JPH08131174A - ノイラミニダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】本発明は、配列番号：１で表わされる塩基配列
を有するバクテロイデス・フラジリスのノイラミニダー
ゼ遺伝子、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を有
するバクテロイデス・フラジリスのノイラミニダーゼ、
及び上記ノイラミニダーゼ遺伝子の全部又は一部を利用
するバクテロイデス・フラジリスの同定及び診断法を提
供する。 【効果】本発明のノイラミニダーゼ遺伝子は、バクテロ
イデス・フラジリスのノイラミニダーゼの遺伝子工学的
手法による製造及びバクテロイデス・フラジリスの同定
及び診断に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、グラム陰性嫌気性桿菌
であるバクテロイデス・フラジリス（Bacteroides frag
ilis）のノイラミニダーゼ（Neuraminidase ）及びその
遺伝子とその利用、特に上記ノイラミニターゼ遺伝子を
用いたバクテロイデス・フラジリスの同定及び診断法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】バクテロイデス（Bacteroi des)属の菌種
の内でもフラジリス (B. fragilis)は、その腸管内に占
められる割合がさほど大きくないにもかかわらず、病巣
から分離される頻度の最も高い菌種の一つであり、該菌
種には他の菌種の持たない病原因子が存在すると考えら
れている。また該菌種は他のバクテロイデス属と比較し
て、著しく高いノイラミニダーゼ活性を有しており、こ
の酵素が本菌種の病原性因子の一つである可能性が強く
示唆されている。

【０００３】一方、近年病原微生物の同定、診断に病原
因子の遺伝子に由来するＤＮＡをプローブとして用いる
方法や、ＰＣＲ法(Polymerase chain reaction）により
増幅された上記ＤＮＡを用いる方法が取り入れられてき
ている。上記バクテロイデス・フラジリスのＤＮＡ診断
についても、分離株とバクテロイデス基準株との定量
的ハイブリダイゼーション［Roberts, M. C. et al.,
J. Gen. Microbiol., 133, 1423-1430 (1987)］や、
ランダムＤＮＡをプローブとして用いる方法［Kuritza,
A. P. et al., J. Clin. Microbiol., 23, 343-349 (1
986) : Groves, D. J. and Clark, V., Diagn. Microbi
ol. Infect. Dis., 7, 273-278 (1987) ］が試みられて
いる。しかし、上記の方法では分離株のＤＮＡを調整
して標識せねばならないので、この方法自体腹水や血液
等の検査材料から直接本菌種を検出する目的には用いる
ことができない。また上記の方法ではプローブがいか
なる遺伝子に由来するのか明らかでないので、該方法自
体特異性に問題がある。

【０００４】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、バ
クテロイデス・フラジリスの病原因子と考えられるノイ
ラミニダーゼ及びその遺伝子を解明し、該遺伝子を利用
して上記微生物を同定、診断する技術を提供することに
ある。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研
究の結果、バクテロイデス・フラジリスのノイラミニダ
ーゼ遺伝子の単離に成功すると共に、この遺伝子を利用
して上記微生物の同定、診断にも成功し、ここに本発明
を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明によれば、配列番号：１で表
わされる塩基配列を有するバクテロイデス・フラジリス
のノイラミニダーゼ遺伝子、配列番号：２で表わされる
アミノ酸配列を有するバクテロイデス・フラジリスのノ
イラミニダーゼ、及び上記ノイラミニダーゼ遺伝子の全
部又は一部を用いることを特徴とするバクテロイデス・
フラジリスの同定及び診断法が提供される。

【０００７】本明細書において、アミノ酸配列及び塩基
配列の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定乃
至当該分野における通称又は慣用に従うものとする。

【０００８】本発明に係わるノイラミニダーゼ遺伝子
は、配列番号：１で表わされる塩基配列を有する点にお
いて、また本発明のノイラミニダーゼは、配列番号：２
で表わされるアミノ酸配列を有する点において、それぞ
れ特徴付けられるが、これら以外に例えば上記アミノ酸
配列のＮ端に位置するメチオニン(Met) が欠損したも
の、シグナルペプチド部分の全部又は一部が欠損したも
の等や、天然に見られる翻訳後の修飾や遺伝子工学的手
法による配列の改変（付加、欠損、置換等）等がなされ
たノイラミニダーゼ同効物及びそれらの遺伝子もまた本
発明に包含される。上記遺伝子工学的手法としては、公
知の各種方法、例えばサイトスペシフィック・ミュータ
ゲネシスによるＤＮＡの改変やホスファイト・トリエス
テル法等によるＤＮＡの変異等が包含される。

【０００９】本発明ノイラミニダーゼ遺伝子は、これを
利用して遺伝子組換え技術により所望のノイラミニダー
ゼを製造できるだけでなく、該遺伝子の一部をプローブ
として用いて、バクテロイデス・フラジリスの特異的同
定、診断を可能とし、またＰＣＲ法により容易に該遺伝
子の増幅・検出を行なうことができ、該ＰＣＲ法による
遺伝子増幅用プライマーとしても、本発明ノイラミニダ
ーゼ遺伝子の一部分が有利に利用できる。従って、本発
明は、かかるＤＮＡプローブやＰＣＲ用プライマーとし
てのノイラミニダーゼ遺伝子の部分断片をも提供するも
のである。

【００１０】本発明遺伝子の製造及びこれを利用してノ
イラミニダーゼを製造する方法につき詳述すれば、該方
法は一般的手法に従って、バクテロイデス・フラジリス
からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝子ライブラリーを作製
し、その中から目的ＤＮＡを選出し、これを宿主細胞に
導入し、該細胞を培養することにより実施できる。

【００１１】上記において、バクテロイデス・フラジリ
スからゲノムＤＮＡの抽出は、例えばトーマスの方法
［Berns, K. I. and Thomas, Jr., C. A., J. Mol. Bio
l., 11, 476-490 (1965)］に従うことができる。

【００１２】遺伝子ライブラリーは、通常用いられてい
るプラスミドベクターやラムダファージ由来のベクター
等を用いたり、ファージとプラスミドの両方の性質を兼
ね備えたより大きいＤＮＡ断片がクローニングできるコ
スミドベクター等を用いて、通常の方法に従い作製する
ことができる。

【００１３】宿主細胞としては、大腸菌（Escherichia
coli）が代表的であるが、これに限定されるわけではな
い。

【００１４】ＤＮＡの宿主細胞への導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般的な方法、例えばベクタ
ーとしてファージを用いる場合は、宿主細胞にこれを感
染させる方法等により効率よく宿主にＤＮＡを組み込ま
せることができる。またプラスミドを用いる場合は、対
数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣｌ₂ 処理して自然に
ＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミドを取り
込ませる方法等を採用できる。

【００１５】上記各方法及び引き続く各操作におけるＤ
ＮＡの化学合成、単離、精製等は何れも常法に従って行
なうことができる。また本発明遺伝子のＤＮＡ配列の決
定等も通常の方法、例えばジデオキシ法［Sanger, F. e
t a l., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.,7 4, 5463-546
7 (1977)］やマキサム−ギルバート法［Maxam, A. M.an
d Gilbert, W., Method in Enzymology, 65, 499-560
(1980)］等により行なうことができる。更に、上記ＤＮ
Ａ塩基配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用
いることによっても容易に行ない得る。

【００１６】また本発明遺伝子の利用によるバクテロイ
デス・フラジリスの同定及び診断のための方法として
は、サザンハイブリダイゼーション法やドットハイブリ
ダイゼーション法［何れもSouthern,E.M., J. Mol. Bio
l., 9 8, 503-517 (1975)］等を採用することができる。
該方法では、制限酵素で切断したＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動に従い分画し、ゲルからニトロセルロー
スフィルターに移し取り、一方、目的とする遺伝子に対
応するＤＮＡを標識してプローブとし、このプローブを
フィルター上の相補的な塩基配列を持つＤＮＡ断片とハ
イブダイズさせて、ハイブリッドを形成させ、このハイ
ブリッドを形成するＤＮＡ断片をオートラジオグラフィ
ー等で検出する。

【００１７】更に本発明遺伝子の利用によるバクテロイ
デス・フラジリスの同定及び診断は、パルスフィールド
ゲル電気泳動によっても実施することができる。該方法
は、１９８２年にシュワルツら［Schwartz, D. C., et
al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 47, 189
(1982) ］によってそのプロトタイプが発表された比較
的新しい実験技術であり、近年、巨大ＤＮＡの標準的解
析法として定着し、分子遺伝学、分子生物学等の分野で
多用されているものである。この方法に本発明遺伝子を
応用することによって、バクテロイデス・フラジリスの
同定及び診断が容易に行ない得る。

【００１８】ＰＣＲ法は、インビトロ（in vitro）でＤ
ＮＡの特定領域をその領域の両端のセンス・アンタイセ
ンスプライマー、耐熱性のTaq ポリメラーゼ、ＤＮＡ増
幅システム等の組み合わせを用いて、約２〜３時間で１
０〜１００万倍に特異的に増幅することができる技術で
あり、基礎医学から臨床医学に亘って広範囲に利用され
つつある。本発明遺伝子及びその部分断片は、このＰＣ
Ｒ法によって増幅可能であり、かくして増幅されたＤＮ
Ａの利用によって、上記バクテロイデス・フラジリスの
同定及び診断をより有利に行ない得る。

【００１９】上記した本発明遺伝子の製造のために利用
される起源微生物は、バクテロイデス・フラジリスに属
する限り特に限定されるものではなく、該属に属する公
知の各種保存株や、実際の臨床分野で患者より分離、同
定された分離株のいずれでもよい。また、上記起源微生
物から抽出されたゲノムＤＮＡを本発明遺伝子として含
む組換え体プラスミドの好ましい一具体例としては、後
記する実施例で製造されたｐＯＴ３０５４を例示でき
る。このプラスミドは、工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託されており、その寄託番号は「微工研菌寄第１
２３２６号（FERMP-12326）」である。

【００２０】本発明によれば、上記本発明のノイラミニ
ダーゼ遺伝子で形質転換された宿主細胞の培養によっ
て、所望のノイラミニダーゼを生産、蓄積できる。この
培養は、細菌培養に慣用される常法に従って行なうこと
ができ、その際用いられる培地としても、宿主細胞に応
じて慣用される各種のものを適宜選択でき、例えば大腸
菌の場合は、ＬＢ培地等や之等にアンピシリン等を添加
した培地等を使用できる。

【００２１】上記培養により、形質転換体の細胞内又は
細胞外に生産される所望のノイラミニダーゼは、その物
理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（例
えば「生化学データーブックII」、１１７５−１２５９
頁、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東
京化学同人発行参照）により分離、精製できる。該方法
としては、具体的には例えば通常の蛋白沈殿剤による処
理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾
過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の各種液体クロマ
トグラフィー操作や、透析法、之等の組み合わせ等を例
示できる。

【００２２】上記により、容易に高収率、高純度で所望
のノイラミニダーゼを工業的規模で製造することができ
る。かくして得られるノイラミニダーゼは、血清等のシ
アル酸含有物質等の安定化に有用であり、また病原性の
解明等にも大きく貢献すると考えられる。

【００２３】

【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため実施
例を挙げる。

【００２４】

【実施例１】バクテロイデス・フラジリスのゲノムＤＮ
Ａライブラリーの作製 トーマスの方法［Berns, K. I. and Thomas, Jr., C.
A., J. Mol. Biol., 11, 476-490 (1965)］に従い、バ
クテロイデス・フラジリスのゲノムＤＮＡを抽出した。

【００２５】ここで起源微生物としては、バクテロイデ
ス・フラジリス（B. fragilis)ＹＣＨ４６株（山口県立
中央病院分離株）を、ＧＡＭ培地（ニッスイ社製）を用
いて、３７℃で４８時間嫌気的に静置培養後、培養液１
００mlを遠心・集菌（８０００rpm 、１０分）して利用
した。

【００２６】上記起源微生物菌体を約１０¹⁰細胞／mlに
なるように、ＳＳＣ−０．０１Ｍ−ＥＤＴＡに懸濁さ
せ、リゾチーム（最終濃度５００μｇ／ml）及びＳＤＳ
処理して溶菌し、プロテナーゼＫ（proteinase K）処理
した後、フェノール抽出して、核酸分画を得た。この核
酸分画をＲＮａｓｅ処理してＲＮＡを除去した後、エタ
ノール沈殿法でＤＮＡ画分を得た。これをゲノムＤＮＡ
とする。

【００２７】上記バクテロイデス・フラジリスのゲノム
ＤＮＡを、制限酵素BamHI で部分分解後、コスミドベク
ターｐＨＣ７９（ベーリンガー・マンハイム(Boehringe
r Mannheim) 社製）のBamHI 部位に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結反応させた。連結反応させた溶液（ライ
ゲーション溶液）を、そのまま引き続いてインビトロパ
ッケージング反応に利用して反応させた。この反応はロ
ーゼンベルグらの方法［Rosenberg, S. M., Stahl, M.
M., Kobayashi, I. and Stahl, W. F., Gene,38, 165-1
76 (1985)］に従って実施した。

【００２８】かくして、バクテロイデス・フラジリスの
ゲノムＤＮＡライブラリーを作製した。

【００２９】

【実施例２】ノイラミニダーゼ活性を指標としたスクリ
ーニング 実施例１で作製したライゲーション溶液を、大腸菌(E.
coli) ＨＢ１０１株に形質導入し、アンピシリン３０μ
ｇ／mlを含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ／
ｌ、バクトイースト抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／
ｌ、バクトアガー１５ｇ／ｌ）に撒き、出現してきた集
落を、アンピシリン１５μｇ／mlを含むＧＡＭ培地３ml
に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。遠心・集菌（１
２０００rpm 、１０分）後、ミネラルソルーション
［（９ｍＭ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 、３４ｍＭＮａＣｌ、１５ｍ
Ｍ （ＮＨ₄ ）₂ ＳＯ₄ 、１２ｍＭ （ＣＨ₂ ＣＯＯＮ
ａ）₂ ］１mlに懸濁させた。更に遠心・集菌（１２００
０rpm 、１０分）した後、ミネラルソルーション１００
μｌに懸濁させた。得られた細胞懸濁液を−７０℃で２
時間凍結後、室温で融解し、更に凍結融解を２回繰り返
した。次に、１０％トライトンＸ−１００を１０μｌ加
えてボルテックスミキサーで１０秒間攪拌後、遠心（１
２０００rpm 、１０分）し、上清を得た。この上清０．
１mlと、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．０５ml
及び０．１２５mg／ml４−メチルウンベリフェリル−Ｎ
−アセチル−α−Ｄ−ノイラミン酸（4-methylumbellif
eryl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid, ４−ＭＵ−ＡＮ
Ａ）０．０５mlとを、マイクロタイタープレートのウェ
ル中で混合し、３７℃で１〜２４時間保温後、マイクロ
プレートリーダー（コロナ社製、ＭＦII）で測定した
（励気波長３６５nm、蛍光波長４５０nm）。

【００３０】上記により１５０クローンの中からノイラ
ミニダーゼ活性を有する１クローンを得た。また上記ノ
イラミニダーゼ活性を有する集落からコスミドを単離
し、これをｐＯＴ２６３３と命名した。

【００３１】

【実施例３】欠失解析 この操作は以下の通り行なわれたものであり、その概略
及びそれにより得られるコスミド及びプラスミドの特徴
を図１に示すと共に、得られた組換え体のノイラミニダ
ーゼ活性を図２に示す。

【００３２】図１及び図２における制限酵素、制限酵素
開裂部位、その他の略号はそれぞれ次のことを示す。 Ｂ，Bam ：BamHI 、Ｋ，Kpn ：KpnI、Ｐ，Pst ：PstI、
Ｓ，Sal ：SalI、Ｘ，Xho ：XhoI、Ａ：AccI、Ｅ：EcoR
I 、Ｃ：ClaI、Ｐｖ：PvuII 、Ｐｓ：PstI、ｎａｎＨ：
ノイラミニダーゼ遺伝子、ｂｌａ ：βラクタマーゼ遺
伝子、cat ：クロラムフェニコール アセチルトランス
フェラーゼ遺伝子、lac ：乳糖分解遺伝子、lacP：乳糖
分解遺伝子プロモーター。

【００３３】まず、実施例２で得たｐＯＴ２６３３を制
限酵素SalIで切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結
反応させ、連結物で大腸菌HB101 株を形質転換させた。
かくして得られた組換え体から得られるコスミドをｐＯ
Ｔ３００１と命名した。

【００３４】次に上記ｐＯＴ３００１を制限酵素SalIで
切断後、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む断片をｐＨＳＧ
３９９（宝酒造社製）のマルチクローニングサイトの中
にあるSalIサイトにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反
応させ、反応物で大腸菌HB101 株を形質転換させた。か
くして得られた組換え体から得られるプラスミドをｐＯ
Ｔ３０１０と命名した。

【００３５】また上記ｐＯＴ３０１０を制限酵素BamHI
で切断後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、
連結物で大腸菌HB101 株を形質転換させた。かくして得
られた組換え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０１
４と命名した。

【００３６】上記ｐＯＴ３０１４を制限酵素KpnIで切断
し、Mung been Nuclease処理後、制限酵素XhoIで切断し
て得られる断片を、ｐBluescriptＫＳ＋（ストラトジェ
ン(Stratagene)社製）のSmaI-XhoI 部位にＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結反応させ、反応物で大腸菌HB101 株
を形質転換させた。かくして得られた組換え体から得ら
れるプラスミドをｐＯＴ３０５４と命名した。

【００３７】またｐＯＴ３０１０を制限酵素PstIで切断
し、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む断片をｐBluescript
ＫＳ＋のマルチクローニングサイトの中にあるPstIサイ
トに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、連結
物で大腸菌HB101 株を形質転換させた。かくして得られ
た組換え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０２０及
びｐＯＴ３０１６と命名した。

【００３８】上記ｐＯＴ３０２０を制限酵素KpnIで切断
後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応させ、反応物
で大腸菌HB101 株を形質転換させた。かくして得られた
組換え体から得られるプラスミドをｐＯＴ３０３０と命
名した。

【００３９】上記各操作により得られたｐＯＴ３０１
４、ｐＯＴ３０３７、ｐＯＴ３０３４、ｐＯＴ３０１
６、ｐＯＴ３０２０、ｐＯＴ３０３０、ｐＯＴ３０４
５、ｐＯＴ３０４７、ｐＯＴ３０５１及びｐＯＴ３０５
４のそれぞれを有する大腸菌HB101株組換え体につき、
それぞれのノイラミニダーゼ活性を実施例２と同様にし
て測定した結果を、図２に示す。

【００４０】上記図２より、ｐＯＴ３０５４を有する組
換え体がノイラミニダーゼ活性を示すことから、ノイラ
ミニダーゼ遺伝子はXhoI - KpnI 断片（２．２ｋｂ）中
に存在するものと認められた。

【００４１】

【実施例４】ＤＮＡ塩基配列の決定 本発明ノイラミニダーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を、Ｅ
ＸＯ／Mung DeletionKit （ストラトジェン社製）及び
Ｍ１３シークエンシングキット（ニッポンジーン社製）
を用いて、ジデオキシシークエンス法に従って調べた。

【００４２】その結果、本発明ノイラミニダーゼ遺伝子
は、５４４個のアミノ酸をコードする１６３２塩基対の
ＤＮＡ領域であることが確認された。その配列は、配列
番号：１に示す通りである。

【００４３】

【実施例５】サザンハイブリダイゼーションによるバク
テロイデス・フラジリスの検出 （５−１） ＤＮＡプローブの調製 ｐＯＴ３０５４から、ノイラミニダーゼ遺伝子を含む３
２５bpのEcoRI-ClaIＤＮＡ断片を切り出し、この断片を
ｐBluescipt ＫＳII＋のマルチクローニングサイト中の
EcoRI-ClaIサイトに挿入して、ｐＫＳＥＣ１を作製し
た。これをプローブとして用いた。

【００４４】該プローブのＤＮＡ塩基配列は、配列番
号：１に示すノイラミニダーゼ遺伝子の第７７５番目〜
第１１０４番目のＤＮＡ塩基配列に合致するものであっ
た。

【００４５】また、上記プローブの標識は、ＤＮＡラベ
リングキット（ニッポンジーン社製）を用いて行なっ
た。

【００４６】（５−２） パルスフィールドゲル電気泳
動法 供試菌として以下のものを用いた。 １．サッカロミセス・セレビシエ(Sacchar omyces cerev
isiae)ＹＮＮ２９５株（バイオ・ラッド社の市販ゲルブ
ロック使用） ２．バクテロイデス・フラジリス(B. frag ilis) ＹＣＨ
４６株（山口県立中央病院分離株） ３．バクテロイデス・フラジリス(B. frag ilis) ＧＡＩ
０６２４株（岐阜大学医学部付属嫌気性菌実験施設） ４．バクテロイデス・フラジリス(B. frag ilis) ＡＴＣ
Ｃ２５２８５株（ＡＴＣＣ保存株） ５．バクテロイデス・フラジリス(B. frag ilis) ＫＭＳ
１株（香川医科大学分離株） ６．バクテロイデス・フラジリス(B. frag ilis) ＹＣＨ
２１株（山口県立中央病院分離株） ７．バクテロイデス・シータイオタオミクロン (B. the
taiotaomicron)５４８２株（VPI 5482株、ATCC 29148
株、Werner E50株及びNCTC 10582株に同じ） ８．バクテロイデス・ユニフォルミス(B. uniformis)Ｂ
Ｕ１００１株（VPI 1001株に同じ）

【００４７】上記菌株を用いて、集菌・洗浄後の各菌体
をアガロースに封入（５×１０⁸ 細胞／ml）してゲルブ
ロックとした。このゲルブロック中で菌体をリゾチーム
により溶菌させ、次にプロテイナーゼＫ処理して除蛋白
を行なった。得られた染色体ＤＮＡを制限酵素NotIで切
断し、ＣＨＥＦ−ＤＲ（Clamped Homogeneous Electric
Field-Dynamically Regulated, バイオ・ラッド社製）
［Chu, G. et al., Science, 234, 1582 (1982) ］を用
いて、パルスフィールドゲル電気泳動を行ない、各断片
を分離した。泳動後、トランスイルミネーターの上にゲ
ルを置き、写真撮影した。

【００４８】（５−３）サザンハイブリダイゼーション 上記（５−２）で写真撮影後のゲルを、０．２５Ｎ塩酸
溶液に２０分間浸漬した。次に、塩酸溶液を捨て変性溶
液（０．５Ｎ ＮａＯＨ＋１．５Ｍ ＮａＣｌ）を加
え、室温で４０分間振盪後、変性液を捨て中和液（０．
５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）＋１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ）を加え４０分間振盪した。更に、ゲルからＤＮＡ断
片をナイロンメンブランフィルターに移行させた。フィ
ルターを風乾後、８０℃のオーブン中に２時間入れてＤ
ＮＡをフィルターに固定した。シールバックにベーキン
グしたフィルターを入れ、ハイブリダイゼーション緩衝
液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１００〜２００
μｇ／mlサケ精子ＤＮＡ（５分間煮沸後氷水で急冷した
もの）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、
０．１％ＳＤＳ及び１０×Denhardt's solution ）を加
え、入れ口をポリシーラーで閉じた後、４２℃で３時間
保温した。次にシールバックの一部を切り、緩衝液を捨
て、新しい緩衝液に熱処理し急冷したプローブを入れ、
空気が入らないようにシールし、４２℃で１２時間保温
した。フィルターを取り出し、２×ＳＳＣ＋０．１％Ｓ
ＤＳ溶液で１０分間３回洗浄した。更に、０．１×ＳＳ
Ｃ＋０．１％ＳＤＳ溶液中で５６〜６０℃で１時間洗浄
した。フィルターを乾燥後、−８０℃で増感紙存在下に
オートラジオグラフィーを行なった。

【００４９】上記（５−２）及び（５−３）の各結果の
対比より、バクテロイデス・フラジリスの５株では、い
ずれもプローブとハイブリダイズする約１３０kbのバン
ドが検出されたが、バクテロイデス・シータイオタオミ
クロン及びバクテロイデス・ユニフォルミスでは、プロ
ーブとハイブリダイズするバンドは検出されないことが
明らかとなった。このことから、ノイラミニダーゼのEc
oRI-ClaI断片を含むプローブｐＫＳＣ１は、非常に特異
性が高くバクテロイデス・フラジリスの同定、診断に有
用であることが判った。

【００５０】

【実施例６】 （６−１）ドットブロットハイブリダイゼーションによ
るバクテロイデス・フラジリスの検出 培養液０．１mlをドットブロット装置（バイオ・ラッド
社製）を用いて菌体をナイロンメンブランフィルターに
吸着させた。このフィルターを変性溶液（実施例５−３
に同じ）に浸した濾紙上に、菌体側を上にして１０分間
放置した。次に中和液（実施例５−３に同じ）に浸した
濾紙上に、５分間放置した。フィルターを風乾後、８０
℃のオーブン中に２時間入れ、ＤＮＡをフィルターに固
定した。ハイブリダイゼーション、プローブの調製は、
実施例５の方法に従った。

【００５１】下記表１に示す臨床検査室で従来用いられ
ている培養法でバクテロイデス・フラジリスと同定され
た臨床分離株６２株、バクテロイデス・フラジリスの保
存株、他の各種の嫌気性菌（保存株）につき、上記試験
を行なった。

【００５２】

【表１】

【００５３】尚、表中の各菌種は次のものを示す。Bacteroides f ragilis YCH1 〜YCH50 : 山口県立中央病
院分離株Bacteroides f ragilis KMS1 〜KMS9 : 香川医科大学分
離株Bacteroides f ragilis UTH1 〜UTH3 : 徳島大学中検分
離株Bacteroides t hetaiotaomicron 5482 : VPI 5482株、AT
CC 29148株、Werner E50株及びNCTC 10582株に同じ）Bacteroides u niformis 1001 : VPI 1001 株Bacteroides u niformis ATCC 8492 : Int. J. Sys. Bac
t., 30, 261 (1980) :Int. J. Sys. Bact., 23, 70 (19
73) 参照Bacteroides o vatus ATCC 8483 : Int. J. Sys. Bact.,
26, 230 (1976) 参照Bacteroides e ggerthii ATCC 27754 : Int. J. Sys. Ba
ct., 24, 272 (1974) 参照

【００５４】得られた結果より、臨床分離株６２株及び
バクテロイデス・フラジリスの保存株は、すべて陽性の
結果を与えた。これに対してバクテロイデス・フラジリ
ス以外の嫌気性菌（保存株）は、いずれも陰性であっ
た。このことからも、本発明ノイラミニダーゼ遺伝子の
断片を含むプローブは、バクテロイデス・フラジリスの
同定、診断に有用であることが判る。

【００５５】（６−２）ドットブロットハイブリダイゼ
ーションによるバクテロイデス・フラジリスの検出 実施例６−１の方法に従って、下記表２に示す好気性菌
について、同一試験を実施した。

【００５６】

【表２】

【００５７】尚、表中の各菌種は前記表１と同じである
か又は次のものを示す。Pseudomonas a erginosa UTC 55 :徳島大学中検分離株Staphylococcu s aureus 209 P : FDASalmonella typhimuriun KUB 29 : 九州大学医学部細菌
学教室

【００５８】得られたより、試験したすべての好気性菌
（保存株）は、いずれも陰性であり、このことからも、
本発明ノイラミニダーゼ遺伝子の断片を含むプローブ
は、バクテロイデス・フラジリスに対して特異的である
ことが判った。

【００５９】

【実施例７】ＰＣＲ法によるバクテロイデス・フラジリ
スの検出 ＰＣＲ法はパーキン・エルマー・シータス社のＤＮＡ増
幅システム（ＤＮＡサーマルサイクラー）を用いて実施
した。遺伝子増幅試薬としては、同社のＤＮＡ試薬キッ
ト（商品名：Gene Amp）を用いた。遺伝子増幅に用いた
合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成装置（アプライ
ド・バイオシステム社製）で合成したものであり、ＨＰ
ＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）にて精製後利用
した。

【００６０】遺伝子増幅用プライマーとしては、プライ
マー１（配列番号：３）及びプライマー２（配列番号：
４）を用い、７６３bpの断片を増幅した。反応液として
は次の組成のものを用いた。 （１０×）Reaction buffer （１×） ｄＮＴＰｓＭｉｘ，１．２５ｍＭ ２００μＭ プライマー１ １．０μＭ プライマー２ １．０μＭ ＴａｑＤＮＡPolymerase ２．５Ｕ genome DNA solution ５０μｌ 全量 １００μｌ ９４℃で０．５分、５５℃で０．５分及び７２℃で２分
の保温を１サイクルとして、３０サイクル行なって、遺
伝子を増幅させた。

【００６１】細胞数が０、２×１０¹ 、２×１０² 、２
×１０³ 、２×１０⁴ 、２×１０⁵、２×１０⁶ 及び２
×１０⁷ になるように調製した細胞懸濁液５０μｌを５
分間煮沸して、genome DNA solution とした。

【００６２】ＰＣＲ反応後、反応液１０μｌをナイロン
メンブランフィルターにスポットし、風乾後、８０℃の
オーブン中に１時間入れてＤＮＡを固定した。ハイブリ
ダイゼーション、プローブの調製は実施例５の方法に従
った。

【００６３】その結果、ＰＣＲ反応を用いれば、細胞数
２×１０¹ においても、バクテロイデス・フラジリスが
検出可能であることが判った。

【００６４】

【配列表】

【００６５】配列番号：１ 配列の長さ：１６３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：genomic DNA 起源：ノイラミニダーゼ遺伝子 生物名：Bacteroides fragilis YCH46株 配列の特徴： 特徴を表す記号：coding sequence 存在位置： 1 -1635 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： ATG AAA AAA GCC GTA ATT CTA TTT TCG CTT TTC TGT TTT CTG TGT GCT 48 ATA CCG GTA GTT CAA GCA GCA GAT ACC ATT TTT GTT CGT GAA ACA CGT 96 ATT CCT ATT TTG ATA GAA AGG CAG GAT AAT GTC TTA TTC TAT CTC CGT 144 TTG GAT GCT AAA GAG AGC CAG ACC CTG AAC GAT GTA GTG TTA AAC TTG 192 GGT GAA GGA GTG AAT CTT TCT GAA ATT CAG TCC ATA AAG CTT TAT TAT 240 GGA GGT ACT GAA GCA TTG CAG GAT AGT GGT AAA AAA CGT TTT GCT CCT 288 GTT GGA TAT ATT TCC AGT AAC ACT CCG GGG AAA ACA CTT GCC GCC AAT 336 CCG TCT TAT TCA ATC AAA AAA TCA GAG GTG ACT AAT CCC GGT AAT CAG 384 GTT GTT CTG AAA GGA GAT CAG AAA CTG TTT CCC GGA ATC AAT TAT TTC 432 TGG ATT AGT TTG CAA ATG AAG CCG GGC ACT TCG CTT ACC AGC AAG GTG 480 ACC GCG GAT ATC GCT TCA ATT ACT TTG GAT GGC AAA AAA GCC CTG TTG 528 GAT GTA GTT TCA GAA AAT GGG ATA GAA CAC CGT ATG GGA GTA GGA GTG 576 CGC CAT GCC GGA GCA GAT AAT TCT GCC GCA TTC CGT ATT CCG GGA TTG 624 GTG ACT ACT AAT AAA GGT ACG TTA CTG GGA GTT TAT GAT GTA CGT TAT 672 AAC AGT AGT GTT GAC TTG CAG GAG CAT GTT GAT GTT GGT TTA AGC CGC 720 AGT ACA GAT GGT GGA AAA ACT TGG GAA AAA ATG CGT TTG CCT TTG GCT 768 TTT GGA GAA TTC GGT GGT TTG CCT GCC GGT CAG AAT GGG GTA GGA GAC 816 CCT TCT ATT CTT GTT GAT ACA AAA ACA AAT AAT GTT TGG GTG GTT GCT 864 GCC TGG ACA CAT GGT ATG GGT AAT CAG CGG GCA TGG TGG AGT TCA CAT 912 CCG GGT ATG GAT ATG AAC CAT ACA GCA CAA CTT GTT TTA GCT AAA AGT 960 ACA GAT GAT GGT AAA ACA TGG TCT GCA CCT ATT AAT ATT ACA GAG CAG 1008 GTG AAA GAT CCT TCT TGG TAT TTC TTG TTG CAG GGA CCG GGT AGG GGT 1056 ATC ACT ATG AGT GAC GGT ACT TTG GTA TTC CCA ACT CAG TTT ATC GAT 1104 TCG ACA CGT GTG CCC AAT GCC GGT ATT ATG TAC AGT AAA GAT GGT GGC 1152 AAG AAC TGG AAG ATG CAC AAT TAT GCA CGT ACG AAC ACC ACA GAA GCC 1200 CAG GTA GCT GAG GTC GAA CCC GGA GTG TTG ATG TTG AAT ATG CGT GAT 1248 AAT CGT GGA GGA AGC CGC GCT GTG GCT ATT ACA AAA GAT TTG GGT AAA 1296 ACA TGG ACG GAA CAT GAA TCT TCT CGT AAG GCA TTG CCG GAA TCT GTT 1344 TGT ATG GCT AGT TTG ATC AGT GTG AAA GCA AAA GAT AAT GTG TTG GGC 1392 AAG GAT TTA TTG ATT TTC TCT AAT CCT AAT ACG ACA AAA GGA CGC TAT 1440 AAT ACT ACT ATT AAA ATA AGT TTG GAT GGC GGT GTG ACT TGG TCA CCC 1488 GAA CAT CAG CTG TTG TTG GAT GAA GGC AAT AAC TGG GGT TAT TCT TGC 1536 CTC TCT ATG ATT GAT AAA GAG ACG ATT GGT ATT CTT TAT GAA AGT AGT 1584 GTG GCG CAC ATG ACA TTC CAG GCT GTG AAG TTG AAA GAC ATT ATT AAA 1632 TGA 1635

【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：５４４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：蛋白 配列： Met Lys Lys Ala Val Ile Leu Phe Ser Leu Phe Cys Phe Leu Cys Ala 1 5 10 15 Ile Pro Val Val Gln Ala Ala Asp Thr Ile Phe Val Arg Glu Thr Arg 20 25 30 Ile Pro Ile Leu Ile Glu Arg Gln Asp Asn Val Leu Phe Tyr Leu Arg 35 40 45 Leu Asp Ala Lys Glu Ser Gln Thr Leu Asn Asp Val Val Leu Asn Leu 50 55 60 Gly Glu Gly Val Asn Leu Ser Glu Ile Gln Ser Ile Lys Leu Tyr Tyr 65 70 75 80 Gly Gly Thr Glu Ala Leu Gln Asp Ser Gly Lys Lys Arg Phe Ala Pro 85 90 95 Val Gly Tyr Ile Ser Ser Asn Thr Pro Gly Lys Thr Leu Ala Ala Asn 100 105 110 Pro Ser Tyr Ser Ile Lys Lys Ser Glu Val Thr Asn Pro Gly Asn Gln 115 120 125 Val Val Leu Lys Gly Asp Gln Lys Leu Phe Pro Gly Ile Asn Tyr Phe 130 135 140 Trp Ile Ser Leu Gln Met Lys Pro Gly Thr Ser Leu Thr Ser Lys Val 145 150 155 160 Thr Ala Asp Ile Ala Ser Ile Thr Leu Asp Gly Lys Lys Ala Leu Leu 165 170 175 Asp Val Val Ser Glu Asn Gly Ile Glu His Arg Met Gly Val Gly Val 180 185 190 Arg His Ala Gly Ala Asp Asn Ser Ala Ala Phe Arg Ile Pro Gly Leu 195 200 205 Val Thr Thr Asn Lys Gly Thr Leu Leu Gly Val Tyr Asp Val Arg Tyr 210 215 220 Asn Ser Ser Val Asp Leu Gln Glu His Val Asp Val Gly Leu Ser Arg 225 230 235 240 Ser Thr Asp Gly Gly Lys Thr Trp Glu Lys Met Arg Leu Pro Leu Ala 245 250 255 Phe Gly Glu Phe Gly Gly Leu Pro Ala Gly Gln Asn Gly Val Gly Asp 260 265 270 Pro Ser Ile Leu Val Asp Thr Lys Thr Asn Asn Val Trp Val Val Ala 275 280 285 Ala Trp Thr His Gly Met Gly Asn Gln Arg Ala Trp Trp Ser Ser His 290 295 300 Pro Gly Met Asp Met Asn His Thr Ala Gln Leu Val Leu Ala Lys Ser 305 310 315 320 Thr Asp Asp Gly Lys Thr Trp Ser Ala Pro Ile Asn Ile Thr Glu Gln 325 330 335 Val Lys Asp Pro Ser Trp Tyr Phe Leu Leu Gln Gly Pro Gly Arg Gly 340 345 350 Ile Thr Met Ser Asp Gly Thr Leu Val Phe Pro Thr Gln Phe Ile Asp 355 360 365 Ser Thr Arg Val Pro Asn Ala Gly Ile Met Tyr Ser Lys Asp Gly Gly 370 375 380 Lys Asn Trp Lys Met His Asn Tyr Ala Arg Thr Asn Thr Thr Glu Ala 385 390 395 400 Gln Val Ala Glu Val Glu Pro Gly Val Leu Met Leu Asn Met Arg Asp 405 410 415 Asn Arg Gly Gly Ser Arg Ala Val Ala Ile Thr Lys Asp Leu Gly Lys 420 425 430 Thr Trp Thr Glu His Glu Ser Ser Arg Lys Ala Leu Pro Glu Ser Val 435 440 445 Cys Met Ala Ser Leu Ile Ser Val Lys Ala Lys Asp Asn Val Leu Gly 450 455 460 Lys Asp Leu Leu Ile Phe Ser Asn Pro Asn Thr Thr Lys Gly Arg Tyr 465 470 475 480 Asn Thr Thr Ile Lys Ile Ser Leu Asp Gly Gly Val Thr Trp Ser Pro 485 490 495 Glu His Gln Leu Leu Leu Asp Glu Gly Asn Asn Trp Gly Tyr Ser Cys 500 505 510 Leu Ser Met Ile Asp Lys Glu Thr Ile Gly Ile Leu Tyr Glu Ser Ser 515 520 525 Val Ala His Met Thr Phe Gln Ala Val Lys Leu Lys Asp Ile Ile Lys 530 535 540

【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：primer bind 存在位置： 1 -17 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： AGATAATTCT GCCGCAT 17

【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ｐｒｉｍｅｒ ｂｉｎｄ 存在位置： 1 -17 特徴を決定した方法：Ｅ 配列： CATACAAACA GATTCCG 17

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３に従うコスミド及びプラスミド構築の
概略図を示す。

【図２】実施例３に従い得られた組換え体の特徴及びノ
イラミニダーゼ活性を調べた結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｑ 1/34 6807−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号：１で表わされる塩基配列を有す
   ることを特徴とするバクテロイデス・フラジリスのノイ
   ラミニダーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を
   有することを特徴とするバクテロイデス・フラジリスの
   ノイラミニダーゼ。
3. 【請求項３】請求項１に記載のノイラミニダーゼ遺伝子
   の全部又は一部を用いることを特徴とするバクテロイデ
   ス・フラジリスの同定及び診断法。
4. 【請求項４】ノイラミニダーゼ遺伝子の一部としてEcoR
   I-ClaI断片を用いる請求項３に記載の同定及び診断法。