JPH06500019A - ペプチドリガーゼ活性を有するセリンプロテアーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド刃ガーゼ活性を有するセリンプロテアーゼ変異体発明の詳細な説明 産業上の利用分野 本発明はペプチドリガーゼ活性が向上したプロテアーゼ変異体を形成するための 組換えおよび、または化学的方法で前駆体セリンプロテアーゼから誘導されるセ リンプロテアーゼ変異体に関する。また本発明はセリンプロテアーゼ変異体およ び第２ライゲーシヨン基質と合せてライゲーション産物を形成し得る新しいライ ゲーション基質を含む。また本発明はこのようなライゲーション産−を形成する 方法および該方法により形成される産物に関する。

従来の技術 たんぽ（質を合成するための化学的方法は非天然または選択的にラベル化したレ ヴユー、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）、　Ｅ、　Ｔ、　（１９８９）Ａｃｅ、　Ｃ ｈｅａ　Ｒｅｓ、２２．　４７−５４ニオフオード（Ｏｆｆｏｒｄ）、　Ｒ，Ｅ 、　（Ｉ　９８７）　Ｐｒａｔ、εｎｇｉ、２５２−１５７参照）。

たんばく質分解酵素、特にセリンプロテアーゼはその立体選択性および温和な反 応条件から合成ペプチド化学の代替物として使用し得ることが報告されている（ レヴユー、クルマン（Ｋｕｌｌｍａｎ）、　Ｗ、（１９８７）　、酵素的ペプチ ド合成、ＣＲＣブレス、７０リダ、Ｕ、Ｓ、；チャイケン（Ｃｈａｉｋｅｎ）、 （１９８１）　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅ［ＩＬｌ　１．　２５ ５−３０１参照）。これらの酵素は合成フラグメイトのブロック的酵素的結合に よってより大きいペプチドを生成させるというように化学的結合法を補うように 使用し得ることが報告されている（イノウイエ（Ｔｎｏｕｙｅ）等、（１９７９ ）、　Ｊ、　Ａｆｆｌ、Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、１０１．　７５１−７５２　（ インシュリンフラグメント）；ホマンドバーグ（）Ｉｏｍｎｄｂｅｒｇ）および ラスコラスキ−（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ）（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　１且、５８６−５９２　（リボヌクレアーゼフラグメント））。しかし、セ リンプロテアーゼの狭い基質特異性と本質的な加水分解（ペプチダーゼ）活性が ペプチド合成への使用を制限している。

ペプチド合成におけるセリンプロテアーゼの中心的問題はアシル−酵素中間体の 加水分解が加アミノ分解（ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ）よりもはるかに起こり易いこ とである（第１図）。いくつかの研究グループは触媒作用を起こす混合または純 粋な有機溶剤を使用することで平衡を加水分解がら加アミノ分解へと変化するこ とを報告している（コレチーブレビＺｃｔ　（Ｃｏｌｅｔｔｊ−Ｐｒｅｖｉｅｒ ｏ）等（１９６９）　Ｊ、　Ｍａｌ。

Ｒｉａｌ、３９．４９３−５０１　；パーパス（Ｂａｒｂａｓ）等、（１９８８ ）　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、１１０．　５１６２−５１６６）。しかし、一般に酵素は有機溶媒中で は不安定で、かつ比較的溶解しにくい（ウォン（Ｗｏｎｇ）等、（１９９０）　 Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ。

酵素活性へと誘導するのに関する荷電転移状態に対してより高い。これらの問題 を回避するため１つの研究グループは活性部位の５ｅｒ２２１をＣｙｓに化学的 に変換した（Ｓ　２２ＩＣ）バクテリアセリンプロテアーゼの誘導体チオールズ ブチリシンは非常に小さいペプチドに対しては加水分解に対するよりも加アミノ 分解への選択性が１０００倍以上変化していることを報告した。ナヵスタ（Ｎａ ｋａｓｕｔａ）等、＜１９８７）　Ｊ、　Ａｍ、Ｃｈｅａ　Ｓａｃ、　Ｉ　Ｏ９ ，３８０８−３８１０’。コノ変化は水よりもアミンと反応するチオエステルの 速度論的選択性に寄因する。゛同じ原則に基づき別の研究グループはセレノール ズブチリシンは加水分解に対するよりも加アミノ分解への選択性が１４０００倍 の変化を示した“ことを報告した。つ（Ｎｕ）およびヒルバート（Ｈ１ｌｖｅｒ ｔＸ１９８９）Ｊ、　ｋｎ、　ＣｈｅＩＬＳａｃ、１上１．４５１３−４５１４ ゜しかし、チオールまたはセレノールズブチリシンによる化学的に活性化された エステルの加アミノ分解の触媒効率は各々約１０”倍および１０’倍となったが 共に野生型ズブチリシンのエステラーゼ活性よりも低い。化学的に活性なエステ ルがチオールまたはセレノールズブチリシンのアシル化速度の増加に使用し得る ことが報告されているが（たとえば＞５０％ＤＭＦ中での４１１１ｅｒペプチド とのライゲーションに対する８ｆｆ１ｅｒペプチドのｐ−クロロフェニルエステ ルによるチオールズブチリシンのアシル化）、これらの活性化された′エステル は合成が困難であり水性溶液中での自然の加水分解を受け易い基質を生成する（ ナヵッヵ（Ｎａｋａｔｓｕｋａ）等、（１９８７）主述）。

セリンプロテアーゼには広範囲の特異性および生物学的機能を存する多様な酵素 か含まれる。ストロード（Ｓｔｒｏｕｄ）、　Ｒ，Ｍ、　（１９７４）　Ｓｃｉ 、　Ａｍｅｒ、±１±、７４−８８゜これらの機能的多様性にもかかわらず、セ リンプロテアーゼの触媒機構は少なくとも２つの遺伝的に異なる酵素で調べられ てきている。１つはバチルスズブチリシン型セリンプロテアーゼで、もう！つは 哺乳類および相同的バクテリアトリプシン型セリンプロテアーゼ（たとえばトリ プシンおよびＳ、フレシラス（ｇｒｅｓｊｕｓ）　トリプシン）である。これら ２つのグループのセリンプロテアーゼは触媒機構の著しい類似を示す。クロー） 　（Ｋｒａｕｔ）、　Ｊ、　（１９７７）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、４６，３３１−３５８゜さらに−次構造は関連していないか これらの２つの酵素グループの３次元構造はセリン、ヒスチジンおよびアスパラ ギン酸からなるアミノ酸の保存的触媒トリオを形成している。

ズブチリシンは広範囲のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種から大量に分泌される セリンエンドプロテアーゼ（ＭＷ２７．５００）である。ズブチリシンのたんば く質配列は少なくとも４種類のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）について決定され ている。マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）　Ｆ、　Ｓ、等（１９７１）”酵素 ”、ボイヤー（Ｂｏｙｅｒ）　Ｐ、　Ｄ、纒、アカデミツクプレス、ニューヨー ク、■巻、５６１−６０８；ネドコフ（Ｎｅｄｋｏｖ）。

Ｒ３等（１９８３）　Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 　Ｃｈｅｍ、、　３６４．　ｌ　５７４−Ｉ５４０゜分解能２５人のズブチリシ ンＢＰＮ’　（Ｂ、アミロリクエファシェンス（ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ ｅｎｓ）の３次元結晶構造も報告されている。ポット（Ｂｏｔｔ）等Ｃ，Ｓ、等 （１９６９）、　Ｎａｔｕｒｅ、２２１．　２３５−２４２　；ドレンス（Ｄｒ ｅｎｔｈ）。

Ｊｌ等（１９７２）Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、２６．　１７７−１８１ ０これらの研究でズブチリシンは遺伝的に哺乳類セリンプロテアーゼとは関連し ていないが、同様の活性部位構造を有していることが示された。共有結合したペ プチドインヒビターを含むズブチリシン（ロバータス（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ）、　 Ｊ、　Ｄ、、等（１９７２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ　１１．２４３９− ２４４９）、産物複合体（ロバータス（Ｒｏｂｅｒｔｕｓ）、　Ｊ。

Ｄ、１等（＋　９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１．　４２９３−４３０ ３）および転移状態アナログ（マチユース（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）、　Ｄ、　Ａ、 、等（１９７５）、　Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｍ。

２５０．７１２０−７１２６　、ボーロス（Ｐｏｕｌｏｓ）、　Ｔ、　Ｌ、等（ １９７６）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

ンの活性部位および推定上の基質結合クレットに関する情報を提供している。さ らに多くの速度論的および化学修飾的研究がズブチリシンについて報告されてい る（フィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐ）、　Ｍ、、等（１９８３）　Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５１．５−３２．２ベンドセン（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ ）、　［、Ｂ、　（１９７６）　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　ＣｏｆｆＩｎ 。

米国特許４．７６（］、　０２５はバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ−１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの部位＋３ ２．＋１５５．　＋１０４．＋２２２゜＋１６６、＋６４．＋３３．　＋１６９ ．＋１８９．＋２１７または＋１５６の天然のアミノ酸残基を種々のアミノ酸で 置換したズブチリシン変異体を公開している。

先に示した参考文献は本出願の出願日以前に公開されたものを単に示したもので あり、より早期の発明であることやより早期にされた出願に基づく優先権によっ て発明者がこれらの開示の日付けを遡らせるような権利が与えられないことを認 めるものと解釈されてはならない。

本発明の概要 先の事実に基づき、大型のペプチドおよびたんばく質の化学合成は使用し得る化 学合成技術および合成または組換えペプチドブロックを結合し得る有効なペプチ ドリガーゼの欠除により厳しく制限されていることが分る。

したがって本発明の目的はペプチドおよび他の基質を有効にライゲーションし得 るセリンプロテアーゼ変異体を提供することである。

さらに、本発明は先に述べたセリンプロテアーゼ変異体と共に用いて、第１ライ ゲーシヨン基質と第２ライゲーシヨン基質をライゲーションし、ライゲーション 産物を得るライゲーション基質を提供することにある。

さらに、本発明の目的はセリンプロテアーゼ変異体およびライゲーション基質を 用いて、ライゲーション産物を生成させる方法を提供することである。

さらに本発明は先に述べた方法によって作られるライゲーション産物を提供する ことを目的とする。

先に述べた目的に従がい、本発明には前駆体セリンプロテアーゼのアミノ酸残基 中央なくとも２つの変化により前駆体セリンプロテアーゼから誘導される天然に は存在しないアミノ酸配列を存するセリンプロテアーゼ変異体が含まれる。特に 前駆体セリンプロテアーゼは通常その前駆体酵素によりて行なわれる触媒作用に 関与する触媒性セリン残基を特徴とする。この活性部位セリン残基を別のアミノ 酸で置換え、そのセリン側鎖の核的酸素を別の核基で置換する。また、活性部位 セリンの側鎖を直接化学的に修飾してその核性酸素を別の核基に置換できる。第 ２の変化は前駆体酵素の活性部位セリンを含まない第２のアミノ酸残基の置換ま たは修飾で構成される。活性部位セリンの置換または修飾と合せて、第２アミノ 酸残基の置換または修飾は活性部位セリンにおける核性酸素の置換または修飾の みを含む別のセリンプロテアーゼ変異体よりも高い水溶液中のペプチドリガーゼ 活性を特徴とするセリンプロテアーゼ変異体を生じさせる。

また本発明には先に述べたセリンプロテアーゼ変異体と合せて有効なライゲーシ ョン基質が含まれる。種々の前駆体セリンプロテアーゼはペプチド結合（切断可 能なペプチド結合）の切断を触媒する。スケッチャー（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）お よびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）　（１９６７）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ ｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａｎｕｎ、　２７．　１５７−１６２の命名法を用いた プロテアーゼ加水分解基質残基の標準的名称および加水分解された切断可能な結 合を第２Ａ図を示す。基本的にペプチドライゲーションは加水分解の逆反応なの でライゲーション基質は第２Ｂ図に示したものと同様に定義される。すなわち、 本発明の特徴の１つとして第４ライゲーシヨン基質はそのカルボ牛シ末端が有機 アルコール（たとえば２−ヒドロキシカルボン酸）またはチオールでエステル化 している少なくとも１個のＲ１アミノ酸残基を含む。このＲ１残基には優先的に 前駆体セリンヒドロラーゼに結合するか、またはさらにＰ１部位で基質特異性を 変えるよう修飾されたセリンヒドロラーゼに優先的に結合するアミノ酸残基Ｒ１ が含まれる。またこのようなＲ１残基にはその変異体が特異性を示す非天然のア ミノ酸が含まれる。さらにエステル化した２−ヒドロキシカルホン酸は前駆体セ リンプロテアーゼの基質中のＰｌ′残基またはＰＩ’部位においてその特異性を 変化させたセリンプロテアーゼ変異体に好ましい残基と非常によく似ている。

また本発明には本発明のセリンプロテアーゼ変異体を第１および第２ライゲーシ ヨン基質と接触させライゲーション産物を生成するライゲーション法が含まれる 。第１ライゲーシヨン基質には先に述べたライゲーション基質が含まれる（第２ ８ＩＮ）。第２ライゲーシヨン基質にはセリンプロテアーゼ変異体が特異性を示 す少なくとも１個のＲ１’アミノ酸残基が含まれる（第２Ｃ図）。またそれには その変異体が特異性を示す非天然のアミノ酸が含まれる。第１および第２ライゲ ーシヨン基質のライゲーションにより形成されるライゲーション産物には配列Ｒ １−Ｒ１’か含まれる（第２Ｄ図）。

さらに本発明には先に述べた方法によって作られるライゲーション産物が含まれ る。このような産物は輿望的には約１７アミノ酸残基長以上の長さを有している 。またこのようなライゲーション産物は水溶液中で行なわれる（これに限定され る訳ではないが）ライゲーション法によって特徴付けられる。

図面の簡単な説明 第１図はペプチドライゲーションの速度論的特徴を示している。等式ｌにおいて エステル結合は酵素によって切断し、アルコール基が放出さむうその酸が活性部 位求核基にアシル化しアシル−酵素中間体（アシル−酵素）が生成する。このア シル−酵素中間体の２つの可能な反応は加水分解（等式２）および加アミノ分解 （等式３）である。加水分解は非生産的であり、一方加アミノ分解では付加物形 成が起こる。この酵素のアミダーゼ活性（等式４）はこの付加物の切断およびア シル−酵素中間体の再形成を起こす。

第２Ａ図はシェラチャ−（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ Ｘ１９６７）Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏａｏｕｎ、、　２７．　１５７−１６２）の 命名法を用いて表わしたプロテアーゼ基質残基を示している。第２Ｂ図および第 ２Ｃ図はペプチドライゲーションで用いる第１および第２ライゲーシヨン基質を 示している。種々の残基Ｒ２、Ｒ１，Ｒ１’　およびＲ２’　はセリンプロテア ーゼ変異体または前駆体酵素が特異性を示すアミノ酸残基またはそのような残基 のアナログで構成され、たとえばそれらのアミノ酸残基にはＰ２．　ＰＩ、Ｐｉ ’　およびＰ２’が含まれる。第１ライゲーシヨン基質のカルボキシ末端は使用 される基質のＣ末端カルボキシル基にエステル化し第１ライゲーシヨン基質を形 成する２−ヒドロキシカルボン酸であるＸ基を含む。残基Ｒ２’などはプロテア ーゼ変異体または一体酵素か特異性を示すアミノ酸残基またはそのような残基の アナログ、たとえばＰ２’などで構成される。第２Ｄ図は本発明のセリンプロテ アーゼ変異体による第１および第２ライゲーシヨン基質のライゲーションで形成 されるライゲーション産物を示している（第２Ｂ図および第２Ｃ図参照）。

第３図は触媒性トリオ５ｅｒ２２Ｌ　Ｈｉｓ６４およびＡｓｐ３２を含むバチル スアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃ ｉｅｎｓ）ズブチリシンの触媒性残基を示している。四面体中間体転移状態はＥ Ｓ’として示されている。

第４図はバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌ ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの三次構造を示している。触媒性残基５ ｅｒ２２１と関連するα−へリックスを強調しである。

第５図は触媒性５ｅｒ２２１と関連するバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂ ａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンのα−へ リツクスノ立体像である。

第６図は天然のアミノ酸に標準的−文字命名法を用いたバチルスアミロリクエフ ァシェンス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）Ｖａｒ［１６８およびバチルス リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のズ ブチリシンのアミノ酸配列を示している。

第７図は５ｅｔ２２１および部位２２５を含むα−へリックスを含む領域におけ る野生型（自律）およびＰ２２５Ａ（黒棒）バチルスアミロリクエファシェンス （ｈｃｉ　１ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの重 ねあわせ立体像である。

第８図は野生型ズブチリシンの活性部位（残基Ｐ４からＰ２″）に結合した遷移 状態のペプチド基質を示す活性部位像を示している。加水分解基質は酵素の対応 する官能基との水素結合に関与する主鎖カルボニル酸素およびアミドを含む外に 伸びたβ−シート様構造で結合する。特に、残基５ｌ−Ｓ４は３木組逆子行β− シートの中央鎖を形成する（マクファレン（ＭｃＰｈａｌｅｎ）等、（１９８８ ）上述）。

切断可能な結合のいずれかの側のより重要な側鎖相互作用のいくつかか強調され ている。基質特異性に影響する他の残基、たとえばＰＩ特異性に対するＧｌｕ　 １５６およびＧＩＹ１６６などは示してない。

第９図はペプチド基質を真似た第１ライゲーシヨン基質を作る上で有用な一般的 構造と特異的２−ヒドロキシカルボン酸を示している。特異的２−ヒドロキシ基 とアミノ酸との構造的関係も示している。

第１０Ａ、ＩＯＢおよびＩＯＣ図は種々のズブチリシン変異体とともに請求核剤 （アシル−アクセプター）としてジペプチドＡｌａ−Ｐｈｅ−アミド（３，６ｍ Ｍ）を使用したときのペプチドエステル基質（初期濃度０．３５ｍＭのサクシニ ル−ＡｌａＡｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−グリコール酸−Ｐｈｅ−アミド）の消 費とそれに伴う加水分解および加アミノ分解産物の出現を示す進行曲線を表わし ている。各々の場合、同一条件下（ｐＨ８，０、（２５±０．２°Ｃ））で等量 の酵素を用いて行った。経時的に部分標本をサンプリングし、ＲＰ−ＨＰＬＣで 分析した。第１０Ａ図のズブチリシン変異体はＰｒｏ２２５Ａｌａ、第１０Ｂ図 は５ｅｒ２２１　Ｃｙｓ、および第１ＯＣ図はＳｅｒ　２２１　Ｃｙｓ／　Ｐｒ ｏ　２２５　Ａｌａである（加アミノ分解（・）、加水分解（Ｏ））。　第１１ 図は４種の第１ライゲーシヨン基質各々に対して異なるＰＩ特異性を示すズブチ リシン変異体の比較である。進行曲線は核性ライゲーションペプチドＡｌａ−Ｐ ｈｅ−アミド１．５ｍＭの存在下加水分解産物または加アミノ分解産物に変わる 基質の消費を示している。基質は１文字コードのテトラペプチドに略しである。

すなわちＡＡＰＦはｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−グリコール酸−Ｐ ｈｅ−アミドである。各々の場合前アミノ分解は加水分解よりも多い。

第１２図は天然の最初の８個のアミノ酸の第１ライゲーシヨン基質エステルまた はズブチリシンの野生型の特異性により適するよう修正した第１ライゲーシヨン ペプチドを用いた成長ホルモンライゲーションの経時サンプルの還元５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥを示している。第２ライゲーシヨン基質はｄｅｓ−ｏｃｔａ　ｈＧＨであ る。レーンｌ、低分子量標準、レーン２および９、非ライゲーションｄｅｓ−ｏ ｃｔａ　ｈＧＨ；レーン３−７、ｌ、１０．２０．４０および８０分後の天然Ｎ −末端のペプチドエステルにペプチドリガーゼＧ１６６Ｅ／５２２ＩＣ／Ｐ２２ ５Ａ変異体を用いた反応の部分標本。レーン８、野生型成長ホルモン：レーン１ ０−１４．１．１０．２０，４０および８０分後の別のペプチドエステルにリガ ーゼの３２２１Ｃ／Ｐ　２２，５　Ａ変異体を用いた反応の部分標本。ｄｅｓ− ｏｃｔａ変異体ｈＧＨを含む全てのレーンにおいて、主要バンドの下により小さ いバンドを２本見ることかできる。これらは大腸菌からの発現および精製の際の たんばく質分解的切断に由来する２本の鎖である。さらに、全ての時点でズブチ リシン変異体の部分標本に約３０ｋＤａの見かけの分子量を育することが分る。

第１３図はバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの部位２２５のプロリンのアラニンに よる置換をコードするＤＮＡの構築法を示している。

第１４図はプロトロピンライゲーションの経時部分標本の還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ を示している。５ｅｔ２２１　Ｃｙｓ／Ｐｒｏ２２５Ａｌａ型のペプチドリガー ゼを用し）９残基ペプチドをプロトロピンにライゲーションした。レーンｌ、低 分子量標準物質、レーン２、ズブチリシン；レーン３、ライゲーションしていな いプロトロピン、レーン４−９．１．２．５．１Ｏ１３０および６０分後のペプ チドとライゲーションしたｈＧＨ。

詳細な説明 本明細書で使用されている“セリンプロテアーゼ”は少なくとも１個の触媒活性 セリン残基を含むプロテアーゼを意味する。このようなセリンプロテアーゼは原 核および真核生物の両方に遍在する。ズブチリシン型およびトリプシン型セリン プロテアーゼなど多くのセリンプロテアーゼの一般的特徴はアスパラギン酸、ヒ スチジンおよびセリンを含む共通する触媒性トリオの存在である。ズブチリシン 型プロテアーゼの場合、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に読んだこれらア ミノ酸の相対的順番はアスパラギン酸−ヒスチジン−セリンである。トリプシン 型プロテアーゼの場合、その相対的順番はヒスチジン−セリンくラギン酸−セリ ンである。しかしこの触媒性残基の相対的配列順序にかかわらず、セリンプロテ アーゼの二次および三次構造はこれら３つの触媒性残基を非常に近似の触媒性活 性部位を形成させている。

第３図および第５図はバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ａｍｙｌｏ−１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの触媒性残基を示してい る。四面体転移状態を形成するズブチリシン中のセリン２２１と切断可能ペプチ ド結合の相互作用を第３図に示す。触媒性セリンと基質のカルボキシ部分の間の アシル−酵素中間体は基質のカルボキシ末端部分が活性部位から離れた後に形成 される。アシル−酵素中間体の加水分解はその酵素から切断されたペプチドのア ミノ末端側部分を放出し、またセリンアルコール基を元へ戻す。

ズブチリシン型セリンプロテアーゼの場合、セリン（ズブチリシン中のセリン２ ２１）の触媒性側鎖のＯＧ基はこの分子中に伸びている長い中央α−へ１ルツク スのアミノ末端付近に位置する。ポット（Ｂｏｔｔ）等、（１９８８）　Ｊ、　 Ｒｉａｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、。

２６３．７８９５−７９０６゜バチルスアミロリクエファシェンス（ＢａＣｌｌ ｌｕＳａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンの場合、このα−へ リックスにはメチオニン２２２からリジン２３７までが含まれる。このヘリック スは進化的に関連するズブチリシン型セリンプロテアーゼ中に保存されているが 、トリプシン型セリンプロテアーゼの触媒性部位には存在しない。マクフアレン （ＭｃＰｈａｌｅｎ）等（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７．　６５ ８２−６５９８゜ズブチリシン型セリンプロテアーゼの活性部位に関連するα− へリックスはこのヘリックスの双極子が触媒において機能的役割を果していると いうことを示唆する。ホル（Ｍｏｌ）、　Ｗ、　Ｇ、　’Ｊ、　（１９８５）Ｐ ｒｏｇ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、４５′、１４９−１９ ５゜しかしトリプシン型セリンプロテアーゼの活性部位におけるα−ヘリックス の欠除がズブチリシン型ブｄテアーゼの活性部位へリックスが触媒において重要 かどうかという未解決の問題を生じさせた。ホル（Ｈｏｔ）　（１９８５）上述 。　□第４図において、触媒性セリン２２１と共にバチルスアミロリクエファシ ェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシ ンのα−へリックスはそれが酵素の３次構造に関連することを示している。触媒 性セリン２２１に関連するこのα−へリックスの立体像を第５図に示す。

バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ ｒａｃｉｅｎｓ）　、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）Ｖａｒ　 Ｉ　１６８およびバチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓ）由来のズブチリシンのアミノ酸配列を第６図に示す。バチルスア ミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃ ｉｅｎｓ）ズブチリシンのα−へリックスはＭｅｔ２２２からＬｙｓ２３７にお よんでいる。枯草菌の対応する（等価な）α−へリックスも同様でありごまたバ チルスリチェニホルミス（Ｂａｃｊ　ｆｌｕｓ１ｉｃｈｅｎｉ　ｆｏｒｍｉ　ｓ ）ズブチリシンのα−へリックスはＭｅｔ２２１からＬｙｓ２３６を含む。また バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ ｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中のプロリン２２５の対応する（等価な）残基は 枯草菌ズブチリシンではプロリン２２５であり、またバチルスリチェニホルミス （Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ　ｌ　ｉｃｈｅｎｊｆｏｒｍｊｓ）ズブチリシンの場合は プロリン２２４である。枯草菌における触媒性セリンは部位２２１にあり、また バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ） ズブチリシンにおいては部位２２０に存在する。

本明細書で用いている“前駆体セリンプロテアーゼ“は天然セリンプロテアーゼ および組換えセリンプロテアーゼを意味する。天然の前駆体セリンプロテアーゼ の例にはバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉ　１ｌｕｓ　ａｍｙｌｏ ｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスリチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ 　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）　、バチルスアミすサラ力リジカス（Ｂａｃｉ 　１ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｓａｃｃａｒｉｄｉｃｕｓ）由来のバクテリアズブチリ シン、および菌類、植物および高等動物の相同的セリンプロテアーゼ、バクテリ ア、菌類、植物、動物およびウィルス由来のトリプシン、キモトリプシン、α− 溶溶解性プロアアーゼエラスターゼプラスミノーゲン、トロンビン、組織プラス ミノーゲン活性化因子およびその類似物を含むトリプシン壓セリンプロテアーゼ が含まれる。

“組換えセリンプロテアーゼ“は天然のセリンプロテアーゼをコードするＤＮＡ 配列をそのセリンプロテアーゼアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の置換、挿 入または欠失をコードする変異ＤＮＡ配列を生ずるよう修正したセリンプロテア ーゼを示す。適当な修正法は本明細書および１９８５年１月９日公表されたＥＰ Ｏ刊行物Ｎ（Ｌ　０１３０７５６および１９８８年１月７日公表された　ＥＰＯ 刊行物ＮｃＬ０２５１４４６に報告されている。特定のセリンプロテアーゼ、た とえばズブチリシンについて言及するとき、前駆体ズブチリシンおよび組換えズ ブチリシンという用語はこれらの定義に従って使用される。

天然および組換えセリンプロテアーゼに加えて、“前駆体セリンプロテアーゼ” という語句は天然にはない１つ以上のアミノ酸残基を含む天然または組換えセリ ンプロテアーゼである合成セリンプロテアーゼも含む。これらの合成セリンプロ テアーゼは本明細書またはンュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ）等（１９８９）　５ｃｉ ｅｎｃｅ、　２４４゜１８２−１８８に報告されているインビトロ転写−翻訳法 で調製し得る。

本明細書で使用される“セリンプロテアーゼ変異体″は前駆体セリンプロテアー ゼのアミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列を存するセリンプロテアーゼを意 味する。セリンヒドロラーゼ変異体のアミノ酸配列は前駆体アミノ酸配列の１つ 以上のアミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体プロテアーゼアミノ酸配列 から誘導される。このような修正は前駆体セリンプロテアーゼのアミノ酸配列を コードする“前駆体ＤＮＡ配列”に関する。さらにある場合にはこのセリンプロ テアーゼ変異体は前駆体アミノ酸配列のアミノ酸残基の１つ以上の側鎖の直接的 化学的修飾により前駆体プロテアーゼから誘導し得る。たとえば好ましい態様の １つではバチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌ ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンのセリン２２１をシスティンに変換する 。このような変換はズブチリシンのＤＮＡ配列をシスティンをコードするよう修 正し、変異体中セリンをシスティンで置換すること、または適当な化学試薬でセ リンを直接修飾することにより等価な変異体を形成させることにより行い得る。

たとえばニート（Ｎｅｅｔ）。

Ｋ、　Ｅ、等（１９６６）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、　５６．１６０６−１６１１；ボルガ−（Ｐｏｌｇａｒ）、　Ｌ、、等 （１９６６）、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、８８．　３１５３− ３１５４　（ズブチリシンの化学修飾によるチオズブチリシンの形成）参照。

好ましい態様において、活性部位セリン残基の側鎖の核性酸素はその側鎖の核性 酸素を別の核基で置換されるよう置換もしくは修飾される。好ましい核基には− ＳＨ，−３ｅＨ，−ＮＨ，が含まれる。最も好ましい核基はＳＨ−であり、セリ ンのシスティンによる置換を意味している。

さらに、本発明のセリンプロテアーゼ変異体には前駆体セリンプロテアーゼ中の 第２のアミノ酸残基の置換または修飾が含まれる。この第２アミノ酸残基の修飾 は活性部位セリン残基の側鎖の置換または修飾によりそこに誘導された変化を許 容できる程度に活性部位を変化させるよう行なわれる。活性部位セリンか置換ま たは修飾を受け天然のセリン側鎖よりも大きい側鎖が生じる場合（たとえばシス ティンがセリンと置換するか、またはセレニウムが核性酸素と置換する場合）、 第２アミノ酸残基は活性部位の大きさを効果的に増加させるように置換または修 飾により新しい核的触媒性側鎖を生ずる残基である。すなわちたとえばズブチリ シン型セリンプロテアーゼの場合、バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃ ｉ　１ｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン中部位２ ２１に存在する核基は前駆体セリンプロテアーゼ中の活性部位セリンの位置また はその付近に存在するα−へリックス中の１つ以上のアミノ酸残基を修正するこ とにより動かし得る。

ズブチリシンの場合、このような修飾または置換はプロリン２２５に関するもの であることか好ましい（カルドウエル（Ｃａｌｄｗｅｌ　ｌ）等（１９８９）　 Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５ｕｐｐ、１３Ａ、５１）ｏバチルスアミロリクエファシェ ンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌ　１ｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシン 中のこの残基または他のズブチリシンにおける等価な残基の修正はへリックス形 成アミノ酸による置換によって行なわれる。

チヨ−（Ｃｈｏｕ）　Ｐ、　Ｙ、等（１９７４）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｉ　３．　２１１　；カイト（Ｋｙｔｅ）、　Ｊ、、等（１９８２）　Ｊ、　Ｍ ｏ１．　Ｂｉａｌ、、　１５７．　１０５　；ローズ（Ｒｏｓｅ）。

Ｇ１３等（１９７７）　、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、Ｉ　１３．　ｌ　５３ ．このようなアミノ酸の例にはアラニン、ロイシン、メチオニン、グルタミン、 バリンおよびセリンが含まれる。グリシンおよびプロリンなとのへリックス破壊 アミノ酸は好ましくない。

あるいは、置換アミノ酸には置換される残基よりも小さい側鎖容積を育するもの が含まれる。チョシア（ＣｈｏｔｈｉａＸ　１９８４）、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、５３．５３７゜先に述べたアミノ酸またはそれらのアナログ による置換はα−へリックス中の残基２２３−２３７に先行する不連続性（よじ れ）を変える。

部位２２５の好ましい置換アミノ酸はアラニンである。このような変異体を作っ たとき、５ｅｒ２２１を含むα−へリックスはオキシアニオンホールから請求核 基を引き離すことが知られている。天然のズブチリシンに関するこの特定の置換 の効果は野生型およびＰｒｏ２２５Ａｌａズブチリシンの残基２２０乃至２３０ の立体図である第７図に示されている。５ｅｒ２２１の請求核基はオキシアニオ ンホールおよび触媒性ヒスチジン６４から０．２〜０．４人離れる。５ｅｒ２２ １のシスティンによる置換と組合せたとき、２２１残基のこの置換は各々０．６ ５人および１．０３人の核基サイズの増加を効果的に埋め合せる。ポーリング（ Ｐａｕ　ｌ　ｉｎｇ）。

Ｌ、（１９６０）　“化学結合の性質″、第３編、コーネル大学出版、アイチカ 、Ｎ、　Ｙ、ρ１１．２４６−２６０゜ 本発明のセリンプロテアーゼ変異体の特徴はそれが水性溶液中その活性部位セリ ン残基の核性酸素の置換または修飾のみを含む別のセリンプロテアーゼよりも大 きいペプチドリガーゼ活性を有していることである。このように５ｅｒ２２１Ｃ ｙｓ／　Ｐｒｏ　２２５　Ａｌａなどの変異体は５ｅｒ２２１Ｃｙｓ変異体より も大きいペプチドリガーゼ活性を存している。

本明細書て使用している“ペプチドリガーゼ活性”という語句は２つ以上の基質 をライゲーションする酵素の能力を意味している。このような基質には後に述へ るライゲーション基質およびペプチドチオベンジルエステルｐ−クロロフェニル エステル（ナカツカ（Ｎａｋａｔｓｕｋａ）等（１９８７）　Ｊ、　Ａｍｅｒ、 　Ｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、、　Ｉ　Ｏ９゜３８０８−３８１０）、ｐ−ニトロフェ ニルエステルおよび他のアリールエステルなどの公知の活性化ペプチドが含まれ る。さらに活性化エステルにはメチル、エチル、グリコール酸、乳酸なとのアル キルエステルおよびアルキルチオールエステルが含まれる。ペプチドリガーゼ活 性は測定する酵素をライゲーションに適した条件下少なくとも２つのペプチドま たは基質（一般にその１つは活性化したカルボキシ末端を含む）と接触させるこ とにより測定する。それからその酵素のＫｃａｔ、　Ｋｍおよび／またはＫｃａ ｔ／Ｋｍ比をめる。Ｋｃａｔはその酵素のターンオーバー数を示し、酵素分子当 り単位時間当り転換し得る最高の基質数を提供する。通常Ｋｍは酵素の基質アフ ィニティーに逆比例する。基質の産物への転換に対する二次速度定数である触媒 効率はＫｃａｔ　／Ｋｍ比で与えられる。同じペプチドライゲーションに対して より高いＫｃａｔ　／Ｋｍ比を存する種々のセリンプロテアーゼはより高いペプ チドリガーゼ活性を有している。しかしそれらがその酵素が基質で飽和している 場合に反応が進行すると仮定してより良いＫｃａｔ値を育する場合にはより高い ペプチドリガーゼ活性を有すると考えることができる。２つの酵素のペプチドリ ガーゼ活性を比較する場合、各酵素は同じ条件下、同じペプチドと接触させるこ とが望ましい。

リガーゼ活性を有するセリンプロテアーゼ変異体を形成するための活性部位セリ ンおよび第２アミノ酸残基の先に述べた修正に加えて、アミノ酸側鎖の種々の他 の置換または修飾が目的のライゲーションペプチド産物を形成するのに用いられ るライゲーションペプチドに対する特異性を修正するために行ない得る。たとえ ばズブチリシン変異体５ｅｒ２２１　ＣＹＳ／Ｐｒｏ２２５Ａｌａはバチルスア ミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎ＋ｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ ｅｎｓ）由来の野性嬰ズブチリシンから誘導される。この野生型ズブチリシンは 第２Ａ図に示した加水分解ペプチドの円残基がＴｈｒ、　Ｖａｎ、Ｉｌｅ、Ｐｒ ｏまたはＧｌｙではなく、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイ シン、メチオニンおよびリジンからなるペプチドを優先的に加水分解する。さら に好ましい加水分解ペプチドはＰｌ′部位にＩｌｅ。

Ｐｒｏ、　ＡｓｐまたはＧｌｕを、もしくはＰ２’部位にＧｌｙ、　Ａｌａ、Ｐ ｒｏ、　Ｓｅｒ、　ＡｓｐまたはＴｈｒなどの小さいアミノ酸を含むべきではな い。ズブチリシン変異体５ｅｒ２２１　Ｃｙｓ／Ｐｒｏ２２５　Ａｌａにおいて ズブチリシンの基質結合クレットを形成するアミノ酸残基は修正せず、従ってた とえばＲ２からＰ２’など１個以上の基質残基と相互作用するこの結合クレット 内にある種々の酵素サブサイトは、なお野生型ズブチリシンの通常の基質を結合 し得る。もちろんこの変異体はこのズブチリシン変異体を形成するために行なわ れた修正のためこのようなペプチド基質に関し実質的により低い触媒活性を示す 。

したがってこのようなズブチリシン変異体は正常なペプチド基質に存在するもの に対応するかもしくは非常に関連するアミノ酸残基またはアナログを含むライゲ ーション基質を結合し得る。このように第２Ｂ図で図式的に示されている“第１ ライゲーソヨン基質”には（アミノ末端からカルボキシ末端の方向に読んで）残 基ＲｎからＲ１が含まれる。Ｒ１は通常ズブチリシン加水分解基質のＰ１部位に 見出されるものに類似する大きな疎水性アミノ酸またはアナログである。同様に 、Ｒ２は通常加水分解基質のＲ２部位に見出されるアミノ酸残基（またはそのア ナログ）に対応するか、または非常に関連している。第１ライゲーシヨン基質の カルボキシ末端に共有結合しており、第１ライゲーシヨンペプチドおよびＲ２“ からＲｎの残基を活性化するＸ基については後に詳しく議論する。

第２Ｃ図に図で示されている“第２ライゲーシヨン基質”は残基Ｒ１’からＲｎ ’　（アミノ末端からカルボキシ末端の方向に読んで）を含む。残基２２１およ び２２５に修正を受けた上記のズブチリシン変異体とともに用いた時、Ｒ１’は 通常のズブチリシン加水分解基質中のＰＩ’アミノ酸残基（またはそのアナログ ）に対応する。第２ライゲーシヨン基質残基Ｒ２’に関し、この残基は通常のズ ブチリシン加水分解基質のＰ２’残基と類似か、または非常に関連する大きな疎 水性アミノ酸残基（またはそのアナログ）を含む。第１および第２ライゲーシヨ ン基質の両方について通常の加水分解基質中に存在するアミノ酸残基（またはそ のアナログ）に対応するか、または非常に関連する別のアミノ酸残基も選択し得 る。別のセリンプロテアーゼに対する適当なＲおよびＲ′残基がこれらのプロテ アーゼに対する天然の加水分解基質に対して選択されるがこれらに限定されるこ とはない。

さらに、第１または第２ライゲーシヨン基質のいずれかは産物の部位特異的修正 を起こす他の化合物を含み得る。この特定の化合物は産物内の特定の部位を特異 的に指向するよう選択することができる。たとえば第１または第２ライゲーシヨ ン基質はライゲーション産物の構造のＸ線結晶学的解析に宵月なライゲーション 産物の重金属誘導体を生ずるような重金属イオンを含み得る。第１または第２ラ イゲーシヨン基質は生物物理学的研究を目的とした修飾またはアイソトープラベ ルしたアミノ酸も含み得る。

さらに、ライゲーション反応を行う条件はライゲーションが起こるように修正し てもよい。この修正はライゲーション基質がリガーゼ活性を破壊することなくラ イゲーションを起こすのに適当な立体構造を取るのに必要とされよう。たとえば 、その実験条件には変性剤、界面活性剤、有機溶剤または還元剤の添加またはと りわけｐＨまたは温度の変化が含まれる。

実験条件と同様に第１および第２ライゲーシヨン基質は望ましいレベルの特異性 を生ずるのに要求されるものを選択すればよい。本発明の応用例にはより低いレ ベルのライゲージ３ン反応特異性を必要とするものもあるが、一方他の応用の場 合厳格な特異性が望まれる。

本明細書で示されているようにズブチリシン変異体Ｓ　ｅｒ　２２１　Ｃｙｓ／ 　Ｐ　ｒｏ２２５ＡｌａはＲ１およびＲ２’アミノ酸残基に対する上述の優先性 に従かい第１ライゲーシヨン基質（活性基を含む）および第２ライゲーシヨン基 質をライゲーションし得る。この変異体のペプチドライゲーション活性は同じラ イゲーション基質に対し実質的に５ｅｒ２２１　Ｃｙｓ変異体の活性よりも大き い。部位Ｒ１にアミノ酸Ｐｈｅ、　Ｔｙｒ、　Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、　Ｔｒｐおよび Ｌｙｓおよび部位Ｒ２’にアミノ酸Ｐ　ｈｅ。

Ｔｙｒ、ＬｅｕおよびＭｅｔを育する第１および第２ライゲーシヨン基質に対す るこの変異体の優先性は公知の化学合成法で調製したものなどのブロック基質の ライゲーションへの実質的な応用を提供する。

一般に合成ライゲーション基質は約１５〜２５残基長であり、約５０残基長のラ イゲーション産物を生ずる。この第１ライゲーション産物はその後別のライゲー ション基質とライゲーションしてより長いライゲージジン産物を構築し得る。

基質ライゲーションに広い特異性を提供するためこのセリンプロテアーゼ変異　 ′体に別の修正を行ない第１および／または第２ライゲーシヨン基質に対する特 異性を変化させ得る。ここで述べているように、５ｅｔ２２１ＣＹＳ／Ｐｒｏ２ ２５ＡＩａの修正とＧ１ｕ１５６およびＧＩＹ１６６残基における修正を含むズ ブチリシン変異体を作り第１ライゲーシヨン基質のＲ１残基に対するこの変異体 の特異性を修正した。５ｅｒ２２１　Ｃｙｓ／Ｐｒｏ２２５　Ａｌａ変異体から ３つの変異体を作った。これらの特異的変異体には２２１および２２５の修正の 他にさらにｃｌｙ　１６６　Ｇｌｕ。

Ｇｌｕｌ　５６．Ｇ１ｎ／Ｇｌｙｌ　６６ＬｙｓおよびＧｌｙｌ　６６　ｌｉｅ を含んでいた。アミノ酸残基の標準的１文字記号を用いると、これらの変異体は 各々Ｇ　ｌ　６６　Ｅ／５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａ、Ｅ１５６Ｑ／Ｇ１６６に／５ ２２ＩＣ／Ｐ２２５ＡおよびＧ１６６１／５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａと表すことが できる。５２２ＩＣ／Ｒ２２５Ａ変異体にこれらの変異を導入することにより、 ペプチドリガーゼ特異性が実質的に変化した。種々の第１ライゲーシヨン基質（ 後に詳細に議論する）および第２ライゲーション基質Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミドの ライゲーションを示した第１１図を参照のこと。

小さいＲ１エステル基質（ｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ａｌａ　−ｇｌｃ 　−Ｐｈｅ−アミド）に対してはＧ１６６Ｉ／５２２１Ｃ／Ｒ２２５Ａ変異体（ ＩＯＡ）が実質的に他のものよりも良い（第１１図）。Ｅ１５６Ｑ／Ｇ１６６に ／５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａ５２２ＩＣ／Ｒ２２５Ａ変異Ｒ１第１ライゲーション 基質を第２ライゲーション基質Ａｌａ−Ｐｈｅ−アミド（ＡＦ−アミド）ととも に効率的に加アミノ分解する。

またこれはＰｈｅ　Ｒ１第１ライゲーシヨン基質に対し他の変異体よりもより大 きいペプチドライゲーション活性を有している。ＬｙｓＲ１エステル基質に対し 、３つの変異体（相補的に荷電した０１６６Ｅ／５２２ＩＣ／Ｒ２２５Ａ変異体 （ＥＣＡ）を含む）の速度は同様であり、かつ同様に荷電した変異体Ｅ１５６Ｑ １０１６６に／５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａよりも非常に活性か高いｏＲＩＡｒｇｚ ステルを含むペプチド基質のライゲーションについて本発明者の予備的データは Ｇ１６５Ｅ／５２２１Ｃ／Ｐ　２２５　Ａは実質的に親リガーゼよりも高い活性 を有していることを示している。第１表を参照のこと。

一般に、至適酵素ライゲージコンペプチドペアに対する加アミノ分解速度は同等 であり、このことはＬｙｓ、　Ａｌａ、ＰｈｅおよびＧＩｕＲ１ライゲーション 基質を５２２１Ｃ／Ｐ　２２５　Ａ由来のりガーゼ５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａ　（ ＣＡ）の適正な選択物と効率的にライゲーションすることか可能であることを示 している。ＬｙｓＲ１ライゲーション基質以外、３つの別の特異性変異体のうち の少なくとも１つは親ペプチドリガーゼよりも実質的に活性が高かった。これら 付加的変異体酵素はライゲーション結合部の設計にさらに柔軟性を与える。

これらの結果は各々ＬｙｓまたはＡｒｇ、　ＧｌｕおよびＡｌａＰ１基質を含む ペプチドの加水分解についてのズブチリシン変異体Ｇ１６６Ｅ、Ｅ１５６Ｑ／Ｇ １６６におよびＧ１６６Ｉの特異性と一致している（ウェルズ（Ｗｅｌｔｓ）等 、（１９８７）４４６）。野生型ズブチリシン中の種々のＰおよびＰ′残基に関 する基質特異性の変化を起こすことが知られている別の修正を種々の第１および 第２ライゲーシヨン基質に対するセリンヒドロラーゼ変異体の特異性をさらに修 正する５ｅｔ２２１／Ｐｒｏ２２５またはそれと等価な修正と効果的に組合せ得 る。

バチルスアミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅ ｆａｃｉｅｎｓ）ズブチリシンに対するこれらの多くの修正は、１９８８年１月 ９日公表されたＥＰＯ公開ＮＩＬ　０１３６７５６および１９８８年！月７日公 表されたＥＰＯ公開１１ｈ　０２５１４４６ｉ：：報告されている。これらの修 正はここで述べられている５ｅｒ２２１　／Ｐｒｏ２２５変異体（並びに本発明 の範囲内にある他の変異体）に容易に導入でき第４および第２ライゲージジン基 質に対して広い特異性を示す変異体を形成し得る。これらのＥＰＯ公開に開示さ れている方法はここで述べている変異体をコードする　ＤＮＡを修正するのに容 易に適用し得る。

第１表 ズブチリシン変異体を用いたペプチドのライゲーションに適する配列残基 Ｒ４Ｒ３Ｒ２ＰＩ　Ｒ１’　Ｒ２’　Ｒ３’不適：　Ｇ、Ｐ、Ｔ、Ｖ、［、［、 Ｐ、Ｄ、Ｅ”　Ｐ、Ｇ。

適合二　大小の　柔軟性　柔軟性　Ｍ、Ｙ、Ｌ（１）’　Ｒ，Ｃ，Ｎ、Ｆ、Ｙ、 柔軟性疎水性物　Ｐ（１，４）　Ｔ、に、Ｈ，Ｌ、Ｍ。

Ｋ（１，２，３）　Ｗ、Ｑ、Ｙ、Ｐ、Ｋ。

Ｒ（３）　Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｇ。

Ａ（２） Ｅ（４） （ａ）　ＧｌｕおよびＡｓｐ側鎖の有害な効果は高塩濃度（１Ｍ以上、カーター 等（Ｃａｒｔｅｒ）等、（１９８９）　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、６．２４０−２４８ ）で抑制できる。

（ｂ）これらの残基は以下のチオズブチリシン変異体に対して好ましい。

（１）＝Ｓ２２１Ｃ／Ｐ２２５Ａ：（２）＝０１　’１６　Ｉ／５２２ＩＣ／Ｐ ２２５Ａ；（３）＝Ｇ１６６Ｅ／５２２１Ｃ／Ｐ２２５Ａ；（４）＝Ｅ１５６Ｑ ／Ｇ１６６に／Ｓ２２　ＩＣ／Ｒ２２５Ａ。

基質特異性に影響する修正を組合せることに加えて、セリンプロテアーゼの他の 性質に影響する他の修正と組合せることも可能である。特に本発明の変異体と組 合せることが望まれる多くの性質に影響する修正がズブチリシンに対して行なわ れる。たとえば部位５０のメチオニンのＰｈｅまたはＣｙｓによる置換および部 位２２２のＡｌａ、　Ｃ；ｌｙ、　ＳｅｒおよびＣｙｓによる置換は野生型ズブ チリシンと比べて酸化的に安定なズブチリシン変異体を生ずる。さらに熱安定性 、アルカリ安定性の増加およびｐＨ活性特性の変化を起こすズブチリシンへの修 正か知られている。

たとえば１９８８年１月７日公表されたＥＰＯ刊行物０　２５１　４４６を参照 のこと。本発明はライゲーション活性に加えて前駆体酵素の１つ以上のその他の い温度での失活に耐え得るセリンプロテアーゼは、反応温度の増加が１つ以上の ライゲーションペプチドの部分的または完全な変性を容易にし、ライゲーション 収率か増加する場合の第１および第２ライゲーシヨン基質のライゲーションに有 用である。同様にライゲーション基質の変性を容易にするｐＨで至適活性を有す る変異体は特定の応用に有用である。もちろん現在知られていないが本発明のセ リンプロテアーゼ変異体に望ましい性質を与えることが分った他の修正も本発明 の範囲に含まれる。

活性化したアリール−エステル基質（チオベンジルエステルなど）はズブチリシ ンのアシル化に関し対応するアルキル−エステルよりも効率が良いか、アリール −エステルは合成が困難で、かつ本質的に不安定である。一連のアルキル−エス テル基質を合成し、アシル−酵素中間体形成に対するドナー基質としてのそれら の触媒効率を改良した。ペプチド基質は残基Ｐ４がらＰ３’　までの伸長したア ンチパラレルβ−シート構造に結合する（マクフアレン（ＭｃＰｈａｌｅｎ）お よびジェームス（Ｊａｍｅｓ）　（１９８ｇ）　、　Ｂｊｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、２ヱ、６５９２−６５９８）、Ｒ４およびＰＩ残基はこの酵素の基質特異性を 支配しているけれども（フィリップ（Ｐｈｉ　１ｉｐｐ）およびベンダー（Ｂｅ ｎｄｅｒ）　（１９８３）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅａ、５１゜５ −３２；エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）等（１９８Ｂ）、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３３ ．　６５９−６６３参照）、加水分解の触媒効率はペプチド基質がＰ１′からＰ ３°に伸長する場合有意に増加する（モラハラ（Ｍｏｒａｈａｒａ）等、（１９ ７０）　、　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１３８．　５１５−５２５）。

第２Ｂ図および第２Ｃ図で第１および第２ライゲーシヨン基質を先に述べられた Ｒ１およびＲ２’基とともに示した。第２Ｂｆｆｌ中エステルの脱離基Ｘは以下 の有機アルコールまたはチオールのいずれであってもよいニアリール基が置換し ていないか、または１つ以上のニトロ基、水酸基、ハロゲン（Ｆ、　ＣＩｌ、　 Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ，−Ｃ，アルキル基、ハロゲン−Ｃ，−Ｃ，アルキル基、Ｃ，− Ｃ，アルコキシ基、アミノ基、フェニルオキシ基、フェニル基、アセトアミド基 、ベンズアミド基、ジーＣ，−Ｃ，アルキルアミノ基、Ｃ，−Ｃ，アルキルアミ ノ基、ｃ＠−Ｃ１２アロイル基、Ｃ，−Ｃ，アルカノイル基、およびヒドロキシ −Ｃ，−Ｃ，アルキル基で置換しているＣｍ　ｃｉｔｙリル基；非置換またはハ ロゲン（Ｆ、　Ｃｆ、　Ｂｒ。

Ｉ）置換の分岐、直鎖または環状のＣ，−Ｃ，□アルキル基：Ｃ，−Ｃ，アルコ キシ基、アリール基か置換していないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、 ハロゲン（Ｆ、Ｃ１，Ｂｒ、Ｉ）　、Ｃ，−Ｃ，アルキル基、Ｃ，−Ｃ，−アル コキシ基、アミン基、フェニルオキシ基、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジ ーＣ１−已アルキルアミノ基、Ｃ，−Ｃ，アルキルアミノ基、Ｃ−−Ｃ１２アロ イル基およびＣ，−Ｃ，アルカノイル基で置換しているＣ、−Ｃ，、アリロキシ 基：イソチオウレイド基：Ｃ−−０７シクロアルキル基；ウレイド基；アミノ基 ；Ｃ，−Ｃ，アルキルアミノ基；ジーＣ，−Ｃ，アルキルアミノ基、水酸基二ア ミノ−Ｃ２−Ｃ。

アルキルチオ基；アミノ−Ｃ，−Ｃ，アルコキシ基：アセトアミド基：フェニル 環か置換されていないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロゲン（Ｆ。

Ｃｐ、Ｂｒ、Ｉ）　、Ｃａ−Ｃ＊アルキル基、Ｃ，−Ｃ，−アルコキシ基、アミ ノ基、フェニルオキシ基、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジーＣ，−Ｃ，ア ルキルアミノ基、Ｃ＋　−Ｃ−アルキルアミノ基、Ｃ・−Ｃｕアロイル基および Ｃ，−Ｃ，アルカノイル基で置換したベンズアミド基ニアリール基か置換されて いないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロゲン、Ｃ，−Ｃ，アルキル 基、Ｃ，−Ｃ，−アルコキシ基、アミノ基、フェニルオキシ基、アセトアミド基 、ベンズアミド基、ジーＣ，−Ｃ，アルキルアミノ基、Ｃ，−Ｃ，アルキルアミ ノ基、Ｃ，−Ｃ，２アロイル基およびＣ，−Ｃ，アルカロイル基で置換したＣ、 −Ｃ，□アリールアミノ基２グアニジノ基：フタルイミド基；メルカプト基、Ｃ ，−Ｃ，アルキルチオ基；Ｃ６−Ｃａｔアリールチオ基；カルボキシ基；カルボ キシアミド基；カルボ−Ｃ，−Ｃ。

アルコキシ基ニアリール基が置換されていないか、または１個以上のニトロ基、 水酸基、ハロゲン、Ｃ，−Ｃ，アルキル基、Ｃ，−Ｃ，アルコキシ基、アミノ基 、フエニロキシ基、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジーＣ，−Ｃ，アルキル アミノ基、Ｃ，−Ｃ，アルキルアミノ基、ヒドロキシＣ，−Ｃ，アルキル基、Ｃ １−Ｃ＋ｔアロイル基およびＣ，−Ｃ，アルカノイル基で置換したＣ、−Ｃアリ ール基：およびヘテロ環が５〜ＩＯ個の環原子を含み、かつ２個までの０．Ｎ、 またはＳヘテロ原子を含む芳香族へテロ環。

本発明の１つの態様としてＸは２−ヒドロキシカルボン酸であることが好ましい 。２−ヒドロキシカルホン酸の一般式を第９図に示す。これから分るように２− ヒドロキノカルボン酸のコア構造は２−ヒドロキシ基がアミノ基で置換している こと以外アミノ酸のコア構造と同じである。したがって、適当な＃鎖Ｒ基は２− ヒドロキシ酸に対し天然のアミノ酸で見られる側鎖Ｒ基に対応するよう選択でき る。このようにたとえばアミノ酸グリシンに相当するグリコール酸およびアミノ 酸アラニンに相当する乳酸などの種々の２−ヒドロキシカルボン酸を基質のカル ボキシ末端でエステル化し第１ライゲーシヨン基質を形成し得る。

２−ヒドロキシカルボン酸をグリコール酸または乳酸とした第１ライゲーシヨン 基質を構築した。基本的に２−ヒドロキシカルボン酸は加水分解基質のＰｌ。

残基と相互作用する酵素結合クレット中の領域に結合するアミノ酸として働く。

さらに、２−ヒドロキシカルボン酸の遊離カルボキシル基を第２Ｂ図に示したよ うに各々Ｒ２’またはＲ２’からＲｎ’で表わされるアミノ酸残基（またはその アナログ）またはペプチド（またはペプチドアナログ）でアミド化される。ここ で示したようにＲ２’は加水分解基質残基Ｐ２’　と相互作用する酵素の結合ク レット中の領域との相互作用を至適化するように選ぶことが好ましい。その他の Ｒ″残基は同様のアナログが存在する。得られる脱離基は′Ｍ１ライゲーション 基質を活性化し、その結果エステル切断の活性化エネルギーはセリンプロテアー ゼ変異体への結合を至適化することにより低下する。

本明細書で使用されているように“ライゲーション産物″は本発明のセリンヒド ロラーゼ変異体による第１および第２ライゲーシヨン基質のライゲーションで形 成する。しかし、ライゲーション産物および第１および第２ライゲーシヨンペプ チドはその全てが天然アミノ酸で出来ている必要はなく、またさらに全てがたん ばく質である必要はないと理解すべきである。この点に関し、第１および第２ラ イゲーシヨン基質の唯一の必要事項はそれらが少なくとも１個のＲ１アミノ酸ま たはその機能的アナログ（第１ライゲーシヨンペプチドのカルボキシ末端）、な らびに第２ライゲーシヨンペプチドのＲ１’部位には１個のアミノ酸またはその 機能的アナログを含むことである。これらのＲ１およびＲ１’残基はセリンヒド ロラーゼ変異体の基質結合クレットの適当な領域に結合でき、その結果ライゲー ションが起こる。Ｒ１およびＲ１’中には特に本発明のセリンプロテアーゼ変異 体に機能するアミノ酸残基アナログが含まれる。このようなアナログにはＬ−セ レノシスティン、Ｌ−セレノメチオニンおよびＬ−プロパルギルグリシン（シグ マ）がある。

このような結合およびライゲーションもＲ２およびＲ２’　アミノ酸（またはそ のアナログ）または付加的アミノ酸Ｒ３又はＲ３’など（またはそのアナログ） を必要とする程度に第１および第２ライゲーシヨン基質ペプチドにこのような構 造が含まれる。しかし、第１および／または第２ライゲーシヨン基質は結合およ びライゲーションに必要な領域の外に非天然のアミノ酸を含み得る。さらに、第 １および第２ライゲーシヨン基質はライゲーションを起こすのに十分な結合力を 存することだけが必要なので、第１および第２ライゲーシヨン基質および対応す るライゲーション産物は必要とされる結合およびライゲーション領域の外には事 実上どんな化学構造でも含み得る。したがって、本発明は天然のアミノ酸を含む ポリペプチドまたはたんばく質に対応するライゲージ３ン基質およびライゲーシ ョン産物に限定されることはない。

一連のグリコレート酸および乳酸−エステルを用いた５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａズ ブチリシンによるペプチドライゲーションの効率を分析した（第■表）。ここに 示されているように、−ｇｌｃ−アミドから−ｇｌｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−アミド へと伸長することによりＫｃａｔ／Ｋｍ値が約１０倍系統的に増加している。こ の増加のほとんどはより低いＫｍ値の結果である。１ａｃ−アミドから出発する と同様の増加があり、このことはさらにエステル鎖長の伸長の利点を示している 。一般に乳酸−エステルシリーズはグリコール酸−エステルシリーズよりも４〜 ５倍反応性が低く、また付加的な光学活性中心を含んでいる。それゆえ、触媒効 率の向上、合成の容易性のためさらに−ｇｌｃ−Ｐｈｅ−アミドエステル基質を 研究した。

Ｐ２２５Ａ変異体はほとんど加アミノ分解を伴なわず迅速かつ定量的に−ｇｌｃ −Ｐｈｅ−アミドエステルを加水分解した（第１０Ａ図）。５２２ＩＣ変異体は 基質をゆっくり加アミノ分解し、かつその付加物（ライゲーション産物）を加水 分解し、その結果この時間内で基質の３分の１が加水分解した（第１０Ｂ図）。

しかし５２２１Ｃ／Ｐ２２５Ａ変異体は迅速でほぼ定量的な加アミノ分解を起こ した（〉９０％：第１０Ｃ図）。さらに５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａの低いアミダー ゼ活性から期待されるように（第■表）、加アミノ分解産物（ライゲーション産 物）は５２２１ＣまたはＰ２２５Ａ変異体の結果とは異なり（データ示さず）検 出レベルでの加水分解は確認されなかった。迅速な加アミノ分解、および遅いラ イゲーション産物加水分解に基づき、５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａは−ｇｌｃ−Ｐｈ ｅ−アミドーエステルドナー基質を用いた基質ライゲージジンに関しいずれの親 単−変異体よりも有用な酵素である。

第■表 基質脱離基比較：　全てについてアシル−ドナ一部分はｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−であり、かつ別の脱離基がそれに続く。ジペプチド−Ａｌａ −Ｐｈｅ−アミド（３，１ｍＭ）を用いたライゲーションの初期速度を測定した 。・ｋｃａｔ／Ｋｍ値、基質および酵素間の反応に関する見かけの二次速度定数 の加アミノ分解フラクションは最も信頼性が高い（誤差約２０％）。

脱離基”　ｋｃａｔ（Ｓ−’）　Ｋｍ（ｄ　ｋｃａｔ／ｆａｎ（Ｓ−’ａｍ−’ ）・−ｇｌｃ−アミド　９．５　３．０　３．２０ｘｌＯ”−ｇｌｃ−Ｐｈｅ− アミド　２０．０　１．３　１５Ｘ１０’−ｇｌｃ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−アミド　 ２０．０　０．６　３４ｘｌＯ”−１ａｃ−アミド　３．８　４．５　０．８６ ｘｌＯ’−１ａｃ−Ｌｅｕ−アミド　２．３　１．９　１．２Ｘ１０″−１ａｃ −Ｐｈｅ−アミド　２．９　１．０　２．９刈０３−３ｂｚ　２３０．０　０． ４　請 求核性アクセプターペプチド（第２ライゲーシヨン基質）の配列要件はＮＨ。

−Ｒ１’　−Ｐｈｅ−アミド型（Ｒ１’　はチオアシル−酵素中間体の攻撃の際 Ｒ１’重合部位に存在する第２ライゲーシヨン（アクセプター）基質のアミノ末 端残基に対応する）を有する一連のアクセプタージペプチドのライゲーション効 率を測定することで研究した。Ｒ１’残基は大きさや荷電が様々なので（Ｇｌｙ 、　Ａｌａ。

ＬｅｕｌＡｒｇ）　、　ｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｇｌ ｃ−Ｐｈｅ−アミドの加アミノ分解の見かけの二次速度定数は７倍以下で変化し ている（第１７表）。このことは種々のＰＩ’ペプチド基質の加水分解に関する 広い特異性と一致している（カーター（（Ｃａｒｔｅｒ）等（１９８９）Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ、６．　２４０−２４８）。

第　Ｉｖ　表 種々のジーおよびトリーアミノ酸ペプチドの加アミノ分解反応における効率の比 較。

求核基のｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅによりアシル化されたペプ チドリガーゼとの反応に関する見かけの二次速度定数を比較した。

ペプチド１　ペプチド ＧＦ　０．８　ＧＡ　Ｏ，Ｉ ＡＦ　１．ＯＧＬ　０．３ ＬＰ　Ｏ，３°　ＦＧ　Ｏ，００６ ＲＦ　２．ＯＡＦＡ　２．０ ＲＧ　Ｏ，０４ＬＦＤ　Ｏ，３ ｆａｌ　１文字コードを用いた。全てのペプチドはカルボキシ末端がアミド化し ている。

Ｒ２’部位をＮＨ＊　Ｇｌｙ−Ｒ２’　−アミド型を育する一連のジペプチドで 調べた（第［Ｖ表）。大きなアミノ酸に対する優先性があるが、ライゲーション の速度定数は５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａに対し、ＡｌａからＬｅｕ、　Ｐｈｅと伸 びるにつれ８倍しか変化しない。いくつかのジペプチドの組合せについてはその 差はもっと大きくなる。たとえば、Ａｒｇ−Ｐｈｅは加アミノ分解がＡｒｇ−Ｇ ｌｙよりも１００倍速い。さらにＲ１’　に大きな疎水性アミノ酸およびＲ２° にＧｌｙなどという組合せは極単に悪いライゲーション基質を与える（ＮＨｚ　 Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−アミドとＮＨ２−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミドを比較のこと、第１ ｖ表）。求核性ペプチドを伸長するとライゲーションの触媒効率を２〜３倍増加 できる（ＮＨｚ　Ａｌａ　Ｐｈｅ−アミドとＮＨｚ　−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ −アミドを比較のこと、第ｒｖ表）。

２つの大きなライゲーション基質のライゲーションテストとして、グリコレート −Ｐｈｅ−アミドにエステル化したｈＧＨの最初の８個のアミノ酸（ＦＰＴ［Ｐ ＬＳＲ）を含むペプチドエステル（第１ライゲーシヨンペプチド）を合成した。

アクセプターペプチドフラグメントはｈＧＨの残基９−１９１を含むｄｅｓ−ｏ ｃｔａ　ｈＧＨとした（第２ライゲーシヨンペプチド）。０１６６Ｅ／５２２Ｉ Ｃ／Ｐ２２５Ａ変異体は８０分後期待される分子量を有するライゲーション産物 を生成した（第１２図）。この産物の最初の１０個の残基のアミノ末端シーケー シングで単一のＦＰＴ　ＩＰＬＳＲ７ラグメントがＬｅｕ　−Ｐｈｅ−Ａｓｐで 始まるｄｅｓ−ｏｃｔａ　ｈＧＨのＮ−末端に正しくライゲーションし完全長の ホルモンを与えることを示している。親ペプチドリガーゼ（Ｓ２２　ＩＣ／Ｐ２ ２５Ａ）はこの２つのｈＧＨペプチドフラグメントのライゲーションに関して有 意に効率が悪かった。親リガーゼよりも高いＧ１６６Ｅ／Ｓ　２２　Ｉ　Ｃ／Ｐ 　２２５　Ａ酵素の効率はＰＩ結合部位中のＧ１６６Ｅ置換によるＡｒｇＲ１基 質に対する活性の増加に帰因する。非保護ペプチドエステルの重合は観測されな かった。これはおそらく非常に弱いＰ２’残基である第１ライゲーシヨンペプチ ドの第２アミノ酸残基に位置するＰｒｏ残基に依るものであろう（カーター（（ Ｃａｒｔｅｒ）およびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）　（１９８９）上述）。

このリガーゼ（Ｓ２２２１Ｃ／Ｐ２２５Ａ）の有用性を示すためナノマーエステ ル第１ライゲーシヨン基質（ＦＰＴ　［ＰＡＡＰＦ）を至適酵素基質（Ｓ　−、 Ａ、１ａ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｇｌｃ−Ｐｈｅ−アミド）を真似て構築 した。このペプチドエステルを３２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａによりｄｅｓ　−ｏｃｔ ａ　ｈＧＨ（第２ライゲージａン基質）にライゲーションした（第１２図）。こ のライゲーション産物のたんばく質シーケンシングはｄｅｓ−ｏｃｔａ　ｈＧＨ の未反応アミノ末端ではなく期待されるアミノ末端配列を与えた。このことはラ イゲーションはｈＧＨのα−アミノ基のみに起こりカリリジンのα−アミノ基に は起こらないことを示している。

このｈＧＨの準合成は水中におけるペプチドフラグメントのライゲーションによ り大きいペプチドを形成させた最初の例である。報告によると５０％以上のＤＭ Ｆ　（ジメチルホルムアミド）を含む溶液中でのチオズブチリシンを用いた以前 のライゲーションは１７個以下のアミノ酸残基のペプチドを生成した。ナカツカ （Ｎａｋａｔｓｕｋａ）等（１９８７）　Ｊ、　Ａａ　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、１ ０９．　３２０８−３２１０゜ここで報告するライゲーションでは本発明のセリ ンプロテアーゼ変異体を用いた第１および第２ライゲーシヨンペプチドのライゲ ーションで１９１アミノ酸残基長のライゲージコン産物が生成した。さらにこの ライゲーションは、非水性溶媒の容積２％以下の水性溶液中で行なわ托かつペプ チド側鎖は保護基を必要としない。

ここで用いる“水性溶液”とは水を含む溶液を意味する。ある場合には、この水 性溶液は１〜約５％程の水しか含まないこともある。しかし、一般に水性溶液は 約５０〜１００％（溶質を除いて）の水で構成される。したがって、少量の非水 溶媒を含む溶液は水性溶液の定義の範囲内にあると考える。

しかし、本発明の変異体は触媒性セリンの位置でのみ修正を受けた変異体との比 較で、水性溶液中でのセリンプロテアーゼ変異体のペプチドリガーゼ活性に関し てのみ定義されていると理解すべきである。この定義は水をほとんど、あるいは 全く含まない溶液中での本発明のセリンプロテアーゼ変異体の使用を除外しない 。

以下に例を示すがこれら特許請求の範囲を制限するものとして考えてはならない 。

（材料と方法） （略号）　ＤＭＡ、ジメチルアセトアミド；ＤＭＳＯ，ジメチルスルホキシド： ＤＴＮＢ、５．　５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）、ＤＴＴ、ＤＬ−ジ チオスレイトール：　ｈＧＨ，ヒト成長ホルモン；ＮＥＭ％Ｎ−エチルマレイミ ド；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリ ウム；ｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、　Ｎ−スクシニル−Ｌ −Ａｌａ−Ｌ　−Ａｌａ　−Ｌ　−Ｐｒｏ　−Ｌ　−Ｐｈｅ−パラ−ニトロアニ リド：　ｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−３ｂｚ１同スラスクシ ニル化ペプチドオベンジルエステル；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；　Ｔｒｉｃｉ ｎｅ、　Ｎ　−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン；　Ｔｒｉｓ、トリ ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；Ｅ−Ａｃ１アシル−またはチオアシル− 酵素中間体。変異体たんばく質は野生型残基（１文字アミノ酸コード）の後ろに その部位番号と変異残基を付けて表わされる。多重変異はスラッシュで分ける。

たとえば５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａは部位２２１のセリンおよび部位２２５のプロ リンが各々システィンおよびアラニンに置換したことを示す。プロテアーゼ基質 残基は’／エッチ＋　−（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）およびバーガー（Ｂｅｒｇｅｒ ）　（１９６７）の命名法を用いて命名する、 （一般式中、切断可能な結合はＰＩとＰＩ’残基の間である）。

（材料）：ＤＮＡ操作用の酵素はニューイングランドバイオラプスまたはベセス ダリサーチラブスから入手した。オリゴヌクレオチドはジエネンテクの有機化学 部で合成した。特に示さない限り全てのペプチドはＬ−アミノ酸から成っており 、標準的手法で合成した（パラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍ ｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）。

＋９７９）。ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）’、ＤＴＮＳ、２−メルカプ トエタノール、ＮＥＭ、　ＴＦＡ、　Ｔｗｅｅｎ　８０．　Ｔｒｉｃｉｎｅ、ジ メチルスルホキシド、ジメチルアセトアミドおよび基質ｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡおよび５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｂｚは シグマから入手した。溶媒エタノールおよびアセトニトリルはＪ、　Ｔ、ベーカ ー（Ｂａｋｅｒ）社から購入し、硫酸アンモニウムはＩＣＮバイオケミカルス社 から購入した。ジペプチドＡｌａ−Ｐｈｅ−アミド、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−アミド、 Ａｒｇ−Ｐｈｅ−アミド、Ｇｌ）’−Ａｌａ−アミド、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−アミド 、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−アミド、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−アミド、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−アミド 、およびトリペプチドＡｌａ　−Ｐｈｅ−Ａｌａ−アミドはＢＡＣＨＥＭファイ ンケミカリエンＡＧから入手した。トリペプチドＬｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−アミ ドはＧ、パラ＝　−（Ｂａｒａｎｙ）およｎ、　Ｂ、メリフィールド（Ｍｅｒｒ ｉｆｉｅｌｄ）　（１９７９）、“固相ペプチド合成”、“ペプチド・分析・合 成・生物学的方法１、ジペプチド合成、パートＡ、２巻（Ｅ、グロー（Ｇｒｏｗ ）、Ｊ、メイエンハッター（Ｍｅｉｅｎｈａｔｔｅｒ）纒、Ｎ、　Ｙ、アカデミ ツクプレス）、ｐｐ、３−２５４）に報告されている一般的方法に従って合成し た。

活性化チオールセファロース並びにＧ−２５およびＧ−７５セフアロースはファ ルマシアＬＫＢテクノロジーＡＢから入手した。

（ズブチリシン変異体の発現と精製）：Ｍ１３−大腸画一枯草菌（Ｂ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）シャトルプラスミドｐＳＳ５（（カーター（（Ｃａｒｔｅｒ）およ びウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３７．　３９８−３ ９９）中のズブチリシン遺伝子を内在性ズブチリシンおよび中性プロテアーゼ遺 伝子を欠く枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）宿主株（ＢＧ２０３６）中で発現 させた（ヤン（Ｙａｎｇ）、　Ｍ、　Ｙ、等（１９８４）Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６０．　１５−２１）。ズブチリシンの成熟にはプロ 配列のたんばく質分解的除去が行なわれるので（パワー（Ｐｏｗｅｒ）等（１９ ８６）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、８３．　３０９６−３１００）、プロテアー ゼ活性が減少した変異体は活性ズブチリシンの存在下で発現する。これは対数増 殖期後期に少量の精製ズブチリシンを添加するか（最終濃度５００μｇ／Ｌ＞か もしくは０．１％の野生型ズブチリシン発現細胞を含むＢＧ２０３Ｂの接種物と 共培養することによって達成される（（カーター（（Ｃａｒｔｅｒ）およびウェ ルズ（Ｗｅｌｌｓ）　（１９８７）、上述）。

不活性ズブチリシン変異体の精製は冷エタノールの２倍容のエタノール添加によ るズブチリシン沈殿の前に上溝に等容量の冷エタノールを添加して不純物を沈殿 させる事以外は基本的に報告された方法に従った（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）お よびウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）　（１９８７）　、上述）。さらに、イオン交換ク ロマトグラフィーステップにおいてＣＭ−）リスアクリルをＳＰ−トリスアクリ ルＭと置き換えた。３２２１Ｃ変異体に対しては活性化チオールセファロース上 での精製に活性部位システィンを使用した。この後者のステップは微量の野生型 “ヘルパーズブチリシンから変異体たんばく質を分離するのに重要である。元の 操作の対応するステップでは野生型活性の効率的除去を行うたんばく質表面に導 入したシスティン残基を使用した（カーター（Ｇａｒｔｅｒ）およびウェルズ（ Ｗｅｌｌｓ）　（１９８７）上述：　（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）およびウェル ズ（Ｗｅｌｌｓ）　（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ、３３２゜５６４−５６８）。

変異体Ｐ２２５Ａは自己たんばく質分解的プロセシングを行い得る。それゆえ、 ヘルパーズブチリシンなしに培養し、標準的方法で精製した（エステル（Ｅｓｔ ｅｌｌ）等（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６０．　６５１８−６ ５２１）。

（速度論的検定）：エステラーゼおよびアミダーゼ活性はコントロン・ウビコン ８６０スペクトロフォトメーターを用いた初期速度測定から評価した。エステラ ーゼ活性の検定は１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，６０）、４％（ｖ／ｖ ）ジメチルスルホキシド、０．００５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ　８０中（２５ ±０．２℃）で基質には５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−３ｂｚを用いて 行った。システィン非含有プロテアーゼの場合、ＤＴＮＢを最終濃度３７．５μ Ｍとなるように添加しくエルマン（Ｅｌ−１ｍａｎ　（１９５９）　、　Ａｒｃ ｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｒｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、　８２．　７０−７７）基質の加 水分解によるチオベンゾエートの放出を可視化した。５２２１Ｃ誘導体プロテア ーゼの場合、基質と加水分解産物の２５０ｒａにおける吸光度の差を反応のモニ ターに直接利用した。アミダーゼ活性は同一条件下、ｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ　− Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−ｐＮＡからのｐ−ニトロアニリドの加水分解による４　１ ２ｎｍでの吸光度の増加を追跡することで測定した。

ペプチドの酵素的ライゲーションは９０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ　（ｐＨ８，０） 、２％（ｖ／ｖ）ジメチルアセトアミド、Ｏ，ＯＯ５％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ 　８０中（２５±０．２）”Ｃで行った。

種々の離脱基を育する基質間の比較は、速度が各々ｋｃａｔ／ＫＩＪおよびｋｃ ａｔに比例する低基質濃度（７０−７５μＭ）および高基質濃度（１，３３ｍＭ ）における初期速度を測定することで簡略化した（ファースト（Ｐｅｒｓｈｔ） 　（１９７７）　“酵素の構造とメカニズム”Ｗ、Ｈ，フリーマン・アンド・カ ンパニー社、　ＵＳＡ）。いくつかの基質についてはより高い基質濃度がなおＫ Ｍ値以下となり、その結果ｋｃａｔ値は不正確となる。ジーおよびトリペプチド による加アミノ分解は低いペプチド濃度で行った。族アミノ分解速度はＶ＝に加 アミノ分解（Ｎ）（Ｅ−Ａｃ）／Ｋ　Ｎ（式中（Ｎ）は核剤濃度、（Ｅ−Ａｃ） はアシル−酵素中間体濃度およびＫＮはアシル−酵素中間体に対する核剤の結合 に関する解離定数である）で与えられる（リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）お よびカシｚ（Ｋａｓｃｈｅ）　（１９８５）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　８３０．１６４−１７２）　、　ＫＮ＝　（Ｎ ）　（Ｅ−Ａｃ）　／　（ＮＥ−Ａｃ）なので（Ｎ）の変化は（Ｅ−Ａｃ）の変 化を生じるが低い（Ｎ）の場合、（Ｅ−Ａｃ）　＞＞　（Ｎ−Ｅ−Ａｃ）となり 、Ｋ加アミノ分解／ＫＮ　（種々の核基とアシル−酵素中間体の反応に関する見 かけの二次速度定数）が比較される。

請求核剤の濃度および種々のライゲーション産物に対する吸光度データの較正は アミノ酸組成分析から得られる。ペプチドライゲーションの速度を各求核剤に関 し４または５種類の濃度で測定した。

ライゲージコン反応は経時的に部分標本を採取し、Ｃ−１８逆相ＨＰＬＣでペプ チド産物を分析した。ペプチドは０．１％ＴＦＡ水溶液中アセトニトリルの勾配 で溶出し２１４圓の吸光度でモニターした。アミノ酸組成分析で加水分解および 加アミノ分解産物を確認するとともに、その吸光度の値を較正した。加水分解お よび加アミノ分解産物（求核剤としてジペプチドＡｌａ−Ｐｈｅ−アミドを使用 した）の構造はマススペクトル測定で確認した。

実施例 実施例１　ズブチリシン変異体の生産 分子モデル化はプログラムＦＲＯＤＯ（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）　（１９７８ ）　Ｊ。

Ａｐｌ）、　Ｃｒｙｓｔａｌｌのｇｒ、比　２６８−２７２）およびバチルスア ミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ ｎｓ）由来のズブチリシンＢＰＮ’の１．８人分解能の構造の座標（ポット（Ｂ ｏｔｔ）等（１９８８）　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａ、、２６３゜７８９５ −７９０６）を用いエバンス・アンド・サザーランドＰＳ３００で行っ（アステ リスクは修正するヌクレオチドの位置を示し、また下線は唯一のＫｐｎＩ部位で ある）を用い野生型ズブチリシン遺伝子（ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）等、（１９８ ３）はＫｐｎＩ部位に対する制限選択により（ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）等、（１ ９８６）　Ｐｈ１ｌ。

レオチドを示し、下線は新しいＦｓｐＩ部位を示す）を用いて５２２ＩＣテンプ レートに導入した。変異体Ｇ１６６ＥおよびＥ１５６Ｑ／Ｇ１６６にの構築はウ エルス（Ｗｅｌｌｓ）等（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　８４．１２１９−１２２３に報告されており、また変異 体０１６６Ｉはエステル（Ｅｓｔｅｌｌ）等（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２ ２３．　６５９−６６３に報告されている。活性部位（部位２２１および２２５ ）およびＰ１１％ポケット（１５６および１６６）のまわりの変異の組合せは酵 素ＰｐｕＭＩにより分解した変異制限フラグメントのライゲーションで得られる 。１９８８年１月９日公表されたＥＰＯ公開Ｎｏ、０　２５１　４４６参照。

全ての変異体はダイデオキシシーケンシングで確認した（サンガー（Ｓａｎｇｅ ｒ）等、（１９７７）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳ Ａ、８３．　３０９６−３１００）。

Ｐ２２５Ａ変異体をコードする変異遺伝子はＴ、グレイカー（Ｇｒｅｙｃａｒ） 　（ゼネンカー（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、　Ｓ、サンフランシシコ、ＣＡ）から供 与された。それは第１３図に示した変異体オリゴヌクレオチドを用いたバチルス アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉ ｅｎｓ）ズブチリシンの一末鎖Ｍ１３サブクローンに対するプライマー伸長突然 変異誘発で合成した。

先に同定したズブチリシン変異体を実施例２および実施例３に示したライゲーシ ョン基質とともに使用して先に述べた結果を得た。

実施例２　ＦＰＴＩＰＡＡＰＦ−グリコレート−Ｆ−アミドの合成Ｃ末端アミド ライゲーションペプチドの合成はメチレンクロライド中ジイソプロピルカルボジ イミドを用いた第１Ｂｏｃ保護アミノ酸（Ｂｏｃ−フェニルアラニン）の４−メ チル−ベンズヒドリルアミン樹脂（バツケム社り、Ａ、）への結合によって行っ た。保護ペプチドの合成を目的とした標準的Ｂｏｃ合成法は以下のとおりである 。バラニー（Ｂａｒａｎｙ）　Ｇ、等（１９７９）、“固相ペプチド合成″、“ ペプチド、分析、合成、生物学、ペプチド合成の特殊な方法”、パートＡ、２巻 （Ｅｊロー（Ｇｒｏｗ）、　Ｊ、メイエンホフｙ−（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｆｅｒ） 編、ニューヨーク、アカデミ・ツクプレス）、ｐｐ、３−２５４゜グリコール酸 残基を対応するｔ−ブチルエステル、とじて導入した。メチレンクロライド中５ ０％トリフルオロ酢酸によるｔ−ブチルエーテルの除去および９０％メチレンク ロライド、１０％ジメチルアセトアミド中でのジイソプロピルカルボジイミドお よびｌＯｍｏ１％ジメチルアミノピリジンを用いた次のアミノ酸のカップリング がエステル結合を与えた。次のアミノ酸は再び標準的Ｂｏｃプロトコールを用い て組込んだ。粗ペプチドを脱保護し、フ・ソ化水素で樹脂から切り離した。それ からこの粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣて精製した。純度はマススペクトル分析で測 定した。Ｍ＋１理論値、１１６４．５、Ｍ′″１測値１１６４．６゜同様の方法 を用い他の第１ライゲーシヨンペプチドを生成した。

実施例３　成長ホルモン発現および半合成大腸菌アルカリホスファターゼプロモ ーターおよび大腸菌熱安定性エンテロトキシン■由来のシグナルペプチドを用い （チャン（Ｃｈａｎｇ）等（１９８７）　Ｇｅｎｅ。

５５．１８９−１９６）ヒト成長ホルモンの短縮型（残基９−１９１を含むｄｅ ｓ　−ｏｃｔａ　ｈＧＨ）を大腸菌Ｗ３１１０　（ｔｏｎＡ：ＡＴＣＣ２７３２ ５）で発現させた。

細胞ペレットを４倍容の１０ｍＭトリス−Ｈ（Ｊ、ｐＨ８，０に懸濁し、細胞周 辺腔からｈＧＨを放出させた。この細胞をペレット化し、その上清からｈＧＨを 精製した（オルソン（Ｏｌｓｏｎ）等（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ、２９３，４０ ８−４１１）。

カルボキシ末端に配列ＦＰＴＩＰＬＳＲまたはＦＰＴＩＰＡＡＰＦを育するｈＧ Ｈのアミノ末端配列から誘導されるペプチドを脱離基グリコール酸−Ｐｈｅ−ア ミドでエステル化した。ｄｅｓ−ｏｃｔａ　ｈＧＨ（０，５ｍＭ）および２つの ペプチド基質のいずれか（最終２．４ｍＭ）との間の反応は各々最終濃度３．０ μＭまたは３．４μＭの３２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａまたは０１６６Ｅ／５２２ＩＣ ／Ｐ２２５Ａズブチリシンを用い、２０℃、Ｔｒｉｃｉｎｅ　（ｐＨ８，０）中 で行った。反応は部分標本を等容量の１００ｍＭ　ＮＥＭ（活性化部位システィ ンをアルキル化する）と混合することにより停止した。ローディングバッファ（ ５％　２−メルカプトエタノール、５％グリセロール、１０ｍＭ）リスＨ（Ｊ、 ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５％ＳＤＳ、最終濃度）を加え、このサ ンプルを煮沸してから５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） 　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ１２２ヱ、６８０−６８５）。

第１２図参照。このライゲーション産物をポリビニリデンジフルオリドメンブレ ンニブロッティングしくマツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ）等、（１９８７） 　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６２．１００３５−１００３８）、そのアミノ末端配列を決定した 。

実施例４　ペプチドによるプロトロピンの修飾ペプチドをライゲーションしてよ り大きいたんばく質を作ることに加えて、プロトロピン（ｍｅｔ　−ｈＧＨ）を ５２２ＩＣ／Ｐ２２５Ａペプチドリガーゼで修飾した。成長ホルモン準合成に使 用したペプチドの１つ、ＦＰＴＩＰＡＡＰＦ−グリコリル−Ｆ−アミドをこれら のライゲーションに使用した。プロトロピン（７５μＭ）をｌ＋５μｆの反応バ ッフｙ　−（１０ｍＭ　Ｔｒｉｃｉｎｅ　ｐＨ８，０）中３μＭリガーゼの存在 下ペプチド（３５０μＭ〜７ｍＭ）と２５℃で反応させた。ライゲーション反応 の進行は部分標本（１５μｌ）を等容量の１００ｍＭＮＥＭと混合し１分から１ 時間の時間間隔でモニターした。それからこのサンプルを５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅゲ ルで分析した（レムリ（Ｌａｅｍａ＋ｌｉ）　（１９７０）　Ｎａｔｕｒｅ、　 ２２７．６８０−６８５）。第１４図は期待される分子量の産物の出現で示され るようにほとんどの基質は１時間後にライゲーションしていることを示している 。

実施例５　リガーゼ基質特異性の確認 リガーゼ基質特異性がペプチドの加水分解に関するズブチリシンの基質特異性と 同じであることを示すため、いくつかのライゲーションを試した。使用した基質 および得られた結果でライゲーションはズブチリシン加水分解基質の配列と同じ アミノ酸配列を有するライゲーション基質に制限されることが確認された。

ＰＩ’　またはＰ２°部位のいずれかにプロリンが存在することがズブチリシン ヒドロラーゼ活性を阻害することが示された。カーター（Ｃａｒｔｅｒ）等、（ １９８９）たんばく質；構造、機能および遺伝学、ｂ巻、２４０−２４８　（１ ９８９）。

ｈＧＨはＰ２″部位にプロリンを有しているがｄｅｓ−１ｈＧＨはＰＩ’部位に プロリンを有している。したがって、実施例４の実験条件下、ｈＧＨまたはｄｅ ｓ　−１ｈＧＨのいずれかによるプロトロピンの置換はライゲーションを起こさ ない（データ示さず）。

この結果はインシュリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）を用いて確認した。

ＴＣＦ−１のＮ−末端配列はＧＰＥＴＬＣである。部位Ｐ２’　におけるこのプ ロリンはｈＧＨと同様ライゲーションを阻害することが期待された。実施例４の 実験条件下、プロトロピンとＩＧＦ−１の置換はライゲーションを起こさなかっ た（データ示さず）。

これらの結果はライゲーションされるペプチドのＮ末端配列が重要であり、それ らは野生型ズブチリシンによる加水分解反応における配列と同じであることを示 している。

実施例６　Ｎ−末端による特異性の限定基質のＮ末端の構造配置の重要性のため 、次のレベルの基質特異性か得られる。

アミノ酸配列に加えて、可能性のある基質の対の１つのＮ末端構造か重要である 。

ズブチリシンは切断部位においてアミノ酸か伸長した構造配置を取ることが好ま しいことが示された。好ましいアミノ酸配列を有するいくつかのアクセプターた んばく質はライゲーションできないか、またはわずかじかライゲーションしない か、またはライゲージ３ンが起きるのに特殊な処理が必要であった。このことは これらの基質はそのＮ末端に必要とされる伸長構造を育していないことを示して いる。

構造配置およびＮ末端柔軟性の潜在的重要性はＩＧＦ−１を用いて示された。

２つの修正型ＩＧＦ−１を使用した。脳由来のＩＧＦ−１は除去されたアミノ末 端由来の３残基を有している。この型のたんばく質ｄｅｓ　−３ＩＧＦ−１はＰ ２’部位にもはやプロリンを有していない。実施例４の条件下、これらの非還元 条件ではいずれのペプチドもｄｅｓ　−３１ＣＦ　−１へのライゲーションは起 こさなかった。しかし、１時間還元剤（１０ｍＭ　ＤＴＴ）で基質を前処理する ことにより、ライゲーションが観測された（５％）。別のペプチド、長いＡｒｇ 　−３１０Ｆ−１はＩＣＦ−１のＧｌｕ３→Ａｒｇ変異体に結合するブタ成長ホ ルモン（ＭＦＰＡＭＰＬＳＳＬＦＶＮ）の最初の１３個のアミノ酸残基を有して いる。このたんばく質のプロトロピンに対する高いＮ末端配列ホモロジーはそれ を基質として使用し得ることを示している。１時間の１０ｍＭＤＴＴによる前処 理を含めた実施例４の条件下、い（らかのライゲーションがＩ［１１１された（ ５％）。０．１％ＳＤＳおよびｌＯ％ＤＭＳＯを添加し、かつ５０℃で反応を行 うことにより、生成物の量は２〜３倍増加した（データ示さず）。

実施例４の条件下プロトロピンの代りにｈＧＨレセプターを用いることによって は４倍濃度のりガーゼを用いた５時間後でさえ、ライゲーションは起こらなかっ た（データ示さず）。ｈＧＨレセプターはＮ末端配列ＦＳＧＳＥＡＴを有してお り、したがってこの配列は許容され得るズブチリシン基質−次配列を満足してい るが、ライゲーションか起きないのはＮ末端の接近可能性の欠除または高い構造 を持つＮ末端のいずれかに寄因する。

同様の結果はりプロリンでも得られた。リプロリンは２つの鎖ＡおよびＢからな る。Ａ鎖はＮ末端にピログルタミン酸を有し、それゆえα−アミンは核剤として 作用し得ない。一方、Ｂ鎖は配列ＤＳＷＭを存しており、高塩濃度で適当な基質 となり得る。しかし、バッファ溶液中２Ｍ　ＮａＣｊ７を含めるように実施例４ の実験条件を修正すると、１時間後ライゲーションは起こらない（データ示さず ）。

これらの結果は反応条件の思慮ある選択によれば（温度、界面活性剤、ｐＨおよ び非水性有機物など）リガーゼ活性を維持しつつ、基質たんばく質のＮ末端セグ メントの構造を選択的に修正でき、その結果非常に特異性のあるライゲーション を起こすことができることを示すものである。

本発明の好ましい態様を述べてきたが当業者にとって多くの修正が可能でありか つこれらの修正が本発明の範囲にあることは明白であろう。

全ての引用文献は参考として本明細書に含める。

ロ＝ω　ロ＝ω　ロ工ロ　Ｎ ■ ばっ バチルス・プロテアーゼのホモクジ− １，バチルス・アミロリクイファシェンス　ＦＩＧ、−６Ａ２、バチルス・サブ リリナリ１６８ ３、バチルス・リチェニホルミス（カーシス　バージンシス）ＡＧＳＶＰＹＳＶ ＳＱＩＫＡＰＡＬＮＳＱＧＡＧＳＶＰＹＳＩＳＱＩＫＡＰＡＬＮＳＱＧＡＧＴＶ ＰＹＳＩＰＬＩＫＡＤＫＶＱＡＱＧＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＩ）ＳＳＮ ＰＹＴＧＳＮＶＫＶＡＶＩＤＳＧＩＤＳＳＮＰｒＫＧＡＮＶＫＶＡＶＬＤＴＧＩ ＤＡＳＮＰＤＬＮＶＡＧＧＡＳＲＶＰＳＥＴＮＰＦＱＤＤＬＮＶＲＧＧＡＳＦＶ ＰＳＥＴＮＰＹＱＤＤＬＮＶＶＧＧＡＳＦＶＡＧＥＡＹＮＴＱＤ６１　７０　８ Ｏ ＮＮＳＮＧＴＮＶＡ（ＩＴＶＡＡＬＮＮｓ　Ｉ　ＧＧＳＳＮＧＴＮＶＡＧＴＩＡ ＡＬＮＮＳＩＧＧＮＧＮＧＴＮＶＡＧＴＶＡＡＬＩＩＮＴＴＧＶＬＧＶＡＰＳＡ ＳＬＹＡＶ［ＶＬＧＡＤＧＶＬＧＶＳＰＳＡＳＬＹＡＶＥＶＬＤＳＴＧＶＬＧＶ ＡＰＳＶＳＬＹＡＶＥＶＬＮＳＳＧｌ　０ｆ　１１０　１２０ ＳＧＱＹＳＮＩＩＮＧＩＥＮ　＾　１　＾　ＮＮＲ１ｌ５ＧＱＹＳＮＩ　ＩＮＧ ＩＥＮＡＩＳＮＮＲＤＳＧＳＹＳＧＩＶＳＧＩＥＮＡＴＴＮＧＲＤＶＩＮＲ５Ｌ ＧＧＰＳＧＳＡＡＬＫＡＡＶＤＶＩＮＲＳＬＧＧＰＴＧＳＴＡＬＫ　τ　ＶＶＤ Ｖ　Ｉ　ＮＲＳＬにＧＡＳＧＳ　τ　ＡＲＫＱＡＶＤ＋４１　１５０　１６０ ＫＡＶＡＳＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＥＧＴＳＧＫＡＶＳＳＧＩＶＶＡＡＡＡＧＮＥ ＧＳＳＧＮＡＹＡＲＧＶＶＶＶＡＡＡＧＮＳＧＮＳＧＳＳＳＴＶＧＹＰＧＫＹＰ ＳＶＩＡＶＧＡＶＳＴＳＴＶＧＹＰＡＫＹＰＳＴＩＡＶＧＡＶＳＴＮＴＩＧＹＰ 　＾　に　ＹＤＳＶＩＡＶＧＡＶ１８１　１９０　２０ｇ ＤＳＳＮＱＲＡＳＦＳＳＶＧＰＥＬＩ）ＶＲＡＮ　Ｓ　Ｓ　Ｎ　Ｑ　ＲＡ　Ｓ　 Ｆ　Ｓ　、Ｓ　Ａ　Ｇ　Ｓ　Ｅ　Ｌ　Ｄ　Ｖ　ＲＡＤＳＮＳＮＲＡＳＦＳＳＶＧ ＡＥＬＥＶＲＡＰＧＶＳ　Ｉ　ＱＳＴＬＰＧＮＫＹＧＡＹＮＧＴＰＧＶＳＩＱＳ ＴＬＰＧＧＴＹＧＡＹＮＧＴＰＧＡＳＶＹＳＴＹＰＴＮＴＹＡＴＬＮＧＴＳＲＡ ＳＰＮＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＮＰＮＳＲＡＴＰＮＶＡ　Ｇ　ＡＡＡＬＩＬＳＫ ＮＰＴＳＲＡＳＰＮＶＡＧＡＡＡＬＩＬＳＫＮＰＮＭＴＮＴＱＶＲ３ＳＬＥＮＴ ＴＴＫＬＧＤＳＭＴＮＡＱＶＲＩ）ＲＬＥＳＴＡＴＹＬＧＮＳＬＳＡＧＱＶＲＫ ＲＬＳＳＴＡＴＴＬＧＳＳｒＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ Ｆ’ＹＹＧＫＧＬＩＮＶＱＡＡＡＱ ＦＹＹＧＫＧＬＩＮＶＥＡＡＡＱ ＦＩＧ、−６Ｂ ＦＩＧ、−９ ＾ＡＰＫ レイヌル ＾ＡＰＡ レイヌル ＾ＡＰＦ レイヌル へ八ＰＥ レイヌル 間際調査報告 □Ａ、、、ｌ−，ＰＣＴ／ＬＩＳ９１１０５４８０Ｔ７ｖａｎｒｊｎｎＴ：Ｃ１ Ａ（ｍＲ１−２８ｐｒｏ電：＊ａ＊ｅ刺−ｕｔａｎｔｅｎｚｙ■ｅ＆ｍｅｒ、ｈ ｏｄｏｆｕｓｅ。

丁ｒ＋ｖｅｒ＋ｔｉｏｎｒ「：ｌ二１ａ＋ｍＰ＋２９−３４ｓｕｂｓｔｒａｔａ ｐｒｏｔｅｉｎｏｆＧｒｏｕｐＣ。

ＴｑｖａｎｒイｎｎＴ７丁：　Ｃ］ａｊｍ　３５　ｃｏ＋ｍｐｏｓｉｔｊｏｎ　 ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｈ！、ｕｈＰｔｒａＦｔ＝。

丁ｎｖ＝ｒｌｔ、（ｏｎ　ＪＶ：　（］ａｉｍ　３６　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　 ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　工。

ｒｎｖｐｎｔ−ｔｃ＋ｎ　Ｘ’：　Ｃ１ａｉｎ＋ｓ　３７−３９　ＤＮＡ、　ｈ ｏｓｔ、　ｖｅｃｔｏｒ　＠ｎｃｏｄｉｎｇ　ｐｒｏｄｕｃ剥H。

ＴｎＶ＊ｎｒ、’１ｏｎＲＴ　＆　丁工　ａｒｐ　ｃｏ＋＊ｐｌｅｔ＊１ｙ　ｕ ｎｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｃｘｌｕｃｔｓ。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ｃｔ、　Ｓ　識別記号　庁内整理番号／／ＣＣ１２Ｎ　９ １５４ Ｃ１２Ｒ１：１２５） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１２５） （Ｃ１２Ｎ　１５１５７ Ｃ１２Ｒ１：０７） （７２）発明者　ウエルス　ジエイムズ　エイアメリカ合衆国　カリフォルニア 州 ９４０１０　バーリンガム　コロンバス　アベニュー　１３４１ Ｉ

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．天然には存在しない配列を有し、かつ前駆体セリンプロテアーゼ中の少なく とも２個のアミノ酸残基を変化させることにより該前駆体から誘導されるセリン プロテアーゼであり、該第１の変化が該前駆体プロテアーゼ中の活性部位のセリ ン残基の置換または修飾を含み該セリン部位の側鎖の求核性酸素を他の求核基で 置換するものであり、かつ該第２の変化が該前駆体セリンプロテアーゼ中の第２ のアミノ酸残基の側鎖の置換または修飾を含むものであり、該求核性酸素の置換 または修飾のみを含む前駆体セリンプロテアーゼ変異体よりも高い水溶液中での べプチドリガーゼ活性を有することを特徴とする該セリンプロテアーゼ。
2. ２．前記前駆体セリンプロテアーゼがアルファーヘリックスの末端またはその付 近に前記活性部位を含み、かつ前記第２アミノ酸残基が該アルファーヘリックス 中に含まれる請求の範囲１記載のセリンプロテアーゼ変異体。
3. ３．前記前駆体セリンプロテアーゼがズブチリシンである請求の範囲１記載のセ リンプロテアーゼ変異体。
4. ４．前記活性部位のセリンがバチルスアミロリクエファシエンスのズブチリシン のアミノ酸配列のセリン２２１を含み前記第２のアミノ酸残基がプロリン２２５ および他の前駆体ズブチリシン中の等価はアミノ酸残基を含む請求の範囲３記載 のズブチリシン変異体。
5. ５．前記セリン２２１がシステインで置換した請求の範囲４記載のズブチリシン 変異体。
6. ６．前記プロリン２２５が別のアミノ酸残基で置換した請求の範囲５記載のズブ チリシン変異体。
7. ７．前記部位２２５の別のアミノ酸がＬｙｓ，ＡｒｇまたはＧｌｕである請求の 範囲６記載のズブチリシン変異体。
8. ８．前記部位２２５の別のアミノ酸がプロリンの側鎖容積よりも小さい側鎖容積 を有する請求の範囲６記載のズブチリシン変異体。
9. ９．前記部位２２５の別のアミノ酸がヘリックス形成アミノ酸である請求の範囲 ６記載のズブチリシン変異体。
10. １０．前記部位２２５の別のアミノ酸がアラニンである請求の範囲６記載のズブ チリシン変異体。
11. １１．請求の範囲６記載のズブチリシン変異体で、さらに前記アミノ酸配列中の 少なくとも１個の別のアミノ酸残基の置換を含む変異体。
12. １２．前記少なくとも１個のアミノ酸残基の置換が基質特異性、酸化安定性、熱 安定性およびｐＨ活性特性からなる群から選ばれる性質を変える請求の範囲１１ 記載のズブチリシン変異体。
13. １３．前記性質が基質特異性である請求の範囲１２記載のズブチリシン変異体。
14. １４．前記少なくとも１個の別のアミノ酸残基がバチルスアミロリクエフアシエ ンスのズブチリシンのアミノ酸配列のグルタミン酸１５６またはグリシン１６６ および他の前駆体ズブチリシン中の等価はアミノ酸残基を含む請求の範囲１３記 載のズブチリシン変異体。
15. １５．前記グルタミン酸１５６がグルタミンと置換し、かつ前記グリシン１６６ がリジンと置換した請求の範囲１４記載のズブチリシン変異体。
16. １６．前記グリシン１５６がグルタミン酸と置換した請求の範囲１４記載のズブ チリシン変異体。
17. １７．前記グルタミン酸１６６がイソロイシンと置換した請求の範囲１４記載の ズブチリシン変異体。
18. １８．請求の範囲１のセリンプロテアーゼ変異体を第１および第２のライゲーシ ョン基質と接触させるステップを含むライゲーション法であって、該第１ライゲ ーション基質が アリール基が置換を受けていないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロ ゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、ハロゲン化Ｃ１−Ｃ６ア ルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アミノ基、フェニルオキシ基、フェニル基 、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１− Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６−Ｃ１２アロイル基、Ｃ１−Ｃ６アルカノイル基お よびヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル基で置換しているＣ６−Ｃ１２アリル基、 非置換またはハロゲン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ．Ｉ）置換の分枝、直鎖または環状のＣ １−Ｃ１２アルキル基、 Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、 アリール基が置換していないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロゲン （Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基、 アミノ基、フェニルオキシ基、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジ−Ｃ１−Ｃ ６アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６−Ｃ１２アロイル基お よびＣ１−Ｃ６アルカノイル基で置換しているＣ６−Ｃ１２アリルオキシ基、イ ソチオウレイド基、 Ｃ３−Ｃ７シクロアルキル基、 ウレイド基、 アミノ基、 Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、 ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、 水酸基、 アミノ−Ｃ２−Ｃ６アルキルチオ基、 アミノ−Ｃ２−Ｃ６アルコキシ基、 アセトアミド基、 フェニル環が置換されていないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロゲ ン（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、 アミノ基、フェニルオキシ基、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジ−Ｃ１−Ｃ ６アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ６−Ｃ１２アロイル基お よびＣ１−Ｃ６アルカノイル基で置換したベンズアミド基、アリール基が置換さ れていないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アル キル基Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基アミノ基、フェニルオキシ基、アセトアミド基 、ベンズアミド基、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミ ノ基Ｃ４−Ｃ１２アロイル基およびＣ１−Ｃ６アルカロイル基で置換したＣ４− Ｃ１２アリールアミノ基、グアニジノ基、 フタルイミド基、 メルカプト基、 Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ基、 Ｃ６−Ｃ１２アリールチオ基、 カルボキシ基、 カルボキシアミド基、 カルボーＣ１−Ｃ６アルコキシ基、 アリール基が置換されていないか、または１個以上のニトロ基、水酸基、ハロゲ ン、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ基、アミノ基、フェニロキシ 基、アセトアミド基、ベンズアミド基、ジ−Ｃ１−Ｃ６アルキルアミノ基、Ｃ１ −Ｃ６アルキルアミノ基、ヒドロキシ−Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ６−Ｃ１２ア ロイル基およびＣ１−Ｃ６アルカノイル基で置換しているＣ４−Ｃアリール基、 および ヘテロ環が５〜１０個の環原子を含み、かつ２個までのＯ，ＮまたはＳヘテロ原 子および２−ヒドロキシカルボン酸を有する芳香族ヘテロ環、からなる群から有 機部分が選択される有機アルコールまたはチオールでカルボキシ末端がエステル 化された少なくとも１個のＲ１残基を含み、かつ該第２のライゲーション基質が 少なくとも１個のＲ１′残基を含み、該ライゲーション反応によって形成される ライゲーション産物が配列Ｒ１−Ｒ１′を含む方法。
19. １９．前記Ｒ１残基のカルボキシ末端が２−ヒドロキシカルボン酸でエステル化 されている請求の範囲１８記載の方法。
20. ２０．前記２−ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸または乳酸である請求の範 囲１９記載の方法。
21. ２１．前記２−ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸である請求の範囲１９記載 の方法。
22. ２２．前記２−ヒドロキシカルボン酸がアミド化されている請求の範囲１９記載 の方法。
23. ２３．前記２−ヒドロキシカルボン酸がアミノ酸または第３のペプチドのアミノ 末端でアミド化されている請求の範囲２２記載の方法。
24. ２４．前記第１および第２ライゲーション基質の各ＲおよびＲ′残基が１乃至２ ５残基の長さを有しており、かつ前記ライゲーション産物が約５０残基を有する 請求の範囲１８記載の方法。
25. ２５．前記接触に請求の範囲４記載のズブチリシン変異体を用い、かつ前記第１ ライゲーションペプチドのＲ１アミノ酸残基がフェニルアラニン、チロシン、ト リプトファン、ロイシンおよびメチオニンからなる群から選ばれる大きな疎水性 アミノ酸である請求の範囲１８記載の方法。
26. ２６．前記接触に請求の範囲４記載のズブチリシン変異体を用い、かつ前記Ｒ１ ′残基がイソロイシンおよびプロリンを含まないアミノ酸残基からなる群から選 ばれる請求の範囲１８記載の方法。
27. ２７．前記第２ライゲーション基質が少なくともＲ１′およびＲ２′残基を含み 、かつ該Ｒ２′残基がフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシン 、メチオニン、アルギニンおよびリジンからなる群から選ばれる請求の範囲１８ 記載の方法。
28. ２８．前記セリンプロテアーゼ変異体のライゲーション活性を実質的に破壊する ことなく前記第１ライゲーション基質のＣ末端および前記第２ライゲーション基 質のＮ末端がライゲーションを起こすのに正しいコンフォーメーションとなる条 件で前記接触が行なわれる請求の範囲１８記載の方法。
29. ２９．カルボキシ末端が２−ヒドロキシカルボン酸でエステル化されているＲ１ 残基を少なくとも１個含む第１ライゲーション基質。
30. ３０．前記２−ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸または乳酸である請求の範 囲２９記載の第１ライゲーション基質。
31. ３１．前記２−ヒドロキシカルボン酸がグリコール酸である請求の範囲３０記載 の第１ライゲーション基質。
32. ３２．前記２−ヒドロキシカルボン酸がアミド化している請求の範囲２９記載の 第１ライゲーション基質。
33. ３３．前記２−ヒドロキシカルボン酸がアミノ酸または第３のペプチドのアミノ 末端でアミド化されている請求の範囲３２記載の第１ライゲーション基質。
34. ３４．請求の範囲２９記載の第１ライゲーション基質であって、さらにフェニル アラニン、チロシン、トリプトファン、ロイシンおよびメチオニンからなる群か ら選ばれるＲ２残基を含む基質。
35. ３５．請求の範囲１記載のセリンプロテアーゼ変異体および請求の範囲２９記載 の第１ライゲーション基質を含む組成物。
36. ３６．請求の範囲１８記載の方法に従って生成したライゲーション産物。
37. ３７．請求の範囲１記載のセリンプロテアーゼ変異体をコードするＤＮＡ。
38. ３８．請求の範囲３７記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
39. ３９．請求の範囲３８記載の発現ベクターでトランスホームした宿主細胞。