JPH0646865A - ノイラミニダーゼ遺伝子 - Google Patents
ノイラミニダーゼ遺伝子Info
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- JPH0646865A JPH0646865A JP3269931A JP26993191A JPH0646865A JP H0646865 A JPH0646865 A JP H0646865A JP 3269931 A JP3269931 A JP 3269931A JP 26993191 A JP26993191 A JP 26993191A JP H0646865 A JPH0646865 A JP H0646865A
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- neuraminidase
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- bacteroides
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、配列番号：１で表わされる塩基配列
を有するバクテロイデス・フラジリスのノイラミニダー
ゼ遺伝子、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
するバクテロイデス・フラジリスのノイラミニダーゼ、
及び上記ノイラミニダーゼ遺伝子の全部又は一部を利用
するバクテロイデス・フラジリスの同定及び診断法を提
供する。 【効果】本発明のノイラミニダーゼ遺伝子は、バクテロ
イデス・フラジリスのノイラミニダーゼの遺伝子工学的
手法による製造及びバクテロイデス・フラジリスの同定
及び診断に有用である。
を有するバクテロイデス・フラジリスのノイラミニダー
ゼ遺伝子、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
するバクテロイデス・フラジリスのノイラミニダーゼ、
及び上記ノイラミニダーゼ遺伝子の全部又は一部を利用
するバクテロイデス・フラジリスの同定及び診断法を提
供する。 【効果】本発明のノイラミニダーゼ遺伝子は、バクテロ
イデス・フラジリスのノイラミニダーゼの遺伝子工学的
手法による製造及びバクテロイデス・フラジリスの同定
及び診断に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、グラム陰性嫌気性桿菌
であるバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）のノイラミニダーゼ（Ｎｅ
ｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）及びその遺伝子とその利用、
特に上記ノイラミニターゼ遺伝子を用いたバクテロイデ
ス・フラジリスの同定及び診断法に関する。
であるバクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉ
ｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）のノイラミニダーゼ（Ｎｅ
ｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）及びその遺伝子とその利用、
特に上記ノイラミニターゼ遺伝子を用いたバクテロイデ
ス・フラジリスの同定及び診断法に関する。
【０００２】
【従来の技術】バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ）属の菌種の内でもフラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）は、その腸管内に占められる割合がさほど大きくな
いにもかかわらず、病巣から分離される頻度の最も高い
菌種の一つであり、該菌種には他の菌種の持たない病原
因子が存在すると考えられている。また該菌種は他のバ
クテロイデス属と比較して、著しく高いノイラミニダー
ゼ活性を有しており、この酵素が本菌種の病原性因子の
一つである可能性が強く示唆されている。
ｓ）属の菌種の内でもフラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）は、その腸管内に占められる割合がさほど大きくな
いにもかかわらず、病巣から分離される頻度の最も高い
菌種の一つであり、該菌種には他の菌種の持たない病原
因子が存在すると考えられている。また該菌種は他のバ
クテロイデス属と比較して、著しく高いノイラミニダー
ゼ活性を有しており、この酵素が本菌種の病原性因子の
一つである可能性が強く示唆されている。
【０００３】一方、近年病原微生物の同定、診断に病原
因子の遺伝子に由来するＤＮＡをプローブとして用いる
方法や、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅された上記ＤＮＡを用
いる方法が取り入れられてきている。上記バクテロイデ
ス・フラジリスのＤＮＡ診断についても、分離株とバ
クテロイデス基準株との定量的ハイブリダイゼーション
［Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３３，１４２３−１４３
０（１９８７）］や、ランダムＤＮＡをプローブとし
て用いる方法［Ｋｕｒｉｔｚａ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３，３
４３−３４９（１９８６）：Ｇｒｏｖｅｓ，Ｄ．Ｊ．ａ
ｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｖ．，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，７，２７３−２７８
（１９８７）］が試みられている。しかし、上記の方
法では分離株のＤＮＡを調整して標識せねばならないの
で、この方法自体腹水や血液等の検査材料から直接本菌
種を検出する目的には用いることができない。また上記
の方法ではプローブがいかなる遺伝子に由来するのか
明らかでないので、該方法自体特異性に問題がある。
因子の遺伝子に由来するＤＮＡをプローブとして用いる
方法や、ＰＣＲ法（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅された上記ＤＮＡを用
いる方法が取り入れられてきている。上記バクテロイデ
ス・フラジリスのＤＮＡ診断についても、分離株とバ
クテロイデス基準株との定量的ハイブリダイゼーション
［Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３３，１４２３−１４３
０（１９８７）］や、ランダムＤＮＡをプローブとし
て用いる方法［Ｋｕｒｉｔｚａ，Ａ．Ｐ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３，３
４３−３４９（１９８６）：Ｇｒｏｖｅｓ，Ｄ．Ｊ．ａ
ｎｄ Ｃｌａｒｋ，Ｖ．，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，７，２７３−２７８
（１９８７）］が試みられている。しかし、上記の方
法では分離株のＤＮＡを調整して標識せねばならないの
で、この方法自体腹水や血液等の検査材料から直接本菌
種を検出する目的には用いることができない。また上記
の方法ではプローブがいかなる遺伝子に由来するのか
明らかでないので、該方法自体特異性に問題がある。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、バ
クテロイデス・フラジリスの病原因子と考えられるノイ
ラミニダーゼ及びその遺伝子を解明し、該遺伝子を利用
して上記微生物を同定、診断する技術を提供することに
ある。
クテロイデス・フラジリスの病原因子と考えられるノイ
ラミニダーゼ及びその遺伝子を解明し、該遺伝子を利用
して上記微生物を同定、診断する技術を提供することに
ある。
【０００５】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研
究の結果、バクテロイデス・フラジリスのノイラミニダ
ーゼ遺伝子の単離に成功すると共に、この遺伝子を利用
して上記微生物の同定、診断にも成功し、ここに本発明
を完成するに至った。
究の結果、バクテロイデス・フラジリスのノイラミニダ
ーゼ遺伝子の単離に成功すると共に、この遺伝子を利用
して上記微生物の同定、診断にも成功し、ここに本発明
を完成するに至った。
【０００６】即ち、本発明によれば、配列番号：１で表
わされる塩基配列を有するバクテロイデス・フラジリス
のノイラミニダーゼ遺伝子、配列番号：２で表わされる
アミノ酸配列を有するバクテロイデス・フラジリスのノ
イラミニダーゼ、及び上記ノイラミニダーゼ遺伝子の全
部又は一部を用いることを特徴とするバクテロイデス・
フラジリスの同定及び診断法が提供される。
わされる塩基配列を有するバクテロイデス・フラジリス
のノイラミニダーゼ遺伝子、配列番号：２で表わされる
アミノ酸配列を有するバクテロイデス・フラジリスのノ
イラミニダーゼ、及び上記ノイラミニダーゼ遺伝子の全
部又は一部を用いることを特徴とするバクテロイデス・
フラジリスの同定及び診断法が提供される。
【０００７】本明細書において、アミノ酸配列及び塩基
配列の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定乃
至当該分野における通称又は慣用に従うものとする。
配列の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定乃
至当該分野における通称又は慣用に従うものとする。
【０００８】本発明に係わるノイラミニダーゼ遺伝子
は、配列番号：１で表わされる塩基配列を有する点にお
いて、また本発明のノイラミニダーゼは、配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列を有する点において、それぞ
れ特徴付けられるが、これら以外に例えば上記アミノ酸
配列のＮ端に位置するメチオニン（Ｍｅｔ）が欠損した
もの、シグナルペプチド部分の全部又は一部が欠損した
もの等や、天然に見られる翻訳後の修飾や遺伝子工学的
手法による配列の改変（付加、欠損、置換等）等がなさ
れたノイラミニダーゼ同効物及びそれらの遺伝子もまた
本発明に包含される。上記遺伝子工学的手法としては、
公知の各種方法、例えばサイトスペシフィック・ミュー
タゲネシスによるＤＮＡの改変やホスファイト・トリエ
ステル法等によるＤＮＡの変異等が包含される。
は、配列番号：１で表わされる塩基配列を有する点にお
いて、また本発明のノイラミニダーゼは、配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列を有する点において、それぞ
れ特徴付けられるが、これら以外に例えば上記アミノ酸
配列のＮ端に位置するメチオニン（Ｍｅｔ）が欠損した
もの、シグナルペプチド部分の全部又は一部が欠損した
もの等や、天然に見られる翻訳後の修飾や遺伝子工学的
手法による配列の改変（付加、欠損、置換等）等がなさ
れたノイラミニダーゼ同効物及びそれらの遺伝子もまた
本発明に包含される。上記遺伝子工学的手法としては、
公知の各種方法、例えばサイトスペシフィック・ミュー
タゲネシスによるＤＮＡの改変やホスファイト・トリエ
ステル法等によるＤＮＡの変異等が包含される。
【０００９】本発明ノイラミニダーゼ遺伝子は、これを
利用して遺伝子組換え技術により所望のノイラミニダー
ゼを製造できるだけでなく、該遺伝子の一部をプローブ
として用いて、バクテロイデス・フラジリスの特異的同
定、診断を可能とし、またＰＣＲ法により容易に該遺伝
子の増幅・検出を行なうことができ、該ＰＣＲ法による
遺伝子増幅用プライマーとしても、本発明ノイラミニダ
ーゼ遺伝子の一部分が有利に利用できる。従って、本発
明は、かかるＤＮＡプローブやＰＣＲ用プライマーとし
てのノイラミニダーゼ遺伝子の部分断片をも提供するも
のである。
利用して遺伝子組換え技術により所望のノイラミニダー
ゼを製造できるだけでなく、該遺伝子の一部をプローブ
として用いて、バクテロイデス・フラジリスの特異的同
定、診断を可能とし、またＰＣＲ法により容易に該遺伝
子の増幅・検出を行なうことができ、該ＰＣＲ法による
遺伝子増幅用プライマーとしても、本発明ノイラミニダ
ーゼ遺伝子の一部分が有利に利用できる。従って、本発
明は、かかるＤＮＡプローブやＰＣＲ用プライマーとし
てのノイラミニダーゼ遺伝子の部分断片をも提供するも
のである。
【００１０】本発明遺伝子の製造及びこれを利用してノ
イラミニダーゼを製造する方法につき詳述すれば、該方
法は一般的手法に従って、バクテロイデス・フラジリス
からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子ライブラリーを作製
し、その中から目的ＤＮＡを選出し、これを宿主細胞に
導入し、該細胞を培養することにより実施できる。
イラミニダーゼを製造する方法につき詳述すれば、該方
法は一般的手法に従って、バクテロイデス・フラジリス
からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子ライブラリーを作製
し、その中から目的ＤＮＡを選出し、これを宿主細胞に
導入し、該細胞を培養することにより実施できる。
【００１１】上記において、バクテロイデス・フラジリ
スからゲノムＤＮＡの抽出は、例えばトーマスの方法
［Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ
ｒ．，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，４７
６−４９０（１９６５）］に従うことができる。
スからゲノムＤＮＡの抽出は、例えばトーマスの方法
［Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ
ｒ．，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，４７
６−４９０（１９６５）］に従うことができる。
【００１２】遺伝子ライブラリーは、通常用いられてい
るプラスミドベクターやラムダファージ由来のベクター
等を用いたり、ファージとプラスミドの両方の性質を兼
ね備えたより大きいＤＮＡ断片がクローニングできるコ
スミドベクター等を用いて、通常の方法に従い作製する
ことができる。
るプラスミドベクターやラムダファージ由来のベクター
等を用いたり、ファージとプラスミドの両方の性質を兼
ね備えたより大きいＤＮＡ断片がクローニングできるコ
スミドベクター等を用いて、通常の方法に従い作製する
ことができる。
【００１３】宿主細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表的であるが、これに限定
されるわけではない。
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表的であるが、これに限定
されるわけではない。
【００１４】ＤＮＡの宿主細胞への導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般的な方法、例えばベクタ
ーとしてファージを用いる場合は、宿主細胞にこれを感
染させる方法等により効率よく宿主にＤＮＡを組み込ま
せることができる。またプラスミドを用いる場合は、対
数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣｌ２処理して自然に
ＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミドを取り
込ませる方法等を採用できる。
形質転換の方法としては、一般的な方法、例えばベクタ
ーとしてファージを用いる場合は、宿主細胞にこれを感
染させる方法等により効率よく宿主にＤＮＡを組み込ま
せることができる。またプラスミドを用いる場合は、対
数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣｌ２処理して自然に
ＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミドを取り
込ませる方法等を採用できる。
【００１５】上記各方法及び引き続く各操作におけるＤ
ＮＡの化学合成、単離、精製等は何れも常法に従って行
なうことができる。また本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決
定等も通常の方法、例えばジデオキシ法［Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３−５４６
７（１９７７）］やマキサム−ギルバート法［Ｍａｘａ
ｍ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９−５
６０（１９８０）］等により行なうことができる。更
に、上記ＤＮＡ塩基配列の決定は、市販のシークエンス
キット等を用いることによっても容易に行ない得る。
ＮＡの化学合成、単離、精製等は何れも常法に従って行
なうことができる。また本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決
定等も通常の方法、例えばジデオキシ法［Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３−５４６
７（１９７７）］やマキサム−ギルバート法［Ｍａｘａ
ｍ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６５，４９９−５
６０（１９８０）］等により行なうことができる。更
に、上記ＤＮＡ塩基配列の決定は、市販のシークエンス
キット等を用いることによっても容易に行ない得る。
【００１６】また本発明遺伝子の利用によるバクテロイ
デス・フラジリスの同定及び診断のための方法として
は、サザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリ
ダイゼーション法［何れもＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．
Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３−５１７
（１９７５）］等を採用することができる。該方法で
は、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動に従い分画し、ゲルからニトロセルロースフィル
ターに移し取り、一方、目的とする遺伝子に対応するＤ
ＮＡを標識してプローブとし、このプローブをフィルタ
ー上の相補的な塩基配列を持つＤＮＡ断片とハイブダイ
ズさせて、ハイブリッドを形成させ、このハイブリッド
を形成するＤＮＡ断片をオートラジオグラフィー等で検
出する。
デス・フラジリスの同定及び診断のための方法として
は、サザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリ
ダイゼーション法［何れもＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．
Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０３−５１７
（１９７５）］等を採用することができる。該方法で
は、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をアガロースゲル電
気泳動に従い分画し、ゲルからニトロセルロースフィル
ターに移し取り、一方、目的とする遺伝子に対応するＤ
ＮＡを標識してプローブとし、このプローブをフィルタ
ー上の相補的な塩基配列を持つＤＮＡ断片とハイブダイ
ズさせて、ハイブリッドを形成させ、このハイブリッド
を形成するＤＮＡ断片をオートラジオグラフィー等で検
出する。
【００１７】更に本発明遺伝子の利用によるバクテロイ
デス・フラジリスの同定及び診断は、パルスフィールド
ゲル電気泳動によっても実施することができる。該方法
は、１９８２年にシュワルツら［Ｓｃｈｗａｒｔｚ，
Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４７，１
８９（１９８２）］によってそのプロトタイプが発表さ
れた比較的新しい実験技術であり、近年、巨大ＤＮＡの
標準的解析法として定着し、分子遺伝学、分子生物学等
の分野で多用されているものである。この方法に本発明
遺伝子を応用することによって、バクテロイデス・フラ
ジリスの同定及び診断が容易に行ない得る。
デス・フラジリスの同定及び診断は、パルスフィールド
ゲル電気泳動によっても実施することができる。該方法
は、１９８２年にシュワルツら［Ｓｃｈｗａｒｔｚ，
Ｄ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４７，１
８９（１９８２）］によってそのプロトタイプが発表さ
れた比較的新しい実験技術であり、近年、巨大ＤＮＡの
標準的解析法として定着し、分子遺伝学、分子生物学等
の分野で多用されているものである。この方法に本発明
遺伝子を応用することによって、バクテロイデス・フラ
ジリスの同定及び診断が容易に行ない得る。
【００１８】ＰＣＲ法は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ）でＤＮＡの特定領域をその領域の両端のセンス・ア
ンタイセンスプライマー、耐熱性のＴａｑポリメラー
ゼ、ＤＮＡ増幅システム等の組み合わせを用いて、約２
〜３時間で１０〜１００万倍に特異的に増幅することが
できる技術であり、基礎医学から臨床医学に亘って広範
囲に利用されつつある。本発明遺伝子及びその部分断片
は、このＰＣＲ法によって増幅可能であり、かくして増
幅されたＤＮＡの利用によって、上記バクテロイデス・
フラジリスの同定及び診断をより有利に行ない得る。
ｏ）でＤＮＡの特定領域をその領域の両端のセンス・ア
ンタイセンスプライマー、耐熱性のＴａｑポリメラー
ゼ、ＤＮＡ増幅システム等の組み合わせを用いて、約２
〜３時間で１０〜１００万倍に特異的に増幅することが
できる技術であり、基礎医学から臨床医学に亘って広範
囲に利用されつつある。本発明遺伝子及びその部分断片
は、このＰＣＲ法によって増幅可能であり、かくして増
幅されたＤＮＡの利用によって、上記バクテロイデス・
フラジリスの同定及び診断をより有利に行ない得る。
【００１９】上記した本発明遺伝子の製造のために利用
される起源微生物は、バクテロイデス・フラジリスに属
する限り特に限定されるものではなく、該属に属する公
知の各種保存株や、実際の臨床分野で患者より分離、同
定された分離株のいずれでもよい。また、上記起源微生
物から抽出されたゲノムＤＮＡを本発明遺伝子として含
む組換え体プラスミドの好ましい一具体例としては、後
記する実施例で製造されたｐＯＴ３０５４を例示でき
る。このプラスミドは、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号は「微工研菌寄第１
２３２６号（ＦＥＲＭＰ−１２３２６）」である。
される起源微生物は、バクテロイデス・フラジリスに属
する限り特に限定されるものではなく、該属に属する公
知の各種保存株や、実際の臨床分野で患者より分離、同
定された分離株のいずれでもよい。また、上記起源微生
物から抽出されたゲノムＤＮＡを本発明遺伝子として含
む組換え体プラスミドの好ましい一具体例としては、後
記する実施例で製造されたｐＯＴ３０５４を例示でき
る。このプラスミドは、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号は「微工研菌寄第１
２３２６号（ＦＥＲＭＰ−１２３２６）」である。
【００２０】本発明によれば、上記本発明のノイラミニ
ダーゼ遺伝子で形質転換された宿主細胞の培養によっ
て、所望のノイラミニダーゼを生産、蓄積できる。この
培養は、細菌培養に慣用される常法に従って行なうこと
ができ、その際用いられる培地としても、宿主細胞に応
じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば大腸
菌の場合は、ＬＢ培地等や之等にアンピシリン等を添加
した培地等を使用できる。
ダーゼ遺伝子で形質転換された宿主細胞の培養によっ
て、所望のノイラミニダーゼを生産、蓄積できる。この
培養は、細菌培養に慣用される常法に従って行なうこと
ができ、その際用いられる培地としても、宿主細胞に応
じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば大腸
菌の場合は、ＬＢ培地等や之等にアンピシリン等を添加
した培地等を使用できる。
【００２１】上記培養により、形質転換体の細胞内又は
細胞外に生産される所望のノイラミニダーゼは、その物
理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（例
えば「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５
９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社
東京化学同人発行参照）により分離、精製できる。該方
法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈殿剤による
処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル
濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロ
マトグラフィー操作や、透析法、之等の組み合わせ等を
例示できる。
細胞外に生産される所望のノイラミニダーゼは、その物
理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（例
えば「生化学データーブックＩＩ」、１１７５−１２５
９頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社
東京化学同人発行参照）により分離、精製できる。該方
法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈殿剤による
処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル
濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロ
マトグラフィー操作や、透析法、之等の組み合わせ等を
例示できる。
【００２２】上記により、容易に高収率、高純度で所望
のノイラミニダーゼを工業的規模で製造することができ
る。かくして得られるノイラミニダーゼは、血清等のシ
アル酸含有物質等の安定化に有用であり、また病原性の
解明等にも大きく貢献すると考えられる。
のノイラミニダーゼを工業的規模で製造することができ
る。かくして得られるノイラミニダーゼは、血清等のシ
アル酸含有物質等の安定化に有用であり、また病原性の
解明等にも大きく貢献すると考えられる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。
例を挙げる。
【００２４】
【実施例１】バクテロイデス・フラジリスのゲノムＤＮ
Ａライブラリーの作製 トーマスの方法［Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｈｏ
ｍａｓ，Ｊｒ．，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
１１，４７６−４９０（１９６５）］に従い、バクテロ
イデス・フラジリスのゲノムＤＮＡを抽出した。
Ａライブラリーの作製 トーマスの方法［Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．ａｎｄ Ｔｈｏ
ｍａｓ，Ｊｒ．，Ｃ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
１１，４７６−４９０（１９６５）］に従い、バクテロ
イデス・フラジリスのゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２５】ここで起源微生物としては、バクテロイデ
ス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＹＣＨ４６株
（山口県立中央病院分離株）を、ＧＡＭ培地（ニッスイ
社製）を用いて、３７℃で４８時間嫌気的に静置培養
後、培養液１００ｍｌを遠心・集菌（８０００ｒｐｍ、
１０分）して利用した。
ス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＹＣＨ４６株
（山口県立中央病院分離株）を、ＧＡＭ培地（ニッスイ
社製）を用いて、３７℃で４８時間嫌気的に静置培養
後、培養液１００ｍｌを遠心・集菌（８０００ｒｐｍ、
１０分）して利用した。
【００２６】上記起源微生物菌体を約１０１０細胞／ｍ
ｌになるように、ＳＳＣ−０．０１Ｍ−ＥＤＴＡに懸濁
させ、リゾチーム（最終濃度５００μｇ／ｍｌ）及びＳ
ＤＳ処理して溶菌し、プロテナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅ Ｋ）処理した後、フェノール抽出して、核酸分
画を得た。この核酸分画をＲＮａｓｅ処理してＲＮＡを
除去した後、エタノール沈殿法でＤＮＡ画分を得た。こ
れをゲノムＤＮＡとする。
ｌになるように、ＳＳＣ−０．０１Ｍ−ＥＤＴＡに懸濁
させ、リゾチーム（最終濃度５００μｇ／ｍｌ）及びＳ
ＤＳ処理して溶菌し、プロテナーゼＫ（ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｓｅ Ｋ）処理した後、フェノール抽出して、核酸分
画を得た。この核酸分画をＲＮａｓｅ処理してＲＮＡを
除去した後、エタノール沈殿法でＤＮＡ画分を得た。こ
れをゲノムＤＮＡとする。
【００２７】上記バクテロイデス・フラジリスのゲノム
ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩで部分分解後、コスミド
ベクターｐＨＣ７９（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）のＢａｍ
ＨＩ部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ
た。連結反応させた溶液（ライゲーション溶液）を、そ
のまま引き続いてインビトロパッケージング反応に利用
して反応させた。この反応はローゼンベルグらの方法
［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｔａｈｌ，Ｍ．
Ｍ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．ａｎｄ Ｓｔａｈｌ，
Ｗ．Ｆ．，Ｇｅｎｅ，３８，１６５−１７６（１９８
５）］に従って実施した。
ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩで部分分解後、コスミド
ベクターｐＨＣ７９（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社製）のＢａｍ
ＨＩ部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ
た。連結反応させた溶液（ライゲーション溶液）を、そ
のまま引き続いてインビトロパッケージング反応に利用
して反応させた。この反応はローゼンベルグらの方法
［Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍ．，Ｓｔａｈｌ，Ｍ．
Ｍ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．ａｎｄ Ｓｔａｈｌ，
Ｗ．Ｆ．，Ｇｅｎｅ，３８，１６５−１７６（１９８
５）］に従って実施した。
【００２８】かくして、バクテロイデス・フラジリスの
ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。
【００２９】
【実施例２】ノイラミニダーゼ活性を指標としたスクリ
ーニング 実施例１で作製したライゲーション溶液を、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株に形質導入し、アンピシ
リン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプ
トン１０ｇ／ｌ、バクトイースト抽出物５ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ１０ｇ／ｌ、バクトアガー１５ｇ／ｌ）に撒き、出
現してきた集落を、アンピシリン１５μｇ／ｍｌを含む
ＧＡＭ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養し
た。遠心・集菌（１２０００ｒｐｍ、１０分）後、ミネ
ラルソルーション［（９ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３４ｍＭ
ＮａＣｌ、１５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１２ｍＭ
（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２］１ｍｌに懸濁させた。更に
遠心・集菌（１２０００ｒｐｍ、１０分）した後、ミネ
ラルソルーション１００μｌに懸濁させた。得られた細
胞懸濁液を−７０℃で２時間凍結後、室温で融解し、更
に凍結融解を２回繰り返した。次に、１０％トライトン
Ｘ−１００を１０μｌ加えてボルテックスミキサーで１
０秒間攪拌後、遠心（１２０００ｒｐｍ、１０分）し、
上清を得た。この上清０．１ｍｌと、０．２Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）０．０５ｍｌ及び０．１２５ｍｇ／ｍ
ｌ４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ
−ノイラミン酸（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅ
ｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎ
ｉｃ ａｃｉｄ，４−ＭＵ−ＡＮＡ）０．０５ｍｌと
を、マイクロタイタープレートのウェル中で混合し、３
７℃で１〜２４時間保温後、マイクロプレートリーダー
（コロナ社製、ＭＦＩＩ）で測定した（励気波長３６５
ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）。
ーニング 実施例１で作製したライゲーション溶液を、大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１株に形質導入し、アンピシ
リン３０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプ
トン１０ｇ／ｌ、バクトイースト抽出物５ｇ／ｌ、Ｎａ
Ｃｌ１０ｇ／ｌ、バクトアガー１５ｇ／ｌ）に撒き、出
現してきた集落を、アンピシリン１５μｇ／ｍｌを含む
ＧＡＭ培地３ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養し
た。遠心・集菌（１２０００ｒｐｍ、１０分）後、ミネ
ラルソルーション［（９ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、３４ｍＭ
ＮａＣｌ、１５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１２ｍＭ
（ＣＨ２ＣＯＯＮａ）２］１ｍｌに懸濁させた。更に
遠心・集菌（１２０００ｒｐｍ、１０分）した後、ミネ
ラルソルーション１００μｌに懸濁させた。得られた細
胞懸濁液を−７０℃で２時間凍結後、室温で融解し、更
に凍結融解を２回繰り返した。次に、１０％トライトン
Ｘ−１００を１０μｌ加えてボルテックスミキサーで１
０秒間攪拌後、遠心（１２０００ｒｐｍ、１０分）し、
上清を得た。この上清０．１ｍｌと、０．２Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．０）０．０５ｍｌ及び０．１２５ｍｇ／ｍ
ｌ４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ
−ノイラミン酸（４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅ
ｒｙｌ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−α−Ｄ−ｎｅｕｒａｍｉｎ
ｉｃ ａｃｉｄ，４−ＭＵ−ＡＮＡ）０．０５ｍｌと
を、マイクロタイタープレートのウェル中で混合し、３
７℃で１〜２４時間保温後、マイクロプレートリーダー
（コロナ社製、ＭＦＩＩ）で測定した（励気波長３６５
ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）。
【００３０】上記により１５０クローンの中からノイラ
ミニダーゼ活性を有する１クローンを得た。また上記ノ
イラミニダーゼ活性を有する集落からコスミドを単離
し、これをｐＯＴ２６３３と命名した。
ミニダーゼ活性を有する１クローンを得た。また上記ノ
イラミニダーゼ活性を有する集落からコスミドを単離
し、これをｐＯＴ２６３３と命名した。
【００３１】
【実施例３】欠失解析 この操作は以下の通り行なわれたものであり、その概略
及びそれにより得られるコスミド及びプラスミドの特徴
を図１に示すと共に、得られた組換え体のノイラミニダ
ーゼ活性を図２に示す。
及びそれにより得られるコスミド及びプラスミドの特徴
を図１に示すと共に、得られた組換え体のノイラミニダ
ーゼ活性を図２に示す。
【００３２】図１及び図２における制限酵素、制限酵素
開裂部位、その他の略号はそれぞれ次のことを示す。
Ｂ，Ｂａｍ：ＢａｍＨＩ、Ｋ，Ｋｐｎ：ＫｐｎＩ、Ｐ，
Ｐｓｔ：ＰｓｔＩ、Ｓ，ｓａｌ：ｓａｌＩ、Ｘ，Ｘｈ
ｏ：ＸｈｏＩ、Ａ：ＡｃｃＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｃ：Ｃ
ｌａＩ、Ｐｖ：ＰｖｕＩＩ、Ｐｓ：ＰｓｔＩ、ｎａｎ
Ｈ：ノイラミニダーゼ遺伝子、ｂｌａ：βラクタマーゼ
遺伝子、ｃａｔ：クロラムフェニコール アセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、ｌａｃ：乳糖分解遺伝子、ｌａ
ｃＰ：乳糖分解遺伝子プロモーター。
開裂部位、その他の略号はそれぞれ次のことを示す。
Ｂ，Ｂａｍ：ＢａｍＨＩ、Ｋ，Ｋｐｎ：ＫｐｎＩ、Ｐ，
Ｐｓｔ：ＰｓｔＩ、Ｓ，ｓａｌ：ｓａｌＩ、Ｘ，Ｘｈ
ｏ：ＸｈｏＩ、Ａ：ＡｃｃＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｃ：Ｃ
ｌａＩ、Ｐｖ：ＰｖｕＩＩ、Ｐｓ：ＰｓｔＩ、ｎａｎ
Ｈ：ノイラミニダーゼ遺伝子、ｂｌａ：βラクタマーゼ
遺伝子、ｃａｔ：クロラムフェニコール アセチルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、ｌａｃ：乳糖分解遺伝子、ｌａ
ｃＰ：乳糖分解遺伝子プロモーター。
【００３３】まず、実施例２で得たｐＯＴ２６３３を制
限酵素ＳａｌＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
させた。かくして得られた組換え体から得られるコスミ
ドをｐＯＴ３００１と命名した。
限酵素ＳａｌＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
させた。かくして得られた組換え体から得られるコスミ
ドをｐＯＴ３００１と命名した。
【００３４】次に上記ｐＯＴ３００１を制限酵素Ｓａｌ
Ｉで切断後、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む断片をｐＨ
ＳＧ３９９（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト
の中にあるＳａｌＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結反応させ、反応物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換させた。かくして得られた組換え体から得られるプラ
スミドをｐＯＴ３０１０と命名した。
Ｉで切断後、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む断片をｐＨ
ＳＧ３９９（宝酒造社製）のマルチクローニングサイト
の中にあるＳａｌＩサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結反応させ、反応物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転
換させた。かくして得られた組換え体から得られるプラ
スミドをｐＯＴ３０１０と命名した。
【００３５】また上記ｐＯＴ３０１０を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応さ
せ、連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。か
くして得られた組換え体から得られるプラスミドをｐＯ
Ｔ３０１４と命名した。
ＨＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応さ
せ、連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。か
くして得られた組換え体から得られるプラスミドをｐＯ
Ｔ３０１４と命名した。
【００３６】上記ｐＯＴ３０１４を制限酵素ＫｐｎＩで
切断し、Ｍｕｎｇ ｂｅｅｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理
後、制限酵素ＸｈｏＩで切断して得られる断片を、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（ストラトジェン（ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）社製）のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ部位にＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応物で大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換させた。かくして得られた組換
え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０５４と命名し
た。
切断し、Ｍｕｎｇ ｂｅｅｎ Ｎｕｃｌｅａｓｅ処理
後、制限酵素ＸｈｏＩで切断して得られる断片を、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋（ストラトジェン（ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ）社製）のＳｍａＩ−ＸｈｏＩ部位にＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応物で大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換させた。かくして得られた組換
え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０５４と命名し
た。
【００３７】またｐＯＴ３０１０を制限酵素ＰｓｔＩで
切断し、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む断片をｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋のマルチクローニングサイトの中
にあるＰｓｔＩサイトに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
させた。かくして得られた組換え体から得られるプラス
ミドをｐＯＴ３０２０及びｐＯＴ３０１６と命名した。
切断し、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む断片をｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋のマルチクローニングサイトの中
にあるＰｓｔＩサイトに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結反応させ、連結物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換
させた。かくして得られた組換え体から得られるプラス
ミドをｐＯＴ３０２０及びｐＯＴ３０１６と命名した。
【００３８】上記ｐＯＴ３０２０を制限酵素ＫｐｎＩで
切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反
応物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。かくして
得られた組換え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０
３０と命名した。
切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反
応物で大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換させた。かくして
得られた組換え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０
３０と命名した。
【００３９】上記各操作により得られたｐＯＴ３０１
４、ｐＯＴ３０３７、ｐＯＴ３０３４、ｐＯＴ３０１
６、ｐＯＴ３０２０、ｐＯＴ３０３０、ｐＯＴ３０４
５、ｐＯＴ３０４７、ｐＯＴ３０５１及びｐＯＴ３０５
４のそれぞれを有する大腸菌ＨＢ１０１株組換え体につ
き、それぞれのノイラミニダーゼ活性を実施例２と同様
にして測定した結果を、図２に示す。
４、ｐＯＴ３０３７、ｐＯＴ３０３４、ｐＯＴ３０１
６、ｐＯＴ３０２０、ｐＯＴ３０３０、ｐＯＴ３０４
５、ｐＯＴ３０４７、ｐＯＴ３０５１及びｐＯＴ３０５
４のそれぞれを有する大腸菌ＨＢ１０１株組換え体につ
き、それぞれのノイラミニダーゼ活性を実施例２と同様
にして測定した結果を、図２に示す。
【００４０】上記図２より、ｐＯＴ３０５４を有する組
換え体がノイラミニダーゼ活性を示すことから、ノイラ
ミニダーゼ遺伝子はＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片中に存在す
るものと認められた。
換え体がノイラミニダーゼ活性を示すことから、ノイラ
ミニダーゼ遺伝子はＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片中に存在す
るものと認められた。
【００４１】
【実施例４】ＤＮＡ塩基配列の決定 本発明ノイラミニダーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を、Ｅ
ＸＯ／Ｍｕｎｇ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ストラト
ジェン社製）及びＭ１３シークエンシングキット（ニッ
ポンジーン社製）を用いて、ジデオキシシークエンス法
に従って調べた。
ＸＯ／Ｍｕｎｇ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ストラト
ジェン社製）及びＭ１３シークエンシングキット（ニッ
ポンジーン社製）を用いて、ジデオキシシークエンス法
に従って調べた。
【００４２】その結果、本発明ノイラミニダーゼ遺伝子
は、３９６個のアミノ酸をコードする１１８８塩基対の
ＤＮＡ領域であることが確認された。その配列は、配列
番号：１に示す通りである。
は、３９６個のアミノ酸をコードする１１８８塩基対の
ＤＮＡ領域であることが確認された。その配列は、配列
番号：１に示す通りである。
【００４３】
【実施例５】サザンハイブリダイゼーションによるバク
テロイデス・フラジリスの検出 （５−１） ＤＮＡプローブの調製 ｐＯＴ３０５４から、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む３
２８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩＤＮＡ断片を切り出
し、この断片をｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ ＫＳＩＩ＋のマ
ルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩサイ
トに挿入して、ｐＫＳＥＣ１を作製した。これをプロー
ブとして用いた。
テロイデス・フラジリスの検出 （５−１） ＤＮＡプローブの調製 ｐＯＴ３０５４から、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む３
２８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩＤＮＡ断片を切り出
し、この断片をｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ ＫＳＩＩ＋のマ
ルチクローニングサイト中のＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩサイ
トに挿入して、ｐＫＳＥＣ１を作製した。これをプロー
ブとして用いた。
【００４４】該プローブのＤＮＡ塩基配列は、配列番
号：１に示すノイラミニダーゼ遺伝子の第３２９番目〜
第６５６番目のＤＮＡ塩基配列に合致するものであっ
た。
号：１に示すノイラミニダーゼ遺伝子の第３２９番目〜
第６５６番目のＤＮＡ塩基配列に合致するものであっ
た。
【００４５】また、上記プローブの標識は、ＤＮＡラベ
リングキット（ニッポンジーン社製）を用いて行なっ
た。
リングキット（ニッポンジーン社製）を用いて行なっ
た。
【００４６】（５−２） パルスフィールドゲル電気泳
動法 供試菌として以下のものを用いた。 １．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＮ２９５株（バ
イオ・ラッド社の市販ゲルブロック使用） ２．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＹＣＨ４６株（山口県立中央病院分離株） ３．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＧＡＩ０６２４株（岐阜大学医学部付属嫌気性菌実
験施設） ４．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＡＴＣＣ２５２８５株（ＡＴＣＣ保存株） ５．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＫＭＳ１株（香川医科大学分離株） ６．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＹＣＨ２１株（山口県立中央病院分離株） ７．バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ．ｔ
ｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）５４８２株（ＶＰＩ
５４８２株、ＡＴＣＣ ２９１４８株、Ｗｅｒｎｅｒ
Ｅ５０株及びＮＣＴＣ １０５８２株に同じ） ８．バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）ＢＵ１００１株（ＶＰＩ １００１株に同
じ）
動法 供試菌として以下のものを用いた。 １．サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＮ２９５株（バ
イオ・ラッド社の市販ゲルブロック使用） ２．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＹＣＨ４６株（山口県立中央病院分離株） ３．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＧＡＩ０６２４株（岐阜大学医学部付属嫌気性菌実
験施設） ４．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＡＴＣＣ２５２８５株（ＡＴＣＣ保存株） ５．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＫＭＳ１株（香川医科大学分離株） ６．バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉ
ｓ）ＹＣＨ２１株（山口県立中央病院分離株） ７．バクテロイデス・シータイオタオミクロン（Ｂ．ｔ
ｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）５４８２株（ＶＰＩ
５４８２株、ＡＴＣＣ ２９１４８株、Ｗｅｒｎｅｒ
Ｅ５０株及びＮＣＴＣ １０５８２株に同じ） ８．バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）ＢＵ１００１株（ＶＰＩ １００１株に同
じ）
【００４７】上記菌株を用いて、集菌・洗浄後の各菌体
をアガロースに封入（５×１０８細胞／ｍｌ）してゲル
ブロックとした。このゲルブロック中で菌体をリゾチー
ムにより溶菌させ、次にプロテイナーゼＫ処理して除蛋
白を行なった。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ
Ｉで切断し、ＣＨＥＦ−ＤＲ（Ｃｌａｍｐｅｄ Ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｄ
ｙｎａｍｉｃａｌｌｙＲｅｇｕｌａｔｅｄ，バイオ・ラ
ッド社製）［Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３４，１５８２（１９８２）］を用いて、パルス
フィールドゲル電気泳動を行ない、各断片を分離した。
泳動後、トランスイルミネーターの上にゲルを置き、写
真撮影した。
をアガロースに封入（５×１０８細胞／ｍｌ）してゲル
ブロックとした。このゲルブロック中で菌体をリゾチー
ムにより溶菌させ、次にプロテイナーゼＫ処理して除蛋
白を行なった。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ
Ｉで切断し、ＣＨＥＦ−ＤＲ（Ｃｌａｍｐｅｄ Ｈｏｍ
ｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｉｅｌｄ−Ｄ
ｙｎａｍｉｃａｌｌｙＲｅｇｕｌａｔｅｄ，バイオ・ラ
ッド社製）［Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３４，１５８２（１９８２）］を用いて、パルス
フィールドゲル電気泳動を行ない、各断片を分離した。
泳動後、トランスイルミネーターの上にゲルを置き、写
真撮影した。
【００４８】得られた結果を図３に示す。
【００４９】図においてレーン１はｌａｍｂｄａ ｌａ
ｄｄｅｒ（分子量マーカー）を示し、またレーン２〜９
はそれぞれ上記供試菌１〜８を示す。
ｄｄｅｒ（分子量マーカー）を示し、またレーン２〜９
はそれぞれ上記供試菌１〜８を示す。
【００５０】（５−３）サザンハイブリダイゼーション 上記（５−２）で写真撮影後のゲルを、０．２５Ｎ塩酸
溶液に２０分間浸漬した。次に、塩酸溶液を捨て変性溶
液（０．５Ｎ ＮａＯＨ＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）を加
え、室温で４０分間振盪後、変性液を捨て中和液（０．
５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ）を加え４０分間振盪した。更に、ゲルからＤＮＡ断
片をナイロンメンブランフィルターに移行させた。フィ
ルターを風乾後、８０℃のオーブン中に２時間入れてＤ
ＮＡをフィルターに固定した。シールバックにベーキン
グしたフィルターを入れ、ハイブリダイゼーション緩衝
液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１００〜２００
μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（５分間煮沸後氷水で急冷し
たもの）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、
０．１％ＳＤＳ及び１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）を加え、入れ口をポリシーラーで閉じた
後、４２℃で３時間保温した。次にシールバックの一部
を切り、緩衝液を捨て、新しい緩衝液に熱処理し急冷し
たプローブを入れ、空気が入らないようにシールし、４
２℃で１２時間保温した。フィルターを取り出し、２×
ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液で１０分間３回洗浄した。
更に、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液中で５６〜
６０℃で１時間洗浄した。フィルターを乾燥後、−８０
℃で増感紙存在下にオートラジオグラフィーを行なっ
た。
溶液に２０分間浸漬した。次に、塩酸溶液を捨て変性溶
液（０．５Ｎ ＮａＯＨ＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）を加
え、室温で４０分間振盪後、変性液を捨て中和液（０．
５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ）を加え４０分間振盪した。更に、ゲルからＤＮＡ断
片をナイロンメンブランフィルターに移行させた。フィ
ルターを風乾後、８０℃のオーブン中に２時間入れてＤ
ＮＡをフィルターに固定した。シールバックにベーキン
グしたフィルターを入れ、ハイブリダイゼーション緩衝
液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１００〜２００
μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（５分間煮沸後氷水で急冷し
たもの）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、
０．１％ＳＤＳ及び１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ′ｓ ｓｏ
ｌｕｔｉｏｎ）を加え、入れ口をポリシーラーで閉じた
後、４２℃で３時間保温した。次にシールバックの一部
を切り、緩衝液を捨て、新しい緩衝液に熱処理し急冷し
たプローブを入れ、空気が入らないようにシールし、４
２℃で１２時間保温した。フィルターを取り出し、２×
ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液で１０分間３回洗浄した。
更に、０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ溶液中で５６〜
６０℃で１時間洗浄した。フィルターを乾燥後、−８０
℃で増感紙存在下にオートラジオグラフィーを行なっ
た。
【００５１】上記結果を図３と同様にして図４（レーン
Ｎｏ．は図３と同じ）に示す。
Ｎｏ．は図３と同じ）に示す。
【００５２】図３と図４との対比より、レーン３〜７に
示すバクテロイデス・フラジリスの５株では、いずれも
プローブとハイブリダイズする約１３０ｋｂのバンドが
検出されたが、レーン８に示すバクテロイデス・シータ
イオタオミクロン及びレーン９に示すバクテロイデス・
ユニフォルミスでは、プローブとハイブリダイズするバ
ンドは検出されないことが明らかである。このことか
ら、ノイラミニダーゼのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片を含
むプローブｐＫＳＣ１は、非常に特異性が高くバクテロ
イデス・フラジリスの同定、診断に有用であることが判
る。
示すバクテロイデス・フラジリスの５株では、いずれも
プローブとハイブリダイズする約１３０ｋｂのバンドが
検出されたが、レーン８に示すバクテロイデス・シータ
イオタオミクロン及びレーン９に示すバクテロイデス・
ユニフォルミスでは、プローブとハイブリダイズするバ
ンドは検出されないことが明らかである。このことか
ら、ノイラミニダーゼのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片を含
むプローブｐＫＳＣ１は、非常に特異性が高くバクテロ
イデス・フラジリスの同定、診断に有用であることが判
る。
【００５３】
【実施例６】（６−１）ドットブロットハイブリダイゼ
ーションによるバクテロイデス・フラジリスの検出 培養液０．１ｍｌをドットブロット装置（バイオ・ラッ
ド社製）を用いて菌体をナイロンメンブランフィルター
に吸着させた。このフィルターを変性溶液（実施例５−
３に同じ）に浸した濾紙上に、菌体側を上にして１０分
間放置した。次に中和液（実施例５−３に同じ）に浸し
た濾紙上に、５分間放置した。フィルターを風乾後、８
０℃のオーブン中に２時間入れ、ＤＮＡをフィルターに
固定した。ハイブリダイゼーション、プローブの調製
は、実施例５の方法に従った。
ーションによるバクテロイデス・フラジリスの検出 培養液０．１ｍｌをドットブロット装置（バイオ・ラッ
ド社製）を用いて菌体をナイロンメンブランフィルター
に吸着させた。このフィルターを変性溶液（実施例５−
３に同じ）に浸した濾紙上に、菌体側を上にして１０分
間放置した。次に中和液（実施例５−３に同じ）に浸し
た濾紙上に、５分間放置した。フィルターを風乾後、８
０℃のオーブン中に２時間入れ、ＤＮＡをフィルターに
固定した。ハイブリダイゼーション、プローブの調製
は、実施例５の方法に従った。
【００５４】下記表１に示す臨床検査室で従来用いられ
ている培養法でバクテロイデス・フラジリスと同定され
た臨床分離株６２株、バクテロイデス・フラジリスの保
存株、他の各種の嫌気性菌（保存株）につき、上記試験
を行なった。
ている培養法でバクテロイデス・フラジリスと同定され
た臨床分離株６２株、バクテロイデス・フラジリスの保
存株、他の各種の嫌気性菌（保存株）につき、上記試験
を行なった。
【００５５】
【表１】
【００５６】尚、表中の各菌種は次のものを示す。Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＹＣＨ１
〜ＹＣＨ５０：山口県立中央病院分離株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＫＭＳ１
〜ＫＭＳ９：香川医科大学分離株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＵＴＨ１
〜ＵＴＨ３：徳島大学中検分離株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃ
ｒｏｎ ５４８２：ＶＰＩ ５４８２株、ＡＴＣＣ ２
９１４８株、Ｗｅｒｎｅｒ Ｅ５０株及びＮＣＴＣ １
０５８２株に同じ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ １００
１：ＶＰＩ １００１株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣ
Ｃ ８４９２：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔ．，３
０，２６１（１９８０）：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃ
ｔ．，２３，７０（１９７３）参照Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ ＡＴＣＣ ８
４８３：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔ．，２６，２３
０（１９７６）参照Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ ＡＴＣ
Ｃ ２７７５４：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔ．，２
４，２７２（１９７４）参照 得られた結果を図５に示す。
〜ＹＣＨ５０：山口県立中央病院分離株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＫＭＳ１
〜ＫＭＳ９：香川医科大学分離株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ ＵＴＨ１
〜ＵＴＨ３：徳島大学中検分離株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃ
ｒｏｎ ５４８２：ＶＰＩ ５４８２株、ＡＴＣＣ ２
９１４８株、Ｗｅｒｎｅｒ Ｅ５０株及びＮＣＴＣ １
０５８２株に同じ）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ １００
１：ＶＰＩ １００１株Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣ
Ｃ ８４９２：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔ．，３
０，２６１（１９８０）：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃ
ｔ．，２３，７０（１９７３）参照Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ ＡＴＣＣ ８
４８３：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔ．，２６，２３
０（１９７６）参照Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｅｇｇｅｒｔｈｉｉ ＡＴＣ
Ｃ ２７７５４：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓ．Ｂａｃｔ．，２
４，２７２（１９７４）参照 得られた結果を図５に示す。
【００５７】図５より、臨床分離株６２株及びバクテロ
イデス・フラジリスの保存株は、すべて陽性の結果を与
えた。これに対してバクテロイデス・フラジリス以外の
嫌気性菌（保存株）は、いずれも陰性であった。このこ
とからも、本発明ノイラミニダーゼ遺伝子の断片を含む
プローブは、バクテロイデス・フラジリスの同定、診断
に有用であることが判る。
イデス・フラジリスの保存株は、すべて陽性の結果を与
えた。これに対してバクテロイデス・フラジリス以外の
嫌気性菌（保存株）は、いずれも陰性であった。このこ
とからも、本発明ノイラミニダーゼ遺伝子の断片を含む
プローブは、バクテロイデス・フラジリスの同定、診断
に有用であることが判る。
【００５８】（６−２）ドットブロットハイプリダイゼ
ーションによるバクテロイデス・フラジリスの検出 実施例６−１の方法に従って、下記表２に示す好気性菌
について、同一試験を実施した。
ーションによるバクテロイデス・フラジリスの検出 実施例６−１の方法に従って、下記表２に示す好気性菌
について、同一試験を実施した。
【００５９】
【表２】
【００６０】尚、表中の各菌種は前記表１と同じである
か又は次のものを示す。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｇｉｎｏｓａ ＵＴＣ
５５：徳島大学中検分離株Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ２０９
Ｐ：ＦＤＡＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｎ ＫＵ
Ｂ ２９：九州大学医学部細菌学教室 得られた結果を図６に示す。
か又は次のものを示す。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｇｉｎｏｓａ ＵＴＣ
５５：徳島大学中検分離株Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ２０９
Ｐ：ＦＤＡＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｎ ＫＵ
Ｂ ２９：九州大学医学部細菌学教室 得られた結果を図６に示す。
【００６１】図６より、試験したすべての好気性菌（保
存株）は、いずれも陰性であった。このことからも、本
発明ノイラミニダーゼ遺伝子の断片を含むプローブは、
バクテロイデス・フラジリスに対して特異的であること
が判る。
存株）は、いずれも陰性であった。このことからも、本
発明ノイラミニダーゼ遺伝子の断片を含むプローブは、
バクテロイデス・フラジリスに対して特異的であること
が判る。
【００６２】
【実施例７】ＰＣＲ法によるバクテロイデス・フラジリ
スの検出 ＰＣＲ法はパーキン・エルマー・シータス社のＤＮＡ増
幅システム（ＤＮＡサーマルサイクラー）を用いて実施
した。遺伝子増幅試薬としては、同社のＤＮＡ試薬キッ
ト（商品名：Ｇｅｎｅ Ａｍｐ）を用いた。遺伝子増幅
に用いた合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置
（アプライド・バイオシステム社製）で合成したもので
あり、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）にて
精製後利用した。
スの検出 ＰＣＲ法はパーキン・エルマー・シータス社のＤＮＡ増
幅システム（ＤＮＡサーマルサイクラー）を用いて実施
した。遺伝子増幅試薬としては、同社のＤＮＡ試薬キッ
ト（商品名：Ｇｅｎｅ Ａｍｐ）を用いた。遺伝子増幅
に用いた合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置
（アプライド・バイオシステム社製）で合成したもので
あり、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）にて
精製後利用した。
【００６３】遺伝子増幅用プライマーとしては、プライ
マー１（配列番号：３）及びプライマー２（配列番号：
４）を用い、７６３ｂｐの断片を増幅した。反応液とし
ては次の組成のものを用いた。 （１０×）Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （１×） ｄＮＴＰｓＭｉｘ，１．２５ｍＭ ２００μＭ プライマー１ １．０μＭ プライマー２ １．０μＭ ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５Ｕ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌ 全量 １００μｌ ９４℃で０．５分、５５℃で０．５分及び７２℃で２分
の保温を１サイクルとして、３０サイクル行なって、遺
伝子を増幅させた。
マー１（配列番号：３）及びプライマー２（配列番号：
４）を用い、７６３ｂｐの断片を増幅した。反応液とし
ては次の組成のものを用いた。 （１０×）Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ （１×） ｄＮＴＰｓＭｉｘ，１．２５ｍＭ ２００μＭ プライマー１ １．０μＭ プライマー２ １．０μＭ ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２．５Ｕ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ５０μｌ 全量 １００μｌ ９４℃で０．５分、５５℃で０．５分及び７２℃で２分
の保温を１サイクルとして、３０サイクル行なって、遺
伝子を増幅させた。
【００６４】細胞数が０、２×１０１、２×１０２、２
×１０３、２×１０４、２×１０５、２×１０６及び２
×１０７になるように調製した細胞懸濁液５０μｌを５
分間煮沸して、ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎとした。
×１０３、２×１０４、２×１０５、２×１０６及び２
×１０７になるように調製した細胞懸濁液５０μｌを５
分間煮沸して、ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎとした。
【００６５】ＰＣＲ反応後、反応液１０μｌをナイロン
メンブランフィルターにスポットし、風乾後、８０℃の
オーブン中に１時間入れてＤＮＡを固定した。ハイブリ
ダイゼーション、プローブの調製は実施例５の方法に従
った。
メンブランフィルターにスポットし、風乾後、８０℃の
オーブン中に１時間入れてＤＮＡを固定した。ハイブリ
ダイゼーション、プローブの調製は実施例５の方法に従
った。
【００６６】上記ハイブリダイゼーションの結果を図７
に示す。
に示す。
【００６７】図においてカラムＡはＰＣＲ反応を行なっ
たｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎをスポット
したものを示し、カラムＢは同ＰＣＲ反応を行なわなか
ったｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎをスポッ
トしたものを示す。
たｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎをスポット
したものを示し、カラムＢは同ＰＣＲ反応を行なわなか
ったｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｓｏｌｕｔｉｏｎをスポッ
トしたものを示す。
【００６８】図よりＰＣＲ反応を用いれば、細胞数２×
１０１においても、バクテロイデス・フラジリスが検出
可能であることが判る。
１０１においても、バクテロイデス・フラジリスが検出
可能であることが判る。
【００６９】配列番号：１ 配列の長さ：１１９１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源：ノイラミニダーゼ遺伝子 生物名：Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ
ＹＣＨ４６株 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ 存在位置：１−１１８８ 特徴を決定した方法：Ｅ
ＹＣＨ４６株 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ 存在位置：１−１１８８ 特徴を決定した方法：Ｅ
【００７０】配列番号：２ 配列の長さ：３９６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白
【００７１】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：１−１７ 特徴を決定した方法：Ｅ
【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置：１−１７ 特徴を決定した方法：Ｅ
【図１】実施例３に従うコスミド及びプラスミド構築の
概略図を示す。
概略図を示す。
【図２】実施例３に従い得られた組換え体の特徴及びノ
イラミニダーゼ活性を調べた結果を示す。
イラミニダーゼ活性を調べた結果を示す。
【図３】実施例５−２に従うパルスフィールドゲル電気
泳動結果を示す図面に代わる写真である。
泳動結果を示す図面に代わる写真である。
【図４】実施例５−３に従うサザンハイブリダイゼーシ
ョンのオートラジオグラフィーの結果を示す図面に代わ
る写真である。
ョンのオートラジオグラフィーの結果を示す図面に代わ
る写真である。
【図５】実施例６−１に従うバクテロイデス・フラジリ
ス及びその他の供試菌につき行なわれたドットブロット
ハイダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真であ
る。
ス及びその他の供試菌につき行なわれたドットブロット
ハイダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真であ
る。
【図６】実施例６−２に従うバクテロイデス・フラジリ
ス及びその他の供試菌につき行なわれたドットブロット
ハイダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真であ
る。
ス及びその他の供試菌につき行なわれたドットブロット
ハイダイゼーションの結果を示す図面に代わる写真であ
る。
【図７】実施例７に従うバクテロイデス・フラジリスの
検出のためのＰＣＲ法によるハイダイゼーションの結果
を示す図面に代わる写真である。
検出のためのＰＣＲ法によるハイダイゼーションの結果
を示す図面に代わる写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】配列番号：１で表わされる塩基配列を有す
ることを特徴とするバクテロイデス・フラジリスのノイ
ラミニダーゼ遺伝子。 - 【請求項２】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
有することを特徴とするバクテロイデス・フラジリスの
ノイラミニダーゼ。 - 【請求項３】請求項１に記載のノイラミニダーゼ遺伝子
の全部又は一部を用いることを特徴とするバクテロイデ
ス・フラジリスの同定及び診断法。 - 【請求項４】ノイラミニダーゼ遺伝子の一部としてＥｃ
ｏＲＩ−ＣｌａＩ断片を用いる請求項３に記載の同定及
び診断法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3269931A JPH0646865A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | ノイラミニダーゼ遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3269931A JPH0646865A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | ノイラミニダーゼ遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646865A true JPH0646865A (ja) | 1994-02-22 |
Family
ID=17479196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3269931A Pending JPH0646865A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | ノイラミニダーゼ遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0646865A (ja) |
-
1991
- 1991-07-17 JP JP3269931A patent/JPH0646865A/ja active Pending
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