JPH0648998B2 - 歯周疾患検査薬 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は歯周疾患検査薬、さらに詳しくは、検体中のあ
る種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、迅速に
検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測する
ことのできる検査薬に関する。

従来の技術および問題点 近年、歯周疾患に関する細菌学的研究が進み、歯周疾患
病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床的
指標と高い相関性を示すことが判明している。また、嫌
気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因菌である
ことも判明しており、その中でも特に、バクテロイデス
・ジンジバリス(Bacteroides gingivalis)が注目され、
その病原性について多数の報告がなされている。

そこで、口腔内におけるこれらの原因菌の存在を検知
し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。

しかしながら、細菌学的方法によるこれらの原因の検知
には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高度
な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培養
や結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点が
あり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。また、
免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免疫で
ある血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫であるリン
パ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する試み
もなされているが、検体試料の調製に煩雑な操作を必要
とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難であ
る。

このような事情にかんがみ、本発明らは、臨床的に実用
化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく、鋭意研
究を重ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に特
異的なアミノペプチダーゼ様酵素活性を有し、また、バ
クテロイデス・ジンジバリスも同様な活性を有し、ある
種の基質を用いることにより、この酵素活性を特異的
に、かつ、簡便、迅速に検出でき、しかも、歯周疾患の
症状が正確に反映されることを見出した。

これまで、口腔内のスピロヘータやバクテロイデス・ジ
ンジバリスがトリプシン様酵素やフィブリン分解酵素を
産生することは知られているが［ジャーナル・オブ・ク
リニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical
Microbiology)，９７〜１０２，１９８２年１月；マイ
クロバイオス・レターズ(Microbios Letters)，２５，
１５７〜１６０，１９８４年；ジャーナル・オブ・ペリ
オドンタル・リサーチ(Journal of Periodontal Resear
ch)，２１，９５〜１００，１９８６年］、臨床症状と
の相関性や検出の特異性の点でこれらの酵素を指標とす
ることは困難である。

問題点を解決するための手段 本発明は、検体中のアミノペプチダーゼ様酵素活性を測
定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断あるい
は予測するための検査薬であって、式： Ｘ−Ｚ−Arg−Ｙ ［Ｉ］ ［式中、Argはアルギニン残基、Ｘはアミノ基保護基、
Ｙはアルギニン残基のＣ末端に結合する発色基、Ｚはそ
のＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合する１〜４個
のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸また
はペプチドの残基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質としてなることを特徴
とする歯周疾患検査薬を提供するものである。

本発明の検査薬を用いれば、唾液、歯垢、歯肉溝浸出液
などのような検体を、好ましくは、中性条件下(pH６．
０〜８．５）、式［Ｉ］の基質と反応させ、その水解活
性の強弱を発色反応により測定することにより、簡便か
つ迅速に、歯周疾患の罹患や進行を診断、予測すること
ができる。

基質として用いる式［Ｉ］の化合物は公知であるが、少
なくとも、公知のペプチド合成法によって容易に製造で
きるものであり、式［Ｉ］中のＸ基で示されるアミノ基
保護基はペプチド合成に用いられる公知のアミノ基保護
基のいずれのものでもよく、例えば、ホルミル基、アセ
チル基、スクシニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベ
ンゾイル基、カルボベンゾキシ基、ｐ−トルエンスルホ
ニル基などが挙げられる。

Ｙ基の発色基は、発色による酵素活性の測定（紫外部、
可視部、赤外部の吸収、蛍光の測定によるものを包含す
る）に用いられるものいずれでもよく、例えば、β−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール、７−アミノ
−４−メトキシクマリン、５−アミノイソフタル酸ジメ
チルエステル、７−アミノ−４−トリフルオロメチルク
マリンなどから由来する基が挙げられる。特に、適当な
発色試薬により、肉眼的に判定可能な発色を示すβ−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール由来の基が好
ましい。

Ｚ基はそのＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合する
１〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｚ基中
のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、アルギニ
ン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残基で
あることが好ましい。該保護誘導体には、セリンのＯＨ
基、システインのＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン
酸のβ−あるいはγ−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベ
ンジル基などで保護されたものが包含される。

式［Ｉ］の化合物における各アミノ酸残基の立体配置
は、アミノペプチダーゼ様酵素の基質となりうる限り、
特に限定するものではない。

本発明の検査薬は、式［Ｉ］の化合物が検体由来のアミ
ノペプチターゼ様酵素の基質として反応できる形態のも
のであればいずれでもよく、もっとも基本的には、式
［Ｉ］の化合物の水溶液でよく、好ましくは、測定時、
pH６．０〜８．５となるように緩衝剤を含有させる。用
いる緩衝剤は通常用いられるものいずれでもよく、例え
ば、トリス塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、
ベロナール緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤などを用いること
ができる。該水溶液は、式［Ｉ］の化合物および、所望
により、緩衝剤を蒸留水に溶解するような公知の方法で
製造することができ、要すれば、さらに、防腐剤、抗生
物質などの他の添加物を適宜添加することができる。

式［Ｉ］の化合物は、最終濃度１０nM〜１０mM範囲、ま
た、緩衝剤は最終濃度１mM〜１Ｍの範囲で使用すること
が好ましく、前記の水溶液は、これらの濃度の式［Ｉ］
の化合物、所望により緩衝剤を含有する、そのまま直
接、検査に供することのできる形態にすることができ、
あるいは、使用時、適宜、蒸留水で所望の濃度に希釈す
る濃厚液の形態とすることもできる。

本発明の検査薬には、これらの水溶液の形態のものを、
さらに、公知の方法により乾燥粉末化、顆粒化したもの
のごとき固体の形態のもの、粉末成分を混合した粉末、
その顆粒化物のごとき固体の形態のもの、あるいは、液
状の形態のものを濾紙、ペーパーディスク、スポンジ、
高分子物などの担体に含浸させものも包含される。

さらに、本発明の検査薬には、式［Ｉ］の化合物を含有
する試薬と、緩衝剤、発色試薬などの他の試薬を組合せ
てなるキットも包含される。

発色試薬は、式［Ｉ］の化合物におけるＹ基に応て適宜
選択でき、Ｙがβ−ナフチルアミン、４−メトキシ−２
−ナフチルアミン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフ
ェノール由来の基の場合、例えば、ファーストガーネッ
トＧＢＣやファストブルーＢＢあるいはこれらのジアゾ
ニウム塩や塩化亜鉛との塩のごとき塩などを、水、エタ
ノール、酢酸緩衝液、２−メトキシエタノールあるいは
これらの混合溶媒などに０．０１〜５重量％の濃度で溶
解した溶液や、０．５〜５Ｍの水酸化ナトリウム、水酸
化カリウム、酢酸などの水溶液が用いられる。これらの
溶液またはその濃厚液、さらには固形化物を式［Ｉ］の
化合物を含有する試薬と組合せてキットとして用いるこ
とができる。

本発明の検査薬を用いて検査を行なうには、まず、検体
を採取する。検体の採取は公知の方法で行なってもよ
く、例えば、歯肉溝浸出液や唾液は濾紙、キャビラリ
ー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿棒、キ
ュレット、スケラーなどで採取できる。

ついで、式［Ｉ］の化合物濃度を１０nM〜１０mMに調整
した該化合物を含有する本発明の検査薬と検体を、例え
ば、試験管、マイクロタイタープレート、セル、バイア
ル瓶、プラスチック・キュベットなどの中で接触させ、
好ましくは、pH６．０〜８．５で水解反応を行なわせ
る。この反応は、通常、２５〜４５℃で行なわれ、反応
時間は検体や反応温度により異なるが、３７℃で１５分
間〜７２時間程度の反応が好ましい。

反応終了後、発色試薬を添加し、発色の有無、強弱を肉
眼あるいは分光光度計や蛍光光度計で判定し、これによ
り、検体中のアミノペプチダーゼ様酵素活性の有無、強
弱を判断し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測
する。

実験および実施例 つぎに、実験および実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。

実験１ 各種口腔内嫌気性細菌のアミノペプチダーゼ様酵素活性 口腔内の嫌気性細菌であるトレポネーマ・デンティコー
ラ(Treponema denticola)４株、バクテロイデス・ジン
ジバリス５株、アクチノバチルス・アクチノマイセテム
コミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)４
株、キャプノサイトファーガ・エス・ピー(Capnocytoph
aga sp.)４株およびフゾバクテリウム・ヌクレータム(F
usobacterium nucleatum)３株のアミノペプチダーゼ様
酵素基質に対する水解活性をつぎのとおり測定した。

トレポネーマ属の細菌はＴＹＧＵＳ培地を用い、３７℃
で７日間、他の細菌はブレイン・ハート・インフュージ
ョン・ブロスを用い、３７℃で４８〜７２時間嫌気的に
培養し、培養液を希釈して、各々、６６０nmにおける吸
光度が１．０の細菌懸濁液を調製した。

β−ナフチルアミン由来の種々の発色基を有するアミノ
ペプチダーゼ様酵素の基質化合物を０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液(pH７．０）に０．２mMの濃度で溶解し、基質溶
液を調製した。

この基質溶液１．５mlに、前記の細菌懸濁液０．３mlを
加え、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、発色
試薬（１０％ツィーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液(p
H４．２）にジアゾニウム塩ガーネットＧＢＣを０．５m
g／mlの濃度で溶解して調製）０．６mlを加え、１５分
後に５２５nmにおける吸光度を分光光度計にて測定し
た。

水解活性は、各細菌株のβ−ナフチルアミン遊離量の平
均値に基づき、つぎのとおり表示した。

−：遊離量＜５ナノモル／ml ±：遊離量５〜＜１０ナノモル／ml ＋：遊離量１０〜＜２０ナノモル／ml ++：遊離量２０〜＜４０ナノモル／ml +++：遊離量４０ナノモル／ml以上 結果を第１表に示す。第１表中、基質化合物の略号はつ
ぎのとおりである。

Ａ：アラニン−β−ナフチルアミド Ｇ：グリシン−β−ナフチルアミド Ｒ：アルギニン−β−ナフチルアミド Ｋ：リジン−β−ナフチルアミド ＧＲ：グリシル−アルギニン−β−ナフチルアミド ＲＲ：アルギニル−アルギニン−β−ナフチルアミド ＲＧ：アルギニル−グリシン−β−ナフチルアミド ＫＲ：リジル−アルギニン−β−ナフチルアミド ＦＲ：フェニルアラニル−アルギニン−β−ナフチルア
ミド ＧＫ：グリシル−リジン−β−ナフチルアミド ＧＦ：グリシル−フェニルアラニン−β−ナフチルアミ
ド ＰＦＲ：プロリル−フェニルアラニル−アルギニン−β
−ナフチルアミド BzGR：Ｎ−ベンゾイル−グリシル−アルギニル−β−ナ
フチルアミド CxRR：Ｎ−カルボベンゾキシ−アルギニル−アルギニン
−β−ナフチルアミド CxFR：Ｎ−カルボベンゾキシ−フェニルアラニル−アル
ギニン−β−ナフチルアミド CxKR：Ｎ−カルボベンゾキシ−リジル−アルギニン−β
−ナフチルアミド CxVGR：Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−ア
ルギニン−β−ナフチルアミド BzVGR：Ｎ−ベンゾイル−バリル−グリシル−アルギニ
ン−β−ナフチルアミド BcVLGR：Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−バリル−ロイシ
ル−グリシン−アルギニン−β−ナフチルアミド ScGPLGR：Ｎ−スクシニル−グリシル−プロリル−ロイ
シル−グリシル−アルギニン−β−ナフチルアミド 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性菌のうち、歯周疾患
原因菌であるスピロヘータ（トレポネーマ・デンティコ
ーラ）およびバクテロイデス・ジンジバリスが特異的な
アミノペプチダーゼ様酵素活性を示し、種々の基質化合
物中、式［Ｉ］で示される化合物を特異的に水解する。

実験２ 臨床所見との相関−１ 臨床所見上、健常であると認められた者５名、歯肉炎患
者６名および歯周炎患者６名から、各々、ペーパーポイ
ントにより歯肉溝浸出液検体を採取し、リンガー液１．
５mlに分散後、位相差顕微鏡を用い、全菌数に対するス
ピロヘータの相対量 を測定した。また、このリンガー液０．３mlを、実験１
におけると同様にして調製した基質溶液を用い、同様に
して水解活性を測定した。基質としては、式［Ｉ］の化
合物であるＮ−ベンゾイル−バリル−グリシル−アルギ
ニン−β−ナフチルアミド(BzVGR)およびＮ−カルボベ
ンゾキシ−バリル−グリシン−アルギニン−β−ナフチ
ルアミド(CxVGR)を用いた。

結果を第２表に示す。なお、第２表中、水解活性は発色
を肉眼で判断し、つぎの基準により表示した。

−：オレンジ色 ＋：濃オレンジ色 ++：褐色 +++：濃渇色 第２表に示すごとく、水解活性はスピロヘータ量、臨床
所見と相関する。なお、両方の基質間において反応の差
は認められない。

実験３ 臨床所見との相関−２ 健常者群（１０名）、成人性歯周炎患者群（１０名）、
限局性若年性歯周炎患者群（４名）の各群の混合全唾液
遠心上清を検体として用い、前記と同様に、ただし、３
７℃で４時間反応させて水解活性を測定した。基質とし
て、Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギ
ニン−ｐ−ニトロアニリド(CxVGR-pNA)、Ｎ−カルボベ
ンゾキシ−バリル−グリシン−アルギニン−４−メトキ
シ−２−ナフチルアミド(CxVGR−４ＮＡ）およびＮ−カ
ルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニン−β−
ナフチルアミド(CxVGR−βＮＡ）を用い、CxVGR-pNAの
場合は１Ｎ水酸化ナトリウム、CxVGR−４ＮＡおよびCxV
GR−βＮＡの場合はファーストブルーＢＢを用いて発色
させた。結果を第３表に示す。

第３表に示すごとく、成人性歯周炎患者および限局若年
性歯周炎患者は、いずれも、健常者と比べて約２倍以上
の高い値（活性）を示し、統計的にも有意差が認められ
る。したがって、この活性の測定により、歯周疾患の診
断、予測を客観的に行なうことができる。

実施例１ Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−グリシル−アルギニン
−４−メトキシ−２−ナフチルアミドの２mM蒸留水溶液
を調製し、基質溶液とした。

０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）を調製し、緩
衝液として用いた。

１０％ツイーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液(pH４．
０）にジアゾニウム塩ガーネットＧＢＣを０．５mg／ml
の濃度で溶解し、発色試薬とした。

これらを組合せて、本発明の歯周疾患検査薬キットとし
た。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。

被検者の歯肉溝にペーパーポイントを３０秒間挿入して
検体を採取する。基質溶液液０．１mlおよび緩衝液０．
９mlを混合し、これに検体を加え、３７℃で一昼夜反応
させる。反応終了後、発色試薬０．３mlを加え、室温で
１５分間放置後、色調を肉眼観察する。検体を添加しな
い対照と比較し、褐色の強弱を判定する。強い褐色の呈
色は歯周疾患の罹患を示す。

実施例２ Ｎ−ベンゾイル−バリル−グリシル−アルギニン−４−
メトキシ−２−ナフチルアミド５００ナノモルをペーパ
ーディスク（径０．６cm）に含浸させて基質試薬を調製
した。

０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．２）を調製し、緩衝液と
して用いた。

これらと、実施例１におけると同様に調製した発色試薬
を組合せて、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。

緩衝液４００μｌをバイアル瓶に入れ、これに、被検者
から採取した混合唾液１００μｌを加え、さらに基質試
薬のペーパーデイスクを加え、３７℃で４時間反応させ
る。反応終了後、発色試薬を加え、実施例１と同様に肉
眼観察して判定する。

実施例３ Ｎ−カルボベンゾキシ−アルギニル−４−メトキシ−２
−ナフチルアミド５００ナノモルをアンプル（内径５m
m、長さ３cm）内で凍結乾燥させて基質試薬とした。
０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）を調製し、
緩衝液とした。

１０％ツイーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液（pH４．
２）にジアゾニウム塩ファーストブルーＢを１mg／mlの
濃度で溶解し、発色試薬とした。これらを組み合わせ
て、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。

被験者の歯肉溝にペーパーストリップを３０秒間挿入し
て検体を採取する。緩衝液１mlを基質含有アンプルに入
れ基質を溶解させる。これに検体を加え、３７℃で一昼
夜反応させる。反応終了後、発色試薬０．４mlを加え、
実施例１と同様に肉眼観察して判定する。

実施例４ Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−バリル−ロイシル−グリ
シル−アルギニン−β−ナフチルアミドを０．０５Ｍリ
ン酸緩衝液（pH７．２）で２００ナノモル／mlとなるよ
うに調製し、その１００μｌを円形ろ紙（径１cm）に含
浸乾燥させ、キュベット（内径１cm）底に挿入して基質
試薬とした。

これらと実施例３におけると同様に調製した発色試薬を
組み合わせて、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。

このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。

被検者から採取した混合唾液１００μｌをキュベットに
加え、３７℃で４時間反応させる。反応終了後、発色試
薬４０μｌを加え、実施例１と同様に肉眼観察して判定
する。

発明の効果 本発明の検査薬を用いれば、特殊な設備や高度の技術を
必要とせずに、簡便かつ迅速に歯周疾患の罹患や進行を
客観的に診断あるいは予測することができ、これによ
り、歯周疾患の治療や予防を適切に行なうことができ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体中のアミノペプチターゼ様酵素活性を
   測定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断ある
   いは予測するための検査薬であって、式： Ｘ−Ｚ−Ａｒｇ−Ｙ ［式中、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｘはアミノ基保護
   基、Ｙはアルギニン残基のＣ末端に結合する発色基、Ｚ
   はそのＣ末端がアルギニン残基のＮ末端と結合する１〜
   ４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ酸
   またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質としてなることを特徴
   とする歯周疾患検査薬。
2. 【請求項２】Ｚ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、
   リジン、アルギニン、フェニルアラニンまたはこれらの
   保護誘導体残基である特許請求の範囲第（１）項の歯周
   疾患検査薬。