JPH0641422B2 - 多価肺炎球菌ワクチン - Google Patents
多価肺炎球菌ワクチンInfo
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- JPH0641422B2 JPH0641422B2 JP59155729A JP15572984A JPH0641422B2 JP H0641422 B2 JPH0641422 B2 JP H0641422B2 JP 59155729 A JP59155729 A JP 59155729A JP 15572984 A JP15572984 A JP 15572984A JP H0641422 B2 JPH0641422 B2 JP H0641422B2
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、“Ｃ”多糖が実質的に存在しない精製された
肺炎球菌莢膜多糖（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃａｐ
ｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）から成る
多価肺炎球菌ワクチンに関する。本発明は、また、デン
マーク表示によると、３、５、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、
１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型である
１０の肺炎球菌型の各々を特別に精製して、本発明の精
製された免疫原多糖を生成することに関する。本発明の
多価肺炎球菌ワクチン中に存在する他の肺炎球菌型は、
デンマーク表示よると、１、２、４、６Ａ、６Ｂ、７
Ｆ、８、９Ｎ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２０、
２３Ｆおよび３３Ｆであり、これらは米国特許第４，２
４２，５０１号中に示されているようにして精製するこ
とができる。
肺炎球菌莢膜多糖（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ ｃａｐ
ｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）から成る
多価肺炎球菌ワクチンに関する。本発明は、また、デン
マーク表示によると、３、５、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、
１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型である
１０の肺炎球菌型の各々を特別に精製して、本発明の精
製された免疫原多糖を生成することに関する。本発明の
多価肺炎球菌ワクチン中に存在する他の肺炎球菌型は、
デンマーク表示よると、１、２、４、６Ａ、６Ｂ、７
Ｆ、８、９Ｎ、１２Ｆ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２０、
２３Ｆおよび３３Ｆであり、これらは米国特許第４，２
４２，５０１号中に示されているようにして精製するこ
とができる。
本発明において有用な各型の肺炎球菌培養物は、多数の
培養研究所に貯蔵されておりかつ前記研究所から世界中
において入手することができる。アメリカン・タイプ・
カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｔｈｅ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．
２０８５２）は、本発明の肺炎球菌型のすべてを自由に
入手可能であるとして記載している。
培養研究所に貯蔵されておりかつ前記研究所から世界中
において入手することができる。アメリカン・タイプ・
カルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（Ｔｈｅ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃ
ｔｉｎ，１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．
２０８５２）は、本発明の肺炎球菌型のすべてを自由に
入手可能であるとして記載している。
１９８２年のＡＴＣＣカタログは、これらの型を次のよ
うに表示している（表Ｉ参照）： ワクチンの製造における重要な工程は、適当な抗体の生
産を起こす保持された物質の性質を損失しないで、異質
物質を除去するように、免疫原物質を精製することであ
る。多糖類のこのような性質は、多糖類の「自然状態の
立体配置（ｎａｔｖｅ ｓｔａｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒ
ａｔｉｏｎ）」と呼ぶことができるものの保持にあるよ
うに思われる。
うに表示している（表Ｉ参照）： ワクチンの製造における重要な工程は、適当な抗体の生
産を起こす保持された物質の性質を損失しないで、異質
物質を除去するように、免疫原物質を精製することであ
る。多糖類のこのような性質は、多糖類の「自然状態の
立体配置（ｎａｔｖｅ ｓｔａｔｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒ
ａｔｉｏｎ）」と呼ぶことができるものの保持にあるよ
うに思われる。
多糖類から分離すべき材料のうちに、タンパク質、核
酸、および“Ｃ”多糖がある。“Ｃ”多糖は、デンマー
ク表示で肺炎球菌型４、７Ｆおよび１４中に高濃度で存
在し、そして米国特許第４，２４２，５０１号中に示さ
れているようにしてそれから分離することができる。
酸、および“Ｃ”多糖がある。“Ｃ”多糖は、デンマー
ク表示で肺炎球菌型４、７Ｆおよび１４中に高濃度で存
在し、そして米国特許第４，２４２，５０１号中に示さ
れているようにしてそれから分離することができる。
核酸類（２６０ＭＵの光を吸収する）は肺炎球菌多糖類
の製造において満足すべきレベルに減少させることは困
難である。この問題は、免疫原性を保持しながら、より
容易に精製される髄膜炎菌多糖により提供される場合と
対照的である。髄膜炎多糖は、米国特許第３，６３６，
１９２号（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）中に示されている比較
的過酷な方法により精製可能である。８５の特定の型の
肺炎球菌が存在する。これらの型は米国およびデンマー
クの両者の命名系により表示される。ここに引用する型
の表示はデンマークの番号による。各型は汚染物質を排
除する特定の方法を必要とするように思われるが、単一
の方法をすべての型の肺炎球菌多糖類に適用することが
できない。さらに、特定の適切な方法は予測不可能であ
るように思われる。種々の肺炎球菌多糖類を精製するた
めに使用される異る手順の例として、あるものは沈殿の
ために大量のエタノールを必要とし、このアルコール
は、核酸類が３Ａアルコールを用いて低級アルコールの
範囲において沈殿するので、核酸類から部分的に分離す
ることができる。３Ａアルコールは５％の無水メタノー
ルおよび９５％の無水エタノールである。無水エタノー
ルは本質的に同一の態様で挙動するであろうから、完全
に同等であると考えられる。この明細書を通じて、「ア
ルコール」という用語は、特記しないかぎり、３Ａアル
コールを表示する。
の製造において満足すべきレベルに減少させることは困
難である。この問題は、免疫原性を保持しながら、より
容易に精製される髄膜炎菌多糖により提供される場合と
対照的である。髄膜炎多糖は、米国特許第３，６３６，
１９２号（Ｇｏｔｓｈｌｉｃｈ）中に示されている比較
的過酷な方法により精製可能である。８５の特定の型の
肺炎球菌が存在する。これらの型は米国およびデンマー
クの両者の命名系により表示される。ここに引用する型
の表示はデンマークの番号による。各型は汚染物質を排
除する特定の方法を必要とするように思われるが、単一
の方法をすべての型の肺炎球菌多糖類に適用することが
できない。さらに、特定の適切な方法は予測不可能であ
るように思われる。種々の肺炎球菌多糖類を精製するた
めに使用される異る手順の例として、あるものは沈殿の
ために大量のエタノールを必要とし、このアルコール
は、核酸類が３Ａアルコールを用いて低級アルコールの
範囲において沈殿するので、核酸類から部分的に分離す
ることができる。３Ａアルコールは５％の無水メタノー
ルおよび９５％の無水エタノールである。無水エタノー
ルは本質的に同一の態様で挙動するであろうから、完全
に同等であると考えられる。この明細書を通じて、「ア
ルコール」という用語は、特記しないかぎり、３Ａアル
コールを表示する。
他の型では、多糖類は３０〜５０％の範囲において沈殿
し、こうしてアルコールは分離沈殿剤として有効ではな
い。対照的に、他の型は注意して調節された量の硫酸プ
ロタミンにより核酸類から分離することができる。これ
らの型では、硫酸プロタミンの最適濃度（０．０２〜
０．２０％）において、核酸類は沈殿し、高速遠心によ
り沈降させることができる。しかしながら、構成成分の
核酸を沈殿させるために要求される量を超える、この系
における過剰量の硫酸プロタミンは多糖類を追加的に沈
殿させる。他の型の肺炎球菌多糖の精製の例は、３型肺
炎球菌にしばしば用いられる精製により提供され、この
多糖は核酸からの分離が困難である。酢酸カルシウムを
酢酸ナトリウムの代わりに３型肺炎球菌多糖の溶液中の
電解質として使用すると、多糖は最小量のアルコール
（１０〜１２％）で沈殿させることができる。しかしな
がら、この方法は時には実質的な量の核酸を上澄み相中
に溶解させることがある。多糖−核酸混合物と硫酸アン
モニウムとの反応における種々の肺炎球菌多糖の型の挙
動は、また変動する。ある多糖類は５０〜６０％におい
て硫酸アンモニウムにより沈殿し、これに対して他のも
のは沈殿しない。１型多糖は硫酸アンモニウムで沈殿せ
ず、これに対して３型および４型は硫酸アンモニウムで
５０％の飽和にすることにより核酸からある程度分離す
ることができる。上の解説および次の参考文献から明ら
かなように、８５以上の型の肺炎球菌が存在しかつ実際
的なワクチンの製造は多くの種の肺炎球菌からの多糖分
画からなる多価ワクチンを必要とし、各分画が比較的自
然状態の立体配置を保持するという事実を見ると、すべ
ての型に適用可能な肺炎球菌多糖から汚染物質を除去す
る満足すべき方法は存在しない［Ｇｕｙ，Ｒ．Ｃ．
Ｗ．，Ｈｏｗ，Ｊ．，Ｓｔａｃｅｙ，Ｍ．，Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｊ．ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．２４
２：２１（１９６７）；Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．３７：４４５（１９３９）；Ｇｌａｕｄｅｍ
ａｎｓ，Ｃ．Ｐ．Ｊ．，Ｔｒｅｆｆｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．，
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．４，（１９６
７）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａ
ｓ，ｐｕｂｌｉｓｔｅｒ，ｐｐ．８３８−８４２（１９
６７）。
し、こうしてアルコールは分離沈殿剤として有効ではな
い。対照的に、他の型は注意して調節された量の硫酸プ
ロタミンにより核酸類から分離することができる。これ
らの型では、硫酸プロタミンの最適濃度（０．０２〜
０．２０％）において、核酸類は沈殿し、高速遠心によ
り沈降させることができる。しかしながら、構成成分の
核酸を沈殿させるために要求される量を超える、この系
における過剰量の硫酸プロタミンは多糖類を追加的に沈
殿させる。他の型の肺炎球菌多糖の精製の例は、３型肺
炎球菌にしばしば用いられる精製により提供され、この
多糖は核酸からの分離が困難である。酢酸カルシウムを
酢酸ナトリウムの代わりに３型肺炎球菌多糖の溶液中の
電解質として使用すると、多糖は最小量のアルコール
（１０〜１２％）で沈殿させることができる。しかしな
がら、この方法は時には実質的な量の核酸を上澄み相中
に溶解させることがある。多糖−核酸混合物と硫酸アン
モニウムとの反応における種々の肺炎球菌多糖の型の挙
動は、また変動する。ある多糖類は５０〜６０％におい
て硫酸アンモニウムにより沈殿し、これに対して他のも
のは沈殿しない。１型多糖は硫酸アンモニウムで沈殿せ
ず、これに対して３型および４型は硫酸アンモニウムで
５０％の飽和にすることにより核酸からある程度分離す
ることができる。上の解説および次の参考文献から明ら
かなように、８５以上の型の肺炎球菌が存在しかつ実際
的なワクチンの製造は多くの種の肺炎球菌からの多糖分
画からなる多価ワクチンを必要とし、各分画が比較的自
然状態の立体配置を保持するという事実を見ると、すべ
ての型に適用可能な肺炎球菌多糖から汚染物質を除去す
る満足すべき方法は存在しない［Ｇｕｙ，Ｒ．Ｃ．
Ｗ．，Ｈｏｗ，Ｊ．，Ｓｔａｃｅｙ，Ｍ．，Ｈｅｉｄｅ
ｌｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．，Ｊ．ＢｉＯｌ．Ｃｈｅｍ．２４
２：２１（１９６７）；Ｂｒｏｗｎ，Ｒ．，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．３７：４４５（１９３９）；Ｇｌａｕｄｅｍ
ａｎｓ，Ｃ．Ｐ．Ｊ．，Ｔｒｅｆｆｅｒｓ，Ｈ．Ｐ．，
Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓ．４，（１９６
７）；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ．Ｔｈｏｍａ
ｓ，ｐｕｂｌｉｓｔｅｒ，ｐｐ．８３８−８４２（１９
６７）。
肺炎球菌多糖の他の汚染物質はタンパク質である。アル
コールの沈殿はタンパク質汚染物質のレベルの低下にお
いて有効であるが、この汚染を非経口的生成物のために
満足すべきレベルに低下させることは不可能である。タ
ンパク質のレベルを低下させるために普通に用いられる
１つの方法は、肺炎球菌多糖類とタンパク質との混合物
を有機溶媒に暴露することである。例えば、「セバグ
（Ｓｅｖａｇ）」の手順［Ｓｅｖａｇ，Ｍ．Ｇ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｚ．，２７２：４１９（１９３４）］は、ク
ロロホルムとブタノールとの混合物とともに４〜６時間
激しく振盪することにより抽出し、次いで低速度で遠心
することからなる。界面に集まる変性したタンパク質
を、次いで水相から多糖類と分離することができる。し
かしながら、この手順は、抽出が肺炎球菌多糖類にしば
しば悪影響を及ぼし、肺炎球菌多糖類を破壊し、解重合
し、あるいは自然状態の立体配置を損失させるので、不
満足である。得られるものは、免疫原として有効でない
多糖類である。他の手順、例えば、硫酸アンモニウムの
沈殿およびモレキュラーシーブを用いてタンパク質の汚
染を減少することができるが、このような手順は溶液中
の多くの異る大きさおよび型のタンパク質類のうちの各
群のタンパク質類およびペプチド類に対して特異的であ
る。ここで再び、多糖類の変動性は、菌株に依存して、
用いる特定のタンパク質の分離工程の有効性を決定す
る。さらに、１つの手順はすべての肺炎球菌莢膜多糖類
の精製において有効ではなく、かつ特定の肺炎球菌莢膜
多糖の挙動の予測は不可能であるように思われると結論
することができる。
コールの沈殿はタンパク質汚染物質のレベルの低下にお
いて有効であるが、この汚染を非経口的生成物のために
満足すべきレベルに低下させることは不可能である。タ
ンパク質のレベルを低下させるために普通に用いられる
１つの方法は、肺炎球菌多糖類とタンパク質との混合物
を有機溶媒に暴露することである。例えば、「セバグ
（Ｓｅｖａｇ）」の手順［Ｓｅｖａｇ，Ｍ．Ｇ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｚ．，２７２：４１９（１９３４）］は、ク
ロロホルムとブタノールとの混合物とともに４〜６時間
激しく振盪することにより抽出し、次いで低速度で遠心
することからなる。界面に集まる変性したタンパク質
を、次いで水相から多糖類と分離することができる。し
かしながら、この手順は、抽出が肺炎球菌多糖類にしば
しば悪影響を及ぼし、肺炎球菌多糖類を破壊し、解重合
し、あるいは自然状態の立体配置を損失させるので、不
満足である。得られるものは、免疫原として有効でない
多糖類である。他の手順、例えば、硫酸アンモニウムの
沈殿およびモレキュラーシーブを用いてタンパク質の汚
染を減少することができるが、このような手順は溶液中
の多くの異る大きさおよび型のタンパク質類のうちの各
群のタンパク質類およびペプチド類に対して特異的であ
る。ここで再び、多糖類の変動性は、菌株に依存して、
用いる特定のタンパク質の分離工程の有効性を決定す
る。さらに、１つの手順はすべての肺炎球菌莢膜多糖類
の精製において有効ではなく、かつ特定の肺炎球菌莢膜
多糖の挙動の予測は不可能であるように思われると結論
することができる。
しかしながら、高い純度でかつ免疫原性を保持して肺炎
球菌莢膜多糖を精製するある数の方法が今回発見され
た。これらの精製は、具体的には１０の型の肺炎球菌の
精製に関する。これらの型は、３、５、９Ｖ、１０Ａ、
１１Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ
型（デンマーク表示）である。
球菌莢膜多糖を精製するある数の方法が今回発見され
た。これらの精製は、具体的には１０の型の肺炎球菌の
精製に関する。これらの型は、３、５、９Ｖ、１０Ａ、
１１Ａ、１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ
型（デンマーク表示）である。
本発明の主題は、デンマーク表示により、１、２、３、
４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１
Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、
１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ型と、場合
によって、６Ａおよび２５型を含まないかまたは６Ａお
よび２５型のいずれかもしくは両者からの肺炎球菌莢膜
多糖の有効免疫原量との群からなり、かつ４、７Ｆおよ
び１４型の主要汚染物質である“Ｃ”多糖が実質的に存
在しない有効免疫原量の組み合わせからなる多価ワクチ
ンである。この明細書において定義されているように、
“Ｃ”多糖が実質的に存在しないとは０．５％より少な
い“Ｃ”多糖を意味する。この多価ワクチンの調製に対
する中心は、このワクチンにおいて使用する１０の型の
各々の精製された莢膜多糖を調製する方法である。肺炎
球菌バクテリアが適当な発酵法により静止生長相に生長
した後、有効量のナトリウムデオキシコレートを添加し
てすべてのバクテリア細胞を溶解することで発酵を停止
し、そして細胞に関連する多糖を媒質中に放出する。細
胞の破片を媒質から除去し、１または２回のアルコール
沈殿を行なう。この手順は、タンパク質を含む汚染物質
のきわめて多くを肺炎球菌多糖類から除去する。
４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１
Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、
１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ型と、場合
によって、６Ａおよび２５型を含まないかまたは６Ａお
よび２５型のいずれかもしくは両者からの肺炎球菌莢膜
多糖の有効免疫原量との群からなり、かつ４、７Ｆおよ
び１４型の主要汚染物質である“Ｃ”多糖が実質的に存
在しない有効免疫原量の組み合わせからなる多価ワクチ
ンである。この明細書において定義されているように、
“Ｃ”多糖が実質的に存在しないとは０．５％より少な
い“Ｃ”多糖を意味する。この多価ワクチンの調製に対
する中心は、このワクチンにおいて使用する１０の型の
各々の精製された莢膜多糖を調製する方法である。肺炎
球菌バクテリアが適当な発酵法により静止生長相に生長
した後、有効量のナトリウムデオキシコレートを添加し
てすべてのバクテリア細胞を溶解することで発酵を停止
し、そして細胞に関連する多糖を媒質中に放出する。細
胞の破片を媒質から除去し、１または２回のアルコール
沈殿を行なう。この手順は、タンパク質を含む汚染物質
のきわめて多くを肺炎球菌多糖類から除去する。
注意して調節したアルコール沈殿は、本発明の方法にお
いてすべての多糖類の精製における主要工程であり、各
多糖をアルコールにより少なくとも５回沈殿させる。こ
れはより過酷なクロロホルム−ブタノール抽出を回避す
る。
いてすべての多糖類の精製における主要工程であり、各
多糖をアルコールにより少なくとも５回沈殿させる。こ
れはより過酷なクロロホルム−ブタノール抽出を回避す
る。
２つの型のアルコール沈殿を使用する。
第１に、十分なアルコールを試料に添加して多糖類を沈
殿させる。次いで、この沈降物を上澄みから遠心により
分離し、蒸留水中に再溶解させる。
殿させる。次いで、この沈降物を上澄みから遠心により
分離し、蒸留水中に再溶解させる。
第２の型は、分別アルコール沈殿である。多糖類を沈殿
させない最大量のアルコールを添加する。次いで汚染物
質の沈降物を遠心により除去し、十分量のアルコールを
上澄みへ添加して多糖類を沈殿させる。次いで多糖類の
沈降物を遠心により収穫し、そして多糖類を蒸留水中に
再溶解させる。
させない最大量のアルコールを添加する。次いで汚染物
質の沈降物を遠心により除去し、十分量のアルコールを
上澄みへ添加して多糖類を沈殿させる。次いで多糖類の
沈降物を遠心により収穫し、そして多糖類を蒸留水中に
再溶解させる。
両方の型の沈殿の終りにおいて、水中に溶解しない特定
の物質は多糖ではなく、遠心または濾過により除去され
る。
の物質は多糖ではなく、遠心または濾過により除去され
る。
数回のアルコール沈殿を実施した後における、臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム［セタブロン（ｃｅｔ
ａｖｌｏｎ）］の処理は最も有効であり、精製手順にお
ける初期の工程における使用よりも改良されている。
サデシルトリメチルアンモニウム［セタブロン（ｃｅｔ
ａｖｌｏｎ）］の処理は最も有効であり、精製手順にお
ける初期の工程における使用よりも改良されている。
セタブロンは、本発明の肺炎球菌型の大部分にとって、
重要な分離工程である。これらの型において、この工程
は注意して調節された条件下でタンパク質および核酸の
汚染物質よりも優先的に多糖類を沈殿させるか、あるい
は逆に、汚染物質を優先的に沈殿させる。次いで沈殿し
た多糖類を、塩化ナトリウム（通常０．２５Ｍ）中に可
溶化し、遠心して、前記塩中に不溶性である汚染する高
分子を除去する。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムおよび塩の濃度は多糖の精製に最適に変えることが
できるが、この手順は沈殿する３、５、１１Ａ、１５
Ｂ、１７Ｆおよび２２Ｆ型に有効であることが明らかに
された。
重要な分離工程である。これらの型において、この工程
は注意して調節された条件下でタンパク質および核酸の
汚染物質よりも優先的に多糖類を沈殿させるか、あるい
は逆に、汚染物質を優先的に沈殿させる。次いで沈殿し
た多糖類を、塩化ナトリウム（通常０．２５Ｍ）中に可
溶化し、遠心して、前記塩中に不溶性である汚染する高
分子を除去する。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムおよび塩の濃度は多糖の精製に最適に変えることが
できるが、この手順は沈殿する３、５、１１Ａ、１５
Ｂ、１７Ｆおよび２２Ｆ型に有効であることが明らかに
された。
４つの型（９Ｖ、１９Ａ、２３Ｆおよび３３Ｆ）は臭化
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムにより沈殿しな
い。これらに４つの型の場合において、臭化ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムを添加し、そして生ずる汚染
物の沈殿を遠心分離し、廃棄する。臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウムはアルコール中に可溶性であるの
で、引く続くアルコール沈殿はそれ以上の多糖の精製お
よび残留する臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
の除去の両者において有効である。この一般的もくろみ
は、ある数の肺炎球菌多糖の型に対して変法と共に適す
る広範な手順である。１０Ａ型は、セタブロンの使用に
より精製されないということにおいて独特である。
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムにより沈殿しな
い。これらに４つの型の場合において、臭化ヘキサデシ
ルトリメチルアンモニウムを添加し、そして生ずる汚染
物の沈殿を遠心分離し、廃棄する。臭化ヘキサデシルト
リメチルアンモニウムはアルコール中に可溶性であるの
で、引く続くアルコール沈殿はそれ以上の多糖の精製お
よび残留する臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
の除去の両者において有効である。この一般的もくろみ
は、ある数の肺炎球菌多糖の型に対して変法と共に適す
る広範な手順である。１０Ａ型は、セタブロンの使用に
より精製されないということにおいて独特である。
セタブロンを効果的に除去するアルコールの処理後、特
定の菌株に対して独特である汚染物質のために異る工程
を組み込むことができる。次いで、肺炎球菌多糖を透析
し、凍結乾燥し、そして−２０℃以下において乾燥粉末
として貯蔵することができる。
定の菌株に対して独特である汚染物質のために異る工程
を組み込むことができる。次いで、肺炎球菌多糖を透析
し、凍結乾燥し、そして−２０℃以下において乾燥粉末
として貯蔵することができる。
ワクチンは、防腐剤を含有する適当な緩衝液、例えば、
リン酸塩緩衝液中に多糖類を溶解し、次いで滅菌濾過す
ることによってつくることができる。
リン酸塩緩衝液中に多糖類を溶解し、次いで滅菌濾過す
ることによってつくることができる。
肺炎球菌多糖の普通の精製法は、次のように要約するこ
とができる。
とができる。
デオキシコレートにより溶解された培養物 ↓ ２回の分別アルコール沈殿 ↓ セタブロン処理 ↓ ３回のアルコール沈殿 ↓ 活性炭 ↓ 透析 ↓ 凍結乾燥 本発明の目的は、“Ｃ”多糖汚染が実質的に存在しな
い、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９
Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、
１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび
３３Ｆ型、ならびに、場合によって、６Ａおよび２５型
を含まないかまたは６Ａおよび２５型のいずれかもしく
は両者についての、効率よく精製された高度に免疫原性
の多価肺炎球菌多糖ワクチンを提供することである。
い、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９
Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、
１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび
３３Ｆ型、ならびに、場合によって、６Ａおよび２５型
を含まないかまたは６Ａおよび２５型のいずれかもしく
は両者についての、効率よく精製された高度に免疫原性
の多価肺炎球菌多糖ワクチンを提供することである。
本発明の特定の目的は、“Ｃ”多糖汚染が実質的に存在
しない、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、
９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７
Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆお
よび３３Ｆ型と、場合によって、６Ａおよび２５型を含
まないかまたは６Ａおよび２５型のいずれかもしくは両
者についての、高度に免疫原性の肺炎球菌多糖ワクチン
を提供することである。
しない、１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、
９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７
Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆお
よび３３Ｆ型と、場合によって、６Ａおよび２５型を含
まないかまたは６Ａおよび２５型のいずれかもしくは両
者についての、高度に免疫原性の肺炎球菌多糖ワクチン
を提供することである。
本発明の他の目的は、３、５、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、
１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型肺炎球
菌の免疫学的に活性な莢膜多糖を精製する方法を提供す
ることである。
１５Ｂ、１７Ｆ、１９Ａ、２２Ｆおよび３３Ｆ型肺炎球
菌の免疫学的に活性な莢膜多糖を精製する方法を提供す
ることである。
“Ｃ”多糖が存在しない有効な多価肺炎球菌ワクチン
は、０．０１％のシメロサル（thimerosal）を含有する
０．１Ｍのリン酸塩緩衝液に凍結乾燥された免疫学的に
活性の十分な肺炎球菌多糖を添加して、約１００ミクロ
グラム／ｍｌ／型の最終濃度を生成させることによって
調製することができる。免疫を提供するための多糖の精
確な濃度が肺炎球菌の型および免疫化すべき個体の両者
ともに変動するので、これは一般に有効量である。
は、０．０１％のシメロサル（thimerosal）を含有する
０．１Ｍのリン酸塩緩衝液に凍結乾燥された免疫学的に
活性の十分な肺炎球菌多糖を添加して、約１００ミクロ
グラム／ｍｌ／型の最終濃度を生成させることによって
調製することができる。免疫を提供するための多糖の精
確な濃度が肺炎球菌の型および免疫化すべき個体の両者
ともに変動するので、これは一般に有効量である。
この混合物を約４℃において約４０時間かきまぜ、滅菌
濾過する。１つの実施態様において、１、２、３、４、
５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１
Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、
１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆ型の
凍結乾燥された肺炎球菌多糖の各々の１．０mgを０．０
１％のシメロサルを含有する０．１モルのリン酸塩緩衝
液と一緒にして１０ccの最終体積とし、約４℃において
約４時間かきまぜる。４、７Ｆ、および１４型を“Ｃ”
多糖を本質的に含まず（０．５％より少ない“Ｃ”多糖
の存在量）かつ有効な免疫原性を示す状態で添加する。
濾過する。１つの実施態様において、１、２、３、４、
５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１
Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、
１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２５および３３Ｆ型の
凍結乾燥された肺炎球菌多糖の各々の１．０mgを０．０
１％のシメロサルを含有する０．１モルのリン酸塩緩衝
液と一緒にして１０ccの最終体積とし、約４℃において
約４時間かきまぜる。４、７Ｆ、および１４型を“Ｃ”
多糖を本質的に含まず（０．５％より少ない“Ｃ”多糖
の存在量）かつ有効な免疫原性を示す状態で添加する。
好ましい実施態様において、上の手順を利用するが、２
３の肺炎球菌型のみを使用する。これらの型は１、２、
３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１
１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９
Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ型であ
る。自然状態の立体配置を損失せず、それゆえ有効免疫
原性を損失せずに、利用する各肺炎球菌型を精製するこ
とは、上の有効な多価ワクチンの調製に対して重要であ
る。後の実施例において、１０は特定の肺炎球菌型から
純粋な免疫学的に活性な多糖を得る特定の方法を例示す
る。これらの型は温血動物における特定の免疫原の応答
を生じさせるために利用することができ、あるいは多価
ワクチンとして組み合わせで利用することができる。前
述の２種類の多価ワクチンは、本発明の２５の精製され
た肺炎球菌莢膜多糖類を全体的にあるいは部分的に利用
して調製されうる多価ワクチンの多くの組み合わせを単
なる例示として理解されるであろう。
３の肺炎球菌型のみを使用する。これらの型は１、２、
３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１
１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９
Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ型であ
る。自然状態の立体配置を損失せず、それゆえ有効免疫
原性を損失せずに、利用する各肺炎球菌型を精製するこ
とは、上の有効な多価ワクチンの調製に対して重要であ
る。後の実施例において、１０は特定の肺炎球菌型から
純粋な免疫学的に活性な多糖を得る特定の方法を例示す
る。これらの型は温血動物における特定の免疫原の応答
を生じさせるために利用することができ、あるいは多価
ワクチンとして組み合わせで利用することができる。前
述の２種類の多価ワクチンは、本発明の２５の精製され
た肺炎球菌莢膜多糖類を全体的にあるいは部分的に利用
して調製されうる多価ワクチンの多くの組み合わせを単
なる例示として理解されるであろう。
これらの実施例は、次の順序で配置される：実施例 デンマーク型 アメリカン型 １ ３ ３ ２ ５ ５ ３ ９Ｖ ６８ ４ １０Ａ ３４ ５ １１Ａ ４３ ６ １５Ｂ ５４ ７ １７Ｆ １７ ８ １９Ａ ５７ ９ ２２Ｆ ２２ １０ ３３Ｆ ７０ デンマーク表示により１、２、４、８、１２Ｆ、２５、
６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、１４、１９Ｆ、２０、２３Ｆ
および１８Ｃ型である炎球菌型は、引用によってここに
加える、米国特許第４，２４２，５０１号に記載されて
いるように調製することができる。
６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｎ、１４、１９Ｆ、２０、２３Ｆ
および１８Ｃ型である炎球菌型は、引用によってここに
加える、米国特許第４，２４２，５０１号に記載されて
いるように調製することができる。
実施例１ ３型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 ３００〜５００の培地を使用して、３型肺炎球菌をこ
のよな肺炎球菌の生長の適する条件下で生長させて静止
相に到達させる。次いでバクテリアを適当な溶解剤（ｌ
ｙｓａｎｔ）、ここではナトリウムデオキシコレートの
１０％の滅菌濾過した溶液の添加により溶解する。他の
洗剤のような多くの溶解法ならびに超音波破砕およびフ
レンチプレス処理のような機械的方法を使用することが
できる。すべては本発明の方法において完全に同等の材
料を生成するであろう。ナトリウムデオキシコレートを
使用するとき、適当な溶解濃度は約０．１〜０．２％で
あることがわかった。すべてのバクテリア細胞を溶解し
て、細胞に関連する多糖を培地中に解放する。濁った培
地を遠心により清浄にする。ここで、１６型シャープレ
ス（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）遠心機を１６，０００ｒｐｍお
よび３６〜４０／時の流速で使用すると同時に約２〜
１０℃の温度を維持した。このようにして集められた細
胞の破片（ｄｅｂｒｉｓ）を廃棄する。多糖を含む上澄
みをpH約６．６に調節する。これらの実施例において、
pHの調節は通常８モルの酢酸の添加により達成された。
予備工程において表示された精確なpH値は一般的なもの
であり、好ましいモードを指示するだけであることに注
意すべきである。有用なpH範囲は、すべての肺炎球菌型
とともに広く変動することを理解すべきである。セタブ
ロンを利用する沈殿工程のみは、高度に特定のpHの観測
を必要とする。同様に、酢酸は１種の酸性化剤の単なる
例示である。酢酸は付随する緩衝作用をもつ酢酸ナトリ
ウムの使用を可能とするが、他の酸類、塩基類および緩
衝剤類の他のpH調節系は当業者にとって明らかであろ
う。上の手順により、本発明の精製法のための原料の多
糖上澄が調製される。
のよな肺炎球菌の生長の適する条件下で生長させて静止
相に到達させる。次いでバクテリアを適当な溶解剤（ｌ
ｙｓａｎｔ）、ここではナトリウムデオキシコレートの
１０％の滅菌濾過した溶液の添加により溶解する。他の
洗剤のような多くの溶解法ならびに超音波破砕およびフ
レンチプレス処理のような機械的方法を使用することが
できる。すべては本発明の方法において完全に同等の材
料を生成するであろう。ナトリウムデオキシコレートを
使用するとき、適当な溶解濃度は約０．１〜０．２％で
あることがわかった。すべてのバクテリア細胞を溶解し
て、細胞に関連する多糖を培地中に解放する。濁った培
地を遠心により清浄にする。ここで、１６型シャープレ
ス（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）遠心機を１６，０００ｒｐｍお
よび３６〜４０／時の流速で使用すると同時に約２〜
１０℃の温度を維持した。このようにして集められた細
胞の破片（ｄｅｂｒｉｓ）を廃棄する。多糖を含む上澄
みをpH約６．６に調節する。これらの実施例において、
pHの調節は通常８モルの酢酸の添加により達成された。
予備工程において表示された精確なpH値は一般的なもの
であり、好ましいモードを指示するだけであることに注
意すべきである。有用なpH範囲は、すべての肺炎球菌型
とともに広く変動することを理解すべきである。セタブ
ロンを利用する沈殿工程のみは、高度に特定のpHの観測
を必要とする。同様に、酢酸は１種の酸性化剤の単なる
例示である。酢酸は付随する緩衝作用をもつ酢酸ナトリ
ウムの使用を可能とするが、他の酸類、塩基類および緩
衝剤類の他のpH調節系は当業者にとって明らかであろ
う。上の手順により、本発明の精製法のための原料の多
糖上澄が調製される。
多糖の精製：３型 （Ａ）第１アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
濃度（以下、単に「モル」という）の酢酸で調節する。
アルコールを０．１５〜０．５容量、好ましくは０．２
５容量で、２〜６℃の温度においてかきまぜながらゆっ
くり添加する。pHを約７．０に、好ましいモードにおい
て、±０．１に８モルの酢酸で調節する。多糖の沈殿は
ゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６〜２０時間静
置し、そして遠心する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において取扱われ、こうして
１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時に、ここ
では約４℃に保持すべきである。多糖の沈殿は、かきま
ぜながら、十分な量、通常約１００の、４％の酢酸ナ
トリウム溶液中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。ブ
レンダー内の短時間の機械的かきまぜ（４〜６秒）はこ
の溶解を促進する。濁りが存在するとき、この溶液を低
温、約２〜６℃および約１６〜１８／時の流速におい
て、濾過または遠心により清浄化することができる。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
濃度（以下、単に「モル」という）の酢酸で調節する。
アルコールを０．１５〜０．５容量、好ましくは０．２
５容量で、２〜６℃の温度においてかきまぜながらゆっ
くり添加する。pHを約７．０に、好ましいモードにおい
て、±０．１に８モルの酢酸で調節する。多糖の沈殿は
ゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６〜２０時間静
置し、そして遠心する。肺炎球菌多糖類は不安定化する
傾向があり、それらは低温において取扱われ、こうして
１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時に、ここ
では約４℃に保持すべきである。多糖の沈殿は、かきま
ぜながら、十分な量、通常約１００の、４％の酢酸ナ
トリウム溶液中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。ブ
レンダー内の短時間の機械的かきまぜ（４〜６秒）はこ
の溶解を促進する。濁りが存在するとき、この溶液を低
温、約２〜６℃および約１６〜１８／時の流速におい
て、濾過または遠心により清浄化することができる。
（Ｂ）第２アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．６容量、好ましい実施態様にお
いて０．４容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、
第１アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過ま
たは遠心により清浄化する。このように取り出された多
糖沈殿を５０の水中に再溶解し、そして水を凍結乾燥
により除去する。乾燥粉末を２００の水中に再溶解
し、遠心して濁りを除去する。ＣＰＸ １０ＣおよびＣ
ＰＸ ７０Ｃパッド（ＡＭＦ ＣＵＮＯ）または同等物
を装填したナイアグラ（Ｎｉａｇｒａ）フィルタープレ
スを使用して、上澄みを濾過する。部分的に精製された
多糖上澄み流体をpH約６．６に、好ましいモードにおい
て±０．１に調節する。多糖を完全に沈殿させるため
に、酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そし
てpHを第１アルコール沈殿において記載したように約
６．７に、好ましいモードにおいて±０．１に調節し、
そして約０．１〜０．５容量のアルコールを好ましい実
施態様において０．５容量の最終最小濃度に添加し、そ
してpHを７に調節する。次いで、静置し、第１アルコー
ル沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約２００
の冷ピロゲン不含水中に、好ましい実施態様において
約４℃において再溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．６容量、好ましい実施態様にお
いて０．４容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、
第１アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過ま
たは遠心により清浄化する。このように取り出された多
糖沈殿を５０の水中に再溶解し、そして水を凍結乾燥
により除去する。乾燥粉末を２００の水中に再溶解
し、遠心して濁りを除去する。ＣＰＸ １０ＣおよびＣ
ＰＸ ７０Ｃパッド（ＡＭＦ ＣＵＮＯ）または同等物
を装填したナイアグラ（Ｎｉａｇｒａ）フィルタープレ
スを使用して、上澄みを濾過する。部分的に精製された
多糖上澄み流体をpH約６．６に、好ましいモードにおい
て±０．１に調節する。多糖を完全に沈殿させるため
に、酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そし
てpHを第１アルコール沈殿において記載したように約
６．７に、好ましいモードにおいて±０．１に調節し、
そして約０．１〜０．５容量のアルコールを好ましい実
施態様において０．５容量の最終最小濃度に添加し、そ
してpHを７に調節する。次いで、静置し、第１アルコー
ル沈殿におけるように、沈殿し、遠心し、再び約２００
の冷ピロゲン不含水中に、好ましい実施態様において
約４℃において再溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を０．１〜
０．５容量％，好ましくは０．３容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、３型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、ア
ルコール沈殿後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。
０．５容量％，好ましくは０．３容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、３型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、ア
ルコール沈殿後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約０．５０容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約０．５０容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
この明細書を通じて、セタブロンの濃度は１０％の溶液
に基づく％の値で表わす。セタブロン溶液の濃度の変更
は、同等の最終濃度に到達させるために添加するこのよ
うな溶液の量を相応して変更することを理解すべきであ
る。
に基づく％の値で表わす。セタブロン溶液の濃度の変更
は、同等の最終濃度に到達させるために添加するこのよ
うな溶液の量を相応して変更することを理解すべきであ
る。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、また冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
３〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列の遠心機お
よび／または膜フィルターに通過させることにより清浄
化する。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ
（ＡＭＦ−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．
２、０．６５、０．４５および０．２２ｕミリポア（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜を使用する。この手順の間、２６
０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度についての対照標準
として使用することができ、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔａ
ｌ．の方法を使用してタンパク質含量を監視することが
できる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
３〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列の遠心機お
よび／または膜フィルターに通過させることにより清浄
化する。好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ
（ＡＭＦ−ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．
２、０．６５、０．４５および０．２２ｕミリポア（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ）膜を使用する。この手順の間、２６
０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度についての対照標準
として使用することができ、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔａ
ｌ．の方法を使用してタンパク質含量を監視することが
できる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析する。ここで、１０，０００の分子量のカット
オフ（ｃｕｔ ｏｆｆ）の中空繊維のカートリッジを含
有するＤＣ３０型アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）装置を使用
し、すべての残留する塩化ナトリウムを除去した。次い
で、透析濾過液（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）を急速凍結
し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、
ここで３型、が残る。この粉末を低い温度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
２０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析する。ここで、１０，０００の分子量のカット
オフ（ｃｕｔ ｏｆｆ）の中空繊維のカートリッジを含
有するＤＣ３０型アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）装置を使用
し、すべての残留する塩化ナトリウムを除去した。次い
で、透析濾過液（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅ）を急速凍結
し、そして凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、
ここで３型、が残る。この粉末を低い温度においてびん
中に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−
２０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
明細書を通じて、活性炭の濃度は２０％の活性炭懸濁液
に基づく容量％で表わす。このような懸濁液の濃度の変
更は、同等の最終濃度に到達させるために必要とするこ
のような懸濁液の量に相応して変更することを理解すべ
きである。
に基づく容量％で表わす。このような懸濁液の濃度の変
更は、同等の最終濃度に到達させるために必要とするこ
のような懸濁液の量に相応して変更することを理解すべ
きである。
実施例２ ５型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、５型発酵肉汁のリゼイトから調製す
る。
おけるようにして、５型発酵肉汁のリゼイトから調製す
る。
多糖の精製：５型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。５型に
ついて、アルコールを最小約０．９〜１．４容量に添加
し、そしてpHを７に調節する。５型では、好ましい最終
アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約１．２５容
量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。５型に
ついて、アルコールを最小約０．９〜１．４容量に添加
し、そしてpHを７に調節する。５型では、好ましい最終
アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約１．２５容
量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきまぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約２〜６℃において、濾
過または遠心により清浄化することができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきまぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが存
在するとき、この溶液を低温、約２〜６℃において、濾
過または遠心により清浄化することができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。
約０．２５〜０．８０容量、好ましい実施態様において
０．５容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、第１
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過ま
たは遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコール沈殿
において記載したように約６．７に、好ましいモードに
おいて±０．１に調節する。約０．９〜１．４容量のア
ルコールを好ましい実施態様において１．２５容量の最
終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節する。次い
で、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不含水中
に、好ましい実施態様において約４℃において再溶解す
る。
０．５容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、第１
分別アルコール沈殿において前述のように処理し、かき
まぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾過ま
たは遠心により清浄化する。このように除去された沈
殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコール沈殿
において記載したように約６．７に、好ましいモードに
おいて±０．１に調節する。約０．９〜１．４容量のア
ルコールを好ましい実施態様において１．２５容量の最
終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節する。次い
で、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不含水中
に、好ましい実施態様において約４℃において再溶解す
る。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を１．０〜
５．０容量％，好ましくは２．００容量％にゆっくり添
加する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、５型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、ア
ルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。
５．０容量％，好ましくは２．００容量％にゆっくり添
加する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、５型肺炎
球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより沈殿
する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、ここ
で６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を使用す
る。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の
不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、ア
ルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物
の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．２５容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．２５容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）（２９３mm）膜を使用する。この手順の間、２
６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度についての対照標
準として使用することができ、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ
ａｌ．の方法を使用してタンパク質含量を監視すること
ができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）（２９３mm）膜を使用する。この手順の間、２
６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度についての対照標
準として使用することができ、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ
ａｌ．の方法を使用してタンパク質含量を監視すること
ができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）する。こ
こで、１０，０００の分子量のカットオフの中空繊維の
カートリッジを含有するＤＣ３０型アミコン装置を使用
し、すべての残留する塩化ナトリウムを除去した。次い
で、透析濾過液を急速凍結し、そして凍結乾燥して精製
された肺炎球菌多糖粉末、ここで５型、が残る。この粉
末を低い温度においてびん中に収穫し、次いでこれを密
封し、冷時に貯蔵する。−２０℃以下が適当であること
がわかった。
後、透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）する。こ
こで、１０，０００の分子量のカットオフの中空繊維の
カートリッジを含有するＤＣ３０型アミコン装置を使用
し、すべての残留する塩化ナトリウムを除去した。次い
で、透析濾過液を急速凍結し、そして凍結乾燥して精製
された肺炎球菌多糖粉末、ここで５型、が残る。この粉
末を低い温度においてびん中に収穫し、次いでこれを密
封し、冷時に貯蔵する。−２０℃以下が適当であること
がわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質の９０％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
実施例３ ９Ｖ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、９Ｖ型発酵肉汁のリゼイトから調製
する。
おけるようにして、９Ｖ型発酵肉汁のリゼイトから調製
する。
多糖の精製：９Ｖ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。９Ｖ型
について、アルコールを最小約１．２５〜２．２５容量
に添加し、そしてpHを７に調節する。９Ｖ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．７５容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。９Ｖ型
について、アルコールを最小約１．２５〜２．２５容量
に添加し、そしてpHを７に調節する。９Ｖ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．７５容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．１５〜０．３５容量、好ましい実施態様に
おいて０．２５容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜２．
２５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．
７５容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷ピロゲン
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．１５〜０．３５容量、好ましい実施態様に
おいて０．２５容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜２．
２５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．
７５容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷ピロゲン
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
塩化ナトリウムを０．１５モルに添加し、かきまぜなが
ら、セタブロンの１０％の溶液を０．０５〜１．０容量
％，好ましくは０．２容量％にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混合
物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。６〜８／時の流速および７〜１４℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、９Ｖ型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。
ら、セタブロンの１０％の溶液を０．０５〜１．０容量
％，好ましくは０．２容量％にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混合
物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。６〜８／時の流速および７〜１４℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、９Ｖ型肺炎球菌多糖は
セタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖は
ここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を廃
棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、アルコール分
別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分を
除去する。
次いで多糖を含有する上澄みを再沈殿させ、上澄みをpH
約６．６に調節し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添
加する。次いでpHを約６．７に上昇させ、約１．７５容
量のアルコールを添加し、そしてpHを７に約４℃におい
て１６〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発
熱物質不含水中に再溶解し、約４０は適当である。こ
の手順をさらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡
量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約２０の水中
に再溶解する。
約６．６に調節し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添
加する。次いでpHを約６．７に上昇させ、約１．７５容
量のアルコールを添加し、そしてpHを７に約４℃におい
て１６〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発
熱物質不含水中に再溶解し、約４０は適当である。こ
の手順をさらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡
量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約２０の水中
に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３mm）膜
を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃
度を核酸濃度についての対照標準として使用することが
でき、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用し
てタンパク質含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３mm）膜
を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃
度を核酸濃度についての対照標準として使用することが
でき、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用し
てタンパク質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
９Ｖ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中に
収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０
℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
９Ｖ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中に
収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０
℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
実施例４ １０Ａ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１０Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、１０Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：１０Ａ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．８容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１０Ａ
型について、アルコールを最小約１．０〜１．５容量に
添加し、そしてpHを７に調節する。１０Ａ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．５０容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１０Ａ
型について、アルコールを最小約１．０〜１．５容量に
添加し、そしてpHを７に調節する。１０Ａ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．５０容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．８容量、好ましい実施態様にお
いて０．５容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコール沈殿
において記載したように約６．７に、好ましいモードに
おいて±０．１に調節する。約１．０〜２．０容量のア
ルコールを好ましい実施態様において１．５容量の最終
最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節する。次いで、
静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、沈殿
し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不含水中に、好
ましい実施態様において約４℃において再溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．８容量、好ましい実施態様にお
いて０．５容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコール沈殿
において記載したように約６．７に、好ましいモードに
おいて±０．１に調節する。約１．０〜２．０容量のア
ルコールを好ましい実施態様において１．５容量の最終
最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節する。次いで、
静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、沈殿
し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不含水中に、好
ましい実施態様において約４℃において再溶解する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコールを
添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間
調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に
再溶解し、約２０は適当である。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコールを
添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間
調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に
再溶解し、約２０は適当である。
（Ｃ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３mm）膜
を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃
度を核酸濃度についての対照標準として使用することが
でき、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用し
てタンパク質含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３mm）膜
を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃
度を核酸濃度についての対照標準として使用することが
でき、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用し
てタンパク質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１０Ａ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１０Ａ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質の９９％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９０％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の９０％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
実施例５ １１Ａ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１１Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、１１Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：１１Ａ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．７５〜１．２５容
量、好ましくは１．０容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．７５〜１．２５容
量、好ましくは１．０容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１１Ａ
型について、アルコールを最小約１．５〜２．２５容量
に添加し、そしてpHを７に調節する。１１Ａ型では、好
ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
２．０容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１１Ａ
型について、アルコールを最小約１．５〜２．２５容量
に添加し、そしてpHを７に調節する。１１Ａ型では、好
ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
２．０容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．７５〜１．２５容量、好ましい実施態様に
おいて１．００容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．５０〜２．
２５容量のアルコールを好ましい実施態様において２．
００容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．７５〜１．２５容量、好ましい実施態様に
おいて１．００容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．５０〜２．
２５容量のアルコールを好ましい実施態様において２．
００容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を１．５〜
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、１１Ａ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、１１Ａ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約２容量のアルコールを添加
し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間調節
し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に再溶
解し、約４０は適当である。この手順をさらに２回反
復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロンを除去
し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約２容量のアルコールを添加
し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間調節
し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に再溶
解し、約４０は適当である。この手順をさらに２回反
復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロンを除去
し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３mm）膜
を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃
度を核酸濃度についての対照標準として使用することが
でき、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用し
てタンパク質含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア（２９３mm）膜
を使用する。この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃
度を核酸濃度についての対照標準として使用することが
でき、そしてＬｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用し
てタンパク質含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１１Ａ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１１Ａ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
実施例６ １５Ｂ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１５Ｂ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、１５Ｂ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：１５Ｂ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．４〜１．０容量、
好ましくは０．７５容量で、２〜６℃の温度においてか
きまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好ま
しいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節す
る。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６〜
２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向
があり、それらは低温において最もよく取扱われる。こ
うして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．４〜１．０容量、
好ましくは０．７５容量で、２〜６℃の温度においてか
きまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好ま
しいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節す
る。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６〜
２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向
があり、それらは低温において最もよく取扱われる。こ
うして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１５Ｂ
型について、アルコールを最小約１．５〜２．２５容量
に添加し、そしてpHを７に調節する。１５Ｂ型では、好
ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．７５容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１５Ｂ
型について、アルコールを最小約１．５〜２．２５容量
に添加し、そしてpHを７に調節する。１５Ｂ型では、好
ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．７５容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．４〜１．０容量、好ましい実施態様におい
て０．７５容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコール沈殿
において記載したように約６．７に、好ましいモードに
おいて±０．１に調節する。約１．５〜２．２５容量の
アルコールを好ましい実施態様において１．７５容量の
最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節する。次い
で、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不含水中
に、好ましい実施態様において約４℃において再溶解す
る。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．４〜１．０容量、好ましい実施態様におい
て０．７５容量のアルコールを添加し、pH７に調節し、
第１分別アルコール沈殿において前述のように処理し、
かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そして濾
過または遠心により清浄化する。このように除去された
沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約６．６
に、好ましいモードにおいて±０．１に調節する。多糖
を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを約４％の
最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコール沈殿
において記載したように約６．７に、好ましいモードに
おいて±０．１に調節する。約１．５〜２．２５容量の
アルコールを好ましい実施態様において１．７５容量の
最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節する。次い
で、静置し、第１分別アルコール沈殿におけるように、
沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不含水中
に、好ましい実施態様において約４℃において再溶解す
る。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を２．０〜
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、１５Ｂ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、１５Ｂ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈降物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．７５容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
濁りが見えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および
約６〜７／時の流速において濾過または遠心により清
浄することができる。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．７５容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
濁りが見えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および
約６〜７／時の流速において濾過または遠心により清
浄することができる。
（Ｄ）透析濾過および乾燥 得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１５Ｂ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１５Ｂ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質の９８％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
実施例７ １７Ｆ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１７Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、１７Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：１７Ｆ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間約４℃において静置する。肺炎球菌多糖類は
不安定化する傾向があり、それらは低温において最もよ
く取扱われる。こうして１６〜２０時間の期間の間、多
糖の沈殿を冷時に、ここでは約４℃に保持すべきであ
る。前述の分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製における
アルコール沈殿工程の標準である。上の方法の他の型に
ついての変動は、アルコールの容量および特定の型に使
用する工程の順序に主として依存するが、それらに限定
されない。沈殿した汚染物質は、遠心により、約１６〜
２０／時の流速および低温、好ましくは約２〜約６℃
の温度において均一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間約４℃において静置する。肺炎球菌多糖類は
不安定化する傾向があり、それらは低温において最もよ
く取扱われる。こうして１６〜２０時間の期間の間、多
糖の沈殿を冷時に、ここでは約４℃に保持すべきであ
る。前述の分別の方法は、肺炎球菌多糖の精製における
アルコール沈殿工程の標準である。上の方法の他の型に
ついての変動は、アルコールの容量および特定の型に使
用する工程の順序に主として依存するが、それらに限定
されない。沈殿した汚染物質は、遠心により、約１６〜
２０／時の流速および低温、好ましくは約２〜約６℃
の温度において均一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１７Ｆ
型について、アルコールを最小約１．０〜１．５容量に
添加し、そしてpHを７に調節する。１７Ｆ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．２５容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１７Ｆ
型について、アルコールを最小約１．０〜１．５容量に
添加し、そしてpHを７に調節する。１７Ｆ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．２５容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様に
おいて０．５０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．０〜１．５
容量のアルコールを好ましい実施態様において１．２５
容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節す
る。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿における
ように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不
含水中に、好ましい実施態様において約４℃において再
溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様に
おいて０．５０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．０〜１．５
容量のアルコールを好ましい実施態様において１．２５
容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節す
る。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿における
ように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不
含水中に、好ましい実施態様において約４℃において再
溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を２．０〜
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、１７Ｆ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、１７Ｆ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．２５容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．２５容量のアルコール
を添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時
間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中
に再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに
２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロン
を除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１７Ｆ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１７Ｆ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
実施例８ １９Ａ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、１９Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、１９Ａ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：１９Ａ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．５〜１．０容量、
好ましくは０．７５容量で、２〜６℃の温度においてか
きまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好ま
しいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節す
る。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６〜
２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向
があり、それらは低温において最もよく取扱われる。こ
うして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．５〜１．０容量、
好ましくは０．７５容量で、２〜６℃の温度においてか
きまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好ま
しいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節す
る。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６〜
２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾向
があり、それらは低温において最もよく取扱われる。こ
うして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１９Ａ
型について、アルコールを最小約１．５〜２．０容量に
添加し、そしてpHを７に調節する。１９Ａ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．７５容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。１９Ａ
型について、アルコールを最小約１．５〜２．０容量に
添加し、そしてpHを７に調節する。１９Ａ型では、好ま
しい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について約
１．７５容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．７５〜１．２５容量、好ましい実施態様に
おいて１．０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．５〜２．０
容量のアルコールを好ましい実施態様において１．７５
容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節す
る。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿における
ように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不
含水中に、好ましい実施態様において約４℃において再
溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．７５〜１．２５容量、好ましい実施態様に
おいて１．０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．５〜２．０
容量のアルコールを好ましい実施態様において１．７５
容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節す
る。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿における
ように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質不
含水中に、好ましい実施態様において約４℃において再
溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
塩化ナトリウムを０．１５モルにかきまぜながら添加
し、セタブロンの１０％の溶液を０．０５〜０．２容量
％，好ましくは０．０７５容量％にゆっくり添加する。
沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この
混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除
去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃の温度を
好ましい実施態様において使用するが、これらの範囲は
一般的である。この手順を用いると、１９Ａ型肺炎球菌
多糖はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。
多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純
物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、アルコ
ール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大
部分を除去する。
し、セタブロンの１０％の溶液を０．０５〜０．２容量
％，好ましくは０．０７５容量％にゆっくり添加する。
沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この
混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除
去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃の温度を
好ましい実施態様において使用するが、これらの範囲は
一般的である。この手順を用いると、１９Ａ型肺炎球菌
多糖はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。
多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純
物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、アルコ
ール分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大
部分を除去する。
次いで多糖を含有する上澄みを再沈殿させ、上澄みをpH
約６．６に調節し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添
加する。次いでpHを約６．７に上昇させ、約１．７５容
量のアルコールを添加し、そしてpHを７に約４℃におい
て１６〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発
熱物質不含水中に再溶解し、約４０は適当である。こ
の手順をさらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡
量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約２０の水中
に再溶解する。
約６．６に調節し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添
加する。次いでpHを約６．７に上昇させ、約１．７５容
量のアルコールを添加し、そしてpHを７に約４℃におい
て１６〜２０時間調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発
熱物質不含水中に再溶解し、約４０は適当である。こ
の手順をさらに２回反復して多糖をさらに精製し、痕跡
量のセタブロンを除去し、最後の沈殿を約２０の水中
に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１９Ａ型、が残る。凍結乾燥前に、０．０１％〜２５
％、好ましくは０．２％のグリシンを透析濾過液に添加
する。この粉末を低い温度においてびん中に収穫し、次
いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０℃以下が適
当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
１９Ａ型、が残る。凍結乾燥前に、０．０１％〜２５
％、好ましくは０．２％のグリシンを透析濾過液に添加
する。この粉末を低い温度においてびん中に収穫し、次
いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２０℃以下が適
当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
実施例９ ２２Ｆ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、２２Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、２２Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：２２Ｆ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。２２Ｆ
型について、アルコールを最小約１．２５〜１．７５容
量に添加し、そしてpHを７に調節する。２２Ｆ型では、
好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について
約１．５０容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。２２Ｆ
型について、アルコールを最小約１．２５〜１．７５容
量に添加し、そしてpHを７に調節する。２２Ｆ型では、
好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について
約１．５０容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様に
おいて０．５０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜１．
７５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．
５０容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様に
おいて０．５０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜１．
７５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．
５０容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
かきまぜながら、セタブロンの１０％の溶液を２．０〜
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、２２Ｆ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
５．０容量％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加
する。沈殿が形成するまで、ここで約９０分間、静置
し、この混合物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心
により除去する。６〜８／時の流速および７〜１４℃
の温度を好ましい実施態様において使用するが、これら
の範囲は一般的である。この手順を用いると、２２Ｆ型
肺炎球菌多糖は多少の不純物とともにセタブロンにより
沈殿する。沈殿を４０の約０．２５モルの塩化ナトリ
ウム中に再溶解し、かきまぜながら、ここで約４℃に、
冷却する。濁った懸濁液を濾過または遠心し、冷却し、
ここで約６〜７／時の流速および７〜１２℃の温度を
用いる。多糖はここで溶液中に存在し、一方核酸および
他の不純物を廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順
は、アルコール分別後に残留する核酸およびタンパク質
不純物の大部分を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコールを
添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間
調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に
再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに２
回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロンを
除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコールを
添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間
調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に
再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに２
回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロンを
除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
２２Ｆ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
２２Ｆ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質および核酸の９９％よ
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
り多くを除去すると同時に、生成物の免疫原性を保持し
た。
実施例１０ ３３Ｆ型の肺炎球菌 原料の多糖懸濁液の調製 原料の多糖は、３型について実施例１に記載した方法に
おけるようにして、３３Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
おけるようにして、３３Ｆ型発酵肉汁のリゼイトから調
製する。
多糖の精製：３３Ｆ型 （Ａ）第１分別アルコール沈殿 原料の多糖上澄みに、酢酸ナトリウムを上澄みおよびア
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
ルコールに対して約４％の最終濃度に添加する。pHを約
６．７に、好ましいモードにおいて、±０．１に８モル
の酢酸で調節する。アルコールを０．２５〜０．７５容
量、好ましくは０．５容量で、２〜６℃の温度において
かきまぜながらゆっくり添加する。pHを約７．０に、好
ましいモードにおいて、±０．１に８モルの酢酸で調節
する。沈殿はゆっくり形成し、この混合物を一夜約１６
〜２０時間静置する。肺炎球菌多糖類は不安定化する傾
向があり、それらは低温において最もよく取扱われる。
こうして１６〜２０時間の期間の間、多糖の沈殿を冷時
に、ここでは約４℃に保持すべきである。前述の分別の
方法は、肺炎球菌多糖の精製におけるアルコール沈殿工
程の標準である。上の方法の他の型についての変動は、
アルコールの容量および特定の型に使用する工程の順序
に主として依存するが、それらに限定されない。沈殿し
た汚染物質は、遠心により、約１６〜２０／時の流速
および低温、好ましくは約２〜約６℃の温度において均
一に排除されるであろう。
部分的に精製された多糖を含有する上澄みは、pH約６．
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。３３Ｆ
型について、アルコールを最小約１．２５〜１．７５容
量に添加し、そしてpHを７に調節する。３３Ｆ型では、
好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について
約１．５０容量を超えなくてはならない。
６に上のように調節し、次の工程のアルコールを添加す
るときの最終体積に対して４％の最終濃度に酢酸ナトリ
ウムを添加し、次いでpHを約６．７に調節する。３３Ｆ
型について、アルコールを最小約１．２５〜１．７５容
量に添加し、そしてpHを７に調節する。３３Ｆ型では、
好ましい最終アルコール濃度は合計の多糖沈殿について
約１．５０容量を超えなくてはならない。
次いで、混合物を、第１アルコール分別沈殿におけるよ
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
うに低温において匹敵する時間の間静置し、同様に遠心
するが、これはこの工程において沈殿した多糖である。
多糖の沈殿は、かきなぜながら、十分な量、通常約４０
の水中に溶解し、低温、約４℃は好ましい。濁りが見
えるとき、この溶液を低温、約２〜６℃および約６〜７
／時において、濾過または遠心により清浄化すること
ができる。
（Ｂ）第２分別アルコール沈殿 これは第１アルコール分別沈殿におけるように、上で形
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様に
おいて０．５０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜１．
７５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．
５０容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
成した多糖含有上澄みを、pH約６．６に８モルの酢酸で
調節し、好ましいモードにおいて±０．１に達成する。
酢酸ナトリウムを約４％の最終濃度に添加し、そしてpH
を約６．７に調節し、そして±０．１は上のように好ま
しい。約０．２５〜０．７５容量、好ましい実施態様に
おいて０．５０容量のアルコールを添加し、pH７に調節
し、第１分別アルコール沈殿において前述のように処理
し、かきまぜなたら冷却し、pHを調節し、静置し、そし
て濾過または遠心により清浄化する。このように除去さ
れた沈殿、部分的に精製された多糖上澄み流体をpH約
６．６に、好ましいモードにおいて±０．１に調節す
る。多糖を完全に沈殿させるために、酢酸ナトリウムを
約４％の最終濃度に添加し、そしてpHを第１分別アルコ
ール沈殿において記載したように約６．７に、好ましい
モードにおいて±０．１に調節する。約１．２５〜１．
７５容量のアルコールを好ましい実施態様において１．
５０容量の最終最小濃度に添加し、そしてpHを７に調節
する。次いで、静置し、第１分別アルコール沈殿におけ
るように、沈殿し、遠心し、再び約４０の冷発熱物質
不含水中に、好ましい実施態様において約４℃において
再溶解する。
（Ｃ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（セタ
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
ブロン）分別沈殿 次いで多糖溶液を室温（２１〜２５℃）に加温し、そし
てpHを約７．４±０．１に炭酸ナトリウム溶液で調節す
る。０．４％の炭酸ナトリウムの濃度は、この調節溶液
に便利であることがわかった。
塩化ナトリウムを０．１５モルにかきまぜながら添加
し、セタブロンの１０％の溶液を１．０〜５．０容量
％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混合
物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。６〜８／時の流速および７〜１４℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、３３Ｆ型肺炎球菌多糖
はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖
はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を
廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、アルコール
分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分
を除去する。
し、セタブロンの１０％の溶液を１．０〜５．０容量
％，好ましくは３．０容量％にゆっくり添加する。沈殿
が形成するまで、ここで約９０分間、静置し、この混合
物を約４℃に再冷却し、そして沈殿を遠心により除去す
る。６〜８／時の流速および７〜１４℃の温度を好ま
しい実施態様において使用するが、これらの範囲は一般
的である。この手順を用いると、３３Ｆ型肺炎球菌多糖
はセタブロンにより沈殿しない。沈殿を廃棄する。多糖
はここで溶液中に存在し、一方核酸および他の不純物を
廃棄可能な遠心沈殿物である。この手順は、アルコール
分別後に残留する核酸およびタンパク質不純物の大部分
を除去する。
次いで多糖を再沈殿させ、上澄みをpH約６．６に調節
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコールを
添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間
調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に
再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに２
回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロンを
除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
し、そして酢酸ナトリウムを約４％に添加する。次いで
pHを約６．７に上昇させ、約１．５容量のアルコールを
添加し、そしてpHを７に約４℃において１６〜２０時間
調節し、多糖を再び遠心し、多糖を発熱物質不含水中に
再溶解し、約４０は適当である。この手順をさらに２
回反復して多糖をさらに精製し、痕跡量のセタブロンを
除去し、最後の沈殿を約２０の水中に再溶解する。
（Ｄ）活性炭の精製 次いで、多糖溶液を、まだ冷たい間、pHを約６．１に調
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
節し、そして塩化ナトリウムを０．１５モルの濃度にす
る。活性炭の２０％懸濁液をかきまぜながら添加して、
２〜７％、好ましくは５％の活性炭の濃度にする。この
混合物を、約４℃に約３０分間冷却静置する。この混合
物を濾過して活性炭を除去し、さらに１系列のフィルタ
ーパッドまたは膜に通過させることにより清浄化する。
好ましい実施態様において、ＣＰＸ−１０Ｃ（ＡＭＦ−
ＣＵＮＯ）フィルターを使用し、次いで１．２、０．６
５、０．４５および０．２２ｕミリポア膜を使用する。
この手順の間、２６０ｍｕにおける光学濃度を核酸濃度
についての対照標準として使用することができ、そして
Ｌｏｗｒｙ，ｅｔ ａｌ．の方法を使用してタンパク質
含量を監視することができる。
得られた濾液を、室温、ほぼ２１〜２５℃に加温した
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
３３Ｆ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
後、透析濾過する。ここで、１０，０００の分子量のカ
ットオフの中空繊維のカートリッジを含有するＤＣ３０
型アミコン装置を使用し、すべての残留する塩化ナトリ
ウムを除去した。次いで、透析濾過液を急速凍結し、そ
して凍結乾燥して精製された肺炎球菌多糖粉末、ここで
３３Ｆ型、が残る。この粉末を低い温度においてびん中
に収穫し、次いでこれを密封し、冷時に貯蔵する。−２
０℃以下が適当であることがわかった。
上の方法は汚染物質のタンパク質の９７％より多くおよ
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
び汚染物質の核酸の９９％より多くを除去すると同時
に、生成物の免疫原性を保持した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジエイムズ・デイ・イングリツシユ アメリカ合衆国ニユージヤージイ州07649 オラデル・エルムストリート 333 (72)発明者 ウエンリイ・リン アメリカ合衆国ニユーヨーク州10956ニユ ーシテイ・ホールアベニユー 89 (56)参考文献 特開 昭56−29524（ＪＰ，Ａ) 特開 昭54−95724（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開72513（ＥＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｎｆｅｔ．Ｄｉｓ．，148（６) （1983）第1136−1159頁
Claims (10)
- 【請求項１】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の３型肺炎球菌多糖は清澄化さ
れた発酵リゼイト（fermentation lysate）から精製さ
れ、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を、０．１５〜０．５容量のアルコールで沈殿させ、 （ｂ）このような沈殿を再溶解させ、 （ｃ）工程（ａ）を約０．２５〜０．６容量のアルコー
ルで反復し、 （ｄ）工程（ｂ）を反復し、 （ｅ）工程（ａ）を約０．１〜０．５容量のアルコール
で反復し、 （ｆ）工程（ｂ）を反復し、 （ｇ）工程（ｆ）の多糖からの不純物を、２１〜２５℃
の温度およびpH７．４±０．１、および１０％の臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウム溶液に基づいて０．
１〜０．５容量％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウム濃度において、臭化ヘキサデシルトリメチルアン
モニウムで分別沈殿させ、 （ｈ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約０．５０容量のアルコールで再沈殿させ、そ
して発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて３〜７％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項２】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の５型肺炎球菌多糖は清澄化さ
れた発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を０．２５〜０．８容量のアルコールで分別沈殿させ、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）５型の多糖を約０．９〜約１．４容量のアルコー
ルでpH約６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．２５〜０．８０容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を約０．９〜１．４容量のアルコール
で反復し、次いで工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の
温度およびpH７．４±０．１、および１０％の臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム溶液に基づいて１．０
〜５．０容量％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウム濃度において、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を取り出し、そして前記多糖を約
０．２５Ｍの塩化ナトリウム中に冷却しながら再溶解
し、 （ｈ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１容量のアルコールで再沈殿させ、そして発
熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて２〜７％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項３】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の９Ｖ型肺炎球菌多糖は清澄化
された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を、０．２５〜０．８容量のアルコールで分別沈殿さ
せ、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）９Ｖ型の多糖を約１．２５〜約２．２５容量のア
ルコールでpH約６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．１５〜０．３５容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を反復しかつ工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の多糖から不純物を、２１〜２５℃の
温度および０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよびpH７．４
±０．１、および１０％の臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウム溶液に基づいて０．０５〜１．０容量％の
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム濃度におい
て、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムで分別沈
殿させ、 （ｇ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１．７５容量のアルコールで再沈殿させ、そ
して発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｈ）工程（ｇ）を２回反復し、 （ｉ）工程（ｈ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５モルの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭
懸濁液に基づいて２〜６％の濃度に懸濁した活性炭を添
加することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を
約３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｊ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｋ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項４】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の１０Ａ型肺炎球菌多糖は清澄
化された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を０．２５〜０．８容量のアルコールで分別沈殿させ、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１０Ａ型の多糖を約１．０〜約１．５容量のアル
コールでpH約６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．２５〜０．８容量のアルコー
ルで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を約１．０〜２．０のアルコールで反
復しかつ工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）を反復し、 （ｇ）工程（ｆ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて４〜８％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｈ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｉ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項５】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよび
２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デン
マーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにおい
て、効果的に免疫原性の１１Ａ型肺炎球菌多糖は清澄化
された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度にある前記リゼイトを
０．７５〜１．２５容量のアルコールで分別沈殿させ、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１１Ａ型の多糖を約１．５０〜約２．２５容量の
アルコールでpH約６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．７５〜１．２５容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を１．５０〜約２．２５容量のアルコ
ールで反復し、次いで工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の
温度およびpH７．４±０．１、および１０％の臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム溶液に基づいて１．５
〜５．０容量％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウム濃度において、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約０．２
５Ｍの塩化ナトリウム中に冷却しながら再溶解し、 （ｈ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約２．０容量のアルコールで再沈殿させ、そし
て発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて２〜５％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項６】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の１５Ｂ型肺炎球菌多糖は清澄
化された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を０．４〜１．０容量のアルコールで分別沈殿させ、そ
してそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１５Ｂ型多糖を約１．５０〜約２．２５容量のア
ルコールで沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．４〜１．０容量のアルコール
で反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を反復し、次いで工程（ｃ）を反復
し、 （ｆ）工程（ｅ）の溶解した多糖の分画を、２１〜２５
℃の温度およびpH７．４±０．１および１０％の臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウム溶液に基づいて２．
０〜５．０容量％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウム濃度において臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約０．２
５Ｍの塩化ナトリウム中に冷却しながら再溶解し、 （ｈ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１．７５容量のアルコールで再沈殿させ、そ
して発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｋ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項７】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の１７Ｆ型肺炎球菌多糖は清澄
化された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を０．２５〜０．７５容量のアルコールで分別沈殿さ
せ、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１７Ｆ型の多糖を約１．０〜約１．５容量のアル
コールでpH６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．２５〜０．７５容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を１．０〜約１．５容量のアルコール
で反復し、次いで工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の
温度およびpH７．４±０．１、および１０％の臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム溶液に基づいて２．０
〜５．０容量％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウム濃度において、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を取り出し、そして多糖を約０．２
５Ｍの塩化ナトリウム中に冷却しながら再溶解し、 （ｈ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１．２５容量のアルコールで再沈殿させ、そ
して発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて３．０〜６．０％の濃度に懸濁した活性
炭を添加することにより、活性炭で精製し、そしてこの
溶液を約３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去
し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項８】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の１９Ａ型肺炎球菌多糖は清澄
化された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）０．５〜１．０容量のアルコールで分別沈殿さ
せ、前記リゼイトはpHが約６．７であり、約４％の最終
酢酸ナトリウム濃度を有しかつ２〜６℃の温度にあり、
そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）１９Ａ型の多糖を約１．５０〜約２．２５容量の
アルコールでpH６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．７５〜１．２５容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を反復し、そして工程（ｃ）を反復
し、 （ｆ）工程（ｅ）の多糖から不純物を、２１〜２５℃の
温度０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよびpH７．４±０．
１、および１０％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウム溶液に基づいて０．０５〜０．２容量％の臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウム濃度において、臭化
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムで分別沈殿させ、 （ｇ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１．７５容量のアルコールで再沈殿させ、そ
して発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｈ）工程（ｇ）を２回反復し、 （ｉ）工程（ｈ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて５〜９％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｊ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、 （ｋ）濾液に０．０１〜２５％グリシンを加え、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項９】有効量の免疫学的に活性な精製された肺炎
球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を含
んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、４、
５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１
２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９
Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、場合
によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａおよ
び２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型（デ
ンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチンにお
いて、効果的に免疫原性の２２Ｆ型肺炎球菌多糖は清澄
化された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を０．２５〜０．７５容量のアルコールで分別沈殿さ
せ、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）２２Ｆ型の多糖を約１．２５〜約１．７容量のア
ルコールでpH６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．２５〜０．７５容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を１．２５〜約１．７５容量のアルコ
ールで反復し、そして工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の再溶解した沈殿を、２１〜２５℃の
温度およびpH７．４±０．１、および１０％の臭化ヘキ
サデシルトリメチルアンモニウム溶液に基づいて２．０
〜５．０容量％の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウム濃度において、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモ
ニウムで分別沈殿させ、 （ｇ）沈殿した多糖を除去し、そして多糖を約０．２５
Ｍの塩化ナトリウム中に冷却しながら再溶解し、 （ｈ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１．５容量のアルコールで再沈殿させ、そし
て発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｉ）工程（ｈ）を２回反復し、 （ｊ）工程（ｉ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて３〜７％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。 - 【請求項１０】有効量の免疫学的に活性な精製された肺
炎球菌莢膜多糖（“Ｃ”多糖が実質的に存在しない）を
含んでなり、前記肺炎球菌莢膜多糖は、１、２、３、
４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１
Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、
１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆならびに、
場合によって、６Ａおよび２５を含まないかまたは６Ａ
および２５のいずれかもしくは両者から成る肺炎球菌型
（デンマーク表示）のものである多価肺炎球菌ワクチン
において、効果的に免疫原性の３３Ｆ型肺炎球菌多糖は
清澄化された発酵リゼイトから精製され、前記精製は、 （ａ）pHが約６．７であり、約４％の最終酢酸ナトリウ
ム濃度を有しかつ２〜６℃の温度下にある前記リゼイト
を、０．２５〜０．７５容量のアルコールで分別沈殿さ
せ、そしてそのように沈殿した汚染物質を除去し、 （ｂ）３３Ｆ型の多糖を約１．２５〜約１．７５容量の
アルコールでpH６．７において沈殿させ、 （ｃ）このような沈殿を集めかつ再溶解し、 （ｄ）工程（ａ）を約０．２５〜０．７５容量のアルコ
ールで反復し、 （ｅ）工程（ｂ）を反復し、かつ工程（ｃ）を反復し、 （ｆ）工程（ｅ）の多糖から不純物を、２１〜２５℃の
温度、０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよびpH７．４±
０．１、および１０％の臭化ヘキサデシルトリメチルア
ンモニウム溶液に基づいて１．０〜５．０容量％の臭化
ヘキサデシルトリメチルアンモニウム濃度において、臭
化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムで分別沈殿さ
せ、 （ｇ）多糖をpH約６．７において約４％の酢酸ナトリウ
ムおよび約１．５容量のアルコールで再沈殿させ、そし
て発熱物質不含水中に再溶解させ、 （ｈ）工程（ｇ）を２回反復し、 （ｉ）工程（ｈ）の多糖溶液を、pH６．１および０．１
５Ｍの塩化ナトリウム濃度において、２０％の活性炭懸
濁液に基づいて３〜７％の濃度に懸濁した活性炭を添加
することにより、活性炭で精製し、そしてこの溶液を約
３０分間冷却放置し、そして前記活性炭を濾去し、 （ｋ）前記溶液を蒸留水に対して透析濾過し、そして （ｌ）得られた生成物を凍結しかつ凍結乾燥する、 ことからなる方法によって実施することを特徴とする多
価肺炎球菌ワクチン。
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