JPH0643998B2 - 集塊の検知及び／又は定量法 - Google Patents

集塊の検知及び／又は定量法

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JPH0643998B2 JP59244692A JP24469284A JPH0643998B2 JP H0643998 B2 JPH0643998 B2 JP H0643998B2 JP 59244692 A JP59244692 A JP 59244692A JP 24469284 A JP24469284 A JP 24469284A JP H0643998 B2 JPH0643998 B2 JP H0643998B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、結合剤及び対応する受体基質によって生成し
た凝集物の、ブロット・オーバレイ分析（blot overla
y、assays）による検知及び／又は定量法に関する。受体
基質は普通水性試験試料中に含まれ、分析の後の段階に
おいて固定化マトリックスに吸着され及び／又は共有的
に結合せしめられる。固定化マトリックスの例は、ニト
ロセルロース（ＮＣ）フィルム（公知の孔性の硝酸エス
テル化セルロースの薄い層）、ジアゾベンジルオキシメ
チル（ＤＢＭ）−及びジアゾフェニルチオエーテル（Ｄ
ＰＴ）改変のセルロース紙、シアノーゲンブロマイドで
活性化された紙又は酢酸セルロース、及びナイロンに基
づく膜例えばGene Screen及びZetabindである。この後
者は、製造中に多くの３級アミノ基を導入することによ
って改変したナイロンマトリックス（ナイロン６６とし
て言及されるポリヘキサメチレンアジペート）である。
該固定化マトリックスは通常ブロッティング媒体（blot
ting media）として言及される。〔例えば、ジエイ・エ
ム・ゲルシヨニ及びジー・イー・パレード（Ｊ．Ｍ．Ge
rshoni及びＧ．Ｅ．Pallade）、アナリテイカル・バイ
オケミストリイ(Analytical Biochemistry)、１３１、
１〜１５（１９８３）参照〕。
ブロット・オーバレイ分析は一般に２つの異なる技術に
分類できる： Ａ．サンドウィッチ式オーバレイ分析では、Ｂ（下記参
照）による固定化マトリックスに、精製した又は富んだ
特異的結合剤を好ましくは小さいスポットとして付け、
受体基質をこれに結合させてマトリックスに固定化し、
続いてこれを検知する。これは特異的結合剤の特異性の
ために受体基質を複雑な試験試料例えば尿、血漿、血
清、他の体液、細胞を含まない翻訳系、細胞及び組織溶
解物などから分離することに、またこの手法を半定量及
び／又は定性（診断）分析、即ち所謂サンドウィッチ式
ブロット・オーバレイ分析（ＳＢＯＡ）に使用すること
を可能にする。現在まで、比較的複雑な検知法だけが今
日使用されているから、ＳＢＯＡの実際的な価値は無視
されてきた。しかし本発明の具体例によれば、その検知
法は非常に単純化され、ＳＢＯＡの診断に対する興味は
増大する可能性がある。
Ｂ．直接的なブロット・オーバレイ分析においては、
「転移（transfer）」又は「ブロッティング（blottin
g）」として公知の方法により受体基質をブロッティン
グ媒体に直接付ける。これを行なう文献から良く知られ
た他の方法も存在する。例えば１μｌ程度（他の量でも
よい）の公知の又は未知の量の受体基質（精製したもの
又はしないもの）を含有する小滴を、ブロッティング媒
体上に点として適用して、受体基質をブロッティング媒
体に付着させる。そのような点状のブロット（blot）は
種々の体液中の固定化された受体基質に対する特異的結
合剤の存在の診断上の検知に潜在的に用いることができ
る。受体基質が複雑な混合物の一部である場合には、受
体基質の同定を容易にするために、後者を種々のクロマ
トグラフィー法例えば薄層クロマトグラフィー法又は電
気泳動法例えばポリアクリルアミドゲル中での方法、例
えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）電気泳動法、等
電フォーカス法（isoelectric focusing）、２−Ｄゲル
電気泳動法、グラジエント・ゲル及び酸−尿素ゲル電気
泳動法、及び無変性ゲル電気泳動法で分離することがで
きる。核酸に対するようないくつかの場合には、寒天ゲ
ルも使用できる。次いで電気泳動法で分割した成分（例
えば蛋白質、ペプチド及び核酸）をキャピラリー、真空
又は電気的転移（或いはブロッティング）によって固定
化マトリックスに転移させる。続いて元の電気泳動パタ
ーンを殆んど保持させながら、成分をブロッティング媒
体上に固定化させる。この完全なパターンは公知の染色
法例えばアミド・ブラック及びクーマシー（coomassi
e）青を用いて肉眼で見えようにでき、問題としている
成分（受体基質）を検知する（更に見る）ことができ
る。この時その位置は全電気泳動パターンと関係づけら
れる。
今まで使用された特異的結合剤のほとんどは、受体基質
の十分はっきりした領域へ結合する蛋白質であった。糖
蛋白を検知するにはレクチンが使用される。ポリクロー
ナル及びモノクローナル抗体は、その対応する抗原又は
ハプテンを検知するために使用される（例えばビオチン
又はビオチニル化（biotynylated）ＤＮＡは、抗ＤＮＰ
を有するジニトロフエニル化蛋白上において抗ビオチ
ン、ＤＮＰで検査される）。ブロット・オーバレイ分析
は、抗体の特異性を試験するために及びモノクローナル
抗体の選別においてすでに広く使用されている。これら
広く使用されている系のほかに、成分の１つが固定化さ
れている場合多くの他の蛋白−蛋白（例えばカルモジュ
リン（calmodulin）又はアクチン（actin）結合蛋
白）、或いは蛋白−配位体（例えばアビジン（avidin）
−ビオチン）相互作用も分析することができる。これら
はＤＮＡ−蛋白及びＲＮＡ−蛋白相互作用、受体−配位
体相互作用、及び一般にいずれか他の、十分に特異的な
及び親和性の巨大分子−巨大分子相互作用を含む。
ブロット・オーバレイ分析の本質的な部分は、固定化さ
れた受体基質を見えるようにするために使用される方法
である。直接的及び間接的方法が存在する。検知の本質
はマーカー、即ち放射性同位元素（３Ｈ、１４Ｃ、３２
Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）を利用し、続いて自動放射線
写真現像剤；不溶性の着色生成物又は螢光色素を形成す
ることのできる酵素を用いるものである。直接的な方法
においては、マーカーが特異的結合剤に結合する。間接
的な方法では、それは第１の特異的結合剤に対して特異
的に結合することのできる巨大分子に結合する。後者が
抗体である場合、巨大分子は蛋白質Ａ又は２次抗体を有
していてよい。アビジン・ビオチニル化西洋ワサビペル
オキシダーゼの複合体（ＡＢＣ）及び標識されてないペ
ルオキシダーゼの抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）を用い
る方法のような工程の多い技術も抗体に対して使用でき
る。
本発明の本質的な観点は、金属又は金属化合物或いは金
属又は金属化合物でコーティングした核の分散液を、ブ
ロット・オーバレイ法における視覚化及び／又は検知手
段として利用する。本明細書で用いる如き「コロイド状
金属粒子」とは、粒子の分散液、随時金属、金属化合物
或いは金属又は金属化合物でコーティングした核からな
るゾルを包含する。
コロイド状金属粒子は、次の技術的に公知の方法、例え
ばコロイド状の金、銀又は鉄酸化物などの製造法に従っ
て製造することができる。コロイド状金属粒子は、技術
的に公知の方法に従い、特異的に結合する蛋白又は受体
基質に或いは第１の特異的に結合する試剤に対して特異
的に結合する巨大分子例えば蛋白質Ａ、２次抗体（１次
抗体の場合）、又はストレプタビジン（streptavidin）
及びアビジン（成分の１つをビオチニル化する場合）
に、元の結合活性のほとんどを保持したままで直接又は
間接的に付着させることができる。ここにこの付着（at
taching）とは、化学的又は物理的結合、例えば共有結
合、水素橋、極性引力及び吸着による結合として理解さ
れる。
今回、受体基質が間接的に（Ａ参照）又は直接に（Ｂ参
照）付着せしめられたブロッティング媒体を、コロイド
状金属粒子で標識された特異的結合剤の適当な濃度と共
に（直接的検知法）或いは最初に標識されてない特異的
結合剤と、次いで第１の特異的結合剤に特異的に結合す
ることのできるコロイド状金属粒子で標識された巨大分
子と共に（間接的検知法）保温する場合、コロイド状金
属粒子が特異的結合部位に蓄積し、驚くことに用いたコ
ロイド状金属粒子に特徴的な色として見えるようになる
ことが発見された。例えば金のような金属を用いると桃
色ないし暗赤色が、銀を用いると黄色ないし褐／黒色が
得られる。この色は裸眼で定性的に読むことのできる或
いは随時技術的に公知の分光学的方法例えば濃度計を用
いて測定することのできる信号を生成する。
コロイド状金属粒子の粒径は、好ましくは３〜１００ｎ
ｍ、更に好ましくは５〜５０ｎｍである。
特異的結合剤に付着せしめうるコロイド状金属粒子の例
としては、金属、白金、金、銀及び銅、及び金属化合
物、ヨウ化銀、臭化銀、水和酸化銅、酸化鉄、水酸化鉄
又は水和酸化鉄、水酸化アルミニウム又は水和酸化アル
ミニウム、水酸化クロム又は水和酸化クロム、酸化バナ
ジウム、硫化砒素、水酸化マンガン、硫化鉛、硫化水
銀、硫酸バリウム、及び二酸化チタンが記述されてい
る。上述の金属又は金属化合物で被覆された核からなる
コロイドが使用できることも公知である。これらの粒子
は金属又は金属化合物コロイドとして類似の性質を有す
るが、寸法、密度及び金属含量は随時組合せることがで
きる。一般に、特異的結合剤にその結合活性を破壊する
ことなしに結合することができ且つ裸眼で見るのに十分
なブロット・オーバレイ分析での色強度を与えるすべて
のコロイド状金属又は金属化合物は使用しうる。好まし
くはこれらの感度は金または銀で得られるものに等しい
か、それよりも優れているものがよい。
今や特異的結合剤例えば抗体、レクチン、蛋白Ａ、アビ
ジン、及びその他、或いは更に受体蛋白例えば抗原で表
面が被覆されるコロイド状金属粒子、特に金ゾルのそれ
を用いることは、透過型及び掃引型電子顕微鏡による多
くの細胞化学的着色技術において良く確立されている。
金属で被覆された重合体からなるコロイド状金属粒子を
用いる例は、抗体に付着した時に透過型電子顕微鏡に対
して非常に有用なマーカーを与える鉄で被覆されたデキ
ストランである。しかしながらこれらの使用は、このマ
ーカーの典型的な電子不透明性（透過型電子顕微鏡）或
いは２次電子又は後方散乱１次電子を放射するその能力
（掃査型電子顕微鏡）を利用する。
コロイド状金属粒子、特に金及び銀からなるものは、試
料を見るために光学顕微鏡を用いる場合に、そのような
コロイド状金属粒子の、組織スライドにおける結合部位
又は細胞表面における蓄積が見られるということが示さ
れて以来、光学顕微鏡による細胞化学的着色技術に対す
るマーカーとしても使用されてきた。
コロイド状金属粒子は、免疫学的成分、例えば水性媒体
中ハプテン、抗原及び抗体のある試験管内での定量及び
定性試験にも使用される。これらの技術は、ゾル粒子免
疫分析及び受動的金接合法（passive gold agglutinati
on）（Geoghegan）と呼ばれている。
受動的金接合技術は、金で標識された抗原（金粒子１８
〜２０nmの、標識されてない抗体への接合に基づき、そ
して接合してない金が赤色の流れをなして壁面を流下す
るという標準的なミクロン力価セットを用いることを含
む。この技術は、古典的な受動的接合に同様であり、同
じく敏感であり、金で標識された抗体である逆接合（re
verse agglutinamtion）に対して能力を有すると言われ
た。
ゾル粒子免疫分析は２つの範ちゅうに分類される。この
第１は均一ゾル粒子分析と呼ばれ、抗体で標識されたコ
ロイド状粒子の、免疫化学的２価又は多価抗原による或
いは担体蛋白に結合したハプテンによる接合に基づく。
この接合は空試験として緩衝剤を用いる比色法によって
測定される如く色を減少させる。コロイド状金属粒子の
接合は試料からの遊離のハプテン分子によって禁止され
てよい。そのような方法はヨーロッパ特許第０００７６
５４号に記述されている。
第２の種類のゾル粒子免疫分析は、放射線免疫分析及び
酵素免疫分析に類似の結合した／遊離のコロイド状金属
粒子共役体分離法に基づく。そのような方法はヨーロッ
パ特許第０００７６５４号に記述されている。１つのそ
のような方法は、サンドウィッチ式ゾル粒子免疫分析
（Sandwich Sol Particle Immunoassay（ＳＳＰＬＡ）
と呼ばれ、サンドウィッチ式ＥＬＩＳＡ又は固相サンド
ウィッチ式放射線免疫分析に同様である。ＳＳＰＬＡに
おいて、典型的には決定すべき抗原に対する抗体をミク
ロ滴定板（例えばポリスチレン製）の表面上に吸着させ
る。適当な緩衝系に溶解した試料（抗原標準物又は空試
料）を抗体で被覆された井戸にピペットで入れ、適当に
保温する。金で標識された抗体を添加し、反応混合物を
更に保温する。井戸を吸引し、洗浄して結合してない共
役体を除去する。最後に、結合した免疫錯体を、均一に
したコロイド状金属粒子と一緒に離脱させる。得られる
分散液の色の強度を視覚的に検査し或いは金属濃度を比
色計によって測定する。視覚による検査法（例えば分散
された金の色）はより高い抗原濃度においてだけ使用す
ることができる。
ゾル粒子分析は、非免疫学的分析に対して、一般に「反
応成分の相互に対する公知の結合親和性を適用すること
により、水性試験試料中の特異的結合蛋白及び対応する
結合しうる基質間の反応の１つ又はそれ以上の成分を検
知及び／又は定量する、すなわち該反応の所望の成分
を、粒子径が少なくとも５ｎｍの金属、金属化合物或い
は金属又は金属化合物で被覆された重合体核の水性分散
液の粒子に直接又は間接的に結合させることによって得
られる１つ又はそれ以上の標識された成分を用い、これ
によって反応中に又は適当な反応時間後、随時結合した
及び遊離の標識された成分の分離後に、技術的に公知の
方法に従って金属及び／又は生成した金属含有の集塊の
物理的性質及び／又は性質を試験試料又は誘導された画
分の１つにおいて決定し、検知及び／又は定量すべき成
分を定性及び／又は定量する」分析に対して有用である
と記述されていることも特記すべきである。
本発明は、ブロット・オーバレイ分析法におけるマーカ
ーとしてコロイド状金属粒子を用いることに関する。こ
の使用は全く新規であり、驚くことに使用可能であるこ
とがわかった。
コロイド状金属粒子とは、金属、金属化合物、或いは金
属又は金属化合物で被覆された核の分散液を含む。
コロイド状金属粒子の、マーカーとしての使用は、ブロ
ット・オーバレイ分析のすべての形態に当てはまり、ブ
ロッティング媒体の表面において結合部位に蓄積するコ
ロイド金属粒子が、少くとも現存する技術の非常に高感
度のもの、例えば酵素に基づくブロット・オーバレイ分
析と対比しうる感度を有して裸眼で直接見えるようにな
るという利点をもたらす。本発明は、上述の点が含まれ
ないならば実際上の価値がないということが強調され
る。分析値が２次的酵素反応の必要なしに、螢光染料に
対する自動放射線計法又は視覚系で、或いはサンドウィ
ッチ式ゾル粒子免疫分析における如く結合したコロイド
状金属粒子の離脱、続く裸眼（低感度）、比色計又はＣ
ＲＡＡＳ（高感度）での測定で読みとることができると
いうことは重要な利点である。また本発明の最大の利点
は、反応中に色が発現するから簡単であるということで
ある。これは所望の信号が生じた時に反応を停止する。
或いは予じめ決められた結果を固定された時間限界内で
得るために系を補正することを可能にする。
金で標識された抗体の使用は、非常に感度のよいと言わ
れる免疫ペルオキシダーゼ法よりも非常に簡単であり、
それと同程度の感度を与える。本発明のこの簡単な分析
法は、ブロッティング媒体に結合した受体基質に対する
特異的結合剤、及び第１の特異的結合剤に対するコロイ
ド状金属粒子で標識された特異的結合剤の存在を間接的
に検知するための試験キットに使用できる。特異的結合
剤が抗体である場合、これはコロイド状金属粒子で標識
された２次抗体又は蛋白Ａであってよい。これは非常に
簡単な浸漬棒（dip stick）試験として、例えば血清の
ような水性試験試料中の選んだ抗原に対する抗体の存在
を迅速に選別するためのスポット・ブロット・オーバレ
イ免疫分析として使用できた。
本方法は、 ｉ．受体基質の、ブロッティング媒体として公知の固定
化マトリックスへの次の方法のいずれかによる固定化、 i.i.随時電気泳動分離法を適用し且つ電気泳動媒体から
ブロッティング媒体への転移又はブロッティング法を適
用し、そして続いてＢＳＡ、ゼラチン、ＰＥＧ又はTwee
n２０の使用のような技術的に公知の方法に従い、残存
する蛋白結合部位を消去させた後、一般にブロッティン
グを呼ばれる直接的な結合及び／又は共有結合をさせる
こと、或いは i.ii.ブロッティング媒体を受体基質を含む水溶液と接
触させることによりブロッティング媒体に固定化される
ようになった特異的結合剤によって受体基質を結合せし
めること。
ii.i)のブロッティング媒体を、洗浄及び空気乾燥後に
ある期間次のいずれかと接触させること、 i.i.適当な濃度のコロイド状金属粒子で標識された特異
的結合剤、或いは ii.ii.先ず適当な濃度の標識されてない特異的結合剤、
次いで標識されてない特異的結合剤に特異的なコロイド
状金属で標識された蛋白。
iii.ブロッティング表面において結合したコロイド状金
属粒子によって生ずる着色信号及び特性を裸眼で或いは
濃度計のような技術的に公知の分光学的技術を用いて読
むこと、 の連続的工程を含んでなる。
また本発明は、反応の成分又はこの反応を間接的に検知
するために使用できる成分を、上述の如きコロイド状金
属粒子に結合させることによって得られたコロイド状金
属粒子で標識された成分及び他の試剤を含有するブロッ
ト・オーバレイ分析において、特異的結合剤及び対応す
る受体基質間の反応の１つで直接的に又は間接的に決定
するのに用いるための試験キットに関する。反応が免疫
学的反応の場合には、サンドウィッチ式ブロット・オー
バレイ分析（参照、実施例III）に対して、また選んだ
抗原に対する血清中の抗体の存在の決定（参照、実施例
Ｉ）に対して試験キットが使用できる。
本発明の随意の特徴は、ブロット・オーバレイ分析の特
徴として、ブロッティング媒体の表面に結合したコロイ
ド状金属粒子の検知が、対応する金属に還元できる物理
的現像剤を適用することによって間接的に見る及び／又
は高めることができるという事実を利用する。適当な物
理的現像剤は例えば乳酸銀、硝酸銀などである。例えば
銀を物理的現像剤として用いる場合、反応は最初に還元
を接触する金属粒子の表面で起こり、続いてこれを種に
して自動触媒となる。この結果金属銀の蓄積によって黒
い、非常にコントラストのきいた信号が生成する。これ
は感度のかなりの増加をもたらす。光に鈍感な銀沈殿物
を得るためには、顕微鏡写真のプリントに対して使用さ
れる安定化液でブロットを定着しなければならないとい
うことも発見された。
物理的現像剤は、組織中の水に不溶な金属、特に硫化金
属を見るために多年に亘って使用されてきた〔ダンシヤ
ー(Danscher)、ヒストケミストリイ(Histochemistry)７
１、１〜１６、１９８１参照〕。硫化金属及び金属銀は
金属イオンの還元に触媒効果を示す。組織中のコロイド
状金金属も物理的現像剤で現像でき、またこれは元来の
免疫金着色法よりも非常に優れた感度をもたらす免疫金
／銀着色法の導入に対する ホルゲートら(Holgate et al.)〔ジャーナル・オブ・ヒ
ストケミカル・シトケミストリイ（J.Histochem.Cytoch
em.）３１、９３８〜９４４（１９８３）参照〕によつ
て開発されたものである。
本発明の随意の特徴の主たる利点は、ブロット・オーバ
レイ分析に対して存在するいずれか他の検知法よりも優
れた多大の感度を示すということにある。これは、使用
者が用いる試薬量を経済的にしたい時或いは受体基質及
び／又は特異的結合剤が非常に低量でしか存在しない場
合に使用することができる。
本発明の更なる随意の特徴は、バックグランドを減じ及
び物理的現像剤の反応生成物の安定性を改良する写真の
定着剤を使用することである。
次の実施例は本発明を例示するが、その範囲を限定する
ものではない。
実施例 実施例Ｉ 犬の脳のツブリン（tubulin）及びカルモジュン（calmo
dulin）に対する抗体を、免疫にしたウサギの血清中の
金で標識された２次抗体で間接的に示すための簡単なス
ポット・ブロット・オーバレイ免疫分析。
I.1.抗血清の製造 1.1.抗血清の増殖 緩衝剤（０．１Ｍ Pipes，pH６．９） １．０ml中の犬の脳のツブリン（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲルから抽出）１mg或いは電気泳動的に純粋な犬
の脳のカルモジュリン１mg（Ｈ２Ｏ中）を、完全なフロ
インド佐剤（ＤＩＦＣＯ）１．０mlと混合した。均一に
した後、白ウサギの背骨に沿って５ケ所に抗原を皮下注
射した。４週間毎にブースター注射をした。不完全なフ
ロインド佐剤を用いる以外同一の方法で抗原を調製し
た。各ブースターから１週間後に、ウサギから採血し
（±６０mlの血液を採取）、血清を準備し、使用まで−
２０℃下に一部ずつ貯蔵した。
1.2.コロイド状金属で標識された２次抗体 これはジヤンセン・ライフ・サイエンス・プロダクツ
（Janssen Life Science Products）〔２３４０ ベン
ゼ，ベルギー（２３４０Beerse，Belgium）〕から購入
した。
コード番号：＝ＧＡＲ Ｇ２０。これは２０nmのコロイ
ド状金粒子で標識されたウサギのＩｇＧに対する親和性
精製したヤギの抗体である。
抗原を含むスポットを有するニトロセルロース紙ストリ
ップの調製 ０．１Ｍ Pipes，１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ２（pH６．７５）中の純粋なツブリン或いはＨ２Ｏ中
の純粋なカルモジュリンの４倍の血清希釈物（初め２５
０ng／μｌ）の１０個の１μｌ小滴を、乾いたニトロセ
ルロース・ストリップ（６cm×０．６cm）上に１列にス
ポットした。このスポットが乾燥した時（約５分間）、
ストリップ上の残存する蛋白結合部位を、２０ｍＭ Tr
is緩衝食塩水（pH８．２）中の５％の牛の血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）の溶液と共に３０℃で３０分間保温するこ
とによって消去した。
1.3.ツブリン及びカルモジュリン抗体の検知のための試
験法。金で標識された抗体を用いることの、ＡＢＣ−ペ
ルオキシダーゼ検知法との比較 工程で用いる緩衝剤は断らない限り０．１％ＢＳＡ、Tr
is（２０ｍＭ Tris-ＨＣｌ，０．９％ＮａＣｌ pH
８．２，２０ｍＭ ＮａＮ３中０．１％ＢＳＡ）であっ
た。
ａ．１次抗血清を用いる培養 −２つのストリップを、栓つきの５mlのプラスチック管
内において、０．１％ＢＳＡ−Tris中で１：１０００に
希釈したウサギの抗ツブリン血清１mlと共に室温で２時
間保温した。
−２つのストリップを、抗原の特異性に対する対照とし
て役立つSepharose−４Ｂに共有結合させたツブリンに
吸着された同一の抗血清と共に、上述の如く保温した。
−２つのストリップを、０．１％ＢＳＡ−Tris中で１：
１０００で希釈したウサギの抗カルモジュリン血清１ml
と共に、室温で２時間保温した。
−２つのストリップを、セファロース−４Ｂ（Sepharos
e−４Ｂ）に共有結合させたカルモジュリンに吸着され
た同一のものと共に上述の如く保温した。吸着された及
び吸着されてない１次抗血清との保温後、ストリップを
０．１％ＢＳＡ−Tris中で３×１０分間洗浄した。各対
の１つのストリップを、ＧＡＲ Ｇ２０（参照1.3.ｂ）
を用いて更に保温した。他のものを、ベクター・ラボラ
トリーズ（Vector Laboratories）から購入し且つ製造
業者の指示に従って使用される非常に敏感なベクタスタ
イン（Vectastain）ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ・キッ
トと共に保温した（参照、1.3.ｃ）。
ｂ．金で標識された２次抗体：ＧＡＲ Ｇ２０を用いる
培養 Ｏ．Ｄ▲．1cm 520nm▼＝０．１％ＳＡ−Tris＋０．４％
ゼラチン中０．２に希釈したＧＡＲ Ｇ２０を用い、洗
浄したストリップ（参照1.3.ａ）を２時間保温した。こ
の保温後、ストリップを０．１％ＢＳＡ−Trisで２×１
０分間洗浄し、空気乾燥した。
ｃ．ベクタスタイン（Vectastain）キットを用いる培養 洗浄したストリップ（参照、1.3.ａ）を、２次ビオチニ
ル化抗体溶液（０．１％ＢＳＡ−Tris中１：２００）と
共に１時間保温した。このストリップを過剰量の０．１
％ＢＳＡ−Tris中において３×１０分間洗浄し、次いで
アジビン−ピオチニル・ペルオキシダーゼ複合体中で１
時間保温した。この複合体は、製造業者の指示に従って
準備した：試薬Ａ（アビジンＨ）１００μｌＰＢＳ〔プ
ルベコ（Pulbecco）液、Mg2+及びCa2+なし〕１０mlに添
加した。試薬Ｂ（ビオチニル化西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼ）１００μｌを連続的に撹拌しながら添加した。
５分後に複合体を用いた。ストリップを０．１％ＢＳＡ
−Tris（２×１０分間）中で、続いてTris-Ｈ Ｃｌ緩
衝液（pH７．６）中で洗浄した。次いで固定化したペル
オキシダーゼを、基質としての４−クロル−１−ナフト
ールで見えるようにした：４−クロル−１−ナフトール
２０mgを、エタノール１mlに溶解し、更に１００ｍＭ
Tris-ＨＣｌ緩衝液（pH７．６）２０mlで希釈し、約５
０℃まで暖めた。１％Ｈ２Ｏ２２００μｌを添加し、基
質溶液を注射器に取りつけたミクロフィルター（０．２
μ、ミリポア）を通してストリップにつけた。反応を５
分間進行させ、次いでストリップをＨ２Ｏで洗浄するこ
とによって反応を停止させ、空気乾燥した。
1.4.評 価 ＡＢＣ法において、正（positivity）は青色として検知
される。コロイド状金を用いる場合、用いる金の寸法に
対して正は桃赤色である（大きい、例えば４０nmの金の
粒子は紫色がかった色を示す）。両方法に対する感度は
全く対比でき、用いる条件下にツブリンに対して５ng／
μｌ及びカルモジュリンに対して３０ng／μｌの程度で
ある。特異性は、抗血清をそのそれぞれの抗原と共に吸
着させた時、負の反応によって示される。
実施例II 金で標識したヤギの抗体をマウスのIgＧに対して用いる
ことによる、生育ヒブリドマ（hybridomas）の培養上澄
液中の微小管と関連した蛋白に対するマウスのモノクロ
ーナル抗体の存在の選別。
2.1.マウスの免疫化 ラットの脳の微小管蛋白（１００μｇ／マウス）（温度
依存性の重合−解重合のサイクル２回で調製）及び完全
なフロインド佐薬の均一な混合物（参照、実施例1.1.）
をマウス（Balb／Ｃ）に注射した。この注射は背中に５
点、皮下的に行なった。不完全なフロインド佐薬を用い
て調製した抗原（１００μｇ）のブースター注射を隔週
に３回行なった脾臓細胞の骨髄腫細胞腺との融合（fusi
on）の３日前に、マウスにＰＢＳ−緩衝液１００μｌ中
５０μｌ抗原／マウスを静脈内ブースター注射した。
2.2.脾蔵細胞の、ＮＳ−１骨髄腫細胞との融合 技術的に公知の方法に従ってＮＳ−１細胞を２匹の免疫
にしたマウスの脾臓細胞と融合させ、得られたヒブリド
マ（hybridomas）を、７％のＣＯ２を含む水蒸気飽和雰
囲気中、３７℃下に、５つの９６井戸のプレート（Nun
c）中で培養した。約２週間の生長後、生長するヒブリ
ドマを含む井戸の培養上澄液１００μｌをとり、分泌さ
れたモノクローナル抗体の存在に対して試験した（参
照、2.4.）。
2.3.ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルからある種類の蛋
白を電気的にブロッティングしたニトロセルロース紙ス
トリップの調製 抗原（２回重合させた微小管蛋白）のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルの電気泳動を、Laemmliに従い、７．５
％ゲルについて行なった。試料緩衝液に溶解し且つ沸と
うさせた抗原を、連続層として積層のゲルの上に３００
μｇ／ゲルの量でつけた。染料の先端が分離するゲル中
に３cm移動した時、電気泳動を止めた。ゲルの小さい垂
直のストリップをクーマシー（coomassie）青での染色
のために切り取り、残りをニトロセルロース紙上に電気
的にブロッティングするために使用した。ゲルを転移緩
衝液（２５ｍＭ Tris-１９２ｍＭグリシン／２０％
（容量／容量）メタノール、pH８．３）中において室温
で３０分間平衡させた。このゲルをニトロセルロースの
シート（予じめ緩衝液中に浸漬）上に置き、いずれか捕
捉される空気泡を避け或いは除去するように注意した。
これを２つの予じめ浸漬した紙及び２つのナイロン・
スクリーンクッション間にサンドウィッチにした。この
結果ＥＣ−電気ブロッティング装置の密閉される電極グ
リッドにぴったりはまった。次いで室温４００ｍＡにお
いて電極ブロッティングを夜通し行なった。電気泳動転
移後、ニトロセルロース紙シート上に残る蛋白結合部位
を、２０ｍＭ Trisで緩衝された食塩水中５％ＢＳＡ
（pH８．２）に３７℃で３０分間浸することにより消滅
させた。続いてニトロセルロースシートを、電気泳動の
方向に対して平行に巾３mmのストリップに切断した。こ
れらのストリップを用いてヒブリドマ細胞の上澄液を選
別した。
2.4.モノクローナル抗体の検知 各ヒブリドマ培養上澄液１００μｌを、長３．５cmの
０．５mlのエッペンドルフ（Eppendorf）チップに移
し、０．１％ＢＳＡ−Trisの０．４mlで１：５に希釈し
た。このチップ及びストリップをコートnr.とした。各
チップには１つのストリップを与え、これらを２時間保
温した。各ストップを過剰量の０．１％ＢＳＡ−Tris中
においてバッチ式で洗浄し、またジヤンセン・ライフ・
サイエンス・プロダクツ(Janssen Life Science Produc
ts)〔２３４０ベンゼ，ベルギー（２３４０Beerse，Bel
gium）〕から購入したＧＡＭ Ｇ２０（２０nmのコロイ
ド状金粒子で標識されたヤギの抗マウスＩIgＧ）と共に
バッチ式で培養した。ＧＡＭ Ｇ２０を０．１％ＢＳＡ
−Tris＋０．４％ゼラチンで０．Ｄ▲．1cm 520nm▼＝
０．１まで希釈し、夜通し反応させた。次いでストリッ
プを０．１％ＢＳＡ−Tris及びＨ２Ｏで洗浄し、空気乾
燥した。
与えられた分子物質を含む蛋白バンドに相当して、正は
桃色ないし赤色がかったバンドとしてはっきり見ること
ができた（参照、他の実施例）。この非常に簡単な選別
法は、抗体を分泌するヒブリドマを同定するばかりでな
く、開連する抗体の特異性に関する直接的な情報を与
え、それ故に興味ある抗体分泌のヒブリドマの選別の多
大な助けとなる。
実施例III 水性試験試料における抗原の検知のためのサンドウィッ
チ式免疫ブロット・オーバレイ分析：水性試験試料中の
IgＧの検知。
3.1.分 析 法 決定すべき抗原に対してモノ特異的な精製された又は富
んだ抗体の小滴（±１μｌ）を、ニトロセルロース紙
（又はいずれか簡便なブロッティング媒体）のストリッ
プ上にブロッティングし、乾燥し、遊離の蛋白結合部位
を消滅させた（参照、実施例1.3.）。随時これらの抗体
を含む消滅させたストリップを水中で洗浄し、空気乾燥
し、貯蔵した。次いでこのストリップを一定の期間に亘
り、抗原を含む試験溶液のある容量と共に保温した。結
合してない基質を洗い落した後、更にブロッティング媒
体上へ吸着されたものと同様に、ストリップを適当に希
釈されたコロイド状金属粒子（例えば金又は銀のゾル）
で標識された抗体と共に保温した。随時、それぞれが異
なる抗原エピトープ（epitope）を認識する２つのモノ
クローナル抗体を使用することができた。この時１つを
ブロッティング媒体に付着させ、他をコロイド状金属粒
子に付着させた。一定の条件下に、予じめ決められた最
小濃度の抗原を検知でき、また与えられた試験溶液中に
最小の必要な濃度を検出しうる場合には定性的な診断試
験として使用することができた。
3.2.分析例：公知の濃度のウサギのIgＧを含む緩衝され
た溶液におけるウサギのIgＧの検知 本発明の新規なサンドウィッチ式分析法の実用性を試験
するために次の実験を行なった： −６×０．６cmのニトロセルロース紙の６つのストリッ
プに、実施例1.2.に記述したようにウサギのIgＧ（ＧＡ
Ｒ IgＧ）に対する親和性精製したヤギの抗体を漸減量
（１２５ng／μｌから始めて１／２希釈の一連の希釈
物）で含有する小滴（１μｌ）を付けた。
−残存する蛋白結合部位を実施例1.2.に記述したように
消滅させた。１つのストリップ（第６番）を２０ｍＭ
Tris-緩衝の食塩水中で洗浄し、紙上に乾式ブロッテ
ィング処理し、空気乾燥し、室温で乾燥下に夜通し貯蔵
した後使用した。
−残りの５つのストリップを、次のように室温下に３０
分間、栓つきのプラスチック管中で保温した： 第１番：ＲIgＧ、１ml、１μｇ／ml 第２番：ＲIgＧ、１ml、０．２５μｇ／ml 第３番：ＲIgＧ、１ml、０．０６３μｇ／ml 第４番：ＲIgＧ、１ml、０．０１５μｇ／ml 第５番：ＲIgＧ、１ml、０μｇ／ml ウサギのIgＧを０．１％ＢＳＡ−Tris中で希釈した。第
６番のストリップをＲIgＧ ０．２５μｇ／mlと共に保
温した。
−ストリップを０．１％ＢＳＡ−Tris中で２×１０分間
洗浄した。
−すべてのストリップを、ジヤンセン・ライフ・サイエ
ンセス・プロダクツ(Janssen Life Sciences Products)
〔Ｂ−２３４０ベンゼル，ベルギー（Ｂ−２３４０Beer
se,Belgium〕から購入したガル（ＧＡＲ）Ｇ２０（直径
２０nmのコロイド状金粒子で標識されたウサギのIgＧに
対するヤギの抗体）中で室温下に正確に１時間培養し
た。ＧＡＲ Ｇ２０を０．１％ＢＳＡ−Tris＋０．４％
ゼラチンでＯ．Ｄ▲．1cm 520nm▼＝０．２まで希釈し
た。
−ストリップを０．１％ＢＳＡ−Trisで、次いで水で洗
浄し、空気乾燥した。
3.3. 評 価 １５ng程度の少量のＧＡＲ IgＧを吸着させたスポット
は、ＲIgＧ １５ng／mlを含有する溶液１ml中で３０分
間だけ培養し、続いてＧＡＲＧ２０（０．０５２０nm＝
０．２）１mlと共に１時間培養した後桃色の点として見
えるようになった。少くともこの量のＲIgＧを含有する
溶液は正と判定されるであろう。第６番のストリップの
結果は、第２番のストリップのそれと同一であり、スト
リップは消滅工程に乾燥しても抗体活性を保持しうると
いうことを示す。
実施例IV コロイド状銀で標識された１次抗体を有するＮＣ紙に付
着させた抗原の直接的検知：コロイド状銀で標識した、
マウスのIgＧに対するヤギの抗体を用いるマウスのIgＧ
のスポットの検知。
−ＮＣ紙のストリップ（６cm×０．６cm）に、実施例1.
2.に記述した如く、２５０〜０．４ng／μｌの一連の２
倍希釈のマウスIgＧのスポット（１μｌ）をつけた。
−残存する蛋白結合部位を実施例1.2.における如く消滅
させた。
−ストリップを、０．１％ＢＳＡ−Trisで１：１００に
希釈したマウスのIgＧ（Ｅ．Ｙ．Laboratoriesから購
入、ＳＰ−００１１）に対するコロイド状銀で標識した
ヤギの抗体と共に培養した。
−ストリップを０．１％ＢＳＡ−TrisＨ２Ｏで２×１０
分間洗浄し、空気乾燥した。
−正のスポットは黄色であった。これらの条件下に１μ
ｌ＝±３０ngのスポットが検知できた。
実施例Ｖ ブロット・オーバレイ免疫分析及び金で標識された２次
抗体、続く銀増感を用いることによる、ヒヨコの未成熟
の肺の上皮細胞の２次培養における全細胞溶解物中に産
するアクチンのための、親和性精製したウサギの抗体の
ヒヨコの砂袋アクチンに対する特異性の試験。
5.1.抗アクチン抗血清の調製 電気泳動的に純粋なヒヨコの砂袋アクチンを均一にし、
実施例1.1においてツブリン及びカルモジュリンに対し
て記述したようにウサギに注射した。次いで血清を実施
例1.1.に記述したように調製し、貯蔵した。
5.2.アクチンに対する抗体の親和性精製 製造業者の指示に従ってアクチンをセフアロース(Sepha
rose)−４Ｂ−ＣＮＢｒ〔フアルマシア(Pharmacia）〕
に結合させた。抗体を血清から直接精製した。後者を抗
原を含むゲルと一緒に培養した。１０mgの結合した抗原
に対して血清２０mlを用いた。培養２時間後に、ゲルを
カラム中に注ぎ、２８０nmにおけるＯ．Ｄ．が殆んど０
になるまで１０ｍＭ Trisで緩衝させた食塩水（ＴＢ
Ｓ）で洗浄した。非特異的吸着物質を、１Ｍ ＮａＣｌ
を含むＴＢＳで流出させ、次いでＴＢＳで洗浄した。特
異的抗体をpH２．８の０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液
で流出させた。１mlずつの画分を、１Ｍ Tris-ＨＣｌ
緩衝液（pH８．５）で直ぐに中和した。抗体の濃度を、
Ｅ１％＝１４．３を用いて２８０nmで測定した。流出し
た抗体の画分を更に処理しないで−２０℃下に貯蔵し
た。
5.3.未成熟なヒヨコの肺の上皮細胞の培養 未成熟なヒヨコの肺の上皮細胞を日令１４日のヒヨコの
未成熟な肺から分離した。この組織を手で裂き、Ca2+及
びMg2+を含まないHanksの平衡化塩溶液中０．２５％ト
リプシンを用いて、３７℃で３０分間トリプシン化し
た。この反応を媒体及び１０％ＦＣＳで停止させた。遠
心分離及び再懸濁後、細胞を７５cm2のＴ−フラスコに
移し、１２〜２４時間に亘って付着させ、次いで媒体を
変えた。培養３〜５日後、細胞を短期間（２〜３分
間）、（０．２５％トリプシン溶液中で）トリプシン化
し、９cmφのペトリ皿の上に置き、細胞が接合する培養
３〜５日後に使用された。細胞は、非必須アミノ酸及び
１０％胎牛血清の補充されたEagleの最小必須培地にお
いて、有湿の５％ＣＯ２／空気の雰囲気中で３７℃下に
生長させた。
5.4.未成熟なヒヨコの肺の上皮細胞の全細胞ＳＤＳ溶解
物の調製 ９cmφのペトリ皿で生長させた細胞をCa2+、Mg2+を含ま
ないＰＢＳ（Dulbecco）中で洗浄し、ゴム製ポリスマン
で集め、Eppendorfチップ（１．５ml）中の無水アセト
ン中に−２０℃で浸した。このアセトンを蒸発させ、乾
燥した細胞残渣を、１ｍＭ ＴＡＭＥ（プロテアーゼ禁
止剤）を含む沸とうＳＤＳ−試料緩衝液中に溶解した。
遠心分離後、不溶性の残渣を捨てた。試料緩衝液で連続
的に希釈し且つクーマシー青で着色したこの溶解物のＳ
ＤＳＳゲル（Laemmliによる）を用いて試料の最も適当
な希釈度を見積った。続く遺伝子選別膜（ＮＥＮから購
入）への電気泳動的転移に対して１：１６の希釈を使用
した。１つの転移単位は、１列のそのような希釈した溶
解物及び１列の精製した対照蛋白の混合物：１列当りC
h.g.フィラミン、＝Ch.g.ミオシン（Ｈ＋Ｌ鎖）、Ch.g.
α−アクチニン、ＢＳＡ、ラットの脳のツブリン、豚の
胃のトロポミオシン各０．０６μｇ、からなった。
緩衝液の先端をゲルの底部に達しせしめ、遺伝子選別膜
への電気泳動的移動を実施例2.3.と正確に同じにして行
なった。ブロット単位を切り取り、残存する蛋白結合部
位を実施例1.2.及び2.3.に記述したように消滅させた。
アクチンに対する抗体（０．５μｇ／ml）及びＧＡＲ
Ｇ２０（Ｏ．Ｄ．５２０nm＝０．２）との培養及びＧＡ
Ｒ Ｇ２０の、０．１％ＢＳＡ−Tris＋０．４％ゼラチ
ンでの希釈は、実施例2.4.に記述したものと同一の方法
に従い、シートの寸法の±の密閉されたプラスチック製
バック中において、それぞれ２時間行なった。
ＧＡＲ Ｇ２０との２時間の保温後、シートを０．１％
ＢＳＡ−Trisで洗浄し、銀での増感にそなえた。この時
点において、溶解物におけるアクチンの移動及び蛋白混
合物中のアクチンとの対応に基づき、桃赤色のバンドが
すでに見られた。
5.5.銀での増感 −シートを１：１０で希釈したクエン酸塩原料緩衝液中
において２分間洗浄した。この緩衝液は１００mlに対し
てクエン酸三ナトリウム２５．５ｇ及びクエン酸２３．
５ｇを含有した（pH４）。
−次いでシートを、次のものを含む物理学的現像剤中に
おいて、注意深く光から保護しつつ１５分間培養した： 脱イオン水 ６０ml 脱イオン水１５．０ml中ハイドロキノン０．８５ｇ クエン酸塩緩衝液（pH４）１０ml 脱イオン水15.0ml中乳酸銀０．１１ｇ。
乳酸銀を注意深く光から保護し、使用直前に他の成分に
添加した。
−反応時間後、シートを過剰のＨ２Ｏで洗浄し、Agetix
（水中１：４）写真定着剤で処理した。
−このシートを再び過剰のＨ２Ｏ中で洗浄し、空気乾燥
した。
5.6.結 果 初めに桃赤色のバンドとして見えていたバンドは今や深
い黒色になった。アクチンに対する抗体は、非常に特異
的と考えられ、培養細胞中におけるアクチン含有物の免
疫細胞化学的な着色に対して満足しうる結果を与えた。
5.7.結 論 上述の銀増感は、検知法のコントラスト及び感度を強く
増大させた。例えば実施例IVにおいて、コロイド状銀で
標識された抗体で着色したものを更に現像し、そして反
応の僅か５分後に検出限界が３０ng／スポットの代りに
３ng／スポットとなった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グイド・フランシスクス・テオフイリス・ ダネールス ベルギー国ビー‐2452‐ギールレ・ドール ストラート 57 (72)発明者 ヤン・ラオウル・デ・メイ ベルギー国ビー‐2300‐トウルンホウト・ ブスジエイ・コレーゲストラート 56 (56)参考文献 特開 昭55−15100（ＪＰ，Ａ)

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ｉ）受体基質をブロッティング媒体に固定
    化し； ii）該ブロッティング媒体を、該受体基質に対するコロ
    イド状金属粒子で標識された特異的結合剤と接触させ；
    そして iii）該受体基質と該特異的結合剤との間の反応部位で
    コロイド状金属粒子により生ずるブロッティング媒体の
    表面における着色信号を検知する、工程からなることを
    特徴とするブロット・オーバレイ分析による受体基質の
    検知及び／又は定量法。
  2. 【請求項２】随時電気泳動分離法を適用し、電気泳動媒
    体からブロッティング媒体への転移又はブロッティング
    を適用し、続いて結合部位に特異的な残存する試剤を技
    術的に公知の方法で消去した後、直接的吸着及び／又は
    共有結合によって固定化工程を行なう特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
  3. 【請求項３】ブロッティング媒体を、受体基質を含有す
    る水溶液と接触させることによって、該ブロッティング
    媒体に固定化せしめられた特異的結合蛋白により、受体
    基質を結合せしめることで固定化工程を行なう特許請求
    の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】コロイド状金属粒子が粒子径３〜１００ｎ
    ｍの金、銀、白金又はこれらの金属の化合物或いは鉄又
    は銅化合物からなる特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
    かに記載の方法。
  5. 【請求項５】コロイド状金属粒子が粒子径３〜１００ｎ
    ｍの金及び／又は銀からなる特許請求の範囲第１〜４項
    のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】コロイド状金属粒子の最終的検知を、物理
    的現像剤の適用後に行なう特許請求の範囲第１〜５項の
    いずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】物理的現像剤が銀含有化合物である特許請
    求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】ｉ）受体基質をブロッティング媒体に固定
    化し； ii）該ブロッティング媒体を、該受体媒質に対する標識
    されていない特異的結合剤と、そして続いて該標識され
    ていない特異的結合剤に対して特異的なコロイド状金属
    で標識された蛋白と接触させ；そして iii）該受体基質と該特異的結合剤との間の反応部位で
    コロイド状金属粒子により生ずるブロッティング媒体の
    表面における着色信号を検知する、工程からなることを
    特徴とするブロット・オーバレイ分析による受体基質の
    検知及び／又は定量法。
  9. 【請求項９】随時電気泳動分離法を適用し、電気泳動媒
    体からブロッティング媒体への転移又はブロッティング
    を適用し、続いて結合部位に特異的な残存する試剤を技
    術的に公知の方法で消去した後、直接的吸着及び／又は
    共有結合によって固定化工程を行なう特許請求の範囲第
    ８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】ブロッティング媒体を、受体基質を含有
    する水溶液と接触させることによって、該ブロッティン
    グ媒体に固定化せしめられた特異的結合蛋白により、受
    体基質を結合せしめることで固定化工程を行なう特許請
    求の範囲第８項記載の方法。
  11. 【請求項１１】コロイド状金属粒子が粒子径３〜１００
    ｎｍの金、銀、白金又はこれらの金属の化合物或いは鉄
    又は銅化合物からなる特許請求の範囲第８〜１０項のい
    ずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】コロイド状金属粒子が粒子径３〜１００
    ｎｍの金及び／又は銀からなる特許請求の範囲第８〜１
    １項のいずれかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】コロイド状金属粒子の最終的検知を、物
    理的現像剤の適用後に行なう特許請求の範囲第８〜１２
    項のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】物理的現像剤が銀含有化合物である特許
    請求の範囲第１３項記載の方法。
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