JPH0646850A - 新規プロテア−ゼ - Google Patents
新規プロテア−ゼInfo
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- JPH0646850A JPH0646850A JP35172991A JP35172991A JPH0646850A JP H0646850 A JPH0646850 A JP H0646850A JP 35172991 A JP35172991 A JP 35172991A JP 35172991 A JP35172991 A JP 35172991A JP H0646850 A JPH0646850 A JP H0646850A
- Authority
- JP
- Japan
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- plasmid
- mutant
- gly
- puctz55
- protease
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Abstract
(57)【要約】
【構成】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中性プ
ロテアーゼにおいて、アミノ末端から１１９番目のグル
タミン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規なプロ
テアーゼ、又は、上記の他のアミノ酸残基がグルタミン
酸、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンである新規な
プロテアーゼ 【効果】本発明における変異体酵素は、特定の合成ペプ
チドに対する分解活性が著しく高いものであり、種々の
用途における本酵素の利用に際し、反応効率の上昇や反
応時間の短縮などの点で優れた効果を発揮する。
ロテアーゼにおいて、アミノ末端から１１９番目のグル
タミン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規なプロ
テアーゼ、又は、上記の他のアミノ酸残基がグルタミン
酸、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンである新規な
プロテアーゼ 【効果】本発明における変異体酵素は、特定の合成ペプ
チドに対する分解活性が著しく高いものであり、種々の
用途における本酵素の利用に際し、反応効率の上昇や反
応時間の短縮などの点で優れた効果を発揮する。
Description
【産業上の利用分野】本発明は、サーモリシン様金属プ
ロテアーゼの改良に関するものである。サ−モリシンは
工業的に製造されている有用な酵素であり、その用途は
洗剤、食品製造、化粧品等広範な分野に渡っている。例
えば、人工甘味料の一種であるアスパルテ−ムの前駆体
であるベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
ルフェニルアラニンメチルエステルの合成等に使用され
る。
ロテアーゼの改良に関するものである。サ−モリシンは
工業的に製造されている有用な酵素であり、その用途は
洗剤、食品製造、化粧品等広範な分野に渡っている。例
えば、人工甘味料の一種であるアスパルテ−ムの前駆体
であるベンジルオキシカルボニル−α−Ｌ−アスパルチ
ルフェニルアラニンメチルエステルの合成等に使用され
る。
【０００２】
【従来の技術】サーモリシンは好熱菌の一種であるバチ
ルス サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoprote
olyticus）の培養上清中に見つけられた金属プロテアー
ゼである（J. Fermentation Tech.,40,346 (1962) 参
照）。サ−モリシンに関しては一次構造（Titani K.,et
al.,Nature New Biol.(1972) 238,35-37)や三次構造(
Holmes, M.A., Matthews, B.W. J. Mol. Biol.(1982)
160,623-639)をはじめとして多くの報告がなされている
が、その遺伝子構造は明らかにされていない。ところが
最近、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus s
tearothermophilus) より耐熱性中性プロテアーゼの遺
伝子（ｎｐｒＭ）がクローン化され（Kubo M. and Iman
aka T., J.Gen.Microbiol. (1988) 134,1883-1892)、そ
の塩基配列から推測される成熟酵素のアミノ酸配列（配
列表１に記載）が、サーモリシンと極めて類似している
ことが明らかになった。ｎｐｒＭ遺伝子の単離はサ−モ
リシン類似酵素の遺伝子工学的操作が可能になったこと
を意味し、この手法を応用し、より工業的に汎用性のあ
る酵素を開発する道が開かれた。尚、本明細書において
はこのｎｐｒＭ遺伝子に由来するプロテアーゼを「サー
モリシン様金属プロテアーゼ」と呼ぶ。
ルス サーモプロテオリチカス（Bacillus thermoprote
olyticus）の培養上清中に見つけられた金属プロテアー
ゼである（J. Fermentation Tech.,40,346 (1962) 参
照）。サ−モリシンに関しては一次構造（Titani K.,et
al.,Nature New Biol.(1972) 238,35-37)や三次構造(
Holmes, M.A., Matthews, B.W. J. Mol. Biol.(1982)
160,623-639)をはじめとして多くの報告がなされている
が、その遺伝子構造は明らかにされていない。ところが
最近、バチルス ステアロサーモフィラス（Bacillus s
tearothermophilus) より耐熱性中性プロテアーゼの遺
伝子（ｎｐｒＭ）がクローン化され（Kubo M. and Iman
aka T., J.Gen.Microbiol. (1988) 134,1883-1892)、そ
の塩基配列から推測される成熟酵素のアミノ酸配列（配
列表１に記載）が、サーモリシンと極めて類似している
ことが明らかになった。ｎｐｒＭ遺伝子の単離はサ−モ
リシン類似酵素の遺伝子工学的操作が可能になったこと
を意味し、この手法を応用し、より工業的に汎用性のあ
る酵素を開発する道が開かれた。尚、本明細書において
はこのｎｐｒＭ遺伝子に由来するプロテアーゼを「サー
モリシン様金属プロテアーゼ」と呼ぶ。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本酵素の基質特異性、
至適ｐＨ、物理的安定性等はアミノ酸配列により規定さ
れている。工業用酵素として本酵素の利用範囲を拡大す
るためには、これらの諸性質を利用分野に適するよう改
変しなければならない。一般に蛋白質の高次構造はアミ
ノ酸配列に由来しており、蛋白質の性質を改変するため
にはアミノ酸配列を改変することが１つの解決策であ
る。
至適ｐＨ、物理的安定性等はアミノ酸配列により規定さ
れている。工業用酵素として本酵素の利用範囲を拡大す
るためには、これらの諸性質を利用分野に適するよう改
変しなければならない。一般に蛋白質の高次構造はアミ
ノ酸配列に由来しており、蛋白質の性質を改変するため
にはアミノ酸配列を改変することが１つの解決策であ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この様な課題を解決する
ために、本発明者らはタンパク質工学の手法を用いて、
上記 Bacillus stearothermophilus 由来のサーモリシ
ン様金属プロテアーゼの改変を行い、本発明を完成する
に至った。
ために、本発明者らはタンパク質工学の手法を用いて、
上記 Bacillus stearothermophilus 由来のサーモリシ
ン様金属プロテアーゼの改変を行い、本発明を完成する
に至った。
【０００５】すなわち、配列表１のアミノ酸配列を有す
る上記サーモリシン様金属プロテアーゼにおいて、アミ
ノ末端から１１９番目のグルタミン残基を他のアミノ酸
に置換することにより、新規なプロテアーゼを作製し
た。
る上記サーモリシン様金属プロテアーゼにおいて、アミ
ノ末端から１１９番目のグルタミン残基を他のアミノ酸
に置換することにより、新規なプロテアーゼを作製し
た。
【０００６】置換するアミノ酸としては種々のものが考
えられるが、たとえばグルタミン酸、ヒスチジン、リジ
ン、アルギニン等に置換した場合に、優れた性質の酵素
が得られることがわかった。以下、これらの変異体酵素
の作製方法について具体的に説明する。
えられるが、たとえばグルタミン酸、ヒスチジン、リジ
ン、アルギニン等に置換した場合に、優れた性質の酵素
が得られることがわかった。以下、これらの変異体酵素
の作製方法について具体的に説明する。
【０００７】ｎｐｒＭ遺伝子を枯草菌において発現させ
る方法が報告されている(Kubo M.and Imanaka T., J. B
acteriol.(1989) 171, 4080-4082) 。本報告における、
プラスミドｐＭＫ１はｎｐｒＭ遺伝子を含み枯草菌で複
製される領域およびカナマイシン耐性遺伝子を有する。
本プラスミドによって形質転換された枯草菌は培地中に
多量のサーモリシン様金属プロテアーゼを分泌すること
が見出された。この結果からｎｐｒＭ遺伝子は枯草菌に
おいても効率よく発現されることがわかるが、さらに効
率の良いプロモーター等を導入することにより発現量を
高めることは可能であると考えられる。また枯草菌内で
複製可能な他のベクターを用いても同様に本遺伝子を発
現させることができるであろう。
る方法が報告されている(Kubo M.and Imanaka T., J. B
acteriol.(1989) 171, 4080-4082) 。本報告における、
プラスミドｐＭＫ１はｎｐｒＭ遺伝子を含み枯草菌で複
製される領域およびカナマイシン耐性遺伝子を有する。
本プラスミドによって形質転換された枯草菌は培地中に
多量のサーモリシン様金属プロテアーゼを分泌すること
が見出された。この結果からｎｐｒＭ遺伝子は枯草菌に
おいても効率よく発現されることがわかるが、さらに効
率の良いプロモーター等を導入することにより発現量を
高めることは可能であると考えられる。また枯草菌内で
複製可能な他のベクターを用いても同様に本遺伝子を発
現させることができるであろう。
【０００８】クローン化ＤＮＡへの部位特異的な変異導
入方法は種々の方法が報告されている。我々はVandeyar
らの方法（Vandeyar M.,et al. Gene (1988) 65, 129.)
を用いて、Ｍ１３ファージにｎｐｒＭ遺伝子の全体ま
たは一部をクローン化して得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型
とし、化学合成したオリゴヌクレオチドを変異プライマ
ーとして、変異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を作製した。
入方法は種々の方法が報告されている。我々はVandeyar
らの方法（Vandeyar M.,et al. Gene (1988) 65, 129.)
を用いて、Ｍ１３ファージにｎｐｒＭ遺伝子の全体ま
たは一部をクローン化して得られた一本鎖ＤＮＡを鋳型
とし、化学合成したオリゴヌクレオチドを変異プライマ
ーとして、変異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を作製した。
【０００９】鋳型一本鎖ＤＮＡの作製はたとえば次のよ
うにして行うことができる。図１に示したように、プラ
スミドｐＭＫ１より制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ
で消化して得られる約３．５ｋｂの断片をプラスミドｐ
ＵＣ９にサブクローン化しｐＵＣＴＺ５５なるプラスミ
ドを作製した。
うにして行うことができる。図１に示したように、プラ
スミドｐＭＫ１より制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩ
で消化して得られる約３．５ｋｂの断片をプラスミドｐ
ＵＣ９にサブクローン化しｐＵＣＴＺ５５なるプラスミ
ドを作製した。
【００１０】さらに図２に示したように１１９番目に変
異を導入する場合にはｐＵＣＴＺ５５よりＢａｍＨＩ、
ＳｐｈＩで消化して得られる約７３０ｂｐの断片を、Ｍ
１３ファージｍｐ１９にクローン化し（Ｍ１３ＴＺＢａ
−Ｓｐ）一本鎖ＤＮＡを調製した。
異を導入する場合にはｐＵＣＴＺ５５よりＢａｍＨＩ、
ＳｐｈＩで消化して得られる約７３０ｂｐの断片を、Ｍ
１３ファージｍｐ１９にクローン化し（Ｍ１３ＴＺＢａ
−Ｓｐ）一本鎖ＤＮＡを調製した。
【００１１】変異プライマーは１１９番目のグルタミン
残基のコドンを含む鋳型一本鎖ＤＮＡと部分的に相補性
があれば良く例えば次のようなものが考えられる。
残基のコドンを含む鋳型一本鎖ＤＮＡと部分的に相補性
があれば良く例えば次のようなものが考えられる。
【００１２】１１９番目のグルタミン残基を他のアミノ
酸に置換する場合の例 アルギニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ リジン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ ヒスチジン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ アスパラギン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ アスパラギン酸 ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ バリン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ アラニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ フェニルアラニン５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ トリプトファン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ ロイシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ イソロイシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ メチオニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ トレオニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ セリン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ グルタミン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ チロシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ グリシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ システイン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ プロリン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´
酸に置換する場合の例 アルギニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＧＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ リジン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ ヒスチジン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ アスパラギン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ アスパラギン酸 ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ バリン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ アラニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ フェニルアラニン５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ トリプトファン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＧＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ ロイシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ イソロイシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ メチオニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ トレオニン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ セリン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＡＧＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ グルタミン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ チロシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＡＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ グリシン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ システイン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＴＧＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ プロリン ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´
【００１３】これらの変異プライマーを用いることによ
り所望のアミノ酸に置換することができる。部位特異的
変異導入を行った後、変異体Ｍ１３ファージをクローン
化し、ＤＮＡ塩基配列を決定することによって目的のア
ミノ酸置換が起こっていることを確認した。
り所望のアミノ酸に置換することができる。部位特異的
変異導入を行った後、変異体Ｍ１３ファージをクローン
化し、ＤＮＡ塩基配列を決定することによって目的のア
ミノ酸置換が起こっていることを確認した。
【００１４】変異体Ｍ１３ファージの二本鎖ＤＮＡから
変異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を切り出し、プラスミドｐＵ
ＣＴＺ５５の相当領域と置換することにより変異体ｎｐ
ｒＭ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＴＺ５５（ｍｕｔａ
ｎｔ）が得られた。
変異体ｎｐｒＭ遺伝子断片を切り出し、プラスミドｐＵ
ＣＴＺ５５の相当領域と置換することにより変異体ｎｐ
ｒＭ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣＴＺ５５（ｍｕｔａ
ｎｔ）が得られた。
【００１５】図３に示したように、まず野性型サーモリ
シン様金属プロテアーゼの遺伝子の一部を欠失したプラ
スミドｐＭＫ８を作製した。これは以下の操作において
野性型酵素の組換体の出現を防ぐために重要な意味を持
つ。
シン様金属プロテアーゼの遺伝子の一部を欠失したプラ
スミドｐＭＫ８を作製した。これは以下の操作において
野性型酵素の組換体の出現を防ぐために重要な意味を持
つ。
【００１６】図４に示したように、ｐＭＫ８およびｐＵ
ＣＴＺ５５（ｍｕｔａｎｔ）をそれぞれＢａｍＨＩで切
断した後、ＤＮＡリガーゼで連結しｐＭＫ９（ｍｕｔａ
ｎｔ）を作製した。本プラスミドにより形質転換された
枯草菌を培養し、変異体酵素を培地中に分泌発現させ
た。
ＣＴＺ５５（ｍｕｔａｎｔ）をそれぞれＢａｍＨＩで切
断した後、ＤＮＡリガーゼで連結しｐＭＫ９（ｍｕｔａ
ｎｔ）を作製した。本プラスミドにより形質転換された
枯草菌を培養し、変異体酵素を培地中に分泌発現させ
た。
【００１７】分泌させた酵素を通常の方法、たとえば疎
水クロマトグラフィーやゲル濾過によって均一に精製し
た。
水クロマトグラフィーやゲル濾過によって均一に精製し
た。
【００１８】精製された変異体酵素は合成ペプチドであ
るＦｕｒｙｌａｃｒｙｌｏｙｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ａｍ
ｉｄｅ（以下ＦＡＧＬＡと略す）の分解において著しい
比活性の上昇が認められた。
るＦｕｒｙｌａｃｒｙｌｏｙｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ａｍ
ｉｄｅ（以下ＦＡＧＬＡと略す）の分解において著しい
比活性の上昇が認められた。
【００１９】本発明の新規プロテアーゼは、上に詳細に
記載したアミノ酸配列を有するポリペプチドのほかに、
これと実質上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを
包含する。特定の酵素活性を有するポリペプチド中の酵
素活性に関与しない領域においてアミノ酸配列に変更を
加えても、当該酵素活性が影響を受けない場合があるこ
とは、当業者により良く知られている。したがって、そ
のような変更を含むポリペプチドも、本発明の特徴を保
持している限り、すなわち配列表１において１１９番目
のグルタミン残基を置換したものである限り本発明の範
囲に属するものである。
記載したアミノ酸配列を有するポリペプチドのほかに、
これと実質上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを
包含する。特定の酵素活性を有するポリペプチド中の酵
素活性に関与しない領域においてアミノ酸配列に変更を
加えても、当該酵素活性が影響を受けない場合があるこ
とは、当業者により良く知られている。したがって、そ
のような変更を含むポリペプチドも、本発明の特徴を保
持している限り、すなわち配列表１において１１９番目
のグルタミン残基を置換したものである限り本発明の範
囲に属するものである。
【００２０】
【実施例】以下に本発明を更に詳細に説明するために実
施例を記載するが、これらの実施例は本発明を説明する
ための一例であり、本発明を限定するものではない。
施例を記載するが、これらの実施例は本発明を説明する
ための一例であり、本発明を限定するものではない。
【００２１】Bacillus stearothermophilus MK232 株由
来のサ−モリシン様金属プロテア−ゼ遺伝子、ｎｐｒＭ
を含むプラスミドｐＭＫ１、１μｇを２０マイクロリッ
トルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、
１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ、５ユニットおよびＢａｍＨ
Ｉ、５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。こ
のサンプルを１％アガロ−スゲル電気泳動で約３．５ｋ
ｂのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−
ンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
来のサ−モリシン様金属プロテア−ゼ遺伝子、ｎｐｒＭ
を含むプラスミドｐＭＫ１、１μｇを２０マイクロリッ
トルの反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、
１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ、５ユニットおよびＢａｍＨ
Ｉ、５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。こ
のサンプルを１％アガロ−スゲル電気泳動で約３．５ｋ
ｂのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−
ンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
【００２２】一方、プラスミドベクタ−ｐＵＣ９、１μ
ｇを含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ、
ＢａｍＨＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応さ
せた。
ｇを含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＰｓｔＩ、
ＢａｍＨＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応さ
せた。
【００２３】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキッ
トを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断
片を含む組換体プラスミド（ｐＵＣＴＺ５５）を得た。
ＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片と、ｐＵＣ９のＰｓｔＩ−Ｂ
ａｍＨＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキッ
トを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断
片を含む組換体プラスミド（ｐＵＣＴＺ５５）を得た。
【００２４】組換体プラスミドｐＵＣＴＺ５５、１μｇ
を含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス
−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１
００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、Ｓｐ
ｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。
このサンプルを１％アガロ−スゲル電気泳動で約７３０
ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ
−ンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
を含む２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス
−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１
００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、Ｓｐ
ｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応させた。
このサンプルを１％アガロ−スゲル電気泳動で約７３０
ｂｐのＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ
−ンＤＮＡ精製キットを用いて精製した。
【００２５】一方、ファ−ジベクタ−Ｍ１３ｍｐ１８、
１μｇを２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応
させた。
１μｇを２０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭ ト
リス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨ
Ｉ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７℃で２時間反応
させた。
【００２６】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１８のＢａｍ
ＨＩ−ＳｐｈＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ショ
ンキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１
０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＢａｍＨＩ−Ｓｐ
ｈＩ断片を含む組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓ
ｐ）を得た。
ＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、Ｍ１３ｍｐ１８のＢａｍ
ＨＩ−ＳｐｈＩ消化物を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ショ
ンキットを用いて反応させ、常法に従って大腸菌ＪＭ１
０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子のＢａｍＨＩ−Ｓｐ
ｈＩ断片を含む組換体ファ−ジ（Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓ
ｐ）を得た。
【００２７】得られたＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐから、常法
に従って１本鎖ＤＮＡを調製し、変異の導入に用いた。
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて
作製し、その塩基配列の一例を以下に記す。 ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ 変異の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビトロミュ
−タゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定に
よって確認した。
に従って１本鎖ＤＮＡを調製し、変異の導入に用いた。
変異の導入に用いたオリゴヌクレオチドはアプライドバ
イオシステムズ社製３８０Ｂ型ＤＮＡ合成装置を用いて
作製し、その塩基配列の一例を以下に記す。 ５´ＡＡＣＧＧＴＴＣＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴ ３´ 変異の導入は、東洋紡社製Ｔ７−ＧＥＮインビトロミュ
−タゲネシスキットを用いて行い、ＤＮＡの配列決定に
よって確認した。
【００２８】変異を導入したＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ及
び、ｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを、常法に従って調
製し、それぞれ１μｇを含む２０マイクロリットルの反
応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ
塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）にＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７
℃で２時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−ス
ゲルで電気泳動しＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ消化物からは、
７３０ベ−スペアのＤＮＡ断片を分離し、ｐＵＣＴＺ５
５消化物からは、５．１キロベ−スペアのＤＮＡ断片を
分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キッ
トを用いて精製した。
び、ｐＵＣＴＺ５５の二本鎖ＤＮＡを、常法に従って調
製し、それぞれ１μｇを含む２０マイクロリットルの反
応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ
塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ）にＢａｍＨＩ、ＳｐｈＩ各５ユニットを加えて３７
℃で２時間反応させた。このサンプルを１％アガロ−ス
ゲルで電気泳動しＭ１３ＴＺＢａ−Ｓｐ消化物からは、
７３０ベ−スペアのＤＮＡ断片を分離し、ｐＵＣＴＺ５
５消化物からは、５．１キロベ−スペアのＤＮＡ断片を
分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤＮＡ精製キッ
トを用いて精製した。
【００２９】このようにして得られたｎｐｒＭ遺伝子の
変異の導入されたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、ｐＵＣ
ＴＺ５５のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を宝酒造社製ＤＮ
Ａライゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子の変
異の導入されたＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組換体
プラスミドｐＵＣＴＺ５５（Ｑ１１９Ｅ）を得た。
変異の導入されたＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片と、ｐＵＣ
ＴＺ５５のＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片を宝酒造社製ＤＮ
Ａライゲ−ションキットを用いて反応させ、常法に従っ
て大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、ｎｐｒＭ遺伝子の変
異の導入されたＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を含む組換体
プラスミドｐＵＣＴＺ５５（Ｑ１１９Ｅ）を得た。
【００３０】プラスミドｐＭＫ１、１μｇを含む２０マ
イクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ
７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食
塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加え
て３７℃で２時間反応させた。ｐＭＫ１消化物を１％ア
ガロ−スゲルで電気泳動し、１５．８キロベ−スペアの
ＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤ
ＮＡ精製キットを用いて精製した。
イクロリットルの反応液（５０ｍＭトリス−塩酸 ｐＨ
７．５、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食
塩、１ｍＭ ＤＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加え
て３７℃で２時間反応させた。ｐＭＫ１消化物を１％ア
ガロ−スゲルで電気泳動し、１５．８キロベ−スペアの
ＤＮＡ断片を分離し、バイオ１０１社ジ−ンクリ−ンＤ
ＮＡ精製キットを用いて精製した。
【００３１】このようにして得られたｐＭＫ１のＢａｍ
ＨＩ断片を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用
いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２株（ｔｒｐ
Ｃ２ｌｅｕＣ７ ｈｓｄＲ ｈｓｄＭ Ｎｐｒ−）に形
質転換し、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む
ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一夜培養し、コロニ
−を単離することにより、組換体プラスミドｐＭＫ８を
持った形質転換体を得た。これより常法に従ってプラス
ミドＤＮＡを調製した。
ＨＩ断片を宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ションキットを用
いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２株（ｔｒｐ
Ｃ２ｌｅｕＣ７ ｈｓｄＲ ｈｓｄＭ Ｎｐｒ−）に形
質転換し、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む
ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一夜培養し、コロニ
−を単離することにより、組換体プラスミドｐＭＫ８を
持った形質転換体を得た。これより常法に従ってプラス
ミドＤＮＡを調製した。
【００３２】プラスミドｐＭＫ８およびｐＵＣＴＺ５５
（Ｑ１１９Ｅ）それぞれ１μｇを２０マイクロリットル
の反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加えて３７℃で２時
間反応させた。
（Ｑ１１９Ｅ）それぞれ１μｇを２０マイクロリットル
の反応液（５０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０
ｍＭ塩化マグネシウム、１００ｍＭ 食塩、１ｍＭ Ｄ
ＴＴ）にＢａｍＨＩ、５ユニットを加えて３７℃で２時
間反応させた。
【００３３】これらを宝酒造社製ＤＮＡライゲ−ション
キットを用いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２
株に形質転換し、１％カゼイン、５μｇ／ミリリットル
のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃に
て一夜培養し、ハロー形成コロニーを単離することによ
り、組換体プラスミドｐＭＫ９（Ｑ１１９Ｅ）を持った
形質転換体を得た。
キットを用いて反応させ、常法に従って枯草菌ＭＴ−２
株に形質転換し、１％カゼイン、５μｇ／ミリリットル
のカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃に
て一夜培養し、ハロー形成コロニーを単離することによ
り、組換体プラスミドｐＭＫ９（Ｑ１１９Ｅ）を持った
形質転換体を得た。
【００３４】組換枯草菌ＭＴ−２／ｐＭＫ９（Ｑ１１９
Ｅ）の単一コロニ−を、５μｇ／ミリリットルの濃度で
カナマイシンを含む５ミリリットルのＬＢ培地で３７℃
にて一夜培養したのち、５μｇ／ミリリットルの濃度で
カナマイシンを含む１００ミリリットルの２Ｌ培地（２
％ バクトトリプトン、１％ イ−ストイクストラク
ト、０．５％ 食塩）に植菌し、３７℃、１８時間培養
した。培養液を１２０００×ｇにて１０分間遠心分離し
て菌体を除去し、上清に６０％飽和になるように硫安を
加えて４℃で一夜攪拌した。
Ｅ）の単一コロニ−を、５μｇ／ミリリットルの濃度で
カナマイシンを含む５ミリリットルのＬＢ培地で３７℃
にて一夜培養したのち、５μｇ／ミリリットルの濃度で
カナマイシンを含む１００ミリリットルの２Ｌ培地（２
％ バクトトリプトン、１％ イ−ストイクストラク
ト、０．５％ 食塩）に植菌し、３７℃、１８時間培養
した。培養液を１２０００×ｇにて１０分間遠心分離し
て菌体を除去し、上清に６０％飽和になるように硫安を
加えて４℃で一夜攪拌した。
【００３５】遠心分離により沈殿を回収し、この沈殿を
１０ミリリットルの緩衝液（２０ｍＭ トリス−塩酸
ｐＨ９．０、１０ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解し、２
０ミリリットルのブチルトヨパ−ル６５０Ｍにアプライ
し、同じ緩衝液で１．５ミリリットル／分の流速で溶
出、活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、２５０
００×ｇにて１０分間遠心分離して、沈殿を集めた。
１０ミリリットルの緩衝液（２０ｍＭ トリス−塩酸
ｐＨ９．０、１０ｍＭ 塩化カルシウム）に溶解し、２
０ミリリットルのブチルトヨパ−ル６５０Ｍにアプライ
し、同じ緩衝液で１．５ミリリットル／分の流速で溶
出、活性画分を集め、６０％飽和硫安にて塩析、２５０
００×ｇにて１０分間遠心分離して、沈殿を集めた。
【００３６】続いて、この沈殿を５ミリリットルの緩衝
液（２０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ
塩化カルシウム）に溶解し、Ｇ２０００ＳＷ（２１．５
×６００ｍｍ）にアプライし、同じ緩衝液で３ミリリッ
トル／分の流速で溶出、活性画分を集め精製物を得た。
液（２０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ
塩化カルシウム）に溶解し、Ｇ２０００ＳＷ（２１．５
×６００ｍｍ）にアプライし、同じ緩衝液で３ミリリッ
トル／分の流速で溶出、活性画分を集め精製物を得た。
【００３７】各種のｐＨに調整した基質溶液（２００ｍ
Ｍ トリス−マレイン酸、１０ｍＭ塩化カルシウム、
１．５ｍＭ ＦＡＧＬＡ）２．０ミリリットルに精製酵
素溶液（２０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ 塩化カルシウムに酵素を溶解したもの）０．２ミリ
リットルを加えて反応を開始し、反応液の３４５ｎｍに
おける吸光度の減少を測定した。ＦＡＧＬＡの加水分解
による３４５ｎｍでのモル吸光度変化として３１７Ｍ
−１ｃｍ−１、酵素の２８０ｎｍでのモル吸光係数とし
て６．１１Ｘ１０４Ｍ−１ｃｍ−１を用い、常法により
反応速度定数を求め、野性型酵素の反応速度定数と比較
した。
Ｍ トリス−マレイン酸、１０ｍＭ塩化カルシウム、
１．５ｍＭ ＦＡＧＬＡ）２．０ミリリットルに精製酵
素溶液（２０ｍＭ トリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍ
Ｍ 塩化カルシウムに酵素を溶解したもの）０．２ミリ
リットルを加えて反応を開始し、反応液の３４５ｎｍに
おける吸光度の減少を測定した。ＦＡＧＬＡの加水分解
による３４５ｎｍでのモル吸光度変化として３１７Ｍ
−１ｃｍ−１、酵素の２８０ｎｍでのモル吸光係数とし
て６．１１Ｘ１０４Ｍ−１ｃｍ−１を用い、常法により
反応速度定数を求め、野性型酵素の反応速度定数と比較
した。
【００３８】図５に示したように、１１９番目のグルタ
ミン残基をグルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リ
ジンに置換すると、ＦＡＧＬＡ分解活性の上昇が認めら
れた。なお変異体酵素の表し方として、例えば１１９番
目のグルタミン残基をグルタミン酸に置換したものをＱ
１１９Ｅと表した。
ミン残基をグルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン、リ
ジンに置換すると、ＦＡＧＬＡ分解活性の上昇が認めら
れた。なお変異体酵素の表し方として、例えば１１９番
目のグルタミン残基をグルタミン酸に置換したものをＱ
１１９Ｅと表した。
【００３９】
【発明の効果】本発明における変異体酵素は、特定の合
成ペプチドに対する分解活性が著しく高いものであり、
種々の用途における本酵素の利用に際し、反応効率の上
昇や反応時間の短縮などの点で優れた効果を発揮する。
成ペプチドに対する分解活性が著しく高いものであり、
種々の用途における本酵素の利用に際し、反応効率の上
昇や反応時間の短縮などの点で優れた効果を発揮する。
【００４０】また、本発明の変異体のうちＱ１１９Ｅは
すでに報告されているサ−モリシンと同一のアミノ酸残
基である。しかし、活性およびｐＨプロファイルの点に
おいて、配列表１に示した野生型酵素が市販のサ−モリ
シンときわめて類似していることから考えて、このよう
な著しい酵素活性の上昇が起こるという効果は予想する
ことができなかったことであり、本発明の効果が顕著で
あることを示している。
すでに報告されているサ−モリシンと同一のアミノ酸残
基である。しかし、活性およびｐＨプロファイルの点に
おいて、配列表１に示した野生型酵素が市販のサ−モリ
シンときわめて類似していることから考えて、このよう
な著しい酵素活性の上昇が起こるという効果は予想する
ことができなかったことであり、本発明の効果が顕著で
あることを示している。
【００４１】尚、本発明における配列表１は以下の様に
表現される。
表現される。
【００４２】［配列表１］
【００４３】配列の長さ：３１６ トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源：バチルス属
【００４４】 Ile Thr Gly Thr Ser Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Lys Asn Ile Asn Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu 20 25 30 Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys 35 40 45 Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn 50 55 60 Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro Ala Val Asp Ala His Tyr 65 70 75 Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys Asn Val His Asn Arg 80 85 90 Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg Ser Ser Val His 95 100 105 Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly Ser Gln Met 110 115 120 Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu Ser Gly 125 130 135 Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr Asp 140 145 150 Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 155 160 165 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala 170 175 180 Asn Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro 185 190 195 Gly Ile Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys 200 205 210 Tyr Gly Asp Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln 215 220 225 Asp Asn Gly Gly Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys Ala 230 235 240 Ala Tyr Leu Ile Ser Gln Gly Gly Thr His Tyr Gly Val Ser Val 245 250 255 Val Gly Ile Gly Arg Asp Lys Leu Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Ala 260 265 270 Leu Thr Gln Tyr Leu Thr Pro Thr Ser Asn Phe Ser Gln Leu Arg 275 280 285 Ala Ala Ala Val Gln Ser Ala Thr Asp Leu Tyr Gly Ser Thr Ser 290 295 300 Gln Glu Val Ala Ser Val Lys Gln Ala Phe Asp Ala Val Gly Val 305 310 315 Lys
【００４５】
【００４６】
【図１】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＵＣＴＺ
５５を構築する工程図である。
５５を構築する工程図である。
【００４７】
【図２】プラスミドｐＵＣＴＺ５５からＭ１３ファ−ジ
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する工程図である。
Ｍ１３ＴＺＢａ−Ｓｐを構築する工程図である。
【００４８】
【図３】プラスミドｐＭＫ１からプラスミドｐＭＫ８を
構築する工程図である。
構築する工程図である。
【００４９】
【図４】プラスミドｐＭＫ８およびプラスミドｐＵＣＴ
Ｚ５５（ｍｕｔａｎｔ）からｐＭＫ９（ｍｕｔａｎｔ）
を構築する工程図である。
Ｚ５５（ｍｕｔａｎｔ）からｐＭＫ９（ｍｕｔａｎｔ）
を構築する工程図である。
【００５０】
【図５】ＦＡＧＬＡ分解における各変異体のｐＨプロフ
ァイルである。図中、●は配列表１に示される野生型酵
素を、▲は市販されているサ−モリシンを、■はＱ１１
９Ｈを、○はＱ１１９Ｅを、△はＱ１１９Ｒを、□はＱ
１１９Ｋを示す。
ァイルである。図中、●は配列表１に示される野生型酵
素を、▲は市販されているサ−モリシンを、■はＱ１１
９Ｈを、○はＱ１１９Ｅを、△はＱ１１９Ｒを、□はＱ
１１９Ｋを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 青山 淳夫 東京都小金井市貫井南町４−18−12 (72)発明者 米屋 隆 東京都町田市中町３−18−６ (72)発明者 城所 俊一 神奈川県相模原市南台１−９−２ (72)発明者 三木 洋一郎 神奈川県相模原市西大沼４−４−１ (72)発明者 遠藤 きみ子 東京都町田市金森1733−10 (72)発明者 和田 昭允 東京都港区赤坂８−11−４
Claims (2)
- 【請求項１】配列表１のアミノ酸配列を有する耐熱性中
性プロテアーゼにおいて、アミノ末端から１１９番目の
グルタミン残基が他のアミノ酸残基に置換された新規な
プロテアーゼ - 【請求項２】請求項１に記載された他のアミノ酸残基が
グルタミン酸、ヒスチジン、リジンまたはアルギニンで
ある新規なプロテアーゼ 【０００１】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35172991A JPH0646850A (ja) | 1991-12-16 | 1991-12-16 | 新規プロテア−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35172991A JPH0646850A (ja) | 1991-12-16 | 1991-12-16 | 新規プロテア−ゼ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646850A true JPH0646850A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=18419217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35172991A Pending JPH0646850A (ja) | 1991-12-16 | 1991-12-16 | 新規プロテア−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646850A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006527584A (ja) * | 2003-06-19 | 2006-12-07 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ |
| JP2013078334A (ja) * | 2007-11-01 | 2013-05-02 | Danisco Us Inc | サーモリシン及びその変異体の生成及び液体洗剤での使用 |
-
1991
- 1991-12-16 JP JP35172991A patent/JPH0646850A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006527584A (ja) * | 2003-06-19 | 2006-12-07 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ |
| JP4880453B2 (ja) * | 2003-06-19 | 2012-02-22 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ |
| JP2013078334A (ja) * | 2007-11-01 | 2013-05-02 | Danisco Us Inc | サーモリシン及びその変異体の生成及び液体洗剤での使用 |
| JP2016052306A (ja) * | 2007-11-01 | 2016-04-14 | ダニスコ・ユーエス・インク | サーモリシン及びその変異体の生成及び液体洗剤での使用 |
| US9976134B2 (en) | 2007-11-01 | 2018-05-22 | Danisco Us Inc. | Thermolysin variants |
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