PL171938B1 - w srodowisku i sposób wytwarzania rekombinowanego wirusa owadziegoo zmniejszonej zdolnosci do transm isji poziomej w srodowisku PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Rekombinowany wirus owadzi o zmniejszonej zdolnosci do transmisji poziomej w srodowisku, znamienny tym, ze ma zniesiona zakaznosc wobec owadów przez modyfikacje elementu genetycznego i przywrócona zakaznosc przez komplementacje produktem lub funkcja brakujacymi lub uszkodzo- nymi w zwiazku ze zmiana elementu genetycznego z utrzymaniem braku genetycznej zdolnosci do pro- dukowania brakujacego produktu lub funkcji. 14. Sposób wytwarzania rekombinowanego wiru- sa owadziego o zmniejszonej zdolnosci do transmisji poziomej w srodowisku, znamienny tym, ze obej- muje nastepujace etapy: (1) zniesienie zakaznosci wirusa dla owadów poprzez modyfikacje elementu genetycznego wirusa przy zachowaniu zdolnosci do wtórnego zakazenia szerzacego sie na inne tkanki owada; i (2) przywrócenie zakaznosci wirusa po- przez komplementacje produktem lub funkcja braku- jaca lub uszkodzona w zmodyfikowanym wirusie. FIG.3 PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany wirus owadzi o zmniejszonej zdolności do transmisji poziomej (gospodarz - gospodarz) w środowisku oraz sposób jego wytwarzania.

W niniejszym zgłoszeniu użyto następujących skrótów:

A. cal. - A^ito^grap^ha! caiifomica (motylnocny z rodźmy sówek).

AcMNPV -wirus poliedrozy atakujący Autographa californica (A. cal. polyhedrosis mononuclear virus).

bp - ]prr(a/)) zasad (base jparr/s)..

ECV - portac wirusa pozktomórkowa eexrracenuaar vrn/s).

GV - win/s gmułozy (g^i^uh^^śs viuss).

kD - kilodalton.

MOI - wdeb^l^on^t^^ć meekcj) (muliipiiclty of ^εού-οη..

NPV - wrms poieedroty (t^t^cetan· ροΙ,νΗεώΌβΝ

OB - c^kko okhzyjjiee (occlusion body..

OV - okuzyjua forma wriusa (occluded vin/s).

PCR - reikccj a ańicuchowa poiimeraw polymerśsse cham macion..

PDV - foima wirusa zawarta w poiiedronach (polyhedron derived vrius).

p.i. - poineekcyjny· po infekcji (post-infection).

PEB - pohedrabee ciałko ink:lrzy'ji^e polyhedron niclusion ło)dy) (równoważnie z OB).

5' UTR - sekwencja mRNA lub genu odpowiadająca regionowi rozciągającemu się od miejsca początku transkrypcji genu do ostatniej zasady lub pary zasad, które poprzedzają kodon inicjacyjny dla syntezy białka.

3' UTR - sekwencja mRNA lub genu odpowiadająca regionowi rozciągającemu się· od pierwszej zasady lub pary zasad następujących po kodonie terminacyjnym dla syntezy białka do ostatniej zasady w obrębie danego genu na 3' końcu mRNA.

nić (+) - ta z nici DNA genu i jego sekwencji otaczających, która jest komplementarna do mRNA powstającego na bazie owego genu.

nić (-) - nić DNA genu i jego sekwencji otaczających komplementarna do nici (+).

Obecny wynalazek stosuje się do wszystkich wirusów owadów, włączając w to wirusy

DNA jak i wirusy RNA. Wirusy DNA obejmują entomopox wirusy (EPV) i wirusy Bacuioviradae takie jak wirusy NPV, wirusy GV i podobne. Wirusy RNA obejmujątogawirusy, flaviwiru4

171 938 sy, picomawirusy, wirusy CPV i podobne. Podrodzina dwuniciowych wirusów DNA Eubaculviridae obejmuje dwa rodZaje; wirusy NPV i GV, które są szczególnie użyteczne dla kontroli biologicznej ponieważ wytwarzają one ciałka okluzyjne (OB) w swoim cyklu życiowym.

Zidentyfikowano ponad 400 gatunków bakulowirusów obecnych w organizmach bezkręgowców. AcMNPV jest wirusem prototypowym dla rodziny Baculoviridae, posiadającym stosunkowo szeroki zakres gospodarzy. Wirus AcMNPV pierwotnie wyizolowano z organizmu Autographa californica, owada łuskoskrzydłego z rodziny sówek (w dojrzałej postaci będącego nocnym motylem). Wirus ten może zakażać 12 rodzin i ponad 20 gatunków w obrębie rzędu owadów łuskoskrzydłych (1). Nieznane są wrażliwe gatunki spoza tego rzędu.

Możliwość użycia bakulowirusów jako bioinsektycydów wygląda obiecująco. Jedną z głównych trudności na drodze do ich szerokiego użycia w gospodarce rolnej jest zwłoka czasowa pomiędzy początkiem infekcji owada a jego śmi^j^»^i^. Zwłoka ta może się mieścić w granicach od kilku dni do kilku tygodni. W tym czasie owad odżywia się w dalszym ciągu, powodując dalsze szkody dla rośliny. Wielu badaczy usiłowało pokonać tę przeszkodę poprzez umieszczenie heterologicznego genu w genomie wirusa, tak by wirus wytwarzał substancję niszczącą bądź modyfikującą aktywność owada, taką jak toksyna (2, 3, 4), neuropeptyd lub hormon (5,6) czy enzym (7).

O ile inżynieria genetycaiadostarcoa arodków do przezwyzizżeyia przeazkód technicznych dla wprowadzenia na rynek wirusów jak bioizaeOtycydów, podniosła ona kwestię, iż może istnieć inna potencjalna przeszkoda dla ich powszechnej akceptacji. Co szczególnie istotne, istnieje poddjrzdnid, że uwolnienie wirusów uzyskanych na Cnonzd inżynierii genetycznej do środowiska może mieć nieprzrwiCzikzr konsekwencje dla ekosystemu jeśli wirusy te będą się zamzaPkć i rozprzestrzeniać (8, 9). Do chwili obecnej podejrzenie to stosuje się do wszystkich rekombizowkzyoh wirusów, wytworzonych dla celu biologicznej kontroli populacji owadów, ponieważ wszystkie one zdolne są do transmisji z jednego organizmu owada na inne. Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na nekombinowkze wirusy, specyficzne dla owada, o zmniejszonej zdolności do przenoszenia się z owada na owada (transmisja pozioma), po uwolnieniu ich do środowiska.

Cykl życiowy bakulowirusów, przykładowo AcMNPV, obejmuje dwa stadia. Każde stadium cyklu życiowego reprezentowane jest przez inną postać wirusa: pozakomórkowe cząstki wirusa (ECV), pozbawione polierdalzej osłony oraz polidCnonowa forma wirusa (PDV), (10, 11). Postacie ECV i OB posiadają ten sam genom lecz wykazują odmienne właściwości biologiczne. Dojrzewaniem każdej z dwu form kieruje odrębny zestaw genów wirusa, wśród których istnieją geny o aktywności unikalnej dla każdej formy.

W naturalnie występującej postaci inwazyjnej dla owada, zespół wielu wirionów znajduje się w pkrkkryatklicznej macierzy białkowej, co określa się jako ciałko okluzyjzd (OB) lub inaczej, jako wtrętowe ciałko poliedralne (PlB). Białkowe okluzje wirusowe określa się mianem polie^-onu. Białko poleeCryna, o masie cząsteczkowej 29 kD, jest głównym z kodowanych przez wirus białkiem strukturalnym okluzji wirusowych (10, 12). (Adekwatnie, GV wytwarzają OB zbudowane w głównej mierze z grazuliny w miejsce polieCnazy).

Okluzje wirusowe są ważną częścią w naturalnie przebiegającym cyklu życiowym bakulowiruahw, dostarczając możliwości transmisji poziomej (z owada na owada) wśród wrażliwych gatunków. W naturalnym środowisku wrażliwy owad (zwykle w stadium larwalnym) zjada okluzje wirusowe obecne w zakażonym źródle pożywienia, jak np. rośliny. Krystaliczne okluzje ulegają rozkładowi w jelicie wrażliwych owadów, uwalniając cząsteczki zakaźnego wirusa. Te uwolnione formy poleedralnd (PDV) atakują i nkmzkpają się w komórkach tkanek jelita środkowego (10).

Uważa się, że infekcyjne cząstki wirusa dostają się do komórki na drodze ennocytoza lub poprzez fuzję, a DNA wirusowe ulega uwolnieniu w obrębie nukleoporów lub w samym jądrze komórkowym. Replikacja DNA wirusowego rozpoczyna się w ciągu 6 godzin. Około 10-12 godziny od infekcji (p.i.), zaczyna się szerzyć wtórna infekcja do innych tkanek poprzez pączkowanie formy pozakomórkowej wirusa (ECV) z powierzchni zakażonych komórek. Forma ECV wirusa jest odpowiedzialna za rozpnzeatnzdzikzir się infekcji wirusowej pomię171 938 dzy komórkami w obrębie pojedynczego organizmu owada, jak również za szerzenie się infekcji w hodowli tkankowej.

Późno w cyklu zakażenia (12 godz. p.i.) w zakażonych komórkach pojawia się białko poliedryna. Nie wcześniej niż w 18-20 godz. p.i. poliedryna ulega nagromadzeniu w jądrze komórkowym zakazonej komórki i cząsteczki wirusa ulegają zamknięciu w białkowych okluzjach. Okluzje wirusowe gromadzą się w dużych ilościach około dnia 4-5, kiedy to komórka ulega lizie. Forma występująca w poliedronach nie ma znaczenia w rozprzestrzenianiu się zakażenia w obrębie larwy. Śmierć larwy owada związana jest z namnażaniem się i rozprzestrzenianiem formy ECV w hemolimfie (10,11,12).

Po śmierci larwy miliony poliedronów pozostają w rozkładającej się tkance, podczas gdy formy ECV wirusa ulegają degradacji. Po ekspozycji innych larw na formę poliedronową, np. przy spożyciu zakażonych roślin czy innego pożywienia, cykl się powtarza (10).

Podsumowując, forma OV wirusa jest odpowiedzialna za pierwotną, infekcję owada na drodze pokarmowej jak i za stabilność środowiskową wirusa. Forma ta praktycznie jest niezakaźna przy podaniu przez wstrzyknięcie ale wysoce zakaźna na drodze jelitowej. Forma wirusa niezwiązana z poliedronami (np. ECV) odpowiada za wtórne zarażenia przy szerzeniu się wirusa pomiędzy komórkami gospodarza. Forma ECV jest wysoce zakaźna dla komórek w hodowli oraz dla owada przy podaniu pozajelitowym, lecz praktycznie nie jest zakaźna na drodze pokarmowej.

Użycie rekombinowanych bakulowirusów charakteryzujących się ekspresją obcych białek, toksycznych dla owadów ułatwia fakt, iż wirusy te nie są patogenne dla roślin i kręgowców. Co więcej bakulowirusy posiadają ogólnie wąski raczej krąg gospodarzy. Dla wielu szczepów jest on ograniczony do jednego lub kilku zaledwie gatunków owadów.

Najszerzej zbadanym bakulowirusem jest AcMNPV. Wiadomo, że AcMNPV zarażać może 12 rodzin i ponad 30 gatunków w obrębie rzędu Lepidoptera (1). Nie wykazano produktywnej infekcji AcMNPV w żadnym gatunku z poza tego rzędu. Zarówno organizacje społeczne jak i szereg urzędów podnosiło kwestię potencjalnych konsekwencji jakie miałoby wprowadzenie do środowiska szczepu AcMNPV zawierającego obcą sekwencję DNA (8, 9). Odnosi się to do możliwości rozprzestrzeniania się rekombinowanego wirusa wśród gatunków owadów łuskoskrzydłych nie będących zamierzonym celem. Innym przedmiotem rozwazań jest stabilność środowiskowa takich wirusów.

Tak więc, istnieje zapotrzebowanie na specyficzne dla owadów rekombinowane wirusy o obniżonej zdolności do szerzenia się z jednego owada na inne (gospodarz - gospodarz). Wirusy takie powinny być zdolne do jednorazowego zakażenia organizmu owada, lecz winny wykazywać znaczne obniżenie zdolności przenoszenia się z organizmu jednego owada na inne, ograniczając trwałość wirusa w środowisku.

Wynalazek dotyczy konstrukcji i namnażania rekombinowanych szczepów wirusów owadzich o obniżonej zdolności do szerzenia się z owada na inne owady, to znaczy, o obniżonej zdolności do przenoszenia się z gospodarza na gospodarza.

Wirus według wynalazku ma zniesioną zakaźność wobec owadów przez modyfikację elementu genetycznego i przywróconą zakaźność przez komplementację produktem lub funkcją brakującymi lub uszkodzonymi w związku ze zmianą elementu genetycznego z utrzymaniem braku genetycznej zdolności do produkowania brakującego produktu lub funkcji.

Wirusy z rodziny Baculoviridiae są szczególnie przydatne do konstrukcji takich szczepów z powodu występowania u nich dwu stadiów cyklu życiowego opisanych powyżej.

Rekombinowane wirusy owadzie wytwarzane są sposobem według wynalazku, który obejmuje następujące etapy: (1) zniesienie zakaźności wirusa dla owadów poprzez modyfikację elementu genetycznego wirusa przy zachowaniu zdolności do wtórnego zakażenia szerzącego się na inne tkanki owada; i (2) przywrócenie zakaźności wirusa poprzez komplementację produktem lub funkcją brakującą lub uszkodzoną w zmodyfikowanym wirusie.

Zmiana struktury genetycznej nie ogranicza się jedynie do genów kodujących czynniki działające w układzie trans, takie jak RNA lub cząsteczki białek, lecz dotyczy też czynników regulatorowych działających w układzie cis, takich jak enhancery transkrypcji, promotoiy oraz

171 938 inne elementy regulujące transkrypcję, translację i replikację genomu oraz wirusowe sekwencje opakowujące (DNA lub RN A).

Wspomniana zmiana może mieć formę delecji, zmiany fazy odczytu, insercji, zmian układu genu, mutacji punktowej lub innych metod zniszczenia funkcji genu. Inne sposoby modyfikacji aktywności wirusa obejmują metody, które zakłócają aktywność wirusa, takie jak hamowanie transkrypcji lub translacji, użycie antysensów RNA, wbudowanie dodatkowego elementu genowego, wbudowanie dodatkowego elementu regulatorowego, takiego jak drożdżowa przedgenowa sekwencja aktywująca wymagająca obecności białka GAL 4 dla swej aktywności (UASgal)·

Przywrócenie infekcyjności rekombinowanego wirusa przy znacząco obniżonej zdolności do jego transmisji poziomej (gospodarz - gospodarz) w środowisku osiągnięte jest na drodze komplementacji produktem lub funkcją brakującą lub uszkodzoną w tak zmienionej formie wirusa.

Sposobem według wynalazku jednorazowo zakaźną dla owadów formę rekombinowanego wirusa uzyskuje się przez jego namnażanie w: (a) komórkach owadzich poddanych transfekcji fragmentem DNA dostarczającym produktu lub funkcji, brakującej Lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie; (b) liniach komórkowych, w sposób trwały stransformowanych fragmentem DNA dostarczającym produktu lub funkcji, brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie; (c) owadach transgenicznych, które zawierają fragment DNA dostarczający produktu lub funkcji brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie.

W zależności od rodzaju uzupełnianego produktu lub funkcji, może być potrzebne łub pożądane użycie heterologicznych promotorów komórkowych lub pochodzenia wirusowego, kontrolujących ekspresję fragmentu DNA.

Komórki owadzie z metod (1) i (2) oraz owady transgeniczne z metody (3) funkcjonują tu jako czynnik wspomagający przywrócenie infekcyjności wirusa, tak że cząsteczki wirusa przy zjedzeniu ich przez owada mogą wywołać infekcję. Wiriony produkowane w organizmach zarażonych larw są defektywne, zatem infekcja nie przenosi się łatwo na inne owady. Wobec tego, pod nieobecność koinfekcji dzikim szczepem wirusa, cykl życiowy wirusa rekombinowanego kończy się po pojedynczym cyklu zakażenia.

Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem, w genom wirusa wbudowany jest gen kodujący substancję niszczącą lub modyfikującą funkcje organizmu owada. Gen ten umieszczony jest w jakimkolwiek dogodnym punkcie genomu zmodyfikowanego wirusa. Wśród substancji tego typu znajdują się toksyny, neuropeptydy i hormony oraz enzymy. Ekspresja tych substancji dodatkowo wzmaga biologiczny efekt owadobójczy.

W szczególnym przypadku, gen ten umieszczony jest przy lub wewnątrz zmodyfikowanego miejsca genomu, odpowiedzialnego za obniżenie zdolności do transmisji poziomej wirusa. Umieszczenie heterologicznego genu w bezpośredniej bliskości lub wewnątrz zmodyfikowanego miejsca zapobiega lub znacznie ogranicza możliwość zajścia rekombinacji mogącej wytworzyć formę wirusa o dzikim fenotypie (nieograniczonej zdolności do transmisji poziomej), jednocześnie posiadającą gen niszczący lub modyfikujący funkcje zakażanych owadów.

Figura 1 przedstawia liniową mapę znanych genów bakulowirusowych w genomie AcMNPV (13).

Figura 2 przedstawia konstrukcję plazmidu Ap74-1, zawierającego delecję w obrębie genup74-1 wirusa AcMNPV.

Figura 3 przedstawia miejsce delecji w obrębie genu p74-ł (Ap74-1) szczepu A4000 wirusa AcMNPV.

Figura 4 przedstawia mapę restrykcyjną części wektora ekspresyjnego serii pMEV, pokazując promotor, polilinker i 3' UTR.

Wytworzenie metodami inżynierii genetycznej wirusa owadziego o obniżonej zdolności do transmisji poziomej warunkuje zwiększenie współczynnika, zanikania zakaźnej formy wirusa w środowisku naturalnym w porównaniu ze współczynnikiem osiąganym przez naturalne procesy biotycznej i abiotycznej degradacji. W ten sposób zmodyfikowany wirus nie może w sposób trwały zasiedlić środowisk.

171 938

Obecny wynalazek stosuje się do wszystkich wirusów owadzich, włączając w to wirusy DNA i wirusy RNA. Wirusy DNA obejmują dwuniciowe osłonkowe wirusy DNA takie jak (rodziny, potem gatunki) Entomopoxvirinae (poxwirus chrząszczy), Eubaculovirinae (Autographa califomica MNPV; Helicoverpa zea SNPV), Nudibaculovirinae (Helicoverpa zea NOB), Ichnovirus (Campoletis sonorensis) i Bracovirus (Cotesia melanoscela), jak również dwuniciowe bezosłonkowe wirusy DNA jak Iridoviridae (Chilo iridescent virus) i jednoniciowe bezosłonkowe wirusy DNA jak Parvoviridae (Galleria densovirus).

RNA wirusy obejmują dwuniciowe wirusy osłonkowe jak Togaviridae (Sindbis virus), Bunyaviridae (Beet leafcurl virus) i Flaviviridae (Wesselbron virus) oraz dwuniciowe bezosłonkowe wirusy RNA jak Reoviridae (Corriparta virus) i Bimaviridae (Drosophila X virus), jak również jednoniciowe bezosłonkowe wirusy RNA jak Picomaviridae (Cricket paralysis virus), Tetraviridae (Nudaurelia beta virus) i Nodaviridae (Black beetle virus),

Podrodzina dwuniciowych wirusów DNA Eubaculovirinae obejmuje dwa rodzaje; wirusy NPV i wirusy GV, szczególnie przydatne dla celów kontroli biologicznej za sprawą wytwarzania w ich cyklu życiowym ciałek okluzyjnych. Przykładem wirusów NPV są Lymantaria dispar NPV, Autographa californica MNPV, Anagrapha falcifera NPV, Spodoptera litturalis NPV, Spodoptera frugiperda NPV, Heliothis armigera NPV, Mamestra brasicae NPV, Choristoneura fumiferana NPV, Trichoplusia ni NPV, Helicoverpa zea NPV, Rachiplusia ou NPV itp. Przykładami wirusów GV są Cydia pomonella GV, Pieris brassicae GV, Trichoplusia ni GV, Artogea rapae GV, Plodia interpunctella GV, itp. Przykłady entomopoxwirusow to Melolonotha melonotha EPV, Amsacta moorei EPV, Locusta migratoria EPV, Melanoplus sanquinipes EPV, Schistocerca gregaria EPV, Aedes egipti EPV, Chironomus luridius EPV, itp.

Zastosowanie niniejszego wynalazku umożliwia ochronę uprawianych zbóż, drzew i krzewów, sadów, sadów i roślin ozdobnych zabezpieczając przed atakami i zapewniając kontrolę nad owadami, szczególnie należącymi do rzędów Lepidoptera, Orthoptera, Diptera, Isoptera, Hymenoptera, Homoptera, Hemiptera i Coleoptera.

Pomimo że wynalazek opisany będzie na przykładzie Autographa californica NPV (AcMNPV), rozumiemy że przedstawione tu rozwiązania stosują się do wszystkich wymienionych powyżej wirusów owadzich. Ponadto, zakłada się, że obecny wynalazek będzie wysoce użyteczny dla ulepszenia nowych wirusów owadzich, dotąd niezidentyfikowanych i niesklasyfikowanych w literaturze.

Infekcja AcMNPV w pierwszym etapie przebiega z wytworzeniem pączkującej formy wirusa znanej jako ECV. Forma ECV odpowiada za rozprzestrzenianie się wirusa pomiędzy komórkami pojedynczego zarażonego owada oraz za jego szerzenie się w hodowlach komórkowych. W przypadku wirusów NPV, na dalszym etapie rozwoju infekcji, komórki zaczynają wytwarzać formę PDV, opakowaną w parakrystaliczne ciałko okluzyjne (OB), określane też jako PIB. (Adekwatnie, wirusy GV wytwarzają OB złożone głównie z granułiny w miejsce poliedryny). Forma wirusa PDV odpowiada za pierwotną infekcję owada na drodze pokarmowej, jak i za trwałość wirusa w środowisku naturalnym.

Modyfikacja którejś z funkcji związanych z wytworzeniem pełnowartościowej postaci OB a niezwiązanej z aktywnością formy pączkującej (ECV) wydaje się być szczególnie użyteczna.

Mutacje takie znaleziono w wirusie AcMNPV (14). Szereg doświadczalnych mutacji pozwoliło zidentyfikować loci genowe, których uszkodzenie powoduje zaburzenia w wytwarzaniu pełnowartościowych zakaźnych poliedronów przy zachowanej produkcji formy ECV. Jednym z najbardziej interesujących i potencjalnie użytecznych loci zidentyfikowanych dotychczas jest gen p74 zawarty we fragmencie HindiTTp genomu AcMNPV (15). Produkcja małych ilości białka p74 obecna jest jedynie w późnym etapie infekcji bakulowirusem (15).

Geny homologiczne do p74 zidentyfikowano w innych wirusach NPV, wśród nich Choristoneura fumeiferana NPV (16) i Orygia pseudotsugata NPV (17). Geny homologiczne dla p71 powinny być obecne u wszystkich wirusów NPV. Podobieństwa pomiędzy cyklami życiowymi wirusów NPV a pokrewnymi im GV, czynią wysoce prawdopodobnym, że wirusy GV zawierają geny o właściwościach zbliżonych do p74.

171 938

Obszerne delecje, usuwające gen dla p74 i pobliski gen dla p10, powodują powstanie wirusów niezakaźnych dla larw na drodze pokarmowej, pomimo zachowanej zdolności do wytwarzania poliedronów. Jako że sama delecja genu p10 daje produkcję zakaźnych pokarmowo poliedronów, uważa się, że opisany fenotyp związany jest z delecją genu p74 (15).

Jak opisano w przykładzie I i poniżej, Zgłaszający wytworzył wektor przenoszący (oznaczony Ap74-1), który, po rekombinacji z genomem dzikiego typu daje izolowaną delecję w obrębie genu p74 (Ap74) (fig. 3). Próbki szczepu E. coli HB101 mieszczące wektor przenoszący Ap74-1 zostały złożone przez Zgłaszającego 21 maja 1992 roku w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA i przyznano im numer aTcC 68 988. Zgłaszający, podobnie 21 maja 1992 roku, złożył w ATCC próbki szczepu AcMNPV oznaczonego A4000 (w którym gen p74 został zniszczony poprzez delecję), któremu przyznano numer VR2373.

Zgłaszający potwierdził, jak przedstawiono w przykładzie II poniżej, że to właśnie delecja we fragmencie DNA zawierającym gen p74 jest odpowiedzialna za powstanie form PIB niezakaźnych dla larw na drodze pokarmowej. Forma ECV pomimo to jest niezmiennie wytwarzana i jest zakaźna przy bezpośrednim wstrzyknięciu do organizmu owada.

Pojedyncza delecja fragmentu DNA nie jest jedynym rodzajem modyfikacji użytej dla celowanego zniszczenia funkcji części aparatu genetycznego wirusa. Dla potrzeb tego zastosowania element ten nie jest ograniczony do genów kodujących czynniki działające w układzie trans, jak RNA czy cząsteczki białka, lecz obeemują też czynniki działające w układzie cis, jak enhancery transkrypcji, promotory i inne czynniki kontroli transkrypcji, translacji i replikacji wirusa, jak również sekwencje opakowujące (DNA lub RNA).

Modyfikacja przybiera również formę zmiany fazy odczytu, insercji, rearanżacji genowej, mutacji punktowej i innych typów zniszczenia funkcji genu. Włącza się w to zmianę fazy odczytu, która albo wprowadza stop-kodon, albo prowadzi do wytworzenia niefunkcjonalnego białka. Zakres niniejszego wynalazku obejmuje też wprowadzenie do obszaru genomu kodującego białko stop-kodonu, razem z umieszczeniem genu dla supresorowego tRNA w pomocniczej linii komórkowej.

Inne formy modyfikacji obejmują metody interferencji z funkcjami wirusa, jak hamowanie transkrypcji czy translacji, użycie antysensowanego RNA, wbudowanie do genomu wirusa dodatkowych elementów genowych i dostarczenie odpowiednich sekwencji regulatorowych w układzie trans. Jednym z przykładów tej metody jest użycie UAS drożdży - przedgenowej sekwencji aktywującej transkrypcję, zależnej od białka GAL 4 (UAS GAL).

Umieszczenie sekwencji UAS GAL powyżej określonego genu wirusowego uzależnia jego transkrypcję od obecności białka GAL 4. Pomocnicza linia komórkowa zawiera obszar kodujący białko GAL 4 kontrolowany przez jeden z heterologicznych promotorów opisanych poniżej. Także inne możliwe elementy UAS mieszczą się w obrębie tego wynalazku jak np. te obecne w systemie płciowym drożdży. Obejmuje on także sekwencje regulatorowe, które wymagają związania z białkiem dla aktywacji, takie jak receptory steroidowe i ich miejsca wiążące DNA.

Obejmuje on także użycie promotorów funkcjonujących jedynie w obecności specyficznych białek. Jednym z przykładów jest promotor T7 bakteriofaga T7, wymagający specyficznej dla siebie polimerazy RNA dla zapoczątkowania transkrypcji. Umieszczenie promotora T7 powyżej genu p74, w miejsce naturalnie występującego promotora, uzależnia transkrypcję genu wirusowego od obecności polimerazy RNA T7. Pomocnicza linia komórkowa dla takiego wirusa zawiera polimerazę RNA T7 pod kontrolą heterologicznego promotora jak np. wirusowy promotor IE-1.

Poza genem p74 i genami o homologicznych funkcjach, również modyfikacja innych genów (14) prowadzi do ograniczenia zdolności wirusa do szerzenia się w środowisku.

Szczególnie użyteczne są geny biorące udział w wytworzeniu zakaźnej formy OB. Przykładami są tu elementy zaangażowane w przełączenie aparatu wirusa z produkcji formy ECV na wytwarzanie formy OB; gen bezpośrednio odpowiedzialny za funkcję niezbędną dla ostatecz171 938 nego składania lub dojrzewania cząsteczki wirusa i jeden z genów kodujących białka strukturalne cząsteczki wirusa.

Dalszymi przykładami genów, które są modyfikowane zgodnie z wynalazkiem, są geny związane z powstaniem mutacji FP (few polyhedra), jak gen 25K (18) oraz geny, które po zniszczeniu dają pożądany fenotyp, takie jak czynniki transkrypcyjne odpowiedzialne za włączanie późnych i bardzo późnych genów wirusa; geny dla białek poliedralnej osłonki (32-36,5 kD), gen dla białka formy PDV wiążącego receptor w jelicie środkowym, odpowiadający za pierwotną infekcję komórek jelita środkowego, gen lub element genowy odpowiedzialny za składanie nukleokapsydu formy PDV, gen odpowiedzialny za organizację poliedronu i gen wirusa NPV kodujący funkcjonalny ekwiwalent czynnika wzmagającego (Viral Enhancing Factor) (19), obecnego w wirusach GV.

Chociaż gen dla poliedryny również może być przedmiotem modyfikacji, mogą zaistnieć znaczące ograniczenia praktyczne tego podejścia. Wysoki współczynnik transkrypcji i translacji genu dla poliedryny równoległy do powielania się genomu w trakcie replikacji wirusa sprawia, że ilość poliedryny w komórce sięga 50-70% całego białka zakażonej komórki. Może to spowodować, że ograniczona ilość niewirusowych kopii genu dla poliedryny w komórce linii pomocniczej nie będzie w stanie skompensować braku wirusowego genu dla tego białka. Jednakże komplementacja wirusa z uszkodzonym genem dla poliedryny mogłaby być uzyskana przez dostarczenie elementów regulatorowych, które wystarczałyby w znacznie mniejszej ilości. Przykłady obejmują użycie supresorowego tRNA lub modyfikację struktur regulatorowych wirusowego genu dla poliedryny w połączeniu z namnażaniem wirusa w odpowiedniej pomocniczej linii komórkowej lub w organizmie zmodyfikowanego szczepu owadów, jak opisano wcześniej.

W przeciwieństwie do genu dla poliedryny, białko p74 wydaje się być potrzebne w znacznie mniejszej ilości. Choć gen ten ulega transkrypcji na późnym etapie infekcji wirusowej, gdy genom wirusowy uległ już powieleniu i wtedy poziom mRNA dla p74 jest relatywnie niski. Powinno więc być możliwe uzyskanie konstruktu p74, tak by niewielka liczba niewirusowych kopii zapewniła dostateczną aktywność p74 do komplementacji zmodyfikowanego wirusa dla osiągnięcia jego pełnej zakaźności drogą pokarmową.

Wynalazek opisano na przykładzie wirusa AcMNPV. Geny o funkcjach homologicznych do genu p74 winny być obecne u wszystkich bakulowirusów z grupy NPV i GV. W gatunkach bakulowirusów blisko spokrewnionych z AcMNPV można zidentyfikować geny homologiczne do p74 przez hybrydyzację z fragmentem genu p74 wirusa AcMNPV, w mniej ostrych warunkach. Podejście to ułatwia fakt, iż dostępne dane wskazują na dużą, zachowawczość genu p74 u bakulowirusów (16). Dla wirusów o dalszym stopniu pokrewieństwa, jak GV, podejście to może okazać się nieefektywne. Alternatywne podejście do identyfikacji genów homologicznych do p74 u AcMNPV opisano w przykładzie XIV. W doświadczeniach tych, szczep AcMNPV o ustalonym defekcie genetycznym jest kotransfekowany razem z fragmentami badanego genomu wirusowego. Pozytywny efekt, w postaci efektywnej komplementacji wskazuje na obecność interesującego nas genu. To podejście użyto z powodzeniem dla identyfikacji genu Cydia pomonella GV, o funkcji homologicznej dla genu hamowania apoptozy p35 wirusa AcMNPV (20).

Także inne metody mogą być wykorzystane dla identyfikacji dodatkowych istotnych funkcji późnych genów. Passarelli i Miller (21) opublikowali ostatnio metodę identyfikacji czynników transkrypcyjnych dla późnych/bardzo późnych genów. W metodzie tej fragmenty genomu wirusa AcMNPV są przedmiotem kotransfekcji wespół z konstruktami, które wykorzystują promotory późnych/bardzo późnych genów dla ekspresji genu CAT. Fragmenty genomu AcMNPV, zawierające sekwencje kierujące transkrypcją późnych/bardzo późnych genów wirusa, identyfikowane sąjako te, aktywujące CAT powyżej poziomu tła.

Wytworzenie formy zmodyfikowanego wirusa, jednorazowo zakaźnego dla owada, możliwe jest przez dostarczenie produktu zmienionego genu na drodze komplementacji. Taka zmodyfikowana forma wirusa nie ma jednak zdolności do transmisji poziomej. Mianem kom10

171 938 plementacji określa się zdolność genu występującego w układzie trans do przywrócenia zmutowanemu wirusowi dzikiego fenotypu.

W ramach niniejszego wynalazku zawiera się szereg metod wytworzenia jednorazowo zakaźnej dla owadów formy rekombinowanego wirusa przez komplementację, takich jak:

(1) uzyskanie hodowli tkankowej komórek owadzich, transfekowanych fragmentem DNA, dostarczającym produktu lub funkcji brakującej, bądź uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie;

(2) wytworzenie owadzich linii komórkowych, w sposób stabilny stransformowanych fragmentem DNA, dostarczającym produktu lub funkcji brakującej, bądź uszkodzonej, w zmodyfikowanym wirusie; (3) wytworzenie transgenicznych owadów, posiadających fragment DNA, dostarczający produktu lub funkcji brakującej, bądź uszkodzonej, w zmodyfikowanym wirusie. Linia komórkowa według metod (2) i (3) dostarcza brakującej funkcji, pełniąc rolę pomocniczej linii komórkowej.

Przykładowo, gen p74 wirusa AcMNPV ulega delecji jak podano powyżej. Gen p74 dzikiego typu może uzupełnić ów niedobór przy konkretnym zastosowaniu jednej z trzech powyższych metod: (1) Namnażanie wirusa w komórkach owadzich, zawierających pozachromojomalne kopie funkcjonalnego genu p74. Mogą to być fragmenty DNA, plazmidy zawierające p74 lub plazmidy zdolne do replikacji w czasie podziału komórki czy infekcji wirusowej. (2) Namnażanie wirusa w owadziej linii komórkowej, o jednej lub wielu kopiach p74 trwale włączonych do genomu. (3) Namnażanie wirusa w organizmach owadów transgenicznych, posiadających w genomie jedną lub szereg kopii p74.

We wszystkich tych metodach p74 może pochodzić od AcMNPV lub jakiegokolwiek innego wirusa z rodziny Eubaculoviridae, o ile przywróci to infekcyjność. Kluczową koncepcją jest tu udział funkcjonalnego genu p74 w układzie trans, dostarczającego substancji odtwarzającej dziki fenotyp wirusa.

Według jednej z metod wytworzenia takiej formy wirusa, jest on namnażany w linii komórkowej, która dostarcza utraconej funkcji. Przykładem jest namnażanie wirusa Ap74 w linii komórkowej zdolnej do ekspresji genu dla p74. Przez jej kotransfekcję plazmidem, zawierającym fragment P Hind III AcMNPV, głównie gen p74 z niewielkimi odcinkami własnych sekwencji otaczających oraz wirusem Ap74, uzyskuje się przejściowe odtworzenie zakaźnej dla owadów formy wirusa. Próbki szczepu HB101 E. coli niosącego plazmid AC0028.3, który zawiera wspomniany gen p74 i sekwencje otaczające, został złożony przez Zgłaszającego 21 maja 1992 roku w ATCC i przyznano mu numer referencyjny ATCC 68 987. Metoda ta jest jednak nisko wydajna poprzez fakt, że jedynie 0,1-5,0% komórek, poddanych kotransfekcji, zawiera zarówno funkcjonalny gen p74 jak i zmodyfikowany genom wirusa Ap74.

Metodą bardziej wydajną jest stworzenie pomocniczej linii komórkowej poprzez umieszczenie na stałe genu p74 w jej genomie (patrz przykład VI). Procedura taka została użyta dla wprowadzenia genów innych wirusów do linii komórek owadzich Sf9 (22). Linia Sf9 (numer ATCC - CRL 1711) pochodzi od Spodoptera frugiperda 21 (Sf21). Plazmid zawierający interesujący nas gen jest tu wprowadzony razem z plazmidem niosącym określony znacznik selekcyjny.

Znacznik selekcyjny jest genem, którego ekspresja pozwala na identyfikację komórek efektywnie stransformowanych wektorem niosącym ten gen razem z genem będącym przedmiotem naszego zainteresowania. Przykładami powszechnie używanych znaczników selekcyjnych są geny dla kinazy tymidynowej (TK) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninówej (HGPRT) oraz geny niosące oporność na antybiotyki, szczególnie neomycynę i bigromycynę.

Najczęściej używa się wektory zawierające właściwy gen i gen znacznikowy w stosunku między 2:1 a 20:1. Maksymalizuje to 'prawdopodobieństwo, że komórka nosząca marker selekcyjny zawiera też pożądany gen. Użyta ' linia komórkowa musi być permisywna dla danego typu wirusa. W najkorzystniejszym dla AcMNPV zastosowaniu linią tą jest Sf9 lub Sf21. Po transfekcji, komórki są hodowane w warunkach selekcyjnych, tak że te niosące marker selek171 938 cyjny ulegają wybiórczemu namnożeniu. Następnie są one sprawdzane w teście komplementacji wirusa z delecjąp74.

Metoda ta została użyta do izolacji linii komórek Sf9, niosących opisany uprzednio plazmid AC0028.3, zawierający p74. Próbki linii komórkowej oznaczonej Sf9 (28.3) CL-2. zawierające na stale zintegrowane z genomem kopie plazmidu AC0028.3, zostały złożone przez Zgłaszającego 7 kwietnia 1993 w ATCC i przyznano im numer ATCC - CRL 11 332. Jak opisano w przykładzie VII, Zgłaszający potwierdził, że namnażanie zmodyfikowanego wirusa Ap74, niezakaźnego na drodze pokarmowej, w powyższych komórkach, prowadzi do otrzymania infekcyjnej formy wirusa Ap74.

Możliwość komplementacji nie jest ograniczona do namnażania wirusa w hodowli komórkowej. Podobnie jak pomocniczą linię komórkową, tak też można wytworzyć pomocniczy szczep owadów. Na przykład, transformacja elementem P Drosophila jest obecnie praktykowana rutynowo i można zaprojektować podobny system dla innych owadów. Co więcej, transformacja organizmu owada może być osiągnięta bez użycia wektorów, podobnymi technikami do wykorzystywanych w organizmach ssaków. Bezpośrednie wstrzyknięcie (23) lub transformacja balistyczna (24) jaj pre-blastodermalnych, z użyciem filamentów metalowych, pozwala na wytworzenie owadów niosących potrzebny gen.

Relatywnie słaby, własny promotor p74 wystarcza dla produkcji białka p74. Jednakże może być wskazane użycie silniejszego lub działającego wcześniej promotora dla kontroli genu p74. Użycie heterologicznego promotora mogłoby usprawnić komplementację wirusa Ap74. Dostępnych jest obecnie szereg promotorów wirusowych. Przykładami są promotor 6.9K (białko zasadowe), promotor DA26, promotor poliedryny, promotor 39K, promotor 35K, promotor p10 oraz promotor IE-1.

Zastosowanie konstruktów o heterologicznych promotorach, jak te opisane w przykładach IV i V, niesie dodatkową korzyść. W przypadkach tych niemal wszystkie sekwencje homologiczne po stronie 5' delecji w obrębie genu p74 wirusa A4000 Ap74, opisanego w przykładzie I, są usunięte. Powinno to do minimum zmniejszyć możliwość zajścia rekombinacji homologicznej pomiędzy Ap74 a funkcjonalnym genem p74, zintegrowanym z genomem komórki. Rekombinacja homologiczna tego typu mogłaby przywrócić gen p74 oraz dziki fenotyp zmodyfikowanemu wirusowi (patrz dyskusja w przykładzie VII). Kolejnym krokiem dla zmniejszenia szansy takiej rekombinacji jest zwiększenie obszaru delecji w obrębie genu p74 wirusa Ap74, tak by nie pozostawały żadne sekwencje kodujące. W prosty sposób można to uzyskać, modyfikując protokół podany w przykładzie I.

Jako obcy promotor nie musi być użyty promotor wirusowy. Promotory komórkowe dostępne są tu również. Wśród przykładów są promotor aktynowy Bombyx mori i promotor hsp 70 Drosophila melanogaster. Właściwe promotory utrzymują aktywność na średnim do wysokiego poziomie w komórkach owadów w trakcie infekcji wirusowej. Te cechy nie ograniczają nas jednak do promotorów owadów. Istotne kryteria spełniać też mogą promotory kręgowców, drożdży oraz wirusów innych klas. Każdy z nich może też kontrolować ekspresję znacznika selekcyjnego.

W dalszych zastosowaniach przedstawionego wynalazku, do genomu wirusowego wprowadza się obcy gen kodujący substancję niszczącą lub modyfikującą aktywność owada.

Substancja ta to przykładowo toksyna, neuropeptyd lub hormon albo enzym. W szczególnym przypadku, gen ten jest wprowadzony bezpośrednio w miejsce modyfikacji elementu genetycznego wirusa, co znaczy, że rekombinacja między zmodyfikowanym wirusem a wirusem dzikiego typu, w przypadku superinfekcji, najczęściej nie będzie w stanie odtworzyć wirusa o dzikim fenotypie i niosącym wspomniany obcy gen. Podobnie, w ramach przedstawianego wynalazku mieści się umieszczenie obcego genu w miejscu przyległym do osiągniętej modyfikacji genomu wirusa, tak że segregacja owego genu i zmienionego elementu możliwa będzie u mniej niż 10% wirusów potomnych. W obydwu przypadkach uzyskuje się ograniczenie zdolności zmodyfikowanego wirusa do transmisji poziomej.

Do toksyn, o których mowa, zalicza się specyficzna dla owadów toksyna AalT skorpiona Androctonus australis (25), toksyna roztocza Pyemotes tritici (2), toksyna Bacillus thurin12

171 938 giensis subsp. aizawai (4), toksyna jadu pająka (26) i toksyna BTI Bacillus thuringiensis CiyIVD (3). PrzakłaCkmi neuroprptydów i hormonów, możliwych tu do zastosowania, są ekdazon (hormon wylinkowy) (6), hormon protorakotropowy (PTTH), hormon adipokezrtyozny, hormon diuretyczny i prootoliza (5). Przykładem enzymów jest tu esteraza hormonu juwezilnego (JHE) (7).

Przykładowo, rekombinowany bakulowirus, o uszkodzonym lub usuniętym genie p74 i obcym genie wprowadzonym w miejsce uszkodzenia, ma zwiększoną aktywność owadobójczą lecz jest niezdolny do przenoszenia się w środowisku naturalnym, z jednego na inne owady.

Jak opisano poniżej w przykładach XI-XII, wyizolowano wirus AcMNPV z wprowadzonym, w miejsce delecji w genie p74 (wirusa Δρ74 A4000) genem dla toksyny skorpiona AalT, specyficznej dla owadów, pozostających pod kontrolą promotora wirusowego DA26. Próbki tego wirusa, oznaczonego A4001, zostały zdeponowane przez Zgłaszającego w Americkz Type Culture Collection 7 kwietnia 1993 i przyznano im numer ATCC VR2405. Namnapkzir się tego wirusa w komórkach Sf9 o ziezmodyfekowkzym genomie prowadzi do uzyskania ziezakaźnyoh (zgodnie z oczekiwaniem) na nronze pokarmowej form PIB. Jeżeli wirus nkmzkPkny jest w komórkach linii pomocniczej Sf9 (28.3) CL-2, opisanej powyżej, powstają formy PIB zakaźne na drodze pokarmowej, a zarażone owady wykazują objawy porażenia skurczowego, charakterystycznego dla działania toksyny AalT (patrz przykład XII pozepdj).

NαmzaPkzir wirusa w linii komórkowej lub w organizmach owadów tnαzagdzicznaoh, dostarczających funkcjonalnego produktu genu p74, umożliwia wirusowi zakażenie owada poprzez jelito. Jednakże, jako że brak jest dalszej komplementach, normalna populacja owadów wytwarza jedynie formy defektywne pod względem zakaźności drogą pokarmową. Tak więc, przy braku koinfekcji wirusem dzikiego szczepu, cykl życiowy rekombizowkzdgo wirusa kończy się w obrębie tej pojedynczej infekcji. Jest to sytuacja odmienna niż publikowane wcześniej propozycje użycia bakulowirusów jako bioinaektycynów (2), kiedy to, po śmierci zarażonego owada, formy OB wirusa są uwalniane do otoczenia, gdzie są następnie zjadane przez izzr owady i tak dochodzi do powtórzenia cyklu życiowego wirusa, a więc i transmisji poziomej zakażenia.

Co, być może, najistotniejsze dla tego wynalazku, wprowadzenie obcego genu dla toksyny, zruropeptadu, hormonu czy enzymu, w miejsce przyległe do lub bezpośrednio w miejsce modyfikacji elementu genetycznego wirusa, dostarcza pewności, że jakakolwiek rekombinacja homologiczna, pomiędzy wirusem zmodyfikowanym genetycznie a wirusem dzikiego szczepu, odtworzy jedynie oryginalne genotypy rodzicielskid.

Dla przykładu, wbudowanie genu dla toksyny w miejsce delrcji w genie p74, prowadzi do powstania wirusa o fenotypie toksyczność (+) / zakaźność pokarmowa (-). Rekombinacja z dzikim szczepem wirusa (toksyczność (-) / zakaźność pokarmowa (+)) prowadzić może jedynie do wytworzenia wirusów potomnych o fenotypach toksyczność (+) / zakaźność pokarmowa (-) i toksyczność (-) / zakaźność pokarmowa (+). Wyelimizowkza jest możliwość rekombinacji dającej efekt w postaci fenotypu toksyczność (+) / zakaźność pokarmowa (+) poprzez fakt, że miejsce nrlecji jest identyczne z miejscem wprowadzenia obcego genu, a zid położone w odległym loci genomu wirusa. W takim więc przypadku, gen kodujący toksynę znajdować się może jedynie w genomach potomnych, obarczonych delrcją, zapobiegającą przed wytwarzaniem infekcyjnych pokarmowo form OB. To ognaziczezid rozprzestrzeniania się obcego genu cechuje się dużym stopniem zachowawczości i zmodyfikowany wirus zanikać będzie znacznie szybciej niż dzikie szczepy wirusa w tym samym ekosystemie, na skutek obniżonej zdolności do wytwarzania potomstwa.

Dla lepszego znozumidnik przedstkwikzego wynalazku przedkładamy następujące przykłady. Przykłady te podajemy wyłącznie dla celów lepszego zobrazowania wynalazku i w żadnej mierze nie mogą być uważane za ramy, ograniczające jego zakres.

Standardowe techniki biologii molekularnej zastosowano zgodnie z przepisami podanymi w podręczniku Sambrook et al. (27). Standardowe techniki ’ namzkżkzia i produkcji bakulowirusów stosowano według przepisów przedstawionych w pracy Summers i Smith (28). Wszystkie odnośniki do wskazywanych fragmentów restrykcyjnych genomu AcMNPV oparte

171 938 są na mapach genomu szczepu E2 wirusa AcMNPV, opublikowanych w pracy Summers i Smith (28),

Przykład I. Konstrukcja wektora przenoszącego Ap74-1 i rekombinowanego wirusa A4000.

Wektor przenoszący Ap74-1 skonstruowano dla celu uzyskania delecji w genie p74 szczepu E2 wirusa Autographa californica NPV, w okolicy 90 jednostki mapowania genomu bakulowirusa (patrz fig. 1). Fragment E Bst EH, zawierający DNA kodujące p74, wyizolowany został z DNA wirusa Szczepu E2. Fragment ten subklonowano w miejsce Bst Eli wektora plazmidowego pSE280 (Invitrogen, San Diego, Kalifornia). Klon ten oznaczony jest jako LB10.2. Fragment kodujący region 5' genu p74 wraz z sekwencjami otaczającymi 5' wyizolowano z LB10.2 przez trawienie Nco I, wypełnienie miejsca Nco I przez polimerazę DNA T4 i oczyszczenie otrzymanego fragmentu na żelu. Ów fragment Nco I, wypełniony do miejsca Xho I, jest subklonowany pomiędzy miejsca Kpn I a Xho I plazmidu LB9.6. Plazmid LB9.6. jest pochodną plazmidu Bluescript SK (Stratagene, La Jolla, Kalifornia), w którym umieszczono polilinker w miejscu Hinc Π. Linker ten zawiera dodatkowe, unikalne miejsca restrykcyjne, przydatne dla wbudowania obcego genu w miejsce delecji p74 (patrz niżej). Uzyskany plazmid, obejmujący sekwencje 5' geny p74 i 5' sekwencje otaczające, opisane powyżej, oznaczono jako LB 11.12. Fragment od Hpa I do Bam HI genu p74, kodujący jedną trzecią genu p74 od końca 3' oraz sekwencje 3' otaczające, został wyizolowany i wklonowany pomiędzy miejsca Eco RV i Bam HI plazmidu LB11.12. Uzyskany klon to wektor przenoszący Ap74-1 (patrz fig. 2). Wektor ten zawiera 4750 par zasad sekwencji otaczających 5', sekwencje genu p74 od 1 do 69 pary zasad, 64 pary zasad opisanego powyżej polilinkera plazmidowego, sekwencje genu p74 od 1287 pary zasad do kodonu terminacyjnego w pozycji 1937 bp oraz 1796 par zasad sekwencji otaczającej 3' (15). Fig. 3 opisuje bardziej szczegółowo delecję w obszarze kodującym p74. Przedstawiony wektor transferowy jest następnie użyty do uzyskania szczepu A4000 wirusa na drodze standardowych technik kotransfekcji (29). Dwa miliony komórek Sf9 wysiano na 60 mm średnicy płytce do hodowli tkankowych. Po przyczepieniu się komórek do podłoża, pożywkę usunięto i zastąpiono ją 0,75 ml pożywia Grace, wzbogaconej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) z dodatkiem antybiotyków. 1 fg DNA wirusa AcMNPV z 2 jag DNA Ap74-1 dodano do 0,75 ml buforu transfekcyjnego (25 mM HEPES, pH 7,1, 140 mM NaCl, 125 mM CaCĘ). Z kolei, DNA dodawano kroplami do komórek, które następnie inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 27°C. Po 4 godzinach pożywkę usunięto i delikatnie przepłukano komórki świeżym TNMFH z dodatkiem 10% FCS i antybiotyków. Następnie komórki hodowano w świeżym TNMFH z 10% FCS i antybiotykami. Po 4-5 dniach zebrano formy ECV i przeprowadzono izolację poszczególnych łysinek w teście łysinkowym, jak opisali Summers i Smith (28).

Pojedyncze łysinki użyto następnie do infekcji pojedynczych dołków w 48 dołkowej płytce do hodowli tkankowych, w których uprzednio wysiano 7,5 x 10⁴ komórek Sf9 w 0,5 ml świeżej pożywki TNMFH. Po 5 dniach, spulowano po 10 mcl nadsączy, zawierających pączkujące wirusy, z każdego dołka w kolumnie oraz z każdego dołka w rzędzie. Ustawiono reakcję PCR z użyciem 4 mcl spulowanych nadsączy i z zastosowaniem oligomerów A i C, jak przedstawiono na fig. 3. Ponieważ oligonukleotyd C jest specyficzny względem zdeletowanego p74, fragment DNA ulegnie amplifikacji jedynie w tych próbkach, które zawierają DNA rekombinowanego wirusa. Reakcję PCR ustawiono następująco: 4 mcl spulowanych nadsączy trawiono przez godzinę w temperaturze 55°C w obecności 200 mcg/ml niespecyficznej proteazy Streptomyces griseus (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) w objętości 25 mcg w środowisku jednokrotnego buforu A (10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM Kcl, 0,1 mcg/ml żelatyny, 0,45% Nonidetu P40 (Shell Oil Co,) i 0,45% Tweenu 20 (ICI Americas, Inc.)). Następnie zinaktywowano niespecyficzna proteazę przez ogrzewanie do 90°C przez 12 minut. Amplifikację PCR prowadzono w 50 mcl mieszaniny traktowanego proteazą wirusa z 50 pikomolami każdego z wyszczególnionych primerów oligonukleotydowych, w obecności 200 mM każdego z czterech dezoksyrybonukleotydów (dATP, dGTP, dCTP i dTTP), 1,5 mM MgCl₂, jednokrotnego buforu A i 1,25 jednostek AmpliTaq polimerazy DNA (Perkin-Elmer/Cetus,

171 938

Norwalk. Cincinatti). Próbki były poddane 30 cyklom amplifkacji, z których każdy składał się z jednominutowej denaturacji (94°C), 1,5 minuty przyłączania primerów (55°C) i 2,5 minut wydłużania (72°C). Po 25 cyklach następował 7 minutowy etap wydłużania (w temperaturze 72°C). 20 mcg mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie na żelu agarozowym, dla wykazania obecności rekombinowanego wirusa. Ponieważ nadsącze pulowano uprzednio w kolumnach oraz w rzędach, obecność rekombinowanego wirusa w danym dołku rozpoznawano po pozytywnym wyniku dla określonego rzędu i dla określonej kolumny.

Przykład II. Wykazanie fenotypu wirusa A4000 w teście na krążku liścia z wykorzystaniem larwy Heliothis virescens.

Dla sprawdzenia zakaźności szczepu A4000 przeprowadzono, na larwach trzeciego stopnia Heliothis virescens, standardowy test na krążku liścia. 1 pg kroplę zawiesiny wirusa (o określonej dawce formy PIB) w buforze TET (50 mM Tris/HCl, pH 7,5\10 mM EDTA/O, 1% Triton Χ-100 (Rhom & Haas, Filadelfia, Pensylwania), nałożono na 5 mm krążek liścia bawełny w każdym dołku, zawierającym zwilżony krążek papieru filtracyjnego (około 4 mm średnicy - 30 pl wody). Po wyschnięciu kropli, w każdym dołku umieszczono jedną larwę i zakryto dołek. Odżywiające się liśćmi larwy pozostawiono przez noc. Następnego dnia rano larwy, które zjadły liść całkowicie przeniesiono pojedynczo do dołków, zawierających zwykłą pożywkę dla owadów. Monitorowano umieralność larw aż do momentu wypoczwarzenia się tych, które przeżyły.

Tę samą procedurę powtórzono z dzikim szczepem E2 wirusa AcMNPV oznaczonym symbolem A1000, którego użyto jako kontroli. Wyniki dwóch niezależnych testów podano poniżej:

Wirus	Dawka (ilość form PIB)	Liczba martwych/żywych gąsienic
Test 1
A4000 ( Ap74)	2,5 x 105	1/31
	5x 104	0/32
	5x 103	0/31
	5x 102	0/32
A1000 (dziki szczep)	5Χ102	16/18
	5 x 101	14/31
Test 2
A4000 (Ap74)	5 x 10«	0/20
	5 x 105	0/21
	5 x 104	0/24
	5 x 103	0/20
A1000 (dziki szczep)	5 x 102	22/32
	5x 101	5/32

Wyniki te wykazują brak zakaźności drogą pokarmową wirusa zawierającego delecję w obrębie genu p74, nawet przy dawkach tysiąckrotnie większych niż w przypadku wirusa zakaźnego, o nienaruszonym genie p74. Śmierć jednej larwy obserwowana w obecności wirusa A4000 (test 1) była najprawdopodobniej wynikiem innych czynników, niezwiązanych z samą infekcją wirusową.

171 938

Przykład III. Komplementacja genetyczna wirusa A4000 dla wytworzenia zakaźnej dla owadów formy wirusa poprzez jego namnażanie w linii komórkowej, zawierającej kopię fragmentu P Hind III AcMNPV, niezintegrowanej na stałe z genomem komórki.

Komórki Sf9 zostały poddane kotransfekcji według standardowego protokołu, podanego w przykładzie I. 1 mcg genomowego DNA wirusa A4000 w obecności lub bez DNA plazmidu AC0028.3, w dziesięciokrotnym nadmiarze molowym, użyto dla przeprowadzenia transfekcji. AC0028.3 składa się z fragmentu P Hind III wirusa AcMNPV wbudowanego do miejsca Hind III Błuescript Ks II (Stratagene, La Jolla, Kalifornia). Fragment P Hind III jest pokazany w górnej części fig. 2, jako część fragmentu E AcMNPV. Fragment ten zawiera całą sekwencję kodującą p74, wraz z 221 bp sekwencji otaczających 5' i 56 bp sekwencji otaczających 3'. Po 48 godzinach uzyskano struktury poliedralne z zakażonych komórek poprzez odwirowanie przy niskiej prędkości obrotowej i zawieszenie ich w buforze TET. Do zawiesiny wirusa dodano SDS w stężeniu końcowym 1. Komórkowe DNA wydzielono przez energiczne mieszanie i pipetowanie. Następnie oddzielono komórkowy DNA, kilkakrotnie płucząc formy PIB w buforze TET bez SDS i wirując przy niskiej prędkości obrotowej. Ostatecznie formy PIB zawieszono w buforze TET i policzono w hemocytometrze przed przeprowadzeniem testu zakaźności. Test przeprowadzono według opisu w przykładzie DL W dawce 1 x 10⁵ formy PIB uzyskane z komórek Sf9 transfekowanych jedynie DNA wirusa A4000 nie powodowały śmierci larw. Formy PIB uzyskane z komórek Sf9 po kotransfekcji DNA A4000 i Ac0028.3 powodowały śmierć larw poprzez zakaźność tej formy wirusa. Tak więc, namnażanie wirusa A4000 w komórkach dostarczających białka p74 (wskutek obecności plazmidu AC0028.3) powoduje wytworzenie form wirusa zakaźnych dla owadów. Wirus taki jest w stanie zapoczątkować produktywną infekcję w organizmie larwy. Wyniki te potwierdzono uzyskując formy PIB z martwych larw. Formy PIB uzyskano przez umieszczenie martwych larw w pojemnikach, których dno, po usunięciu, zastąpiono Nytex’em (nazwa zastrzeżona dla Tetko, Bnarcliff Manor, Nowy Jork). Martwe owady przepłukiwano buforem TET (1 ml/larwę), zbierając popłuczyny zawierające formy PIB wirusa. Tak uzyskane PIB, zawieszano następnie w buforze TET z dodatkiem 1%o SDS, mieszano i odwirowywano przy niskiej prędkości obrotowej. Następnie płukano je kilkakrotnie w tym samym buforze bez dodatku SDS. Izolację DNA z tak uzyskanych form PIB wirusa przeprowadzono według przepisu na stronie 35 w publikacji Summersa i Smitha (28). Dla wykazania obecności zmodyfikowanego wirusa Ap74 w martwych larwach, przeprowadzono następnie amplifikację PCR, z użyciem primerów oligonukleotydowych, opisanych w przykładzie I.

Przykład IV. Budowa wektora ekspresyjnego zawierającego promotor heterologiczny.

Użycie heterologicznych promotorów dla sterowania ekspresją genu dla p74 może zwiększyć efektywność komplementacji genetycznej zmodyfikowanego wirusa Ap74. Wygodne dla tego celu wektory ekspresyjne winny zawierać następujące moduły: (1) moduł heterologicznego promotora, użytego dla regulacji transkrypcji; (2) moduł polilinkera, ułatwiający wbudowanie sekwencji DNA, których ekspresję chcemy uzyskać; (3) 3'UTR, dostarczający miejsca pierwotnej obróbki transkryptu i poliadenylacji (patrz fig. 4). Tak zbudowany wektor ekspresyjny, zawierający promotor DA26 wirusa AcMNPV, polilinker i 3’UTR 6.9 k zasadowego białka AcMNPV, został oznaczony jako pMEV1. Próbki szczepu E. coli DH5 alfa zawierające specyficzny przykład pMEV1, oznaczony jako AC0064, zostały zdeponowane przez Zgłaszającego w American Type Culture Collection 7 kwietnia 1993 i przyznano im numer ATCC 69275.

Dodatkowe wektory mogą być z łatwością przygotowane na drodze substytucji fragmentu Pst I/Xba i pMEV1, zawierającego promotor, przez fragmenty uzyskane trawieniem Pstl/Xba I, mieszczące promotory wirusa AcMNPV dla genów 6.9K (pMEV2), poliedryny (pMEV3) i dla genu 35k (pMEV4).

Fragmenty promotorowe użyte dla konstrukcji tych wektorów uzyskano przez amplifikację PCR klonowanego DNA wirusa, przy zastosowaniu specyficznych względem każdego z promotorów par oligonukleotydowych primerów. Primery zaprojektowano tak by powielone

171 938 segmenty promftfrowe posiadały następującą budowę ogólną: (1) 5' końcową sekwencję syntetycznego heteropolimeru, zawierającego miejsca restrykcyjne dla enąonnkiepz Sst I, Sse 83871 i Stu I (w tej właśnie kolejności); (2) segment wirusowego DNA, rozciągający się od punktu leżącego 100-350 bp powyżej głównego miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu, do 3' końca 5'UTR (to jest w pozycji -1 w stosunku do kodom inicjacji transkrypcji) i (3) 3' końcowej sekwencji heteropolimerycznej zawierającej miejsca restrykcyjne dla endonukleaz Esp 3I i Xba I (w tej właśnie kolejności). Położenie i orientacja miejsca rozpoznawanego przez Esp 3I umiejscawia miejsca trawienia pomiędzy pozycjami -4 a -5 na nici (+) oraz pomiędzy pozycjami-1 a +1 na nici (-).

Matrycą, użytą do przygotowania promotorów 35K, jest fragment K Hind III wirusa AcMNPV. Sekwencja primera, komplementarnego do nici (+), obejmuje sekwencję heteropolimera z miejscami restrykcyjnymi dla enzymów Sst I, Sse 83871 i Stu I oraz sekwencję 5' 35K od -399 do -382. Primer, komplementarny do nici (-), zawiera sekwencję 5' 35K od -21 do -1, za którą mieści się region heteropołimeru z miejscami restrykcyjnymi enzymów Esp 31 i Xba). Dla )każdee re^kcj ωρ^ΐφ, aniesamo 50 pikomoh odpowiednie piay primerów z 250 pg matrycowego DNA w objętości 50 mci mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 10m Tris/HCl (pH 8,3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl₂, 200 mcg dezo/krybonukieotyąów, WOmcg/ml żelatyny i 2,5 jednostek polimerazy DNA Amplitaq (Perkin-ElmerrCetns, Norwalk, Cincinatti). Próbki były poddane 25 cyklom amplifikacji, z których każdy składał się z jednominutowej ąenatnracji (94°C), 1,5 minuty przyłączania primerów (55°C) i 2,5 minut wydłużania (72°C). Jak i w innych reakcjach, po 25 cyklach następował 7 minutowy etap wydłużania.

Każdą reakcję zakańczano dodaniem EDTA do stężenia 10 mM i Sαrkfzyin (N-lanrylo/prkozynian sodu) do stężenia 0,2% (w/v).

Produkty reakcji poddano następnie jednorazowej ekstrakcji chloroformem, następnie fenolem z chloroformem, następnie strąceniu alkoholem etylowym. Próbki DNA zawieszono w odpowiednim buforze i trawiono Pst I (rozpoczynającym sekwencję centralnych 6 par zasad [CTGA|G] miejsca Sse 83871 i Xba I. Każdy spodziewany fragment promotorowy oczyszczano następnie przez elektroforezę na 1,2% żelu agarozowym (niskotopliwym) i ligowano z 3.2 kb fragmentem Pst IrXba I wektora, uzyskanym z pMEVl. Fragment ten zawiera moduł poldinkera, moduł 3' UTR oraz otoczenie Bluescript SK+ z pMEV1. Pożądane produkty rekombinacji są rozpoznawane przez analizę restrykcyjna i sekwencjonowanie DNA. Osoby o przeciętnych zdolnościach w tym zakresie mogą powtórzyć powyższą procedurę dla jakiegokolwiek regionu promotorowego o znanej sekwencji, jak na przykład promotor 6.9K AcMNPV, promotor poliedryny, czy promotory komórkowe, jak np. promotor białka szoku termicznego (hsp) 70 Drosophila melanogaster.

Przykład V. Wytworzenie połączenia heterologicznego promotora z regionem kodującym genu p74.

Region kodujący białko genu p74 wyizolowano dla celu wbudowania go do wektorów ekspresyjnych, zawierających heterologajzny promotor (jak opisano w przykładzie IV), przez pmplifikPcję PCR odpowiedniego regionu AC0028.3. 24 bp primer komplementarny do nici (+), użyty dla tej repkcCi, posiada koniec 5' odpowiadający ATG - mieC/cn rozpoczęcia trpnsiacCi genu p74. Primer komplementarny do nici (-) ma długość 29 bp i składa się z 20 bp końca 3' genu p74, kończąc się kodonem terminacyjnym translacji TAA. Następuje potem 9 bp dodatkowej sekwencji, zawierającej Bam HI. Na warunki PCR składa się mieszanina 250 pmoh AC0028.3 z 50 pmolami każdego z wyszczególnionych primerów oligonnkieotydowych w 50 μg mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 200 mcg każdego z dezorsyrybonnrieolyąów (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1,5 mM MgCł₂, jednokrotnego bufom A i 1,25 jednostek polimerazy DNA AmpliTaq (Perkin-ElmeraCetus, NorwaJk, Cincinatti). Próbki były poddane 5 cyklom pmpiifikacji, z których każdy składał się z jednominutowej denαlurαcji (94°C), 1,5 minuty przyłączania primerów (45°C) i 2,5 minut wydłużania (72°C). Po 5 cyklach następował 7 minutowy etap wydłużania w 72°C.

171 938

Po oczyszczeniu, produkty reakcji traktowano fragmentem Klenowa polimerazy DNA I, w obecności wszystkich 4 dezoksyrybonukleotydów, dla wypełnienia końców wszystkich produktów PCR. Koniec 3' regionu kodującego p74 jest następnie trawiony Bam HI i otrzymane fragmenty są oczyszczane za pomocą elektroforezy na żelu z użyciem 1%o agarozy niskotopliwej. Uzyskany fragment jest następnie klonowany do któregokolwiek z wektorów ekspresyjnych, opisanych w przykładzie IV. Dla przygotowania wektorów ekspresyjnych do wbudowania genu p74, każdy wektor zostaje trawiony Esp I a uzyskane lepkie końce 5' są następnie wypełniane przy użyciu polimerazy DNA I (fragmentu Klenowa) w obecności wszystkich czterech dezoksyrybonukleotydów. Każdy preparat jest następnie trawiony BamHI. Wektor oddziela się od uwolnionego fragmentu polilinkera przez elektroforezę na 1%o niskotopliwym żelu agarozowym, a następnie liguje się w osobnych reakcjach do fragmentu kodującego p74.

Przykład VI.Izolacja ustalonej linii komórkowej Sf9, zawierającej funkcjonalną kopię genu p74, w sposób trwały zintegrowaną z genomem komórki.

W tym przykładzie, komórki wywodzące się z linii Sf9, posiadające konstrukty, zawierające gen p74, włączone w sposób trwały do genomu, zostały wyizolowane, jak opisano w pracy Jarvis et al. (22). W tym szczególnym przypadku użyto plazmidu oznaczonego jako AC0028.3 (ATCC 68 987). Plazmid ten zawiera fragment P Hind III AcMNPV, obejmujący gen p74 wraz z niewielką ilością własnych sekwencji otaczających. W pierwszym etapie, komórki Sf9 są poddane kotransfekcji mieszaniną 2 μg plazmidowego DNA AC0028.3 i 1 gg DNA plazmidu IE-1 Neo (22). Po transfekcji, komórki inkubowane są przez 2 godziny w temperaturze 28°C. Następnie komórki wysiewa się w niskiej gęstości dla wytworzenia rzadkich hodowli i dostarcza się im kompletnego medium TNMFH z dodatkiem analogu neomycyny G418 (Gibco-BRL, Grand-Island, N. Y.) o stężeniu 0,5 mg/ml (w przeliczeniu na składnik aktywny). W tych warunkach komórki hodowane są przez 1 tydzień w temperaturze 28°C. W końcu tygodnia pożywka jest wymieniona na TNMHf bez G418. Dla każdej z trzech oddzielnych płytek stosuje się następującą procedurę. Komórki, które przeżyły, są zbierane i namnażane. Te trzy namnożone pule komórek są oznaczone jako Sf9(28.3)CL-1, Sf9(28.3)CL-2 (ATCC CRL 11 322) i Sf9(28.3)CL-3. Te mieszane populacje hoduje się i następnie sprawdza na obecność genu p74 używając PCR-u, jak opisano w przykładzie I, z zastosowaniem oligomeru A (komplementarnego do nici (+) genu p74) i oligomeru B (komplementarnego do obszaru nieobecnego w genie p74 szczepu wirusa A4000), j ak przedstawiono na fig. 3.

Przykład VII. Wytworzenie zakaźnego dla owadów wirusa A4000, poprzez jego namnażanie w powyżej opisanych liniach komórkowych oraz wykazanie jego fenotypu.

Każda z linii komórkowych przedstawionych w przykładzie VI została zainfekowana wirusem szczepu A4000 przy wielokrotności infekcji powyżej 1. Namnażanie wirusa można prowadzić przy współczynnikach MOI w zakresie od 0,01 do 20. Formy PIB zebrano z zakażonych komórek, jak opisano w przykładzie III. Standardowy test na krążku liścia przeprowadzono według przepisu podanego w przykładzie II. Poniżej przedstawiono wyniki trzech oddzielnie przeprowadzonych testów. Wirus A1000 jest dzikim szczepem E2 wirusa AcMNPV.

Wirus/Linia komórkowa (numer pasażu)	Dawka	Przeżywalność	r Śmiertelność
1	2	3	4
Test 1
A4000/Sf9	1 x 105	0/16	0
A4000/CL-1(P3)	1 x 105	7/17	44
A4000/CL-2(P2)	1x 105	19/15	60
A4000/CL-3(P2)	1x105	6/16	38
A1000/Sf9	1x 103	30/32	94
kontrola	0	0/30	0

171 938

1	2	3	4
Test 2
A4000/Sf9	1x 105	0/15	0
A4000/CL-1(P3)	1x 105	1/15	6
A4000/CL-2(P2)	1 x 105	4/16	25
A4000/CL-3(P2)	1x 105	6/16	38
A1000/Sf9	1x1(3	21/28	75
kontrola	0	0/30	0
Test 3
A4000/Sf6	1 x 105	0/16	0
A4000/CL-1(P7)	1x 105	5/16	31
A4000/CL-2(P6)	1x 105	5/16	31
A4000/CL-3(P6)	1x 105	0/16	0
A4000/CL-3(P2)	1x 105	3/15	20
A1000/Sf9	1x103	17/31	55
kontrola	0	0/15	0

Jak wskazują podane powyżej wyniki, gdy trwale stransformowane plazmidem AC0028.3 komórki linii Sf9 zostają zakażone wirusem A4000, powstają zakaźne dla owadów formy PIB wirusa. W przeciwieństwie, formy PIB uzyskane przez namnażanie się wirusa w macierzystych, niezmienionych komórkach Sf9, nie powodują, śmierci larw. Oznacza to, że namnażanie wirusa A4000 w komórkach dostarczających funkcjonalnego białka p74 (poprzez stabilną integrację konstruktu, zawierającego funkcjonalny gen p74, co opisano w przykładzie VI) prowadzi do wytworzenia zakaźnej dla owadów formy wirusa A4000. Nieznany jest powód utraty zdolności do komplementacji wirusa przez linię komórkową Sf9(28.3)CL-3 w 6 pasażu.

W następnym kroku przygotowano DNA (jak opisano w przykładzie III oraz w publikacji Summersa i Smitha (28) na stronie 35) z form PIB, indywidualnie zebranych z każdej z 20 larw zabitych przez wirusa w teście 1, powyżej. Przeprowadzono reakcję PCR według procedury z przykładu I; z primerami A i C dla wykazania obecności wirusa Ap74 oraz z primerami B i D dla wykazania wirusa dzikiego szczepu (patrz fig. 3 - opis primerów).

Wyniki wykazały, że wszystkie 20 larw zainfekowane było zmodyfikowanym wirusem Δρ74. Poza pozytywnym sygnałem dla wirusa Δρ74, w przypadku 5 z 20 larw wykazywano silny prążek, odpowiadający niezmodyfikowanemu genowi dla p74. Test na krążku liścia (patrz przykład II) przeprowadzono z użyciem form PIB uzyskanych 18 spośród 20 larw, zabitych w teście 1. Dawkę 1 x 10⁵ PIB/larwę zastosowano w przypadku 32 larw użytych w kolejnym teście. Jedynie wirusy uzyskane z 4 larw, wykazujących obecność niezmodyfikowanej formy wirusa p74, powodowały śmiertelność larw większą od tła. Żadna z 14 larw, pozytywnych jedynie względem DNA zmodyfikowanego wirusa, nie powodowała wzrostu śmiertelności larw powyżej poziomu tła.

Nie wykluczając innych możliwości, efekt ten można przypisać dwu przyczynom. Bardziej bezpośrednią mogło być to, iż próbki zmodyfikowanego wirusa były zanieczyszczone dzikim szczepem lub że niektóre larwy użyte w pierwotnym teście (test 1) nosiły w organizmach dziki szczep wirusa i przy superinfekcji wirusem Ap74, zarówno wirus dzikiego szczepu, jak i wirus Ap74 obecny był wśród form PIB izolowanych z martwych larw. Alternatywnym wyjaśnieniem może być to, że podczas namnażania wirusa Ap74 w komórkach linii po171 938 mocniczej, zaszła rekombinacja homologiczna pomiędzy DNA wirusa i sekwencjami p74, wbudowanymi do genomu komórkowego. W przypadku niskiej częstości takiego zjawiska, jedynie pewien procent larw, ginących w przebiegu infekcji zmodyfikowanym wirusem, zawierałoby w organizmach także wirusy dzikiego typu. Wirus ten byłby pokarmowo zakaźny w teście wtórnym. W obecnych konstruktach istnieje homologia 284 par zasad po strome 5' deldcjl oraz homologia 713 par zasad po stronie 3' ^^ΐ, pomiędzy wirusem Ap74 a sekwencjami p74, obeonami w genomie komórek linii pomocniczej. Jeżeli druga z hipotez okaże się shiszna, niekorzystny efekt można będzie waelimezowkć poprzez usunięcie, w części lub całkowicie, sekwencji wykazujących homologię między wirusem a linią komórkową,

Przykład VIII. Wytworzenie owadów tnαzagezlozzych, posiadających funkcjonalną, kopię genu p74 w sposób trwały wbudowaną do genomu.

W przykładzie tym, używa się bkliatyozzdgo wprowadzenia DNA za pomocą kuleczek wolframowych dla wytworzenia tnknsgezicznych szczepów owadzich (24). 20-100 pg DNA dla jednego z opisanych w przykładzie V konstruktów p74, w buforze do iniekcji embrionalnych (0,1 mM fosforan sodowy, pH 6,8, 5 mM KCl) osadza się na przepłukanych kuleczkach wolframowych o średnicy 1,2 mm (Bio-Rad, Richmond, Kalifornia). Reakcję tę przeprowadza się w objętości 65 pl. Po kdaorboji na wolframie, 50 pl objętości usuwa się. Peletę i 12-15 pl płynu miesza się energicznie tuż przed wprowadzeniem 8 mcl do makropocisku. System wprowadzania cząsteczek biologicznych produkcji DuPont, Wilmington, DE, został użyty dla bombardowania embrionów Trlohoplusia ni, znajdujących się na etapie przed wykształceniem blkatodermy. Podczas tego zabiegu embriony utrzymywane są na papierze filtraoy‘nam. Następnie, embriony umieszcza się pod warstwą olejku halokarbonowego Serii 700 (Halokarbon PrOducts Corp., Hackerach, N. J.), aż do momentu wyklucia się larw. Organizmy, które przeżyły, umieszcza się w grupach po 25 we wspólnych klatkach. Po zebraniu jaj w poszczególnych klatkach, przygotowuje się embrionalne DNA jak opisano w publikacji Robertsa (30). Dla wskazania klatek, produkujących jaja z obecnym genem p74, używa się reakcji PCR (patrz przykład I), z wykorzystaniem primerów A i B, jak pokazano na fig. 3. Po znalezieniu właściwych grup, jaja umieszcza się na pożywce i pozwala się im rozwinąć w osobniki dorosłe. Krzyżuje się poszczególne pary i sprawdza się za pomocą PCR czy DNA, uzyskany z jaj, zawiera gen p74. Operację tę powtarza się aż do uzyskania linii owadów homozygotaczzyoh względem genu p74.

Przykład IX. Wytworzenie wirusa A4000 zakaźnego dla owadów przez jego namnkPknlr w organizmach wyżej opisanych szczepów owadów trαzsgdnloznyoh oraz wykazanie ich fenotypu.

Na wstępie, niewielkiej liczbie (10-20) trkzsgezloznych larw czwartego stadium Trichoplusia ni, wstrzykuje się do hemolimfy 5 pl pożywki hodowlanej, z zawartością 1 x 10⁵ pączkujących wirusów szczepu A4000. Po śmierci większości larw w przebiegu infekcji A4000 (4-5 dni), formy PIB wirusa są zbierane, jak opisano w przykładzie III. Są one następnie użyte dla dalszego nkmnażanik wirusa. Trknageniczze larwy trzeciego stadium Trichoplusia ni, posiadające jeden z opisanych w przykładzie V konstruktów p74, utrzymywane są na prostokątach z pożywki o wymiarach 2,55 x 3,825 cm, zakażonych 0,4 pg 1 x 10⁶ PEB/ml wirusa A4000. Po śmierci większości z larw, w przebiegu infekcji wirusem A4000 (5-6 dni), zbiera się formy PIB, jak opisano uprzednio. Próbka PIB zostaje przechowana w buforze TET jako zapas, zaś wirus jest sprawdzany standardowym testem na krążku liścia z larwą drugiego stadium Trichoplusia ni dzikiego szczepu. Wyniki pokazują, że zαmzażanld wirusa A4000 w organizmach owadów trknsgenicznaoh, posiadających funkcjonalna kopię genu p74, przywraca normalny poziom infekcyjności zmodyfikowanemu wirusowi. Jednakże wirus uzyskany z martwych larw dzikiego typu, zabitych przez infekcję, ma obniżoną zdolność do zakażania dalszych larw drogą pokarmową.

Przykład X. Wbudowanie genu, kodującego toksynę do wektora transferowego Ap74-1 oraz izolacja rrkomblnowkzrgo wirusa A4TxP-I.

Fragment DNA kodujący specyficzną dla owadów toksynę roztocza Pyemotes tritici (TxP-I) został wyodrębnionym z klonu cDNA Tox34 (2). Fragment Eco RI zawierający cały re20

171 938 gion kodujący tego genu, wraz z częścią sekwencji niekodujących z końców 5' i 3' zostało wklonowanych do wektora AvMNPV pVL 1393 (Invitrogen, San Diego, CA). Fragment (wypełniony) Eco RI do Hind III tego konstruktu wbudowano do wektora przenoszącego p74-1, w miejsce Afl II, wewnętrzne w stosunku do delecji (patrz fig. 2). Kotransfekcja komórek Sf9 owym plazmidem, oznaczonym jako LB15.9, wespół z genomowym DNA wirusa A4000, jak opisano w przykładzie I, prowadzi do powstania wirusa zawierającego gen dla TxP-I, który nie jest zakaźny dla larw na drodze pokarmowej. Wstrzyknięcie pączkującej formy tego wirusa do hemolimfy larwy czwartego stadium Heliothis virescenses nie prowadzi jednakże do objawów porażenia typowych dla toksyny TxP-I. Co więcej, namnażanie tego wirusa metodami opisanymi w przykładach III, VII i IX prowadzi do wytworzenia zakaźnej dla owadów formy wirusa A4TxP-I. Ten zakaźny wirus A4TxP-I może zakażać larwy pokarmowo i wywoływać porażenie. Jednakże potomstwo wirusa wytworzone przez te zarażone larwy nie zachowuje już swej zakaźności dla dalszych owadów.

Przykład XI. Wytworzenie wektora ekspresyjnego zawierającego optymalny kodonowo gen dla AalT.

AalT, specyficzna dla owadów toksyna, została odkryta w jadzie północnoafrykańskiego skorpiona Androctonus australis Hector. Zbudowano wektor przenoszący dla wbudowania genu dla AalT w region kodujący gen dla poliedryny wirusa AcMNPV. Wektor ten, oznaczony AC0055.1, zawierający gen dla AalT wbudowany w miejsce BamHI pVL985 (30), składa się z optymalnej kodonowo sekwencji nukleotydowej dla dojrzałej toksyny AalT, powiązanej z sekwencją sygnałowa, genu oskórkowego Drosophila Melanogaster. Próbki szczepu HB101 E. coli, zawierającego wektor przenoszący AC055.1, zostały złożone przez Zgłaszającego 17 grudnia 1992 w American Type Culture Collection i przyznano mu numer ATCC 69 166.

Segment owego wektora przenoszącego, kodujący toksynę, jest odzyskany przez PCR dla następnego wbudowania go do wektora ekspresyjnego z przykładu IV. Primer komplementarny do nici (+) jest oligonukleotydem o długości 27 bp, którego koniec 5' odpowiada kodonowi ATG inicjującemu translację optymalnego kodonowo genu dla AalT (w obrębie AC0055.1), mającego być przedmiotem amplifikacji PCR. Primer komplementarny do nici (-) rozpoznaje miejsce w AC0055.1 ulokowane około 35-40 par zasad poniżej końca 3' genu dla AalT. Warunki reakcji PCR są tu w zasadzie identyczne jak w przykładzie I. Po oczyszczeniu, produkty reakcji traktuje się jak opisano w przykładzie V, z tym wyjątkiem, że istotny fragment izoluje się przez elektroforezę na 1,8 niskotopliwym żelu agarozowym.

Dla przygotowania wektorów ekspresyjnych do wbudowania genu dla toksyny, każdy z wektorów jest trawiony Esp 3I, a powstające lepkie końce wypełniane są przez polimerazę DNA I E. coli (fragment Klenowa) w obecności wszystkich czterech dezoksyrybonukleotydów. Każdy z preparatów jest następnie trawiony BamHI. Wektor zostaje oddzielony od uwolnionego polilinkera przez elektroforezę na 1% niskotopliwym żelu agarozowym, a następnie ligowany w oddzielnych reakcjach do fragmentu genu kodującego AalT.

Przykład XII. Izolacja rekombinowanego wirusa A4001, noszącego gen dla toksyny

AalT.

Dla przygotowania DNA wirusa A4000 do wbudowania genu, DNA jest linearyzowane przez sekwencyjne trawienie Sse 83871 i Bsu 36I. W typowym preparacie 40 pg DNA wirusa A4000 trawione jest przez 2 godziny w temperaturze 37°C w obecności 100 jednostek Sse 83871 (Takara Biochemical, Inc. Berkeley, CA) w objętości 250 μΐ mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 10 mM Tris/HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂,1 mM ditiotreinol (DTT), 50 mM NaCl i 0,1 % BSA. Mieszanina reakcyjna jest n^tępnie doprowackona do 100 mM N^<^1 i 50mM Tris/HCl, pH 7,9 i DNA jest trawione przez 2 godziny w temperaturze 37°C, w obecności 100 jednostek Bsu 361 (New England Biolabs, Beverly, MA). Reakcja jest przerwana przez dodanie SDS do końcowego stężenia 1% (w/v), NaCl do końcowego stężenia 0,3 M i EDTA do końcowego stężenia 10 mM. Następnie, DNA poddane jest _ chromatografii na kolumnie poly-prep (Biorad Laboratories, Richmond, CA), zawierającej 2 ml objętości początkowej SephacryPu 300 (Pharmacia, Piscataway, NJ) wyrównanego 10 mM Tris/HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 % SDS i 0,3 M NaCl. Zbiera się dwanaście frakcji po 150 μΐ. 10 pl każdej frakcji

171 938 poddaje się analizie przez elektroforezę na żelu, dla identyfikacji frakcji zawierających DNA wirusa. Frakcje te zbiera się, po czym przeprowadza jednorazową ekstrakcję fenolem z chloroformem. Następnie strąca się wirusowy DNA etanolem i zawiesza w buforze TE (10 mM Tris/HCl, (pH 8.0), 1 mM EDTA) w stężeniu 0,2-1 mg/ml i przechowuje w temperaturze 4°C. Dla sprawdzenia czy wirusowy DNA został całkowicie zlinearyzowany, jego próbki trawiono Eco RI i analizowano elektroforezą na żelu. DNA wirusowe zawierające 7 kb fragment Eco RI nie został całkowicie strawiony Bsu 361 i Sse 83871 i nie był dalej używany.

Wektor ekspresyjny, zawierający AalT, opisany w przykładzie I, poddano trawieniu Bsu 36I i Sse 83871. 12 ng fragmentu zawierającego sekwencję toksyny poddano ligacji z 0,5 pg oczyszczonego DNA szczepu A4000 AcMNPV uprzednio linearyzowanego działaniem Bsu 361/Sse 83871. Reakcja przebiegała w 5 mci mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 25 mM Tris/HCl (pH 7,6), 5 mM MgCb, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% (w/v) glikolu polietylenowego - 8000 oraz 0,5 jednostek ligazy T4 DNA (Gibco, Gaithersburg, MD). Po całonocnej inkubacji w 16°C, całą objętość mieszaniny ligacyjnej użyto do transfekcji komórek Sf9, według opisu w przykładzie I.

Pięć dni po transfekcji, usunięto pożywkę z hodowli transfekowanych komórek Sf9. Przygotowano dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia nadsączu z hodowanych komórek i dwie jednomililitrowe objętości rozcieńczeń 10'³, 10^-4 i 10- użyto do zakażenia 1,5 x 10⁶ komórek w 6 cm szalce hodowlanej. W godzinę po dodaniu wirusa usunięto pożywkę zawierającą wirusy, zaś na komórki nawarstwiono pożywkę z agarozą, według opisu w poprzednim przykładzie. Po pełnym wykształceniu się łysinek, użyto je do zakażenia pojedynczych dołków w płytce 48 dołkowej, a uzyskane wirusy potomne analizowano z użyciem PCR, stosując primer A (jak na fig. 3) jako primer komplementarny do nici (+) oraz primer oskórkowo-AalT (przedstawiony w przykładzie XI) jako primer komplementarny do nici (-).

Po jednej lub dwu dodatkowych rundach oczyszczania łysinek, przygotowano rezerwy P1 (28). Wirus noszący gen dla AalT oznaczony jest jako A4001. Aktywność biologiczna tego wirusa oceniona została przez test wstrzyknięcia formy ECV wirusa. Formę ECV wirusa wstrzyknięto larwom czwartego stadium Heliothis virescens. Wirus miareczkowano testem łysinkowym (28), po czym przygotowano rozcieńczenia wirusa w pożywce TNM-FH z dodatkiem 0,5% (v/v) czerwieni numer 5 : 2 x 10⁷, 2 x 10⁶, 2 x 105 PFU/ml. Każdą, z larw znieczulono dwutlenkiem węgla przez 2-5 minut, po czym nastrzyknięto 0,5 mcl odpowiedniego rozcieńczenia wirusa, używając strzykawki Hamiltona z 26 kanałową igłą. Igłę wkłuto wzdłużnie między dwoma ostatnimi posuwkami i przesunięto do przodu o 2-3 segmenty przed podaniem zawiesiny. Po wstrzyknięciu sprawdzano czy larwa nie uwalnia czerwono zabarwionej hemolimfy i przy obecności łub podejrzeniu wycieku daną larwę odrzucano. Następnie larwy przechowywano w temperaturze 27°C w osłoniętych celach z pożywką o powierzchni 4 cm² (1 larwa na celę) i codziennie oceniano ich żywotność. Larwy oceniano jako ginące (wynik pozytywny), jeśli nie potrafiły odwrócić się samodzielnie w ciągu 0,5-2 minut po przewróceniu ich na grzbiet.

Po nastrzyknięciu larw H. virescens 6 x 103-1 x 104 pfu wirusa, larwy nastrzyknięte szczepem A4001 wirusa prezentowały porażenie przykurczowe i krótszy czas rozwijania objawów infekcji w porównaniu do larw zarażonych dzikim szczepem wirusa AcMNPV. Odpowiada to produkcji toksyny AalT w ich organizmach. W szczególności, rekombinowany wirus powodował wystąpienie pierwszych objawów w średnim czasie (RT50) o 50% (±4%) krótszym niż dziki szczep wirusa w pierwszym teście oraz o 52% (±5%) krótszym niż dziki szczep w drugim teście. Wynik ten wykazuje, że wbudowanie genu AalT i oskórkowej sekwencji sygnałowej do genomu wirusa AcMNPV (A4001) przyspiesza tempo zabijania larw poprzez ekspresję genu dla aktywnej biologicznie toksyny.

W standardowym teście na krążkach liści, opisanym w przykładzie Π, wyłącznie larwy które zjadły wirusy A4001 namnożone w komórkach linii pomocniczej Sf9 (28.3) CL-2, wykazywały objawy porażenia przykurczowego charakterystycznego dla toksyny AalT. W przeciwieństwie do nich, larwy zakażone pokarmowo przez ten sam szczep A4001 wirusa namnożony w komórkach linii Sf9 o dzikim fenotypie, nie wykazywały żadnych oznak porażenia.

171 938

Przykład XIII. Wytworzenie wektora przenoszącego ^uasgal-p74 oraz wirusa A4UAS.

W przykładzie tym specyficzna przedgenowa sekwencja aktywująca transkrypcję, ^uasGAl (drożdży), waz z minimalnym aktywnym promotorem hsp 70 Drosophiła mełanogaster (-41 do -1 bp), wbudowane zostały w miejscu -1 bp powyżej regionu kodującego p74 wirusa. Gen strukturalny GAL4 wyizolowano z plazmidu pLA (31), jako odcinek o długości 2,9 kb, zawarty pomiędzy miejscami BamHI a Hind ΙΠ. Ten fragment GAL4 umieszczony został w jednym z wektorów zawierających promotor heterologiczny, opisanych w przykładzie V. Ustalona linia komórek Sf9 zawierających funkcjonalne kopie konstruktu heterologiczny promotor GAL4 została otrzymana w sposób przedstawiony w przykładzie VI. W celu wytworzenia wirusa rekombinowanego ^uasgal-p74, zbudowano wektor przenoszący ^uasgal~p74. Wykorzystano konstrukt 17-hsp/lacZ (32), jako substrat dla reakcji PCR do wytworzenia fragmentu o długości 175 bp. Fragment ten składa się z czterech powtórzeń sekwencji 29 bp, zawierających wysoko swoiste 17-merowe miejsce rozpoznawane przez GAL4, związane z minimalnym aktywnym (-43 bp - -1 bp) promotorem hsp 70 Drosophiła mełanogaster. Dzięki użyciu specyficznych primerów dodano dodatkowe miejsca restrykcyjne, potrzebne dla następnych kroków przy klonowaniu; przy końcu 5' (Sma I) oraz przy końcu 3' (Esp 31 i Nde I). Fragment ten wbudowano do wektora Δρ74-1 (patrz fig. 4) między wypełnione, skrajne 5' końcowe miejsce Hind ΠΙ a miejsce Nde I genu p74. Uzyskany klon plazmidowy oznaczono symbolem LB17.8. Region kodujący genu p74 wytworzono przez amplifikację PCR przy użyciu primerów: komplementarnego do nici (+) genu p74, przedstawionego w przykładzie V oraz komplementarnego do nici (-) primera T3 specyficznego dla plazmidu Błuescript (Stratagene, La Jolla, CA). Ów fragment p74 traktowano fragmentem Klenowa polimerazy I DNA, jak opisano poprzednio. Po oczyszczeniu uzyskanego fragmentu, poddano go trawieniu Bel I, rozpoznającym miejsce przy końcu 3' genu p74. LB 17.8 przygotowano w podobny sposób trawiąc Esp 31 i następnie wypełniając koniec fragmentem Klenowa. Po oczyszczeniu wektora, poddano go również trawieniu Bel I. Przygotowany wektor i fragment zawierający p74 zostały następnie ligowane w standardowych warunkach. Uzyskany klon oznaczono symbolem ^UASGAL-p74. Zawiera on kompletny gen p74 pod kontrolą promotora hsp, zależnym jednak od obecności białka Gał4. Rekombinowany wirus oznaczony A4UAS uzyskano dalej metodą opisaną w przykładzie I. Pełnowartościowy wirus jest uzyskiwany przez namnażanie go w liniach komórkowych, przedstawionych w przykładzie VI. Przeprowadzono standardowy test biologiczny, według opisu w przykładzie H, którego rezultaty wykazały brak zakaźności wirusa przy podaniu drogą pokarmową. Jednakże w przypadku namnażania wirusa w pomocniczej linii komórkowej GAL4(+), uzyskany wirus jest wysoce zakaźny przy podaniu drogą pokarmową.

Przykład XIV.Izolacja funkcjonalnego analogu genu p74 wirusa AcMNPV z genomu wirusa GV.

Izolację genu odpowiedzialnego za zakaźność drogą pokarmową wirusa granulozy jest możliwa dzięki wykorzystaniu techniki marker rescue, będącej modyfikacją testu komplementacji genetycznej. Na wstępie, przygotowana zostaje bilblioteka zachodzących klonów kosmidowych na bazie DNA wirusa granulozy Trichoplusia ni (TnGV). Uzyskuje się to przez ligację DNA TnGV częściowo strawionego Sal I z wektorem kosmidowym pVK102 (33). Próbka 1 pg jednego z klonów kosmidowych jest przedmiotem kotransfekcji wespół z 1 pg DNA szczepu A4000 wirusa AcMNPV, według procedury podanej w przykładzie I. Po 5 dniach przeprowadza się standardowy test łysinkowy (28). Gdy łysinki są w pełni wykształcone, poszczególnych z nich używa się do zakażenia pojedynczych dołków w płytce 48 dołkowej, jak podano w przykładzie I. Potomne wirusy, otrzymane w studzienkach, sąpulowane w grupach po 20 studzienek i podawane larwom trzeciego stadium Trichoplusia ni, w teście na krążku liścia, opisanym w przykładzie Π. Jeżeli badany klon kosmidowy zawiera analog funkcjonalny genu p74, przywraca on zakaźność pokarmową wirusa A4000. Właściwy gen, odpowiedzialny za ten efekt jest następnie identyfikowany przez powtarzane kotransfekcję i testy dotyczące subkionów plazmidowych pozytywnego kosmidu.

171 938

Bibliografia

1. Granados, R, R. and Federici, B. A., The Biology of Baculoviruses, I, 99 (1986).

2. Tomalski, M. D. and Miller, L. K, Nature, 352, 82-85 (1991).

3. Federici, B. A., In Vitro, 28 50A (1992).

4. Martens, J. W. M., et al., App. & Envir. Microbiology, 56,2764-2770 (1990).

5. Menn, J. J. and Borkovec, A. B., J. Agric. Food Chem., 37,271-278 (1989).

6. Eldridge, R, et all., Insect Biochem., 21,341-351 (1992).

7. Hammock, B. D., et all., Nature, 344,458-461 (1990).

8. Williamson, M., Nature, 353,394 (1991).

9. Hammock, B., Nature, 335,119 (1992).

10. Luckov, V. A. and Summers, M. D., Bio/Technology, 6, 47-53 (1988).

11. Miller, L. K., Ann Rev. Microbiol., 42, 177-199 (1988).

12. Smith, G. E. and Summers, M. D., opis patentowy USA 4 745 051.

13. Blissard, G. W. and Rohrmann, G. F., Ann. Rev. Entomol., 35,127-155 (1990).

14. Partington, S., et all., Virology, 175,91-102 (1990).

15. Kuzio, J., et all.. Virology, 173,759-763 (1989).

16. Hill, J. E., et ab, Biochimica et Biophysica Acta, 1172,1-2 (1993).

17. Leisy, D. J., et all.. Virology, 153,157-167 (1986).

18. Beames, B. and Summers, M. D., Virology, 168,344-353 (1989).

19. Gallo, L. G., et all., J. Invertebrate Path., 58,203-210 (1991).

20. Crook, N. E„ et al., J. Virology, 67,21168-2174 (1993).

21. Passarelli, A. L. and Miller, L. K., J. Virology, 67, 2149-2158 (1993).

22. Jarvis, D. L., et all.. Biotechnology, 8, 950-955 (1990).

23. Presnail, J. K. and Hoy, M. A., Proc. Natl. Acad. Sci., 89,7732-7736 (1992).

24. Baldarelli, R. M. and Lengyel, J. A., Nucleic' Acids Res., 18, 5903-5904 (1991).

25. Zlotkin, E., et all., Toxicon, 9,1-8 (1971).

26. Jackson, J. R. H. and Parks, T. N., opis patentowy USA nr 4 925 664.

27. Sambrook, J., et alb. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).

28. Summers, M. D. and Smith, G. E, A Manual Of Methods For Baculovirus Vectors And Insect Cell Culture Procedures, Dept, of Entomology, Texas, Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas 77843-2475, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987).

29. Webb, N. R. and Summers, M. D., J. Methods Cell & Molec. Biol., 2, 173-188 (1990).

30. Roberts, D. B., ed.. Drosophila: A Practical Approach, sts 276, IRL Press, Oxford, England (1986).

31. Johnston, S. A., et alb, Proc. Natl. Acad. Sci., 83,6553-6557 (1986).

32. Fischer, J. A,, et alb. Nature, 332, 853-856 (1988).

33. Knauf, V. C. and Nester, E. W., Plasmid, 8,45-54 (1982).

171 938

171 938

Csl

CL ς:

<

>LjlJ

O ^c O ω 3t o o c: cx

Ae o o hć en to §

t

DuAjpaijoj f

O σ>

o oo in — CC

X — CC

U o ~ r*

- o to r>

_ cc o ^X ~ m o

ro o es CS _ cc

X o — CC ° X

		rz	Jjj
	jca	jx-	ł—ł
	ł—4	»—« »—<	ł—ł LU 4*
♦—«	1—*	T3	Ul
*—4 ł—ł T3 C X	ł—ł “23 C X	a X ł	ect

“Ό u?

Ul

o.

cc o

u *O

C

171 938

Hind III P

Bst Eli E fragment

AcMNPV

Hpal BanHI

FIG.2

171 938

FIG.3

Bsu 361 AfIII Rsrll Sse 83871

171 938

ModuT Polilinkera Esp 31

o

a.

c uu

CZ. —I 73

-Xhol

-Apal

-Κρη I

FIG.4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 4,00 zł

Claims (18)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Rekombinowany wirus owadzi o zmniejszonej zdolności do transmisji poziomej w środowisku, znamienny tym, że ma zniesioną zakaźność wobec owadów przez modyfikację elementu genetycznego i przywróconą zakaźność przez komplementację produktem lub funkcją, brakującymi lub uszkodzonymi w związku ze zmianą elementu genetycznego z utrzymaniem braku genetycznej zdolności do produkowania brakującego produktu lub funkcji.
2. 2. Wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy wirusów DNA lub wirusów RNA.
3. 3. Wirus według zastrz. 2, znamienny tym, że jest wirusem DNA wybranym z grupy składającej się z wirusów Eubaculovirinae, Nudibaculovirinae, Entomopoxvirinae, Ichnovirus, Bracovirus, Iridiviridae oraz Parvoviridae.
4. 4. Wirus według zastrz. 3, znamienny tym, że jest wirusem z rodziny Eubaculovirinae, wybranym z grupy wirusów poliedrozy jądrowej i wirusów granulozy.
5. 5. Wirus według zastrz. 4, znamienny tym, że jest wirusem poliedrozy jądrowej wybranym z grupy obejmującej wirus poliedrozy jądrowej Autographa californica, wirus poliedrozy jądrowej Heliocoverpa zea, Spodoptera littoralis NPV, Heliothis armigera NPV, Mamestra brassicae NPV i Rachiplusia NPV.
6. 6. Wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że modyfikacja elementu genetycznego wirusa polega na zniszczeniu funkcji genu lub zakłóceniu funkcji wirusa.
7. 7. Wirus według zastrz. 6, znamienny tym, że modyfikacja elementu genetycznego wirusa jest delecją. .
8. 8. Wirus według zastrz. 7, znamienny tym, że modyfikacja elementu genetycznego wirusa jest delecją w genie p74.
9. 9. Wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że ma przywróconą zakaźność przez namnażanie w:

   (a) komórkach owadzich poddanych transfekcji fragmentem DNA dostarczającym produktu lub funkcji, brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie;

   (b) liniach komórkowych, w sposób trwały stransformowanych fragmentem DNA dostarczającym produktu lub funkcji, brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie;

   (c) owadach transgenicznych, które zawierają fragment DNA dostarczający produktu lub funkcji brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie.
10. 10. Wirus według zastrz. 9, znamienny tym, że do kontroli ekspresji fragmentu DNA zastosowano heterologiczny promotor.
11. 11. Wirus według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo zawiera, w obrębie swego genomu, obcy gen kodujący substancję niszczącą lub modyfikującą funkcje owada.
12. 12. Wirus według zastrz. 11, znamienny tym, że zawiera obcy gen kodujący substancję niszczącą lub modyfikującą funkcje owada wybraną z grupy obejmującej toksyny, neuropeptydy, hormony i enzymy.
13. 13. Wirus według zastrz. 11, znamienny tym, że obcy gen jest wprowadzony:

    (a) bezpośrednio w miejsce modyfikacji elementu genetycznego wirusa; lub (b) w miejsce przylegające do miejsca modyfikacji elementu genetycznego wirusa, tak że segregacja heterologicznego genu i zmienionego elementu genetycznego zachodzi u mniej niż 10% potomstwa wirusa.
14. 14. Sposób wytwarzania rekombinowanego wirusa owadziego o zmniejszonej zdolności do transmisji poziomej w środowisku, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

    171 938 (1) zniesienie zakaźności wirusa dla owadów poprzez modyfikację elementu genetycznego wirusa przy zachowaniu zdolności do wtórnego zakażenia szerzącego się na inne tkanki owada; i (2) przywrócenie zakaźności wirusa poprzez komplementację produktem lub funkcją brakującą lub uszkodzoną w zmodyfikowanym wirusie.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że modyfikacja elementu genetycznego wirusa polega na zniszczeniu funkcji genu lub zakłócaniu funkcji wirusa.
16. 16. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że zakaźność wirusa przywraca się przez jego namnażanie w:

    (a) komórkach owadzich poddanych transfekcji fragmentem DNA dostarczającym produktu lub funkcji, brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie;

    (b) liniach komórkowych, w sposób trwały stransformowanych fragmentem DNA dostarczającym produktu lub ftmkcji, brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie;

    (c) owadach transgenicznych, które zawierają fragment DNA dostarczających produktu łub funkcji brakującej lub uszkodzonej w zmodyfikowanym wirusie.
17. 17. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że obejmuje zastosowanie heterologicznego promotora.
18. 18. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje wprowadzenie do genomu wirusa obcego genu kodującego substancję niszczącą lub modyfikującą funkcje owada.