JPH0646860A - ひとｓｏｄをコードする新規ｄｎａおよびそれを有する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構 成】ひとスーパーオキシドジスムターゼをコード
する特定の塩基配列を含む新規ＤＮＡおよびその新規Ｄ
ＮＡで形質転換した微生物 【効 果】ひとＳＯＤ様ポリペプチドを微生物に生産さ
せるためのＤＮＡ、及びそのＤＮＡを含む微生物が得ら
れた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は活性酸素依存性炎症（関
節リウマチなど）の治療に有用なひとスーパーオキシド
ジスムターゼ（Ｓuperoxide Ｄismutase以下ＳＯＤとい
う。）のポリペプチドをコードする塩基配列を含む新規
ＤＮＡ及びそのＤＮＡで形質転換した微生物に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】ＳＯＤは１９３９年、Ｍann とＫeilin
によって始めて発見された活性酸素変異作用をもつ分子
量約１６，０００のポリペプチド２分子が会合した金属
酵素である。そして、ＳＯＤは生体内で酸素分子から発
生したスーパーオキシドイオンによる組織障害から起こ
ると考えられている炎症、たとえば、変形性関節症、お
よび慢性関節リウマチ、または放射線照射による障害に
対する有効な治療剤として注目されている。そしてＪab
uschら〔Ｂiochem, １９，２３１０−２３１６（１９８
０）〕は赤血球より単離・精製したＳＯＤのアミノ酸配
列を決定した。また、Ｓhermanら〔Ｐroc. Ｎatl. Ａ
cad. Ｓci., ８０，５４６５−５４６９（１９８
３）〕はＳＶ８０細胞（ひと線維芽細胞にＳimian Ｖir
us ８０を形質転換した細胞）由来のｍＲＮＡを用いて
ＳＯＤ ＤＮＡをクローニングし、そのＤＮＡ塩基配列
を決定した。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ひと由来のＳＯＤは大
量に入手することが困難であるため、動物試験や臨床な
どでの薬理効果の試験が進んでおらず、現在ひと由来の
ＳＯＤを容易に大量生産できる技術開発が望まれてい
る。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはひと由来の
ＳＯＤを遺伝子操作技術を利用して大量生産する技術開
発を目的とし、種々研究の結果、ひと胎盤由来のＳＯＤ
をコードするｍＲＮＡを分離し、これを用いてひと胎盤
ＳＯＤをコードするｃＤＮＡを合成し、これを組込んだ
組換え体を微生物に形質転換して、遺伝子を発現させる
ことによりひと胎盤ＳＯＤ様ポリペプチドを製造するこ
とができることを見い出し本発明を完成した。本発明の
ＤＮＡはひとＳＯＤをコードする下記式（Ｉ）

【０００５】

【化３】 (5') GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG 1 5 10 CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG 15 20 25 30 GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT 35 40 45 GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC AGT GCA GGT CCT 50 55 60 CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA AAG GAT GAA GAG 65 70 75 AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC AAA GAT GGT GTG 80 85 90 GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC TCA GGA GAC CAT 95 100 105 110 TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA GCA GAT GAC TTG 115 120 125 GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA AAC GCT GGA AGT 130 135 140 CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA (3')・・・（Ｉ） 145 150

【０００６】で表わされている塩基配列を含有するＤＮ
Ａである。本発明における式（Ｉ）の塩基配列は公知の
Ｊabuschらにより報告されたＳＯＤのアミノ酸配列と、
６箇所においてコードするアミノ酸が相違している。ま
たＳhermanらにより報告されたＳＯＤとは５４番目にお
けるコドンにおいて相違するものである。本発明のＤＮ
Ａは上記式（Ｉ）の塩基配列を含む限り、単鎖ＤＮＡ、
二本鎖ＤＮＡもしくはプラスミドいずれの形体であって
もよい。

【０００７】なお本明細書及び図面で使用する主な略称
は次の通りである。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｔ チミン Ｇ グアニン Ｃ シトシン ＲＮＡ リボ核酸 ｄＧ デオキシグアニン ｄＴ デオキシチミジン ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸 ｄＧＴＰ デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 Ｇｌｙ グリシン Ａｌａ アラニン Ｖａｌ バリン Ｌｅｕ ロイシン Ｉｌｅ イソロイシン Ｓｅｒ セリン Ｔｈｒ スレオニン Ｃｙｓ システイン Ｇｌｕ グルタミン酸 Ａｓｐ アスパラギン酸 Ｌｙｓ リジン Ａｒｇ アルギニン Ｈｉｓ ヒスチジン Ｐｈｅ フェニールアラニン Ｔｒｐ トリプトファン Ｐｒｏ プロリン Ａｓｎ アスパラギン Ｇｌｎ グルタミン ＴＴＰ チミジン三リン酸 Ｔｒｉｓ トリス塩酸

【０００８】本発明の新規ＤＮＡは、微生物や動物細胞
などの宿主を形質転換し、ＳＯＤ活性ポリペプチドを産
生するために使用される。本発明の新規ＤＮＡにおい
て、式（Ｉ）の（５´）末端に下記式（II）

【０００９】

【化４】 (5') AGGACCACGG CGTGGCCTAG CGAGTTATG (3')・・・（II）

【００１０】の塩基配列を含むときは動物細胞などで本
発明の遺伝子を発現させるのに好ましい。本発明のＤＮ
Ａは次のようにして製造することができる。

【００１１】（イ） ひと胎盤からのｍＲＮＡの分離 （ロ） そのｍＲＮＡを用いて、例えば岡山−Ｂerg の
方法〔Ｍol. Ｃell. Ｂiol. ２ １６１−１７０（１
９８２）などにより、相補ＤＮＡを組み込んだプラスミ
ドを得、 （ハ） このプラスミドにより、大腸菌を形質転換し、 （ニ） この大腸菌を培養して得られる菌体から目的と
する式（Ｉ）の塩基配列を含むプラスミド（ＤＮＡ）を
単離する。 （ホ） 次に所望により、このプラスミドより目的とす
る式（Ｉ）の塩基配列を含むＤＮＡを切り出すことがで
きる。 （ヘ） この切り出されたＤＮＡをベクターのプロモー
ターの下流に連結させることにより、式（Ｉ）の塩基配
列を含むベクタープラスミドとすることができる。 上記方法において、ｍＲＮＡからの相補ＤＮＡの合成は
岡山−Ｂerg の方法の代りに、常法に従って、まず逆転
写酵素を用いて単鎖の相補ＤＮＡとし、次いで二本鎖Ｄ
ＮＡに変換したのち、ベクタープラスミドに組み込むこ
ともできる。

【００１２】本発明のＤＮＡを用いてＳＯＤ様蛋白を製
造するには、上記の式（Ｉ）の塩基配列を含むベクター
プラスミドで、例えば大腸菌を形質転換し、培養し、培
養菌体より蛋白質を単離することにより得ることができ
る。大腸菌でＳＯＤ様蛋白を製造する場合のプロモータ
ーとしてはＴacプロモーター又はＰ_L プロモーターなど
が好適に使用されうる。以下実施例により本発明のＤＮ
Ａの製法及びその発現につき説明する。

【００１３】実施例 （１） ひと胎盤からのｍＲＮＡの分離とＳＯＤ ｍＲ
ＮＡの同定：新生児誕生より１時間以内の新鮮な胎盤約
３００ｇをリン酸生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で洗い、グ
アニジン・チオシアネート法〔Ｃhirgwins：Ｂicohem,
１８，５２９４−５２９９（１９７９）〕によって細胞
質の全ＲＮＡを抽出した。この抽出した全ＲＮＡを高塩
濃度の緩衝液（Ｔris, ０．５Ｍ ＮａＣｌを含む，ｐ
Ｈ７．４）に溶かし、これをオリゴ（ｄＴ）セルロース
（ファルマシア社製）カラムに通し、ポリＡ ＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）を吸着させた後、低塩濃度の緩衝液（Ｔri
s, ＮａＣｌを含まず，ｐＨ７．４）で溶出してエタノ
ール沈殿させた。全ＲＮＡ１５０mgより１．７mgのｍＲ
ＮＡを得た。沈殿を２００μｌの滅菌水に溶かし、８０
℃２分間加温後急冷して、５〜２０％ショ糖密度勾配遠
心法により分子量の大きさの順に分離した。実際には日
立ＲＰＳ４０Ｔローターを用い、３５Ｋｒｐｍ、１７時
間０℃で遠心した。次いで分離した各画分（０．５ml)
の一部を、ウサギ網状赤血球ライセート（アマシャム社
製）の系で翻訳させ、合成された蛋白質を免疫学的方法
（エンザイム・イムノアッセイ法）（Ｊ．Ｐharm. Ｄy
n.,５ ３９４−４０２（１９８２））で調べた。この
ようにして、ｍＲＮＡの１０〜１２Ｓ画分にＳＯＤ ｍ
ＲＮＡの存在が認められた。

【００１４】（２） ｍＲＮＡのアニーリングとｃＤＮ
Ａの合成：（１）で得られた分画を用い、岡山−Ｂerg
の方法〔Ｍol．Ｃell. Ｂiol., ２，１６１−１７０
（１９８２）〕に従って以下のように合成した。あらか
じめ５０ｍＭ Ｔris （ｐＨ８．３）、３０ｍＭＫＣ，
０．３ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、８ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂ 、４０μｇ／mlアクチノマイシンＤ、各２ｍＭの
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、３０μＣｉ
〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ（６００Ｃｉ／mmol）（ＮＥＮ社
製）、２８０単位のリボヌクレアーゼインヒビター（和
光純薬社製）、および２．８μｇのプラスミドプライマ
ー〔大腸菌プラスミドｐＳＶ７１８６（ファルマシア社
製）を用い、岡山−Ｂerg 法に準じて合成したＴ−テー
リング約６０塩基のプライマー〕を含む溶液１０μｌを
調整し、３７℃に保つ。次に１０ｍＭＴris(ｐＨ８）、
１ｍＭＥＤＴＡと３μｇのｍＲＮＡを含む溶液１０μｌ
を調整し、６５℃で５分間加温後直ちに３７℃に移した
後、上記溶液１０μｌと混合して、さらに５分間加温し
た。つづいて５単位の逆転写酵素（ライフサイエンス社
製）を加え、３７℃で２０分間加温した。２μｌの２５
０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）と１μｌの１０％ＳＤ
Ｓ溶液を加えて反応を停止させた後、フェノール・クロ
ロホルム抽出、エタノール沈殿をそれぞれ２回経て次の
段階へ進んだ。

【００１５】（３） 本発明の式（Ｉ）の塩基配列を含
有するプラスミドの合成：（２）で得られた沈殿物を１
４０ｍＭカコジル酸ナトリウム−３０ｍＭ Ｔris(ｐＨ
６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ₂ 、０．１ｍＭ ＤＴＴ、
１ｍＭ ｄＣＴＰおよび５０μＣｉ〔α−³²Ｐ〕ｄＣＴ
Ｐを含む溶液に溶かし、３７℃で２〜３分間加温後、１
８単位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼ（ファルマシア社製）を加え、全体を１５μｌ
とした。３７℃で３分間加温した後、逆転写反応と同様
な後処理を行なってエタノール沈殿物を得た。

【００１６】次に該沈殿物を５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０
ｍＭ Ｔris(ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１
００μｇウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および１２単
位のＨind III （ニッポンジーン社製）を含む溶液に溶
かして３７℃、２〜４時間加温した。フェノール・クロ
ロホルム抽出、エタノール沈殿後、これを１０μｌの１
０ｍＭ Ｔris(ｐＨ７．３）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む
溶液に溶かし、さらに３μｌのエタノールを加えて全体
を１３μｌとした。この溶液１μｌに０．０４pmolのオ
リゴ（ｄＧ）リンカー〔大腸菌プラスミドｐＳＶ １９
３２（ファルマシア社製）を用い、岡山−Ｂerg 法に準
じて合成したｄＧ−テーリング約１２塩基のリンカ
ー〕、１０ｍＭ Ｔris(ｐＨ７．５）、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡの１０倍濃縮液１μｌと蒸留水８
μｌを加えて全体を１０μｌとし、核溶液を６５℃５分
間、４２℃３０分間と経時加温後０℃に保った。これに
２０ｍＭ Ｔris(ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、
１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μ
ｇ／ml ＢＳＡ、０．１ｍＭ β−ニコチンアミドアデ
ノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および０．６μｇの大
腸菌ＤＮＡリガーゼ（ファルマシア社）を含む濃縮液を
加えて最終的に該濃縮溶液１００μｌとし、１２℃で一
夜加温した。次いで、核２０ｍＭを含んだｄＡＴＰ、ｄ
ＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰを０．４μｌ、１．５ｍ
Ｍ β−ＮＡＤを１μｌ、大腸菌ＤＮＡリガーゼを０．
４μｇ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを０．３μｇ、そ
して大腸菌リボヌクレアーゼＨを１単位それぞれ添加し
て（全体として１０４μｌ）、さらに１２℃で１時間、
２５℃で１時間加温した。 （４） 大腸菌への形質転換：大腸菌としてχ１７７６
（ＡＴＣＣ３１２４４）を使用した。コンピテントセル
はManiatisら〔Molecular Cloning 、 cold spring harb
or harbor laboratory 、 254-255(1982) 〕と全く同様
の方法で調製し、０．２ｍｌづつ分注した。該ＤＮＡ溶
液を２μｌづつ５本形質転換し、バクトトリプトン１０
ｇ／ｌ、イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、ジアミノピ
メリン酸０．０１％チミジン０．００４％およびアンピ
シリン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌを含む１．５％寒天培地
上にコロニー約３万個を得た。 （５）コロニーハイブリダイゼーション：得られたコロ
ニーのうち約１万個を同組成の寒天培地上に移し換え
（５１２個／１４×１０ｃｍプレート；２枚１組とし、
１枚をマスタープレートとして保存した。）、直径約３
ｍｍに成長するまで培養した。これにワットマン５４１
ロ紙をゆっくりとのせ、コロニーを完全にロ紙に移行さ
せてから、クロラムフエニコール２５０μｇ／mlを含む
同組成寒天培地上に該ロ紙を密着させ、一昼夜培養し
た。ロ紙へのＤＮＡ固定は次のように行なった。

【００１７】培養後のロ紙を０．５Ｍ ＮａＯＨで５分
間、２回処理し、０．５Ｍ Ｔris（ｐＨ７．４）で中
性にもどし、２×ＳＳＣ（ｐＨ７）（１×ＳＳＣ：０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
処理を経、９５％エタノール水溶液で軽く洗浄した後風
乾した。プローブとして（Ａ）１７ヌクレオチド：ＡＡ
（Ｔ or Ｃ）ＴＴ（Ｔ or Ｃ）ＧＡ（Ａ or Ｇ）ＣＡ
（Ａ or Ｇ）ＡＡ（Ａ or Ｇ）ＧＡの３２種類（Ｂ）１
４ヌクレオチド：ＧＡ（Ｔ or Ｃ）ＣＡ（Ｔ orＣ）Ｔ
Ｇ（Ｔ or Ｃ）ＡＴ（Ｔ，Ｃ or Ａ）ＡＴの２４種類を
それぞれトリエステル法で化学合成し、以下に述べるハ
イブリダイゼーションに使用した。

【００１８】（イ） プレハイブリダイゼーション ロ紙を６×ＳＥＴ（１×ＳＥＴ：０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．０１５Ｍ Ｔris(ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ）、０．５％ソニデットＰ４０（半井化学社製）お
よび１００μｇ／mlの変性大腸菌ＤＮＡ（ファルマシア
社製の大腸菌ＤＮＡを５分間煮沸後急冷したもの）を含
む溶液で５５℃、２時間加温した。 （ロ） ハイブリダイゼーション 次に変性大腸菌ＤＮＡの代りに１００μｇ／mlの酵母ｔ
ＲＮＡ（ＢＲＬ社製）と、〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰ（５００
０Ｃｉ／mmol ＮＥＮ社製）とポリヌクレオチドキナー
ゼ（ＮＥＢ社製）を用いて５´位を〔³²Ｐ〕標識したプ
ローブ０．２ｎｇ／mlとを用いて２９℃、２時間ハイブ
リダイゼーションを行なった。

【００１９】（ハ） 式（Ｉ）の塩基配列を含むプラス
ミドの単離 洗浄は各々（Ａ）３９℃で５分間（Ｂ）２９℃で２０分
間、続いて室温で１０分間の処理を６×ＳＳＣ溶液を用
いて各段階３回づつ繰返した。ロ紙を風乾後、Ｘ線フィ
ルム（コダックＸＡＲ５）を用いてオートラジオグラフ
ィーを行ない、（Ａ）、（Ｂ）両方にポジテイブなコロ
ニー１個選別し、その菌体よりプラスミドを取り出しそ
のプラスミドをｐＨＳ３２３７と命令した。

【００２０】（６） ひとＳＯＤをコードするｃＤＮＡ
の制限地図と塩基配列の確認：ひとＳＯＤをコードする
ＤＮＡはＰstＩおよびＰvuII（いずれもＮＥＢ社製）で
切り出すことができ、さらにＡvaII、ＴaqＩ、ＳtuＩ、
Ｈinf Ｉ、Ｓau３ＡＩおよびＡluＩ（いずれもニッポン
ジーン社製）を用いて制限地図を作成したところ、ｐＨ
Ｓ３２３７は図１に示す構造を有することが確認され
た。本プラスミド中に挿入された約７８０bpＤＮＡがＳ
ＯＤをコードしていることは、Ｍaxam−Ｇilbert法〔Ｐ
roc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci., ７４，５６０−５６４
（１９７７）〕およびＭ１３−ジデオキシ法〔Ｐroc.
Ｎatl. Ａcad.Ｓci., ７４，５４６３−５４６７（１
９７７）〕を用い、塩基配列を決定することで確認し
た。図２がその塩基配列を示したものであるが、ここに
示す開始コドンＡＴＧから下流は、５４番目のＴhrに対
応するコドンＡＣＡがＳhermanらの結果ＡＣＧと相違し
ているが、またＡＴＧより上流についてはＳhermanらは
何も報告していない。本発明者らはさらに上流１３０bp
（図２にはその一部のみ示す）まで得ており、ほぼ完全
長のｃＤＮＡを得ることができた。

【００２１】（７） 発現ベクターの構築 大腸菌プラスミドｐＵＣ１３（ファルマシア社製）上の
ラクトース・プロモーターに最近接したＨaeII部位を切
断後、エキソヌクレアーゼＢal３１（ＮＥＢ社製）で両
端を約１００bp削除し、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）で再閉環させたプラスミドｐΔＵＣ１３を調整した
（このプラスミドはラクトース・プロモーターとしての
機能を失っている）。次いでこのプラスミドのＨincII
切断部位にＴrpＡターミネーター（ファルマシア社製）
を挿入したプラスミドｐΔＵＣＴ１３にＴacプロモータ
ー又はＰ_L プロモーター（いずれもファルマシア社製）
を挿入し、さらにＳＯＤ ＤＮＡを連結して以下に述べ
るようなＳＯＤ発現ベクターを構築した。

【００２２】（Ａ） ＳＯＤをコードするＤＮＡの調整 前記（５）の（ハ）で得られたｐＨＳ３２３７をＰvuII
で消化し、ＸbaＩリンカー（ＮＥＢ社製）をＴ₄ ＤＮＡ
リガーゼで連結してＸbaＩ部位を設けこのプラスミドを
ｐＨＳＸ３２３７と命名した。ｐＨＳＸ３２３７をＰst
Ｉで消化し、エキソヌクレアーゼＢal３１で遂次消化し
た。さらにＴ₄ ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑にそろ
え、ＢamＨＩリンカー（宝酒造社製）を連結してＢamＨ
ＩとＸbaＩ（いずれもニッポン・ジーン社製）で消化後
約６３０〜７００bpのＤＮＡを２−１６％グラジエント
ポリアクリルアミドゲルで回収した。

【００２３】（Ｂ） ＴacプロモータおよびＳＯＤ Ｄ
ＮＡを挿入したプラスミドの調整 プラスミドｐＤＲ５４０（ファルマシア社製）をＥcoＲ
Ｉ（ニッポン・ジーン社製）とＢamＨＩで消化しＴacプ
ロモーターを含む１２１bpをポリアクリルアミドゲルで
回収し、ｐΔＵＣＴ１３のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ間に挿入
して得られた約３ＫｂのプラスミドをｐＴacＩと命名し
た（図３）。ｐＴacＩのＢamＨＩ−ＸbaＩ間に（７）
（Ａ）で得られた約６３０−７００bpのＤＮＡを挿入し
て得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８
４９）に形質転換した。得られた種々のプラスミドの塩
基配列を決定し、ＳＤ配列（ＡＧＧＡ）から開始コドン
ＡＴＧまでの距離が８〜１３ヌクレオチド長のプラスミ
ドをｐＴacＳＯＤ８〜１３と命名した（図３）。

【００２４】（Ｃ） Ｐ_L プロモータおよびＳＯＤ Ｄ
ＮＡを挿入したプラスミドの調整 ＳＤ配列を含むＰ_L プロモータを利用する場合 ＳＤ配列を含むＰ_L プロモータを有するプラスミドｐＰ
Ｌ−λ（ファルマシア社製）をＨpaＩとＳau９６Ｉ（い
ずれもニッポン・ジーン社製）で消化し、Ｐ_L プロモー
ター含有ＤＮＡフラグメント約４８０bpをポリアクリル
アミドゲルで回収した。該フラグメントをさらにＨinf
Ｉ（ニッポン・ジーン社製）で部分消化後、ＤＮＡポリ
メラーゼ・クレノウフラグメント（ＮＥＢ社製）、Ｅco
R Ｉ消化を経て、ＥcoＲＩより下流約３５０bp ＤＮＡ
をポリアクリルアミドゲルで回収した。別にｐＴac−Ｓ
ＯＤ８〜１３をＢamＨＩ処理後、ＤＮＡポリメラーゼ・
クレノウフラグメントやエキソヌクレアーゼＳＩ処理を
行なってＢamＨＩ部位を平滑にしたＤＮＡを調整し、先
の約３５０bpＤＮＡとリゲーションした。これをさらに
ＸbaＩとＥcoＲＩで消化して約１ＫｂのＤＮＡフラグメ
ントを回収した。得られた１ＫｂのＤＮＡフラグメント
中にはＰ_L プロモーター、ＡＴＧより始まるＳＯＤコー
ド配列が含まれており、これをＰΔＵＣＴ１３のＥcoＲ
ＩとＸbaＩの間に挿入した。これらプラスミドをｐＰＬ
２０８〜２１３と命名した（図４）。

【００２５】（８） ＳＯＤ様ポリペプチドの発現：ｐ
ＰＬ２０８−２０３を温度感受性リプレッサーを有する
大腸菌Ｎ４８３０（ファルマシア社）に形質転換して得
られた単一コロニーをＬ培地中で２８〜３０℃培養し、
Ａ６００＝０．１〜０．３となった時点で３７℃〜４２
℃に温度を上げ、さらに数時間培養することにより培養
物中ＳＯＤ様ポリペプチドを産生せしめる。この産生は
ＳＯＤ抗体と反応させるイムノブロッティング法により
確認した。又、ｐＴac ＳＯＤ８−１３は１acＩ^q をも
つ大腸菌に形質転換して得られた単一コロニーを適当な
培地中３７℃で培養し、Ａ６００＝０．１〜０．３とな
った時点でイソプロピルーβチオガラクトピラノシド
（シグマ社製）を最終濃度１ｍＭ程度となるよう加え、
３７℃でさらに数時間培養して、培養物中にＳＯＤ様ポ
リペプチドを産生せしめることができる。

【００２６】

【発明の効果】本発明によりひとＳＯＤ様ポリペプチド
を微生物に生産させるためのＤＮＡ及びそのＤＮＡを含
む微生物が得られた。

【配列表】

【００２７】配列番号：１ 配列の長さ：６９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起 源： 生物名：ヒト 株 名：胎盤 ライブラリー名：岡山・バーグ cDNA ライブラリー 配列の特徴： 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：６８．．５２６ 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：poly A site 存在位置：６２５．．６９９ 特徴を決定した方法：Ｅ 配 列 CTGCAGCGTC TGGGGTTTCC GTTGCAGTCC TCGGAACCAG GACCTCGGCG TGGCCTAGCG 60 AGTTATG GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG 109 Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val 1 5 10 CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG 157 Gln Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys 15 20 25 30 GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT 205 Val Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His 35 40 45 GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC AGT GCA GGT CCT 253 Val His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro 50 55 60 CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA AAG GAT GAA GAG 301 His Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu 65 70 75 AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC AAA GAT GGT GTG 349 Arg His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val 80 85 90 GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC TCA GGA GAC CAT 397 Ala Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His 95 100 105 110 TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA GCA GAT GAC TTG 445 Cys Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu 115 120 125 GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA AAC GCT GGA AGT 493 Gly Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser 130 135 140 CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA TAAACATTCC CTTGGATGTA 546 Arg Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln 145 150 GTCTGAGGCC CCTTAACTCA TCTGTTATCC TGCTAGCTGT AGAAATGTAT CCTGATAAAC 606 ATTAAACACT GTAATCTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 666 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 699

【００２８】配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起 源： 生物名：ヒト 株 名：胎盤 ライブラリー名：岡山・バーグ cDNA ライブラリー 配 列 AGGACCACGG CGTGGCCTAG CGAGTTATG 29

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はｐＨＳ３２３７の制限地図を示す。

【図２】図２はＳＯＤ ｃＤＮＡの塩基配列およびＳＯ
Ｄアミノ酸配列を示す。

【図３】図３はｐΔＵＣＴ１３，ｐＴacＩおよびｐＴａ
ｃＳＯＤ８〜１３の構成図である。

【図４】図４はｐΔＵＣＴ１３およびｐＰＬＳＯＤ２０
８〜２１３の構成図である。図中のマークの意味は次表
のとおりである。

【表１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ひとスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯ
   Ｄという）をコードする式 【化１】 (5') GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG 1 5 10 CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG 15 20 25 30 GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT 35 40 45 GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC AGT GCA GGT CCT 50 55 60 CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA AAG GAT GAA GAG 65 70 75 AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC AAA GAT GGT GTG 80 85 90 GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC TCA GGA GAC CAT 95 100 105 110 TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA GCA GAT GAC TTG 115 120 125 GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA AAC GCT GGA AGT 130 135 140 CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA (3') 145 150 で表わされる塩基配列を含む新規ＤＮＡ。
2. 【請求項２】ひとＳＯＤをコードする式 【化２】 (5') GCG ACG AAG GCC GTG TGC GTG CTG AAG GGC GAC GGC CCA GTG 1 5 10 CAG GGC ATC ATC AAT TTC GAG CAG AAG GAA AGT AAT GGA CCA GTG AAG 15 20 25 30 GTG TGG GGA AGC ATT AAA GGA CTG ACT GAA GGC CTG CAT GGA TTC CAT 35 40 45 GTT CAT GAG TTT GGA GAT AAT ACA GCA GGC TGT ACC AGT GCA GGT CCT 50 55 60 CAC TTT AAT CCT CTA TCC AGA AAA CAC GGT GGG CCA AAG GAT GAA GAG 65 70 75 AGG CAT GTT GGA GAC TTG GGC AAT GTG ACT GCT GAC AAA GAT GGT GTG 80 85 90 GCC GAT GTG TCT ATT GAA GAT TCT GTG ATC TCA CTC TCA GGA GAC CAT 95 100 105 110 TGC ATC ATT GGC CGC ACA CTG GTG GTC CAT GAA AAA GCA GAT GAC TTG 115 120 125 GGC AAA GGT GGA AAT GAA GAA AGT ACA AAG ACA GGA AAC GCT GGA AGT 130 135 140 CGT TTG GCT TGT GGT GTA ATT GGG ATC GCC CAA (3') 145 150 で表わされる塩基配列を含むＤＮＡで形質転換した微生
   物