JPH051800B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は魚類の新規成長ホルモンポリペプチド
をコードするDNA、該DNAを組み込んだ組換え
体DNA、該組換え体DNAを含む微生物および該
微生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチド
の製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の
養殖産業分野において広い用途が期待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産
されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、ユ
ー・ジエイ・レビイス（U.J.Lewis）らによつて
ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
イエテイ（J.Am.Chem.Soc.）80，4429（1958）
に、エイ・エス・ハートリー（A.S.Hartree）に
よつてバイオケミカル・ジヤーナル（Biochem.
J.），100，754（1966）に、シー・エイチ・リー
（C.H.Li）らによつてアーチブス・オブ・バイオ
ケミストリイ・アンド・バイオフイジクス・（サ
プルメント）〔Arch.Biochem.Biophys.
（Suppl.）〕，１，327（1962）に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単
離されたという報告は多く見られるが、その生理
活性と蛋白化学的な性質で信頼性のあるものは数
が少ない。信頼性のある報告の例には次のような
ものがある。 テイラピアよりの単離例：エス・ダブリユ・フ
アーマー（S.W.Farmer）ら、ジエネラル・ア
ンド・コンパラテイブ・エンドクリノロジイ
（Gen.Comp.Endocrin.，30，91（1976）． チヨウザメよりの単離例：エス・ダブリユ・フア
ーマー（S.W.Farmer）ら、エンドクリノロジ
イ（Edocrinology），108，377（1981）． コイよりの単離例：エイ・エフ・クツク（A.F.
Cook）ら、ジエネラル・アンド・コンパラテ
イブ・エンドクリノロジイ（Gen.Comp.
Endocrin.），50，335（1983）． 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子については
ラツト成長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シー
バーグ（P.H.Seeburg）ら、ネイチヤー
（Nature）270486（1977）〕、ウシおよびブタの成
長ホルモン遺伝子〔ピー・エイチ・シーバーグ
（P.H.See−burg）ら：デイー・エヌ・エイ
（DNA），２，37（1983）〕、ヒト成長ホルモン遺伝
子〔ジエイ・エイ・マーシヤル（J.A.Martial）
ら：サイエンス（Science），205，602（1979）〕な
どがすでに知られており、魚類の成長ホルモン遺
伝子についても本発明者らにより既に単離されて
いる〔特願昭59−134536および同59−213360〕。
該遺伝子によりコードされる魚類成長ホルモンポ
リペプチドは、川内らにより先にサケ脳下垂体よ
り調製され、硬骨魚類における成長促進効果を有
することも確認されているサケ成長ホルモンポリ
ペプチド〔特願昭59−68670〕で、Ｎ末端（40
個）、Ｃ末端（21個）のアミノ酸配列が完全に一
致していた。 発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有
するので、養魚用餌料の組成物として有用である
が、魚類の脳下垂体からの採取は供給量が限られ
ている。従つて魚類の成長ホルモンを安価に大量
に供給する方法の開発が望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えDNA技法により魚類の
成長ホルモンを製造する方法について研究を行つ
た。その結果、魚類の成長ホルモン製造に使用す
ることができる、魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドに相補的なDNAの採取ならびにこれを含む組
換え体DNAおよび微生物の製造に成功した。即
ちサケ脳下垂体からメツセンジヤーRNA
（mRNA）を抽出し、これと相補的なDNA
（cDNA）を合成し、次いでサケの成長ホルモン
のＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するDNAプ
ローブを合成し、このDNAとハイブリダイズす
るcDNAを選択することにより、サケ成長ホルモ
ン遺伝子をクローン化することに成功し、すでに
特許出願した（特願昭59−134536および同59−
213360）。さらにいくつかのサケ成長ホルモン遺
伝子を詳細に検討する仮定で、先に特許出願した
ものと相関性の高い別の遺伝子があることがわか
り、そのcDNAの全塩基配列を決定した。本発明
者らはさらに研究を進め、該新規サケの成長ホル
モンをコードするDNAを組み込んだ組換え体
DNAを含む微生物を培養することにより、培養
物中にサケ成長ホルモンポリペプチドが著量生産
蓄積することを見い出し、本発明を完成するに到
つた。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明は、魚類の新規成長ホルモンポリペプチ
ド、とくに第１表に示されたペプチド配列を有す
るポリペプチドを提供する。該ポリペプチドは、
組換えDNA技法を用いて下記のごとく製造する
ことができる。 即ち、魚類成長ホルモンのmRNAを鋳型とし
て用いて該mRNAに相補性を示すDNA（cDNA）
を調製し、該cDNAを組み込んだ組換え体プラス
ミドを調製する。さらに、該組換え体プラスミド
を宿主微生物に挿入する。該DNAおよび組換え
体プラスミドは、とくにエツシエリヒア・コリの
ような細菌中で新規成長ホルモン遺伝子の増幅に
使用することができる。該組換え体プラスミドを
有する微生物は魚類の新規成長ホルモンポリペプ
チドを安価に大量に製造するために有用である。 従つて、本発明は、魚類の新規成長ホルモンポ
リペプチドをコードするDNA、該DNAを組み込
んだ組換え体DNA、該組換え体DNAを含む微生
物および該微生物を用いる新規成長ホルモンポリ
ペプチドの製造法を提供する。 本発明のDNAと組換え体プラスミドは下記の
一般的手法で調製される。 シロザケ脳下垂体より全RNAを調製し、これ
をオリゴ（dT）セルロース〔oligo（dT）
cellulose〕カラムを通すことによりポリアデニ
ル酸〔ポリ(A)〕を有するRNA〔ポリ(A)RNA〕を
分離する。このポリ(A)RNAを鋳型とし、逆転写
酵素により二重鎖DNAを合成する。組換え体は
試験管内DNA組換え技法を用い、大腸菌のプラ
スミドDNAのようなベクターDNAに該合成
DNAを挿入して得られる。 次に本発明のDNAおよび組換え体プラスミド
の製法について具体的に説明する。 捕獲されたシロザケより脳下垂体を摘出し、即
座に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体
にグアニジウム・イソチオシアネート
（guanidium isothiocyanate）を加え破砕し、可
溶化する。次いでCsCl溶液層に重層し、超遠心
後、沈殿物とし全細胞質RNAを得る。またグア
ニジウム・イソチオシアネート可溶化物にLiClを
加えてRNAのみを沈殿させ回収することもでき
る。 抽出したRNAをNaClまたはKClの高塩濃度
（たとえば0.5M）溶液に溶解し、オリゴ（dT）
セルロースのカラムに通塔してポリ(A)を有する
mRNAをカラムに吸着させる。水、10mMトリ
ス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶
出し、ポリ(A)を有するmRNAを単離する。 以下、オカヤマ−バーグ（Okayama−Berg）
の方法〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama
＆ Berg）；モレキユラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.）２，161
（1982）〕に従い、cDNAの合成および、そのベク
ターへの組み込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクター
としてはたとえばpCDV1を適当な溶液、たとえ
ばトリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5，
10mM），MgCl₂（たとえば6mM），NaCl（たとえ
ば10mM）を含む溶液中でKpnIで処理し、
pCDV1のKpnI部位を切断する。このDNAをト
リス−HCl緩衝液（たとえばPH6.8，30mM）、カ
コジル酸ナトリウム（たとえば140mM）、CoCl₂
（たとえば1mM）、ジチオスレイトール（たとえ
ば0.1mM）およびdTTP（たとえば0.25mM）中、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼとともに一定温度（たとえば37℃）で一定
時間（たとえば20分間）インキユベートし、ベク
ターDNAの両3′末端に60個前後のチミジル残基
を付加する。さらにこのDNAをトリス−HCl緩
衝液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl₂（たとえ
ば6mM）、NaCl（たとえば100mM）を含む溶液
中EcoRIで切断後、低融点アガロースゲル電気泳
動〔ラルス・ウイスランダー（Lars
Wieslander）：アナリテイカル・バイオケミスト
リイ（Analytical Biochmistry），98，305
（1979）〕にて分画し、約3.1キロベースの断片を
回収する。次いで該DNAをNaClまたはKClの高
塩濃度（たとえば0.5M）溶液に溶解し、ポリ
（dA）セルロースカラムに通塔してポリ（Ｔ）を
有するベクタープライマー分子のみをカラムに吸
着させる。水、10mMトリス−HCl緩衝液のよう
な低塩濃度溶液を用いて溶出し、ポリ（Ｔ）の付
加したベクタープライマー分子のみを単離する。 次にリンカーDNAを合成する。たとえば
pL1DNAを適当な溶液、たとえばトリス−HCl
緩衝液（たとえばPH7.5，10mM），MgCl₂（たと
えば6mM）、NaCl（たとえば50mM）を含む溶液
中でPstIで処理し、pL1のPstI部位を切断する。
このDNAを、dTTPの代わりにdGTPを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、15個前後のオリゴ（dG）鎖を付加する。
該DNAを適当な溶液たとえばトリス−HCl緩衝
液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl₂（たとえば
6mM）、NaCl（たとえば60mM）を含む溶液中
Hindにて切断する。アガロースゲル電気泳動
にて約0.5キロベースのDNA断片を分画し、
DEAEペーパーにて回収する。このようにしてリ
ンカ−DNAを得る。 以上のようにして得たポリ(A)RNA、ベクター
プライマー、リンカ−DNAを用い、cDNA合成
を行う。ポリ(A)RNA、ベクタープライマーDNA
をトリス−HCl緩衝液（たとえばPH8.3，
50mM）、MgCl₂（たとえば8mM）、KCl（たとえ
ば30mM）、ジチオスレイトール（たとえば
0.3mM）、dATR，dTTP，dCTP，dGTP（たと
えば各々2mM）を含む溶液中、逆転写酵素を一
定温度（たとえば37℃）、一定時間（たとえば40
分間）反応させる。こうして得たRNA−DNA二
重鎖の3′末端に、dTTPがdCTPに変わる以外は
ベクタープライマーに（dT）鎖を付加した条件
と同様の操作でオリゴ（dC）鎖を15個前後付加
する。このDNAをトリス−HCl緩衝液（たとえ
ばPH7.5，10mM）、MgCl₂（たとえば6mM）、
NaCl（たとえば60mM）を含む溶液中Hindで
切断する。このDNAに、先に調製したリンカ−
DNAを混合し、トリス−HCl緩衝液（たとえば
PH7.5，20mM）、MgCl₂（たとえば4mM）、
（NH₄）₂SO₄（たとえば10mM）、KCl（たとえば
0.1M）、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（β−NAD）（たとえば0.1mM）を含む溶
液中、大腸菌DNAリガーゼとともに一定時間
（たとえば16時間）、一定温度（たとえば12℃）で
インキユベートする。こうしてcDNAとリンカ−
DNAとの環状化が行われる。この反応液に
dATP，dTTP，dGTP，dCTPを各々、終濃度
40μMとなるよう加え、大腸菌DNAリガーゼ、
大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌リボヌクレ
アーゼＨを加え、RNA部分をDNAに変換するこ
とにより、完全な二重鎖cDNAを含む組換えプラ
スミドを得る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、
たとえば大腸菌c600SF8株を、たとえばスコツト
（Scott）らの方法〔重定勝哉：細胞工学 ２，
616（1983）〕により形質転換する。上記で得た組
換え体プラスミド上にはアンピシリン耐性遺伝子
が存在するため、形質転換した大腸菌はアンピシ
リン耐性を示す。以下の手法はこれらアンピシリ
ン耐性（Ap^r）菌株から魚類の成長ホルモン
mRNAに相補性を示す遺伝子を持つ新規組換え
体プラスミドDNAを保有する菌株を選択するの
に一般的に用いられる。すなわち、上記で得られ
た形質転換株をニトロセルロースフイルター上に
固定し、既知のシロザケ成長ホルモンのアミノ酸
配列より予想されるDNA配列を有する合成DNA
プローブと会合させ、強く会合するものを選択す
る〔グルンステイン−ホグネス（Grunstein−
Hogness）の方法、プロシーデイング・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci）．，USA.，72，3961
（1975）〕。プローブDNAは通常のトリエステル法
〔ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サイエテイ（J.Am.Chem.Soc.），97，7327
（1975）〕で合成される。合成DNAプローブによ
る選択はサザーン（Southern）らの方法〔ジヤ
ーナル・オブ・モレキユラー・バイオロジイ（J.
Mol.Biol.）98，503（1975）〕によつてさらに確実
にでき、この方法でシロザケ成長ホルモン
mRNAに相補性を示す遺伝子を有する組換え体
プラスミドDNAを同定できる。 このようにして得られる組換え体プラスミドの
１例がpSGH14である。このプラスミドをサケ成
長ホルモンをコードするDNAの供給源として用
いることができる。 微生物中でのサケ成長ホルモンをコードする
DNAの発現による魚類の成長ホルモンポリペプ
チドの生産： サケ成長ホルモンをコードするDNAを含むプ
ラスミドから該DNAを切り出し、これをベクタ
ーDNAに組み込み、得られる組換え体DNAを微
生物に導入し、得られる形質転換体を培養するこ
とによつてサケ成長ホルモンポリペプチドを培養
物中に生成蓄積させ、これを採取することによつ
てサケ成長ホルモンポリペプチドを製造すること
ができる。 サケ成長ホルモンをコードするDNAを含むプ
ラスミドとしては、上記pSGH14が好適な例とし
てあげられる。 ベクターDNAとしては、挿入したDNAを微生
物中で発現させることができるものなら、いかな
るものでも用いることができる。好ましくは、適
当なプロモーター、たとえばトリプトフアン
（trp）系、ラクトース（lac）系、PL系などのプ
ロモーターを持ち、その下流にDNAを挿入でき、
しかも内在するシヤインダルガーノ配列（以下
SD配列と略記する）と翻訳開始コドン（ATG）
との間を適当な距離たとえば６〜18塩基対に調節
したベクターDNAが用いられる。具体的に好適
なベクターDNAとしては、プラスミドpGEL1を
あげることができる。pGEL1は第３図に示すプ
ラスミドで、それを含む大腸菌はEscherichia
coli IGEL1（FERM BP−629）として昭和59年
10月６日付で工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に寄託されている。ポリペプチドをコ
ードするDNAとベクターDNAとの組換えは、制
限酵素を用いて両DNAを消化後、T4DNAリガ
ーゼを用いて結合する一般的組換えDNA手法を
用いて行うことができる。 具体例として示したpSGH14とpGEL1の場合は
第３図に示したごとく２段階の造成を行う。すな
わちpSGH14よりサケ成長ホルモン成熟ペプチド
Ｎ末端付近をコードするMbo−Pvu断片と、
cDNAの残りの部分およびベクター部分を含む
Pvu−Hind断片を別々に得る。一方、以下
のような合成DNAリンカーを作製する。 上記DNA断片と合成DNAリンカーとを
T4DNAリガーゼで結合し、第３図に示した組換
え体プラスミドpSGHB9を得る。 次にpSGHB9よりサケ成長ホルモン成熟ペ
プチドをコードするHind−BamHI消化断片を
得、pGEL1からはトリプトフアンプロモーター
を含むHind−BamHI消化断片を得る。上記２
つのDNA断片をT4DNAリガーゼで結合し、第
３図に示した組換え体プラスミドpSGHC2を得
る。本プラスミドはトリプトフアンプロモーター
下流に、成熟サケ成長ホルモンをコードする領域
が連結した形を有する。 上記組換え技法における反応の条件は、一般的
に下記のとおりである。 DNAの制限酵素による消化反応は、通常0.1〜
20μgのDNAを２〜200mM（好ましくは10〜
40mM）のトリス−HCl（PH6.0〜9.5好ましくはPH
7.0〜8.0）、０〜200mMのNaCl、２〜30mM（好
ましくは５〜10mM）のMgCl₂を含む反応液中
で、制限酵素0.1〜100単位（好ましくは1μgの
DNAに対して１〜３単位）を用い、20〜70℃
（至適温度は用いる制限酵素により異なる）にお
いて、15分間〜24時間行う。反応の停止は、通常
55〜75℃で、５〜30分間加熱することによるが、
フエノールまたはジエチルピロカーボネートなど
の試薬により制限酵素を失活させる方法も用いる
ことができる。 制限酵素消化によつて生じたDNA断片の精製
は、低融点アガロースゲル電気泳動法〔エル・ウ
イスランダー（L.Wieslander）：アナリテイカ
ル・バイオケミストリイ（Analytical
Biochemistry）98，305，（1979），以下LGT法と
いう〕やポリアクリルアミドゲル電気泳動法など
によつて行う。 DNA断片の結合反応は、２〜200mM（好まし
くは10〜40mM）のトリス−HCl（PH6.1〜9.5、好
ましくはPH7.0〜8.0）、２〜20mM（好ましくは５
〜10mM）のMgCl₂、0.1〜10mM（好ましくは0.5
〜2.0mM）のATP、１〜50mM（好ましくは５〜
10mM）のジチオスレイトールを含む反応液中
で、T4DNAリガーゼ0.3〜10単位を用い、１〜
37℃（好ましくが３〜20℃）で15分間〜72時間
（好ましくは２〜20時間）行う。 結合反応によつて生じた組換え体プラスミド
DNAは、必要によりCohenらの形質転換法〔エ
ス・エヌ・コーエン（S.N.Cohen）ら：プロシー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA
69，2110（1972）〕によつて、大腸菌に導入する。 組換え体プラスミドDNAを持つ大腸菌から該
DNAの単離は、後に述べる実施例１に示した方
法あるいはバーンボイム（Birnboim）らの方法
〔エイチ・シー・バーンボイム（H.C.Birnboim）
ら：ヌクレイツク・アシド・リサーチ（Nucleic
Acids Res.）７，1513（1979）〕などを用いて行
う。 プラスミドDNAを１〜10種類の制限酵素で消
化後アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により切断部位を調べる。
さらにDNAの塩基配列を決定する必要がある時
はマキサム・ギルバード法〔プロシーデイング・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.），74，560（1977）〕
またはM13フアージを用いたサンガー（Sanger）
法〔サンガー（Sanger）らプロシーデイング・
オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA，74，5463
（1977）；アマーシヤム（Amersham）社M13ク
ローニング・アンド・シークエンシング・ハンド
ブツク（cloning and sequencing handbook）〕
によつて決定する。 以上のような条件で組換え体プラスミドDNA
を製造することができる。 本発明の魚類の成長ホルモンペプチドは以下の
とおりに製造できる。 すなわち、プラスミド（例えばpSGHC2）を
用いて大腸菌Ｋ−12 HB101を形質転換させ、ア
ンピシリン耐性のコロニーの中からpSGHC2を
有する大腸菌を選びだす。pSGHC2を有する大
腸菌を培地に培養することにより培養物中に魚類
の成長ホルモンポリペプチドを生成させることが
できる。 ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならび
に魚類の成長ホルモンポリペプチドの生産に好適
なものならば合成培地、天然培地のいずれも使用
できる。 炭素源としては、グルコース、フラクトース、
ラクトース、グリセロール、マンニトール、ソル
ビトールなどが、窒素源としては、NH₄Cl，
（NH₄）₂SO₄、カザミノ酸、酵母エキス、ポリペ
プトン、肉エキス、バクトリプトン、コーン・ス
テイープリカーなどが、その他の栄養源として
は、K₂HPO₄，KH₂PO₄，NaCl，MgSO₄、ビタ
ミンB₁、MgCl₂などが使用できる。 培養はPH5.5〜8.5、温度18〜40℃で通気攪拌培
養により行われる。 培養５〜90時間で培養菌体中にシロザケ成長ホ
ルモンポリペプチドが蓄積するので、培養物から
菌体を集菌し、菌体をリゾチーム処理後、凍結、
融解を繰り返して菌体を破砕し、遠心してえられ
る上清から通常のポリペプチドの抽出方法に従つ
てポリペプチドを採取する。 また該ポリペプチドの検出は培養菌体を直接レ
ムリ（Laemmli）のサンプルバツフアー〔レム
リ（Laemmli）、ネイチヤー（Nature），227，
680（1970）〕に加熱、溶解後、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル〔レムリ（Laemmli）の方法：同
上文献〕にかけ、クマシーブリリアントブルー染
色によつて行う。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ シロザケ脳下垂体よりのポリ(A)RNAの調製： シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネ
ート−セシウムクロライド法〔マニアテイス
（Maniatis）ら編、モレキユラー。クローニング
（Molecular Cloning），p196、コールド・スプリ
ング・ハーバー（Cold Spring Harbor）刊；重
定勝哉、細胞工学、２，616（1983）〕に従いポリ
(A)を有するRNAを下記のごとく調製した。 シロザケの凍結脳下垂体２ｇ（約30個体分）を
4Mグアニジウムチオシアネート、0.5％ザルコシ
ン、5mMクエン酸ナトリウム（PH７）および
0.1mβ−メルカプトエタノールからなる溶液10ml
中でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にて破砕
し可溶化した。このホモジネートを18G注射針に
数回通してDNAを分断した。5.7MCsCl、0.1M
EDTA（PH８）の溶液各1.2mlを超遠心管中に分注
しておき、前記ホモジネートを重層した。
Hitachi RPS40ローターにて35000rpm、15時間
遠心後、RNAを沈殿として回収した。RNAの沈
殿を1mM EDTAを含むトリス−HCl（PH8.0）溶
液10mlに溶解し、フエノール−クロロホルムで抽
出後、エタノール沈殿により回収した。得られた
RNA約１mgを10mMトリス−HCl（PH8.0）および
1mM EDTAからなる溶液１mlに溶かした。65
℃、５分間インキユベートし、0.1mlの5M NaCl
を加えた。混合物をオリゴ（dT）セルロース・
カラム（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）クロマト
グラフイー（カラム体積0.5ml）にかけた。吸着
したポリ(A)を有するmRNAを10mMトリス−
HCl（PH7.5）および1mM EDTAからなる溶液で
溶出し０，２mlずつ分画した。３〜５番目の画分
を回収し、ポリ(A)を有するmRNA約10μgを得た。 実施例 ２ cDNA合成と該DNAのベクターへの挿入： オカヤマ−バーグ（Okayama−Berg）の方法
〔モレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジ
イ（Mol.Cell.Biol.），２，161（1982）〕に従い、
cDNAの合成とそれを組み込んだ組換え体プラス
ミドの造成を行つた。その工程の概略を第１図に
示す。 pCDV1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okaya−
ma ＆ Berg）：モレキユラー・アンド・セル
ラー・バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.），３，280
（1983）〕400μgを100mMトリス−HCl（PH7.5）、
6mM MgCl₂および10mM NaClからなる溶液
300μlに加え、さらに500単位のKpnI（宝酒造社
製、以下特記しない限り制限酵素はすべて宝酒造
社製）を加えて、37℃、６時間反応させ、プラス
ミド中のKpnI部位で切断した。フエノール−ク
ロロホルム抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を回収した。KpnI切断した該DNA約200μgを
40mMカコジル酸ナトリウム、30mMトリス−
HCl（PH6.8）、1mM CaCl₂および0.1mMジチオス
レイトール（以下DTTと略記する）からなる緩
衝液（以下TdT緩衝液と略記する）にdTTPを
0.25mMとなるよう加えた溶液200μlに加え、さ
らに81単位のターミナルデオキシヌクレオチジル
トランスフエラーゼ（以下TdTと略記する）（Ｐ
−Ｌ Biochemicals社製）を加えて、37℃11分
間反応させた。ここで、pCDV1のKpnI切断部位
の3′末端にポリ（dT）鎖が約67個付加された。
該溶液からフエノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿により、ポリ（dT）鎖の付加した
pCDV1DNA約100μgを回収した。該DNAを
10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl₂，
100mM NaClからなる緩衝液150μlに加え、さら
に360単位のEcoRIを加え、37℃２時間反応させ
た。該反応物をLGT法で処理後、約3.1Kbの
DNA断片を回収し、約60μgのポリ（dT）鎖付加
pCDV1を得た。該DNAを10mMトリス−HCl
（PH8.0）および1mM EDTAからなる溶液500μl
に溶解し、65℃５分間インキユベート後、氷冷し
て50μlの5M NaClを加えた。混合物をオリゴ
（dA）セルロースカラムコラボラテイブリサーチ
社製）クロマトグラフイーにかけた。ポリ（dT）
鎖長が充分なものはカラムに吸着し、これを
10mMトリス−HCl（PH8.0）および1mM EDTA
からなる溶液で溶出し、ポリ（dT）鎖の付加し
たpCDV1（以下ベクタープライマーと略記する）
27μgを得た。 次にリンカーDNAの調製を行なう。 pL1〔オカヤマ・アンド・バーグ（Okayama
＆ Berg）：モレキユラー・アンド・セルラー・
バイオロジイ（Mol.Cell.Biol.），３，280（1983）〕
約14μgを10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM
MgCl₂および50mM NaClからなる緩衝液200μl
に加え、さらに50単位のPstIを加え、37℃４時間
反応させ、pL1DNA中のPstI部位で切断させた。
該反応物をフエノール−クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿を行い、PstIで切断したpL1DNA
約13μgを回収した。該DNA約13μgをTdT緩衝液
に終濃度0.25mMのdGTPを含む溶液50μlに加え、
さらにTdT（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）54単位
に加えて37℃13分間インキユベートし、pL1の
PstI切断部位3′末端に（dG）鎖を約14個付加し
た。フエノール−クロロホルム抽出後エタノール
沈殿にてDNAを回収した。該DNAを100μlの
10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl₂および
60mM NaClからなる緩衝液100μlに加え、さら
に80単位のHindを加えて37℃３時間インキユ
ベートし、pL1DNAのHind部位で切断した。
該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、
約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法〔ドレ
ツエン（Dretzen）ら、アナリテイカル・バイオ
ケミストリイ（Anal.Biochem.），112，295
（1981）〕にて回収し、オリゴ（dG）鎖付きのリ
ンカーDNA（以下単にリンカーDNAと略記する）
を得た。 上記で調製したポリ(A)RNA約2μg、ベクター
プライマー約1.4μgを50mMトリス−HCl（PH8.3）、
8mM MgCl₂，30mM KCl，0.3mM DTT，
2mM dNTP（dATP，dTTP，dGTPおよび
dCTP）および10単位のリボヌクレアーゼインヒ
ビター（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）からなる
溶液22.3μlに溶解し、10単位の逆転写酵素（生化
学工業社製）を加え、37℃40分間インキユベート
し、mRNAに相補的なDNAを合成させた。該反
応物をフエノール−クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿を行ない、RNA−DNA二重鎖の付加した
ベクターポライマーDNAを回収した。該DNAを
66μMdCTPおよび0.2μgポリ(A)を含むTdT緩衝液
20μlに溶かし、14単位のTdT（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加えて37℃８分間インキ
ユベートし、cDNA3′末端に12個の（dC）鎖を付
加した。該反応物をフエノール−クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿により（dC）鎖の付加し
たcDNA−ベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAを10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM
MgCl₂および60mM NaClからなる液400μlに溶
かし、20単位のHindを加え、37℃２時間イン
キユベートし、Hind部位で切断した。該反応
物をフエノール−クロロホルム抽出、エタノール
沈殿して0.5pmoleの（dC）鎖付加cDNA−ベク
タープライマーDNAを得た。該DNA0.08pmole
および前記のリンカーDNA0.16pmoleを10mMト
リス−HCl（PH7.5）、0.1M NaClおよび1mM
EDTAからなる溶液40μlに溶かし、65℃，42℃，
０℃でそれぞれ10分、25分、30分間インキユベー
トした。20mMトリス−HCl（PH7.5）、4mM
MgCl₂，10mM（NH₄）₂SO₄，0.1M KClおよび
0.1mMβ−NADの組成で、全量400μlとなるよう
反応液を調製した。該反応液に10単位の大腸菌
DNAリガーゼ（New England Biolabs社製）を
加え、11℃一夜インキユベートした。該反応液を
各40μMのdNTP，0.15mMβ−NADとなるよう
成分を追加調製し、５単位の大腸菌DNAリガー
ゼ、７単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ（Ｐ−Ｌ
Bio−chemicals社製）および２単位の大腸菌
リボヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Biochemicals社
製）を加え、12℃、25℃で順次１時間ずつインキ
ユベートした。上記反応で、cDNAを含む組換え
DNAの環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部
分がDNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換
え体プラスミドが生成した。 実施例 ３ シロザケ成長ホルモンcDNAを含む組換え
DNAの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大
腸菌c600SF8株〔カメロン（Cameron）：プロシ
ーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ
イ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）
USA，72，3416（1975）〕をスコツト（Scott）ら
の方法〔重定勝哉：細胞工学、２，616（1983）〕
に従い形質転換した。得られた約１万個のコロニ
ーのうち4800個をニトロセルロース上に固定し
た。シロザケ成長ホルモンのＮ末端から23番目−
28番目のアミノ酸配列に対応する合成DNA、す
なわち （３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまたは
Ｃ、12番目はＣまたはＴ、15番目はＣまたはＴで
あり、組み合わせて16通りの合成DNAの混合物
となる）を32Pで標識したプローブに40℃で強く
会合した８菌株を選んだ〔グルンステイン−ホグ
ネス（Grunstein−Hogness）の方法、プロシー
デイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミイ・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA，
72，3961（1975）〕。得られた８菌株についてサザ
ーン（Southern）の方法〔ジヤーナル・オブ・
モレキユラー・バイオロジイ（J.Mol.Biol.），
98，503（1975）〕により、上記プローブおよびＣ
末端付近のアミノ酸配列に対応する合成DNAプ
ローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまたは
Ｇ、９番目はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、12番目
はＧまたはＡであり、組み合わせて32通りの合成
DNAの混合物となる）とも会合が確認された。
これらのプラスミドはpSGH1，３，６，８，９，
10，14，17と命名したが、いずれも、シロザケ成
長ホルモンのアミノ酸配列から予想されるDNA
配列を有することから成長ホルモンcDNAを含ん
でいるものと考えられた。 実施例 ４ 該プラスミドpSGH14の塩基配列： 上記で得られたプラスミド８種につき、種々の
制限酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定
した。制限酵素部位の存在位置から、得られたプ
ラスミドは３群に分類でき、pSGH1，６，９，
10，17の群、pSGH3の群、pSGH8，14の群と分
けられた。それぞれの群の制限酵素地図を第２図
に示す。 これらのうち、pSGH1の群のプラスミド、と
くにpSGH1についてはすでに全塩基配列が決定
されており、そのcDNA配列から予想されるアミ
ノ酸配列は、シロザケ成長ホルモンペプチドから
決定されているＮ末端付近およびＣ末端付近のア
ミノ酸配列と完全に一致し、該cDNAはシロザケ
成長ホルモンをコードしていることが確認されて
いる。〔特願昭59−134536および同59−213360〕。 さらにこの群とは制限酵素切断部位の異なるプ
ラスミドであるpSGH8，pSGH14のうち、ほぼ
完全長を有すると思われるより長いcDNAを含む
pSGH14について、その翻訳領域の全ヌクレオチ
ド配列をM13フアージを用いたサンガー法〔サン
ガー（Sanger）ら、プロシーデイング・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミイ・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.），USA，74，5463
（1977）：アマーシヤム（Amersham）社 M13
クローニング・シークエンシング・ハンドブツク
（cloning and sequencing handbook）〕に従つ
て決定した。配列を第１表に示す。 【表】 【表】 第１表中、既知のシロザケ成長ホルモンとの比
較から、塩基数１−66がシグナルペプチドを、67
−630がシロザケ新規成長ホルモンの成熟ペプチ
ドをコードすると考えられる。 該cDNAによりコードされるポリペプチドは、
pSGH1によりコードされるポリペプチドとはシ
グナルペプチドの22個のアミノ酸配列は完全に一
致しているが、成熟ペプチド部分では、188個中
第１表に下線で示してある12個のアミノ酸が異な
つている。またシロザケ成長ホルモンポリペプチ
ドから決定されたＮ末端40個のアミノ酸配列に限
つても５個のアミノ酸が明らかに異なつており、
pSGH14に含まれるcDNAはpSGH1の群とは異
なる魚類の新規成長ホルモンをコードしていると
考えられる。pSGH14を組込んだ組換え体プラス
ミドを含む大腸菌はEscherichia coli ESGH14
（FERMBP−611）として微工研に昭和59年９月
20日付で寄託してある。 実施例 ５ 新規シロザケ成長ホルモンをコードする組換え
体プラスミドの造成： (1) pSGH14から成熟シロザケ成長ホルモンをコ
ードする組換え体プラスミドpSGHB9の造
成： 新規シロザケ成長ホルモンをコードするDNA
を含むプラスミドpSGH14 5μgを20mMトリス−
HCl（PH7.5）、10mM MgCl₂、および10mM
NaClを含む溶液100mlに溶かし、制限酵素Mbo
（New England Bio Labs社製）10単位を加
え、37℃３時間消化反応を行つた。続いてNaCl
濃度を50mMとなるよう調製し、Pvu 10単位
を加え、37℃３時間消化反応を行つた。この反応
液はポリアクリルアミドゲル電気泳動後、DEAE
−ペーパー法によりＮ末端付近に相当する108bp
のDNA断片約0.05μgを得た。 次にpSGH14 5μgを20mMトリス−HCl（PH
7.5）、10mM MgCl₂および50mM NaClを含む溶
液（以下“Ｙ−50緩衝液”と略記する）40μlに溶
かし、Pvu，Hind各々10単位を加え、37℃
３時間消化反応を行つた。該反応液からLGT法
により、pSGH14でコードされる成長ホルモンの
Ｃ末端側、3′−非翻訳領域およびベクター部分を
含む約3.3KbのDNA断片約0.5μgを得た。 一方成熟シロザケ成長ホルモンをコードする
DNAの発現に必要な翻訳開始コドンATGを付加
し、さらにベクターDNAと上記DNAを連結する
目的で下記のDNAリンカーを合成した。 まず一本鎖DNA、14merと9merを通常のトリ
エステル法〔アール・クレア（R.Crea）ら：プ
ロシーデイング・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミイ・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.）
USA.，75，5765（1978）〕により合成した。
14merおよび9merの一本鎖DNA各々39pmoleを
50mMトリス−HCl（PH7.5）、10mM MgCl₂，
10mMジチオスレイトールおよび1mM ATPを
含む溶液20μlに溶かし、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、37℃、60分
間リン酸化反応を行つた。 上記で得たpSGH14由来のMbo−Pvu断片
（108bP）0.08pmole，Pvu−Hind断片（約
3.7Kb）0.02pmoleを5mMトリス−HCl（PH7.5）、
10mM MgCl₂、10mMジチオスレトールおよび
1mM ATPを含む溶液30μlに溶かし、これに上
記の合成DNAリン酸化反応液5μlを加えた。この
混合液にT4DNAリガーゼ６単位を加え、４℃、
18時間結合反応を行つた。 該反応液を用いて大腸菌HB101〔ボリバー
（Bolivar）ら、ジーン（Gene，２，75（1977）〕
株を形質転換しAp^rnoコロニーを得、このコロニ
ーよりプラスミドDNAを回収し、第３図に示し
たpSGHB9を得た。pSGHB9の構造はHind
，XbaI，Bgl，BamHIで切断してアガロー
スゲル電気泳動にて確認した。 (2) pSGHB9の成熟シロザケ成長ホルモンを
コードする領域の発現ベクターpGEL1への組
み込み： pSGHB9 5μgを40μlのＹ−50緩衝液に溶か
し、BamHIとHindを各々10単位加え、37℃３
時間消化反応を行つた。該反応液からLGT法に
より、成熟シロザケ成長ホルモン全体をコードす
る約1200bpのDNA断片約0.1μgを得た。 別にpGEL1 5μgを40μlのＹ−50緩衝液に溶か
し、BamHIとHindとを各々10単位加え、37℃
３時間消化反応を行つた。この反応液からLGT
法によりトリプトフアンプロモーターを含む約
2.7KbのDNA断片約0.1μgを得た。 上記で得たpSGHB9のHind−BamHI断片
（約1200bp）0.01μgとpGELのHind−BamHI断
片（約2.7Kb）0.015μgを50mMトリス−HCl（PH
7.5）、10mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール
および1mM ATPを含む溶液30μlに溶かし、
T4DNAリガーゼ（宝酒造社製）６単位を加え、
４℃、18時間結合反応を行つた。 該反応液を用いて大腸菌HB101株を形質転換
しAp^rのコロニーを得、このコロニーよりプラス
ミドDNAを回収し、第３図に示したpSGHC2
を得た。pSGHC2の構造はEcoRI，Hind，
ClaI，Bgl，BamHIで切断してアガロースゲ
ル電気泳動にて確認した。 pSGHB9，pSGHC2を含む大腸菌菌株は
Escherichia coli ESGHC2 FERM BP−
708および同ESGHB9 FERM BP−707とし
て、それぞれ微工研に寄託されている。 実施例 ６ pSGHC2を含む大腸菌によるシロザケ新規成
長ホルモンペプチドの生産： 実施例５で得た組換え体プラスミドpSGHC2
を用い常法により大腸菌W3110strA株（FERM
BP−732）を形質転換した。得られたAp^rコロニ
ーを８mlのMCG培地〔0.6％ Na₂HPO₄，0.3％
KH₂PO₄，0.5％ NaCl，0.1％ NH₄Cl，0.5
％グルコース、0.5％ カザミノ酸、1mM
MgSO₄，4μg／mlビタミンB₁、PH7.2〕に接種し、
30℃で18時間培養した。得られた培養液を
8000rpm、10分間遠心して菌体を回収した。この
菌体をLaemmliのサンプルバツフアーに懸濁後、
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、
クマシーブリリアントブルーにて染色して、分子
量約25000の部位のポリペプチドバンドを検出し
た。このバンドは該プラスミドを含まないに大腸
菌を用いた場合には存在しなかつた。この結果、
pSGHC2を保有する大腸菌はシロザケ成長ホル
モンポリペプチドを大量に生産していることがわ
かつた。 発明の効果 本発明によれば、魚類の新規成長ホルモンポリ
ペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え
体DNA、該組換え体DNAを含む微生物が得ら
れ、これら魚類の新規成長ホルモンポリペプチド
の大量生産に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図(1)および(2)はオカヤマーバーグ法による
cDNA合成と該DNAを含む組換え体プラスミド
の造成過程の概略を示す。第２図はpSGH1，
pSGH3，pSGH14に含まれるcDNAの制限酵素
地図を示す。第３図は組換え体プラスミドpSGH
B9，pSGHC2の造成過程を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記のペプチド配列を含む魚類の新規成長ホ
   ルモンポリペプチド。 【表】 ２ 魚類の成長ホルモンがニシン類
   （Clupeiformes）の新規成長ホルモンである特許
   請求の範囲第１項のポリペプチド。 ３ 下記のペプチド配列を含む魚類の新規成長ホ
   ルモンポリペプチドをコードするDNAを組み込
   んだ組換え体DNAを含む細菌を栄養培地に培養
   し、該培養物中に魚類の成長ホルモンポリペプチ
   ドを蓄積せしめ、該培養物から該ポリペプチドを
   採取することを特徴とする下記のペプチド配列を
   含む魚類の成長ホルモンポリペプチドの製造法。 【表】