JPH0646840A - 細胞凍結保存液 - Google Patents

細胞凍結保存液

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JPH0646840A
JPH0646840A JP4228001A JP22800192A JPH0646840A JP H0646840 A JPH0646840 A JP H0646840A JP 4228001 A JP4228001 A JP 4228001A JP 22800192 A JP22800192 A JP 22800192A JP H0646840 A JPH0646840 A JP H0646840A
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JP
Japan
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polymer compound
solution
cells
cell
cell cryopreservation
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JP4228001A
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Inventor
Koichi Sase
孝一 佐瀬
Chikako Kinoshita
千佳子 木の下
Tadashi Sudo
忠 須藤
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Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
Original Assignee
Nippon Zenyaku Kogyo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 細胞培養用培地に、天然高分子化合物または
有機合成高分子化合物、ジメチルスルホキシド、単糖ま
たは2糖及び緩衝液を含めて細胞凍結保存液とする。 【効果】 プログラムフリーザーを用いずに細胞を容易
に凍結保存することができ、長期間保存しても高い生存
率を維持できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は培養動物細胞を簡易な操
作で長期間凍結保存可能な細胞凍結保存液に関する。
【0002】
【従来の技術】培養細胞凍結保存は、継代による細胞変
質の防止や雑菌による汚染の防止並びに継代維持の繁雑
さの解消のために行なわれている。これまでの凍結保存
技術は、5〜15%DMSOやグリセリンを含む培養液
に細胞を懸濁しクライオチューブやアンプルにつめ、プ
ログラムフリーザーを用い−1℃/min前後の速度で
冷却し、最終的に液体窒素中(−196℃)での保存方
法が一般的である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】しかし、この方法で
は、時間の経過と共に細胞の生存率が低下してくるた
め、適当な時期に保存している細胞を融解し大量の増殖
させ、また凍結保存するという操作を繰り返さねばなら
ない。保存細胞種が多ければ細胞の維持管理は、膨大な
労力を要する作業となるため、長期にわたって細胞を凍
結しておける保存液が必要になって来る。
【0004】そこで、本発明者等は、上述の問題をでき
るかぎり解決する方法を鋭意検討した結果、細胞培養用
培地に、蛋白質、糖あるいは糖蛋白質からなる天然高分
子化合物やポリエチレングリコールなどの有機合成高分
子化合物、ジメチルスルホキシド、糖及び緩衝液を含む
保存液が、プログラムフリーザーを用いず、短時間に簡
単な操作で各種細胞を保存できる保存液を開発すること
ができた。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明は、細胞培養用培
地に、天然高分子化合物または有機合成高分子化合物、
ジメチルスルホキシド、単糖または2糖及び緩衝液を含
むことを特徴とする細胞凍結保存液、及び天然高分子化
合物として、哺乳類由来血清50〜90%を含むことを
特徴とする細胞凍結保存液、及び天然高分子化合物とし
て、デキストラン0.1〜1.0%を含むことを特徴と
する細胞凍結保存液、及び天然高分子化合物として、グ
リコーゲン0.1〜1.0%を含むことを特徴とする細
胞凍結保存液、及び天然高分子化合物として、メチルセ
ルロースまたはカルボキシメチルセルロース0.1〜
1.0%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及び
有機合成高分子化合物として、ポリエチレングリコール
1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及
び有機合成高分子化合物として、ポリビニルピロリドン
1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、及
び単糖として、グルコース1〜10%を含むことを特徴
とする細胞凍結保存液、及び2糖として、シュークロー
ス1〜10%を含むことを特徴とする細胞凍結保存液、
に係るものである。
【0006】
【作用】本保存液は、高分子化合物、ジメチルスルホキ
シド、細胞培養用培地、糖及び緩衝液の5成分からな
る。以下成分ごとに説明する。
【0007】1 細胞培養用培地 基本的には、細胞培養が可能な基本培地であれば、どの
培地でも良く、オートクレーブができる培地の方が操作
及び滅菌という観点からより好適である。
【0008】2 高分子化合物 本保存液に適用される高分子化合物には、蛋白質、糖、
糖蛋白質等からなる天然高分子化合物と、エチレングリ
コールなどの有機合成化合物が考えられる。前者には各
種動物由来の血清、ゼラチン、アルブミン、肉エキス、
ミルク蛋白質、植物蛋白質、デンプン、デキストラン、
グリコーゲン、メチルまたはカルボキシメチルセルロー
ス、イヌリン、イノシトール及びソルビトール等が考え
られ、使用濃度は蛋白質や糖蛋白質では50〜90%、
糖の場合は0.1〜10%で使用すると良好な結果が得
られる。また、後者には、ジエチレングリコール、プロ
ピレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリエチ
レングリコール等が上げられ、1〜10%の濃度で使用
すると良い結果が得られる。
【0009】3 糖 本保存液に使用される糖としては、グルコース、キシロ
ース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラ
クトース、シュークロース、マルトース、ラフィノース
等の単糖、2糖が細胞凍結保存液として良好な結果が得
られる。使用濃度は10〜50%が最も良い結果を示
す。
【0010】4 ジメチルスルホキシド ジメチルスルホキシドは、一般的に使用されている凍結
保護剤で、使用濃度は5〜15%が適当である。この他
に、グリセロールが使用できるが、本細胞凍結保存剤と
してはDMSOより効果は劣る。
【0011】5 緩衝液 本保存液の水素イオン濃度は、室温において、7.0〜
8.5の範囲が適当である。これに使用されるものとし
ては基本的にはpHが上記の範囲内に収るものであれば
いずれの緩衝液でも良い。本保存液には、リン酸系、B
ES、TES、アセトアミドグリシン、TRICIN
E、グリシンアミド、グリシルグリシン、ベロナール、
トリスエタノールアミン及びHEPESが使用可能で、
濃度は100mM〜200mMが適当である。
【0012】
【実施例及び試験例】以下、本発明の実施例及び試験例
を示して説明する。
【0013】実施例1 細胞凍結保存液の各成分を以下のように調製した。
【0014】1)成牛血清(ヤガイ社製)750ml 原料試験(無菌試験、迷入ウイルス否定試験、エンドト
キシン測定)に合格した成牛血清を、56℃、30分温
水処理し、0.45μMプレフィルター及び0.22μ
M無菌フィルター(ミリポア社製)を用いて滅菌した血
清を用いた。
【0015】2)ジメチルスルホキド100ml ジメチルスルホキシド(和光純薬社製)100mlを
0.22μM無菌フィルター(ミリポア社テフロンフィ
ルター)を用いて滅菌した。
【0016】3)Basic Stock Solut
ion(BSS)150ml RPMI1640(Flow社製)1.575g、グル
コース30.0g、炭酸水素ナトリウム0.8g、HE
PES(和光純薬社製)0.36gを二段蒸留水に加え
全量を150mlとし、0.45μMプレフィルター
(ミリポア社製)0.22μM無菌フィルター(ミリポ
ア社製)を用いて滅菌した。
【0017】4)調合 1)、2)、3)によって得た成牛血清750ml、ジ
メチルスルホキシド100ml、Basic Stoc
k Solution150mlをクリーンベンチ内で
無菌的に調製した(CB−1)。
【0018】実施例2 実施例1で調製した保存成分中で、RPMI1640に
代えて、199培地を用いて、実施例1と同様に保存液
を調製した(CB−2)。
【0019】実施例3 実施例1の調製成分中、牛血清の代わりに、0.5%カ
ルボキシメチルセルロースを用いて、実施例1と同様に
保存液を調製した(CB−3)。
【0020】実施例4 実施例1の調製成分中、グルコースの代わりに、シュー
クロースを用いて、実施例1と同様の操作で保存液を調
製した(CB−4)。
【0021】試験例1 あらかじめ、GIT培地(日本製薬)で培養したJur
kat細胞(Human T Cell Leukae
mia)及びSK−007細胞(HumanMyelo
ma)を遠心で集め細胞数5×105〜5×106個/m
lになるように、実施例1〜4で調製した各種保存液1
mlを加えて懸濁し、2ml容のクライオチューブ(ヌ
ンク社製)に小分けした。20〜30分間予備凍結後、
−80℃または−196℃で一定期間保存した。6ヶ月
間凍結保存したクライオチューブ入りの細胞液を30〜
37℃の微温湯中で軽く振りながら迅速に融解し、直ち
にそれぞれの細胞の至適増殖用培地(10ml)で1回
洗浄後、生細胞をEKDSヘマサイトメーター(萱垣製
作所製)で計測した。結果は下記表1に示した。
【0022】
【表1】
【0023】試験例2 CB−1を用い、あらかじめ、供試細胞をその増殖に適
した培地を用いて培養し、遠心で集めた各種細胞を試験
例1と同様の操作によって1〜30ヶ月間保存し、その
生存率を計測した。結果は下記表2に示した。
【0024】
【表2】
【0025】試験例3 本保存液、CB−1及び従来法を用い、あらかじめ供試
細胞をその増殖に適した培地を用いて培養し、遠心で集
めた各種細胞を試験例1と同様の操作によって6ヶ月間
保存し、その生存率を計測した。結果は下記表3に示し
た。
【0026】
【表3】
【0027】
【発明の効果】本発明の細胞凍結保存液によれば、プロ
グラムフリーザーを用いることなく、短時間に簡単な操
作で細胞の保存を行なうことができ、しかも長期間凍結
保存しても高い生存率を保持する効果がある。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 細胞培養用培地に、天然高分子化合物ま
    たは有機合成高分子化合物、ジメチルスルホキシド、単
    糖または2糖及び緩衝液を含むことを特徴とする細胞凍
    結保存液。
  2. 【請求項2】 天然高分子化合物として、哺乳類由来血
    清50〜90%を含む請求項1記載の細胞凍結保存液。
  3. 【請求項3】 天然高分子化合物として、デキストラン
    0.1〜1.0%を含む請求項1記載の細胞凍結保存
    液。
  4. 【請求項4】 天然高分子化合物として、グリコーゲン
    0.1〜1.0%を含む請求項1記載の細胞凍結保存
    液。
  5. 【請求項5】 天然高分子化合物として、メチルセルロ
    ースまたはカルボキシメチルセルロース0.1〜1.0
    %を含む請求項1記載の細胞凍結保存液。
  6. 【請求項6】 有機合成高分子化合物として、ポリエチ
    レングリコール1〜10%を含む請求項1記載の細胞凍
    結保存液。
  7. 【請求項7】 有機合成高分子化合物として、ポリビニ
    ルピロリドン1〜10%を含む請求項1記載の細胞凍結
    保存液。
  8. 【請求項8】 単糖として、グルコース1〜10%を含
    む請求項1記載の細胞凍結保存液。
  9. 【請求項9】 2糖として、シュークロース1〜10%
    を含む請求項1記載の細胞凍結保存液。
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