide C-terminal est sur la droite.

D'autres abréviations utilisées sont les suivantes:

AcOH acide acétique

AC2O anhydride acétique

Azy Aziridine-2-carbonyle

Boc tert.butoxycarbonyle

Bzl benzyle

CISAL 5-chloro-2-0-l-benzylidène

DCB 2,6-dichlorobenzyle

DCC N,N' -dicyclohexylcarbodiimide

DCM dichlorométhane

DIC N,N'-diisopropylcarbodiimide

DMF diméthylformamide

DOX doxorubicynyle (Adriamycine)

EPP époxypropyle

FM0C9-fluorénylméthyloxycarbonyle ESP espéramycinyle

HMAQG anthraquinone-hémiglutarate de méthyle HOBt 1-hydroxybenzotriazole

HPLC chromatographie liquide à hautes performances MBzl méthylbenzyle MeCN acétonitrile

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MeOH alcool méthylique

MIT Mitomycine C~yle

MTX rnéthotrexoyl (améthropeérine)

NQCE 1, 4-naphtoquinone-5-oxycarbonyléthyle

POL 2~méthyl-3-Q-5~hydroxyméthyl~4-picolylidène

POLP 2-méthyl-3-0-5-phosphoxyméthyl-4-picolylidène

SAL 2-O-l-benzylidène

TEA triéthylamine

TFA acide trifluoracétique

Trt Trityle

Z benzyloxycarbonyle t

Z (2 -Br) 2-bromobenzyloxycarbonyle Z {2 -Cl ) 2 -chlorobenzyloxycarbonyle

On préfère particulièrement, les analogues de la somatostatine réoondant à la formule I i |

Q-Rl~Cys-R3-D-Trp-Lys-R$-Cys-R3-NH2 1

dans laquelle

R1 est L, ou D-Phe, D-îrp, L ou D-Mel,

R3 est Mel, Tyr ou Phe,

R6 est Thr ou Val R8 est Thr, Trp, ou Mel,

Q est choisi parmi l'atome d'hydrogène, L et D-Mel, le dipeptide Mel-Mel, le cycloprcpanecarbonyle, 1'aziridine-2-

carbonyle,le 1, 4-naphtoquinone-5-oxycarbonylé thy le , un

époxyalkyle et les dérivés D-carbonyl-alcanoylés de la 2-

hydroxym é thy1-anthraquinone, de la doxorubicine, de

1 espéiamycine, et de la mitomycine C; le groupe -carbony 1 - a 3 c a n o y 1 c étant tel que défini ci-dessus.

Les composés répondanc à la formule I! qui ont des radicaux cytotoxiques liés à la séquence d'analogues courts, cycliques, de la somatostatine sont eux aussi particulièrement préféx'és:

Q1-A-R1-Cys-R3-D-Trp-Lys-R6-Cys-R°~NH;, II

dans laquelle

R1 est un L" ou D-Phe, un L- ou D-Trp,

R3 est Phe ou Tyr,

r

5

10

15

20

25

30

35

40

45

- 15 -

R6 est Thr ou Val,

R8 est Thr ou Trp,

A est A2pr.

En ce qui concerne les parties cytoxiques préférées répondant aux formules

Q2 ou (B)2Q3 ou {(Q4)2

dans lesquelles

Q2 est PtCl2,

Q3 est Cu++ ou Ni++,

B est SAL,, CISAL, POL ou POLP,

Q4 est un L ou D-Mel, le 1 , 4-naphtoquinone-5-oxycarbonyléthyle, un époxyalkyle, 1'anthraquinone alcoxy, 1'aziridine-2-carbonyle et le cyclopropane carbonyle.

Les modes de réalisation particulièrement préférés sont :

i 1

1. Mel-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

I 1

2. D-Mel-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2

I 1

3. D-Phe-Cys-Mel-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

I l

4. D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Mel-NH2

1 1

5. Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NHn

6. Mel-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH0

r i

7. Mel-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr- NH?

8. Mel-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NEb

9. Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH/.^

10. [A2pr(Mel)2]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH?

I 1

11. Mel -Mel -D- Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys -Val -Cy s -Thr-NH2

12. [A2pr(PtCl)2]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

i 1

13. [A2pr(PtCl)2]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2

\ 1

14. [A2pr (SAL) 2Cu] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

i 1

15. [A2pr(CISAL) 2CU]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NHb

[ 1

16. MTX-D-Phe-Cys -Tyr-D-Trp-Ly s -Val -Cys -Thr-NH2

- 16 -

17. MTX-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2

i 1

18. MTX-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2

Dans tous les modes de réalisation ci-dessus, le composé peut également être préparé sous forme de sel d'addition d'acides ou de bases organiques ou minéraux pharmaceutiquement acceptables. Comme exemples non limitatifs, on peut citer les sels suivants: chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, phosphate, fumarate, gluconate, tannate, maléate, acétate, citrate, benzoate, succinate, alginate, pamoate, malate, ascorbate, tartrate, etc. ainsi que des sels de métaux alcalins et alcalino terreux.

Modes opératoires de détermination

Les composés de l'invention présentent des effets puissants sur le déversement de l'hormone de croissance (GH) par l'hypophyse, ils se lient aux membranes des cellules tumorales, ils inhibent l'incorporation de [3H]thymidine à l'ADN dans les cultures cellulaires et la croissance de certaines cellules tumorales.

(a) Activités d'inhibition de la libération de 1 hormone de croissance

La capacité des composés d'influencer la libération de l'hormone de croissance et de la prolactine in vitro est déterminée en utilisant un système de cellules hypophisaires de rats supercondensé [S. Vigh et A.V. Schally, Peptides, 5 Suppl. 1, 241-247 (1984)].

Pour déterminer l'effet inhibiteur de la libération des hormones, chacun des peptides est perfusé à travers les cellules pendant 3 minutes (1 ml de perfusat) à une concentration de 50-500 pM en même temps que lnM de GHRH. L'hormone de croissance du rat est mesurée dans des parties aliquotes des perfusats par dosage radioimmunologique (avec un nécessaire de RIA de NIAMDDK) pour déterminer soit la sécrétion basale, soit la sécrétion inhibée. L'activité des

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peptides est comparée à celle de 25 pM de somatostatine (1-14) perfusée d'une manière similaire.

(b) Liaison aux récepteurs.

5 L'affinité des peptides pour les membranes des cellules du cancer du sein humain est déterminée en utilisant de la (Tyr11)-somatostatine marquée par du 125I. L'essai de liaison est effectué d'une manière similaire à celui décrit par M. Fekete et coll., J. Clin. Lab. Anal. 3j_ 10 137-141, 1989.

(c) Essai de cytotoxicité

L'activité cytotoxique in vitro des composés de la présente invention est mesurée par une variante des méthodes 15 semiautomatisées de Finlay et coll. (Anal. Biochem., 139, 727 (1984)) et de Dawson et coll. (J. Interferon Res., 6, 137 (1986)).

Diverses lignées cellulaires de cancers humains ont été cultivées dans le milieu RPMI-164 ou dans du milieu 20 d'Eagle modifié par Dulbecco. Les peptides sont.ajoutés à des concentrations de 1-10 000 ng/ml et les effets inhibiteurs sur la-croissance cellulaire (% de survie) sont quantifiés en colorant les cellules, en les solubilisant, puis en déterminant la densité optique. 25 La capacité des peptides répondant à la formule I

d'inhiber l'incorporation de [3H]thymidine dans de l'ADN de cultures en monocouche d'une lignée de cancer du poumon H-69 et d'une lignée de cellules MiaPaCa est déterminée comme il a été décrit par Kern et coll. (Cancer Res., 4J5, 5436 30 (1985).

Synthèse de peptides

Les peptides de la présente invention peuvent se préparer par n'importe quelle technique connue des 35 spécialistes de la technique des peptides. On trouvera un résumé des techniques existantes dans M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer éd., Heildelberg,

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1984. Une solution classique de synthèse est décrite en détail dans le traité "Methoden der Organische Chemie" (Houben-Weyl), vol.i 15, Synthese von Peptiden, Parts I and II, Georg Thieme éd., Stuttgart, 1974. Les techniques de synthèse exclusivement en phase solide sont indiquées dans l'ouvrage de J.M. Stewart et J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Sté Pierce Chem, Rockford, IL, 1984 (2è éd.) et dans la revue de G. Barany et coll., Int. J. Peptide Protein Res. 10' 705-739, 1987.

Les peptides intermédiaires de l'invention et ceux des peptides qui contiennent du melphalan son synthétisés par un procédé en phase solide. Dans la synthèse en phase solide, des aminoacides protégés appropriés (parfois des peptides protégés) sont ajoutés progresivement dans la direction C-->N une fois que 1'aminoacide C-terminal a été fixé (ou ancré) d'une manière appropriée à un support solide inerte tel qu'une résine. Lorsque le stade de couplage est terminé, le groupe protecteur N-terminal est éliminé de ce radical d'aminoacide nouvellement ajouté et 1'amino acide suivant, adéquatement protégé, est ensuité ajouté et ainsi de suite. Lorsque tous les aminoacides désirés ont été liés dans l'ordre approprié, le peptide est détaché du support et débarrassé du ou des groupes protecteurs restant, à condition qu'ils aient une action destructrice minima vis-à-vis des radicaux de la séquence. Ceci doit être suivi d'une purification prudente et d'une caractérisation scrupuleuse du produit synthétique, de manière à s'assurer que la structure désirée est effectivement celle qui a été-obtenue.

Mode de réalisation préférés de la synthèse

Un procédé particulièrement préféré pour la préparation des composés répondant à la formule I de la présente invention est la synthèse en phase solide. Par exemple, un peptide ayant Mel dans la position 0 est préparé par ce procédé ainsi que par le procédé classique (par couplage d'un analogue de 1'octapeptide avec Boc-Mel en solution).

i

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Les peptides répondant à la formule I sont de préférence préparés à partir de peptides intermédiaires répondant à la formule VIIA:

X1-!*1-!*2 (X2) -R3 (X3) -D-Trp-Lys (X5) -R6-R7 (X7) -R8 (X8)-NH-X9 VIIA 5 dans laquelle

R1, R2, R3, R6, R7, R8 et X1 sont tels que définis ci-dessus.

X2 et X7 sont des groupes méthybenzy1e (MBzl) pour la protection du groupe sulfhydryle de Cys,

10 X3 est un groupe 2-Br-benzyloxycarbonyle [Z(2-Br)] ou 2,6-dichlorobenzyle (DCB) pour la protection du groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

X5 est un groupe protecteur Z(2-C1) ou FMOC pour le groupe amino de la chaine latérale de Lys 15 X8 est un groupe 2-Br-benzyloxycarbonyle [Z(2-Br)] ou 2,6-dichlorobenzyle (DCB) pour la protection du groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

X^ est un groupe benzhydryle ou méthylbenzhydryle protecteur du groupe amide incorporé à un support de résine; pour la 20 synthèse d'amides peptidiques, on préfère le copolymère benzhydrylamino-polystyrène-2% de di viny lbenz ène du commerce.

Pour préparer des peptides intermédiaires répondant à la formule VIIIA contenant un groupe diaminoacyle pour 25 préparer le composé répondant à la formule II, le procédé préféré et la synthèse des peptides en phase solide. Les composés répondant à la formule VIIIA sont obtenus en couplant des peptides répondant à la formule VIIA (dans laquelle X1 est un atome d'hydrogène) avec Boc2A2pr, 30 opération qui, suivie d'une déprotection, donne des peptides répondant àla formule II.

X2A2pr-D-Phe-Cys (X2) -Tyr (X3) -D-Trp-Lys (X5) -Val-Cys (X7) -R8(X8)-X9 dans laquelle R8, X2, X3, X5, X7, X8, et X9 sont tels que définis ci-dessus.

35 X est un groupe protecteur Boc pour les groupes amino de A2pr.

- 19 -

Les peptides répondant à la formule I sont de préférence préparés à partir de peptides intermédiaires répondant à la formule VIIA:

X1-!*1-!*2 (X2) -R3 (X3) -D-Trp-Lys (X5) -R6-R7 (X7.) -R8 (X8) -NH-X9 VIIA 5 dans laquelle

R1, R2, R3, R6, R7, R8 et X1 sont tels que définis ci-dessus.

X2 et X7 sont des groupes méthybenzyle (MBzl) pour la protection du groupe sulfhydryle de Cys,

10 X3 est un groupe 2-Br-benzyloxycarbonyle [Z{2-Br)] ou 2,6-dichlorobenzyle (DCB) pour la protection du groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

X5 est un groupe protecteur Z(2-C1) ou FMOC pour le groupe amino de la chaine latérale de Lys 15 X8 est un groupe 2-Br-benzyloxycarbonyle [Z(2-Br)] ou 2,6-dichlorobenzyle (DCB) pour la protection du groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

X9 est un groupe benzhydryle ou méthylbenzhydryle protecteur du groupe amide incorporé à un support de résine; pour la 20 synthèse d'amides peptidiques, on préfère le copolymère benzhydrylamino-polystyrène-2% de di viny lbenz ène du commerce.

Pour préparer des peptides intermédiaires répondant à la formule VIIIA contenant un groupe diaminoacyle pour 25 préparer le composé répondant à la formule II, le procédé préféré et la synthèse des peptides en phase solide. Les composés répondant à la formule VIIIA sont obtenus en couplant des peptides répondant à la formule VIIA (dans laquelle X1 est un atome d'hydrogène) avec Boc2A2pr, 30 opération qui, suivie d'une déprotection, donne des peptides répondant àla formule II.

X2A2pr-D-Phe-Cys (X2) -Tyr (X3) -D-Trp-Lys (X5) -Val-Cys (X7) -R8(X8)-X9 dans laquelle R8, X2, X3, X5, X7, X8, et X9 sont tels que définis ci-dessus.

35 X est un groupe protecteur Boc pour les groupes amino de A2pr.

- 20

Pour préparer des composés cycliques répondant aux formules VIIB et VIIIB à partir des formules réduites VIIA et VIIIA, l'oxydation des deux groupes sulfhydryle de la cystéine par l'iode en solution acide diluée est le procédé 5 particulièrement préféré.

La synthèse en phase solide des peptides répondant à la formule VIIA commence par la fixation de Thr, Trp, ou Mel protégé par Boc à une résine' de benzhydrylamine en CH2CI2 • Le couplage est effectué en utilisant DIC ou DIC/HOBt à la 10 température ambiante. Après l'élimination du groupe Boc, le couplage des aminoacides protégés successifs (chacun est utilisé dans un excès molaire de 3) est effectué dans CH2CI2 ou dans des mélanges DMF/CH2CI2, suivant la solubilité des Boc-amino acides. Le succès de la réaction de couplage à 15 chaque stade de la synthèse est de préférence suivi par l'essai à la ninhydrine tel que décrit par Kaiser et coll. [Anal. Biochem. 3_4, 595 (1970)]. Lorsqu'il se produit un couplage incomplet, on répète l'opération de couplage avant l'élimination du groupe protecteur du groupe alpha-amino 2 0 avant la réaction avec 1'aminoacide suivant.

Après avoir achevé la séquence d'aminoacides désirée pour les peptides intermédiaires répondant à la formule VIIA, on traite la résine de peptide avec du HF liquide en présence d'anisol pour obtenir les peptides répondant à la 25 formule VIIA dans laquelle X2, X3, X5, X7, X8, et X9 sont des atomes d'hydrogène.

Les peptides répondant à la formule VIIIB sont transformés en peptides répondant à la formule II (dans laquelle Q1 est PtCl2) en faisant réagir les peptides avec 30 une quantité équivalente de K2PtCl4 dans du DMF aqueux à 60-80 % à la température ambiante, après quoi on effectue une purification par HPLC. Les composés contenant du platine, si on le désire, peuvent être transformés en les composés correspondants contenant PtY2 par des techniques connues. 35 La préparation des composés répondant à la formule I,

dans laquelle Q est MTX, est effectuée en couplant un

- 21 -

composé répondant à la formule VIIB avec MTX par le procédé au carbodiimide.

Les peptides répondant à la formule II (dans laquelle Q1 est (B)2Q3) portant un atome de métal n'appartenant pas 5 au groupe du platine comme partie cytoxique sont obtenus à partir de peptides intermédiaires répondant à la formule VIIIB par couplage avec un complexe préformé d'un composé hydroxy-oxo-Q3 avec un cation cuivre ou nickel dans une solution aqueuse de DMF à 60-80 %, après quoi on isole le 10 complexe peptide-métal désiré par HPLC.

On peut aussi préparer des composés répondant à la formule II, dans laquelle Q1 est (B)2Q3 à partir d'un peptide intermédiaire répondant à la formule VIIIB (dans laquelle X5 est un groupe protecteur FMOC) en le faisant 15 réagir avec un composé hydroxy-oxo-Q3, approprié, puis un sel métallique d'un acide pharmaceutiquement acceptable, de préférence l'acétate de Cu++ et Ni++, après quoi on effectue une déprotection par 30 à 50 % de pipéridine et l'isolement par HPLC.

20 L'analogue contenant Mel-Mel répondant à la formule II

est obtenu en phase solide par acylation du peptide répondant à la formule VIIIA avec Boc-Mel, après quoi on effectue une déprotection, une oxydation et une purification.

25

PURIFICATION DES PEPTIDES Les peptides intermédiaires répondant aux formules VIIB et VIIIB dans lesquelles tous les groupes protecteurs sont éliminés, sont purifiés en deux stades. Tout d'abord, 30 on soumet le lyophilisât de la solution provenant de la réaction d'oxydation à une filtration sur gel sur une colonne (1,2 x 100 cm) de Sephadex G15 fin pour éliminer les produit polymérisés, l'iode libre et les sels par élution avec de l'acide acétique à 50 %. Dans le second stade, on 35 purifie le lyophylisat (contenant le peptide désiré) provenant de la filtration sur gel par chromatographie liquide à hautes performances (HPLC) sur une colonne à phase

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inversée. On effectue une HPLC semi-préparative sur un SYSTEME de HPLC RAININ (RAININ Inc., Woburn, MA) constitué de trois pompes à HP HPLC Rabbit Rainin commandées par un calculateur APPLE MACINTOSH PLUS, d'un injecteur Rheodyne et 5 d'un détecteur UV de longueur d'onde variable KNAUER modèle 87. Les peptide bruts sont purifiés sur une macrocolonne DYNAMAX (21,2 x 250 mm) remplie d'un silicagel C18 sphérique (taille de pores: 300 , taille de particules: 12 (im ) (Société Rainin Inc., Co.)(Colonne A). La colonne est éluée 10 avec un système de solvants i constitué (A) de TFA aqueux à 0,1 % et (B) de de TFA à 0,1 % dans de 1 ' acétonitrile aqueux à 70 %. (Pour la préparation des éluents de HPLC, 11acétonitrile de qualité UV est acheté à la société Burdick Se Jackson, le TFA et l'AcOH sont de qualité HPLC/Spectro 15 (Pierce Chem.) et l'eau est bi-distillée dans du verre et purifiée à travers un système de purification de l'eau Milli-Q (Millipore)).

Les peptides contenant le melphalan répondant aux formules I et II sont également purifiés en deux stades. Le 20 melphalan (et par conséquent les peptides contenant du melphalan) se décomposent aisément en solution aqueuse, par conséquent la purification doit donc être effectuée aussi rapidement que possible. Pour éliminer les polymères oxydés, l'iode et les sels, on utilise une petite colonne de 25 Sephadex G-15 fine (0,6 x 10 cm). Pour réduire les possibilités de dégradation, la purification est effectuée à 4°C. La colonne est éluée avec du AcOH aqueux à 90%. Les fractions recueillies sont immédiatement lyophilisées et les peptides sont purifiés par HPLC. Une colonne en phase 30 inversée VYDAC Protein & Peptide Cis (10 x 250 mm, remplie de silicagel Ci8/ taille de pores: 300 À, taille de particules: 5|im) (ALTECH, Deerfield, IL) (Colonne B) est montée sur le même instrument que ci-dessus. La colonne est éluée avec un système de solvants i_i constitué (A) d'acide 35 acétique aqueux à 0,2 % et (B) d'acide acétique à 0,2 % dans de 1'acétonitrile aqueux à 70 %, associant un mode isocratique et un mode gradient. L'éluent de la colonne est

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suivi à 220 nm et les fractions sont recueillies dans un bain de glace.

Les peptides contenant du platine répondant à la formule II peuvent être séparés dans une seule étape de HPLC. La purification est effectuée sur une colonne de 10 x 250 mm de W-POREX Cis (taille de pores: 300À, taille de particules: 5flm)' (Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA) (Colonne C) en utilisant le système de solvants i.. La chromatographie est effectuée à la température ambiante, et l'éluat de la colonne est suivi à 220 nm.

Les peptides répondant à la formule II ayant des parties cytotoxiques Cu ou Ni nécessitent des conditions ménagées lors de la purification par HPLC en raison de l'instabilité du complexe métallique en solution fortement acide. Les analogues sont purifiés sur une Colonne B éluée avec un système de solvants iii constitué (A) d'acétate d'ammonium 0,1 M (pH 7,0) et (B) d'acétate d'ammonium 0,1 M dans du MeCN aqueux à 65 %.

HPLC ANALYTIQUE Les caractéristiques de qualité et d'élution des peptides bruts et purifiés sont établies par HPLC analytique sur un chromâtographe liquide Hewlett-Packard modèle 1090 équipé d'un détecteur à rangée de diodes réglé à 220 et 280 nm et une colonne à phase inversée de 4,6 x 250 mm de W-POREX Cis (taille de pores: 300 À, taille de particules : 5 fi.m) (Colonne D) . Un débit de 1,2 ml/min du système de solvants 1 ou 3 est maintenu et les séparations sont effectuées à la température ambiante.

ANALYDE DES AMINO ACIDES Les échantillons de peptides sont hydrolysés à 110°C pendant 20 heures dans des tubes scellés où l'on a fait le vide, contenant de l'acide méthane-sulfonique 4M. Des analyses sont effectuées avec un analyseur d'amino acides Beckman 6300.

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MODE D'EMPLOI

Des microcapsules ou microparticules de ces peptides formulées à partir du poly(DL-lactide-co-glycolide) sont des systèmes de délivrance ininterrompue préférés pour 5 l'injection intramusculaire ou souscutanée. L'administration intraveineuse du peptide dans des solutions salines isotoniques, dans des solutions tampon phosphate etc. peut également être utilisée.

Les formes pharmaceutiques contiennent avantageusement 10 le peptide en association avec un support classique, pharmaceutiquement acceptable. L'intervalle de doses est d'environ 1 à environ 100 microgrammes du peptide par kilogramme du poids du corps de l'hôte lorsqu'il est administré par voie intraveineuse ou intramusculaire. Dans 15 l'ensemble, le traitement des sujets par ces peptides est généralement effectué de la même manière que le traitement clinique en utilisant des agonistes et des antagonistes de la LHRH.

Ces peptides peuvent être administrés aux mammifères 20 par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, ou intravaginale pour obtenir un effet antitumoral. Les doses effectives varieront avec le mode d'administration et l'espèce particulière de mammifère traitée. Un exemple d'une forme pharmaceutique typique est 25 une solution saline physiologique contenant le peptide, laquelle solution est administrée pour donner une dose dans l'intervalle d'environ 0,1 à 2,5 mg/kg de poids du corps.

Bien que l'invention ait été décrite en considérant ces modes de réalisation préférés, il est à noter que des 30 modifications évidentes pour le technicien ordinaire peuvent être effectuées sans s'écarter du domaine de l'invention, qui est défini dans les revendications annexées.

Des substitutions connues dans la technique qui ne diminuent pas d'une manière importante son efficacité 35 peuvent être utilisées dans l'invention.

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PREPARATION I

r

D-Phe-Cys

-Tyr-

1

-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

IA

r

5 D-Phe-Cys

-Tyr-

i

■D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2

IB

r

D-Phe-Cys

-Phe-

1

■D-Trp-Lys -Thr-Cy s -Thr-NH2

IC

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 ID

10

La préparation IA est construite étape par étape sur une résine de benzhydrylamine HCl contenant environ 0,55 méq. de NH2/g (Advanced Chem Tech,Louisville, KY) dans un récipient réactionnel pour la synthèse manuelle en phase 15 solide. On neutralise 0,5 g de résine de benzhydrylamine HCl (environ 0,27 mmoles) avec de la triéthylamine à 10 % dans CH2Cl2, deux fois pendant trois minutes à chaque fois et on la lave six fois avec du CH2Cl2. On mélange la résine avec un excès molaire de trois de Boc-Thr(Bzl) (0,75 mmole) et 20 d'HOBt (0,82 mmole) dans du DMF pendant trois minutes. On ajoute du diisopropylcarbodiimide à 5 % (0,82 mmole) dans du CH2C12 . On agite le mélange à la température ambiante pendant 90 minutes. On lave six fois la résine obtenue avec du DCM et on la soumet à un essai de Kaiser (Kaiser et 25 coll., Anal. Biochem. 34., 595 (1970)).

L'élimination du groupe Boc (déprotection) de la résine Boc-Thr(Bzl)-BHA est effectuée avec une solution d'acide trifluoracétique dans du DCM (1:1) pendant 5 minutes, elle est filtrée et traitée à nouveau pendant 25 30 minutes, filtrée puis lavée 6 fois avec du DCM.

La neutralisation par la triéthylamine à 10 % est effectuée comme il a été décrit pour la résine de benzhydrylamine.

Les radicaux amino acide ultérieurs (Boc-Cys(MBzl), 35 Boc-Val, Boc-Lys[Z2-C1)], Boc-D-Trp, Boc-Tyr[Z(2-Br)] , Boc-Cys (MBzl) et Boc-D-Phe) sont alors introduits successivement par couplage de la même manière que ci-dessus pour donner une résine peptidique ayant la structure de la résine Boc-D-Phe-Cys (MBzl)-Tyr [Z (2-Br) ]-D-Trp-Lys [Z (2-Cl) ]-Val-Cys (MBzl) -40 Thr (Bzl)-BHA'.

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La déprotection, est effectuée comme il a été décrit pour la résine Boc-Thr(Bzl)-BHA. Après incorporation de Boc-D-Trp, on ajoute 5 % mercaptoéthanol à de l'acide trifluoroacétique à 50 % dans du DCM.

5 Enfin, on lave la résine peptidique débarrassée du groupe protecteur Boc avec du DCM, du méthanol et du DCM, trois fois chacun, et on la sèche sous vide.

On mélange 500 mg de résine d ' octapeptide BHA protégé avec 0,5 ml d'anisol et oh l'agite dans 10 ml de HF liquide

10 à O"^ pendant 1 heure. Après élimination du HF sous vide, on lave le mélange de peptide et de résine avec de l'acétate d'éthyle sec. On extrait ensuite le peptide avec de l'AcOH à 30 %, on le sépare de la résine par filtration et on le lyophilise.

15 On dissout 100 mg de peptide brut, réduit, dans 100 ml d'AcOH aqueux à 95 %, puis on ajoute goutte à goutte une solution d'iode 0,005 M dans de l'acide acétique glacial jusqu'à persistance de la coloration jaune. Après évaporation de l'acide acétique, on soumet le peptide

20 contenant des ponts disulfure à une filtration sur gel sur une colonne de Sephadex G15 fine. Une purification supplémentaire est effectuée par HPLC semipréparative sur la Colonne A en utilisant le système de solvant i avec un gradient linéaire à un débit de 5,0 ml/min.

25 | I

La préparation du peptide D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-

Trp-NH2 (Préparation IB) est effectuée comme il a été décrit ci-dessus, excepté que le Boc-Trp est ancré à la résine à la place du Boc-Thr(Bzl) dans la première étape.

30 | i

Le D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-nh2 (lc) est synthétisé par un procédé relié aux synthèses pour la préparation I A, excepté que du Boc-Thr (Bzl) est incorporé dans la troisième étape de couplage à la place du Boc-VAl.

35 La préparation ID est produite comme il a été décrit ci-dessus, excepté que c'est le Boc-D-Trp qui est couplé dans la dernière étape à la place de la Boc-D-Phe.

10

15

- 27

Les peptides purifiés (IA, IB, IC, ID) (28 mg, 21 mg, 32 mg, 25 mg) se sont révélés purs à plus de 95 % en HPLC analytique en utilisant le système de solvants 1 sur le mode gradient linéaire, et l'analyse des amino acides donne les résultats attendus.

Peptide Gradient Temps de

(% de B/min) rétention pour sur la

Code la purification ■ l'analyse colonne D

N°

ia ib ic id

25-55/60 30-60/60 25-55/60 25-55/60

20-60/40 25-65/40 20-60/40 25-85/40

15, 5 19, 5 17, 4 12, 6

preparation ii

20

D-

1

Phe-Cys

-Tyr-

■D-

-Trp-

-Lys (FMOC)

-Val

1

-Cys

-Thr-

-nh2

IIA

D-

r

Phe-Cys

-Tyr-

•D-

■Trp-

-Lys (FMOC)

-Val-

1

-Cys

-Trp-

-nh2

IIB

D-

r

Phe-Cys

-Phe-

■D-

•Trp-

-Lys (FMOC)

-Thr-

1

-Cys

-Thr-

-nh2

IIC

25 D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys (FMOC) -Thr-Cys-Thr-nh2

iid

La préparation IIA est bâtie étape par étape sur une résine BAH conformément au procédé décrit pour la préparation IA, excepté qu'on utilise la Boc-Lys(FMOC) à la 30 place de la Boc-Lys[Z(2-Cl)]. Le peptide est préparé en huit étapes de couplage successives pour donner la résine Boc-d-Phe-Cys (MBzl) -Tyr [z(2-Br) ]-d-Trp-Lys (FMOC)-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BHA. La résine de peptide débarrassée du groupe protecteur Boc est alors traitée par l'HF/anisol, 35 oxydée par l'iode et purifiée sur une colonne de Sephadex g-15 et sur une Colonne A éluée par le système de solvants i.

- 28 -

pour sur la

N° Code la purification l'analyse colo'nne D 5 (min.)

IIA 55-85/60 50-90/40 12,2

IIB 55-85/60 50-90/40 14,6

IIC 50-80/60 50-90/40 12,0

IID 50-80/60 50-90/40 13,9

10

- 29 -

PREPARATION III

A?.pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 IIIA

5 I I

A2Pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 IIIB

Le peptide IIIA est préparé par la technique en phase solide sur une résine BAH (1,0 g, 0,55 meq. de NH2) en 10 suivant les mêmes modes opératoires que pour la préparation I, excepté que la synthèse ne s'arrête pas à l'addition de D-Phe. L ' octapeptide est acylé avec (Boc)2A2pr pour donner 391 mg de résine (Boc) 2-A2pr-D-Phe-Cys (MBzl) -Tyr [Z (2-Br) ]-D-Trp-Lys[Z(2-Cl) ]-Val-Cys(MBz) -Thr(Bzl ) -BHA . Après 15 élimination des groupes Boc, la résine de peptide est traitée par l'HF/anisol pour donner le peptide libre, réduit. Une oxydation suivie par une purification sur une colonne de Séphadex G-15 fine et par une HPLC sur une Colonne A avec un gradient de système de solvants i (20-50 % 20 B en 60 minutes) donne la préparation IIIA (86 mg) .

En procédant d'une manière similaire mais en utilisant du Boc-Trp à la place de la Boc-Thr (Bzl) dans la première étape de la synthèse, on obtient la préparation IIIB (77 mg) .

!

25 Les peptides purs (pureté supérieure à 94%) ayant un temps de rétention en HPLC de 14,5 min. et de 23,7 min, respectivement, lorsqu'on utilise le système de solvants 1 sur le mode gradient linéaire (20-50 % de B en 30 minutes) ont la composition en amino acides attendue.

30

PREPARATION IV

A2pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (FMOC) -Val-Cys-Thr-NH2 IV

35

La synthèse de la Préparation IV est effectuée comme il a été décrit à la Préparation I, excepté que l'on utilise de la Boc-Lys (FMOC) dans la quatrième étape de couplage à la place de la Boc-Lys[Z-(2-C1)]. En effectuant des opérations

- 30 -

similaires de coupure par HF, oxydation et purification (Colonne A, système de solvant i , élution par gradient: 50-80 % de B en 60 minutes), on obtient la Préparation IV (47 mg) . La HPLC analytique du peptide pur montre un pic ayant 5 un temps de rétention de 12,5 minutes.

PREPARATION V

10 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (Boc)-Val-Cys-Thr-NH2 VA

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys-Trp-NH2 VB

15 La préparation VA a été préparée par synthèse comme il a été décrit pour la préparation IA, excepté que l'on a utilisé de la FMOC-D-Phe à la place de la Boc-D-Phe. La résine de peptide a été traitée par l'HF/anisol puis un pont disulfure a été formé par oxydation et le peptide a été 20 purifié sur une colonne de Sephadex G-15 fine et par HPLC (Colonne A, système de solvants 1, élution par gradient 55-85 % de B en 60 minutes) . Le peptide protégé par le FMOC a été dissous dans du DMF et l'on a ajouté 1,2 équivalents de dicarbonate de di-tert-butyle et 1,2-équivalent de TEA pour 25 préparer un peptide contenant Boc-Lys (e-Boc)-. Lorsque la réaction a été terminée, on a fait précipiter le peptide protégé avec de l'éther et on a éliminé le groupe FMOC avec de la pipéridine à 50 %. Le peptide protégé par le Boc a été chromatographié sur une Colonne A avec le système de 30 solvants i (45-75 % de B en 60 minutes) pour donner la préparation VA.

En procédant d'une manière similaire, mais en utilisant du Boc-Trp à la place de la Boc-Thr(Bzl) , la réaction fournit la Préparation VB. Les peptides se sont 35 révélés purs par HPLC analytique en utilisant le système de solvants ± (45-85 % de B en 40 minutes) .

- 31 -PREPARATION VI

5 G11-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (FMOC) -Val-Cys-Thr-NH2 VI

La Préparation VI a été préparée en suivant la synthèse de IIA par acylation du groupe amino N-terminal libre avec l'anhydride glutarique. La résine de peptide a 10 été traitée par l'HF-anisol, un pont disulfure a été formé par oxydation, elle a été purifiée sur une Colonne de Sephadex G-15 fine et enfin par HPLC (Colonne A, solvant 1, gradient d1élution : (50-80 % de B en 60 minutes)).

15 PREPARATION VII

Anthraquinone-2-hémiglutarate de méthyle

On a mis en suspension 576 mg (2mmoles) de 2-(hydroxyméthyl) -anthraquinone dans 6 ml de pyridine anhydre 20 et on les a chauffés sous reflux pendant 24 heures avec 456 mg (4 mmoles) d'anhydride glutarique. La pyridine a été éliminée sous vide, le résidu a été acidifié et extrait par l'acétate d'éthyle. Le produit jaune a été recristallisé dans de l'acétate d'éthyle-hexane (580 mg, F= ÎSO-ISI^) . Le 25 temps de rétention en HPLC. de la Préparation VII a été de 19,7 minutes en utilisant le système de solvants 1 (gradient linéaire de 30-60 % B en 30 minutes) .

PREPARATION VIII 30 5(3-Chloro-propionyloxy)-1,4-naphtoquinone

Une solution de triéthylamine (1,4 ml) et de 1,27 g de chlorure de 3-chloropropionyle dans 5 ml de DCM a été ajoutée à une solution de 1,73 g de 5-hydroxy-1,4-35 naphtoquinone. Le mélange réactionnel a été agité pendant 2 heures à la température ambiante. La solution a été filtrée, concentrée à un faible volume et chromatographiée sur une

- 32 -

colonne de gel de silice (acétate d'éthyle-cyclohexane-DCM) pour donner 741 mg du produit désiré.

EXEMPLE 1

5

1 1

Mel -Cys -Tyr-D-Trp-Ly s -Val -Cys -Thr-NH2 1

10 D-Mel-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2

On prépare le Peptide 1 par couplage successif des amino acides Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Val, Boc-Lys [Z (2-C1) ] , Boc-D-Trp, Boc-Tyr[Z(2-Br)], Boc-Cys(MBzl) et 15 Boc-Mel à une résine BAH (100 mg) de la même manière que pour la préparation I. Le couplage étape par étape de Boc-Thr (Bzl) , Boc-Cys(MBzl), Boc-Val, Boc-Lys[Z(2-C1)], Boc-D-Trp, Boc-Tyr[Z(2-Br)], Boc-Cys (MBzl ) et Boc-D-Mel à la résine BAH (100 mg) conduit à la résine de peptide 2. Après 20 séparation des peptides de la résine, on les oxyde et on les lyophilise, puis on les soumet à une filtration sur gel sur une petite colonne de Sephadex G-15 lavée avec de l'AcOH aqueux à 80 % pour éliminer l'iode. La purification par HPLC sur la Colonne B avec le système de solvant ii en utilisant 25 un gradient d'élution :(55-85 % de B en 60 minutes) donne le Peptide 1 (13 mg) et les Peptides 2 (14 mg) avec une pureté supérieure à 95 %, les temps de rétention en HPLC étant de 20,1 minutes et 22,8 minutes, respectivement, lorsqu'on effectue la HPLC analytique au moyen du système de solvant-30 i (30-70 % B en 40 minutes).

EXEMPLE 2

35 D-Phe-Cys-Mel-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 3

On effectue la synthèse du Peptide 3 par couplage étape par étape de Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl) , Boc-Val, Boc-Lys[Z(2-C1)], Boc-D-Trp, Boc-Mel, Boc-Cys(MBzl) et Boc-

- 33 -

D-Phe sur une résine de BAH comme il est décrit pour la Préparation I. Le traitement de la résine de peptide par l'HF/anisol suivi d'une oxydation, d'une filtration sur gel sur une petite colonne de Sephadex G-15 et d'une 5 purification par HPLC sur une Colonne B éluée par le système de solvant 2 (50-80 % de B en 60 minutes) donne le peptide désiré (11 mg) avec une pureté supérieure à 91 %. Le temps de rétention pour le Peptide 3 est de 19,2 minutes lorsqu'il est chromatographié sur une Colonne D avec le système de 10 solvants 1 (30 à 70 % de B en 40 minutes) .

EXEMPLE 3

15 D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Mel-NH2 4

La préparation du Peptide 3 est effectuée conformément aux modes opératoires indiqués pour la Préparation 1 , excepté que le Boc-Mel est ancré à la résine BAH au lieu de 20 la Boc-Thr(Bzl) dans la première étape. Le peptide est détaché de la résine avec du HF/anisol et oxydé par l'iode, lyophilisé et soumis à une filtration sur gel sur une petite colonne de Sephadex puis à une HPLC en utilisant le système de solvant ii (50-80% de B en 60 minutes) pour donner le 25 Peptide 4 (9,2 mg). Celui-ci se révèle être pur (à plus de 92 %) par chromatographie analytique lorsqu'il est essayé en utilisant le système de solvants 1 sur. le mode gradient linéaire (30-70 % de B en 40 minutes),. Le temps de rétention est de 20,1 minutes.

30

EXEMPLE 4

i 1 1 1

Mel-D-Phe-Cys-Tvr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (5)

35 1 " ~ î

Mel-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 ( 6)

, y

Mel-Phe_-Cys-Phe-D~Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 (7)

r~ ■ t

40 Mel-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-NH2 (8)

- 34 -

j - _ _ _ r

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 ( 9}

La résine de D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-5 Lys[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bz1)-BAH est préparée par synthèse sous le nom de Préparation I, et après déprotection N-terminale, est acylée avec du Boc-Mel en donnant le nonapeptide 5 protégé.

Le couplage Boc-Thr(Bzl) , Boc-Cys(MBzl) , Boc-Thr(Bzl) , 10 Boc-Lys[Z(2-Cl)], Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Cys(MBzl), Boc-Phe, et Boc-Mel successivement à la résine de benzhydrylamine comme il est décrit dans la Préparation I donne le nonapeptide 6 protégé.

Le couplage successif de Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys (MBzl), 15 Boc-Thr(Bzl), Boc-Lys[Z(2-Cl)], Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-Cys (MBzl), Boc-Phe, et Boc-Mel à la résine BAH conduit à la résine de Peptide 7.

L'addition successive de Boc-Thr(Bzl), Boc-Cys(MBzl), Boc-Thr(Bzl) , Boc-Lys[Z(2-Cl)] , Boc-D-Trp, Boc-Phe, Boc-20 Cys(MBzl), Boc-D-Trp, et Boc-Mel à la résine BAH donne la résine de Peptide 8.

'La résine de Mel-D-Phe-Cys(Bzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys [Z(2-Cl)] -Val-Cys (MBzl) -Trp-BAH (Peptide 9 protégé) est préparée en 9 étapes de couplage conformément au procédé 25 décrit pour la Préparation I.

En appliquant une coupure similaire, une oxydation et une filtration sur gel sur une petite colonne de Sephadex G-15 comme dans l'exemple 1, on isole les peptides 5, 6, 7, 8 et 9 (8,4 mg, 10,6 mg, 9,9 mg, 12,4 mg, 7,9 mg, 30 respectivement) par HPLC' sur la Colonne B en utilisant le système de solvant ix avec une pureté supérieure à 92 %.

- 35 -

DONNEES DE HPLC

Peptide Gradient Temps de

(% de B/min) rétention pour sur la

5 N° Code la purification l'analyse colonne D

(min.)

5 60-90/60 40-80/40 16,1

6 60-90/60 40-80/40 14,0

7 69-90/60 35-75/40 17,8 10 8 60-90/60 40-80/40 19,9

9 65-95/60 40-80/40 22,4

Pour prouver la possibilité d'appliquer des synthèses de peptides en phase solide pour incorporer le melphalan 15 instable à la séquence, on prépare également le Peptide 5 par un autre procédé.

I l

Le FMOC-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 est synthétisé comme il a été décrit pour la Préparation IA, excepté 20 que l'on utilise la FMOC-D-Phe à la place de la Boc-Phe. La Boc-Mel est couplée à cet octapeptide en appliquant le procédé de synthèse classique.

30

i

25 FMOC-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

B0C2O

i1

FMOC-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys-Thr-NH2

I pipéridine à 50 % dans du DMF pendant 30 minutes.

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys-Thr-NH2

| couplage avec Boc-Mel DCC + HOBt

I

l1

Boc-Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (Boc) -Val-Cys-Thr-NH2

I déprotection par le TFA à 50% dans du DCM

35 y

I 1

Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

I

- 36 -

Le peptide 5 synthétisé de cette manière a une composition en aminoacides, un spectre UV et un temps de rétention en HPLC identiques à celui préparé en phase 5 solide.

EXEMPLE 5

10 [ (Mel)2A2Pr3 -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (10)

La synthèse du Peptide 10 est effectuée en faisant réagir la résine A2pr-D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys [Z (2-Cl )] -Val-Cys (MBzl) -Thr (Bzl )-BAH (150 mg) obtenue à 15 partir de la Préparation III avec cinq équivalents de Boc-Mel. Les groupes protecteurs sont éliminés par l'HF-anisol; le peptide brut est oxydé par l'iode et soumis à une filtration sur gel. Les fractions lyophilisées contenant le Peptide 10 désiré sont injectées sur la Colonne B et 20 purifiées en utilisant le système ±l ( 60-90 % de B en 60 minutes). Le peptide pur (7,6 mg) a un temps de rétention de HPLC, déterminé sur la Colonne D avec le système de solvant i (40-80 % de B en 40 minutes) de 17,1 minutes.

25 i EXEMPLE 6

Mel-Mel-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Ly s-Val-Cy s-Thr-NH 2 (11)

30 La préparation du décapeptide 11 est effectuée en suivant la synthèse de la résine D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys[Z(2-Cl)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH (obtenue à partir de la Préparation IA par déprotection du groupe amino N-terminal) avec couplage avec le Boc-Mel en deux

35 étapes consécutives. La résine de peptide est traitée par l'HF/anisol et le pont disulfure est établi par oxydation par l'iode. Le mélange réactionnel lyophilisé est soumis à une filtration sur gel et à une HPLC avec le système de

- 37 -

solvant xi (70-100 % de B en 60 minutes) pour donner le Peptide 8 (6,9 mg). Le peptide pur a un temps de rétention en HPLC de 14,9 minutes lorsqu'on utilise le système de solvant i sur le mode gradient linéaire (50-90 % de B en 40 5 minutes).

EXEMPLE 7

10 [A2pr(PtCl2)]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-nh2

- 38 -

[A2pr (PtCl2 ) ]-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2 (13)

Le peptide 12 contenant du platine est préparé en faisant réagir 30 mg de sel de TFA du peptide intermédiaire A2pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (préparation IIA) (dissous dans 100 p.1 de DMF et neutralisé par NaOH) avec du chloroplatinate de potassium (8,4 mg) dans 100 jll d'eau pendant 48 heures en présence de 4 mg d'acétate de sodium. On dilue ensuite le mélange réactionnel avec de l'eau et on l'injecte sur la Colonne C, puis on le chromatographie en utilisant le système de solvant 1 (2 5-50 % de B en 50 minutes).

Le Peptide 13 est synthétisé d'une manière similaire, excepté qu'on utilise comme matière de départ le sel d'acide l i trif luoracétique du A2pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (31 mg, préparation IIB) à la place du dérivé de Thr8 correspondant (Préparation IIA) .

Les métallopeptides qui en découlent (4,8 mg, 5,3 mg) présentent un pic en HPLC avec des temps de rétention de 9,1 minutes et 19,5 minutes, respectivement, lorsqu'on élue avec le système de solvant i (30-60 % de B en 3 0 minutes) .

EXEMPLE 8

[A2pr (SAL) 2Cu] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

I I

[A2pr (CISAL) 2) Cu] -D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2

(15)

Le métallopeptide 14 est préparé par deux procédés différents pour prouver que le complexe du Cu désiré peut être préparé malgré la présence d'un groupe e-amino de la Lys libre.

Dans le procédé A, on dissout du

I 1

A2pr-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (FMOC) -Val-Cys-Thr-NH2

- 39 -

(Préparation III) dans 100 {il de DMF, on ajuste le pH à 8 avec NaOH et NaOAc, puis on ajoute 4 mg de s al icyl aldéhyde. Après repos à la température ambiante pendant 1 heure, on constitue le complexe métallique par réaction avec de 5 l'acétate de cuivre (II) (3 mg dans 50 p.1 d'eau) pendant 30

minutes. Pour éliminer le groupe protecteur FMOC, on mélange le mélange réactionnel avec 50 Jil de pipéridine, et au bout de 30 minutes, on le dilue avec 100 fil d'eau. On centrifuge le précipité, on injecte la solution surnageante verte sur 10 la Colonne C et on élue avec le système de solvant ii (35-55 % de B en 40 minutes) pour isoler le métallopeptide 14 (4,1 mg) . Essayé sur la Colonne D avec le système de solvant ii (40-85 % de B en 30 minutes) il se révèle pur et son temps de rétention est de 11,2 minutes.

15 Par la méthode B, on fait réagir 30 mg du peptide intermédiaire libre (Préparation IIA) avec 7,4 mg de bis(salicyaldéhydato)cuivre (II) préformé [Y. Nakao et A. Nakahara, Bull. Chem. Soc. Jaoan 46, 187 (1973)] dans 300 jil de DMF aqueux à 90 % contenant de l'acétate de sodium (2 mg) 20 pendant 48 heures. Le complexe Peptide-SAL-Cu est séparé sur la Colonne C en utilisant le système de solvant iii(40-60 % de B en 40 minutes) . Le Peptide 14 obtenu (7,6 mg) par ce procédé a le même temps de rétention et le même spectre UV que celui préparé par le procédé A. 25 Le métallopeptide 15 avec CISAL est préparé par la méthode B: on fait réagir 16 mg de sel de TFA du peptide intermédiaire (Préparation IIA) avec 3,9 mg de bis(5-chloro-salicylaldéhydato)cuivre (II) dans une solution aqueuse de DMF tamponnée par NaOAc pendant 48 heures. On 30 chromatographie le mélange réactionnel sur la Colonne C éluée avec le système de solvant iii (45-70 % de B en 50 minutes). Le peptide verdâtre isolé (4,1 mg) a un temps de rétention en HPLC de 11,4 minutes lorsqu'il est essayé sur la Colonne D avec le système de solvant ii sur le mode 35 gradient linéaire (45-90 % de B en 30 minutes).

- 40 -

EXEMPLE 9

MTX-D-Phe-

1

-Cys

-Tyr-

•D-Trp

-Lys-Val-

1

-Cys

-Thr-NH2

(16)

MTX-D-Phe-

1

-Cys

-Phe-

D-Trp-

-Lys-Thr-

1

-Cys

-Thr-NH2

(17)

MTX-D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-nh2 ( 18 )

10

La synthèse de 1'antimébolite contenant le Peptide 16 est effectuée en acétylant le

I l

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (FMOC) -Val-Cys-Thr-NH2 15 (Préparation IIA) avec du méthotrexate. A une solution de 5,6 mg de méthotrexate dans 100 |xl de DMF, on ajoute une quantité équivalente de diisopropyl-carbodiimide à 0°C. Au bout de 15 minutes, on la mélange avec une solution neutralisée (DMF) de 14 mg de peptide et on la maintient à 20 0°C pendant une nuit. On élimine le groupe protecteur FMOC par traitement avec 50 jil de pipéridine, puis on purifie le peptide sur une Colonne C éluée avec le système de solvant i (25-50 % de B en 50 minutes). Deux peptides sont détectés (et isolés) (les temps de rétention sont de 14,9 et 15,4 25 minutes) correspondant à l'acylation avec un groupe a-carboxyle ou^-carboxyle du méthotrexate, lorsqu'ils sont essayés sur la Colonne D dans le système de solvant i (30-50 % de B en 20 minutes).

Les Peptides 17 et 18 sont préparés de la même 30 manière, excepté que l'on utilise comme matières de départ le

D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys (FMOC) -Thr-Cys-Thr-nh2 (Préparation IIC) et le

I 1

D-Trp-Cys-Phe-D-Trp-Lys (FMOC) -Thr-Cys-Thr-NH2 (Préparation IID.

- 41 -EXEMPLE 10

Azy-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

5

On prépare le nonapeptide en faisant suivre la synthèse de la résine D-Phe-Cys(MBzl)-Tyr[Z(2-Br)]-D-Trp-Lys [Z(2-C1)]-Val-Cys(MBzl)-Thr(Bzl)-BAH (obtenue à partir de la Préparation IA par déprotection du groupe amino N-10 terminal) d'un couplage avec Trt-Azy.

On traite la résine de peptide par du HF/anisol et on forme un pont disulfure par oxydation avec de l'iode. On soumet le mélange réactionnel lyophilisé à une HPLC avec le système de solvant ii (70-100 % de B en 60 minutes).

15

EXEMPLE 11

EPP-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

20

La synthèse du peptide ci-dessus est effectuée en alkylant

I l le D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 avec de 1 ' épibromhydrine. A une solution dans 200 (il de DMF de 25 mg 25 de peptide (Préparation VA), on ajoute 6 (il de TEA et 2jil d'épibromhydrine. On agite le mélange réactionnel pendant 24 heures à la température ambiante, puis on fait précipiter le peptide avec de l'éther. Après déprotection avec du TFA à 30 % dans le DCM, on chroma tographie le produit sur une Colonne 30 C avec le système de solvant ii (25-55 % de B en 60 minutes).

EXEMPLE 12

I 1

3 5 HMAQG-D- Phe-Cys -Tyr-D-Trp-Lys - Val -Cys-Thr-NH2

La synthèse du peptide ci-dessus s'effectue en couplant

I 1

le D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val~Cys-Thr-NH2 avec de 40 1'anthraquinone-2-hemiglutarate de méthyle avec du

- 42 -

carbodiimide. On dissout 10,6 mg d1anthraquinone-2-hémiglutarate de méthyle et 4,6 mg de HOBt dans 3 00 jll de DMF, on les refroidit à O^C et on les fait réagir avec 3,4 jil de DIC. Au bout de 15 minutes, on mélange cette solution 5 avec une solution froide (200 p.1 de DMF) de 25 mg de D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (Préparation VA) et on la maintient à 0°C pendant 24 heures. On précipite le peptide par 11éther diéthylique et on élimine le groupe protecteur Boc par traitement avec du TFA à 30 %. Après évaporation, on 10 purifie le produit de la réaction sur une Colonne C avec du solvant x•

EXEMPLE 13

NQCE-D-Phe-Cy s-Tyr-D-Trp-Ly s-Val-Cy s-Thr-NH2 La synthèse du peptide ci-dessus est effectuée en alkylant

I I

20 le D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 (Préparation VA) avec de la 5 (3-chloro-propionyloxy)-1, 4-naphtoquinone. On dissout 25 mg de préparation VA dans 2 00 (il de DMF, on ajoute 1,2 équivalents de 5(3-chloro-propionyloxy)-1,4-naphtoquinone en présence d.'un équivalent de K2C03 solide et 25 on agite pendant 24 heures à la température ambiante. On sépare les sels par filtration, on précipite par 11éther le composé protégé par le Boc et on le déprotège avec du TFA à 30 % dans du DCM. On purifie le conjugué peptide-naphthoquinone brut par HPLC sur une Colonne C avec le 30 solvant i.

EXEMPLE 14

I !

MIT-G1 t-D-Phe-Cy s-Tyr-D-Trp-Ly s-Val-Cys-Thr-NH2

35

La synthèse du peptide ci-dessus est effectuée en acylant la Mitomycine C avec du

- 43 -

D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (FMOC)-Val-Cys-Thr-NH2. 0ri dissout 27,5 mg de Préparation VI dans 200 |Xl de DMF, et on les fait réagir avec 7 mg de mitomycine C et 4 (il de DIC en présence 5 de 2,8 |il de TEA et de 3,3 mg de HOBt à 0°C pendant une nuit. On élimine le groupe FMOC par traitement avec de la pipéridine à 50 % pendant 30 minutes. On purifie le conjugué peptide-mitomycine C sur une Colonne C avec le système de solvant ii .

10

EXEMPLE 15

ESP-Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

15

La synthèse du peptide ci-dessus est effectuée en couplant i l le D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys (FMOC) -Val-Cys-Thr-NH2 avec de 1' hémiglutaryl-espéramycine préformée (position(s) d'acylation 20 non identifiée(s)). On refroidit à 0°C la solution de 2 mg d'hémiglutaryl-espéramycine (100 (Il de DMF), et de 1,3 mg de HOBt et on la fait réagir avec 1 (il de DIC. Au bout de 10 minutes, oïl ajoute 12,5 mg de Préparation IIA dans 50 (il de DMF neutralisé et on maintient le mélange réactionnel à 0°C 25 pendant 24 heures. Plusieurs produits sont isolés par HPLC

(Colonne C, système de. solvant ii ) .

!

EXEMPLE 16

DOX-Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2

La synthèse du peptide ci-dessus est effectuée en couplant la partie aminosucre de la doxorubicine au radical glutaryle

35 ( i du Glt-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2. On dissout

27,5 mg de Préparation VII dans 2 00 (il de DMF, et on les fait réagir avec 14 mg de doxorubicine et 4 (il de DIC en présence 2,8 (Il de TEA et de 3,3 mg de HOBt à 0°C pendant

40 une nuit. On soumet le mélange réactionnel à une HPLC sur

- 44 -

une Colonne C avec le système de solvant i (40-70 % de B en 60 minutes).

EXEMPLE 17

5 Les effets biologiques, les pouvoirs de liaison aux récepteurs et les activités cytotoxiques des peptides de l'invention sont résumés dans les tableaux 1-4.

La tableau 1 indique l'activité inhibitrice du déversement de l'hormone de croissance des composés de

10 l'invention par comparaison à celle de la somatostatine (1-

!

14) dans un système de surfusion des cellules hypophysaires du rat dispersées in vitro [S. Vigh et A.V. Schally, Peptides 241-247 (1984) ] . Le tableau 1 contient aussi des données sur l'affinité de liaison au récepteur de ces 15 composés pour les membranes cellulaires de cortex de rat et de tumeur prostatique de rat (Dunning R3327H) .

Les données du tableau 2 montrent l'effet du Peptide 7 sur la croissance de fibroblastes 3T3, mesuré par la méthode spectrophotométrique. On cultive 105 cellules dans 20 du NCS à 10 % dans du DME dans 96 plaques à trous prétraitées par la poly-D-lysine pour permettre aux cellules d'y adhérer solidement. On traite les cellules pendant 3 jours avec des renouvellements quotidiens des peptides cytotoxiques à des concentrations de 1-10 000 ng/ml. Après 25 la période d'incubation, on ajoute le colorant métabolique MTT (bromure de (3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényl-2H-tétrazolium et après le développement de la coloration pourpre du formazan par les cellules vivantes, on mesure l'absorption à 590 nm (au 4ème jour). Une normalisation 30 préalable avec un nombre connu de cellules relie l'absorbance au nombre effectif de cellules vivantes. Le tableau 3 contient des données sur l'inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans de l'ADN par des analogues de la somatostatine sur une lignée de cellules 35 cancéreuses MiaPaCa pancréatiques humaines cultivées. Au jour 0, on dépose lxlO5 cellules avec des média de DME contenant 10 % de sérum de veau foetal (FCS) . Au bout de 24

- 45 -

heures, on élimine les médias et on les remplace par des médias de DME sans sérum, puis on les fait incuber à 37°C pendant deux jours. On élimine ensuite les médias et on les remplace par des médias de DME contenant 5 % de FCS avec ou 5 sans analogue de la somatostatine. Les médias avec des peptides sont changés tous les jours pendant 4 jours. Au quatrième jour, on ajoute ljlCi de 3H-thymidine et on fait incuber pendant 17 heures supplémentaires. On élimine alors les médias et on recueille les cellules par trypsination. On 10 extrait l'ADN avec de l'acide perchlorique 1 N et on mesure la radioactivité.

Le tableau 4 contient des données sur l'inhibition de l'incorporation de 3H-thymidine dans de l'ADN dans une lignée de cellules de cancer du poumon H-69 par des 15 analogues de la somatostatine. 6,5xl04 cellules sont dépesées dans des tubes de polypropylène stériles dans du RPMI-1640 contenant 10 % de sérum de cheval et 5 % de sérum de veau foetal. Au bout de 3 jours, on ajoute des analogues de la somatostatine et on les fait incuber 5 jours à 37°C. 2 0 Au quatrième jour, on ajoute IfiCi de thymidine tritiée et au cinquième jour, on lave les cellules et on les recueille sur du papier de verre, on les lave avec de l'acide trichloracétique aqueux à 10 %, avec de l'alcool éthylique et on les compte dans un compteur à scintillation de 25 liquide.

TABLEAU 1

Activité d'inhibition de la libération de l'hormone de 30 croissance et affinité de liaison pour le récepteur des analogues de la somatostatine contenant une partie cytotoxique

N° du Peptide Activité inhibi- Constante d'affi-

35 trice (%) té** (KaxlO^"1)

Cortex Tumeur de de rat Dunning

- 46 -

10

15

20

14

12, 0

15,795

1, 378

1 .

26,0

13,355

0,188

3 .

7,2

0,032

N.B.

4.

0

0,744

N.B.

5.

18,790

N.B.

6.

N.B.

0, 111

9.

5,371

0, 694

10.

N.B.

0,459

11.

N.B.

N.B.

12.

44, 6

49,529

1,947

13.

N.B.

0,115

14.

7,3

166,035

0, 004

15.

38,5

4,027

0,277

16A.

30,5

11,396

0, 642

16B.

26,4

3,287

9, 589

*L'activité inhibitrice du déversement de l'hormone de croissance est contrôlée à la dose de 200 nM. **La [125I-Tyr11] somatostatine 1-14 est utilisée comme ligand marqué.

N.B. Pas de liaison.

TABLEAU 2

25

Effet du Peptide 7 sur la croissance des fibroblastes 3T3

mesuré par dosage spectrophotométrique du MTT

Dose du composé

Absorbance

% de diminution

30

Témoin

0,252

0

Peptide 7 10

0,125

50*

100

0,192

24*

100

0, 206

18*

' 1000

0,186

26*

35

10000 0,121

52*

*p<0,01 par le test des intervalles multiples de Duncan.

- 47 -

TABLEAU 3

Effet du Peptide 7 et du melphalan sur le développement des cellules MiaPaCa, mesuré par des comptages de cellules et 5 par incorporation de 3H-thymidine à l'ADN

Composé Dose %de diminu- %d'inhibition de 1'in-

tion du nombre corporation de des cellules 3H-thymidine

10 Témoin 0

Peptide 7 10~6M 22** 68**

10-7M 33** 63**

10"8M 35** 53**

Melphalan 10"6M 29** 20

15 10"7M 1 18

10~8M 1

*p<0,05 par le test des intervalles multiples de Duncan **p<0,01

- 48 -

TABLEAU 4

Effet du Peptide 9 sur l'incorporation de 3H-thyrnidine à l'ADN,dans la lignée de SCLC H-69

Composé

Dose

% d'inhibition de 1'incorporation de 3H-thymidine

10

15

Témoin Peptide 7

0

1

10 100 1000 10000

0

37 34

25

29 36

0,01 0,01 0,01 0,01 0, 01

*Signification. déterminée par le test des intervalles multiples de Duncan.

é

25

- 49

Claims (1)

1. revendications

   1. Composé répondant à la formule :

   5 Q-R1 -Cys-R3-D-Trp-Lys-R6-Cys-R8-NH2

   dans laquelle

   R1est L ou D-Phe, D-Trp, L ou D-Mel,

   R3 est Mel, Tyr, ou Phe,

   r6 est Thr ou Val 10 r8 est Thr, Trp ou Mel,

   Q est choisi parmi l'atome d'hydrogène, L et D-Mel, le dipeptide Mel-Mel, les cyclopropanealcanoyles, l'aziridine-2-carbonyle, le méthotrexoyle, le 1,4-naphtoquinone-5-oxycarbonyléthyle, les époxyalkyles et leurs dérivés £2-15 carbonyl-alkylaminés; et les dérivés Œ-carbonyl-alcanoylés de la 2-hydroxyméthyl-anthraquinone, de la doxorubicine, de 11 espéramycine et de la mitomycine C;

   dans lequel le groupe £2-carbonyl-alkylamino répond à la formule

   20 -CO-(CH2) n-NH~ dans laquelle n est 2-6,

   et le groupe £2-carbonyl-alcanoyle répond à la formule

   -CO-(ch2) n-CO- dans laquelle n est 2-6 et ses sels avec des acides et des bases pharmaceutiquement acceptables.

   Composé répondant à la formule

   Q1-A-R1-Cys-R3-D-Trp-Lys-R6-Cys-R8-NH2

   dans laquelle 30 R^-est L ou D-Phe, L ou D-Trp,

   R3 est Phe ou Tyr,

   R6 est Val ou Thr R8 est Thr ou Trp,

   A est un radical diaminoacyle répondant à la formule 35 -HNCH2- (CH2)m-CH(NH) - (CH2)n-CO-

   dans laquelle m est 0 ou 1 et n est 0 ou 1, Q1 est une partie cytotoxique répondant à la formule

   Q2 ou (B)2Q3 ou (Q4)2

   - 50 -

   dans laquelle

   Q 2 est Pt (Y) 2< où Y est un anion d'un acide pharmaceutiquement acceptable,

   Q3 est un métal n'appartenant pas au groupe du platine choisi parmi le titane, le vanadium, le fer, le cuivre, le cobalt, l'or, le nickel, le cadmium et le zinc,

   Q4 est choisi parmi, les L ou D-Mel, le dipeptide Mel-Mel, les cyclopropanealcanoyles, 1'aziridine-2-carbonyle, les époxyalkyles, le 1,4-naphtoquinone-5-oxycarbonyléthyle ou leurs dérivés H-carbonyl-alkylaminés; les dérivés Q.-carbonyl-alcanoylés de la 2-hydroxyméthyl-anthraquinone, de la doxorubicine, 1'espéramycine, et la mitomycine C,

   dans lesquels le groupe £2-carbonyl-alkylamino répond à la formule

   -CO- (CH2)n-NH- dans laquelle n est 2-6; et le groupe D-carbonyl-alcanoyle répond à la formule

   -CO-(CH2) n-CO- dans laquelle n est 2-6. B est un groupe aralkylidène ou hétéroaralkylidène substitué choisi parmi les halo- et nitrophényle alkylidènes inférieurs ; les (alkyle inférieur)hydroxyméthyl ou phosphoxyméthyles pyridyles alkylidènes inférieurs , dans lesquels alk-désigne 1-6 atomes de carbone, et ses sels avec des acides et des bases pharmaceutiquement acceptables.

   3. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est D-Phe, R3 est Tyr ou Mel, R6 est Val, R8 est Thr ou Mel, Q

   est un atome d'hydrogène.

   !

   4. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est Mel, R3 est Tyr ou Mel, R6 est Val, R8 est Thr, Q est un atome d'hydrogène.

   5. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est

   D-Mel, R3 est Phe, R6 est Thr, R8 est Thr, Q est un atome d'hydrogène.

   - 51 -

   6. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est L- ou D-Phe, R3 est Phe, R6 est Thr, R8 est Thr et Q est Mel.

   5 7. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est D-Phe, R3 est Tyr, R6 est Val, R8 est Thr ou Trp et Q est Mel.

   8. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est 10 D-Trp, R3 est Phe, R6 est Thr, R8 est Thr et Q est Mel.

   9. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est D-Phe, R3 est Tyr, iR6 est Thr, R8 est Thr et Q est Mel-Mel ou MTX.

   15

   10. Peptide selon la revendication 1, dans lequel R1 est D-Phe ou D-Trp, R3 est Phe, R6 est Thr, R8 est Thr et Q est MTX.

   20 11. Peptide selon la revendication 2, dans lequel R1 est D-Phe, R3 est Tyr, R6 est Val, R8 est Thr ou Trp, A est A2pr ou A2bu, Q1 est Q2, où Q2 est Pt,Cl2.

   12. Peptide selon la revendication 2, dans lequel R1 est 25 D-Phe, R3 est Tyr, R6 est Val, R8 est Thr ou Trp, A est A2pr ou A2bu, Q1 est (B2)Q3, où Q3 est le cuivre (II) ou le nickel (II), B est un groupe 2-O-benzylidène, fluoro-, chloro-, nitro-2-O-benzylidène, 2-méthyl-3-O-5-hydroxyméthyl- ou phosphoxyméthyl-4-picolylidène.

   30

   13. Peptide selon la revendication 2, dans lequel R1 est D-Phe, R3 est Tyr, R6 est Val, R8 est Thr ou Trp, A est A2pr ou A2bu, Q1 est (Q4)2, où Q4 est L- ou D-Mel.

   I

   - 52 -

   14. Compositions pharmaceutiques ayant notamment un effet antinéoplasique, caractérisé en qu'elles comprennent une quantité efficace d'un mélange d'un composé selon la 5 revendication 1 et/ou d'un composé selon la revendication

   2, en association avec un véhicule pharmaceutique inerte, tel que des microcapsules ou microsphères pour une délivrance retardée,

   10 15. Procédé de préparation des composés selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on opère en phase solide ou en combinant la technique en phase solide et la synthèse classique en solution à partir de peptides intermédiaires de formule VIIA 15 xl-r1-r2(x2)-r3(x3)-D-Trp-Lys(x5)~r6-r7)-r8{x8)-NH-x9 dans laquelle

   Rlf r2, r3, r7 et R® sont tels que définis ci-dessus,

   Xl est un atome d'hydrogène ou un groupe acyle en c2-c5 sous réserve que la formule X soit un octapeptide 20 ou Mel, Azy ou Mel-Mel sous réserve que la formule I soit un nonapeptide ou un décapeptide, respectivement,

   x2 et yJ sont des atomes d'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe eulfhydryle de Cys,

   x3 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur poui 25 le groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

   x5 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur pou." le groupe -amino de Lys,

   x8 est un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle phénolique de Tyr,

   30 X9 est un atome d'hydrogène ou un groupe benzhydryle incorporé à une résine.