JPH0646840A - 細胞凍結保存液 - Google Patents
細胞凍結保存液Info
- Publication number
- JPH0646840A JPH0646840A JP4228001A JP22800192A JPH0646840A JP H0646840 A JPH0646840 A JP H0646840A JP 4228001 A JP4228001 A JP 4228001A JP 22800192 A JP22800192 A JP 22800192A JP H0646840 A JPH0646840 A JP H0646840A
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- polymer compound
- solution
- cells
- cell
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 細胞培養用培地に、天然高分子化合物または
有機合成高分子化合物、ジメチルスルホキシド、単糖ま
たは2糖及び緩衝液を含めて細胞凍結保存液とする。 【効果】 プログラムフリーザーを用いずに細胞を容易
に凍結保存することができ、長期間保存しても高い生存
率を維持できる。
有機合成高分子化合物、ジメチルスルホキシド、単糖ま
たは2糖及び緩衝液を含めて細胞凍結保存液とする。 【効果】 プログラムフリーザーを用いずに細胞を容易
に凍結保存することができ、長期間保存しても高い生存
率を維持できる。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は培養動物細胞を簡易な操
作で長期間凍結保存可能な細胞凍結保存液に関する。
作で長期間凍結保存可能な細胞凍結保存液に関する。
【0002】
【従来の技術】培養細胞凍結保存は、継代による細胞変
質の防止や雑菌による汚染の防止並びに継代維持の繁雑
さの解消のために行なわれている。これまでの凍結保存
技術は、5〜15%DMSOやグリセリンを含む培養液
に細胞を懸濁しクライオチューブやアンプルにつめ、プ
ログラムフリーザーを用い−1℃/min前後の速度で
冷却し、最終的に液体窒素中(−196℃)での保存方
法が一般的である。
質の防止や雑菌による汚染の防止並びに継代維持の繁雑
さの解消のために行なわれている。これまでの凍結保存
技術は、5〜15%DMSOやグリセリンを含む培養液
に細胞を懸濁しクライオチューブやアンプルにつめ、プ
ログラムフリーザーを用い−1℃/min前後の速度で
冷却し、最終的に液体窒素中(−196℃)での保存方
法が一般的である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法で
は、時間の経過と共に細胞の生存率が低下してくるた
め、適当な時期に保存している細胞を融解し大量の増殖
させ、また凍結保存するという操作を繰り返さねばなら
ない。保存細胞種が多ければ細胞の維持管理は、膨大な
労力を要する作業となるため、長期にわたって細胞を凍
結しておける保存液が必要になって来る。
は、時間の経過と共に細胞の生存率が低下してくるた
め、適当な時期に保存している細胞を融解し大量の増殖
させ、また凍結保存するという操作を繰り返さねばなら
ない。保存細胞種が多ければ細胞の維持管理は、膨大な
労力を要する作業となるため、長期にわたって細胞を凍
結しておける保存液が必要になって来る。
【0004】そこで、本発明者等は、上述の問題をでき
るかぎり解決する方法を鋭意検討した結果、細胞培養用
培地に、蛋白質、糖あるいは糖蛋白質からなる天然高分
子化合物やポリエチレングリコールなどの有機合成高分
子化合物、ジメチルスルホキシド、糖及び緩衝液を含む
保存液が、プログラムフリーザーを用いず、短時間に簡
単な操作で各種細胞を保存できる保存液を開発すること
ができた。
るかぎり解決する方法を鋭意検討した結果、細胞培養用
培地に、蛋白質、糖あるいは糖蛋白質からなる天然高分
子化合物やポリエチレングリコールなどの有機合成高分
子化合物、ジメチルスルホキシド、糖及び緩衝液を含む
保存液が、プログラムフリーザーを用いず、短時間に簡
単な操作で各種細胞を保存できる保存液を開発すること
ができた。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞培養用培
地に、天然高分子化合物または有機合成高分子化合物、
ジメチルスルホキシド、単糖または2糖及び緩衝液を含
むことを特徴とする細胞凍結保存液、及び天然高分子化
合物として、哺乳類由来血清50〜90%を含むことを
特徴とする細胞凍結保存液、及び天然高分子化合物とし
て、デキストラン0.1〜1.0%を含むことを特徴と
する細胞凍結保存液、及び天然高分子化合物として、グ
リコーゲン0.1〜1.0%を含むことを特徴とする細
胞凍結保存液、及び天然高分子化合物として、メチルセ
ルロースまたはカルボキシメチルセルロース0.1〜
1.0%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及び
有機合成高分子化合物として、ポリエチレングリコール
1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及
び有機合成高分子化合物として、ポリビニルピロリドン
1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及
び単糖として、グルコース1〜10%を含むことを特徴
とする細胞凍結保存液、及び2糖として、シュークロー
ス1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、
に係るものである。
地に、天然高分子化合物または有機合成高分子化合物、
ジメチルスルホキシド、単糖または2糖及び緩衝液を含
むことを特徴とする細胞凍結保存液、及び天然高分子化
合物として、哺乳類由来血清50〜90%を含むことを
特徴とする細胞凍結保存液、及び天然高分子化合物とし
て、デキストラン0.1〜1.0%を含むことを特徴と
する細胞凍結保存液、及び天然高分子化合物として、グ
リコーゲン0.1〜1.0%を含むことを特徴とする細
胞凍結保存液、及び天然高分子化合物として、メチルセ
ルロースまたはカルボキシメチルセルロース0.1〜
1.0%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及び
有機合成高分子化合物として、ポリエチレングリコール
1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及
び有機合成高分子化合物として、ポリビニルピロリドン
1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及
び単糖として、グルコース1〜10%を含むことを特徴
とする細胞凍結保存液、及び2糖として、シュークロー
ス1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、
に係るものである。
【0006】
【作用】本保存液は、高分子化合物、ジメチルスルホキ
シド、細胞培養用培地、糖及び緩衝液の5成分からな
る。以下成分ごとに説明する。
シド、細胞培養用培地、糖及び緩衝液の5成分からな
る。以下成分ごとに説明する。
【0007】1 細胞培養用培地 基本的には、細胞培養が可能な基本培地であれば、どの
培地でも良く、オートクレーブができる培地の方が操作
及び滅菌という観点からより好適である。
培地でも良く、オートクレーブができる培地の方が操作
及び滅菌という観点からより好適である。
【0008】2 高分子化合物 本保存液に適用される高分子化合物には、蛋白質、糖、
糖蛋白質等からなる天然高分子化合物と、エチレングリ
コールなどの有機合成化合物が考えられる。前者には各
種動物由来の血清、ゼラチン、アルブミン、肉エキス、
ミルク蛋白質、植物蛋白質、デンプン、デキストラン、
グリコーゲン、メチルまたはカルボキシメチルセルロー
ス、イヌリン、イノシトール及びソルビトール等が考え
られ、使用濃度は蛋白質や糖蛋白質では50〜90%、
糖の場合は0.1〜10%で使用すると良好な結果が得
られる。また、後者には、ジエチレングリコール、プロ
ピレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリエチ
レングリコール等が上げられ、1〜10%の濃度で使用
すると良い結果が得られる。
糖蛋白質等からなる天然高分子化合物と、エチレングリ
コールなどの有機合成化合物が考えられる。前者には各
種動物由来の血清、ゼラチン、アルブミン、肉エキス、
ミルク蛋白質、植物蛋白質、デンプン、デキストラン、
グリコーゲン、メチルまたはカルボキシメチルセルロー
ス、イヌリン、イノシトール及びソルビトール等が考え
られ、使用濃度は蛋白質や糖蛋白質では50〜90%、
糖の場合は0.1〜10%で使用すると良好な結果が得
られる。また、後者には、ジエチレングリコール、プロ
ピレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリエチ
レングリコール等が上げられ、1〜10%の濃度で使用
すると良い結果が得られる。
【0009】3 糖 本保存液に使用される糖としては、グルコース、キシロ
ース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラ
クトース、シュークロース、マルトース、ラフィノース
等の単糖、2糖が細胞凍結保存液として良好な結果が得
られる。使用濃度は10〜50%が最も良い結果を示
す。
ース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラ
クトース、シュークロース、マルトース、ラフィノース
等の単糖、2糖が細胞凍結保存液として良好な結果が得
られる。使用濃度は10〜50%が最も良い結果を示
す。
【0010】4 ジメチルスルホキシド ジメチルスルホキシドは、一般的に使用されている凍結
保護剤で、使用濃度は5〜15%が適当である。この他
に、グリセロールが使用できるが、本細胞凍結保存剤と
してはDMSOより効果は劣る。
保護剤で、使用濃度は5〜15%が適当である。この他
に、グリセロールが使用できるが、本細胞凍結保存剤と
してはDMSOより効果は劣る。
【0011】5 緩衝液 本保存液の水素イオン濃度は、室温において、7.0〜
8.5の範囲が適当である。これに使用されるものとし
ては基本的にはpHが上記の範囲内に収るものであれば
いずれの緩衝液でも良い。本保存液には、リン酸系、B
ES、TES、アセトアミドグリシン、TRICIN
E、グリシンアミド、グリシルグリシン、ベロナール、
トリスエタノールアミン及びHEPESが使用可能で、
濃度は100mM〜200mMが適当である。
8.5の範囲が適当である。これに使用されるものとし
ては基本的にはpHが上記の範囲内に収るものであれば
いずれの緩衝液でも良い。本保存液には、リン酸系、B
ES、TES、アセトアミドグリシン、TRICIN
E、グリシンアミド、グリシルグリシン、ベロナール、
トリスエタノールアミン及びHEPESが使用可能で、
濃度は100mM〜200mMが適当である。
【0012】
【実施例及び試験例】以下、本発明の実施例及び試験例
を示して説明する。
を示して説明する。
【0013】実施例1 細胞凍結保存液の各成分を以下のように調製した。
【0014】1)成牛血清(ヤガイ社製)750ml 原料試験(無菌試験、迷入ウイルス否定試験、エンドト
キシン測定)に合格した成牛血清を、56℃、30分温
水処理し、0.45μMプレフィルター及び0.22μ
M無菌フィルター(ミリポア社製)を用いて滅菌した血
清を用いた。
キシン測定)に合格した成牛血清を、56℃、30分温
水処理し、0.45μMプレフィルター及び0.22μ
M無菌フィルター(ミリポア社製)を用いて滅菌した血
清を用いた。
【0015】2)ジメチルスルホキド100ml ジメチルスルホキシド(和光純薬社製)100mlを
0.22μM無菌フィルター(ミリポア社テフロンフィ
ルター)を用いて滅菌した。
0.22μM無菌フィルター(ミリポア社テフロンフィ
ルター)を用いて滅菌した。
【0016】3)Basic Stock Solut
ion(BSS)150ml RPMI1640(Flow社製)1.575g、グル
コース30.0g、炭酸水素ナトリウム0.8g、HE
PES(和光純薬社製)0.36gを二段蒸留水に加え
全量を150mlとし、0.45μMプレフィルター
(ミリポア社製)0.22μM無菌フィルター(ミリポ
ア社製)を用いて滅菌した。
ion(BSS)150ml RPMI1640(Flow社製)1.575g、グル
コース30.0g、炭酸水素ナトリウム0.8g、HE
PES(和光純薬社製)0.36gを二段蒸留水に加え
全量を150mlとし、0.45μMプレフィルター
(ミリポア社製)0.22μM無菌フィルター(ミリポ
ア社製)を用いて滅菌した。
【0017】4)調合 1)、2)、3)によって得た成牛血清750ml、ジ
メチルスルホキシド100ml、Basic Stoc
k Solution150mlをクリーンベンチ内で
無菌的に調製した(CB−1)。
メチルスルホキシド100ml、Basic Stoc
k Solution150mlをクリーンベンチ内で
無菌的に調製した(CB−1)。
【0018】実施例2 実施例1で調製した保存成分中で、RPMI1640に
代えて、199培地を用いて、実施例1と同様に保存液
を調製した(CB−2)。
代えて、199培地を用いて、実施例1と同様に保存液
を調製した(CB−2)。
【0019】実施例3 実施例1の調製成分中、牛血清の代わりに、0.5%カ
ルボキシメチルセルロースを用いて、実施例1と同様に
保存液を調製した(CB−3)。
ルボキシメチルセルロースを用いて、実施例1と同様に
保存液を調製した(CB−3)。
【0020】実施例4 実施例1の調製成分中、グルコースの代わりに、シュー
クロースを用いて、実施例1と同様の操作で保存液を調
製した(CB−4)。
クロースを用いて、実施例1と同様の操作で保存液を調
製した(CB−4)。
【0021】試験例1 あらかじめ、GIT培地(日本製薬)で培養したJur
kat細胞(Human T Cell Leukae
mia)及びSK−007細胞(HumanMyelo
ma)を遠心で集め細胞数5×105〜5×106個/m
lになるように、実施例1〜4で調製した各種保存液1
mlを加えて懸濁し、2ml容のクライオチューブ(ヌ
ンク社製)に小分けした。20〜30分間予備凍結後、
−80℃または−196℃で一定期間保存した。6ヶ月
間凍結保存したクライオチューブ入りの細胞液を30〜
37℃の微温湯中で軽く振りながら迅速に融解し、直ち
にそれぞれの細胞の至適増殖用培地(10ml)で1回
洗浄後、生細胞をEKDSヘマサイトメーター(萱垣製
作所製)で計測した。結果は下記表1に示した。
kat細胞(Human T Cell Leukae
mia)及びSK−007細胞(HumanMyelo
ma)を遠心で集め細胞数5×105〜5×106個/m
lになるように、実施例1〜4で調製した各種保存液1
mlを加えて懸濁し、2ml容のクライオチューブ(ヌ
ンク社製)に小分けした。20〜30分間予備凍結後、
−80℃または−196℃で一定期間保存した。6ヶ月
間凍結保存したクライオチューブ入りの細胞液を30〜
37℃の微温湯中で軽く振りながら迅速に融解し、直ち
にそれぞれの細胞の至適増殖用培地(10ml)で1回
洗浄後、生細胞をEKDSヘマサイトメーター(萱垣製
作所製)で計測した。結果は下記表1に示した。
【0022】
【表1】
【0023】試験例2 CB−1を用い、あらかじめ、供試細胞をその増殖に適
した培地を用いて培養し、遠心で集めた各種細胞を試験
例1と同様の操作によって1〜30ヶ月間保存し、その
生存率を計測した。結果は下記表2に示した。
した培地を用いて培養し、遠心で集めた各種細胞を試験
例1と同様の操作によって1〜30ヶ月間保存し、その
生存率を計測した。結果は下記表2に示した。
【0024】
【表2】
【0025】試験例3 本保存液、CB−1及び従来法を用い、あらかじめ供試
細胞をその増殖に適した培地を用いて培養し、遠心で集
めた各種細胞を試験例1と同様の操作によって6ヶ月間
保存し、その生存率を計測した。結果は下記表3に示し
た。
細胞をその増殖に適した培地を用いて培養し、遠心で集
めた各種細胞を試験例1と同様の操作によって6ヶ月間
保存し、その生存率を計測した。結果は下記表3に示し
た。
【0026】
【表3】
【0027】
【発明の効果】本発明の細胞凍結保存液によれば、プロ
グラムフリーザーを用いることなく、短時間に簡単な操
作で細胞の保存を行なうことができ、しかも長期間凍結
保存しても高い生存率を保持する効果がある。
グラムフリーザーを用いることなく、短時間に簡単な操
作で細胞の保存を行なうことができ、しかも長期間凍結
保存しても高い生存率を保持する効果がある。
Claims (9)
- 【請求項1】 細胞培養用培地に、天然高分子化合物ま
たは有機合成高分子化合物、ジメチルスルホキシド、単
糖または2糖及び緩衝液を含むことを特徴とする細胞凍
結保存液。 - 【請求項2】 天然高分子化合物として、哺乳類由来血
清50〜90%を含む請求項1記載の細胞凍結保存液。 - 【請求項3】 天然高分子化合物として、デキストラン
0.1〜1.0%を含む請求項1記載の細胞凍結保存
液。 - 【請求項4】 天然高分子化合物として、グリコーゲン
0.1〜1.0%を含む請求項1記載の細胞凍結保存
液。 - 【請求項5】 天然高分子化合物として、メチルセルロ
ースまたはカルボキシメチルセルロース0.1〜1.0
%を含む請求項1記載の細胞凍結保存液。 - 【請求項6】 有機合成高分子化合物として、ポリエチ
レングリコール1〜10%を含む請求項1記載の細胞凍
結保存液。 - 【請求項7】 有機合成高分子化合物として、ポリビニ
ルピロリドン1〜10%を含む請求項1記載の細胞凍結
保存液。 - 【請求項8】 単糖として、グルコース1〜10%を含
む請求項1記載の細胞凍結保存液。 - 【請求項9】 2糖として、シュークロース1〜10%
を含む請求項1記載の細胞凍結保存液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4228001A JPH0646840A (ja) | 1992-08-04 | 1992-08-04 | 細胞凍結保存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4228001A JPH0646840A (ja) | 1992-08-04 | 1992-08-04 | 細胞凍結保存液 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646840A true JPH0646840A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=16869626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4228001A Pending JPH0646840A (ja) | 1992-08-04 | 1992-08-04 | 細胞凍結保存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646840A (ja) |
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-
1992
- 1992-08-04 JP JP4228001A patent/JPH0646840A/ja active Pending
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