JPH06500007A

JPH06500007A - 新規のプロモーター領域

Info

Publication number: JPH06500007A
Application number: JP3510339A
Authority: JP
Inventors: クルト，ローラント; フィリプセン，ペーター; シュタイナー，ザビーネ; ライト，マーチン　シー．
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1990-06-25
Filing date: 1991-06-15
Publication date: 1994-01-06
Anticipated expiration: 2015-07-04
Also published as: DE4020181A1; DE59102761D1; ES2060392T3; EP0536192A1; CA2080482A1; DK0536192T3; CA2080482C; ATE110779T1; EP0536192B1; JP3059214B2; WO1992000379A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規のプロモーター領域本発明は、アシビ＋”ゴシビイ（＾５ｈｂｙａ　ｇｏｓｓｙｐｉｉ）からのプロモーター領域、このプロモーター領域で遺伝的に変えられた菌類及びその使用に関する。

Ａ、ゴシピイは、ビタミンＢ２の発酵的生産に使用される。タンパク質産物の生産によるＡ、ゴシビイのための発酵工学の使用を遺伝子工学の方法の使用下に拡大することは望ましいことである。この目的のためにＡ、ゴシビイについての表現系が必要とされる。若干の高等子嚢菌類、例えばアスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｆｌｌｕｓ　ｎｆｇｅｒ）について、そのような系がすでに記載された（　Ｒａｍｂｏｓｅｋ及びＬｅａｃｈｌＣＲＣＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６　（１９８７）　、３５７−３９３）。それに対して、その属の唯一の代表である半子嚢菌類（Ｈｅｍｉａｓｃｏｓｙｃｅｔｅｎ）　、Ａ、ゴシビイでの遺伝子工学分野上の経験は今までに無い。

所望の生産物についてコードする遺伝子の発現のための系の基本的成分は、いわゆるプロモーター領域であり、これは１）　遺伝子の転写のためにな（ではならない機能的プロモーターから、かつ２）　ｍＲＮＡにおける転写後に翻訳のために必要である５′非−コード化領域（プロモーター及び翻訳開始の間）から成る。

本発明の目的は、翻訳延長因子ＥＦ−１α（＝ＴＥＦ−１α）をコードするＡ、ゴシピイーＴＥＦ−遺伝子のプロモーター領域である。

この遺伝子は極めて強力に表現され、従って極めて有効なプロモーター領域を有する。

本発明により得られるプロモーター領域は、配列−記録Ｎｏ、１に示されたヌクレオチド配列を有する。転写及び翻訳の開始のための能力を有する新規のかつ配列決定されたプロモーター領域の機能範囲を、３′−末端では良好にかつ５′− 末端ではあまり良好ではなく制限することができるので、Ａ、ゴシビイー遺伝子の自然のプロモーター領域は、その長さで容易に挙げられた配列からはずされることは除外することはできない。

本発明のもう１つの目的は、翻訳延長因子ＥＦ−１α（＝ＴＥＦ−１α）をコードするＡ、ゴシピイーＴＥＦ−遺伝子のターミネータ−領域である。

このターミネータ−領域は、有効な転写停止のために使用されうる。

本発明により得られるターミネータ−領域は、配列−記録Ｎｏ、２、位置１５１３−２０９５に所定のヌクレオチド配列を有する。この配列の３′−末端短縮も転写ターミネータ−として考慮される。

ターミネータ−領域は、ＴＥＦ−プロモーター領域又は他の同種又は異種のプロモーターと関連して使用され得る。

更に本発明の目的は、前記のプロモーター領域又はその一部及び／又は前記のターミネータ−領域又はその一部を有する菌類である。

プロモーター領域は、特に次の菌類中に挿入され得る：アシビャ・ゴシピイ、アシビヤと近縁の種類、例えば特にエルモテシウム・アシビ（Ｅｒｅｍｏｔｈｅｃｉｕｓ　ａｓ−ｈｂｙｉ）及びアシビヤとは類縁ではない属、例えば特にアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びノイロスポラ（Ｎｅ−ｕｒｏｓｐｏｒａ）。

新規のプロモーター領域は、ａ）　隣接するＤＮＡ−配列を含むＡ、ゴシピイからの翻訳延長因子ＥＦ−１α のための遺伝子（ＴＥＦ−遺伝子）のクローニング及び引続いての分離により、ｂ）　Ａ、ゴシピイ中で選択可能なプロモーター欠失遺伝子の解放読み枠（ｏｆｆｅｎｅｓ　Ｌｅｓｅｒａｓｔｅｒ）へのＡ。

ゴシビイーＤＮＡ−フラグメントの融合、強い表現性の形質転換体の単離及び次のＴＥＦ−プロモーターの選択により、Ｃ）　公知方法による化学的合成により製造することができる。

新規のプロモーター領域は、適当なベクター系と−緒に、Ａ、ゴシビイ及び他の菌類中で同種及び異種のタンパク質を過剰発現させる可能性を開示する。その際、例えばビタミンＢ２−生合成の遺伝子並びにビタミンＢ２の過剰生産に責任のある構造的に強化された遺伝子の表現又は経済的に重要であるタンパク質の過剰表現及び単離が問題でありうる。更に新規のプロモーター領域を用いて、場合によっては他の菌類とは異なっているＡ、ゴシビイの転写後の変性ポテンシャル（例えばグリコジル化（Ｇｌｙｋｏｓｉｈｉｅｒｕｎｇ）　）が利用するこができる。従来使用された系、例えばアスペルギルス又はサツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）により全ての異種タンパク質が十分な量で製造され得るわけではないので、新規の宿主生体（この場合例えばＡ、ゴシビイ）のための効果的なＴＥＦ−プロモーター領域を有する表現系の開発が極めて重要である。

例１、アシビヤ・ゴシビイーＴＥＦ−遺伝子の単離Ａ、ゴシピイーミセルから単離されたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａ■Ｈ１を用いて切断した。ＴＥＦ−遺伝子又はその一部を有するＤＮＡ−フラグメントを、制限フラグメントのサイズ分けの後に、アガロース−ゲル電気泳動法及び引続＜３２Ｐ −標識化の異種ＴＥＦ−遺伝子試料とのバイブリド形成により同定した、。ＴＥＦ−遺伝子試料は、Ｓ、セレビジ７　工（Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｔ　Ｅ　Ｆ　２−遺伝子の１３７７ｂｐ長さの開放読み枠のヌクレオチド３６３〜１２３５を包含する（　５ｃｈｉｒｓ＋ａｉｅｒ及びＰｈ１ｌｉｐｐｓｅｎ、　Ｅ　Ｍ　Ｂ　ＯＪ、３（１９８４）　、３３１１−３３１５）。４　、６　ｋｂ長さのＥｃｏＲＩ−フラグメント及び６　、４　ｋｂ長さのＢ　ａｍＨＩ−フラグメントを、異種ＴＥＦ−遺伝子試料と、バイブリド形成させた。この長さ範囲のフラグメントをアガロースゲルから溶離させ、Ｅ　ｃｏＲＩもしくはＢａ■ＨＩ−で切断されたベクターｐＵ　Ｃ８（Ｖｉｅｉｒａ及びＭｅｓ−ｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅｌ　９　（１９８２）　２５９−２６８　）中でクローニングしかつＥ、ｃｏｌｉ中に形質転換させた。ＴＥＦ−ＤＮＡを有するクローンは、！１２ｐ−標識化の異種試料とのコロニーバイブリド形成（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びｎｏ−ｇｎｅｓｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　７２　（１９７５）　、３９６１−３９６５）により認識された。陽性クローンは、４．６ｋｂ長さのＥｃｏＲＩ−フラグメント又は６　、４　ｋｂ長さのＢａ璽Ｈ１ −フラグメントを有した。両クローンは、２．１ｋｂの範囲で重なり、これはＴＥＦ−遺伝子試料への相同を有しかつそれは配列決定された（配列Ｎｏ、２）。

この２．１ｋｂ長さのフラグメントは、１３７７ｂｐの開放読み枠、５′−非コード化領域の１３６ｂｐ及び３′−非コード化領域の５８２ｂｐを有する。ＥｃｏＲＩ−切断部位を過ぎてその先のＨ１ｎｄｌ［［−切断部位までの５′−非コード化領域の２７８ｂｐが測定された。引続きプロモーター領域を、出発コドンの前の３７９ｂｐのほかに更にＴＥＦ−遺伝子の開放読み粋の最初の２４ｂｐを有する４０３ｂｐ長さのＨ１ｎｄｌ［［／　Ｈｉｎｃ■−フラグメントとして単離し、かつｐＡＧ−１００及びｐＡＧ−１０１の構築のために使用した（配列Ｎｏ、１）。

２、プラスミド構築ａ）　ベクターｐＡＧ−１（第１図）（寄託ＤＳＭ６０１０）、ベクターｐＥＸ４の誘導体を、Ｅ　ｒｎｓｔ及びＣｈａｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６３　（１９８５）　８−１４によって製造した。ｐＡＧ−１は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ（３’Ｈ）に関してコードするトランスポゾンＴｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子を有する１、７ｋｂＳａｌｌ−フラグメントを含有する。最初のｐＥＸ４−構築体中で、先ずＴｎ９０３の１６９５ｂｐＰｖｕｌＩ−フラグメント（Ｏｋａ等、Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　ｋ４７　（１９８１）　、２１７−２２６）を、補充された５ａｌＩ−切断部位を有するプラスミド中に連結させた。その際、５ａｌｌ −切断部位は保持されたままであり、かつ耐性遺伝子は、１．７ｋｂＳａｌｌ断版として単離され得る。ｐＡＧ−１はサツカロミセス・セルビジアエ、ＡＲＳ− エレメントＡＲ８１及び２μＡＲ８を含有し、かつアシビャゴシビイ中に自発的に複製する（　ｒｅｐｌｉｚｉｅｒｔ）。

ｂ）ｐＡＧ−２（第２図）。カナマイシン耐性遺伝子を有する１　、　７　ｋｂ　Ｓ　ａｔ　Ｉ−フラグメントをｐＡＧ−１から切断し、かつＳ、セルビジアエの５ａｌｌ切断部位に、Ｅ、ｃｏｌｉシャトルベクターＸ　Ｅ　ｐ　２４　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ８　（１９７９）　、１７−２４　；Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ　Ｉｎｃ、、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ　Ａ’、ＵＳＡ、１９８８−１９８９Ｃａｔａｌｏｇ、１１２−１１３）を挿入した。新たに生じたプラスミド−ｐＡＧ−２−の構造を、制限酵素切断地図作製によって調べ、この際１．７ｋｂＳａｌＩ−フラグメント中にあるＸｈｏＩ−切断部位を、挿入配向の調査に使用した。ｐＡＧ−２は、サツカロミセス・セルビジアエＡＲ５−エレメント２μＡＲ８を含有し、かつアシビヤ・ゴシピイ中に自発的に模写されたｃ）　ｐＡＧ−１００（第３図）。３′一方向でカナマイシン、耐性遺伝子の翻訳出発の後の３０ｂｐにあるｐＡＧ−２のＸｈｏｌ切断部位に、プロモーター領域及びＡ、ゴシビイからの翻訳延長因子ＥＦ−１αのための遺伝子（ＴＥＦ−遺伝子）の開放読み枠の最初の２４ｂｐを含有する４０３ｂｐ長さのＨ１ｎｄｕ［／　Ｈ１ｎｃｌｌ−フラグメントを、突出末端の相補後に挿入した。こうして生じたプラスミドｐＡＧ−１００中のフラグメントの配向を、制限酵素切断地図作製によってＨ１ｎｄｌ［［で調べた。４０３ｂｐ長さのフラグメントの挿入によって、ＡＰＨ（３’）Ｉのｌ０Ｎ−末端アミノ酸をＡ、ゴシピイ翻訳延長因子ＥＦ−１αの最初の８アミノ酸に代えた。他のアミノ酸によるＡＰＲ（３’）Ｉの最初の１９アミノ酸の除去又は交換は、活性の損失に結びつかない（Ｃｈｅｎ及びＦｕｋｕｈａｒａ、　Ｇｅｎｅ６９　（１９８８）　、１８１−１９２）。ＴＥＦ−プロモーター領域の挿入後の５ａｌＩ−フラグメントの配列は、配列ＮＯ，２に示す。ｐＡＧ−１００は、サツカロミセス・セルビジアエＡＲ８−エレメント２μＡＲ８を含有し、かつアシビヤ・ゴシピイ中に自発的に複製するｄ）ｐＡＧ−５（第４図）。ｐＡＧ−１からのカナマイシン耐性遺伝子を有する１　、　７　ｋｂフラグメントを、Ｔ）　Ｂ　Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ等、Ｇｅｎｅ２　（１９７７）９５−１１３）の５ａｌｌ−切断部位にサブクローン化した。生じたプラスミド−ｐ　Ｊ　Ｌ３Ａ−は、ｐＢＲ３２２−成分中に各々１個のＢａ−Ｈｌ−及び１個のＥｃｏＲＩ・−切断部位を有し、従ってｐ　Ｊ　Ｌ３Ａは、二重消化（Ｄｏｐｐｅｌｖｅｒｄａｕ）　Ｊ：よって３７５ｂｐ及び５６８８　ｂｐフラグメントに分解される。大きなフラグメントを、翻訳延長因子ＥＦ−１α（ＴＥＦ−遺伝子）に関する遺伝子の開放読み枠を含有する（配列Ｎｏ、ｌ）　２．１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　／　Ｂａｗｌ−Ｉ　Ｉ　Ａ、ゴシピイフラグメントと連結させた。生じたプラスミドを、ｐＡＧ−５と表示した。ｐＡＧ− ５は、サツカロミセス・セルビジアエＡＲ８−エレメントを含有しない。

ｅ）　ｐＡＧ−１０１（第５図）。カナマイシン耐性遺伝子の開放読み枠中にあるＸｈｏｌ切断部位中に、ｐＡＧ−１００の構築のために記載したように、プロモーター領域及びＡ、ゴシピイからのＴＥＦ−遺伝子ノ開放読み枠の最初の２４ｂｐを有する４　０３ｂｐ　ＨｉｎｄｎＩ／ＨｉｎｃＩ！−フラグメントを挿入した。そうして生じたプラスミドを、ｐＡＧ−１０１表示した。ｐ　ＡＧ−１０１は、サツカロミセス・セルビジアエＡＲ３−エレメントを含有しない。

ｆ）　ｐＢＫ３１８７１　（ＴＥＦ−プロモーター１ａｃＺ−融合のための前駆プラスミド）ニブラスミドｐＢＫ　Ｓ　”　（Ｓｈｏｒｔ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、、１６　（１９８８）　、７５８３−７６００）のＰｓｔｌ切断部位中に、プラスミドＤ　Ｍ　Ｃ１８７１（Ｓｈａｐｉｒａ等、Ｇｅｎｅ、２５　（１９８３）　、７ｌ−８２）からの３１１３ｂｐ長さのＰｓｔＩフラグメントをクローン化した。このフラグメントは、最初の７コドンが欠けているＥ、　ｃｏｌｉ　（Ｋａｌｎｉｎｓ等、ＥＭＢＯＪ、　、２　（１９８３）　、５９３−５９７）からのｌａｃ　Ｚ−遺伝子の開放読み枠を有する。

ｇ）　ｐＰＬｌ　（第６図）、ｐＢＫＳ１８７１を１ａｃＺ−遺伝子の前のＳｍａＩ切断部位で線状にした。線状化されたプラスミド中に、ＴＥＦ−プロモーター及びＡ、ゴシビイからのＴＥＦ−遺伝子の最初の８コドンを含む隣接配列を有する１　５００ｂｐ　Ｈｉｎｃ■−フラグメントをクローン化挿入（ｅｉｎｋｌｏｎｉｅｒｔ）させた。それによって、β−ガラクトシダーゼに関してコード化し、その最初の７アミノ酸がＡ、ゴシビイからのＥＦ−１αの最初の８アミノ酸に代えられている開放読み枠が種々の長さの範囲を有するＴＥＦ−プロモーター１ａｃＺ−融合を単離することができた。

ｈ）　ｐＰＬ２　（第９図）ｏｐＢＫｓ１８７１を１ａｃＺ−遺伝子の前のＳａ＋ａｌ−切断部位で線状にした。線状化されたプラスミド中に、ＴＥＦ−プロモーター（２７０ｂｐ）の一部並びにＡ、ゴシビイからのＴＥＦ−遺伝子の最初の８コドンを有する（２４ｂｐ）　２９４ｂｐ長さのＲＨ１／　Ｈ１ｎｃＩＩ−フラグメントをクローン化挿入させた。

ｉ）　ｐＰＬ３　（第１０図）。ｐＢＫＳ１８７１を１ａｃＺ−遺伝子の前のＳｍａＩ−切断部位で線状にした。線状化されたプラスミド中に、ＴＥＦ−遺伝子（２４ｂｐ）の最初の８コドン及び５′一方向で翻訳されなかった領域の出発コドンの前にある範囲の２１５ｂｐを有する２　３９　ｂｐ長さのＨａ１ｍ／フラグメントをクローン化挿入した。

ｊ）　ｐＰＬ４　（第１１図）、ｐＢＫＳ１８７１を１ａｃＺ−遺伝子の前のＳｍａＩ−切断部位で線状にした。この線状化されたプラスミド中に、ＴＥＦ−遺伝子の最初の８コドン及び５′一方向で翻訳されなかった領域の出発コドンの前にある範囲の１３４　ｂｐを有する１５８ｂｐ長さのＥ　ｃｏＲｌ／　Ｈ１ｎｃｌＩ−フラグメントをクローン化挿入した。

ｋ）　ｐＡＧ−１１０（第７図）。Ｘｂａｌ及び５ａｉｌでｐＰＬｌを分断することによって、１５００ｂｐ長さのＴＥＦ−プロモーターフラグメントとＩａｃＺ遺伝子との融合を有する４６’０Ｏｂｐフラグメントを単離した。このフラグメントを、突出末端の補充後に、ｐＡＧ−１００の補充されたＢａｍＨＩ切断部位にクローン化挿入した。

１）　ｐＡＧ−１１１（第８図）　、　ＨｉｎｄＩｆｆでｐＰＬｌを分離することによって、３５０９ｂｐ長さのフラグメントを単離した。このフラグメント中で、ＴＥＦ−プロモーター領域は約１１００ｂｐ短くされている。従ってこれは、ｐＡＧ−１００，ｐＡＧ−１０１、ｐＡＧ−１１０及びｐＡＧ−１１１中で６４１８耐性遺伝子の転写を制御するプロモーター領域に相応する。突出末端の補充後に、３５０９　ｂｐ長さのフラグメントをｐＡＧ−１００の相補されたＢａ飄ＨＩ切断部位中にクローン化挿入した。

ｍ）　ｐＡＧ−１１２（第１２図）。ＸｂａＩ及びＳａｔ■でｐＰＬ２を分断した後に、２９４　ｂｐ長さのプロモーターフラグメントと１ａｃＺ−遺伝子との融合を有する３３９２ｂｐ長さのフラグメントを単離し、かつ突出末端の補充後にプラスミドｐＡＧ−１００の補充されたＢａｍＨＩ−フラグメント中に装入した。

ｎ）　ｐＡＧ−１１３（第１３図）、ＸｂａＩ及びＳａｌ工でｐＰＬ３を分断した後に、２３９ｂｐ長さのプロモーターフラグメントとＩａｃＺ−遺伝子との融合を有する３　３３７　ｂｐ長さのフラグメントを単離し、かつ突出末端の補充後に、プラスミド＝ｐＡＧ−１００の補充されたＢａ■ＨＩ−切断部位中に装入した。

ｏ）　ｐＡＧ−１１４（第１４図）。ＨｉｎｄｍでｐＰＬ４を分断した後に、１５８　ｂｐ長さのプロモーターフラグメントと１ａｃＺ−遺伝子との融合を有する３２７３ｂｐ長さのフラグメントを単離しかつ突出末端の補充後にプラスミドｐＡＧ−１００の補充されたＢａｍＨＩ−切断部位中に装入した。

ｐ）　ｐＡＧ−１１５（第１５図）、ＢａｍＨＩでｐＢＫＳ　１８７１を分断した後に、１ａｃＺ−遺伝子の開放読み枠を有する３０６９ｂｐ長さのフラグメントを単離し、この際開放読み枠の最初の７コドンは無くかつ開放読み枠の前のプロモーターフラグメントはどれも融合されなかりた。このフラグメントをプラスミドｐＡＧ−１００のＢａｍＨＩ−切断部位に挿入した。

ｑ）　ｐＡＧ−１２０゜ｐＢ］ＩＫｓ−（Ｓｈｏｒｔ等、Ｎｕｃ−１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６　（１９８８）　、７５８３−７６００）を５ｓｐＩ及び５ｅａｌで分断しかつ２０８４ｂｐ長さのフラグメントを単離した。Ｙ　Ｅ　Ｐ　２４　（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等、Ｇｅｎｅ８　（１９７９）　、１７−２４）を５ｃａｌ及びＣ１ａＩで分断し、かつ２７８２　ｂｐ大きさのフラグメントを単離した。これを突出末端の補充後に、ｐＢｎＫＳ−からの２０８４　ｂｐ長さの５ｃａＩ／５ｓｐＩ−７ラグメントと連結させ、従って再び完全なアンピシリン耐性遺伝子が生じた（ＳｃａｌはｐＢｎＫｓ−でかツＹＥＰ２４はアンピシリン耐性遺伝子で切断する）。

ｒ）　ｐＡＧ−１２１゜ｐＡＧ−１００を５ａｌｌ及びＨ１ｎｄｌｌ［で切断しかつＧ４１８−耐性遺伝子の一部を有　゛する６６９ｂｐ長さのフラグメントを単離する。これを５ＡＩＩ／Ｈｉｎｄｌｌ［で切断されたプラスミドｐＢ［［Ｋｓ＋（５ｈｏｒｔ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６　（１９８８）、７５８３−７６００）中にクローン化挿入した。

ｓ）　ｐＡＧ−１２２，ｐＡＧ−１００をＨｉｎｄｌ［［で切断しかつＴＥＦ− プロモーターの制御下でＧ４１８−耐性遺伝子の一部を有する９４０ｂｐ長さのフラグメントを単離する。これをＢ　１ｎｄｌｌＩで切断されたプラスミドｐＡＧ−１２１中に、完全なＧ４１８−耐性遺伝子が生じるように、挿入した。このプラスミドのＥ、ｃｏｌｉにおける形質転換は、カナマイシン−含有培地上での形質転換体選択を許す。

ｔ）　ｐＡＧ−１２３゜ｐＡＧ−１２２を５ａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断しかつＴＥＦ−プロモーターの制御下に０４１８−耐性遺伝子を有する１６３９ｂｐ長さのフラグメントを単離した。これを５ｃａＩで切断されたプラスミドｐＡＧ− １２０中に挿入し、それによってカナマイシン−含有培地上でのＥ、　ｃｏｌｔ形質転換体の選択が可能とされた。

ｕ）　ｐＡＧ−１３０゜ｐ　Ｂ　ＩＩ　Ｋ　Ｓ”　（Ｓｈｏｒｔ等、Ｎｕｃ−１ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６　（１９８８）　、７５８３−７６００）をＨ１ｎｄｌ［［及び１（ｉｎａｌｌで分断し、かつ４０３　ｂｐ長さのＨｉｎｄｌｌｌ／　ＨｉｎｃＩＩ　−Ｔ　Ｅ　Ｆ−プロモーターフラグメントを挿入した。

ｖ）　ｐＡＧ　１３１゜ゲノムの＾、ｇｏｓｓｙｐｉｉＤ　Ｎ　Ａの２．１ｋｂの大きさのフラグメントを有し、その上にＴＥＦ−遺伝子を含有しているクローンから、ＴＥＦ−遺伝子の３′−末端の２５ヌクレオチド並びに３′一方向でそれに続く範囲を有する（ターミネータ−フラグメント）２６０ｂｐ大きさのＨａｅＩ［［／ＡｃｃＩ−フラグメントを単離した。このフラグメントを突出末端の補充後に、ＨｉｎｃＩＩで分断されたプラスミドｐ　Ｂ　ｆＩＫｓ−（Ｓｈｏｒｔ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６　（１９８８）　、７５８３− ７６００）中に挿入した。

ｗ）　ｐＡＧ−１３２ａｐａｇ−１３０を５ｃａＩ及びＸｈ。

■で切断しかつ２２４８　ｂｐ大きさのフラグメントを単離した。ｐＡＧ−１３１を同様に５ｃａｌ及びＸｈｏｌで分断しかつ１４４２ｂｐ大きさのフラグメントを単離し、これを新たに完全なアンピシリン耐性遺伝子が生じるようにｐＡＧ −１０３からの２２４８ｂｐフラグメントと連結させた。

ｘ）　Ｍ１３ＰＴ、ｐＡＧ−１３２をＢａ５ＨＩで分離しかつＴＥＦ−プロモーター及びＴＥＦ−ターミネータ−フラグメントからの融合を含有する７５２ｂｐ大きさの７ラグメントを単離した。これをＭ１３ｓｐ９のＢａｇ＋ＨＩ−切断部位にクローン挿入した。

ｙ）　Ｍ１３ＰＴ１、Ｍ１３Ｔ２、Ｍｌ　３Ｔ３゜Ｍｌ　３　ＰＴを、オリゴヌクレオチド−指向の突然変異（Ｋｒａｓｅｒ等、Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄ　Ｒｅｓ、２４　（１９８４）、９４４１−９５５６）により、ＴＥＦ−遺伝子の停止コドンの後で（ターミネータ−フラグメント中）、５ｃａＩ−切断部位を、かつＴＥＦ−遺伝子の出発コドン中で（プロモーターフラグメント中）　、ＮｃｏＩ−切断部位（Ｍ１３ＰＴ１）　、Ｎ５ｉＩ−切断部位（Ｍ１３ＰＴ２）又は５ｐｈＩ −切断部位（Ｍ１３ＰＴ３）が産生されるように変換させた（第１７図）。

ｚ）　ｐＡＧ−２０１゜ｐＡＧ−２０２ｐＡＧ−２０３（第１８図）Ｍ１３ＰＴ１、Ｍ１３ＰＴ２及びＭ１３ＰＴ３をＢａｍＨＩで分断しかつ分断体からＴＥＦ−遺伝子のプロモーター及びターミネータ−領域を有する７　５１　ｂｐ大きさのフラグメントを単離した。このＴＥＦ−シグナル配列をプラスミドｐＡＧ−１２３のＢａ禦ＨＩ−切断部位中に挿入し、かつプラスミドｐＡＧ−２０１を得た。同じ方法により、Ｍ１３ＰＴ２からプラスミドｐＡＧ−２０２を、かつＭ１３ＰＴ３からプラスミドｐＡＧ−２０３を構築させた。

３、ＴＥＦ−プロモーター領域−プラスミドでのＡ。

ゴシビイの形質転換形質転換は、次の概要により行なったニーＭＡ２　（２００■ｌ）に胞子約１− ２Ｘ１０？を接種する、 −３２−４０時１１Ｊ’１２７℃で３５ｏＵｐ履でシヵネンフラスコＣ３ｃｈｉｋａｎｅｎｂｏＬｂｅｎ）中で培養する、−ミセルを吸引濾過で濾取しかっＨｇ０３０ａｌ中でＩＸ洗浄する、一未乾燥重量（Ｆｒｉｓｃｈｇｅｖｔｃｈｔ）を測定する（約２−３ｇ）、一ミセルを５Ｄ３Ｑ■！中に懸濁させ、かつ３０分間３０℃で振盪器中で培養する、 −ミセルを未乾燥重量１ｇ当り５ＰＥＺ５−４０諺１中に懸濁させる、一３０℃で木浴振盪器中で培養し、プロトプラスト化を顕微鏡で調べる（３０分間後に９０％以上のプロトプラスト化度が達成されているはずである）、−プロトプラスト懸濁液をガラス濾過器（５ｃｈｏｔｔ、有孔率１）を通して濾過する、一瀘液を５分間遠心分離する（Ｓｏｒｖａｌｌ　Ｓ　Ｍ　２４　Ｒｏｔｏｒ、１８００Ｕｐｓ）　、一沈殿をＳ　７２０　ｇｌ中テ１　ｘ及びＳＴＣ２Ｏｍｌ中でＩＸ洗浄する、一プロトプラストを５ＴＣ２０＋＋７中に懸濁させかっ力価（Ｔｉｔｅｒ）を計算室で測定する、−プロトプラストを遠心分離後にＳＴＣ中に４Ｘ１０８／ｍｌの濃度に再懸濁させる、一プロトプラスト懸濁液１００μ！をＴＥ最高１５μ！中のＤＮＡに加えかつ混合する、（ＤＮＡ−量：複製ＴＥＦ−プロモーター領域−プラスミドのために：　１−１０ｇｇ：線状化のＴＥＦ−プロモーター領域−プラスミドのために：１５−２０μｇ）、−１５分間室温で培養する、一慎重にＰＴＣ４０（Ｉｇｊ）を加えかつ転回混合する、−５分間遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ　ＢＬｏｆｕｇｅＡ　、　１５００　Ｕ　ｒ）ｍ）、一上澄液を慎重に除去しかつ沈殿をＳＭＴＣＩＣｌｍｌ）中に懸濁させる、一３時間２７℃で培養し、約全４５分間転回により混合する、一遠心分離後に沈殿をＳ　Ｍ　ｉ　ｍｌ中に懸濁させる、−懸濁液を５ＭＡ２上層（Ｔｏｐｌａｙｅｒ）　９　ｍｌと混合しかつ５ＭＡ２平板培地上に加える（１平板培地当り５ＭＡ２−寒天２０寓り、一平板培地を１８時間２７℃で培養、 −平［培ｊｔｌ１１．：Ｇ　４１８を被層する（０４１８原液０．５４厘１＋Ｈｔ０　０．４６ｚｌ＋Ｑ、５％アガロース６ｍ１（Ｈ２Ｏ中、４２℃に予備加熱））、 −平板培地を２７℃で更に培養し、形質転換は複製プラスミドで２−３日後に、組み込み時に３−６日後に可視可能である培地及び溶液培地：ＭＡ２：ペプトン（Ｇｉｂｃｏカゼイン加水分解物Ｎｏ、１４０）　：　１０ｑ／１酵母エキス（Ｇｉｂｃｏ）　：　Ｉｇ／ｌブドウ糖　１０ｑ／１ミオ−イノシトール　０．３ｑ／ｌ５ＭＡ２−寒天：ソルビトール：１Ｍペプトン：　１０９／Ａ’ 酵母エキス：１ｇ／ｌブドウ糖’　２０ｑ／１ミオ−イノシトール　０．３ｙ／１寒天（Ｇｉｂｃｏ）　１２　ｑ／　ＩＳ　ＭＡ　２−上層：５ＭＡ２−寒天ト同様、寒天の代わりに０．８％アガロース溶液：ＳＤ：ソルビトール１量；ジチオトレイトール０ｍＭ５ＰＥＺ　：ソルビトールＬＭ；Ｎａ−ホスフェート緩衝液りＨ５，８（１０ｍＭ）；ＥＤＴＡｌｏｍＭ；チモリエーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）　２０　Ｔ　２　ｍｇ／　ｍｌ（Ｓｅｉｋａｇ−ａｋｕ　Ｋｏｇｙｏ　Ｃｏ、、Ｔｏｋｙｏ）ＳＴコンルビト−ｈｌＭ：ｌ−リス−Ｃ１ｐＨ８（１０ｍＭ）ＳＴＣニア／ｌ／ビトール１Ｍ　；　ト！ｊス−ＣＩ　ｐＨ８（１０ｍＭ）；　Ｃａ　Ｃ１２１ＱｍＭＴＥ：　トリス−Ｃ１１０ｍＭ：ＥＤＴＡ１ｍＭＰＴＣ４０：ポリエチレングリコール４０００（ｌｌｅｒｃｋ）　４　０　％　（ｗ／ｖ）；）　リス−ＣＩｐＨ８（１０ｍＭ）；Ｃａｃ１２１０ｍＭＳＭＴＣＩ　：　ＳＭ　（下記参照）５０％；５ＴＣ５０％：ミオーイノシトール０．０３ｑ／ＩＳＭ：ソルビトール５０％２Ｍ：ＭＡ２　５０％Ｇ４１８−原液：Ｈ２０中Ｇ　４１８　（ＧｅｎｅｔｉｃｉｎＧｉｂｃｏ）　２０　＋ｎ／　ｍ１４．７ＥＦ−プロモーター領域プラスミドでの形質転換結果例３により実施された種々の形質転換の結果を第１表にまとめる。全実験において形質転換体は、形質転換平板培地当りＧ４１８−濃度０．３す／ｍｌで選択した。このＧ４１８−濃度では、Ａ、ゴシビイミセルの増殖は完全に阻止される。

組換体ＤＮＡ−ベクターｐＡＧ−１及びｐＡＧ−２での形質転換では（この際Ｇ４１８−耐性遺伝子は最初の細菌プロモーターの制御下にありかつＴＥＦプロモーター領域の制御下にない）、この濃度では形質転換体は生じなかった。この組換体ＤＮＡベクターで形質転換体を得るためには、形質転換平板培地当り６４１８−濃度０　、１１１９／　ｍｌを越えてはならない。この濃度では、出現するコロニーの８０％までが形質転換体ではない。

５．１ａｃＺ−プラスミドでの形質転換結果ＴＥＦ−プロモーター機能性を更に調べるために、Ｅ、ｃｏｌｉからのβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子（ｌａｃ　Ｚ−遺伝子）がＴＥＦ−プロモーターの制御下にあるプラスミドｐＡＧ−１００の誘導体を構築した。このために、ＴＥＦ−遺伝子のプロモーター領域の種々の範囲を１ａｃＺ−遺伝子の開放読み砕前で融合させ、この際、１ａｃＺ−遺伝子の最初の７コドンはＴＥＦ−遺伝子の最初の８コドンに代えられた。プラスミドｐＡＧ−１１０はｌａｃ　Ｚ−遺伝子の前で約１．５　ｋｂ長さのＨ１ｎｃ１１ＴＥＦ−プロモーターフラグメントを有し、かつプラスミドｐＡＧ−１１１は４０３ｂｐ長さのＨｉｎｄｍ　／ＨｉｎｃＩＩ　−ＴＥＦ−プロモーターフラグメントを有し、これはすでにｐＡＧ−１００及び１）ＡＧ−１０１の構築のために使用された。プラスミドｐＡＧ−１１２は２９４　ｂｐ長さのＴＥＦ−プロモーターフラグメントを有し、プラスミドｐＡＧ−１１３は、２３９ｂｐ長さのＴＥＦ−プロモーターフラグメントを有しかつｐＡＧ−１１４は１５８ｂｐ長さのＴＥＦ−プロモーターフラグメントを有する。

付加的に、対照プラスミドとして、プロモーターフラグメントの融合なしにＩａｃＺ−遺伝子の開放読み枠を有するｐＡＧ−１１５を構築した。

Ａ、ゴシビイにおけるこのプラスミドの形質転換後に、ｌａｃ　Ｚ−遺伝子の表現を発色試験により検査した。ＩａｃＺ−遺伝子によってコードされたβ−ガラクトシダーゼは、青色染料５−ブロム−４−クロル−インジゴ中で、Ｘ−Ｇａ１（５−ブロム−４−クロル−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトシド）を分解する。ｐＡＧ−１１０−１ｐＡＧ−１１１−及びｐＡＧ−１１２−形質転換体は、Ｘ　−Ｇ　ａｌ　０Ｉｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＳＮｅｗＹｏｒｋｌ　９７２．４８）を濃度１００　ｕｙ／ｍｌＱ含有する培地上に青色のコロニーを形成した。ｐＡＧ−１１３、ｐＡＧ−１１４又はｐＡＧ−１１５を含有する形質転換体では、青色呈色は見られなかった。

ＩａｃＺ−遺伝子の前で融合された種々のＴＥＦ−プロモーターフラグメントについての概要を第１６図に示す。＋はＸ−Ｇａ１−含有培地上のコロニーの青色呈色を表わし、−は可能可能な青色呈色が無いことを表わす。

β−ガラクトシダーゼ−表現のもう１つの検査のために、ｐＡＧ−１１０−１ｐＡＧ−１１１−１ｐＡＧ−１１２−１ｐＡＧ−１１３−１ｐＡＧ−１１４−及びｐＡＧ−１１５−形質転換体の液体培地からのβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。このためにミセルをガラス球で破壊した（Ｒｏｓｅ、　Ｍ、；　Ｃａ５ａｄａｂａｎ、　Ｉｌ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　５ＡＶｏ１．７ｇ、Ｎｏ、４（１９８１）、２４６０−２４６４）。０４１８２００μｇ／肩ｌを有するＭＡ２−液体培地中で生育したミセル０．５ｇを、トリス０．１ｍＭ、ｐＨ８，０／グリセリン２０％（ｖｏｌ／　ｖｏｌ）　／　Ｄ　Ｔ　Ｔ　１ｍＭ／ＰＭＳＦ１ｍＭ中に入れかつガラス球（直径０゜４５−０．５履履）０．５ｖの添加後に一２０℃で凍結除去した。ミセルの破壊のために４℃で１５秒間１２回激しく振盪した（ポルテックス）。引続き１００００　ｐｒｅで２０分間２回遠心分離した（ツルバール（５ｏｒｂａｌｌ）冷却遠心分離機）。上澄液を２−緩衝液（Ｎａ２ＨＰ０４０．０６Ｍ／ＮａＨＩＰ０４０．０４Ｍ／ＫＣＩ　Ｏ。

０１Ｍ／ＭｇＳＯ４０，００１Ｍ／β−メルカプトエタノール０．０５Ｍ）中で、１：１０もしくは１：２０に希釈した。希釈されたタンパク質−粗製抽出液中でβ−ガラクトシダーゼ活性を、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの分解により測定した（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｌ　９７２．３５３　ｆｆ）。

酵素活性を粗製抽出液中のタンパク質濃度に相対させ、これをブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）の方法により測定した（　Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　Ｍ　、　Ｍ　、、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、７２（１９７６）、２４８−２５４）。

β−ガラクトシダーゼ−活性測定の結果を第２表に示す。１分間当り及び総タンパク質１＋ｎ当りに遊離された０−ニトロフェノールの量が挙げられている（ＯＤ４２゜とじて測定）第２表：β−ガラクトシダーゼ−表現プラスミド　測定　β−ガラクトシダーゼ活性Ｎｏ、　（相対単位、ＯＤ４□。

／諺す分）ｐＡＧ−１１０１３，６２３３、６３２１、９０配列記録Ｎｏ、１：配列の種類：ヌクレオチド配列の長さ：４０９塩基対鎖形態ニー重鎖トポロジー：線状分子の種類ニゲツム−ＤＮＡ由来：Ａ、ゴシビイ形質：プロモーター領域煮２ＴＥＦ遺伝子の開放読み枠を有する２、１　ｋｂ　ＥＣ０Ｒｒ／ＢａｍＨＩ断片の配夕１ｊ扁２（続き）／Ｉ＆３カナマイシン耐性遺伝子の配列−ＴＥＦプロモーター領域−融合（ＴＥＦ　ｆロモーター領域配列は下線を引いである）’　ＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＡＴＧＧＡＪＩＩＣＴＴ　ＣＣＴＣＧＧＴＧＩＩＩＧ　ＴτττＣＴＣＣτＴＣ八τＴＡＣＡＣ八八　へＣＧＧbＴＴへへＴ　Ｌ丘２ｑＡ３（続き）ＣＧＧＡＴＴＡＣＡＧ　ＴＣ（ＪＣ第１〜８図の説明第１図ニブラスミドｐＡＧ−１゜ＡＲ８：　Ｓ、セレビジアエＡＲ５Ｉ配列：２ミクロン：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃｏＲＩフラグメント；　ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子ＨＧ４１８ｒ　：Ｇ４１８　（カナマイシン）耐性：閉鎖矢印：Ｓ、セレビジアＩＣｙｃｌ　− １３プロモーター；ブラックボックス：Ｓ、セレビジアＩＣｙｃｌターミネータ −；開放矢印は転写方向を示す。

第２図ニブラスミドｐＡＧ−２゜ａｍｐ　：アンピシリン耐性；２ミフロン：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃｏＲＩフラグメント、ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子、Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性；　ＯＲＩ　：　Ｅ、ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製のオリジン；開放矢印は転写方向を示す。

第３図ニブラスミドｐＡＧ−１００，ａｍｐ：アンピシリン耐性；２ミクロン：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃｏＲＩフラグメント：ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子；Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性：ＯＲＩ：Ｅ、ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製のオリジン；閉鎖矢印：ＴＥＦ−プロモーター領域を有するＡ、ゴシピイＤＮＡフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第４図ニブラスミドｐＡＧ−５゜ａ峠：アンピシリン耐性；Ｇ４１８ｒ：　（カナマイシン）耐性；ＯＲＩ：Ｅ、ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製のオリジン、ＴＥＦ：翻訳延長因子のためのＯＲＦを有するＡ、ゴシビイＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨＩフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第５図ニブラスミドｐＡＧ−１０１゜ａｍｐ　：アンビシリン耐性；Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性；　ＯＲＩ　：　Ｅ、ｃｏｌｉ中のプラスミド複製のオリジン：ＴＥＦ：翻訳延長因子のためのＯＲＦを有するＡ。

ゴシビイＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメント；閉鎖矢印：ＴＥＦ−プロモーター領域を有するＡ、ゴシピイＤＮＡフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第６図ニブラスミドｐｐｔ、１゜ａ■ｐ：アンビシリン耐性；Ｍ１３＋ニ一本鎖 −ＤＮＡ−単離のための複製開始点、ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製用オリジン；　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子；　ＦｒｏｍＴ　Ｅ　Ｆ　−プロモーター領域を有する１５００ｂｐＡ、ビシビイＤＮＡフラグメント第７図ニブラスミドｐＡＧ−１１０゜２μ：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃ。

ＲＩフラグメント、ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子；　Ｐｒｏ ■：　ＴＥＦ−プロモーター領域を有する１５００ｂｐ　Ａ、ビシビイＤＮＡフラグメント；　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ１ａｃＺ遺伝子：Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性遺伝子：　ｏｒｉ　：　Ｅ、　６ｏ１ｉにおけるプラスミド複製用オリジン；　ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印：ＴＥＦ−プロモーター領域を有する１５００ｂｐＡ、ゴシビイ、ＤＮＡフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第８図；プラスミドｐＡＧ−１１１゜２μ：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃ。

Ｒ１フラグメント；　ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子；　Ｐｒｏ冒：　ＴＥＦ−プロモーター領域を有する４０３ｂｐＡ、ビシビイＤＮＡフラグメント；１ａｃＺ　：　Ｅ、ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子；Ｇ４１８ｒ　：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性遺伝子；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製用のオリジン；ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印：ＴＥＦ −プロモーター領域を有するＡ、ゴシピイＤＮＡフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第９図；プラスミドｐＰＬ２゜ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子：Ｍ１３＋ニ一本鎖〜ＤＮＡ−単離のための複製開始点；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃａｌｆ中のプラスミド複製用のオリジン：　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子；　Ｐｒｏｗ　：　ＴＥＦ−プロモーター領域の一部（２７０ｂｐ）を有する２９４ｂｐＡ、ゴシピイＤＮＡフラグメント。

第１０図ニブラスミドｐＰＬ３゜ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子；Ｍ１３＋ニ一本鎖−ＤＮＡ−単離のための複製用開始点；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃａｌｆにおけるプラスミド複製用のオリジン；　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｔ　１ａｃＺ遺伝子；Ｐｒｏｓ　：　Ｔ　Ｅ　Ｆ−プロモーター領域の一部（２１５ｂｐ）を有する２３９ｂｐＡ、ゴシピイＤＮＡ−フラグメント。

第１１図ニブラスミドｐＰＬ４゜ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子；Ｍ１３＋ニ一本鎖−ＤＮＡ−単離のための複製用開始点；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃａｌｆにおけるプラスミド複製用のオリジン；　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子；Ｐｒｏｗ：　Ｔ　Ｅ　Ｆ−プロモーター領域の一部（１３４ｂｐ）を有する１５８ｂｐＡ、ビシビイＤＮＡフラグメント。

第１２図；プラスミドｐＡＧ−１１２゜２μ＝複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃａＲＩフラグメント、ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子；　Ｆｒｏｍ　：　Ｔ　Ｅ　Ｆ−プロモーター領域を有する２９４ｂｐＡ、セレビジアよりＮＡフラグメント；　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子：Ｇ４１８　（カナマイシン）耐性遺伝子；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製用のオリジン；ｊｌｌｐ：アムピシリン耐性遺伝子；閉鎮矢印：ＴＥＦ−プロモーター領域を有するＡ、ゴシビイＤＮＡ断片；開放矢印は転写方向を示す。

第１３図；プラスミドｐＡＧ−１１３゜２μ＝複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃｏＲＩフラグメント、ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子；　Ｐｒｏｓ：　Ｔ　Ｅ　Ｆ−プロモーター領域を有する２３９ｂｐＡ、ビシビイＤＮＡフラグメント；　ＬａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＩａｃＺ遺伝子：Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性遺伝子；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃａｌｆ中のプラスミド複製用のオリジン；　ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印：　ＴＥＦ−プロモーター領域を有するＡ、ゴシビイＤＮＡフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第１４図；プラスミドｐＡＧ−１１４゜２μ：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃｏＲＩフラグメント、ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子；Ｐｒｏｗ：ＴＥＦ−プロモーター領域を有する１５８ｂｐＡ、ビシビイＤＮＡフラグメント；　１ａｃＺ　：　Ｅ、ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子；Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８（カナマイシン）耐性遺伝子；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉにおけるプラスミド複製用のオリジン；ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子；閉鎖矢印：　ＴＥＦ−プロモーター領域を有するＡ、ゴシビイＤＮＡフラグメント；開放矢印は転写方向を示す。

第１５図；プラスミドｐＡＧ−１１５．２μ：複製開始点を有するＳ、セレビジアエ２μプラスミドのＥｃｏＲＩフラグメント；　ＵＲＡ３　：　Ｓ、セレビジアエＵＲＡ３遺伝子：　１ａｃＺ　：　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１ａｃＺ遺伝子；Ｇ４１８ｒ；Ｇ４１８　（カナマイシン）耐性遺伝子；ｏｒｉ　：　Ｅ、ｃａｌｆ中のプラスミド複製用のオリジン；　ａｍｐ：アンビシリン耐性遺伝子：開放矢印は転写方向を示す。

第１６図：β−ガラクトシダーゼ−表現プラスミドのＴＥＦ−プロモーターフラグメント。

第１７図、ＡＴＧ−範囲及びＭ１３ＰＴ１、Ｍ１３ＰＴ２、Ｍ１３ＰＴ３、ｐＡＧ−２０１、ｐＡＧ−２０２、ｐＡＧ−２０３のターミネータ−範囲におけるヌクレオチド配列。

第１８１１ｉｅｌ；プｊスミＦｐＡＧ−２０１，ｐＡＧ−２０２、ｐＡＧ−２０３゜２μ：複製開始点ヲ有スルｓ、セレビジアエ２μプラスミドのＥＣ０ＲＩフラグメント：　Ｐｒｏｗ、Ｔｅｒｍ：ＴＥＦ−プロモーターターミネータ−融合を有する７５１ｂｐＡ、ゴシビイＤＮＡ−フラグメント。Ｇ４１８ｒ：Ｇ４１８　（カナマイシン）耐性遺伝子；　ｏｒｉ　：　Ｅ、　ｃｏｌｔにおけるプラスミド複製用の開始点；ａｍｐ：アンピシリン耐性遺伝子；開放矢印は転写方向を示す。

第１９図、ＴＥＦ−遺伝子のプロモーター及びターミネータ−からの融合のヌクレオチド配列。

ＦＩＣ，、Ａ「ＩＧ、すＦｔ（、、ρ ＰＩに、　） ”ｒｒＧ、Ａｎ「１こ−ＡＬＬＦｉｇ　１７　：　ＡＴ（）−範囲における突然変異野生型　ＣＧＡＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＧＧ丁ＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＣ丁ＴＧＴＡＴＴＴＧＴＴＴ丁丁ＡＣＣＣＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣ下線を引いたヌクレオチドによる野生型−配列の置換によってＡＴＧ−範囲に新たな切断部位が導入された。

ターミネータ−範囲における突然変異：Ａ　／　Ｔ−塩基対の欠失によシターミネーター範囲に５ｃａＩ切断部位が導入された。

！１に、ＡｇＦｉｇ　１９ＴＥＦ−プロモーター　−及びＴＥＦ−ターミネータ−フラグメントよりなる融合停止ＴＥＦ−遺伝子のプロモーター−及びターミネータ−領域の配列。

ＴＥＦ−遺伝子の出発コドン及び停止コドンは出発及び停止で示されてい、Ｂ。

切断部位ｆ’ｉ　ｆ　ラスミｌ’　ｐＡＧ−２０１、ｐＡｏ−２０２、ｐＡ（）２０３に関連する（第１８図）。

国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：６４５）（Ｃ１２Ｎ　１／１５Ｃ１２Ｒ１：６４５）（７２）発明者　シュタイナー、ザビーネドイツ連邦共和国　Ｄ−６３００ギーセンザールラントシュトラーセ　１４Ｉ（７２）発明者　ライト、マーチン　シー。

ドイツ連邦共和国　Ｄ　−７９５０ピーベラツバ／リス　マルティンールター− シュトラーセ１３

Claims

【特許請求の範囲】

１．翻訳延長因子ＥＦ−１ａをコードするＡ．ゴシビィー遺伝子のプロモーター領域。
２．請求項１によるプロモーター領域で遺伝的に変えられた真菌。
３．タンパク質の製造のための請求項２に記載の真菌の使用。
４．真菌はＡ．ゴシピィであることを特徴とする請求項３に記載の使用。
５．ビタミンＢ２−生合成の遺伝子又はビタミンＢ２の過剰生産と関係がある遺伝子の過剰表現のための、請求項２による真菌の使用。
６．ビタミンＢ２−生合成の遺伝子又はビタミンＢ２の過剰生産と関係がある遺伝子の過剰表現のための、請求項４による真菌の使用。
７．翻訳延長因子ＥＦ−１αをコードするＡ．ゴシピィー遺伝子のターミネーター領域。