JPH07501448A

JPH07501448A - ７ｂ２タンパク質を利用するタンパク質の生産

Info

Publication number: JPH07501448A
Application number: JP5509807A
Authority: JP
Inventors: マルテンス，ヘラルダス　ユリアヌス　マリア; チャウデュリ，バーバトシュ; ステファン，クリスティーヌ
Original assignee: ノバルティス　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1991-11-29
Filing date: 1992-11-27
Publication date: 1995-02-16
Also published as: FI942442A0; AU675919B2; WO1993011248A1; EP0614490B1; NL9102009A; CA2123567A1; AU2946192A; DE69227921D1; ATE174629T1; US5804417A; EP0614490A1; HUT67739A; HU9401604D0; US5708140A; FI942442A7; FI942442L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】７Ｂ２タンパク質を利用するタンパク質の生産本発明は遺伝子工学の分野に、そして特に、インビボ又はインビトロでのキャベロンとして７Ｂ２の利用に関する。そこで本発明は７Ｂ２を発現可能であり、且つ所望のタンノくり質を分泌可能な組換細胞の助けをかりてのインビボでの所望のタンノくり質の生産のための方法に関する。そこで別の観点はタンパク質を７Ｂ２で処理すること（こよりタンパク質の解離又は凝集防止のためのインビトロての方法である。

発明の背景分泌性タンパク質のための様々な輸送機構が真核細胞内（こ存在している。全ての分泌性細胞は小胞体（ＥＲ）てのタンノくり質合成、ＥＲを介してのゴルジ装置へ、次いてこのコ゛ルジ装置力１ら（１わゆる輸送顆粒への輸送により分泌性タンノくり質を放出すること力（可會ヒである。

輸送顆粒の膜は原形質膜と融合し、その後、分泌性タンノくり質（よエキソサイト−シスにより細胞を離れることができる。分泌性タンノくり質が作られるとき、それらは放出もされ、換言すればタンノ々り質の放出の制御はない。このタンパク質はその結果として構成分泌経路を示し、そして酵母を含む全ての真核細胞の中に存在してし）る。

原核細胞も抑制されていない、即ち構成的なタンノくり質分泌の経路を有している。

一定の分泌性タンパク質の放出は高等真核細胞の一定のグループにおいて制御されていることか知られる。これらの細胞１よニューロン及び内分泌細胞、換言すれば生物活性タンノくり質の前駆体を生産する細胞を含んで成る。これらの細胞の中での合成はＥＲにおいて行われ、輸送は構成細胞と同様にＥＲからゴルノに至るが、しかし次にゴルノから分泌性顆粒に至る。これらの分泌性顆粒において、前駆体の特異的な後翻訳改質のだめの適正なる環境がある。このタイプのタンパク質輸送は制御型経路（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｒｏｕｔｅ）であるとして示されている。生物活性タンパク質のエキソサイト−シスは細胞が外生刺激を受けたときのみに生ずる。このタイプの細胞は制御型分泌性細胞と呼ばれている。

細胞により産出されるタンパク質の適正な折りたたみは分子キャベロンタンパク質によって確実なものとなり、これは細胞の適正なる機能にとって必須であり、なぜならそれらは細胞により産出されるタンパク質が適正な状態に折りたたまれることを確実にするからである。適正なる折りたたみはこのようなタンパク質の細胞内での正しい目標に至る輸送にとって必須である。従って、キャペロンは適正なタンパク質の折りたたみにとって必要のみならず、適正なタンパク質輸送にとっても必要である。特定のキャペロンタンパク質が例えば細胞質からミトコンドリア、クロロプラスト、細胞核及びＥＲの如きの細胞器官に至るタンパク質輸送に関して述べられている。

数多くのこれらのタンパク質の生産は、シートショックにかけられた細胞の中で誘発され、従ってキャペロンタンパク質は［ヒートショックタンパク質」とよく呼ばれている。

組換生物活性タンパク質の生産は組換ＤＮＡ操作の分野における発展を通じて可能となってきているが、しかし時折り実用的に成功しないことがあり、その理由はしばしば生産すべき異種タンパク質の折りたたみ及び／又は分泌が適正に行われない又は有効に行われないからである。かかる問題は通常、大量に生ずるタンパク質の適正なる折りたたみ及び任意的に分泌を確実なものとする能力が不十分である細胞の中での異種タンパク質の強力な発現のケースにおいて生ずる。この問題は、組換タンパク質が原核細胞又は真核細胞の中で大量に生産され、そのために細胞の折りたたみ用タンパク質の活性が大量の外来タンパク質の折りたたみにとって不十分である事実により生ずる。更なる問題は、組換タンパク質をプロセス及び分泌することを所望するが、その宿主細胞が十分でないタンパク質輸送経路しか含んで成らない場合に生ずる。更に、もしプロタンパク質、例えばプロホルモン又はニューロペプチドの前駆体を高等真核細胞の中で生産せしめ、そのプロタンパク質がその細胞の中で生物活性タンパク質へとプロセスに付せること所望することを意図しているとき、使用する細胞が制御型分泌性経由を含んで成らないか又は不十分な程度にしかかかる経由を含んで成らない場合に問題が生ずる。

従ってこれらのタンパク質は完全に生物学的に活性なタンパク質として機能するのに必要な適正なる後翻訳改質を受けることがないであろう。このことは、天然に産出され、そして制御型タンパク質輸送を通じて放出される組換タンパク質にとっての特定なケースである。

別の問題は溶液中でタンパク質がよく凝集する傾向にあることである。凝集体の形成は生物活性タンパク質の活性における損失をもたらすか、又はインビトロ再折りたたみ法による、はどけた又は不適正に折りたたまれたタンパク質の適正なる折りたたみを妨げる。

発明の目的本発明の目的はかかる問題の解決を提供し、ここでインビトロ又はインビボでのキ↑ペロンとしての７８２の利用についての方法を提供する。キャベロンとしての７８２の利用は７Ｂ２と所望のタンパク質との同時発現による形質転換宿主細胞の中でのタンパク質の効率的な生産を可能とし、ここでこのタンパク質は宿主細胞によりインビボで処理されつるか、又はタンパク質を７Ｂ２でインビトロにより処理してよい。

７Ｂ２はもっばら天然に存在しており、そしてニューロン及び内分泌細胞の如きの制御型細胞の中で活性である。従来の技術において、７Ｂ２は可能なＧＰＴ− 結合性タンパク質として述べられており、他の数多くの小型のＧＰＴ−結合性タンパク質と同様に、細胞内の二枚の小器官膜の融合に、又は小器官膜と細胞膜との融合に関与しつる。

本発明は、７Ｂ２が、インビトロ又はインビボでの、特にインビトロでの、タンパク質、好ましくはモノマータンパク質の解離及び凝集の防止に、並びにもし７Ｂ２と組換タンパク質が細胞の中で同時発現するならインビボでの宿主細胞からの組換タンパク質の効率的な生産に利用できつるキャベロン機能を有するという驚くべき事実を基礎とする。

発明の概要本発明はタンパク質の調製のための方法に関連し、タンパク質を７８２でインビボ又はインビトロで処理することを特徴とする。そこで、本発明は、生物活性タンパク質又はその前駆体のアミノ酸配列を育するポリペプチドをエンコードする遺伝情報で形質転換されており、且つこのポリペプチド又は前駆体を発現することが可能な宿主細胞、好ましくは真核細胞によるタンパク質の調製のための方法を含み、その方法は、かかる細胞を、７Ｂ２と前記のポリペプチドもしくは前駆体とをその細胞が同時発現できるようにする遺伝情報で追加的に形質転換せしめること、及びそのポリペプチドもしくは前駆体を、そのポリペプチドもしくは前駆体の解離もしくは適正なる折りたたみが補助されうるように、又は放出のために細胞を任意的に刺激した後に、そのポリペプチドもしくは前駆体が７８２が存在していない場合よりも高い量で分泌されるようにインビボで処理すること、を特徴とする。

本発明の好ましい態様は、タンパク質分泌の制御型経路を有する真核宿主細胞を使用する方法であり、更により好ましいのは、ニューロン又は内分泌細胞の利用にある。更に好ましいのは、ポリペプチド又は前駆体が、放出のためにその細胞を任意的に刺激した後、分泌されるようにインビボで処理する方法であり、更により好ましい態様においては、その分泌されたポリペプチドが生物活性タンパク質である。

別の好ましい態様は、宿主として酵母細胞を利用する方法である。

より好ましくは、酵母細胞を、生物活性タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現可能なりＮＡ配列で形質転換し、ここでポリペプチドはより好ましい態様においては分泌される。最も好ましい態様において、分泌されたポリペプチドはＩＧＦ−１のアミノ酸配列を有する。

本発明の方法は、ペプチドホルモン、ニューロペプチド、成長因子及び凝集因子、好ましくはペプチドホルモン又はニューロペプチドの群より選ばれる生物活性タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドの調製のために利用できつる。

７Ｂ２の意味は以降に記す。最も好ましい態様において、７Ｂ２はヒト起源のそれである。

本発明は、本発明において利用できつる形質転換宿主細胞にも関連する。従って、本発明は形質転換細胞、好適には生物活性タンパク質又はその前駆体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする遺伝情報で形質転換されており、且つこのポリペプチド又は前駆体を発現可能な真核宿主細胞に関連し、ここでかかる細胞は、７Ｂ２と前記のポリペプチドもしくは前駆体とをその細胞が同時発現できるようにする遺伝情報で追加的に形質転換されていること、並びにそのポリペプチドもしくは前駆体を、そのポリペプチドもしくは前駆体の解離もしくは適正なる折りたたみが補助されるように、及び／又は放出のために細胞を任意的に刺激した後に、そのポリペプチドもしくは前駆体を７８２が存在していない場合よりも高い量で分泌させるようにインビボで処理することを特徴とする。

好適な宿主細胞は、タンパク質分泌の制御型経路を有する形質転換真核細胞てあり、より好ましくはニューロン又は内分泌細胞である。好ましい宿主細胞は形質転換酵母細胞でもある。

本発明の形質転換細胞は好ましいヒト７Ｂ２を発現することができるように遺伝情報で形質転換されていることを特徴とする。

本発明の形質転換細胞は、ホルモン、ニューロペプチド、成長因子及び凝集因子の群より選ばれる生物活性タンパク質をエンコードするＤＮＡで、より好ましくはペプチドホルモン又はニューロペプチドをエンコードするＤＮＡで、又はかかる生物活性タンパク質の前駆体をエンコードするＤＮＡで形質転換されていることをも特徴とするのか好ましい。

本発明の形質転換細胞、特に形質転換酵母細胞は最も好ましくはＩＧＦ−１をエンコードするＤＮＡで形質転換されていることを特徴とする。

本発明は更に、インビトロでのタンパク質の解離又は凝集の防止のための方法に好ましくは関連し、そのタンパク質又はその凝集体を７Ｂ２で処理することを特徴とする。

本発明は更に、形質転換細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ、コリ）又は酵母細胞の中ての７８２の調製のための方法に関連する。

発明の詳細な説明本発明はタンパク質の調製方法に関連し、タンパク質をインビボ又はインビトロで７Ｂ２で処理することを特徴とする。詳しくは、本発明は（ａ）インビボでの組換タンパク質の生産の向上のための方法、及び（ｂ）インビトロでの７Ｂ２の利用による、タンパク質、好ましくはモノマータンパク質の解離又は凝集の防止のための方法に関する。

７Ｂ２は制御型細胞、例えばニューロン及び内分泌細胞の制御型分泌経路に存在しており、従ってかかる細胞により産出される生物活性タンパク質、例えばニューロペプチド又はペプチドホルモンの前駆体との特異的な相互反応性を有するものと推定されている。分泌型生物活性タンパク質、例えばニューロペプチド又はペプチドホルモンの前駆体の生産についての特徴は、それらが別の（構成）分泌性タンパク質から分離して細胞の中にあり、そして最終的に制御型顆粒に導かれる経路をたどることにある。この分離機構にとって７Ｂ２は必須であり、そして７Ｂ２がゴルジ装置を介してＥＲから細胞の分泌性顆粒に至る分泌性タンパク質の適正なる輸送にとって重要なキャペロニン類の群に属するキャペロンタンパク質であることが明らかであり、そして７Ｂ２が制御型細胞、例えばニューロン又は内分泌細胞内でのタンパク質輸送の制御型経路の適正な機能にとって必須であることが明らかである。７Ｂ２は生物活性タンパク質の前駆体に特異的に結合し、そしてそれらをタンパク質輸送の制御型経路へと運ぶ。かかるキャベロンはまだ説明されてきていない。更に、７Ｂ２は分泌性タンパク質である（それ故、細胞を離れることのできる）キャペロン機能を有する唯一のタンパク質である。

本発明の第一観点は従って、公知の７８２が分子キャベロンタンパク質に属しており、そして明らかにＥＲからゴルジ装置を介して細胞の分泌性顆粒に至る一定の分泌性タンパク質の輸送における役割を担っていることの新たな、且つ驚くべき発見を基礎とする。適正な経路をたどることは、生物活性タンパク質の前駆体にとって非常に重要であり、なぜならそれらは特異的な後翻訳改質を適正なる状況で受けるために細胞内の適正な微細環境（即ち、制御型経路の分泌性顆粒中）に到着せねばならないからである。本発明の別の観点は７Ｂ２のキャベロン機能が、制御型分泌経路を存する細胞の中のタンパク質の生産性の向上のためにだけに利用されるのではないことにある。７Ｂ２の基質であるタンパク質は制御型でない分泌経路を有する原核又は真核細胞の中で簡単に産出され、その理由は７Ｂ２は前記タンパク質の解離及び折りたたみを助けるからである。従って、７Ｂ２の同時発現は細胞内タンパク質生産性、及び構成又は制御型経路を通して分泌されたタンパク質の生産性を向上せしめる。７Ｂ２キヤペロン機能は本発明の更なる観点において、適正な折りたたみの補助に、そして好ましくはタンパク質の解離又は凝集防止の補助のためにインヒドロで利用もされつる。

インビボで利用するため、７Ｂ２をエンコードするＤＮＡを所望のタンパク質をエンコードする遺伝子と共に宿主細胞の中で同時発現させる。適当な宿主細胞は例えば原核細胞、例えば大腸菌、又は真核細胞、好ましくは酵母細胞、又は好ましくはタンパク質の分泌のための制御型経路を有する細胞、例えばニューロン又は内分泌細胞である。７Ｂ２と所望のタンパク質との同時発現か特に有利であり、なぜなら７Ｂ２は過剰生産細胞における折りたたみの問題を防ぐ又は軽減するのに役立つからである。換言すれば、細胞自体が（過剰）生産されたタンパク質を適正な状況に折りたたみ十分な能力を有しない場合、例えば大腸菌の如きの原核細胞において、又は好ましくは酵母細胞において、より好ましくは制御型顆粒に至る適正な輸送のだめの制御型分泌経路を有する細胞の場合において有利である。

インビボ又はインビトロて７８２機能の対象となりうるタンパク質を以下で定義する。

本発明の７Ｂ２機能に付されるのは、天然においても適正な輸送のために７Ｂ２に依存するタンパク質であり、それらは生物活性タンパク質、例えばペプチドホルモン及びニューロペプチドの前駆体であり、換言すれば神経細胞及び内分泌細胞の中で認められるタンパク質輸送の制御型経路を介して輸送及び細胞を離れるタンパク質である。インヒポ又はインビトロ作用にとって適正な基質は更におそらくは、脂肪族α−へリックスを有するタンパク質、例えば約１０〜約１５個のアミノ酸を有するようなものである。前駆体のプロセシングの際にモチーフか切断されず、従って最終生成物、即ち生物活性タンパク質の中に存在している場合、このタンパク質自体が７Ｂ２にとって適切な基質である。インビボ又はインビトロ作用での７８２にとって適切な基質は溶液の中で凝集しがちなタンパク質てもある。

おそらく、生物活性タンパク質、例えばニューロペプチド又はペプチドホルモンはその構造内に、７Ｂ２により認識され、且つ相互作用に包括される特定のドメインを有するであろう。制御型放出経路に至る分泌性タンパク質の選別のためのシグナルとして担いつる、且つ７Ｂ２との相互作用のためのシグナルとして担いつる共通配列がプロホルモン〔即ち、細胞の分泌性顆粒の中で生物学的に活性なタンパク質への分断しつる火車タンパク質、例えば種々の生物活性タンパク質、例えば副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）　、アヘン様ペプチドβ−エンドルフィン及びメラニン保存細胞刺激ホルモン（ＭＳＮ）に分断しつるブロオピオメラノコ千ルチン（ＰＯＭＣ）　）の構造内に見い出せた（　ｒＡ　ｍｏｔｉｆ　ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｔｈａｔｍａｙ　ｔａｒｇｅｔ　ｔｈｅｍ　ｔｏ　５ｅｃｒｅｔａｒｙ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、１７４．　５８６−５９２．　１９９１）。

本発明の背景における［前駆体Ｊとは、生物学的に活性なタンパク質へと切断されうるプロタンパク質、例えばプロホルモンＰＯＭＣを意味する。

７Ｂ２がキャペロンとして働く新たな発見は、タンパク質の折りたたみ及び／もしくは分泌が組換宿主の中での異種タンパク質の生産に基づき不適切であるか、又は非効率的に生ずるときに利用されうる。７Ｂ２の同時発現は原核細胞及び真核細胞の中での７Ｂ２基質タンパク質のインビボでの折りたたみの問題における低下をもたらす。

好ましいのは真核細胞の中ての７８２のインビボ用途である。特に、酵母細胞の中での７Ｂ２遺伝と、生物活性タンパク質又はその前駆体をエンコードする遺伝子との、又は制御型タンパク質輸送を伴う真核細胞の中での７Ｂ２遺伝子と生物活性タンパク質の前駆体をエンコードする遺伝子との同時発現である。

高等真核細胞の中での発現を考慮する限り、所望の最終生成物、即ち生物活性タンパク質は、好ましくは細胞の中での天然前駆体の産出及びプロセシングによって作られる。従って、本発明の好ましい態様においては、前駆体は組換高等真核細胞の中で産出されて適正にプロセスされ、ここで７８２と生物活性タンパク質の前駆体との同時発現はそのタンパク質が制御型分泌経路をたどることを確実とする。別の好ましい態様においては酵母を使用し、そして生物活性タンパク質を製造するための方法は、インビトロでプロセスに付されつる前駆体の産生か、又は生物活性形態をもたらしめるようにインビトロで再折りたたみに任意的に付されうる所望の生物活性タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質の直接的な産生のいづれかを含む。

以下は本発明において７Ｂ２の基質として利用されうる生成物の遺伝子の例である：二二−ロベブチド遺伝子科、例えばオピオイド遺伝予科の構成員、特にエンケファリン遺伝子、ダイノルフィン遺伝子もしくはプロオピオメラノコルチン遺伝子、後葉下垂体科、特にパップレシン遺伝子もしくはオキシトシン遺伝子、ｃｃｋ／ガストリン科、特にガスト伝子、特にカルシトニン１遺伝子、カルシトニン■ 遺伝子もしくは小島アミロイドポリペプチド遺伝子、ナトリウム排泄増加性因子遺伝予科、特に心房性ナトリウム排泄増加性因子遺伝子、脳ナトリウム排泄増加性遺伝子もしくはＣ型ナトリウム排泄増加性遺伝子、ボンベシン遺伝予科、特にガストリン放出性ペプチド遺伝子もしくはニューロミジンＢ遺伝子、内皮性遺伝予科、特に内皮性１．　２もしくは３遺伝子、セクレチン遺伝予科、特にセクレチン遺伝子、グルカゴン遺伝子、血管作用性腸内ペプチド遺伝子、胃性阻害ペプチド遺伝子、成長ホルモン放出性因子遺伝子もしくは下垂体アデニレートサイクラーゼ活性化性ペプチド遺伝子、キニン遺伝予科、特にタチキニンＡもしくはＢ遺伝子、Ｋ−キニノゲン遺伝子、ニューロテンシン遺伝子もしくはアンジオテンシノゲン遺伝子の構成員の生成物。本発明に従って製造されうるその他の遺伝子の生成物は、インスリン様遺伝子科、特にＩＧＦ−１遺伝子、　ＩＧＦ−２遺伝子、リラキシン遺伝子もしくはインスリン遺伝子、又は様々なその他の遺伝子、特にモチリン遺伝子、ガラニン遺伝子、放出因子遺伝子、甲状腺刺激ホルモン放出因子遺伝子、ゴナドトロピン放出因子遺伝子又はメラニン集中ホルモン遺伝子の構成員の生成物である。好適な生成物はインスリン様遺伝子科の構成員、好ましくはＩＧＦ−１又はＩＧＰ−２、より好ましくはＩＧＦ−１の生成物である。

更に好ましいのはプロラクチン遺伝子及びＰＯＭＣ遺伝子、より好ましくはプロラクチン及びＡＣＴＨのそれぞれの生成物である。本発明は成長因子（例えばＴＧＦ。

ＮＧＦ等）、凝集因子及びその池の血液タンパク質（例えば因子■。

ｔＰＡ、　ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄｓ因子等）も利用できうる。

本発明にかかわる高等真核細胞は動物又は植物細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくはタンパク質輸送の制御型経路を有する細胞、更により好ましくは内分泌又はニュローナル腫瘍細胞に由来する細胞系を含む内分泌又はニューロナル細胞である。

本発明に関して用いられている語７Ｂ２は欧州特許出願ＢＰ−Ａ　Ｏ，３１５，２５４に記載の通りヒト７８２を最も好適には意味する。しかしながら、語７Ｂ２はヒト分子に限らず、様々な生物に由来する対応のタンパク質も包括している。ヒト７Ｂ２とは別に、マウス、ラット、ウシ、サケ及びツメガエルのアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖ旦）の７８２タンパク質の構造も述べられており、そして本発明に利用できうる。

その他の対応の７Ｂ２タンパク質がそのアミノ酸配列と公知の７Ｂ２タンパク質の配列との比較により同定でき、その理由は特に７Ｂ２の間。

末端領域が強く保存されているから、及び全ての７Ｂ２タンパク質が全ての種において類似性を示す更に保存された配列を含むからである。飴７Ｂ２は７Ｂ２活性を有する誘導体である、天然の７８２タンパク質の誘導体を含むことを意図する。かかる誘導体は融合タンパク質、コンジュゲート、特にフラグメント、例えばヒト７Ｂ２の最初の１３７゜１４９又は１７０個のアミノ酸に相当するもの、より好ましくは前記ヒトフラグメントてありうる。

驚くべきことに、７Ｂ２はタンパク質のプロセス及び分泌のための制御経路を有する細胞のみならず、原核細胞及びその他の真核細胞、例えば制御型分泌経路を有さない高等真核細胞、又は菌類細胞、特に酵母細胞の中での異種タンパク質の調製においても機能する。前駆体をエンコードする遺伝子の生成物、又は天然の生物活性タンパク質の前駆体のプロセシング中に生ずるならタンパク質配列をエンコードする遺伝子の生成物、即ち、天然の分泌経路における中間体又は最終生成物でさえも、それらが７８２と共に同時発現するならかかる細胞の中で大量に生産されつる。適正な折りたたみに及ぼされる好都合な効果は特に原核細胞、例えば大腸菌を用いたときに、細胞内に貯蔵されるタンパク質の生産にとって有用である。しかしながら、より好都合なのは、分泌型タンパク質、即ち細胞の中で生産されるタンパク質の生産のための７８２の利用であり、なぜならプロタンパク質がシグナル配列を有するからである。本発明の背景において、分泌せしめることを意図する全てのタンパク質が、細胞の中で切断されるシグナル配列と機能的に連結されて生産されることが理解される。しかしながら、本発明の背景における「前駆体Ｊなる語は、「シグナル配列を有するタンパク質」　（即ち、プレタンパク質）の意味で用いているのではなく、生物学的に活性なタンパク質へとプロセスされうるプロタンパク質、例えばプロホルモンＰＯＭＣを意味している。これらのプロタンパク質はｍＲＮＡの翻訳の後に、もし天然プロセス生成物又はプロタンパク質自体を分泌せしめることを意図するなら、シグナル配列に連結されていてもよい。もし分泌生成物を作ることを意図するなら、７Ｂ２は基質タンパク質と同じように輸送されるためにシグナル配列を必要とする。

従って、本発明は、インビボ又はインビトロで７Ｂ２でタンパク質を処理することを特徴とするタンパク質の調製方法に関する。そこで、本発明は、生物活性タンパク質もしくはその前駆体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする遺伝情報で形質転換されており、且つこのポリペプチドもしくは前駆体を発現可能な宿主細胞、好ましくは真核宿主細胞によるタンパク質の調製方法を含み、この方法は、かかる細胞を、その細胞が前記ポリペプチドもしくは前駆体を７Ｂ２と同時発現できるようにする遺伝情報で追加的に形質転換せしめること、及び、そのポリペプチドもしくは前駆体を、そのポリペプチドもしくは前駆体の解離もしくは適正な折りたたみか補助されるように、又はそのポリペプチドもしくは前駆体を、任意的に放出のためにその細胞を刺激した後に、７Ｂ２が存在していないときよりも高い量で分泌されるようにインビボで処理すること、を特徴とする。

従って、本発明は、所望の生物活性ペプチド、もしくは好ましくは生物活性タンパク質の前駆体のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする遺伝情報及び７Ｂ２をエンコードする遺伝情報が施されており、且つ前記タンパク質又は前駆体と７Ｂ２との同時発現、及び放出のための細胞の任意的な刺激の後に所望の生物活性タンパク質が分泌されるように前記タンパク質又は前駆体を処理することか可能な組換真核細胞、好ましくは高等真核細胞、より好ましくはタンパク質分泌の制御型経路を有するかかる細胞により生物活性タンパク質を製造する方法を提供する。

本発明は、所望の生物活性ペプチド又は好ましくは生物活性タンパク質の前駆体のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする遺伝情報及び７Ｂ２をエンコードする遺伝情報か施されており、且つ前記タンパク質又は前駆体と７Ｂ２との同時発現、及び放出のための細胞の任意的な刺激の後に所望の生物活性タンパク質か分泌されるように前記タンパク質又は前駆体を処理することか可能な組換真核細胞、好ましくは高等真核細胞、より好ましくはタンパク質分泌の制御型経路を有するかかる細胞も提供する。

生物活性タンパク質の分泌を細胞によって刺激することか所望されうる。かかる刺激のためにどの物質を利用するかはその生産に用いる細胞のタイプにある程度依存する。特に制御型の真核細胞の場合におけるこの分泌の刺激にとってかなり一般に有用な手段はｃＡＭＰ又はその誘導体、例えば８−　Ｂｒ　−ｃＡＭＰである。

本発明は更に、所望の生物活性タンパク質の前駆体又はその生物活性タンパク質自体のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする遺伝情報及び７Ｂ２をエンコードする遺伝情報が施されており。

且つ前記タンパク質又はその前駆体と７Ｂ２とを同時発現可能な原核又は真核細胞、好ましくは酵母細胞の中での生物活性タンパク質の前駆体又は好ましくはその生物活性タンパク質自体のアミノ酸配列を有するタンパク質の製造方法も提供し、この生物活性ペプチド又はその前駆体のアミノ酸配列を有するタンパク質はその細胞の中で、解離又は適正な折りたたみが補助されるように処理され、あるいは好ましくは、そしてより好ましくは酵母細胞に関連して、それは分泌されてその上清液から回収できるようになる。

本発明は、所望の生物活性タンパク質の前駆体又は好ましくはその生物活性タンパク質自体のアミノ酸配列を有するタンパク質をエンコードする遺伝情報及び７Ｂ２をエンコードする遺伝情報が施されており、且つ前記タンパク質又は前駆体と７Ｂ２とを同時発現可能な組換原核又は真核細胞、好ましくは酵母細胞も提供し、この生物活性ペプチド又はその前駆体のアミノ酸配列を有するタンパク質は解離又は適正な折りたたみが補助されるようにその細胞の中で処理され、あるいは好ましくは、そしてより好ましくは、酵母細胞に関連して、それは分泌されて上清液から回収できるようになる。

制御型の遺伝子操作された真核宿主細胞の中での７Ｂ２と異種タンパク質との同時発現を含んで成る本発明にかかわる方法は、例えば植物ギヤベロン　ルビスコ（ｒｕｂｉｓｃｏ）について記載の方法に従う公ての７Ｂ２遺伝子と生物活性タンパク質又はその前駆体をエンコードする遺伝子との同時発現を含んで成る本発明にかかわる方法は公知の方法て実施てきうる。両ケースにおいて、細胞は７Ｂ２の発現のための発現カセットと、生産することを所望する本明細書で定義したタンパク質のための発現カセットとを含んで成る。「発現カセット」なる語はポリペプチドを発現することの可能なりＮＡ配列を意味し、そしてプロモーター、所望するならばシグナル配列、更には構造遺伝子、所望するならば転写ターミネータ−１及び任意的に転写エンハンサ−、リポソーム結合性部位、及び／又は更なる調節配列を含んで成る。

７Ｂ２又は所望のタンパク質もしくはその前駆体の発現のために適切なベクターの構築のための手段は当業界で入手できるベクター及び調節配列である。発現ベクターは慣用の技術に従って作ることができる。有用なベクター及び調節配列は７Ｂ２の製造の目的のために７Ｂ２遺伝子の発現について以降に例示する。しかしながら、同じベクター及び調節配列を７Ｂ２と所望の組換タンパク質との同時発現の問題にも類似して適用てきつる。

本発明は更に、タンパク質の解離又はその凝集を防止するためのタンパク質のインヒドロ処理において利用するための本質的な７Ｂ２の製造も考慮している。７Ｂ２は宿主細胞、好ましくは大腸菌細胞又は酵母細胞を、７８２の発現のための発現カセットを含んで成るハイプリトヘクターて形質転換せしめることを含んで成る方法によって作られる。

広範囲にわたる様々なプロモーター配列が、宿主細胞の種類に応して利用てきうる。プロモーターの例はλＰ　Ｌ　＋　λＰ、ｌ、大腸菌ｌａｃ、　ｔｒｐ、　ｔａｃ、酵母ＴＲＰＩ−，ＡＤＨ■−、ＡＤＨＩＩ−、ＰＨ０３−。

アルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）　、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーター、又は真核系ウィルスに由来するプロモーター、例えばＳＶ４０、ラウス肉腫ウィルス、アデノウィルス２、ウシパピロマウイルス、パポバウィルス由来のプロモーター、又は晴れ動物細胞に由来するプロモーター、例えばアクチン、コラーゲン、ミオシン又はβ−グロブリン遺伝子のプロモーターである。真核系プロモーターは交換用配列、例えば酵母の上流活性化性配列（ＵＡＳ）又はウィルスもしくは細胞性エンハンサ−１例えばサイトメガロウィルスＩＥエンハンサ−１ＳＶ４０エンハンサ−、イムノグロブリン遺伝子エンハンサ−等と組合せてよい。

エンハンサ−は、例えばサルウィルス、ポリオーマウィルス、ウシパピローマウィルスもしくはモロニー肉腫ウィルスの如きのウィルス又はゲノム起源に由来する転写刺激性ＤＮＡ配列である。エンハンサ−配列はフィサルム　ボリセブハルム（Ｐｈｙｓａｒｕｍ　ｐｏｌｙｃｅｐｈａｌｕｍ）（ＰＣＴ／ＥＰ　８５００２７８）の染色体外リポソームＤＮＡに由来するものであるか、又は酸性ホスファターゼＰＨ０５遺伝子由来の上流活性化部位であるか（ＥＰ出願ｋ　８６．　ＩＩＩ、　８２０．６）又はＰＨ０５，ｔｒｐ、　ＰＨ０５−ＧＡＰＤＨバイブリド（ＥＰ出願Ｎα８６．１１１．８２０．６）等のプロモーターでありうる。

シグナル配列は例えばポリペプチド等の分泌を導くプレ配列又は分泌性リーダーでありうる。酵母細胞における分泌にとって適切なシグナル配列は例えばＳＵＣ２シグナル配列又は酵母α−因子のシグナル配列である。更なるシグナル配列か、例えばｖｏｎ　Ｈｅ１ｊｎｅ、　ＧのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４．４６８３　（＋９８６）においてまとめられテいルように論文から公知となっている。

本発明の好ましい態様において、７Ｂ２遺伝子は、酵母の中で機能的であるシグナル配列、例えば５ＩＪＣ２シグナル配列又は相同性７Ｂ２シグナル配列と機能的に連結している。構成酵母プロモーターを利用することも好ましい。７Ｂ２発現カセットは酵母ベクターに連結されており、そして酵母細胞はベクターで形質転換されている。７Ｂ２は上清液へと分泌され、そして所望するならば慣用の方法に従って単離されうる。

本発明の別の好ましい態様において、７Ｂ２遺伝子、又はより好ましくは異種タンパク質、好適には大腸菌タンパク質、より好適には例えばアフィニティークロマトグラフィーのために利用できうるリガントに対する親和性を有することにより７Ｂ２の単離を補助するタンパク質に連結されている７Ｂ２コ一ド配列を含む融合遺伝子を、原核細胞、好適には大腸菌の中で、前記細胞の中で機能的なプロモーターのコントロール下で発現させ、次いで７Ｂ２をその細胞から回収する。

融合タンパク質を酵素で切って７Ｂ２をその融合タンパク質から遊離せしめることが好ましい。

本発明はまた、酵母又は原核細胞の中での７Ｂ２の発現のためのバイブリドベクターも考慮しており、このバイブリドベクターは７Ｂ２遺伝子の発現のための発現カセットを含んで成る。

本発明において利用できつるバイブリドベクターは遺伝子工学の業界において有用な任意のベクター、例えばウィルス、ファージ、コスミド、プラスミドもしくは染色体ＤＮＡ、例えばＳＶ４０の誘導体、ヘルペス−ウィルス、パピローマウィルス、レトロウィルス、バキュロウィルス、ファージλ、例えばＮＭ９８９もしくはＥＭＢＬ　４、又はファージＭ１３、例えばＢａｍＨＩ消化により直鎖状にしたＭ１３ｍｐ８ファージＤＮＡ　（文献１５）、細菌性プラスミド、例えば９ＢＲ３２２，ｐｔｌｓｌＢ、又は酵母プラスミド、例えば２μプラスミド、又は欠陥ウィルス、ファージもしくはプラスミドの複製を可能とするヘルパーウィルスの存在下での欠陥ウィルス、ファージもしくはプラスミド、例えばＭ１４ＫＯ７ヘルパーフアージの存在下でのＭ１３（＋）にＳベクターに由来しつる。

本発明のバイブリドベクターは染色体外要素として、又は宿主の染色体に組込むことにより、適当な宿主の中での所望のＤＮＡの複製及び任意的な発現を供する。いくつかの可能なるベクター系が本発明のクローン化ＤＮＡの組込み及び発現のために有用である。原理的には、選ばれた宿主の中の発現カセットの中に含まれる、所望のポリペプチド遺伝子を複製又は複製して発現せしめる全てのベクターが適当である。このベクターは形質転換のために着想した宿主細胞に依存して選ばれる。原理的には、本発明のバイブリドベクターは、上記の所望の発現カセット、複製起点又は自己複製配列、優勢マーカー配列、任意的に所望のＤＮＡの転写及び翻訳にとって並びに任意的に、所望の生成物の分泌のために必須の発現コントロール配列、並びに追加の制限部位を含んで成る。

複製起点又は自己複製配列（染色体外要素に自己複製能力を授けるＤＮＡ要素）を、サルウィルス（５Ｖ４０）もしくはその他のウィルス起源に由来するが如きの外因性起点を含ませるようにベクターを構築することによって、又は宿主細胞の染色体機構のいづれかによって施す。

本発明のバイブリドベクターは、形質転換、選択及びクローンすべき宿主に応じて選択マーカーを含みうる。マーカーの表現型発現に基づいて、形質転換体の選別を促進せしめる任意のマーカー遺伝子が利用できつる。適当なマーカーは特に、例えばテトラサイクリンもしくはアンビシシンに対する抗生物質耐性を発現するもの、又は栄養要求性菌類突然変異体の場合、宿主の傷害を補完する遺伝子である。対応の遺伝子は例えば抗生物質シクロへキシミドに対する耐性を授けるか、又は栄養要求酵母突然変異体、例えばｕｒａ３゜Ｉｅｕ２．　ｈｉｓ３もしくは川」遺伝子において原栄養性を供する。形質転換すべき宿主がマーカーにより発現される生成物に対して栄養要求性であることを条件として、自己複製セグメントに一体化している構造遺伝子をマーカーとして利用することも可能である。

更に、本発明は、本発明の組換ＤＮＡ分子を増幅するだめの、又は特に本発明の組換ＤＮＡ分子を含んで成る発現カセットを発現するための形質転換宿主細胞を、所望のタンパク質と７Ｂ２との同時発現の目的のため、又は７Ｂ２自体を生産する目的のために考慮している。

適切な宿主、特に本発明の組換ＤＮＡ分子を増幅するための宿主の例は、制限酵素又は改質酵素を欠く又はそれが少ない微生物、特に大腸菌の株、例えば大腸菌Ｘｌ７７６、大腸菌Ｙ　１０９０、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌）ＩＢ１０１／ＬＭＩ０３５、大腸菌ＪＡ２２１　、大腸菌ＤＨ５α、好適には大腸菌Ｄ１１５α Ｆ’　、　ＪＭＩ０９．　ＭＨＩもしくはＨＢＩＯＩ　、又は大腸菌Ｋ１２株、等、及び酵母、例えばサツカロマイシス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　、例えばＳ、　セレビジＺ　ＧＲＦ１８である。

更なる適切な宿主細胞は高等生物の細胞、特に樹立された連続ヒト又は動物細胞系、例えばヒト胎芽肺繊維芽細胞Ｌ１３２、ヒト悪性黒腫Ｂｏｗｅｓ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＳＶ４０ウィルスで形質転換されたアフリカ産グリーンモンキーＣＯ５−７の腎細胞もしくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。生物活性タンパク質の前駆体と７Ｂ２との同時発現による生物活性タンパク質の調製に特に関係するのはニューロナル又は内分泌腫瘍細胞に由来する細胞系である。

本発明はまた、かかる形質転換体の調製のための方法も考慮し、この方法は、適当な宿主細胞を形質転換条件のもとて本発明の組換ＤＮＡ分子、特に本発明のバイブリドベクターにより、任意的に選択マーカー遺伝子と共に形質転換せしめ、次いでその形質転換体を選別することを含んで成る。

微生物の形質転換は、例えば鉦　セレビシェ（Ａ、ｔＩｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＡＳ、　７５．１９２９．１９７８）　、枯草菌（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８１．７４１．１９６１）及び大腸菌（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌら、Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　５３．１５９．１９７０）に関する論文に記載の慣用の方法に従って実施される。

従って、大腸菌の形質転換の手順は、例えばＤＮＡ取込みが可能となるようにする細胞のＣａ”予備処理、及びバイブリドベクターとのインキュベーションを含む。形質転換細胞のその後の選別は、例えばその細胞を選択増殖培地に移し入れて形質転換細胞をそのベクター　ＤＮＡのマーカー配列の種類に依存して親細胞から分離することにより成し遂げることができる。好ましくは、ベクターを含まない細胞を増殖させない増殖培地を利用する。酵母の形質転換は、例えばグリコシダーゼによる酵母細胞壁の酵素的除去の工程、得られるスフェロプラストのポリエチレングリコール及びｃａＩの存在下でのベクターによる処理、並びにスフェロプラストをアガーの中に包埋することによる細胞壁の再生を含んで成る。好ましくは、再生アガーは再生と、上記の形質転換細胞の選別とを同時に可能とするようなものに調製する。

高等真核起源の細胞は、例えば哺乳細胞系の形質転換はトランスフェクションにより好適に成し遂げられる。トランスフェクションは慣用の技術、例えばリン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクソ３ン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、即ち、細胞の浸透性を過渡的に高める短い電気パルスによるＤＮＡの導入、又はヘルパー化合物、例えばジエチルアミノエチルデキス）・ラン、ジメチルスルホキシド、グリセロールもしくはポリエチレングリコール等の存在下で行われつる。トランスフェクション手順の後、トランスフェクト細胞を、例えば選択マーカーの種質に応じて選ばれる選択培地、例えば標準の培養培地、例えばＤｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）　、最少必須培地、ＲＰＭＩ培地等であって例えば対応の抗生物質を含むものの中で同定及び選別する。

形質転換細胞を当業界に公知の方法により、炭素の同化性起源、例えば炭水化物、例えばグルコースもしくはラクトース、窒素の起源、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質もしくはその分解生成物、例えばペプトン、アンモニウム塩等、並びに無機塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの硫酸塩、リン酸塩及び／又は炭酸塩を含む液体培地の中で増殖させる。この培地は更に、成長促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等を含む。

培地は好ましくは陶汰圧を及ぼし、そして形質転換されていない、又はバイブリドベクターを失った細胞の増殖を阻止するように選ぶ。

従って、例えば、もしバイブリドベクターがマーカーとして抗生物質耐性遺伝子を含むなら、培地に抗生物質を加える。例えば、もし必須アミノ酸において栄養要求性であり、そのバイブリドベクターがその宿主の欠陥を補完するような酵素についてコードする遺伝子を含む宿主細胞を用いるなら、前記アミノ酸を欠く最少培地を形質転換細胞の培養のために用いる。

高等真核起源の細胞、例えば哺乳細胞を、組織培養条件のもとて、市販の培地、例えばＤｕｌｂｅｃｃｏ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）　、最少必須離したタンパク質、好ましくはモノマータンパク質を７Ｂ２で処理し培地、ＲＰＭ　ｌ培地等の上記のものを用い、任意的に成長促進物質及び／又は哺乳動物の血清を添加して培養させる。組織培養条件下での細胞培養のための技術は当業界に公知であり、そして例えばエアーリフトリアクターもしくは連続スターラーリアクターの中ての均質懸濁培養、又は中空ファイバー、マイクロカプセル、もしくはアガロースマイクロビーズ、多孔性ガラスピーズ、セラミックカートリッジ、もしくはその他のマイクロキャリヤーの中での固定化もしくは捕捉型細胞培養が含まれる。

培養は当業界に公知のプロセスにより行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び発酵時間は、本発明のポリペプチド又は誘導体の最大力価が得られるように選ぶ。

非形質転換細胞から形質転換細胞を選別するために、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカーを含むか、又はそうでなければ、細胞をかかるマーカーを含む第二ベクターで同時形質転換せしめる。他の系と同様にかかる選択マーカーは発現性構造遺伝子であり、その発現ポリペプチド（酵素）は受容生物に化合物毒素に対する耐性を供するか、又はかかる必須ポリペプチドを欠く突然変異体の酵素系を補完しうる。

インビボでの７Ｂ２の長所とは別に、それはインビトロで解離剤として働きもする。即ち、タンパク質、好ましくはモノマータンパク質の不活性な可溶型凝集体を生物学的に活性なタンパク質へと変換できるか、又はタンパク質、好ましくはモノマータンパク質を、不活性な凝集体に凝集するのを防ぐことができる。

従って、本発明はタンパク質、好ましくはモノマータンパク質の解離又は凝集防止のための方法を供し、この方法は、タンパク質の可溶性不活性凝集体を含む不活性凝集体を７８２で処理して、タンパク質、好ましくはモノマータンパク質を解離せしめること、又は解この実施例は本発明の例示を意図する。しかしながら、それらはてその凝集を防ぐことを含んで成る。タンパク質の解離又は凝集の防止は重要であり、その理由は凝集か生物学的に活性なタンパク質を不活性せしめるから、又は解離したタンパク質は再び折りたたまれつるか、凝集体は再び折りたたまれないからである。

本発明にかかわるこの方法は特に、そのタンパク質、好ましくはモノマータンパク質を７Ｂ２で処理してタンパク質の凝集を防ぐか、又はタンパク質、好ましくはモノマータンパク質を７Ｂ２で処理してそのタンパク質を解離させることを特徴とする。処理は適当なバッファー溶液、例えばリン酸もしくはトリスバッファーの中で、又はタンパク質を分泌した細胞の上清液の中て行うことさえもできる。

解離のため、処理すべきタンパク質と７Ｂ２とを混合し、そして数時間、例えば約３０ｍ１ｎ−１ｈにわたり、約４°Ｃ〜３０°Ｃの温度で、任意的にＡＴＰの存在下で、もしそれを使用するなら、好ましくは約１〜１０ｍＭの濃度において、インキュベートする。凝集を防ぐため、７Ｂ２と、凝集すべきてないタンパク質とを混合し、そしてそのタンパク質を７Ｂ２の存在下で通常の条件のもとて保存する。７Ｂ２は例えば、凝集すべきてないタンパク質を分泌する酵母細胞培養物に加えてもよい。

インヒドロての利用のため、７Ｂ２を原核又は真核細胞、例えば大腸菌又は酵母における遺伝子操作により調製し、その細胞から単離するか、又はその調製７Ｂ２が分泌されるなら、その上清液から単離し、そして解離すべき、又は凝集か防かれることを所望するタンパク質に加える。

本発明の最も好ましい態様は実施例に記載のものである。しかしなから、本発明は最も好ましくは、実施例の中に記載の特定の態様の自明の変異体及び同等物を含むことをも意図している。

本発明の限定として考えられるべきでない。

図面の説明図１はｐＧＥＸ　−２Ｔ　−７Ｂ２クローンの構築体を示す。ベクターｐＧＥＸ　−２ＴのＭＣ３の中のＢａｍ８１部位フレノウフラグメントて補完し、その後ｈ７Ｂ２−　ｃＤＮＡのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｐＡＢ１由来）をＳｍａ　Ｉ　／ＥｃｏＲ１部位の中にクローンせしめる。融合タンパク質のアミノ酸配列の中の５ｊ２６と７Ｂ２との間の一過性領域において、トロンビンについての認識部位がある。

図２は、ＥｃｏＲＩ部位の中に多重クローニング部位を有するリンカ−を挿入することによりベクターｐＧＥＸ−２Ｔに由来する、原核発現ベクターｐＧＥＸ− ＫＧの構築体を示す。

実施例例１　大腸菌の中ての組換ヒト７Ｂ２の製造（クローンｐＧＥＸ　−２Ｔ／　７Ｂ２）原核発現ベクターｐＧＥＸ−２７（Ａｍｒａｄ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、メルボルン、ビクトリア、オーストラリア）はｔａｃ−プロモーターより下流にシストツマ　ジャポニカム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のグルタチオンＳ−）ランフエラーセ（ＧＳＴ）遺伝子を有する。このベクターを、大腸菌の中てＧＳＴとの融合タンパク質として７Ｂ２を発現するのに適当にするため、リーディングフレームシフトをＧＳＴ遺伝子の３′ 末端にある多重クローニング部位に導入しなくてはならない。このため、ｐＧＥＸ　−２ＴヘクターをＢａｍＨＩで消化し、そして凹型の３′末端をＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウフラグメントの利用により補完（ｆｉｌｌｉｎ）　ｔ、た。得られるプラント末端のリゲーションは、択一的なリーディングフレームを担う、４個の追加塩基対を存する改変ｐＧＥＸ−２７ベクターをもたらした。このベクターをＳｍａ　Ｉ及びＥｃｏＲ１て消化し、ヒト７８２のアミノ酸１４〜１８５　（７Ｂ２の配列については、ＥＰＡ−０，３１５，２１４を参照ノコト）をエンコードすル１．０ｋｂ（７）ＥｃｏＲＶ　−ＥｃｏＲＩ　ｃＤＮＡフラグメントをこの改質ベクターのＳｎａ／　ＥｃｏＲ１部位にリゲートさせた。得られるプラスミドを大腸菌株ＪＭＩＯＩ　ｈｓｄＳ　ｒｅｃＡに形質転換し、クローンｐＧＥＸ　−２７／　７Ｂ２を得た（図１参照）。

ｐＧＥＸ　−２７／　７Ｂ２プラスミドを含む細菌の一夜培養物（クローンｐＧＥＸ　−２Ｔ／７Ｂ２）を、アンピシリン（７０μｇ／ｍｌ）を含む２００ｍ１のＬＢ培地の中で２０倍に希釈し、そして３７°Ｃでｌｈ増殖させた。融合タンパク質の発現を誘発させるため、ＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド：　Ｓｉｇｍａ）を０．５ｍＭの最終濃度となるように加え、そしてその培養物を更に３ｈ増殖させた。細胞を遠心（５ｍｉｎ。

５、０００ｒｐｍ）で集め、そして音波処理（１０回、２０ｓｅｃづつ）により、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，５；　５０ｍＭのＮａＣ１；　１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００：　２５０ｍＭのグアニジン塩酸塩：１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール；ＩｍＭのエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）　、ｌｏｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びＩｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む溶解バッファー３ｍｌの中で溶解させた。そのリゼートを５．ＯＯＯｒｐｍ、　１０制ｎ、４℃で遠心し、そして融合タンパク質をグルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ、　Ｇ４５１０）を有するアフィニティークロマトグラフィーによって上清液から単離できた。このためには、上清液を、溶解バッファーで平衡にした５０％（Ｖ／Ｖ）のグルタチオンアガロース５００ μｌと混合した。この混合物の４℃でのサンプルの定常回転を伴う２０ｍ１ｎのインキュベーションの後、その混合物を遠心しく３０ｓｅｃ、　５．００Ｏｒｐｍ）　、そしてそのビーズを３ｍｌの溶解バッファーで３回、そして３０ｍ　ｌのトロンビン切断バッフ−ｒ　（５０ｍＭのトリス、ｐＨ５，５；　１５０ｍＭのＮａＣ１；　２．５ｍＭのＣａＣ１ｚ）で５回洗った。

最後の洗浄の後、ビーズを、２μｇのトロンビン（ヒト血漿に由来する凍結乾燥粉末、Ｓｉｇｍａ、　Ｔ６７５９）を含む５００μｌのトロンビン切断バッファーの中に懸濁し、そしてその混合物を室温で１０ｍ１ｎ回転させた。切断反応を、ＰＭＳＦ　（最終濃度１ｍＭ）の添加及び氷上にそのサンプルを置くことにより停止させた。

得られた７Ｂ２はシグナルペプチド及び成熟ヒト７Ｂ２の最初の１３個のアミノ酸を欠き、そして４個の追加のＮ末端アミノ酸を含んでいた。

トロンビンを除去するため、５０％（Ｖ　／　Ｖ　）のｐ−アミノベンズアミジン−アガロース（Ｓｉｇｍａ　Ａ７１５５）懸濁物２００μｌをその上清液に加え、可能な融合タンパク質の残留物を除去した。１０ｍ１ｎのインキュベーション（４°Ｃ）の後、アガロースビーズを除去し、そして精製７Ｂ２を一８０°Ｃに保存するか、又は−２０″Ｃでの保存の前に凍結乾燥しておいた。精製（〉９５％の純度）組換７Ｂ２の収量は約０．５μｇ／　ｍ　ｌ　であった。類似の結果が、ｐＧＥＸ　−２７／　７Ｂ２構築体をＲＲ１、ＨＢＩＯＩ。

Ｃ６００又はＤＨ５αのような他の大腸菌株の中に形質転換せしめたときに得られた。

タンパク質サンプルを、１２．５％のＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥＸＬａｅｍｍｌｉ、　１９７０）、それに続く０．２％のクマジーブリリアントブルーＲ２５０溶液（５０％のメタノール、７．５％の酢酸）の中でのゲルの染色、又はゲルをウェスタンブロッティングにかけることのいづれかにより分析した。ウェスタンプロット分析のためには、タンパク質の分離の後、その５ＤＳ−ゲルをプロッティングバッファー（１５０ｍＭのグリシン、２０ｍＭのトリス、２０％のメタノール）の中で１５ｍ１ｎ平衡にした。ニトロセルロースへのタンパク質のｔ気泳動的転写はプロッティングバッファーの中で１００ｍＡで１６ｈ行った。

プロットをリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ、５０ｍＭ）ＮａＨＰＯ２，１）Ｈ７，３；１２０ｍＭのＮａＣｌ　）の中ですすぎ、そしてブロッキングバッファー（ＰＢＳ中の３％のニワトリ卵アルブミン（ＣＥＡ）、１％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）及び０．３％のトリトン）の中でＩｈブロックした。抗体インキュベーションは、ブロッキングバッファーの中に１：５００で希釈した抗−７Ｂ２％ツクローナル抗体ＭＯＮ−１０２及びＭＯＮ−１４４（培養上清物）（ｖａｎＤｕｉｊｎｈｏｖｅｎ、Ｈ，Ｌ、Ｐ、ら、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４２　：　１８７−１９８（＋９９１））を用いて室温で行った。２ｈ後、未結合材料をすすぎバッファー（ＰＢＳと、　０．５％（７）　ＣＥＡ、０．２９６（Ｄ　ＮＧＳ及び０．３９６（７））リドン）ノ中で３回プロットをすすぐことによって除去した。次にそのニトロセルロースフィルターをペルオキシダーゼラベル化ヤギ−抗−マウス抗体（ＧＡＭ／Ｐ０．　１　：　１０００）を含むこのバッファーの中で２ｈインキ酵母発現ベクターの中ての好都合なりローニングのための上記の遺伝子を得るため、プラスミドｐＥＣ７Ｂ２の中でエンコードされた完全ヒトｃＤＮＡに基づいて（Ｍａｒｔｅｎｓ、　Ｇ、Ｊ、Ｍ、、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ、、　２３４　：　１６０−１６４　（１９８８）　；　ＥＰ− Ａ−０，３１５，２５４の中て公開されているヒト７Ｂ２　ｃＤＮＡのＤＮＡ配列〕、２種のデオキシオリゴリボヌクレオチドをプライマーとして用いて（ＳＥＱ　＋０　Ｎα１と２を参照のこと）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ヒトｃＤＮＡを３０周期のＰＣＲで増幅させた。５４ｂｐの７Ｂ２シグナル配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα３）、７Ｂ２遺伝子の５５５ｂｐのコード領域及び停止コドン（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎａ　４　）を、ＥｃｏＲＩ及びｓｐｈ　Ｉで完全に消化させたプラスミド　ｐＵｃＩ９　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ、ドイツ〕にリゲートさせた。リゲーンヨン混合物のアリコートを、カルシウム処理した形質転換コンピテント大腸菌ＨＢＩＯＩ細胞１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。

サンディエゴ、米国〕に加えた。６個のアンピシリン耐性大腸菌形質転換体を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で増殖させた。プラスミドＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲＩ／Ｓｐｈ　１．　ＥｃｏＲＩ　／Ｐｓｔ　Ｉ、　Ｓａｃ　１／　Ｋｐｎ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ　／　Ｂａｍｔ（Ｉ及びＸｂａ　Ｉ　／　Ｉ（ｉｎｄｌ［での消化により分析した。予測の制限フラグメントを有する−のクローンを選別し、そしてｐＵｃ１９／　ＥｃｏＲＴ　−ｓｐｈ　Ｔ　／　７Ｂ２ｓｓ　−７Ｂ２と命名した〔ここで７Ｂ２ｓｓは、ヒト７Ｂ２の１８個のアミノ酸のシグナル配列を意味する〕。

上記の遺伝子を得るため、完全ヒトｃＤＮＡ　（例２ａと同様）に基づいて、２種のデオキシオリゴリボヌクレオチドをプライマーとして用いて（ＳＥｏ　１０　Ｎ（Ｌ　１と５を参照）、ＰＣＲを行った。ヒトｃＤＮＡを例２ａのように増幅させた。１８個のアミノ酸の７８２シグナルペブチＶ（例２ａ参照）、　１３７個のアミノ酸のヒト７Ｂ２及び停止コドンをエンコードする約４８０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｓｐｈ　Ｉフラグメントを、例２ａのようにプラスミド１）ＵＣｌ３にリゲートさせた。ＤＮＡを形質転換体より調製し、そしてＥｃｏＲＩ／５ｐｈ１．　ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔ１．５ａｃｌ／Ｋｐｎｌ及びＸｂａ　Ｉ　／ＨｉｎｄＩ［による消化によって分析した。予測の制限フラグメントを有するーのクローンを選別し、そして１）ＵＣ１９／　ＥｃｏＲＩ　−Ｓ９ｈ　Ｔ／　７Ｂ２ｓｓ−７８Δｌと命名した。

上記の遺伝子を得るため、完全ヒトｃＤＮＡ　（例２ａと同様）に基づいて、２種のデオキシオリゴリボヌクレオチドをプライマーとして用いて（ＳＥＱ　ＩＤ階ｌと６を参照）、ＰＣＲを行った。ヒトｃＤＮＡを例２ａのように増幅させた。１８個のアミノ酸の７Ｂ２シグナルベブチに（例２ａ参照）、　１４９個のアミノ酸のヒト７Ｂ２及び停止コドンをエンコードする約５１５ｂｐのＥｃｏＲｒ −Ｈｉｎｄｎ［フラグメントを、例２ａのようにＥｃｏＲ１及びＨｉｎｄｎＩて完全に消化させておいたプラスミドｐＵｃ１９にリゲートさせた。ＤＮＡを形質転換体より調製し、そしてＥｃｏＲＩ　／１ｉｉｎｄＩ［［、Ｅｃｏｌ’ｔｌ／Ｐｓｔｌ、５ａｃｌ／Ｋｐｎｌ及びＸｂａ　Ｉ　／　ＢｉｎｄｌＩＩによる消化によって分析した。予測の制限フラグメントををするーのクローンを選別し、そしてｐＵｃ１９／　ＥｃｏＲｌ　−Ｈｔｈｄｌｌ　／　７Ｂ２ｓｓ−７ＢΔ２と命名した。

例２ｄ、アミノ末端の７Ｂ２シグナルペプチド及びヒトタンパク質の最初の１７０個のアミノ酸をエンコードするトランケート化７Ｂ２遺伝子の構築上記の遺伝子を得るため、完全ヒトｃＤＮＡ　（例２ａと同様）に基づいて、２種めデオキシオリゴリボヌクレオチドをプライマーとして用いて（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα１と７を参照）、ＰＣＲを行った。１８個のアミノ酸の７Ｂ２シグナルベブチＦ（例２ａ参照）、　１７０個のアミノ酸のヒト７Ｂ２及び停止コドンをエンコードする約５８０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−１１ｉｎｄＩＩＩフラグメントを、例２ｃのようにプラスミドｐＵｃ１９にリゲートさせた。

ＤＮＡを形質転換体より調製し、そしてＥｃｏＲＩ　／　ｔ（ｉｎｄｌＩＩ、　ＥｃｏＲＩ　／Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｓａｃ　Ｉ　／　Ｋｐｎ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉ　／ＨｉｎｄｌｌＩによる消化によって分析した。予測の制限フラグメントを有するーのクローンを選別し、そしてｐＵｃ１９／　ＥｃｏＲＴ−ＨＢｎｄ丁／７Ｂ２ｓｓ−７ＢΔ３と命名した。

例３　酵母細胞の中での組換７Ｂ２の製造例３ａ・酵母ＳＵＣ２遺伝子由来のアミノ末端シグナルペプチド及び完全ヒト７Ｂ２をエンコードする遺伝子の構築遺伝子由来の５７ｂｐの化学的に合成したシグナル配列〔以降、転化酵素シグナルペプチド又はＩｎｖｓｓとのみ称する（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα８）〕を含む。このプロモーター及びシグナル配列をＥｃｏＲＴ部位により連結させた。このプラスミドをＸｈｏ　Ｔで完全に消化し、そしてＴ４ポリメラーゼでその接着末端を補完した。Ｎｃｏ　Ｉリンカ−をプラント末端ＤＮＡに付加した。ＢａｍＨＩ及びＮｃｏ　Ｉて消化後、約４６５ｂｐのＢａｍｔ（Ｉ　−Ｎｃｏ　Ｉフラグメントか単離された。

プラスミドｐＥＣ７Ｂ２　（例２ａ参照）をＥｃｏＲＩて完全に消化し、そしてその接着末端をＴ４ポリメラーゼで補完した。Ｎｃｏ　Ｉリンカ−をそのプラント末端ＤＮＡに付加させた。Ｓａｃ　Ｉ及びＮｅｏ　Ｉで消化後、７Ｂ２遺伝子の５′末端を含む約２７０ｂｐのＮｃｏｌ　−５ａｃｌ　７ラグメントか単離された。

単離された約４６５ｂｐのＢａｍＨＩ　−Ｎｃｏ　Ｉ及び約２７０ｂｐのＮｅｏ　Ｉ　−Ｓａｃ　Ｔフラグメントを、ＢａｍＨＴ　−Ｓａｃ　Ｉて完全に消化させておいたプラスミドｐＵｃ１９にサブクローンした。大腸菌ＨＢＩＯＩの中に形質転換した後、６の形質転換体より得られるＤＮＡをＢａｍＨＩ　／　Ｓａｃ　ｒ及びＢａｍＨ１／ＨｉｎｄｌＩＩにより分析した。−の適正なりローンを１）ＵＣＩ９／　ＢａｍＨＩ　−３ａｃ　Ｉ　／ＧＡＰＤＨ−１ｎｖｓｓ　−７８２（不正確な構築体）と命名した。この構築体において、転化酵素シグナル配列のコード領域は７Ｂ２のフレーム内になかった。

フレーム内の転化酵素シグナル配列と７Ｂ２コート領域とを含む適正な構築体を、３種のデオキシリボヌクレオチドプライマー（５ＥＱＩＤＮα９．１０及び１１を参照のこと）を用いるＰＣＨにより構築した。

部位特異的欠失突然変異誘発を実施するのに用いた鋳型はｐＵｃ１９／ＢａｍＨＩ　−Ｓａｃ　Ｉ　／ＧＡＰＤＨ−１ｎｖｓｓ　−７Ｂ２（不正確な構築体）である。５ＥＱＩＤＮ（１９とＩＯのプライマーを第一プラントのＰＣＲに用いて、フレーム内の転化酵素シグナル配列の一部と７Ｂ２遺伝子についてコードする約＋８０ｂｐのフラグメントを得た。第二ラウンドのＰＣＲにおいては、この第 −ＰＣＲより獲得した、変性した約１８０ｂｐのフラグメントと５ＥＱＩＤ　Ｎ αＩＩのプライマーとを用い、フレーム内完全転化酵素シグナル配列と７８２遺伝子の一部（遺伝子の５′末端）とをエンコードする約２２０ｂｐのＥｃｏＲＴ　−Ｓａｃ　Ｉフラグメントを得た。このフラグメントをＥｃｏＲ［及びＳａｃ　ｒて完全に消化させておいたｐＵｃＩ９の中にサブクローンした。ＤＮＡを６の大腸菌ＨＢＩ引形質転換体より得た。分析は、全てのクローンが適正であることを示した。かかるクローンの一つをｐＵｃＩ９／　ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｃ　Ｔ　／　Ｉｎｖｓｓ　−７８２Ｓａｃ　（適正構築体）と命名した。

フレーム内完全転化酵素シグナル配列と７Ｂ２遺伝子の一部とをエンコードする約２２０ｂｌ）のＥｃｏＲＩ　−Ｓａｃ　１フラグメントか、ブラスミ）”　ｐＵｃ１９／ＥｃｏＲＩ　−５ａｃ　Ｉ　／　Ｉｎｖｓｓ　−７Ｂ２Ｓａｃ　（適正な構築体）より単離された。

７Ｂ２の３′セグメントと停止コドンとをエンコードする約４１０ｂｐのＳａｃ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［ＩフラグメントかプラスミドｐＵＣＩ９／　ＥｃｏＲＩ　− Ｓｐｈ　１／　７Ｂ２ｓｓ−７８２より単離された（例２ａ参照）。

ＥｃｏＲＴ　−Ｓａｃ　ＩとＳａｃ　ｌ−Ｈｌｎｄｎ［フラグメントとを、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｒにより完全に消化しておいたｌ１ｌＵＣＩ９にリゲートさせた。６の形質転換体より得られたＤＮＡをＥｃｏＲＴ　／　Ｓａｃ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ　／　ＢａｍＨ１及びＥｃｏＲＩ　７　ＨｉｎｄＩ［［て分析した。−の適正なりローンをＩ）ＵＣ１９／　ＥｃｏＲｌ　−ｔｌｉｎｄｎＩ／　１ｎｖｓｓ−７８２と命名した。このプラスミドは、フレーム内完全転化酵素シグナル配列（５７のアミノ酸）と完全ヒト７Ｂ２（１８５のアミノ酸）及び停止コドンをエンコードする。

ＣＹＰ　Ｉ遺伝子；Ｈａｅｎｄｌｅｒ、　Ｂ、、　Ｋｅｌｌｅｒ、　Ｒ，、１ｌｉｅｓｔａｎｄ、　Ｐ、Ｃ，、Ｋｏｃｈｅｒ。

Ｈ，Ｐ、、　Ｗｅｇｍａｎｎ、　Ｇ、、　Ｍｏｖｖａ、　Ｎ、Ｒ，、Ｇｅｎｅ　８３　：　３９−４６　（１９８９））をＰＣＲにより単離した。ＰＣＲは例２ａのように、鋳型としての酵母株３２８８Ｃ由来のゲノムＤＮＡ及びプライマーとしての２種のデオキシオリゴリボヌクレオチド（ＳεＱＩＤＮα１２と１３を参照のこと）を用いて実施した。

約５４５ｂｐのＢａｍＨＴ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを単離し、そしてＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＴて完全に消化しておいたｐＵｃ１８にサブクローンした。６の形質転換体より得られたＩＩＮＡを制限酵素及びＤＮＡ配列決定により分析した。−の適正なりローンをｐＵｃ＋９／　ＢａｍＨＩ　−ＨｃｏＲＩ　／　ＣＹＰＩＩＩと異種遺伝子の発現における有効な転写ターミネータ−として働くＰＨ０５遺伝子由来の約３７７ｂｐのＳｐｈ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｅフラグメント（ＰＨ０５遺伝子の３′末端にあるフラッシュ型５ａｕ３Ａ部位にＳｐＨ１リンカ−を付加；Ｍｅｙｈａｃｋ、　Ｂ、、　Ｂａｊｗａ、　Ｗ、、　Ｒｕｄｏｐｈ、　Ｈ，、Ｈｉｎｎｅｎ、　Ａ、、　ＥＭＢＯＪ、、　６．３４５５−３４６３．　（１９８２））を、ｓｐｈ　Ｉ及びＰｓｔｌて完全に消化しておいたｐＵｃ１９の中にサブクローンした。形質転換体の分析後、−の適正なりローンをＩＩＵＣ１９／Ｓａｈ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ　／ＰＨ０５Ｔと命名した。

約５４５ｂｐのＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲｒ　ｃｙｐｌｐフラグメントをｐＵｃＩ９／　ＢａｍＨｒ−ＥｃｏＲＩ　／　ＣＹＰＩｐから単離した（例３ｂ参照）。

Ｉ８のアミノ酸の７８２シグナルペブチト、　１８５のアミノ酸のヒト７Ｂ２及び停止コドンをエンコードする約６２０ｂｐのＥｃｏＲ１−ｔ（ｉｎｄｌｌＩフラグメントをｐｔｌｃＩ９／　ＥｃｏＲ［−Ｓｐｈ　Ｔ　／　７Ｂ２ｓｓ　−７Ｂ２より単離した（例２ａ参照）。

約３８５ｂｐの旧ｎｄＩ［−Ｓａｌ　Ｉ　ＰＨ０５ＴフラグメントをｐＵＣ１９／　Ｓｐｈ　１−　Ｐｓｔ　Ｉ　／ＰＨ０５Ｔより単離した（例３ｃ参照）。

Ｂａｍｆ（Ｉ　−ＥｃｏＲＩ　、　ＥｃｏＲＴ　−ＨｉｎｄｌＩ［及びＨｉｎｄｌ［−５ａｌＩフラグメントを、ＢａｍＨＴ及び５ａｌｌで完全に消化しておいたベクターｐＤＰ３４にリゲートした。プラスミドｐＤＰ３４は大腸菌−３，セレビシェシャトルベクターであり、完全Ｓ、セレビシェ２ミクロンプラスミドを含み、そして酵母選択マーカーとしてのＳ、セレビシェＵＲＡ　３及びｄＬＥＵ　２遺伝子をエンコードする。大腸菌１１ＢＩＯＩの中での形質転換の後、ＤＮＡを２４の形質転換体より調製した。ＢａｍＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｔによる分析は適正なりローンを確証した。かかる−のクローンをｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　 −５ａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰＩｐ　−７Ｂ２ｓｓ　−７Ｂ２−　ＰＨ０５Ｔと命名した。

例３ｅニア８２シグナル配列を用いるトランケート化７Ｂ２の分泌のための酵母発現ベクターの構築ｐＤＰ３４／ＢａｍＨＩ　−３ａｔ　Ｉ　／ＣＹＰｌｐ−７８２ｓｓ−７Ｂ２Δ ２−ＰＨＯ５ＴｐＤＰ３４／ＢａｍＨＩ　−Ｓａｔ　Ｉ　／　ＣＹＰＩｐ　−７８２ｓｓ　−７Ｂ２Δ３−ＰＨＯ５Ｔと命名したプラスミドを例３ｄと同じようにして構築した。７Ｂ２シグナル配列、トランケート化ヒト７Ｂ２遺伝子コード領域及び停止コドンを含むＥｃｏＲ１−Ｈｉｎｄｌｌ［フラグメントを適当なプラスミドから単離した（例２ｂ−ｄを参照）。

例３ｆ：酵母ＳＵＣ２シグナル配列を用いる完全７Ｂ２の分泌のための酵母発現ベクターの構築ｐＵｃ１９／ＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＴ　、、’ｃｙｐｌｐ由来の約５４５ｂｐのＢａｍＨＩ　−ＥｃｏＲＴ　ＣＹＰ１ｐフラグメント（例３ｂ参照）及びｐＬＩｃ１９／ＥｃｏＲＩ　−Ｓａｃ　Ｉ／　Ｉｎｖｓｓ−７Ｂ２　（（適正構築体）：例３ａ参照〕由来の約２２０ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｓａｃ　Ｉフラグメントを例３ａのように、ＢａｍＨＩ及びＳａｃ　１て完全に消化しておいたｐＵＣ１９にサグクローンした。−の適正なりローンより得られたＤＮＡを、１）ＵＣ１９／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｃ　Ｉ　／　ｃｙｐｔｐ　−［ｎｖｓｓ−７８２（５ ’末端）と命名した。

転子の５′末端を含む約７６５ｂｐのＢａｍＨＩ　−Ｓａｃ　Ｉフラグメント、プラスミドｐＵｃ１９／　ＥｃｏＲＩ　−Ｓｐｈ　Ｉ　／　７Ｂ２ｓｓ　−７８２由来のヒト７Ｂ２遺伝子の３′末端及び停止コドンを含む４１０ｂｐのＳａｃ　Ｉ　−Ｈｉｎｄｌ［フラグメント（例２ａ参照）、ｐＵｃ１９／　ｓｐｈ　Ｉ　−Ｐｓｔ　１　／　ＰＨ０５Ｔ由来の約３７７ｂｐの旧ｎｄＩ［−５ａｉｌフラグメント（例３ｃ参照）を、ＢａｍＨＩ及びＳａｌ　Ｉで完全に消化しておいたベクターｐＤＰ３４にリゲートした。

大腸菌ＨＢＩＯＩの中での形質転換後、ＤＮＡを２４の形質転換体より調製した。Ｂａｍｆ（Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ及びＢａｍＨＩ　／　！（ｉｎｄ　ＩＩＩによる分析は適正なりローンを確証せしめた。かかるークローンをｐＤＰ３４／Ｂａ１ｔ（Ｉ　−Ｓａｌ　ＩｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰｌｐ　−１ｎｖｓｓ　−７Ｂ２Δ１−ＰＨＯ５ＴｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　− Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰｌｐ　−ｒｎｖｓｓ　−７Ｂ２Δ２−ＰＨＯ５ＴｐＤＰ３４／ＢａｍＨＩ　−３ａｌ　Ｉ　／ＣＹＰｌｐ　−［ｎｖｓｓ−７Ｂ２Δ３− ＰＨＯ５Ｔと命名したプラスミドを例３ｆと同じようして構築した。トランケート化ヒト７Ｂ２遺伝子コード領域の３′末端を含むＳａｌ　Ｉ　−Ｈｌｎｄｌ［フラグメントを適当なプラスミドから単離した（例２ｂ−ｄ）。

上記のプラスミドを例３ｆ及びｇに記載の通りに構築した。適当なフラグメントを、ｐＤＰ３４とほとんど同じ１）ＤＰ３３であって、唯一の違いはｐＤＰ３３が酵母選択マーカーとしてプラスミドｐＤＰ３４の中にあるＳ、セレビシェｔＪＲＡ　３遺伝子を欠くことにあるものにリゲートさせた。ｄＬＥＵ２によりエンコードされ、そしてプラスミドｐＤＰ３３の中に存在している欠陥プロモーターは、ＬＥＵ　２対立遺伝子の非機能性ゲノムコピーをプロセスする酵母細胞の中の上記のプラスミド構築体のコピー数を増やすのに役立ちつる。

例３１：ヒト７Ｂ２遺伝子をエンコードするプラスミドによるＳ、セレビシェ株ＡＢ１１０ｐｒｂ　Ｉ　”の形質転換酵母形質転換はＫｌｅｂｅら、Ｇｅｎｅ　２５　：　３３３−３４１　（１９８３）及びＨｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５　：　１９２９　（１９７８）に記載の通りに実施した。

Ｓ、セレビシェＡＢＩＩＯ励ピ１〔例４ｂ参照；ＰＲＢＩは酵母Ｂプロテアーゼをエンコードする〕又は酵母プロテアーゼＡ及びＢについて崩壊している任意の株を、下記のプラスミドで形質転換させ、そしてその形質転換体を表示の通りに命名した：ｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰｌｐ　−７８２ｓｓ　−７８２−ＰＨ０５Ｔ　ｙＨＢ　１ｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／ＣＹＰ１ｐ　−７８２ｓｓ　−７Ｂ２Δ１−　ＰＨ０５Ｔ　ｙｌ（Ｂ　２ｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　［／　ＣＹＰｔｐ　−７８２ｓｓ　 −７Ｂ２Δ２−　ＰＩ（０５Ｔ　Ｙｌ（Ｂ　３ｐＤＰ３４／ＢａｍＨＩ　−３ａｌ　Ｅ　／ＣＹＰ１ｐ−７８２ｓｓ−７Ｂ２Δ３−　ＰＨ０５Ｔ　ＹＨＢ　４ｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰｌｐ　−１ｎｖｓｓ　−７Ｂ２−　ＰＨ０５Ｔ　ｙＨＢ　５ｐＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰＩｌｌ−１ｎｖｓｓ　−７Ｂ２Δ１−　ＰＨ０５Ｔ　ｙ）ＩＢ　６ｐＤＰ３４／ＢａｍＨＴ　−Ｓａｌ　Ｉ　／ＣＹＰ１ｐ　−ｒｎｖｓｓ　−７Ｂ２Δ ２−　ＰＨ０５Ｔ　ｙＨＢ　７１）ＤＰ３４／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰｌｐ　−１ｎｖｓｓ　−７８２Δ３−　ＰＨ０５Ｔ　ＹＨＢ　８ｐＤＰ３３／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰｌｐ−Ｉｎｖｓｓ　−７Ｂ２− 　ＰＨ０５Ｔ　ｙＨＢ　９１）ＤＰ３３／ＢａｍＨＩ　−３ａｌ　Ｉ　／ＣＹＰＩＩ）−１ｎｖｓｓ−７Ｂ２Δ１−ＰＨＯ５Ｔ　ｙｕｅｔ。

１）ＤＰ３３／ＢａｍＨＩ　−３ａｌ　Ｉ　／ＣＹＰ１ｐ　−［ｎｖｓｓ−７Ｂ２Δ２−ＰＨＯ５Ｔ　ＹＨＢＩＩＩＩＤＰ３３／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｔ　／ＣＹＰＩｐ　−ｒｎｖｓｓ　−７Ｂ２Δ３−ＰＨＯ５Ｔ　ｙＨＢ１２各形質転換体のコロニーを３個を選び、そして追加の番号で命名した（即ち、　ｙＨＢ− １−１，ｙＨＢ−１−２，ｙＨＢ−１−３）。

例３ｊ：振騰フラスコの中での７８２酵母形質転換体の増殖Ｓ、セレビシェ株ＡＢＩＩＯＣＭａｔ　ａ、　ｈｉｓ４−５８０．１ｅｕ２．　ｕｒａ３−５２゜ｐｅｐ４−３．　（ｃｉｒ’）　）はどこにでも開示されている（Ｂａｒｒ、　Ｐ、Ｊ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３．１６４７１−１６４７８　（１９８８））　、アミノ酸なしの８．４ｇ／Ｉの酵母窒素ベース（Ｄｉｒｃｏ）　、１０ｇ／　１のＬ−アスパラギン、１ｇ／Ｉのヒスチジン及び２０ｇ／ｌのグルコースを含む最少培地を予備培養物として用いた。この培地に、プラスミドｐＤＰ３４又はｐＤＰ３３のいづれを選別することを要するかに応じてＩｇ／ｌのロイシン又はＩｇ／ｌのウラシルを添加した。７Ｂ２を、３０ｇ／ｌのグルコース、８．５ｇ／ｌのカスアミノ酸及び必須アミノ酸を添加した。１．７ｇ／ｌの酵母窒素ベースを含むメイン培養物の中で発現させた。酵母形質転換体（例３ｉ）はロータリーシェーカー上で３０゛Ｃて１８０ｒｅｖ／ｍｉｎにて、１０ｍ１容量の予備培地で４８ｈ１そして６０ｍ１のメイン培養物の中で４８ｈ増殖させた。

細胞のアリコートを回収し、そして分泌７Ｂ２をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０フイルター（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１０〜５０倍に濃縮した。その濃縮上清液を、　ＩＧＦ−１を含む酵母培養培地でのインキュベーションのために用いた。細胞内及び分泌７Ｂ２の定量評価を大腸菌の中ての７Ｂ２の発現より得た精製７Ｂ２を用いるウェスタンブロッティング（例１参照）によって行った。モノクローナル抗体ＭＯＮ−１０２を７Ｂ２抗原を認識するために用いた（例Ｉ参照）。

例４．インビトロ又はインビボで用いる７Ｂ２によるＩＧＦ−１の生産性の向上例４ａ：ヒト　ＩＧＦ−１遺伝子をエンコードするプラスミドによる１）を分泌せしめる能力を有する株に、プラスミドｐＤＰ３４／ＧＡＰＤＨｐ−ａＦＬ、　 −ＩＧＦＩ　−ａＦＴ　（Ｓｔｅｕｂｅ、　Ｋら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１９８　：　６５１−６５７　（１９９１））を形質転換せしめた。ｐＤＰ３４／　ＧＡＰＤＨｐ−αＦＬ−ＩＧＦＩ　−ａＦＴの中に存在するＩＧＦ−１発現カセットを含む安定２−ミクロンプラスミドｐＦＢＹ６６　（欧州出願Ｎα ９１８１０１２４．７）もＡＢＩＩＯに形質転換せしめた。その形質転換体を概してＹＩＧＦと命名した。

例４ｂ　ヒト　ＩＧＦ−］遺伝子及びヒト７Ｂ遺伝子をエンコードすについて崩壊されている株に、プラスミドｐＦＢＹ６６　（例４ａ参照）、及び下記の４種のプラスミドのいづれかｐＤＰ３３／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／ＣＹＰＩＩ）　−１ｎｖｓｓ　−７８２−ＰＨ０５ＴｐＤＰ３３／Ｂａｎ）Ｉ　Ｉ　−３ａｌ　Ｔ　／ＣＹＰ１ｐ−１ｎｖｓｓ−７Ｂ２ΔＩ　−ＰＨ０５ＴｐＤＰ３３／Ｂａｎ）（Ｉ　−Ｓａｔ　Ｉ　／ＣＹＰＩＩ）−１ｎｖｓｓ−７Ｂ２Δ　２　− 　ＰＨ０５ＴｐＤＰ３３／　ＢａｍＨＩ　−Ｓａｌ　Ｉ　／　ＣＹＰＩｐ−１ｎｖｓｓ　−７Ｂ２Δ３−Ｐ）１０５Ｔ（例３ｈ参照）を同時形質転換せしめた。

この形質転換体に概してＹＩＧＦ／７Ｂ２と命名した。

例４Ｃ振騰フラスコ培養物の中でのＹＩＧＦの増殖、及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるＩＧＦ−１タンパク質の定量決定酵母形質転換体ＹＩＧＦを、６．５ｇ／Ｉの酵母抽出物、４．５ｇ／ｌのカスアミノ酸及び２０ｇ／Ｉのグルコースを含む非選択予備培地としてのリッチな培地の中で増殖させた。　ＩＧＦ−１は７Ｂ２の発現のために用いたのと同じメイン培地の中で、発現した（例４ａ参照）。

細胞のアリコートを回収し、そして培地中の分泌した活性モノマーＩＧＦ−１分子をＨＰＬＣ及びＥＬＩＳＡ　（Ｓｔｅｕｂｅ、　Ｋ、、ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　。

１９８　：　６５１−６５７　（＋９９１））により測定した。

酵母形質転換体ＹＩＧＦ７７Ｂ２Ｃ例４ｂ参照）を例４Ｃのように増殖させた。

細胞のアリコートを回収し、そしてモノマーＩＧＦ−１をウェスタンブロッティングにより評価した。ＹＩＧＦ／７Ｂ２より得られた還元モノマーＩＧＦ−１の量はｙ＋ｃｐ　（例４ａ参照）より得られた量より多いことか認められた。

例４ｅ・活性モノマーＩＧＦ−１の力価に及ぼす７Ｂ２の効果７Ｂ２の濃縮上清液（例４ｂ参照）を、ＩＧＦ−１を含む酵母培養上清液（例３ｊ参照）と、ＡＴＰの存在下又は非存在下で（１ｍＭ〜１０ｍＭの最終濃度）、３０°Ｃでｉｈインキュベートした。活性モノマーＩＧＦ−１の力価をＨＰＬＣにより測定した。

同し培養上清液を３０°Ｃで、７Ｂ２の非存在下、しかしＡＴＰの存在下、そして更に７Ｂ２及びＡＴＰの両者ての７Ｂ２との培養土漬物のインキュベーションの後、　ＩＧＦ−１力価の実質的な上昇を示した。

典型的には、６０μｍの酵母培養上清液（２，５μｇの活性ＩＧＦ−１モノマー及び２０μｇの不活性分子を含む）を、ｙ１ｔＢ６．　ＹＨＢ７．　ｙＨＢｉ。

及びＹＨＢＩ＋より分泌した２０倍濃縮７Ｂ２上清液６０μｍ　（５μｇのトランケート化７Ｂ２を含む）と、２００ｍＭのＡＴＰ６μ＋の存在下て３０°Ｃでｌｈインキュベートし、続いてＥＤＴＡ　（最終濃度２　ｍＭ）を添加する。

この混合物１００μｍをＨＰＬＣにより分析した。

組換ＰＯＭＣタンパク質を標準分子生物学技術により作った。同様にして、純粋なＰＯＭＣをベクターｐＧＥＸ−ＫＧの中てのＰＯＭＣｃＤＮＡのクローニングにより得た。ベクターｐＧＥＸ−ＫＧはｐＧＥＸ−２Ｔベクターの改質バージョンであり、その中に多重クローニング部位を含んで成るリンカ−か一体化されている（図３）。下垂体ライブラリーから単離したｐブルースクリプトクローンを培養することによりこのベクターを利用し、このクローンはＰＯＭＣｃＤＮＡを含んで成り、そしてＥｃｏＲＩ及びＸｈｏ　Ｉによる消化によってこのクローンからＰＯＭＣｃＤＮＡを除去した。このクローンをｐＧＥＸ−ＫＧ−ＰＯＭＣと命名した。このクローンの発現は純粋なＧＳＴ−ＰＯＭＣ融合タンパク質をもたらし、そしてトロンピンによる切断後、純粋なＰＯＭＣを供した。　１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２．５ｍＭのＣａＣＬを含む１５０μ］の５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　、ｐＨ７，５中の凝集組換ＰＯＭＣを組換７Ｂ２と共に及び抜きで、氷上で４５ｍ１ｎインキユベートした。天然ゲル電気泳動は７Ｂ２の添加が解離ＰＯＭＣの量の実質的な上昇をもたらすことを示した。

７Ｂ２の、プロホルモンブロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）を解離せしめる能力を、７Ｂ２を新たに合成したＰＯＭＣ１即ち組織培地の中でキセノプス中間下垂体細胞により産出された新たに合成された総タンパク質の９０％以上のタンパク質とインキュベートすることによって試験した。７Ｂ２と凝集ＰＯＭＣとの相互作用を自然ポリアクリルアミドゲル及びＩＩＰＬｃて分析した。

新たに合成されたＰＯＭＣは、ブラック−アダブト（ｂｌａｃｋ−ａｄａｐｔｅｄ）キセノブスの神経中葉（中間下垂体細胞）により、その葉の５ｍＣ１／ｍｌの（”Ｓ）−メチオニンを含む培地の中でのｌｈのインキュベーションの際に産出される。タンパク質をＩＮのＨＣＩで酸抽出し、凍結乾燥し、そして１５０μ Ｉの１５０ｍＭのＮａＣ１，２，５ｍＭのＣａＣｌ　２．５０ｍＭのトリス−ＭＣＩ　、ｐｔｌ　７．５の中に再溶解させた。３０μｍのアリコートのラジオラヘルタンパク質に（約ｌμｇのＰＯＭＣを含む）に、組換７Ｂ２（例１に従って調製）　、ＧｒｏＥＬ、　ＢＳＡ　（Ｓｉｇｍａ）又はα−クリスタリンのいづれか５μｇを加え、そしてそのサンプルを氷上で４５分インキュベートした。

サンプルを等容量ゲル装填用バッファーと混ぜ、そして６−２５％のアクリルアミド、０．２−０．１５％のビス−アクリルアミドの非変性勾配ゲルて、　１００ｖで３ｈ電気泳動し、続いて固定し、そしてそのゲルを乾かしてオートラジオグラフィーにかけた。非ラジオラベルタンパク質はクマジーブルー染色により検定した。自然ゲル上のバンドに見い出せる事実止金ての放射活性が新たに合成されたＰＯＭＣに相当するかを確認するため、それらのバンドを乾いたゲルから切り出し、そしてＩＭのトリス−ＨＣｌ　、　ｐｉ（８，０をＩｈ載せることによって再水和せしめた。次に、そのトリスバッファーをＳＤＳサンプルバッファーに交換し、そしてそのサンプルを煮沸し、そして１２，５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの上に載せた。

キセノブス中間下垂体細胞由来のラジオラベルタンパク質の調製のために用いる酸抽出法は、自然ゲルに侵入しない、且つ実験に用いた条件及び時間枠内で自発的に折りたたまれない変性（凝集）ＰＯＭＣをもたらした。しかしながら、凝集ＰＯＭＣと組換７Ｂ２（例１に従って調製）とのインキュベーションは、はとんどの凝集体の自然ゲルにおいて約１２０にのラジオラベルバンドに至る変換をもたらし、一方、ＧｒｏＢＬとのインキュベーションは一部のみの凝集体の約５０にのバンドへの変換をもたらした。中温性タンパク質のウシ血清アルブミン又はオリゴマータンパク質のα−クリスタリンとのインキュベーションは効果がなかった。自然ゲルからのラジオラベルバンドの切り出し、それに続＜　５ＤＳ−ＰＡＧＥは、そのバンドがモノマーの３７にのＰＯＭＣより成ることを確証せしめた。

変性したラジオラベルＰＯＭＣ及び７Ｂ２処理ラジオラベルＰＯＭＣをＬｌｌｔｒａＳｈｅｒｏｇｅ　ｌカラム（ＳＥＣ２０００，Ｂｅｃｋｍａｎ）での、カラム溶出バッファーとして１００ｍＭのＫＨ，ｔＰｏ、、１００ｍＭのＮａｔＳＱａ　（ｐＨ７，０）を１ｍｌ／１ｏｉｎの流速で用いるＩＩＰＬＣ（Ｍｏｄｅｌ　５Ｐ８７５０．５ｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ）により分析もした。放射活性画分をβ−カウンターで計測した。この検出法でも、７Ｂ２とのインキュベーション後にモノマーＰＯＭＣにおける有意義な上昇が認められた。

真核細胞の中ての７８２とＰＯＭＣとの生産のため、真核発現ベクターｐＥＣＶ５−Ｘｈｏを用いた。６．８ｋｂの長さのこのベクターは、ｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ａ　Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ −ｖｉｒｕｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｃＤＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９８９）の論文に記載のベクターｐＥＣＶ　５に由来する。ｐＥＣＶ　５のクローニング部位における５ｓｔｌ制限部位をベクターｐＥｃＶ　５−　ＸｈｏにおけるＸｈｏ　Ｉ制限部位と交換した。

ベクターｐＥＣＶ　５−　Ｘｈｏ　（ｔ　ラウス肉腫ウィルス（Ｒ３ｖ）プロモーター、それに続くクローニング部位及びβ−グロブリンイントロン、並びに効率的なポリアデニル化のためのポリアデニル化シグナルを含んで成る。Ｒ３Ｖプロモーターは一般に活性が強く、そして使用したＡｔＴ２Ｏ細胞においては確実にそうであった。ｐＥｃＶ　５−　Ｘｈｏベクターは、トランスフェクションの後に抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を供し、なぜならこれはその構造内にヒグロマイシン耐性遺伝子を含んで成るからである。

成熟タンパク質の７８２をコードする０、　８ｋｂのヒト７Ｂ２　ｃＤＮＡフラグメントを、Ｋｐｎ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉによる消化を介してベクターｐＡＢ　１を含んで成る７Ｂ２　ｃＤＮＡより切り出し、そしてｐＥＣＶ５−ＸｈｏベクターのＫｐｎ　Ｉ　−Ｘｈｏ　１部位の中にリゲートさせた。これは、クローンｐＥＣＶ　５−　Ｘｈｏ−７Ｂ２をもたらした。同様に、成熟ＰＯＭＣタンパク質をエンコードする１、　ｌｋｂのＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　ＰＯＭＣｃＤＮＡ７ラグメントをこのベクターのＥｃｏＲ１部位におけるＲ３Ｖプロモーターの後方に適正な方向で一体化せしめた。プラスミドｐＥｃＶ　５−　Ｘｈｏ　−７Ｂ２及びｐＥｃＶ　５−　Ｘｈ。

−ＰＯＭＣを２〜１５μｇのＤＮＡのエレクトロポレーションによりＡｔＴ２Ｏ細胞にトランスフェクトせしめた。ＡｔＴ２Ｏはマウス下垂体の前案に由来する腫瘍細胞系である。トランスフェクションの一日後、選別をヒグロマイシン含有（８０μｇ／ｍｌ）培地の中て細胞をインキュベートすることにより開始させた。２週間後、個々のクローンを単離し、そして安定なトランスフェクトＡｔ２０細胞系へと新たに増殖させた。

ノーザンプロット分析、並びにモノクローナル及びポリクローナル抗体による免疫沈殿の助けを伴って、７Ｂ２とＰＯＭＣの過剰生産が認められ、事実、これらの細胞においてＲＮＡとタンパク質レベルの両方において２０〜３０倍の上昇が生じた。これらの構築体のトランスフェクションは細胞増殖速度には何ら影響しなかった。予測通り、７Ｂ２における多大なる上昇が、７Ｂ２　ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞において認められ、より多くの７８２が制御型経路をたどったことを示唆している；この７Ｂ２は従って分泌されるように刺激されたときにのみ細胞を離れるのであろう。これは５ｍＭの８−　Ｂｒ　−ｃＡＭＰによる細胞の刺激の後に認められた事実である。

ＰＯＭＣ及び７Ｂ２の両者でトランスフェクトされた細胞によるＡＣＴＨの生産はＡＣＴＨラジオイムノアッセイの利用により、ＰＯＭＣのみでトランスフェクトされた細胞のＡＣＴ）Ｉ生産と比較できつる。

対中間下垂体（ｐａｒｓ　ｉｎｔｅｍｅｄｉａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｙｐｏｐｈｙｓｉｓ）の中温性細胞は７Ｂ２と共同してプロホルモンＰＯＭＣを発現する細胞である。即ち、ＰＯＭＣ発現性が高まると、７Ｂ２も高められた速度で生産されるであろう。７Ｂ２がヒートショックタンパク質である可能性を調べるため、ツメガエル、アフリカッメガエルの下垂体の中温性細胞をこれらの細胞の正常インキュベーション温度（即ち、２１’Ｃ）でインキュベートし、そして同量の細胞を〔７Ｈ〕−リジンの存在下で３０℃（ヒートショック）で１時間インキュベートした。生産されたＰＯＭＣの量は両細胞においてほぼ同じであったが、しかしながらヒートショック細胞においては明らかに多量の７８２（約５倍はど）が生産され：生産された７Ｂ２は、７Ｂ２に対するモノクローナル抗体で特異的に実証される。

公知の合成技術に従い、７８２　ｍＲＮＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列に特異的な合成−木繊ＤＮＡ　（即ち、７Ｂ２アンチセンスオリゴヌクレオチド）の一部（オリゴヌクレオチド）を作った。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞の中での７８２　ｍＲＮＡの７８２への翻訳をブロックするために用いた：アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡに結合するため、タンノ（り質が読まれなし）力１、又はＲＮＡは特定のＲＮＡａｓｅにより細胞の中で分解する。従って、生物活性化合物の生産に及ぼす７Ｂ２の生産性のかかる阻止の影響が調べられうる。これらの実験は、７Ｂ２アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したＡｔＴ２Ｏに同様に及ぶことができる。

監烈青ＳＥＱ　１０　ＮαＩ配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ：２６塩基鎖　の　数ニー重鎖トポロジー：直鎖状起　源二部分的にヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源１合成特　徴：位置９〜２６：ヒト７Ｂ２遺伝子のアミノ酸１〜６のシグナル配列のセンス鎖：位置３〜９：ＥｃｏＲＩ部位ＡＴＧＡＡＴＴＣＡＴ　ＧＣＴＡＴＣＴＧＧＣＣＴＡＣＴＧ　２６ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎα２配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ：２６塩基鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状起　源二部分的にヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源二合成特　徴：位置１２〜２６：ヒト７Ｂ２のコード配列のアンチセンス鎖；位置３〜８：５ｐｈ１部位；位ｆｉＬ９〜１１．停止コドン。

ＴＡＧＣＡＴＧＣＴＴ　ＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣ２６ＳＥＱ　１Ｄ　ｋ３配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ　５４塩基鎖　の　数二二本鎖トポロジー二直鎖状もとの実験起源：　ＰＥＣ７Ｂ２特　徴、ヒト７Ｂ２遺伝子によりエンコードされる１８−アミノ酸のシＳＥ０　１０　Ｎα４配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ、５５８塩基鎖　の　数−二本鎖トポロジー・直鎖状もとの実験起源　ＰＥＣ７Ｂ２特　徴、１８５−アミノ酸のヒト７Ｂ２ＳＥＱ　ＩＤＮα５配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ　２９塩基鎖の　数ニー重鎖トポロジー、直鎖状起　源９部分的にヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源１合成特　徴・位置１２〜２９：ヒト７Ｂ２をコードする配列のアンチセンスｌ；位置３〜８・　ｓｐｈ　１部位：位置９〜ｌｌ：停止コドン。

ＴＡＧＣＡＴＧＣＴＴ　ＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴ　ＧＣＣＣＡＡＧＣＣ２９ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα６配列の種類　ＤＮＡ配列の長さ　２９塩基鎖　の　数、−重鎖トポロシー：直鎖状起　源９部分的にヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源　合成特　徴・位置１２〜２９：ヒト７Ｂ２をコードする配列のアンチセンス鎖：位置３〜８：ＨｉｎｄＩＩＩ部位；位置９〜！１：停止コドン。

ＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴ　ＡＣＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴ　２９ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα７配列の種類　ＤＮＡ配列の長さ、２９塩基鎖　の　数・−重鎖トポロジー　直鎮状起　源１部分的にヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源・合成特　徴：位置１２〜２９：ヒト７Ｂ２をコードする配列のアンチセンス鎖；位置３〜８　：　ＨｉｎｄＩ［［部位；位置９〜ｌｌ：停止コドン。

ＡＴＡＡＧＣＴＴＴＴ　ＡＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＣＣＡＧ　２９ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎα８配列の種類：　ＤＮＡと対応のペプチド配列の長さ＝６９塩基鎖　の　数二二本鎖トポロジー：直鎖状もとの実験起源：　ｐｌＪｃ１９／　ＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ　Ｉ　／ＧＡＰＤＨ− ＩＴ特　徴：位置７〜６３：酵母ＳＵＣ２遺伝子によりエンコードされた１９− アミノ酸のシグナルペプチドのコード領域；位置１〜６：ＥｃｏＲ１部位：位置６４〜６９　：　Ｘｈｏ　１部位。

ＳＥＱ　ＩＤ陽９配列の種類　ＤＮＡと対応のペプチド配列配列の長さ：３６塩基鎖の数ニー重鎖トポロジー：直鎖状起　源：Ｓ、セレビシェとヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源：合成特　徴：位置１〜１８　：　Ｓ、セレビシェ５ＬＩＣ２遺伝子のシグナルペプチドのセンス鎖（Ａｌａ１４〜Ａ１ａ１９）　；位置１９〜３６：　７Ｂ２のコート領域（Ｔｙｒ　Ｉ　〜Ｐｒｏ　６　）。

ＳＥＱ　［Ｄ　？１ｈｌＯ配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ：２０塩基鎖の数ニー重鎖トポロジー二直鎖状起　源：ヒトゲノムＤＮＡ直接の実験起源：合成特　徴：ヒト７８２のコード領域のアンチセンス鎖ＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡ　ＣＣＴＴＣＡＡＴＧＣ２０ＳＥＱ　ＩＤ魔１１配列の種類：　ＤＮＡと対応のペプチド配列の長さ：２１塩基鎖の数ニー重鎖トポロジー二直鎖状起　源：部分的にＳ、　セレビシェゲノムＤＮＡ直接の実験起源二合成特　徴：位置９〜２０：シグナルペプチドのアミノ酸１〜４に対応する鉦　セレビシェＳＵＣ２のシグナルペプチドのセンス鎖：位置３〜８：ＥｃｏＲＩ部位。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＱ１２配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ＝３０塩基鎖　の数ニー重鎖トポロジー二直鎖状起　源：酵母ゲノムＤＮＡ直接の実験起源二合成特　徴：位置ＩＩ〜３０　：　Ｓ、セレビシェＣＹＰ　１遺伝子のプロモーター領域の５′末端；位置５〜１０　：　ＢａｍＨＩ部位。

ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＡＣＣＴ　ＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴ　３０ＳＥＱ　ＩＤ　Ｔｈ１３配列の種類：　ＤＮＡ配列の長さ：３０塩基鎖の　数ニー重鎖トポロジー二直鎖状起　源：酵母ゲノムＤＮＡ直接の実験起源二合成特　徴：位置１１〜３０　：　Ｓ、セレビシェＣＹＰ　１遺伝子のプロモーター領域の３′末端；位置５〜１０　：　ＥｃｏＲ１部位。

ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＴＡＧＴＡＴＴＡ　ＧＣＧＧＴＴＧＡＧＴ　３０二Ｌｋｉ）二Ｌシ１２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：８６５）（Ｃ１２Ｎ　１／１９Ｃ１２Ｒ１：８６５）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ。

ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ。

ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＯ，ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＡ、　ＵＳＩ（７２）発明者　ステファン、クリスティーヌフランス国、エフ−６８２６０キンジェルセイ、リュ　ドウ　レンテント、２６

Claims

【特許請求の範囲】

１．タンパク質をインビボ又はインビトロで７Ｂ２で処理することを特徴とするタンパク質の調製方法。
２．生物活性タンパク質又はその前駆体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする遺伝情報で形質転換されており、且つこのポリペプチド又は前駆体を発現可能な宿主細胞によるタンパク質の調製のための方法であって、かかる細胞を、７Ｂ２と前記ポリペプチド又は前駆体との同時発現を可能とする遺伝情報で追加的に形質転換せしめること、及びこのポリペプチド又は前駆体を、そのポリペプチド又は前駆体の解離もしくは適正な折りたたみが補助されるように、又はそのポリペプチド又は前駆体が、放出のために任意的にその細胞を刺激した後に分泌されるようにインビボで処理することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
３．真核宿主細胞を利用する、請求項２に記載の方法。
４．タンパク質輸送及び分泌の制御型経路を有する真核宿主細胞を利用する、請求項３に記載の方法。
５．前記ポリペプチド又は前駆体を、放出のためにその細胞を任意的に刺激した後にそのポリペプチドが分泌されるようにインビボで処理する、請求項４に記載の方法。
６．分泌されたポリペプチドが生物活性タンパク質であるように前駆を発現させて処理する、請求項５に記載の方法。
７．ニューロナル又は内分泌細胞を利用する、請求項４に記載の方法。
８．酵母細胞を宿主として利用する、請求項３に記載の方法。
９．前記細胞を、生物活性タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現可能なＤＮＡ配列で形質転換する、請求項８に記載の方法。
１０．生物活性タンパク質のアミノ酸配列を有するポリペプチドが分泌されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
１１．生物活性タンパク質がＩＧＦ−１であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
１２．前記生物活性タンパク質が、ペプチドホルモン、ニューロペプチド、成長因子及び凝集因子の群より選ばれることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
１３．前記生物活性タンパク質がペプチドホルモン又はニューロペプチドであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
１４．７Ｂ２がヒト７Ｂ２であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
１５．前記タンパク質又はその凝集体を７Ｂ２で処理することを特徴とする、インビトロでのタンパク質の解離又は凝集防止のための請求項１に記載の方法。
１６．生物活性タンパク質又はその前駆体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをエンコードする遺伝情報で形質転換され、且つこのポリペプチド又は前駆体を発現可能である形質転換宿主細胞であって、かかる細胞が、７Ｂ２と前記ポリペプチド又は前駆体とをその細胞が同時発現できるようにする遺伝情報で追加的に形質転換されており、且つそのポリペプチド又は前駆体を、放出のためにその細胞を任意的に刺激した後にそのポリペプチド又は前駆体が分泌されるようにインビボで処理することを特徴とする形質転換宿主細胞。
１７．真核細胞である、請求項１６に記載の形質転換細胞。
１８．タンパク質輸送及び分泌の制御型経路を有する真核細胞である、請求項１７に記載の形質転換細胞。
１９．酵母細胞である、請求項１７に記載の形質転換細胞。
２０．ヒト７Ｂ２を発現することを可能にする遺伝情報で形質転換されていることを特徴とする、請求項１６に記載の形質転換細胞。
２１．前記生物活性タンパク質がペプチドホルモン、ニューロペプチド、成長因子及び凝集因子の群より選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の形質転換細胞。
２２．前記生物活性タンパク質がペプチドホルモン又はニューロペプチドであることを特徴とする請求項２１に記載の形質転換細胞。
２３．前記生物活性タンパク質がＩＧＦ−１であることを特徴とする請求項１６に記載の形質転換細胞。
２４．７Ｂ２をエンコードする遺伝情報で形質転換した宿主を培養することを含んで成る、形質転換細胞の中での７Ｂ２の調製のための方法。