JPH0648997B2 - 促進された化学ルミネセンス反応並びに診断アッセイ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の分野 本発明は、好ましくは診断アッセイ、特にイムノアッセ
イに用いる促進された化学ルミネセンス反応と、上記ア
ッセイ用の診断キットとに係わる。化学ルミネセンス反
応は、発光をもたらす化学反応である。ルミネセンス発
光は通常、発せられた光が検出あるいは測定され、それ
によって分析対象の検出あるいは定量が可能となるのに
十分な時間継続する。本発明の係わる化学ルミネセンス
反応は、酸化剤、特に過酸化水素を伴った2,3-ジヒドロ
−1,4−フタラジンジオン(DPD)、特にルミノールと、酸
化剤によるDPD酸化を触媒するペルオキシダーゼ酵素、
特にセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)との間に生
起する。上記酸化が発光を伴う。

先行技術の説明 ペルオキシダーゼを触媒とする上記DPD酸化を用いるル
ミネセンスアッセイには、三つの主要なタイプが存在す
る。

ａ．リガンドを標識するべく該リガンドにセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼを結合(conjugate)させ、標識の検
出あるいは定量にルミネセンス反応を用いるアッセイ。
この範疇にはペルオキシダーゼELISAが含まれる。

ｂ．遊離の酸化剤、ペルオキシダーゼあるいはルミノー
ルの測定にルミネセンス反応を用いるアッセイ。このタ
イプのアッセイの例としては、酵素／抗体反応物質をグ
ルコースと反応させて過酸化水素を生成し、次いで生成
した過酸化水素の量を、ルミネセンス反応を導くように
制御した条件下でのルミノール及びペルオキシダーゼ触
媒の添加によって測定することによる抗体結合グルコー
スオキシダーゼの測定が挙げられる。

ｃ．化学ルミネセンス性化合物をタンパク質、ホルモ
ン、ハプテン、ステロイド、核酸、代謝中間体、抗原及
び／または抗体のようなリガンドの標識に直接用いるア
ッセイ。通常、ルミノールあるいはイソルミノールのよ
うな化学ルミネセンス性DPDをリガンドと結合させる。
化学ルミネセンスは、反応した結合体(conjugate)にペ
ルオキシダーゼ及び酸化剤を添加することによって検出
することができる。

ルミネセンスアッセイは、T.P.Whitehead et al.,Clini
cal Chemistry 25,1531-1546(1979)において検討されて
いる。

ペルオキシダーゼを触媒とするDPDの化学ルミネセンス
酸化の感度は、反応物質中にエンハンサー、即ち６−ヒ
ドロキシベンゾチアゾール（ヨーロッパ特許第87959B
号）、厳密に規定した範囲内から選択したフェノール
（ヨーロッパ特許第116454B号もしくは米国特許第4,59
8,044号）、あるいは厳密に規定した範囲内から選択し
た芳香族アミン（英国特許出願公開第2162946A号もしく
は米国特許第4,729,950号）を含めることによって上昇
させることが可能である。上記諸特許及び特許出願の権
利者は、National Research Development Corporation
である。ヨーロッパ特許出願公開第219352A号(Minnesot
a Mining and Mfg.Co.)にはエンハンサーとして、既に
英国特許出願公開第2162946A号で言及されたもののうち
の幾つかを含む様々な芳香族アミンが開示されている。
これら総てのエンハンサーの中で最良のものは、厳密に
規定したフェノール化合物のうち幾つかあると考えられ
る。フェノールエンハンサーの特許出願を行なった当初
の特許請求の範囲においてはフェノール化合物を、一般
式とエンハンサーとして機能するべきであるという特徴
付けとによって規定した。しかし、上記一般式で表され
る化合物のうちの幾つかは著しい感度上昇をもたらさな
かった。従って付与された特許では上記一般式は、明細
書中に記載した、エンハンサーであることが判明した26
のフェノール化合物にほぼ基づくより狭い規定によって
置き換えられた。好ましいエンハンサーはパラ−ヨード
フェノール(PIP)である。その外にも、３種のフェノー
ル化合物が他のものよりはるかに優れた感度上昇をもた
らした。これらのフェノールエンハンサーはいずれも、
大きい信号（光出力）並びに大きい信号対背景比（ペル
オキシダーゼ酵素が存在する場合の光出力と存在しない
場合の光出力との比）をもたらすが、その特性は個々に
異なる。従って本発明は、有効なエンハンサーの範囲を
拡大することを目的とする。この目的の達成は困難であ
り、なぜならエンハンサーとして試みるべく候補化合物
を選択する方法を示唆する理論あるいは機構が未だ公開
されていないからである。強度に電子吸引性でない置換
基によるパラ位置換が好ましいと考えられるが、このよ
うな一般化は、選択するべき化合物が何千にも及ぶので
さほど有用でない。

“発明の概要”を述べないうちはその関連性が理解され
難いと考えられる先行技術については、“発明の概要”
に続く別項において後述する。

〔発明の概要〕

今や、フェノール分子のオルト及び／またはパラ位、特
にパラ位に位置するイミダゾリルあるいはベンズイミダ
ゾリル基置換が、ジヒドロフタラジンジオン(DPD)とペ
ルオキシダーゼ酵素触媒と酸化剤との反応での化学ルミ
ネセンスの有効なエンハンサーを提供することが判明し
た。

本発明は原則として、あらゆる目的において上述の反応
パートナーを用いて生起させるいかなる化学ルミネセン
ス反応からの光出力の増大にも適用可能であるが、ルミ
ネセンスアッセイあるいは光測定アッセイ（こららの用
語は検出法及び定量法をそれぞれ意味する）に関連させ
て用いることが何よりも有利である。アッセイのために
は、エンハンサーは反応からの光出力を増大するのみで
なく、アッセイの感度を高める機能も果たすことが好ま
しい。一般にアッセイは光出力が使用ペルオキシダーゼ
量に関連し得るように実施し、その場合ペルオキシダー
ゼが直接測定する物質である。試料中にペルオキシダー
ゼが存在する場合の光出力の、ペルオキシダーゼ不在の
場合の光出力に対する比がアッセイ感度の保証において
重要となる。この比を、都合が好いので“信号対背景”
比と呼称する。

本発明は上記四つの反応パートナーのいずれの存在ある
いは量の決定にも有用であるが、反応パートナー自体が
必ずしもアッセイ（検定）されるべき物質である必要は
ないと考えられる。例えば、酸化剤は、試料においてよ
り早い段階に実現した一反応の結果か、あるいはカスケ
ード式の複数反応の結果として生成し得る。ペルオキシ
ダーゼあるいはルミノールは、例えばイムノアッセイで
抗原の決定に用いる抗体との結合体（複合体conjugat
e）の形態を取り得る。従って本発明は、共に反応して
化学ルミネセンスを起こし得るDPD、ペルオキシダーゼ
酵素、酸化剤及びエンハンサーから成るグループ中から
選択した一反応パートナーの存在あるいは量にその存在
あるいは量を関連させ得る物質の診断アッセイのいかな
る方法にも適用可能であり、前記方法では反応を生起さ
せて光出力を検出あるいは測定し、従ってアッセイする
べき物質の存在あるいは量は光出力に関連させる。

本発明は、DPD、ペルオキシダーゼ及びエンハンサーを
用いるアッセイ用のキットも提供する。酸化剤は、別途
供給しても、あるいはまたキットに含めてもよい。

〔先行技術の補足説明〕

I.Fridovich,J.Biol.Chem.238,3921-3927(1963)には、
ｏ−ジアニシジンの過酸化水素及びHRPでの酸化をアン
モニア、ピリジンあるいはイミダゾールによって促進す
ることができるという発見が述べられている。また、W.
Straus,Journal of Histochemistry and Cytochemistr
y,30,491-493(1982)には、イミダゾールが上記反応、並
びにジアミノベンジジンの同様反応を促進したことが報
告されている。

〔好ましい具体例の説明〕

好ましいエンハンサーは、式 のｐ−イミダゾール−１−イルフェノールである。この
化合物は市販されている。本発明のその他のエンハンサ
ーには、式 （オルトあるいはパラ） のｏ−及びｐ−ベンズイミダゾール−２−イルフェノー
ルが含まれる。

パラ−イミダゾール−１−イルフェノールは、特にDPD
発光団としてルミノールを用いる場合優れた化学ルミネ
センスエンハンサーである。多くの場合においてパラ−
イミダゾール−１−イルフェノールは、先行技術での好
ましいエンハンサーであるパラ−ヨードフェノールと同
じくらい有効である。

最良の結果は比較的高いpHにおいて得られる。好ましく
は、全反応物質混合時のpHは7.5〜９である。

本発明ではいかなる化学ルミネセンス性DPDも用い得、
即ち添加酸化剤によりペルオキシダーゼ触媒の存在下に
酸化して化学ルミネセンスを実現するいかなるDPDも用
い得る。例えばルミノール、イソルミノール、ABEI及び
AHEI、並びに７−ジメチルアミノナフタレン−1,2−ジ
カルボン酸ヒドラジドなどを用い得、そのうちルミノー
ルが通常好ましい。DPDは遊離状態であり得、あるいは
リガンドと結合して直接的な標識をもたらし得る。その
ような発光団標識アッセイは当業者に公知である。

酸化剤は（酸素そのものを除く）任意の添加物質であり
得、そのうち普通は過酸化水素を用いるが、ナトリウム
塩などの過ホウ酸塩を替わりに用いてもよい。

ペルオキシダーゼ酵素は通常HRPであり、かつルミネセ
ンスアッセイに用いるのに適当な純度を有する。ペルオ
キシダーゼ酵素は遊離状態であり得、あるいはリガンド
と結合し得る。DPD標識アッセイを行なう場合、ペルオ
キシダーゼはマイクロペルオキシダーゼであることが好
ましい。

化学ルミネセンス反応の反応パートナーの濃度は実施す
るアッセイの性格に従属し、また特にいずれの反応パー
トナーをアッセイするかに従属する。通常、DPD濃度が
高いほど光出力は大きい。従ってペルオキシダーゼある
いは酸化剤をアッセイする場合は、DPDを過剰に用いる
ことが好ましい。一般に、DPD濃度は11（リットル）当
たり0.5μmol〜200mmolが望ましく、好ましくは0.5〜10
0μmol/lである。酸化剤濃度は光の強度に影響し、mmol
/lのオーダの高濃度は高い初期強度をもたらし、この初
期強度は時と共に急激に低下する。より低い濃度は光の
初期出力をより小さくするが、信号の減衰をより緩慢に
する。一般に、酸化剤濃度は0.5μmol〜300mmol/lが望
ましく、好ましくは10〜200mmol/lである。本明細書に
述べた実施例で用いた酸化剤の濃度は低く、即ち実施例
１〜３において0.9、1.8及び0.6μmol/lであった。

ペルオキシダーゼの濃度は、ペルオキシダーゼがアッセ
イするべき反応パートナーでない場合は問題とならな
い。過剰なペルオキシダーゼは通常光の強度に顕著な影
響を及ぼさず、ペルオキシダーゼは再利用できる触媒で
ある。従って、ルミノールあるいは酸化剤をアッセイす
る場合ペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼの１ｇ当
たりの活性に拠るが0.01μｇ〜5,000mg/l、好ましくは5
0mg/l以下といった適当濃度で存在させさえすればばよ
い。

エンハンサーの濃度は普通１μmol〜4mol/lで、好まし
くは10μmol〜100mmol/lである。エンハンサー、あるい
はエンハンサーの種あるいは誘導体は反応においてDPD
と競合すると考えられるので、DPDよりはるかに過剰な
エンハンサー、好ましくはDPDのモル濃度の２〜20倍の
エンハンサーを用いることが望ましい。

要するに、（上述の内容に矛盾しないかぎり）化学ルミ
ネセンス反応のあらゆる条件及び特徴、該反応の反応パ
ートナー、アッセイの用途等は、本明細書に含まれるヨ
ーロッパ特許第116454B号に開示されたものと同様であ
る。

本発明を、以下の実施例によって詳述する。用いたパラ
−イミダゾール−１−イルフェノール(IMP)は新たに製
造した。

実施例１ この実施例は、パラ−イミダゾール−１−イルフェノー
ル(IMP)が、ルミノール(LU)とセイヨウワサビペルオキ
シダーゼ(HRP)結合体とH₂O₂との化学ルミネセンス反応
を促進して大きい信号：背景比をもたらすことを示す。
IMPは、パラ−ヨードフェノール(PIP)と比較する。

Dr.G.H.G.Thorpe,Dept.of Clinical Chemistry,Univers
ity of Birmingham,Englandの提供を受けた、セイヨウ
ワサビペルオキシダーゼ結合体であるAnti-AFP-HRPをス
トック溶液とした（濃度１mg/ml、pH8.5、溶媒0.1Mトリ
ス緩衝液）。この溶液を二重に蒸留した水で１：5000に
稀釈し、取り分けた10μｌの稀釈液を、50μｌのナトリ
ウムルミノール溶液（0.1Mトリス緩衝液１ml当たり0.05
mg、pH8.5）並びに300μｌのトリス緩衝液(pH8.5、0.1M)
に添加した。エンハンサー(E)、即ちIMPあるいはPIPの
溶液(25μｌ、DMSO中のエンハンサー濃度(a)５mg/ml；
(b)1mg/ml；(c)0.5mg/ml)を、酸化剤(6.2μｌの30容量
％H₂O₂を10mlのH₂Oに混入した溶液50μｌ）注入の直前
に添加した。IMPはSigma Chemical Company Ltd.,Pool
e,Dorset,Englandから得た。PIPは、Dr.G.H.G.Thorpeが
快く提供してくださった。発せられた光を光電子増倍管
によって、H₂O₂添加時点からの様々な時点（単位は分）
に測定した。各値は、光出力を掲示時点まで１分間にわ
たって積算した合計である。

比較実験では、エンハンサー、HRPあるいはLUを様々に
省いた。結果を表Ｉに示す。まずセット(a)において第
１コラムと第２コラム、即ちエンハンサーが存在する場
合の信号（光出力）と存在しない場合の信号とを比較す
ると、IMPがPIP同様非常に有効なエンハンサーであった
ことが知見される。第１コラムと第３コラムとを比較す
れば、“ブランク”もしくは背景、即ちHRP結合体が存
在しない場合の光出力が非常に小さい信号しかもたらさ
ないことが判る。エンハンサー濃度を低下させたセット
(b)では、IMPは更に大きい信号をもたらし（第１コラ
ム）、背景の値は減小する（第３コラム）。セット(b)
の第２コラムは、（より一般的なHRP標識に替えて）ル
ミノールを標識として用いる別のアッセイ反応において
得られた背景を示す。セット(b)の第１コラムと第２コ
ラムとの比較から、標識としてルミノールを用いて大き
い信号：背景比が得られることが判明する。（ルミノー
ルは結合するよりむしろ遊離するが、ルミノール標識ア
ッセイの試験では遊離ルミノールが結合ルミノールを有
効に模倣することが十分認められている。）セット(c)
は、IMPエンハンサーの稀釈度が更に高くとも良好な結
果が得られることを示す。

実施例２ ルミノールの替わりにイソルミノール(IL)か、またはア
ミノブチルエチルイソルミノール(ABEI)としても知られ
る６−（Ｎ−４−アミノブチル−Ｎ−エチル）アミノ−
2,3−ジヒドロフタラジン−1,4−ジオンを用いて実施例
１の操作を繰り返した。エンハンサー濃度は、DMSO1ml
当たり5mgとした。IMPをPIPと比較する。

結果を表IIに示す。表IIから、この実施例で用いた発光
団に関してIMPが、PIPほどは優れていないもののなお非
常に有効なエンハンサーであることが知見される。ここ
でも背景の状態は、HRPが存在しない場合も発光団が存
在しない場合も、好ましく小さい光出力をもたらす。

実施例３ 実施例１の操作を繰り返したが、ただしその際、実施例
１で用いたpH8.5のトリス緩衝液300μｌに替えて３種の
異なる緩衝液をそれぞれ500μｌ添加することによりpH
を変更し、かつ反応物質濃度を幾分低下させた。用いた
緩衝液は、(a)全反応物質の混合物にpH6.5を付与したク
エン酸ナトリウム(pH4)、(b)混合物のpHを8.1としたリ
ン酸ナトリウム(pH7)、並びに(c)混合物のpHを8.8とし
たトリス(pH9)であった。エンハンサー濃度をDMSO1ml当
たり5mgとし、IMPをPIPと比較した。

表IIIに示した結果から、最も大きいpHにおいて比較的
良好な信号が得られたことが知見される。IMPは概してP
IPほど有効でなかったが、それでもなお好ましい信号を
もたらす。

IMPエンハンサーは存在するがルミノールは存在しない
場合の背景の状態（表IIIに示さず）はゼロ信号をもた
らした。

実施例４ この実施例では、２−（２−ヒドロキシフェニル）ベン
ズイミダゾールとしても知られるオルト−ベンズイミダ
ゾール−２−イルフェノール(OBIMP)を化学ルミネセン
ス反応のエンハンサーとして用いた場合を説明する。

D.W.Hein et al.,J.Amer.Chem.Soc.79,427-429(1957)の
記載に従って生成したOBIMPをエンハンサーとして用い
て、実施例１の操作を繰り返した。m.p.240℃、U.V.λ
max 321(Hein et al.の示した値はm.p.242℃、λ ma
x 319）の生成物をDMSOに、DMSO1ml当たり1mg及び0.1mg
の量で溶解させた。反応促進は行なわれず、信号：背景
比は１：１〜２：１であった。しかし、使用酸化剤の量
を２倍にし、即ち100μｌの酸化剤溶液を用いることに
よって、最初の１分間に積算した信号は1,456mV/sec.に
達し、これに対してエンハンサーが存在しない場合の値
は4mV/sec.、HRPが存在しない場合の値は480mV/sec.で
あった。エンハンサーが存在し、かつルミノールが存在
しない場合にゼロ信号が得られた。

OBIMPを更に精製すれば信号：背景比が改善できると予
想される。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エンハンサーとしてフェノール系化合物を
   存在させてジヒドロフタラジンジオン(DPD)とペルオキ
   シダーゼ酵素触媒と酸化剤との化学ルミネセンス反応か
   らの光出力を増大する方法であって、エンハンサーがオ
   ルト及び／またはパラ位においてイミダゾリルあるいは
   ベンズイミダゾリル基によって置換されたフェノールか
   ら成ることを特徴とする方法。
2. 【請求項２】感度を高めるフェノール系化合物の存在下
   にペルオキシダーゼと酸化剤とジヒドロフタラジンジオ
   ンとの化学ルミネセンス反応を生起させるルミネセンス
   アッセイあるいは光測定アッセイ法であって、フェノー
   ル系化合物がオルト及び／またはパラ位においてイミダ
   ゾリルあるいはベンズイミダゾリル基によって置換され
   たフェノールであることを特徴とする方法。
3. 【請求項３】フェノール系化合物エンハンサーが式 のｐ−イミダゾール−１−イルフェノールであるか、あ
   るいは式 のｏ−ベンズイミダゾール−２−イルフェノールである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項または第２項に
   記載の方法。
4. 【請求項４】ペルオキシダーゼ酵素が遊離しているか、
   あるいはリガンドと結合しており、ペルオキシダーゼの
   存在あるいは量を光出力の存在あるいは量から決定する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項から第３項のい
   ずれか１項に記載の方法。
5. 【請求項５】ペルオキシダーゼがセイヨウワサビペルオ
   キシダーゼであることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項から第４項のいずれか１項に記載の方法。
6. 【請求項６】酸化剤が過酸化水素であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項から第５項のいずれか１項に記
   載の方法。
7. 【請求項７】DPDがルミノールであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載
   の方法。
8. 【請求項８】化学ルミネセンス反応をpH7.5〜９で生起
   させることを特徴とする特許請求の範囲第１項から第７
   項のいずれか１項に記載の方法。
9. 【請求項９】個別容器に収容された 化学ルミネセンス性のジヒドロフタラジンジオン(DP
   D)、 ペルオキシダーゼ酵素触媒、並びに フェノール系化合物エンハンサー を含む診断アッセイ用キットであって、エンハンサーが
   オルト及び／またはパラ位においてイミダゾリルあるい
   はベンズイミダゾリル基によって置換されたフェノール
   から成ることを特徴とするキット。