JPH0646843A - 環境において宿主対宿主の伝染の能力が減少した組み換え昆虫ウイルスおよび前記ウイルスを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 改良された生物殺昆虫作用および所望の特性
の遺伝学的安定性のための昆虫のコントロールまたは修
飾する物質がまたウイルスにより生産されるように、ウ
イルスのゲノムの中へ異種遺伝子の挿入する。 【構成】 遺伝学的相補によりその機能が回復し、これ
により昆虫感染性の形態のウイルスを再び生産する、変
更された遺伝学的要素を有する非感染性昆虫ウイルスを
生産する。 【効果】 変更された遺伝学的要素を有する非感染性昆
虫ウイルスが得られる。また、改良された生物殺昆虫作
用および所望の特性の遺伝学的安定性のための昆虫のコ
ントロールまたは修飾する物質がまたウイルスにより生
産される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、遺伝学的相補によりその機能が
回復し、これにより昆虫感染性の形態のウイルスを再び
生産する、変更された遺伝学的要素を有する非感染性昆
虫ウイルスに関係する。本発明は、さらに、改良された
生物殺虫作用および所望の特性の遺伝学的安定性のため
の昆虫のコントロールまたは修飾する物質がまたウイル
スにより生産されるように、ウイルスのゲノムの中への
異種遺伝子の挿入に関係する。

【０００２】次の略号をこの出願を通じて使用する： Ａ．ｃａｌ． − オウトグラファ・カリフォルニカ
（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｆｏｒｎｉｃａ） ＡｃＭＮＰＶ − オウトグラファ・カリフォルニカ
（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｆｏｒｎｉｃａ）の核の
多角体病ウイルス ｂｐ − 塩基対 ＥＣＶ − 細胞外ウイルス ＧＶ − グラニュローシスウイルス ｋＤ − キロダルトン ＭＯＩ − 感染多重度 ＮＰＶ − 核の多角体病ウイルス ＯＢ − 吸蔵吸蔵 ＯＶ − 吸蔵されたウイルス ＰＣＲ − ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＤＶ − 多角体病誘導ウイルス ｐ．ｉ． − 感染後 ＰＩＢ − 多角体封入体（また、ＯＢとして知られて
いる） ５′ＵＴＲ − 遺伝子の転写の開始部位からタンパク
質合成のための開始コドンに先行する最後の塩基または
塩基対までの領域に相当するｍＲＮＡまたは遺伝子配列 ３′ＵＴＲ − タンパク質合成のための終止コドン後
の最初の塩基または塩基対からｍＲＮＡの３′末端にお
ける最後の遺伝子エンコードされた塩基までの領域に相
当するｍＲＮＡまたは遺伝子配列 （＋）−鎖 − ある遺伝子およびその遺伝子から誘導
されたＲＮＡと同一のセンスを有するそのフランキング
配列のＤＮＡ鎖 （−）−鎖 − （＋）−鎖に対して相補的である遺伝
子およびそのフランキング配列のＤＮＡ鎖 本発明は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを包含
する、すべての昆虫ウイルスに適用される。ＤＮＡウイ
ルスはエントモポックスウイルス（ＥＰＶ）、およびバ
クロウイルス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｄａｅ）のウイル
ス、例えば、核の多角体病ウイルス（ＮＰＶ）およびグ
ラニュローシスウイルス（ＧＶ）などを包含する。ＲＮ
Ａウイルスは、トガウイルス、フラヴィウイルス、ピコ
ルナウイルス、細胞質の多角体病ウイルス（ＣＰＶ）な
どを包含する。二本鎖ＤＮＡウイルスの亜科のエウバキ
ュロウイルス亜科（Ｅｕｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅ）
は、２つの属、ＮＰＶおよびＧＶを包含し、これらはそ
れらの生活環において吸蔵体（ＯＢ）を生産するので、
生物学的コントロールのためにとくに有用である。無脊
椎動物において現在４００を越えるバクロウイルスが同
定されてきている。オウトグラファ・カリフォルニカ
（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｆｏｒｎｉｃａ）の核
の多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）は族バクロウイル
ス科（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｄａｅ）のプロトタイプのウ
イルスであり、そして広い宿主範囲を有する。ＡｃＭＮ
ＰＶウイルスは、普通にアルファルファのシャクトリム
シとして知られている、オウトグラファ・カリフォルニ
カ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｆｏｒｎｉｃａ）
（Ａ．ｃａｌ．）、鱗翅目のヤガ（これは成虫の段階で
ヤガのガである）から本来分離された。このウイルスは
鱗翅目の昆虫の目内の１２族および３０種以上の感染す
る（引用文献１）。この目以外の種を生産的に感染する
ことは知られていない。

【０００３】生物殺虫剤としてバクロウイルスを使用す
ることは有望である。農業におけるバクロウイルスの広
い使用に対する主要な障害の１つは、昆虫の最初の感染
とその死亡との間の時間のずれである。このずれは数日
から数週の範囲であることがある。この時間のずれの間
に、昆虫はえさを食べ続け、植物をさらに損傷する。あ
る数の研究者らは、ウイルスのゲノムの中に異種遺伝子
を挿入して、昆虫のコントロールまたは修飾する物質、
例えば、毒素（２、３、４）、神経ペプチドおよびホル
モン（５、６）または酵素（７）を発現させることによ
って、この欠点を克服する試みをした。

【０００４】遺伝子操作は生物殺昆虫剤としてウイルス
の商業化に対する技術的障害を克服する手段を提供する
が、それは、また、ウイルスの広い受け入れに対する第
２の潜在的な障害が存在しうるという認識が生じた。と
くに、これらの遺伝子操作されたウイルスの環境への解
放は、これらのウイルスは複製しそして広がるので、予
測されない結果を生ずることがあるという推測が存在す
る（８、９）。今日まで、昆虫のバイオコントロールの
ために生産されたすべての組み換え昆虫ウイルスは、虫
媒伝染を行うことができるので、この推測が当てあま
る。こうして、環境の中に解放された後、昆虫対昆虫
（宿主対宿主）の伝染の能力が減少した組み換え昆虫ウ
イルスが必要とされている。

【０００５】バクロウイルスの生活環は、ＡｃＭＮＰＶ
により例示されるように、２つの段階を含む。生活環の
各段階は、ウイルスの特異的形態により表される：吸蔵
されない細胞外ウイルス粒子（ＥＣＶ）、および吸蔵さ
れたウイルス粒子（ＯＶ）（１０、１１）。細胞外ウイ
ルス粒子および吸蔵されたウイルス粒子の形態は同一の
ゲノムを有するが、異なる生物学的性質を示す。ウイル
スの２つの形態の成熟はウイルス遺伝子の別々の組によ
り指令され、それらの組のあるものは各形態に対して独
特である。

【０００６】天然に見いだされる昆虫の感染の形態にお
いて、多数のヴィリオンは吸蔵体（ＯＢ）として知られ
ているパラ結晶質タンパク質マトリックスの中に埋め込
まれており、これはまた多角体封入体（ＰＩＢ）と呼ば
れる。タンパク質のウイルスの吸蔵体は多角体類（多角
体は単数の用語である）。多角体のタンパク質は、２９
ｋＤの分子量を有し、ウイルスの吸蔵体の主要なウイル
スがエンコードされた構造タンパク質である（１０、１
２）。（同様に、ＧＶは多角体よりむしろ主としてグラ
ヌリンから構成されたＯＢを生産する）。

【０００７】ウイルスの吸蔵体は自然のバクロウイルス
の生活環の重要な部分であり、感受性の昆虫種の間の水
平の（昆虫対昆虫）の伝染を提供する。環境において、
感受性の昆虫（通常幼虫の段階）は汚染された食物源、
例えば、植物からのウイルスの吸蔵体を摂取する。結晶
質吸蔵体は感受性昆虫の消化管の中で解離して、感染性
ウイルス粒子を解放する。これらの多角体誘導ウイルス
（ＰＤＶ）は中腸組織の細胞に侵入しそしてその中で複
製する（１０）。

【０００８】ウイルス粒子はエンドサイトーシスまたは
融合により細胞の中に入り、そしてウイルスのＤＮＡは
核の孔でまたは核の中で剥離されると信じられる。ウイ
ルスのＤＮＡの複製は６時間以内で検出される。感染後
（ｐ．ｉ．）１０〜１２時間までに、二次感染は細胞の
表面から細胞外ウイルス（ＥＣＶ）の出芽により他の昆
虫組織に広がる。ウイルスのＥＣＶの形態は個々の感染
した昆虫内のウイルスの細胞対細胞の広がり、ならびに
細胞培養における伝染感染の原因となる。

【０００９】感染サイクルの後期（ｐ．ｉ．１２時間）
に、多角体タンパク質は感染した細胞において検出する
ことができる。ｐ．ｉ．１８〜２４時間になって初め
て、多角体タンパク質は感染した細胞の核の中でアセン
ブリングし、そしてウイルス粒子はタンパク質の吸蔵体
の中に埋め込まれる。ウイルスの吸蔵体は細胞が溶解す
るとき４〜５日にわたって大きい数に蓄積する。これら
の多角体は幼虫における感染の広がりにおいて活性な役
割をもたない。血リンパの中のＥＣＶは増殖および広が
り、幼虫の死に導く（１０、１１、１２）。

【００１０】感染した幼虫が死ぬとき、数百万の多角体
は分解する組織の中に止まるが、ＥＣＶは分解する。他
の幼虫が多角体に、例えば、汚染された植物または他の
食物物質の摂取により、暴露されるとき、サイクルは反
復される（１０）。

【００１１】要約すると、ウイルスの吸蔵された形態は
消化管を通る昆虫の感染、ならびにウイルスの環境的安
定性の原因となる。ＰＤＶは注射により投与されるとき
本質的に感染性ではないが、経口的に高度に感染性であ
る。ウイルスの吸蔵されない形態（すなわち、ＥＣＶ）
は二次および細胞対細胞の感染の原因となる。ＥＣＶは
注射により培養および内部の昆虫組織の中の細胞に対し
て高度に感染性であるが、経口的投与により本質的に感
染性ではない。

【００１２】昆虫に対して毒性である外来タンパク質を
発現する組み換えバクロウイルスの使用は、これらのウ
イルスが脊椎動物または植物に対して病原性ではないと
いう事実により促進される。さらに、バクロウイルスは
一般に狭い宿主範囲を有する。多数の菌株は１つまたは
わずかの昆虫種に限定される。

【００１３】最も広く研究されたバクロウイルスはＡｃ
ＭＮＰＶである。ＡｃＭＮＰＶは鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏ
ｐｔｅｒａ）の昆虫内の１２族および３０以上の種に感
染することが知られている。この目の外側の種を生産的
に感染することは知られていない。一般の公衆の機関お
よび種々の取り締まり機関の両者は、外来ＤＮＡ配列を
含有するＡｃＭＮＰＶの菌株の解放の潜在的結果を論じ
た（８、９）。これは操作したウイルスが標的ではない
鱗翅目の中に広がることができる可能性に関係する。考
慮すべき他の因子はこれらのウイルスの既知の環境的安
定性である。

【００１４】こうして、昆虫対昆虫（宿主対宿主）の伝
染の能力が減少した組み換え昆虫ウイルスが必要とされ
ている。これらのウイルスは昆虫を感染することができ
るが、昆虫から昆虫に伝染する能力が有意に減少し、こ
れにより環境におけるウイルスの持続性を限定すべきで
ある。

【００１５】本発明は、昆虫から昆虫へ広がる能力が減
少している、すなわち、環境における宿主対宿主の伝染
の能力が減少している、組み換え昆虫ウイルス株の構成
および増殖を提供する。バクロウイルス科（Ｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｄａｅ）の族のウイルスは、前述の２段階の生
活環をもつために、このような株の構成をとくに行うこ
とができる。

【００１６】これらのウイルスの株はまず遺伝学的要素
を変更して、ウイルスを昆虫に対して非感染性とする。
この適用の目的で、遺伝学的要素はトランス−作用性の
物質、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質分子をコードす
る遺伝子に限定されず、またシス−作用性の要素または
調節配列、例えば、転写エンハンサー、プロモーター、
他の転写、翻訳およびゲノムの複製のコントロール要
素、およびウイルスのＤＮＡ（またはＲＮＡ）パッケー
ジング配列を包含する。

【００１７】変更は欠失、フレームシフト、または遺伝
子機能の崩壊の他のタイプの形態を取る。変更の他の形
態は、ウイルスの機能を妨害する方法、例えば、転写ま
たは翻訳の抑制、アンチセンスＲＮＡの使用、追加の遺
伝学的要素の挿入、および追加の再結合要素、例えば、
活性のためのＧＡＬ４タンパク質の存在を必要とする酵
母菌の上流の活性化物質（ＵＡＳ_GAL）の挿入を包含す
る。

【００１８】宿主対宿主の伝染を有意に減少すると同時
に組み換えウイルスの感染性の回復するという目的は、
変更されたウイルスに欠けているか、あるいはそのウイ
ルスにおいて欠損している生産物または機能と相補する
ことによって達成される。

【００１９】遺伝学的相補性により組み換え昆虫ウイル
スの昆虫感染性形態を生産する種々の方法は本発明の範
囲内に包含される、すなわち：（１）変更されたウイル
スに欠けているか、あるいはそのウイルスにおいて欠損
している生産物または機能を提供するＤＮＡ断片でトラ
ンスフェクションされた昆虫組織培養の細胞における生
産；（２）変更されたウイルスに欠けているか、あるい
はそのウイルスにおいて欠損している生産物または機能
を提供するＤＮＡ断片で安定に形質転換された昆虫の細
胞系における生産；および（３）変更されたウイルスに
欠けているか、あるいはそのウイルスにおいて欠損して
いる生産物または機能を提供するＤＮＡ断片を含有する
トランスジェニック昆虫における生産。

【００２０】提供されている生産物または機能に依存し
て、異種ウイルスまたは細胞のプロモーターを使用して
ＤＮＡ断片の発現をコントロールすることが必要または
望ましいことがある。これは投与および一時的考察によ
り必要とされることがある。方法（１）および（２）の
昆虫細胞および方法（３）のトランスジェニック昆虫
は、こうして、ウイルスの感染性を回復する「ヘルパ
ー」として機能し、こうして生産されたウイルス粒子
（ヴィリオン）は自然において昆虫により摂取されたと
き感染を引き起こす。感染した幼虫の中で生産されたヴ
ィリオンは、相補されないので、欠損しておりそして、
こうして、感染は他の昆虫に容易い広がらない。したが
って、同時感染性野生型ウイルスの不存在下に、組み換
えウイルスの生活環はこの単一の感染で終わる。

【００２１】本発明の好ましい実施態様において、昆虫
のコントロールまたは修飾する物質をコードする遺伝子
をウイルスのゲノムの中に挿入する。遺伝子は変更され
たウイルスの中にウイルスのゲノム内の任意の適当な位
置に挿入される。このような物質は、毒素、神経ペプチ
ドおよびホルモン、および酵素を包含する。こうして発
現された物質は生物殺虫作用を増強する。

【００２２】とくに、遺伝子は宿主対宿主の伝染の能力
の減少の原因となる遺伝学的要素の変更部位に隣接して
またはその中に直接挿入される。遺伝学的要素の変更部
位に隣接したまたはその部位における挿入は、野生型の
表現型および宿主対宿主の伝染のために昆虫のコントロ
ールまたは修飾する遺伝子の両者を有する形態のウイル
スを発生することができる、遺伝学的組み換えを防止ま
たは大きく最小とする。

【００２３】１つの昆虫から他への広がりが減少した昆
虫の操作は、非生物および生物の分解の自然のプロセス
により達成される速度を越えた、環境からの感染性ウイ
ルスの損失の速度を増加する。それゆえ、操作したウイ
ルスは環境におけるそれ自体を確立しないであろう。

【００２４】本発明は、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウ
イルスを包含する、すべての昆虫ウイルスに当てはま
る。ＤＮＡウイルスは、二本鎖のエンベロープを有する
ＤＮＡウイルス、例えば、（族、次いで種）エントモポ
ックスウイルス亜科（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｒｉｎａ
ｅ）（鞘翅目のポックスウイルス）、エウバキュロウイ
ルス亜科（Ｅｕｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅ）［オウト
グラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｆｏｒｎｉｃａ）ＭＮＰＶ；ヘリオコベルパ・ゼア
（Ｈｅｌｉｏｃｖｅｒｐａ ｚｅａ）ＳＮＰＶ］、ヌデ
ィバキュロウイルス亜科（Ｎｕｄｉｂａｃｕｌｏｖｉｒ
ｉｎａｅ）［ヘリオコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｏｃｖｅ
ｒｐａ ｚｅａ）ＮＯＢ］、イキノウイルス（Ｉｃｈｎ
ｏｖｉｒｕｓ）［カンポレチス・ソノレンシス（Ｃａｍ
ｐｏｌｅｔｉｓ ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）ウイルス］、
およびブラコウイルス（Ｂｒａｃｏｖｉｒｕｓ）［コテ
シア・メラノスセラ（Ｃｏｔｅｓｉａ ｍｅｌａｎｏｓ
ｃｅｌａ）ウイルス］、ならびに二本鎖のエンベロープ
をもたないＤＮＡウイルス、例えば、イリドウイルス科
（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）［キロ・イリデセント
（Ｃｈｉｒｏ ｉｒｉｄｅｓｃｅｎｔ）ウイルス］およ
び一本鎖のエンベロープをもたないＤＮＡウイルス、例
えば、パルヴォウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ
ｅ）［ガレリア・デンソウイルス（Ｇａｌｌｅｒｉａ
ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）を包含する。

【００２５】ＲＮＡウイルスは、二本鎖のエンベロープ
をもつＲＮＡウイルス、例えば、トガウイルス科（Ｔｏ
ｇａｖｉｒｄａｅ）［シンドビス（Ｓｉｎｄｏｂｉｓ）
ウイルス］、バニアウイルス科（Ｖａｎｙａｖｉｒｄａ
ｅ）（ビートの縮葉病ウイルス）およびフラビウイルス
科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｄａｅ）［ウェセルブロン（Ｗｅ
ｓｓｅｌｂｒｏｎ）ウイルス］、ならびに二本鎖のエン
ベロープをもたないＲＮＡウイルス、例えば、レオウイ
ルス科（Ｒｅｏｖｉｒｄａｅ）［コリパルタ（Ｃｏｒｒ
ｉｐａｒｔａ）ウイルス］およびビルナウイルス科（Ｂ
ｉｒｎａｖｉｒｄａｅ）（ショウジョバエＸウイル
ス）、ならびに一本鎖のエンベロープをもたないＲＮＡ
ウイルス、例えば、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎ
ａｖｉｒｉｄａｅ）（コオロギの麻痺ウイルス）、テト
ラウイルス科（Ｔｅｔｒａｖｉｒｄａｅ）［ヌダウレリ
ア（Ｎｕｄａｕｒｅｌｉａ）ベータウイルス）およびノ
ダウイルス科（Ｎｏｄａｖｉｒｄａｅ）（コバネゴキブ
リのウイルス）を包含する。

【００２６】二本鎖ＤＮＡウイルスの亜科のエウバキュ
ロウイルス亜科（Ｅｕｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅ）
は、２つの属、核の多角体病ウイルス（ＮＰＶ）および
グラニュローシスウイルス（ＧＶ）を包含し、これらは
それらの生活環において吸蔵体を生産するので、生物学
的コントロールのためにとくに有用である。ＮＰＶの例
は、リマントリア・ディスパー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ
ｄｉｓｐａｒ）ＮＰＶ（マイマイガのＮＰＶ）、オウト
グラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｆｏｒｎｉｃａ）ＭＮＰＶ、アナグラファ・ファル
シフェラ（Ａｎａｇｒａｐｈａ ｆａｌｃｉｆｅｒａ）
ＮＰＶ（セロリのシャクトリムシのＮＰＶ）、スポドプ
テラ・リッツラリス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｔ
ｒａｌｉｓ）ＮＰＶ、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓ
ｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＮＰＶ、
ヘリオチス・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｏｔｉｓ ａｒｍｇ
ｒａ）ＮＰＶ、マメストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｅｓｔ
ｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）ＮＰＶ、コリストネウラ・
フミフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉ
ｆｅｒａｎａ）ＮＰＶ、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃ
ｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）ＮＰＶ、ヘリオコベルパ・ゼ
ア（Ｈｅｌｉｏｃｖｅｒｐａ ｚｅａ）ＮＰＶ、ラシプ
ルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ ｏｕ）ＮＰＶ
などを包含する。ＧＶの例は、シジア・ポモネラ（Ｃｙ
ｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）ＧＶ（コドリンガのＧ
Ｖ）、ピエリス・ブラシカエ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓ
ｓｉｃａｅ）ＧＶ、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏ
ｐｌｕｓｉａ ｎｉ）ＧＶ、アルトゲイア・ラパエ（Ａ
ｒｔｏｇｅｉａ ｒａｐａｅ）ＧＶ、プロジア・インテ
ルプンクテラ（Ｐｌｏｄｉａ ｉｎｔｅｒｐｕｎｃｔｅ
ｌｌａ）ＧＶ［インディア・ミール（Ｉｎｄｉａｎ ｍ
ｅａｌ）ガ］などを包含する。エントモポックスウイル
スの例は、メロロンタ・メロロンタ（Ｍｅｌｏｌｏｎｔ
ｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔａ）ＥＰＶ、アンサクタ・モオ
レイ（Ａｍｓａｃｔａ ｍｏｏｒｅｉ）ＥＰＶ、ロクス
タ・ミグラトリア（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒ
ｉａ）ＥＰＶ、メラノプルス・サングイニペス（Ｍｅｌ
ａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）ＥＰＶ、シ
ストセルカ・グレガリア（Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ
ｇｒｅｇａｒｉａ）ＥＰＶ、エデス・エギプチ（Ｅｄｅ
ｓ ａｅｇｙｐｔｉ）ＥＰＶ、キロノムス・ルリヅス
（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｌｕｒｉｄｕｓ）ＥＰＶなど
を包含する。

【００２７】昆虫、とくに鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅ
ｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄ
ｉｐｔｅｒａ）、等翅目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、直翅目
（Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔ
ｅｒａ）膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、同翅亜目
（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒ
ａ）および鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）の抑制、お
よび耕種学的作物、木々、低木、果樹園および観賞植物
のこれらの昆虫による攻撃からの保護は、この出願の本
発明の使用により達成される。

【００２８】本発明をオウトグラファ・カリフォルニカ
（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰ
Ｖ（ＡｃＭＮＰＶ）について例示するが、ここに記載す
る概念はすべての前述の昆虫ウイルスについて適用可能
であることを理解すべきである。さらに、本発明は文献
においてこれまで同定されずかつ分類されていない、新
規な昆虫ウイルスの改良において高度に有用であると考
えられる。

【００２９】ＡｃＭＮＰＶによる感染は、最初に、ＥＣ
Ｖとして知られているウイルスの出芽した形態を生成す
る。ＥＣＶは個々の感染した昆虫内の、ならびに細胞培
養における増殖の間のウイルスの細胞対細胞の広がりの
原因となる。ＮＰＶの場合において、感染サイクルの後
期に、細胞はＰＤＶ形態を生産し始め、この形態は結晶
質吸蔵体（ＯＢ）の中にパッケージングされ、吸蔵体は
また多角体封入体（ＰＩＢ）と呼ばれる。（同様に、Ｇ
Ｖは多角体よりむしろ主としてグラヌリンから構成され
たＯＢを生産する）。ウイルスのこのＰＤＶ形態は消化
管を通る昆虫の初期の感染、ならびにウイルスの環境の
安定性の原因となる。

【００３０】ウイルスの出芽した形態（ＥＣＶ）に影響
を与えない、完全な感染性ＯＢの生産に関係する機能の
変更は、とくに有用である。

【００３１】このような突然変異はＡｃＭＮＰＶにおい
て見いだされた（１４）。ある数の突然変異誘発の実験
は、出芽したウイルスが生産されるが、完全な感染性多
角体が生産されない、遺伝学的位置を同定した。同定さ
れた最も興味ある潜在的に有用な位置の１つは、ＡｃＭ
ＮＰＶゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ断片「ｐ」の中に含有さ
れたｐ７４遺伝子である。ｐ７４はバクロウイルスの感
染の後期に比較的低いレベルで生産されるタンパク質で
ある。

【００３２】ｐ７４遺伝子のための相同体は、コリスト
ネウラ・フメイフェラナ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ
ｆｕｍｅｉｆｅｒａｎａ）ＮＰＶ（１６）およびオリ
ギイア・シュードツガタ（Ｏｒｙｇｙｉａ ｐｓｅｕｄ
ｏｔｓｕｇａｔａ）ＮＰＶを包含する他のＮＰＶにおい
て同定された（１７）。ｐ７４の相同体は核の多角体病
ウイルスの属のすべての構成員の中に存在するであろ
う。ＮＰＶおよび関係するグラニュローシスウイルス属
の生活環の間の類似性は、これらのＧＶがｐ７４に対し
て類似する性質をもつ遺伝子をエンコードする可能性を
高くする。

【００３３】このｐ７４遺伝子および付近のｐ１０遺伝
子を除去する大きい欠失は、幼虫に供給したとき感染性
ではない多角体を生産するウイルスを生ずる。ｐ１０遺
伝子単独における欠失は経口的に感染性の多角体の生産
を生ずるので、ｐ７４遺伝子の欠失はこの表現型の原因
となると考えられる（１５）。

【００３４】下の実施例１に記載するように、出願人は
今回トランスファーベクター（△ｐ７４−１と表示す
る）をつくり、これは野生型ゲノムで組み換えると、ｐ
７４遺伝子単独（△ｐ７４）の中の欠失を生ずる（図
３）。このトランスファーベクター△ｐ７４−１を収容
する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０１の試料は、出
願人により、１９９２年５月２１日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国
マリイランド州２０８５２ロックビレ、パークロウンド
ライブ１２３０１）に寄託され、そしてＡＴＣＣ受け入
れ番号６８，９８８を与えられた。出願人は、また、１
９９２年５月２１日にＡ４０００と表示するＡｃＭＮＰ
Ｖ株（ｐ７４遺伝子が欠失により崩壊されている）の試
料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託されそしてＡＴＣＣ受け入れ
番号ＶＲ２３７３を与えられた。下の実施例２に記載す
るように、幼虫に供給したとき非感染性であるＰＩＢを
生ずるのは、ｐ７４遺伝子をエンコードするＤＮＡセグ
メントの欠失であることを出願人は確証した。昆虫の血
体腔の中に注射したとき、出芽したウイルスはなお生産
され、そして感染性である。

【００３５】ＤＮＡセグメントの簡単な欠失は、ウイル
スの標的遺伝学的要素の機能を破壊するために使用する
変更の唯一の型ではない。この出願の目的に対して、遺
伝学的要素はトランス−作用性物質、例えば、ＲＮＡま
たはタンパク質分子をコードする遺伝子に限定されず、
また、シス−作用性の要素または調節配列、例えば、転
写エンハンサー、プロモーター、他の転写、翻訳および
ゲノムの複製のコントロール要素、およびウイルスのＤ
ＮＡ（またはＲＮＡ）パッケージング配列を包含する。

【００３６】変更は、フレームシフト、挿入、再配置、
再配置、点突然変異、または遺伝子機能の崩壊の他のタ
イプの形態を取る。タンパク質を早期に停止するか、あ
るいは変更された非機能的タンパク質を生ずるフレーム
シフトが包含される。遺伝子のタンパク質解読領域の中
への終止コドンの挿入または「ヘルパー」細胞系の中の
適当なサプレッサーｔＲＮＡの遺伝子の配置は、また、
本発明のは範囲内である。

【００３７】変更の他の形態は、ウイルスの機能を妨害
する方法、例えば、転写または翻訳の抑制、アンチセン
スＲＮＡの使用、ウイルスのゲノムの中への追加の遺伝
学的要素の挿入、および要求される調節要素をトランス
で準備することを包含する。この方法の１つの例は、Ｇ
ＡＬ４タンパク質に依存して酵母菌の上流の活性化物質
の使用である（ＵＡＳ_GAL）。

【００３８】ターゲッティングしたウイルスの遺伝子の
上流のＧＡＬ４応答性酵母菌の上流の活性化配列（ＵＡ
Ｓ_GAL）の配置は、ＧＡＬ４タンパク質の生産物に依存
する。「ヘルパー」細胞系は、後述する異種プロモータ
ーの１つののコントロール下にＧＡＬ４遺伝子のための
解読領域を含有する。他の可能なＵＡＳ要素、例えば、
酵母菌の交配型系の中の要素は本発明の範囲内に包含さ
れる。また、活性化のためにタンパク質の結合を必要と
する調節配列の要素、例えば、ステロイドの受容体およ
びそれらのＤＮＡ結合部位が包含される。

【００３９】また、特定のタンパク質の存在下にのみ機
能するプロモーターの使用は包含される。１つの例は、
転写の開始のためにＴ７特異的ＲＮＡポリメラーゼを必
要とするバクテリオファージＴ７のＴ７プロモーターで
ある。その自然のプロモーターの代わりにｐ７４遺伝子
の上流のＴ７プロモーターの配置は、ウイルス遺伝子の
転写をＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在に依存させる。こ
のウイルスのための「ヘルパー」細胞系は、異種プロモ
ーター、例えば、ＩＥ−１ウイルスのプロモーターのコ
ントロール下にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する。

【００４０】ｐ７４およびその機能的相同体に加えて、
変更したとき、組み換えウイルスの含有を生ずる追加の
遺伝子の機能が存在する（例えば、１４）。完全な感染
性ＯＢの生産に対して必須の機能に関係する遺伝子はこ
とに有用である。例は次のものを包含する：ＥＣＶの生
産からＯＢへのに調節のスイッチに関係する遺伝学的要
素、ウイルス粒子のアセンブリーまたは成熟を指令する
ために要求される機能をエンコードする遺伝子、および
ウイルス粒子の構造的タンパク質をエンコードする遺伝
子。

【００４１】本発明に従い変更される遺伝子のそれ以上
の例は、次のものを包含する：ＦＰ（わずかの多角体）
を生産する遺伝子、例えば、２５Ｋ遺伝子、ならびに崩
壊するとき所望の表現型に導く機能をもつ遺伝子、なら
びに後期および非常に後期の遺伝子の機能のために特異
的なウイルスの転写因子、多角体のエンベロープタンパ
ク質（３２〜３６．５ｋＤ）の遺伝子、中腸の受容体と
相互作用しそして中腸細胞の初期の感染の原因となるす
るＰＤＶタンパク質の遺伝子、ＰＤＶヌクレオキャプシ
ドのアセンブリーの原因となる遺伝子または遺伝学的要
素、多角体の有機化の原因となる遺伝子、およびＧＶに
おける見いだされるウイルス増強因子（１９）のＮＰＶ
機能的同等体をコードする遺伝子。

【００４２】多角体の遺伝子はまた変更することができ
るが、その使用に対して有意の実際的制限が存在するこ
とがある。多角体の遺伝子の転写／翻訳の高い速度と、
ウイルスの複製において起こるウイルスのゲノムの大き
い増幅との組み合わせは、感染した細胞における合計の
染色可能なタンパク質の５０〜７５％の到達する量の多
角体のタンパク質を生ずる。この大量のタンパク質は、
制限された数の多角体遺伝子のウイルス外のコピーが欠
失されたウイルスの多角体の遺伝子を補償できる可能性
をなくすることがある。しかしながら、多角体を含まな
いウイルスの相補は、より低いレベルで提供されること
のみが必要である、調節の要素または因子の使用により
達成することができるべきである。例はウイルスの多角
体遺伝子を操作してサプレッサーｔＲＮＡを含有するよ
うにすること、あるいは多角体遺伝子の調節要素を変更
しそして前述したように適当な「ヘルパー」細胞系また
は昆虫株の中で増殖することを包含する。

【００４３】多角体遺伝子に比較して、ｐ７４タンパク
質は非常に低いレベルで要求されるように思われる。遺
伝子はウイルスのゲノムが大量に増幅されたときウイル
スの感染において後期に転写されるが、ｐ７４特異的ｍ
ＲＮＡのレベルは比較的低い。限定された数のウイルス
外のコピーが経口的感染性に対するウイルスの相補のた
めに十分なｐ７４の機能を提供できるように、ｐ７４構
成体を操作することができるべきである。

【００４４】本発明をＡｃＭＮＰＶで例示する。ｐ７４
遺伝子に対して相同的機能を実施する遺伝子はバクロウ
イルスのＮＰＶおよびＧＶの群に属するすべてのウイル
スの中に存在すべきである。ＡｃＭＮＰＶに密接に関係
するバクロウイルスの種において、ストリンジェンシイ
が低い条件下にＡｃＭＮＰＶのｐ７４断片とハイブリダ
イゼーションさせることによって、ｐ７４遺伝子の相同
体を同定することができる。このアプローチはことに可
能である。なぜなら、ｐ７４遺伝子がより高度に保存さ
れたバクロウイルス遺伝子の１つであることを入手可能
なデータが示すからである（１６）。より遠くに関係す
るウイルス、例えば、ＧＶについて、このアプローチは
有効でないことがある。同定されたＡｃＭＮＰＶ遺伝子
に対して相同性の機能をエンコードする遺伝子を同定す
る別のアプローチは実施例１４に記載されている。この
組の実験において、既知の遺伝学的欠陥をもつＡｃＭＮ
ＰＶ株を問題のウイルスのゲノムの断片と一緒に共トラ
ンスフェクションする。欠陥の相補は問題の遺伝子を同
定する。このアプローチを使用して、ＡｃＭＮＰＶのｐ
３５のアポプトシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）阻害遺伝子
に対する機能的相同性をもつシジア・ポモネラ（Ｃｙｄ
ｉａ ｐｍｏｎｅｌｌａ）のグラニュローシスウイルス
の中の遺伝子の同定に成功した（２０）。

【００４５】他の方法を使用して追加の必須の後期の遺
伝子機能を同定することができる。最近、パサレリ（Ｐ
ａｓｓａｒｅｌｌｉ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）
（２１）は後期／非常に後期の遺伝子のための転写機能
を同定する方法を発表した。この方法において、ＡｃＭ
ＮＰＶのウイルスのゲノムの断片を、後期または非常に
後期のウイルスのプロモーターを使用してＣＡＴ遺伝子
の発現を推進する構成体と一緒に共トランスフェクショ
ンする。ウイルスの後期／非常に後期の遺伝子の通常の
転写に関係する遺伝子を含有するＡｃＭＮＰＶのゲノム
の断片を、バックグラウンドの後期／非常に後期の遺伝
子より上のＣＡＴ活性のそれらの刺激により同定する。

【００４６】ウイルスの昆虫感染性形態は、遺伝学的相
補性の技術により、変更された遺伝子機能を供給するこ
とによって生産される。変更されたウイルスのこの昆虫
感染性形態は宿主対宿主の伝染を容易に行わない。遺伝
学的相補性は、突然変異の表現型をトランスで存在する
とき野生型の表現型に変換する遺伝子の能力を呼ぶ。組
み換え昆虫ウイルスの昆虫感染性形態を生産する種々の
方法は、本発明の範囲内に包含される、すなわち：
（１）変更されたウイルスに欠けているか、あるいはそ
のウイルスにおいて欠損している生産物または機能を提
供するＤＮＡ断片でトランスフェクションされた昆虫組
織培養の細胞における生産；（２）変更されたウイルス
に欠けているか、あるいはそのウイルスにおいて欠損し
ている生産物または機能を提供するＤＮＡ断片で安定に
形質転換された昆虫の細胞系における生産；および
（３）変更されたウイルスに欠けているか、あるいはそ
のウイルスにおいて欠損している生産物または機能を提
供するＤＮＡ断片を含有するトランスジェニック昆虫に
おける生産。方法（１）または（２）において使用する
細胞系は、欠けている機能を提供し、こうして「ヘルパ
ー」細胞系として働く。

【００４７】例えば、ＡｃＭＮＰＶにおいてｐ７４遺伝
子は前述したように欠失されている。野生型ｐ７４遺伝
子は、次のようにしてちょうど上に記載した３つの方法
の特定の実施態様において、変更されたウイルスの欠陥
を相補する：（１）機能的ｐ７４遺伝子の染色体外のコ
ピーを含有する昆虫細胞の中でウイルスを増殖させる。
これらの染色体外のコピーは、ＤＮＡ断片、ｐ７４遺伝
子を含有するプラスミド、あるいは細胞分割の間にある
いはウイルスの感染に応答して複製することができるプ
ラスミドであることができる。（２）細胞のゲノムの中
に安定に組み込みまれたｐ７４遺伝子の１または２以上
の機能的コピーをもつ昆虫細胞系の中でウイルスを増殖
させる。（３）昆虫ゲノムの中にｐ７４遺伝子の１また
は２以上の機能的コピーを含有するトランスジェニック
昆虫の中でウイルスを増殖させる。

【００４８】すべての３つの方法において、機能的ｐ７
４遺伝子はＡｃＭＮＰＶからか、あるいはエウバキュロ
ウイルス亜科（Ｅｕｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅ）の族
の任意の他の構成員から、それが感染性を回復するかぎ
り、供給されることができる。主要な概念は、機能的ｐ
７４遺伝子がトランスで存在し、そして野生型の表現型
を再生する拡散可能な物質を提供するということであ
る。

【００４９】ウイルスの相補された形態を生産する１つ
の方法において、欠けている機能を提供する細胞系の中
でウイルスを増殖させる。例えば、△ｐ７４ウイルスは
ｐ７４遺伝子生産物を発現する細胞系の中で生産され
る。ＡｃＭＮＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ断片「ｐ」−−主と
してｐ７４遺伝子＋ＡｃＭＮＰＶ遺伝子の少量の自然フ
ランキング配列−−を含有するプラスミドを△ｐ７４ウ
イルスと一緒に共トランスフェクションすることによっ
て、ウイルスの感染性形態の再生は一時的基準で達成さ
れる。ちょうど記載したｐ７４遺伝子およびフランキン
グ配列を含有する、ＡＣ００２８．３と表示するこのプ
ラスミドを収容する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＨＢ１０
１の試料は、出願人により１９９２年５月２１日にアメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ受け入れ番号６
８，９８７を与えられた。この共トランスフェクション
における細胞の０．１〜５．０％のみが機能的ｐ７４遺
伝子および△ｐ７４ウイルスのゲノムの両者を含有する
ので、このは固有に非効率的である。

【００５０】「ヘルパー」細胞系をつくるより効率よい
方法はｐ７４遺伝子のコピーを細胞の中に挿入し、こう
して遺伝子が細胞のゲノムの中に安定に組み込まれるよ
うにすることである（参照、実施例６）。この手順はＳ
ｆ９昆虫細胞系の中にバクロウイルス以外の遺伝子を挿
入するために使用された（２２）。Ｓｆ９昆虫細胞系
（ＡＴＣＣ受け入れ番号ＣＲＬ １７１１）は、スポド
プテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕ
ｇｉｐｅｒｄａ）２１（Ｓｆ２１）の誘導体である。問
題の遺伝子のコピーを含有するプラスミドを選抜可能な
マーカーを含有するプラスミドと共トランスフェクショ
ンする。

【００５１】選抜可能なマーカーは、マーカー遺伝子、
ならびに問題の遺伝子を含有するベクターで形質転換し
た細胞の同定をその発現を可能とする遺伝子である。普
通に使用されている選抜可能なマーカーの例は、チミジ
ンキナーゼ（ＴＫ）およびハイポキサンチン−グアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、な
らびに抗生物質、例えば、ネオマイシンおよびヒグロマ
イシンに対する耐性を付与する遺伝子を包含する。

【００５２】選抜可能なマーカーを含有するＤＮＡに対
して２〜２０倍モル過剰の相補性ＤＮＡを使用する。こ
れにより、選抜可能なマーカーを発現する細胞がまた問
題の遺伝子を含有する可能性が最大となる。選択する細
胞系は使用しているウイルスについて許容性でなくては
ならない。ＡｃＭＮＰＶを使用する好ましい実施態様に
おいて、細胞系はＳｆ９またはＳｆ２１である。トラン
スフェクション後、細胞を選抜下に増殖させ、そして選
抜可能なマーカーを発現する細胞を増幅する。これらの
細胞系を△ｐ７４ウイルスの中のｐ７４の欠失を相補す
るそれらの能力についてスクリーニングする。

【００５３】この方法を使用して、プラスミドＡＣ００
２８．３、前述のｐ７４を含有するプラスミドのコピー
を含有するＳｆ９細胞系を分離する。細胞のゲノムの中
に安定に組み込まれたプラスミドＡＣ００２８．３のコ
ピーを含有する、Ｓｆ９（２８．３）ＣＬ−２と表示す
る細胞系の試料は、出願人により１９９２年４月７日に
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ
ｃｔｉｏｎ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ受け入れ番号
ＣＲＬ １１，３２２を与えられた。下の実施例７に記
載するように、上の細胞系の中の欠陥のある経口的に非
感染性の△ｐ７４ウイルスの増殖は経口的に感染性の△
ｐ７４ウイルスを生産することを出願人は確証した。

【００５４】相補性は細胞培養におけるウイルスの増殖
に限定されない。ちょうど「ヘルパー」細胞系をつくる
ことができるように、また「ヘルパー」昆虫株を生産す
ることができる。例えば、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐ
ｈｉｌａ）のＰ要素の形質転換は現在日常的であり、そ
して同様な系を任意の昆虫について設計することができ
る。さらに、昆虫のベクターのない形質転換は哺乳動物
において使用されるものに類似する技術を使用して達成
される。直接の注入（２３）または金属フィラメントを
使用する胚盤葉前の卵の弾道形質転換（２４）を使用し
て、必要な遺伝子を有する昆虫をつくることができる。

【００５５】比較的弱い内因性ｐ７４プロモーターはｐ
７４遺伝子の生産のために十分である。しかしながら、
ｐ７４遺伝子の生産を推進するためにより強いか、ある
いはより早いプロモーターを使用することが好ましいこ
とがある。異種プロモーターの使用は△ｐ７４ウイルス
の相補性の効率を改良することができるであろう。任意
の数のウイルスのプロモーターは使用に適する。例は、
６．９Ｋ（基本的タンパク質）のプロモーター、ＤＡ２
６プロモーター、多角体プロモーター、３５Ｋプロモー
ター、３９Ｋプロモーター、ｐ１０プロモーターおよび
ＩＥ−１プロモーターを包含する。

【００５６】異種プロモーターの構成体、例えば、実施
例４および５に記載するものの使用は追加の利点を有す
る。これらの構成体において、実施例１に記載するＡ４
０００の△ｐ７４ウイルスの中のｐ７４遺伝子における
欠失に対して５′のほとんどすべての相同性配列は除去
される。これは△ｐ７４ウイルスと細胞のゲノムの中に
組み込まれたｐ７４配列との間で起こる相同性の組み換
えの任意の選択を大きく減少するであろう。そうでなけ
れば、この相同性の組み換えは、ｐ７４の機能および野
生型の表現型のウイルスへの回復を生ずる（参照、実施
例７の説明）。相同性の組み換えの可能性を減少するそ
れ以上の工程は、△ｐ７４ウイルスのｐ７４遺伝子の中
の欠失の大きさを増加して、解読配列が残らないように
することである。これは実施例１におけるプロトコルを
修飾することによって容易に達成される。

【００５７】異種プロモーターはウイルスのプロモータ
ーに限定されない。細胞のプロモーターはまた適当であ
る。細胞のプロモーターの限定されない選択が存在しな
い。例はボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒ
ｉ）アクチンのプロモーターおよびドロソフィラ・メラ
ノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａ
ｓｔｅｒ）ｈｓｐ７０のプロモーターを包含する。すぐ
れたプロモーターは、ウイルスの感染の間に適当な昆虫
の細胞の中で中程度から高いレベルで発現する。これら
の特性は昆虫のプロモーターに限定されない。種々の脊
椎動物、酵母菌、あるいはウイルスの他のクラスからの
プロモーターはこれらの基準に合致する。前述のプロモ
ーターのいずれも、また、選抜可能なマーカーの発現を
推進する。本発明の他の実施態様において、昆虫のコン
トロールまたは修飾する物質のための異種遺伝子をウイ
ルスのゲノムの中に挿入する。この物質は、例えば、毒
素、神経ペプチド、またはホルモン、または酵素であ
る。とくに、異種遺伝子をいウイルスの遺伝学的要素の
変更部位に直接挿入し、このことはほとんどの場合にお
いて遺伝学的に変更されたウイルスと重感染する野生型
ウイルスとの間の組み換えが野生型機能および挿入され
た異種遺伝子をもつウイルスを発生しないであろうこと
を意味する。異種遺伝子および変更された遺伝学的要素
の分離がウイルスの子孫の１０％より小において起こる
ように、ウイルスの遺伝学的要素の変更部位に隣接して
異種遺伝子を挿入することは、また、本発明の範囲内に
包含される。したがって、遺伝子操作したウイルスの含
有は両者の場合において維持される。

【００５８】このような毒素は、サソリのアンドロクト
ヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕ
ｓｔｒａｌｉｓ）からの昆虫特異的毒素ＡａＩＴ（２
５）、ダニの種ピエモエス・トリチシ（Ｐｙｅｍｏｔｅ
ｓ ｔｒｉｔｉｃｉ）からの（２）毒素、バシルス・ス
リンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉ
ｅｎｓｉｓ）ｓｕｇｓ．アイザワイ（ａｉｚａｗａｉ）
（ＢＴＫ）の毒素（４）、クモの毒液から分離された毒
素（２６）およびバシルス・スリンギエンシス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＣｒｙＩＶ
Ｄ（ＢＴＩ）毒素（３）を包含する。この手順に使用可
能なこのような神経ペプチドまたはホルモンの例は、羽
化ホルモン（６）、前胸腺刺激ホルモン（ＰＴＴＨ）、
脂質動員ホルモン、利尿ホルモンおよびプロクトリン
（ｐｒｏｃｔｏｌｉｎ）（５）を包含する。このような
酵素の例は幼若ホルモンエステラーゼ（ＪＨＥ）である
（７）。

【００５９】欠陥のあるまたは欠失されたｐ７４遺伝子
およびまたｐ７４遺伝子変更部位の中に挿入された毒素
をコードする異種遺伝子を有する組み換えバクロウイル
スは、標的昆虫に対する効能が増加しているが、環境に
おいて１つの昆虫から他の昆虫に伝染することができる
ウイルスを生ずる。

【００６０】実施例１１〜１２に後述するように、Ａｃ
ＭＮＰＶウイルスが分離され、ここでウイルスのＤＡ２
６プロモーターのコントロール下に、昆虫特異的サソリ
毒素ＡａＩＴが△ｐ７４ウイルスＡ４０００の中の欠失
部位の中に挿入されている。Ａ４００１と表示するこの
ウイルスの試料は、出願人の譲受人により１９９３年４
月７日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、そしてＡＴＣＣ受け入
れ番号ＶＲ２４５０を与えられた。野生型Ｓｆ９細胞の
中のこのウイルスの増殖は、非経口的感染性ＰＩＢの生
産を生ずる（期待するように）。このウイルスは前述の
ヘルパー細胞系Ｓｆ９（２８．３）ＣＬ−２の中で増殖
するとき、生ずるＰＩＢは経口的に感染性であり、そし
て感染した昆虫はＡａＩＴ毒素の特徴を示す収縮性麻痺
を示す（参照、下の実施例１２）。

【００６１】機能的ｐ７４遺伝子生産物を供給する細胞
系またはトランスジェニック昆虫の中でこのウイルスを
増殖すると、このウイルスは消化管を通して昆虫を感染
することができるようになる。しかしながら、それ以上
の相補性が存在しないので、昆虫の自然の集団は経口的
感染性を欠く。こうして、同時感染性野生型ウイルスの
不存在下に、組み換えウイルスの生活環はこの単一の感
染で終わる。これはバクロウイルスを使用する発表され
たアプローチ（２）と対照的であり、ここで、感染した
昆虫の死後、ＯＢは環境の中に解放され、ここでＯＢは
他の昆虫により摂取され、そしてウイルスの生活環は反
復され、こうして宿主対宿主の伝染は起こる。

【００６２】多分本発明において最も重要なことには、
ウイルスの遺伝学的要素の変更部位に対して隣接して、
あるいは直接その中に毒素、神経ペプチドまたはホルモ
ン、または酵素のための異種遺伝子を配置することは、
この遺伝子操作されたウイルスと野生型ウイルスとの間
の相同的組み換えがもとの親の遺伝子型をはじめて再生
することを意味する。

【００６３】例えば、ｐ７４の欠失された領域の中への
毒素遺伝子の挿入は毒性＋／感染性ＯＢ−であるウイル
スをつくる。野生型との組み換え（毒素−／感染性ＯＢ
＋）ウイルスは毒素＋／感染性ＯＢ−および毒素−／感
染性ＯＢ＋の子孫のみを生ずるであろう。毒性＋／感染
性ＯＢ＋の子孫を生ずる相同的組み換えのための組み換
えの事象は防止される。なぜなら、遺伝子の欠失および
挿入は、ウイルスのゲノム上の異なる位置のかなり離れ
た位置よりむしろ、同一の部位で起こるからである。し
たがって、毒素の遺伝子は感染性ＯＢの生産について遺
伝学的に欠陥のあるウイルスの中にのみ見いだされるで
あろう。毒素のための異種遺伝子のこの含有は維持さ
れ、そして感染性ウイルスは、子孫のウイルスを発生す
る能力が減少しているために、野生型ウイルスより急速
に生態系から消失するであろう。

【００６４】本発明をよりよく理解することができるよ
うに、以下の実施例を記載する。実施例は例示のみを目
的とし、そして本発明の範囲を限定しない。

【００６５】

【実施例】標準の分子生物学の技術をサムブルック（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ）ら（２７）に記載されているプロトコ
ルに従い利用する。バクロウイルスの増殖および生産の
標準の技術をサンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）およびスミ
ス（Ｓｍｉｔｈ）（２８）に記載されているプロトコル
に従い利用する。さらに、「命名した」ＡｃＭＮＰＶ制
限断片に対するすべての言及はサンマーズ（Ｓｕｍｍｅ
ｒｓ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）（２８）に発表され
たＡｃＭＮＰＶのＥ２の物理地図に基づく。 実施例１ トランスファーベクター△ｐ７４−１および組み換えウ
イルスＡ４０００の構成 オウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ
ａ ｃａｌｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＥ２株からバクロ
ウイルスのゲノムのほぼ地図単位９０でｐ７４遺伝子を
欠失する目的で、トランスファーベクター△ｐ７４−１
を構成する（参照、図１）。ｐ７４をエンコードするＤ
ＮＡを含有するＢｓｔＥＩＩ断片「Ｅ」をＥ２株のウイ
ルスＤＮＡから精製する。この断片をｐＳＥ２８０プラ
スミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニ
ア州サンジエゴ）のＢｓｔＥＩＩ部位の中にサブクロー
ニングする。このクローンをＬＢ１０．２と表示する。
ＮｃｏＩで切断し、このＮｃｏＩ部位をＴ４ＤＮＡポリ
メラーゼで平滑末端とし、ＸｈｏＩで切断しそして生ず
る断片をゲル精製することによって、ＬＢ１０．２から
ｐ７４の５′領域＋５′フランキング配列をエンコード
する断片を分離する。このＸｈｏＩに対してＮｃｏＩ平
滑末端連結した断片を、平滑末端連結したＫｐｎＩ部位
とプラスミドＬＢ９．６のＸｈｏＩ部位との間にサブク
ローニングする。プラスミドＬＢ９．６はブルースクリ
プト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫプラスミド（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ）の誘導体
であり、その中にポリリンカーをＨｉｎｃＩＩ部位に挿
入する。このリンカーはｐ７４欠失領域の中への異種遺
伝子の挿入のために有用な追加の独特制限酵素部位を含
有する（下を参照）。前述の５′フランキング配列およ
び５′ｐ７４配列を含有する生ずるプラスミドをＬＢ１
１．１２と表示する。遺伝子の３′の１／３および３′
フランキング配列をエンコードするｐ７４のＨｐａＩ−
ＢａｍＨＩ断片を分離し、そしてＬＢ１１．１２のＥｃ
ｏＲＶ部位とＢａｍＨＩ部位との間にクローニングす
る。生ずるクローンはトランスファーベクター△ｐ７４
−１（参照、図２）。このトランスファーベクターは４
７５０塩基対（ｂｐ）の５′フランキング配列、ｂｐ１
−６９のｐ７４配列、６４ｂｐの前述のプラスミドのポ
リリンカー、ｂｐ１２８７から１９３７における終止コ
ドンまでのｐ７４配列、および１７９６ｂｐの３′フラ
ンキング配列をエンコードする（１５）。図３はｐ７４
の解読領域を詳細に描写する。次いで、このトランスフ
ァーベクターを使用して、標準の共トランスフェクショ
ン手順（２９）によりウイルスのＡ４０００株を構成す
る。２×１０⁶Ｓｆ９細胞を６０ｍｍの組織培養皿上に
接種する。細胞の取り付け後、培地を細胞から除去し、
そして１０％の胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）＋抗生物質を
有するグレイス（Ｇｒａｃｅ）培地の０．７５ｍｌと置
換する。１μｇのＡｃＭＮＰＶのＤＮＡ＋２μｇの△ｐ
７４−１のＤＮＡを０．７５ｍｌのトランスフェクショ
ン緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１、１４０
ｍＭのＮａＣｌ、１２５ｍＭのＣａＣｌ₂）に添加す
る。次いでＤＮＡを細胞に滴々添加し、そして細胞を２
７℃において４時間インキュベーションする。４時間
後、培地を除去し、そして細胞を新鮮なＴＮＭＦＨ＋１
０％のＦＣＳおよび抗生物質で注意してすすぐ。次い
で、細胞に再び新鮮なＴＮＭＦＨ＋１０％のＦＣＳおよ
び抗生物質を供給する。４〜５日後、ＥＣＶを収獲し、
そして個々のプラークをサンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）
およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）（２８）に記載されている
プラークアッセイにより分離する。

【００６６】次いで、個々のプラークを使用して４８ウ
ェルの組織培養プレートの単一のウェルを感染し、これ
にまず０．５ｍｌの新鮮なＴＮＭＦＨ培地中の７．５×
１０ ⁴Ｓｆ９細胞を接種する。５日後、行または列の各
ウェルからの出芽したウイルスを含有する上澄み液の１
０μｌからプールをつくる。図３に示すように、４μｌ
のプールした上澄み液およびオリゴマーＡおよびＣを使
用してＰＣＲ反応を構成する。オリゴＣは欠失したｐ７
４に対して特異的であるので、断片は組み換えウイルス
を含有する反応においてのみ増幅する。ＰＣＲ反応は次
のようにして構成する：１×緩衝液Ａ（１０ｍＭのトリ
ス（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、０．１μｇ／ｍ
ｌのゼラチン、０．４５％のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅ
ｔ^R）Ｐ４０（Ｓｈｅｌｌ Ｏｉｌ Ｃｏ．）、および
０．４５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ^R）２０（ＩＣＩ
Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．））を含有する２５μｌの
反応混合物中でストレプトミセス・グラセウス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）からの非特異的
プロテアーゼの２００μｇ／ｍｌで、４ｍｌのプールし
た上澄み液をまず消化する。次いで非特異的プロテアー
ゼを９５℃に１２分間加熱することによって不活性化す
る。ＰＣＲ増幅は、２００μＭの４つのｄＮＴＰ（ｄＡ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、１．５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂、１×緩衝液Ａおよび１．２５単位のア
ンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ^R）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、コネチカッ
ト州ノーウォーク）を含有する反応混合物中で、プロテ
アーゼ処理したウイルスを５ｐｍｏｌの特定したオリゴ
ヌクレオチドのプライマーの各々と混合することから成
る。試料を３０サイクルの増幅にかけ、各サイクルは９
４℃で１分（変性工程）、５５℃で１．５分（アニーリ
ング工程）、および７２℃で２．５分（伸長工程）から
成る。２５サイクルに引き続いて７２℃で７分の伸長工
程を実施する。２０μｌの反応混合物を１．２％のアガ
ロースゲル上で電気泳動させて、組み換えウイルスの存
在を確証する。試料を行および列でプールするので、組
み換えウイルスを陽性の行および陽性の列の両者に対し
て共通のウェルにより同定する。

【００６７】実施例２ ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒ
ｅｓｃｅｎｓ）についての葉のディスクのアッセイにお
けるＡ４０００の表現型の証明 標準の葉のディスクのアッセイを第３齢のヘリオチス・
ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎ
ｓ）の幼虫について実施して、Ａ４０００ウイルス株の
感染性を試験する。ＴＥＴ緩衝液（５０ｍＭのトリス−
ＨＣｌ、ｐＨ７．５／１０ｍＭのＥＤＴＡ／０．１％の
トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ^R）Ｘ−１００（Ｒｏｈｍ ａ
ｎｄ Ｈａａｓ、ペンシルベニア州フィラデルフィ
ア））中のウイルスを含有する１μｌの滴（規定した投
与量のＰＩＢを有する）を、前以て湿潤させた濾紙のデ
ィスク（ほぼ４ｍｍの直径−３０μｌの水）を含有する
個々のウェルの中の５ｍｍのワタの葉のディスクに添加
する。滴が乾燥した後、単一の幼虫をウェルの中に配置
し、そしてウェルを閉じる。幼虫に一夜餌を食べさせ
る。次の朝、葉のディスクの全体を消費する幼虫を昆虫
の食物を含有する個々のウェルに移す。生き残る幼虫が
サナギになるまで幼虫を致死率について監視する。サナ
ギになる対照として使用する、Ａ４０００と表示する野
生型Ｅ２のＡｃＭＮＰＶウイルスの株を使用してこの手
順を反復する。２つの別々の試験の結果は次の通りであ
る：

【００６８】

【表１】

【００６９】これらの結果が証明するように、ｐ７４遺
伝子の欠失を含有するウイルスは、完全なｐ７４遺伝子
を含有する感染性ウイルスより１０，０００倍高い投与
量でさえ、感染性ではない。Ａ４０００で見られた１匹
の幼虫の死亡は通常のルートの感染のためであると信じ
られられない。

【００７０】実施例３ ＡｃＭＮＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ断片「Ｐ」の非安定に組
み込まれたコピーを含有する細胞系の中の増殖による非
感染性形態のウイルスを生産するＡ４０００の相補性 Ｓｆ９細胞を実施例１に記載する標準のプロトコルによ
り共トランスフェクションする。１０倍モル過剰のＡＣ
００２８．３プラスミドＤＮＡを含むゲノムのウイルス
のＤＮＡおよび含まないＤＮＡの１μｇをこのトランス
フェクションにおいて使用する。ＡＣ００２８．３はブ
ルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＫＳＩＩ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ）のＨ
ｉｎｄＩＩＩ部位の中に挿入されたＡｃＭＮＰＶのＨｉ
ｎｄＩＩＩ断片「Ｐ」から成る。ＨｉｎｄＩＩＩ断片
「Ｐ」は、ＡｃＭＮＰＶのＢｓｔＥＩＩ断片「Ｅ」の一
部分として、図２の上部に示されている。この断片は２
２１ｂｐの５′フランキング部位および５６ｂｐの３′
フランキング配列をもつ全体のｐ７４解読配列を含有す
る。４８時間後、低速遠心および引き続くＴＥＦ緩衝液
中の再懸濁により、多角体を感染した細胞から収獲す
る。ＳＤＳを再懸濁させたウイルスに１％の最終濃度に
添加する。細胞のＤＮＡは激しい混合および試料のピペ
ット作用により剪断する。ＳＤＳを含まないＴＥＴ緩衝
液の中のＰＩＢのある数の順次の洗浄、および引き続く
低速遠心を使用して、細胞のＤＮＡを除去する。最後
に、ＰＩＢをＴＥＴ緩衝液の中に再懸濁させ、そしてア
ッセイのために血球計で計数する。実施例２に記載する
ようにバイオアッセイを実施する。１×１０⁵のＰＩＢ
の投与量において、Ａ４０００のＤＮＡ単独でトランス
フェクションしたＳｆ９細胞からの多角体は幼虫を死亡
させなかった。Ａ４０００およびＡＣ００２８．３のＤ
ＮＡで共トランスフェクションしたＳｆ９細胞からのＰ
ＩＢは感染性ウイルスのために幼虫を死亡させた。した
がって、機能的ｐ７４タンパク質を提供する細胞の中の
Ａ４０００ウイルスの増殖（ＡＣ００２８．３プラスミ
ドの存在のために）は、昆虫の感染性Ａ４０００ウイル
スを生ずる。このウイルスは幼虫の中で生産的感染を確
立することができる。この結果は死亡した幼虫からＰＩ
Ｂを収獲することによって確証される。底を除去しそし
てニテックス（Ｎｙｔｅｘ^R）（Ｔｅｔｋｏの商標、ニ
ューヨーク州ブリアルクリッフンメイナー）と置換した
カップの中に、死体を配置することによってＰＩＢを収
獲する。次いでＴＥＴ緩衝液を死体の上にかけ（１ｍｌ
／幼虫）、そしてＰＩＢを含有する貫流を集める。これ
らのＰＩＢをＴＥＴ緩衝液＋１％のＳＤＳの中に再懸濁
させ、混合しそして低速で回転する。次いでＰＩＢをＳ
ＤＳを含まないＴＥＴ緩衝液で数回洗浄する。ＤＮＡを
これらのＰＩＢからサンマーズ（Ｓｕｍｍｅｒｓ）およ
びスミス（Ｓｍｉｔｈ）（２８）の第３５ページに記載
されているように調製する。実施例１に記載するように
オリゴマーを使用するＰＣＲ増幅により、これらの死亡
した幼虫の中の△ｐ７４ウイルスの存在が確証される。

【００７１】実施例４ 異種プロモーターを含有する発現ベクターの構成 ｐ７４遺伝子の発現を推進するための異種プロモーター
の使用は、△ｐ７４ウイルスの相補性の効能を増加する
ことができる。この使用のための便利な発現ベクターは
次のモジュールから成る：（１）転写を調節するために
使用する、異種プロモーターのモジュール；（２）発現
しようとするＤＮＡ配列の挿入を促進する、ポリリンカ
ーのモジュール；および（３）一次的転写プロセシング
およびポリアデニル化のための部位を提供する、３′Ｕ
ＴＲ（参照、図４）。このような発現ベクターは、Ａｃ
ＭＮＰＶのＤＡ２６遺伝子のプロモーター、ポリリンカ
ー、およびＡｃＭＮＰＶの６．９ｋの基本的タンパク質
の３′ＵＴＲから成り、ｐＭＥＶ１と表示する。ＡＣ０
０６４．１と表示する特定のｐＭＥＶ１分離物を収容す
る大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株の試料は、出願人
の譲受人により１９９３年４月７日にアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄
託され、そしてＡＴＣＣ受け入れ番号６９２７５を与え
られた。

【００７２】ｐＭＥＶ１のＰｓｔＩ／ＸｂａＩ断片を含
有するプロモーターを、ＡｃＭＮＰＶの６．９Ｋ（ｐＭ
ＥＶ２）、多角体（ｐＭＥＶ３）および３５Ｋ（ｐＭＥ
Ｖ４）ウイルスの遺伝子のプロモーターを含有するＰｓ
ｔＩ／ＸｂａＩ消化した断片と置換することによって、
追加のベクターを容易に調製することができる。

【００７３】これらのベクターの構成に使用するプロモ
ーター断片は、プロモーター特異的対のオリゴヌクレオ
チドのプライマーを使用するクローニングしたウイルス
のＤＮＡのＰＣＲ増幅により形成する。増幅したプロモ
ーターのセグメントが次の一般構造を有するように、プ
ライマーを設計する：（１）制限エンドヌクレアーゼＳ
ｓｔＩ、Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳｔｕＩ（その順序
で）のための認識部位をもつ５′末端の２２ｂｐのヘテ
ロポリマーの合成配列；（２）遺伝子の主要な転写開始
部位より１００−２５０ｂｐ上流の点から５′ＵＴＲの
３′末端（すなわち、翻訳開始コドンに関して位置−
１）まで延びるウイルスのＤＮＡのセグメント；および
（３）制限エンドヌクレアーゼＥｓｐ３ＩおよびＸｂａ
Ｉ（その順序で）のための認識部位をもつ３′末端の２
３ｂｐのヘテロポリマーの領域。Ｅｓｐ３Ｉ制限部位の
位置および向きは、（＋）鎖において−５と−４との間
にそして（−）鎖において位置−１と＋１との間に切断
部位を配置する。

【００７４】３５Ｋプロモーターの調製に使用する鋳型
はＡｃＭＮＰＶのＨｉｎｄＩＩＩ断片「Ｋ」である。
（＋）鎖のプライマーの配列は、制限酵素ＳｓｔＩ、Ｓ
ｓｅ８３８７ＩおよびＳｔｕＩのための位をもつ２２ｂ
ｐのヘテロポリマーの配列および−３９９〜−３８２の
３５Ｋの５′配列を含有する。（−）鎖のプライマーは
−２１〜−１の３５Ｋの５′配列、引き続いて制限酵素
Ｅｓｐ３ＩおよびＸｂａＩのために部位をもつ２３ｂｐ
のヘテロポリマーの領域を含有する。各増幅反応のため
に、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ
のＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０μＭのｄＮＴ
Ｐ、１００μｇ／ｍｌのゼラチンおよび２．５単位のア
ンプリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ^R）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、コネチカッ
ト州ノーウォーク）を含有する５０μｌの反応混合物の
中で、５０ｐｍｏｌの適当なプライマーの対を２５０ｐ
ｇの鋳型ＤＮＡを混合する。試料を２５サイクルの９４
℃で１分（変性工程）、５５℃で１．５分（アニーリン
グ工程）、および７２℃で３．０分（伸長工程）を通し
て増幅する。他の反応において、７分を最後の工程に付
加する。

【００７５】ＥＤＴＡを１０ｍＭにそしてサルコシル
（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）（ナトリウムＮ−ラウロイルサル
コシン）を０．２％（ｗ／ｖ）に添加することによっ
て、各反応を停止させる。次いで生産物をクロロホルム
で１回、フェノール：クロロホルムで１回抽出し、そし
てエタノールで沈澱させる。ＤＮＡ試料を適当な緩衝液
の中に再溶解し、次いでＰｓｔＩ（これはＳｓｅ８３８
７Ｉ部位の中央の６塩基対［ＣＴＧＣＡ↓Ｇ］を認識す
る）およびＸｂａＩで消化する。次いで各推定上のプロ
モーター断片を１．２％の低融点のアガロースゲル上の
ゲル電気泳動により精製し、そしてｐＭＥＶ１から調製
した３．２ｋｂのＰｓｔＩ／ＸｂａＩベクター断片に結
合する。この断片はポリリンカーのモジュール、３′Ｕ
ＴＲのモジュールおよびｐＭＥＶ１のブルースクリプト
（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ＋フレームワークを含有
する。所望の組み換え体を制限酵素の分析およびＤＮＡ
配列の決定により同定する。当業者は、その配列が入手
可能である任意のプロモーター領域、例えば、ＡｃＭＮ
ＰＶの６．９Ｋのプロモーター、多角体のプロモータ
ー、または細胞のプロモーター、例えば、ドロソフィラ
・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎ
ｏｇａｓｔｅｒ）ｈｓｐ７０のプロモーターについてこ
の手順を二重反復実験することができる。

【００７６】実施例５ 異種プロモーター−ｐ７４の解読領域の構成体の構成 ＡＣ００２８．３の適当な領域のＰＣＲ増幅により、異
種プロモーターを含有する発現ベクター（実施例４に記
載するように）の中への挿入のために、ｐ７４のタンパ
ク質解読領域を分離する。この反応において使用する２
４ｂｐの（＋）−鎖のプライマーは、ｐ７４遺伝子のＡ
ＴＧ翻訳開始部位に５′末端を有する。（−）−鎖のプ
ライマーは２９ｂｐの長さであり、そしてＴＡＡ翻訳停
止コドンで終わる２０ｂｐの３′ｐ７４配列、および引
き続くＢａｍＨＩを包含する９ｂｐの追加の配列から成
る。ＰＣＲの条件は、２００μＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、１．５ｍＭ
のＭｇＣｌ₂、１×緩衝液Ａおよび１．２５単位のアン
プリタク（ＡｍｐｌｉＴａｑ^R）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、コネチカッ
ト州ノーウォーク）を含有する５０μｌの反応混合物の
中で、２５０ｐｍｏｌのＡＣ００２８．３を５０ｐｍｏ
ｌの特定したオリゴヌクレオチドのプライマーと混合す
ることから成る。試料を５ラウンドの増幅にかけ、各サ
イクルは９４℃で１分（変性工程）、５５℃で１．５分
（アニーリング工程）、および７２℃で２．５分（伸長
工程）から成り、引き続いて２５ラウンドの増幅にか
け、各サイクルは９４℃で１分（変性工程）、５５℃で
１．５分（アニーリング工程）、および７２℃で２．５
分（伸長工程）から成る。サイクルに引き続いて７２℃
で７分の伸長工程を実施する。

【００７７】精製後、反応生成物をすべての４つのｄＮ
ＴＰの存在下にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片
（２７）で処理して、ＰＣＲ生産物が平滑末端を有する
ことを確実にする。次いでｐ７４解読領域の３′末端を
ＢａｍＨＩで消化し、そして生ずる断片を１％の低融点
のアガロースゲル上の電気泳動により精製する。次い
で、この断片を実施例４に記載するいくつかの発現ベク
ターの任意のものの中にクローニングする。ｐ７４遺伝
子の挿入のための発現ベクターを調製するために、各ベ
クターをＥｓｐ３Ｉで消化し、そして生ずる５′の突起
する末端を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラー
ゼＩ（クレノー断片）の作用によりすべての４つのｄＮ
ＴＰの存在下にフィルインする。次いで各調製物をＢａ
ｍＨＩで消化する。ベクターを１％の低融点のアガロー
スゲル上の電気泳動により遊離したポリリンカー断片か
ら分離し、そして別の反応においてｐ７４をエンコード
する遺伝子断片に結合する。

【００７８】実施例６ 細胞のゲノムの中に組み込まれたｐ７４遺伝子の機能的
コピーを含有する安定なＳｆ９細胞系の分離 この実施例において、細胞のゲノムの中に安定に挿入さ
れたｐ７４遺伝子を含有する構成体を有するＳｆ９細胞
の誘導体をジャルビス（Ｊａｒｂｉｓ）ら（２２）に記
載されているように分離する。詳しくは、ＡＣ００２
８．３と表示するプラスミド（ＡＴＣＣ ６８，９８
７）を使用する。このプラスミドは、ｐ７４遺伝子＋少
量の自然のフランキング配列を含む、ＡｃＭＮＰＶのＨ
ｉｎｄＩＩＩ断片「Ｐ」を含有する。第１に、Ｓｆ９細
胞を２μｇのＡＣ００２８．３プラスミドＤＮＡおよび
１μｇのプラスミドＩＥ−１ＮｅｏのＤＮＡの混合物と
共トランスフェクションする（２２）。トランスフェク
ション後、細胞を２８℃において２時間インキュベーシ
ョンする。細胞を完全なＴＮＭＦＨ培地（２７）で洗浄
した後、細胞を再び供給しそして２８℃において２２時
間インキュベーションする。次いで細胞を低い密度でプ
レートして希薄に接種された培養物を発生させ、そして
再び完全なＴＮＭＦＨ＋０．５ｍｇ／ｍｌ（活性成分に
基づく）のネオマイシン類似体Ｇ４１８（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ、ニューヨーク州グランドアイランド）を供給す
る。次いで細胞を２８℃において１週間インキュベーシ
ョンする。１週の終わりに、培地をＧ４１８を含まない
完全なＴＮＭＦＨに交換する。３つの別々のプレートの
各々について、次の手順を使用する。生き残る細胞を収
獲し、そして増殖する。細胞の３つの増殖した組は、Ｓ
ｆ９（２８．３）ＣＬ−１、Ｓｆ９（２８．３）ＣＬ−
２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１，３２２）およびＳｆ９
（２８．３）ＣＬ−３と表示する安定な細胞系である。
これらの混合した集団を増殖させ、次いで、図３に示す
ように、ｐ７４の（＋）鎖に対して特異的なオリゴマー
（オリゴマーＡ）およびＡ４０００ウイルスの中のｐ７
４遺伝子が欠けている領域に対して特異的なオリゴマー
（オリゴマーＢ）を使用して、ＰＣＲによりｐ７４遺伝
子の存在について検査する。

【００７９】実施例７ 上の細胞系の中の増殖による昆虫感染性Ａ４０００ウイ
ルスの生産および表現型の証明 実施例１に記載するように分離した３つの細胞系の各々
に、Ａ４０００ウイルスで１より大きいＭＯＩで感染さ
せる。生産は約０．０１〜２０の範囲のＭＯＩで実施す
ることができる。標準の葉のディスクのアッセイ（参
照、実施例２）を実施する。３つの別々の実験の結果を
下に記載し、ここでＡ１０００ウイルスはＡｃＭＮＰＶ
の野生型Ｅ２株である：

【００８０】

【表２】

【００８１】このデータから理解することができるよう
に、プラスミドＡＣ００２８．３で安定に形質転換され
たＳｆ９細胞をＡ４０００ウイルスで感染するとき、生
ずるＰＩＢはここで経口的に感染性である。対照的に、
Ａ４０００感染した親の非形質転換Ｓｆ９細胞からのＰ
ＩＢは幼虫を死亡させない。これが意味するように、機
能的ｐ７４タンパク質を提供する細胞の中のＡ４０００
ウイルスの増殖（実施例６に記載するように機能的ｐ７
４遺伝子構成体の安定な組み込みのために）は昆虫感染
性Ａ４０００ウイルスの生産を生ずる。Ｓｆ９（２８．
３）ＣＬ−３細胞系の継代６における相補性の損失の理
由は知られていない。

【００８２】次に、上の試験１における相補性ウイルス
により殺された２匹の幼虫から個々に収獲したＰＩＢか
らＤＮＡ調製する（実施例３およびサンマーズ（Ｓｕｍ
ｍｅｒｓ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）（２８）の第３
５ページに記載されているように）。△ｐ７４ウイルス
の存在についてアッセイするためにプライマーＡおよび
Ｃを使用し、そして野生型ウイルスの存在についてアッ
セイするためにプライマーＡおよびＣを使用するＰＣＲ
増幅（プライマーについて図３参照）を実施例１に記載
されているように実施する。結果が証明するように、す
べての２０匹の幼虫は△ｐ７４ウイルスで感染される。
△ｐ７４ウイルスについての陽性のシグナルに加えて、
２０匹の幼虫のうちの５匹は完全なｐ７４遺伝子の存在
に対して特異的な強いＰＣＲバンドを示す。試験１から
の２０匹の幼虫のうちの１８匹から分離されたＰＩＢを
使用して、葉のディスクのアッセイ（参照、実施例２）
を実施する。１×１０⁵ＰＩＢ／幼虫の投与量および３
２匹の被検幼虫を各試料について使用する。完全なｐ７
４遺伝子の存在について陽性のシグナルを有する検査し
た４匹の幼虫のみがバックグラウンドより上の致死率を
生成する。欠失されたｐ７４遺伝子の存在についてのみ
陽性であると試験された検査した１４匹のいずれも、バ
ックグラウンドより上の幼虫の致死率を引き起こさな
い。

【００８３】次により拘束されないが、これらの結果は
２つの原因のうちの１つのためであろう。相補されたウ
イルスの試料が野生型ウイルスで汚染されているか、あ
るいは初期の試験（試験１）からの幼虫のあるものが野
生型ウイルスを収容しそして、△ｐ７４ウイルスで重感
染するとき、野生型ウイルスおよび△ｐ７４ウイルスの
両者がこれらの幼虫からのＰＩＢ調製物の中に存在する
ということが、より直接の理由であろう。別の説明は次
の通りである。すなわち、相補性細胞系の中で△ｐ７４
ウイルスが増殖する間、相同的組み換えがウイルスと細
胞のゲノムの中に組み込まれたｐ７４配列との間で起こ
る。これが低いレベルで起こる場合、相補されたウイル
スから死亡する幼虫のあるものみは、また、野生型ウイ
ルスを含有するであろう。この野生型ウイルスはアッセ
イの第２ラウンドので経口的に感染性であろう。本発明
の構成体において、△ｐ７４ウイルスと細胞のゲノムの
中に組み込まれたｐ７４配列との間において欠失に対し
て５′に２８４ｂｐの相同性が存在し、そして７１３ｂ
ｐの相同性が欠失に対して３′に存在する。別の説明が
正しい場合、この結果はウイルスと細胞系との間に存在
する相同的配列の量を減少するか、あるいは必要に応じ
て排除することによって回避することができる。

【００８４】実施例８ 昆虫のゲノムの中に安定に組み込まれたｐ７４遺伝子の
機能的コピーを含有するトランスジェニック昆虫の構成 この実施例において、タングステン粒子を介するＤＮＡ
の弾道的導入を使用してトランスジェニック昆虫の株を
構成する（２４）。胚注入緩衝液（０．１ｍＭのリン酸
ナトリウム、ｐＨ６．８、５ｍＭのＫＣｌ）中の、実施
例５に記載するｐ７４構成体の１つのについて２０〜１
００μｇのＤＮＡを、直径１．２ｍｍのタングステン粒
子（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）
上に沈澱させる。沈澱反応の合計の体積は６５μｌであ
る。沈澱後、５０μｌの上澄み液を除去する。ペレット
および１２〜１５μｌの上澄み液を激しく混合した直後
に、マイクロ投射体へ８μｌを適用する。バイオリステ
ィイクス（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）生物粒子のデリバリ
ーシステム（ＤｕＰｏｎｔ、デラウェア州ウィルミント
ン）を使用して、デコリオネイテッド（ｄｅｃｈｏｒｉ
ｏｎａｔｅｄ）トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｏｐｌｕ
ｓｉａ ｎｉ）の胚を衝撃した後、胚盤葉を形成する。
この手順の間、胚を濾紙上に支持する。次いで、孵化す
るまで、胚を系列７００のハロカーボン油（Ｈａｌｏｃ
ａｒｂｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ．ニュージャ
ージイ州ハッケンサック）の下に配置する。生き残る昆
虫が孵化したとき、２５匹の昆虫の群をケージの中に一
緒に入れる。卵をこれらのケージから集め、そしてＤＮ
Ａをロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）（３０）に記載されて
いるように胚から調製する。図３に示すようにオリゴマ
ーＡおよびＢを使用して、ＰＣＲ反応（参照、実施例
１）を実施して、どのケージがｐ７４遺伝子を含有する
卵を生産しているかを決定する。いったん陽性の群が同
定されると、その群からの卵を食物の上に配置し、そし
て成虫に発育させる。成虫の個々の対を交配し、そして
成虫が生産した卵から分離されたＤＮＡを再びＰＣＲに
よりｐ７４の存在についてアッセイする。ｐ７４遺伝子
についてホモ接合体である系統のガが確立されるまで、
この方法を続ける。

【００８５】実施例９ 上のトランスジェニック昆虫株における増殖による昆虫
感染性Ａ４０００ウイルスの生産および表現型の証明 最初に、組織培養培地の中の１×１０⁵のＡ４０００の
出芽したウイルスの５ｍｌの血リンパ注射を、小さい数
（１０〜２０）の第４齢のトランスジェニックトリコプ
ルシア・ニ（Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の幼虫に
与える。Ａ４０００ウイルスによる死亡が幼虫の大部分
において認められた（４〜５日）後、ＰＩＢを実施例３
に記載するように収獲する。次いでこれらのＰＩＢをそ
れ以上の増幅のために使用する。実施例５に記載するｐ
７４構成体の１つを含有する第３齢のトランスジェニッ
クトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ ｎ
ｉ）の幼虫に、表面が０．４μｌの１×１０⁶ＰＩＢ／
ｍｌのＡ４０００ウイルスで汚染された食物を与える。
結果が証明するように、機能的ｐ７４遺伝子を含有する
トランスジェニック昆虫の中のＡ４０００の増殖はほぼ
通常のレベルでウイルスの昆虫感染性を回復する。しか
しながら、この汚染されたウイルスは昆虫を経口的に感
染性する能力が減少している。

【００８６】実施例１０ 毒素をエンコードする遺伝子の△ｐ７４−１トランスフ
ァーベクターの中への挿入および組み換えウイルスＡ４
ＴｘＰ−１の分離 ピエモテス・トリチシ（Ｐｙｅｍｏｔｅｓ ｔｒｉｔｉ
ｃｉ）（ＴｘＰ−１）からの昆虫特異的ダニ毒素をエン
コードするＤＮＡ断片をｃＤＮＡクローンＴｏｘ３４か
ら分離する（２）。遺伝子の全体のタンパク質解読領域
＋ある５′および３′未翻訳領域を含有するＥｃｏＲＩ
断片を、ＡｃＭＮＰＶ ｐＶＬ １３９３ベクター（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンジエゴ）の
中にクローニングする。この構成体からのＥｃｏＲＶ−
ＨｉｎｄＩＩＩ（平滑末端結合）断片を、欠失に対して
内部であるＡａｔＩＩ部位においてトランスファーベク
ター△ｐ７４−１の中に挿入する（参照、図２）。実施
例１に記載するように、Ｓｆ９細胞上にＡ４０００ウイ
ルスのゲノムのＤＮＡをもつ、ＬＢ１５．９と表示す
る、このプラスミドの構成は、ＴｏｘＰ−Ｉ遺伝子をエ
ンコードするが、幼虫を経口的に感染することができな
い組み換えウイルスを生ずる。しかしながら、ヘリオチ
ス・ビリセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅ
ｎｓ）の幼虫の血リンパの中へのこのウイルスの出芽し
た形態の注入は、ＴｏｘＰ−Ｉの発現により引き起こさ
れる特徴ある麻痺を生じない。さらに、実施例３、７お
よび９に記載する方法によりこのウイルスの増殖は、昆
虫感染性Ａ４ＴｘＰ−１ウイルスの生産を生ずる。この
感染性Ａ４ＴｘＰ−１ウイルスは幼虫を感染し、そして
麻痺を誘発する。しかしながら、これらの感染した幼虫
により生産されるウイルスはその昆虫感染性を保持しな
い。

【００８７】実施例１１ コドン最適化ＡａＩＴ遺伝子を含有する発現ベクターの
構成 昆虫特異的毒素であるＡａＩＴは、北アフリカのサソリ
であるアンドロクトヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏ
ｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）Ｈｅｃｔｏｒの毒
液の中に見いだされる。ＡｃＭＮＰＶの多角体遺伝子領
域の中へのＡａＩＴ遺伝子の挿入のためのトランスファ
ーベクターを構成する。ＡＣ００５５．１と表示するこ
のベクターは、ｐＶＬ９８５のＢａｍＨＩ部位の中に挿
入されたＡａＩＴ遺伝子を含有し（３０）、そしてドロ
ソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍ
ｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）クチクラ遺伝子のシグナルペ
プチドに連鎖した、成熟ＡａＩＴ毒素のためにコドン最
適化ヌクレオチド配列から成る。このトランスファーベ
クターＡＣ００５５．１を収容する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）株ＨＢ１０１の試料は、出願人の譲受人により１９
９２年１２月１７日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、そして
ＡＴＣＣ受け入れ番号６９，１６６を与えられた。

【００８８】このトランスファーベクターの毒素解読セ
グメントを、ＰＣＲによる実施例４の発現ベクターの中
への引き続く挿入のために回収する。この反応に使用す
る（＋）−鎖のプライマーは２７塩基のオリゴヌクレオ
チドであり、その５′末端は増幅すべきコドン最適化Ａ
ａＩＴ遺伝子（ＡＣ００５５．１の中の）のＡＴＧ翻訳
開始コドンと一致する。

【００８９】（−）−鎖のプライマーは、ＡａＩＴ遺伝
子の３′末端の約３５−４０ｂｐの下流に位置するＡＣ
００５５．１の中の部位にハイブリダイゼーションす
る。精製後、反応生成物を実施例５に記載するように処
理するが、ただし断片は１．８％の低融点のアガロース
ゲル上の電気泳動により精製する。毒素遺伝子の挿入の
ための発現ベクターを調製するために、各ベクターをＥ
ｓｐ３Ｉで消化し、そして生ずる５′の突起する末端を
すべての４つのｄＮＴＰの存在下に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断片）の作用に
よりフィルインする。ベクターを遊離したポリリンカー
断片から１％の低融点のアガロースゲル上の電気泳動に
より分離し、次いで別の組み換えウイルスにおいてＡａ
ＩＴをエンコードする遺伝子断片に結合する。

【００９０】実施例１２ ＡａＩＴ毒素をエンコードする組み換えＡ４００１ウイ
ルスの分離 遺伝子の挿入のためのＡ４０００ウイルスのＤＮＡを調
製するために、ＤＮＡをＳｓｅ８３８７ＩおよびＢｓｕ
３６Ｉによる順次の消化で線状とする。典型的な調製に
おいて、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０
ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＢＳＡ
を含有する２５０μｌの反応混合物の中で、４０μｇの
Ａ４０００ウイルスのＤＮＡを３７℃において１００単
位のＳｓｅ８３８７Ｉ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バークレイ）で
２時間消化する。次いで反応混合物を１００ｍＭのＮａ
Ｃｌおよび５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９に調
節し、そしてＤＮＡを３７℃において１００単位のＢｓ
ｕ３６Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、
マサチュセッツ州ベベリイ）で２時間消化する。次い
で、ＳＤＳを１％（ｗ／ｖ）の最終濃度に、ＮａＣｌを
０．３Ｍの最終濃度にそしてＥＤＴＡを１０ｍＭの濃度
に添加することによって、反応を停止する。その後、ト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１
％のＳＤＳ、および０．３ＭのＮａＣｌと平衡化した２
ｍｌのベッド体積の「ポリ−プレプ（ｐｏｌｙ−ｐｒｅ
ｐ）」カラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ、カリフォルニア州リッチモンド）上でＤＮＡをクロ
マトグラフィーにかける。１２×１５０μｌの分画を集
める。１０μｌの各分画をゲル電気泳動により分析し
て、ウイルスのＤＮＡを含有する分画を同定する。これ
らの分画をプールし、フェノール：クロロホルムで１回
抽出し、次いでウイルスのＤＮＡをエタノールで沈澱さ
せる。ＤＮＡをＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ
８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）の中に０．１〜１ｍｇ／ｍ
ｌの濃度で再懸濁させ、そして４℃において貯蔵する。
ウイルスのＤＮＡが完全に線状化されているかどうかを
決定するために、アリコートをＥｃｏＲＩで消化し、そ
してゲル電気泳動により分析する。７ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片を示すウイルスのＤＮＡは、Ｂｓｕ３６ＩおよびＳ
ｓｅ８３８７Ｉで完全に消化されていないとき、使用さ
れない。

【００９１】実施例１１に記載するＡａＩＴを含有する
発現ベクターをＢｓｕ３６ＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで
消化する。１２ｎｇの毒素をエンコードする断片を、２
５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭのＭｇＣ
ｌ₂、１ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＤＴＴ、５％（ｗ／
ｖ）のポリエチレングリコール−８００および０．５単
位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、マ
リイランド州カイサーバーグ）を含有する５μｌの反応
混合物の中で、０．５μｇのＢｓｕ３６Ｉ／Ｓｓｅ８３
８７Ｉ線状化しそして精製ＡｃＭＮＰＶのＡ４０００の
ＤＮＡと結合する。１６℃において一夜インキュベーシ
ョンした後、実施例１に記載するように、全体の反応混
合物を使用してＳｆ９細胞をトランスフェクションす
る。

【００９２】トランスフェクション後５日に、培地をト
ランスフェクションしたＳｆ９細胞から除去する。トラ
ンスフェクション上澄み液の１０倍の系統的希釈物を調
製し、そして１０^-3、１０^-4および１０^-5希釈物の２×
１ｍｌのアリコートを使用して６ｃｍの培養皿の中の
１．５×１０⁶細胞を感染させる。ウイルスの添加後１
時間に、ウイルスの接種物を除去しそして、前の実施例
に記載するように、細胞をアガロースを含有する培地で
オーバーレイする。プラークが完全に発育したとき、そ
れらを使用して４８ウェルのプレートの個々のウェルを
接種し、そして生ずる子孫のウイルスを実施例１１に記
載するように（＋）−鎖のプライマーおよび（−）−鎖
のクチクラ−ＡａＩＴのプライマーとして図３における
プライマーＡを使用してＰＣＲによりアッセイする。

【００９３】追加の１または２ラウンドのプラーク精製
後、Ｐ１ストックを調製する（２８）。ＡａＩＴを含有
する組み換えウイルスをＡ４００１と表示する。ＥＣＶ
についての注入アッセイを実施することによって、この
ウイルスの生物学的活性をアッセイする。ＥＣＶを中期
の第４齢のヘリオチス・ビリセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ
ｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（タバコガ）の幼虫の中に注
入する。ウイルスをプラークアッセイ法（２８）により
力価決定し、次いで０．５％（ｖ／ｖ）の赤色色素Ｎ
ｏ．５を補充したＴＮＭ−ＦＨ培地の中で２×１０⁷、
２×１０⁶および２×１０⁵ＰＦＵ／ｍｌに希釈する。各
幼虫を二酸化炭素で２〜５分間麻酔し、次いで２６ゲー
ジの針を装備したハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）注射
器を使用して、０．５ｍｌの希釈したウイルスを注入す
る。針を縦方向に最後の推進脚の間に挿入し、次いで注
入の前に２〜３体セグメントを前方に動かす。注入後、
各幼虫を色素染色した血リンパの解放ついて検査し、そ
して試料の損失が明らかであるか、あるい推測される場
合、廃棄する。次いで幼虫をふたをした４ｃｍ²の食物
セル（１匹の幼虫／セル）の中に２７℃において貯蔵
し、そして１日１回病的状態または致死率の証拠につい
て検査する。幼虫をひっくりかえした後、０．５〜２分
以内にそれ自身で直立しない場合、個体は死にかけてい
る（陽性の応答）として記録する。

【００９４】ヘリオチス・ビリセンス（Ｈ．ｖｉｒｅｓ
ｃｅｎｓ）の幼虫に６×１０³〜１×１０⁴ＰＦＵのウイ
ルスを注入するとき、Ａ４００１ウイルスの感染に対し
て応答する幼虫は、ＡａＩＴ生産性組み換えウイルスの
特徴を示す野生型ＡｃＭＮＰＶと比較して、収縮性の麻
痺および応答時間の減少を示す。詳しくは、組み換えウ
イルスは１つのバイオアッセイにおいて野生型ウイルス
についての値の５０％（＋／−４％）および第２バイオ
アッセイにおいて野生型ウイルスについての値の５２％
（＋／−５％）の平均の応答時間（ＲＴ₅₀）を有する。
この結果が示すように、ＡａＩＴ遺伝子およびクチクラ
のシグナルｓｑのＡｃＭＮＰＶ（Ａ４００１）の中への
挿入は生物学的に活性な毒素の発現を通して殺す速度を
加速する。

【００９５】実施例２に記載するように、標準の葉のデ
ィスクのアッセイにおいて、レスキューする細胞系Ｓｆ
９（２８．３）ＣＬ−２の中で増殖したＡ４００１ウイ
ルスを摂取した幼虫のみはＡａＩＴ毒素の特徴を示す収
縮性麻痺を示す。対照的に、野生型Ｓｆ９細胞の中で増
殖したＡ４００１ウイルスを摂取した幼虫は収縮性麻痺
を示さない。

【００９６】実施例１３ トランスファーベクターＵＡＳ_GAL−ｐ７４およびウイ
ルスＡ４ＵＡＳの構成 この実施例において、特定の酵母菌の上流の活性化ＤＮ
Ａ配列、ＵＡＳ_GAL、＋最小のドロソフィラ・メラノガ
ステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔ
ｅｒ）ｈｓｐ７０プロモーター（−４０〜−１ｂｐ）
を、ウイルスの中のｐ７４解読領域の−１ｂｐ上流に挿
入する。ＧＡＬ４構造遺伝子をｐＬＡプラスミド（３
２）から２．９ｋｂのＢｇｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と
して分離する。このＧＡＬ４断片を、実施例５に記載す
るように、異種プロモーターを含有するベクターの１つ
の中に挿入する。異種プロモーター−ＧＡＬ４構成体の
機能的コピーを含有する安定なＳｆ９細胞を実施例６に
記載するように分離する。ＵＡＳ_GAL−ｐ７４組み換え
ウイルスを発生させるために、ＵＡＳ_GAL−ｐ７４トラ
ンスファーベクターを構成する。１７−ｈｓｐ７０／ｌ
ａｃＺ構成体（３２）をＰＣＲの基質として使用して、
１７５ｂｐの断片を発生させる。この断片は、最小のド
ロソフィラ・メラノガステル（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｈｓｐ７０プロモーター
（−４０〜−１ｂｐ）に融合された高い親和性の１７マ
ーのＧＡＬ４認識部位を含有する、２９ｂｐの反復の４
コピーから成る。引き続くクローニング工程について要
求される制限部位をこの断片の５′末端（ＳｍａＩ）お
よび３′末端（Ｅｓｐ３ＩおよびＮｄｅＩ）に付加する
特別のプライマーを使用する。この断片を△ｐ７４−１
トランスファーベクター（参照、図４）の中に、平滑末
端連鎖した５′ほとんどのＨｉｎｄＩＩＩとｐ７４遺伝
子のＮｄｅＩ部位との間に挿入する。このプラスミドの
クローンをＬＢ１７．８と表示する。実施例５に記載す
るように（＋）鎖のｐ７４特異的プライマーおよび
（−）鎖をプライミングするためにブルースクリプト
（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）特異的プライマーＴ３（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラジョラ）を使用
して、ＰＣＲ増幅により、ｐ７４解読領域の断片を発生
させる。このｐ７４断片を、前述したように、ＤＮＡポ
リメラーゼＩのクレノー断片で処理する。断片を精製し
た後、それをｐ７４遺伝子の３′末端付近で切断するＢ
ｃｌＩで消化する。Ｅｓｐ３Ｉで消化し、次いでこの末
端をクレノーで平滑末端とすることによって、ＬＢ１
７．８を同様に調製する。次いで、調製したベクターお
よびｐ７４遺伝子の断片を一緒に標準の条件下に結合す
る。このクローンをｐＵＡＳ_GAL−ｐ７４と表示し、そ
してｈｓｐプロモーターの条件下に、しかしＧａｌ１４
タンパク質の存在に依存して完全なｐ７４遺伝子を含有
する。Ａ４ＵＡＳと表示する組み換えＡｃＭＮＰＶウイ
ルスを実施例１に記載する方法により発生させる。実施
例６に記載する細胞系の中でこの組み換えウイルスを増
殖させることによって、相補されたウイルスを生産す
る。実施例に記載する標準のバイオアッセイを実施しそ
して、結果が証明するように、ＵＡＳ_GAL−ｐ７４は経
口的に供給するとき非感染性であるが、このウイルスを
ＧＡＬ４相補性細胞系中に増殖させるとき、それは経口
的供給により昆虫に対して感染性である。

【００９７】実施例１４ グラニュローシスウイルスのみはゲノムからのＡｃＭＮ
ＰＶｐ７４遺伝子に対する機能的類似体の分離 グラニュローシスウイルスの経口的に感染性の原因とな
る遺伝子の分離は、マーカーのレスキューの技術を使用
して可能である。ＴｎＧＶのＤＮＡの部分的ＳａｌＩ消
化物をコスミドのベクターｐＶＫ１０２（３４）の中に
結合することによって、まずオーバーラッピングするコ
スミドのクローンのゲノムのライブラリーをトリコプル
シア・ニ（Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）のグラニュ
ローシスウイルス（ＴｎＧＶ）のウイルスのＤＮＡから
調製する。ＣｐＧＶの１つの１μｇのアリコートを、実
施例１に記載する手順により、１μｇのＡｃＭＮＰＶの
Ａ４０００ウイルスのＤＮＡと一緒に共トランスフェク
ションする。５日後、標準のプラークアッセイを構成す
る（２８）。プラークが完全に発育したとき、個々のプ
ラークを実施例１に記載するように使用して、４８ウェ
ルの組織培養プレートの単一のウェルを感染させる。こ
れらのウェルからの子孫のウイルスを２０の群にプール
し、そして実施例２に記載するように葉のディスクのア
ッセイにおいて第３齢のトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃ
ｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の幼虫に供給する。コスミドの
クローンがｐ７４の機能的類似体を含有する場合、それ
は経口的感染に対してＡ４０００ウイルスをレスキュー
する。このレスキューに関係する特定の遺伝子は、陽性
のコスミドのプラスミドのサブクローンを使用して共ト
ランスフェクションおよびアッセイのプロトコルを反復
することによって同定される。

【００９８】

【表３】

【００９９】

【表４】

【０１００】

【表５】

【０１０１】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【０１０２】１、変更されたウイルスに欠けているか、
あるいはそのウイルスにおいて欠損している生産物また
は機能と相補することによって感染性が回復されてい
る、ウイルスの遺伝学的要素の変更により昆虫に対して
非感染性とされている、環境において宿主対宿主の伝染
の能力が減少した昆虫ウイルス。

【０１０３】２、ウイルスがＤＮＡウイルスおよびＲＮ
Ａウイルスから成る群より選択される、上記第１項記載
のウイルス。

【０１０４】３、ＤＮＡウイルスはエウバキュロウイル
ス亜科（Ｅｕｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｎａｅ）のウイル
ス、ヌディバキュロウイルス亜科（Ｎｕｄｉｂａｃｕｌ
ｏｖｉｒｉｎａｅ）のウイルス、エントモポックスウイ
ルス亜科（Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｒｉｎａｅ）のウイル
ス、イキノウイルス（Ｉｃｈｎｏｖｉｒｕｓ）、ブラコ
ウイルス（Ｂｒａｃｏｖｉｒｕｓ）、イリドウイルス科
（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスおよびパルヴ
ォウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス
から成る群より選択されるＤＮＡウイルスである、上記
第２項記載のウイルス。

【０１０５】４、ウイルスは核の多角体病のウイルスお
よびグラニュローシスのウイルスから成る群より選択さ
れたエウバキュロウイルス亜科（Ｅｕｂａｃｕｌｏｖｉ
ｒｉｎａｅ）のウイルスである、上記第３項記載のウイ
ルス。

【０１０６】５、ウイルスの遺伝学的要素の変更は遺伝
子の機能の崩壊およびウイルス機能の妨害から成る群よ
り選択される、上記第１項記載のウイルス。

【０１０７】６、ウイルスの感染性は、（ａ）変更され
たウイルスに欠けているか、あるいはそのウイルスにお
いて欠損している生産物または機能を提供するＤＮＡの
断片でトランスフェクションされた昆虫細胞、（ｂ）変
更されたウイルスに欠けているか、あるいはそのウイル
スにおいて欠損している生産物または機能を提供するＤ
ＮＡの断片で安定に形質転換された細胞系、または
（ｃ）変更されたウイルスに欠けているか、あるいはそ
のウイルスにおいて欠損している生産物または機能を提
供するＤＮＡの断片を含有するトランスジェニック昆
虫、の中のウイルスの生産により回復される、上記第１
項記載のウイルス。

【０１０８】７、異種プロモーターを使用してＤＮＡの
断片の発現をコントロールする、上記第６項記載のウイ
ルス。

【０１０９】８、ウイルスのゲノムの中に挿入された昆
虫のコントロールまたは修飾する物質をコードする異種
遺伝子をさらに含む、上記第１項記載のウイルス。

【０１１０】９、昆虫のコントロールまたは修飾する物
質は、毒素、神経ペプチドおよびホルモン、および酵素
から成る群より選択される、上記第８項記載のウイル
ス。

【０１１１】１０、異種遺伝子を、（ａ）ウイルスの遺
伝学的要素の変更部位の中に直接挿入するか、あるいは
（ｂ）ウイルスの遺伝学的要素の変更部位に隣接して挿
入し、こうして異種遺伝子および変更された遺伝学的要
素の分離はウイルスの子孫の１０％より小で起こる、上
記第８項記載のウイルス。

【０１１２】１１、工程： （１）昆虫ウイルスの遺伝学的要素の変更によりウイル
スを昆虫に対して非感染性とし、そして（２）変更され
たウイルスに欠けているか、あるいはそのウイルスにお
いて欠損している生産物または機能と相補することによ
って感染性を回復する、からなる、環境において宿主対
宿主の伝染の能力が減少した昆虫ウイルスを生産する方
法。

【０１１３】１２、ウイルスの遺伝学的要素の変更は遺
伝子の機能の崩壊およびウイルス機能の妨害から成る群
より選択される、上記第１１項記載の方法。

【０１１４】１３、ウイルスの感染性は、（ａ）変更さ
れたウイルスに欠けているか、あるいはそのウイルスに
おいて欠損している生産物または機能を提供するＤＮＡ
の断片でトランスフェクションされた昆虫細胞、（ｂ）
変更されたウイルスに欠けているか、あるいはそのウイ
ルスにおいて欠損している生産物または機能を提供する
ＤＮＡの断片で安定に形質転換された細胞系、または
（ｃ）変更されたウイルスに欠けているか、あるいはそ
のウイルスにおいて欠損している生産物または機能を提
供するＤＮＡの断片を含有するトランスジェニック昆
虫、の中のウイルスの生産により回復される、上記第１
１項記載の方法。

【０１１５】１４、異種プロモーターの使用をさらに含
む、上記第１１項記載のウイルス。 １５、ウイルスのゲノムの中に挿入された昆虫のコント
ロールまたは修飾する物質をコードする異種遺伝子の使
用をさらに含む、上記第１１項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡｃＭＮＰＶゲノムの既知のバクロウイルス遺
伝子の線状地図を描写する。

【図２】ＡｃＭＮＰＶのｐ７４遺伝子の中に欠失を含有
するプラスミド△ｐ７４−１の構成の詳細を描写する。

【図３】ＡｃＭＮＰＶ Ａ４０００株ｎｏｐ７４遺伝子
（△ｐ７４）の中の欠失の詳細を描写する。

【図４】プロモーター、ポリリンカーおよび３′ＵＴＲ
を示すｐＭＥＶ系列の環境の一部分の制限地図を描写す
る。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 変更されたウイルスに欠けているか、あ
   るいはそのウイルスにおいて欠損している生産物または
   機能と相補することによって感染性が回復されている、
   ウイルスの遺伝学的要素の変更により昆虫に対して非感
   染性とされている、環境において宿主対宿主の伝染の能
   力が減少した昆虫ウイルス。
2. 【請求項２】 ウイルスのゲノムの中に挿入された昆虫
   のコントロールまたは修飾する物質をコードする異種遺
   伝子をさらに含む、請求項１のウイルス。
3. 【請求項３】 工程： （１）昆虫ウイルスの遺伝学的要素の変更によりウイル
   スを昆虫に対して非感染性とし、そして（２）変更され
   たウイルスに欠けているか、あるいはそのウイルスにお
   いて欠損している生産物または機能と相補することによ
   って感染性を回復する、からなる、環境において宿主対
   宿主の伝染の能力が減少した昆虫ウイルスを生産する方
   法。