JPH06500077A - 接合体物質、試薬および新規なポリエーテル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 接合体物質、試薬および新規なポリエーテル接合体の語は、異種または同種の有 機化合物を共有結合的に連結して製造された物質に共通した名称であり、それら の化合物の性質が接合体に付与されたものである。

本発明の接合物質、試薬および新規なポリエーテルは、共通の構造的特徴として 、連続的に連結したエトキシ基、すなわち構造−（ＯＣＨｚＣＨｚ）ｎ−（式中 、ｎ＝または〉１の整数である）を有する。

本発明の接合体は、一般式Ａ−Ｂ−Ａ′（式中、ＡおよびＡ′はそれぞれ、有機 化合物ＦおよびＦ′からの残基である）で表される。少なくとも一方の化合物は ポリマーであり、そのポリマー構造は残基中にも存在する。ＢはＡおよびＡ′を 互いに連結する有機架橋部であり、構造−（ＯＣＨ２ＣＩｌｚ）ｎ−からなる。

ＡおよびＡ′は、接合される化合物（ＦおよびＦ’）に由来する数個の同一の残 基から構成されてもよい。

接合体の製造に際しては、Ｚ−８’−Ｚ’　［式中、ＺおよびＺ′は相互の反応 に関しては不活性な（両者とも核性もしくは電子性である）反応性官能基であり 、Ｂ′は不活性な架橋部である］のタイプのへテロもしくはホモ三官能性試薬が 使用されることが多い。不活性の語は、架橋部が安定で、Ｚおよび／または２′ の反応性を中和できる基をもたないことを意味する。

化合物の一方（ＦまたはＦ’）がポリマーである接合体を製造するためには、均 一な接合体物質を製造することは困難である。得られた物質は、多かれ少なかれ 、類似の接合体分子の混合物からなることが多い。得られた接合体物質の個々の 分子によく見られる変動には、１個の同じＡ′に結合するＡの数の変動、結合位 置の変動、Ｂが分子間および／または分子内架橋として存在する等である。

接合する化合物の性質を付与するためには、架橋部−Ｂ−の長さおよび構造がき わめて重要である。水に溶は難い化合物では、疎水性架橋構造により、不溶性お よび／または低活性の接合体になってしまう。架橋部が短すぎると、生物活性化 合物を接合した場合、活性が損なわれることが多い。極端な場合には、見当はず れの短すぎる架橋部が活性を完全に劣化させてしまうことがある。

構造−（ＯＣＲ２ＣＨ２）□−はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中に存在す る。ＰＥＧの分子量は平均値として与えられる。

すなわち、ＰＥＧは通常、整数ｎが異なる様々な分子の混合物である。ＰＥＧは 、バイオポリマーに連結した場合、利用できる独特の両親媒性をもつことが知ら れている。

構造−（ＯＣＲ２ＣＨ２）　ｎ−はまた、ある種の既知のアミノ−ＰＥＧ−カル ボン酸中にも存在する。たとえば、ｎ＝１〜１０のＮＨ２Ｃｌ’１ｔＣＨｚ（Ｏ ＣＨｚＣＨ２）ｎｏ（ＣＩ’［２）２ＣＯＯＨ（１’ｌｏｕｇｈｔｏｎ　＆５ｏ ｕｔｈｂｙ、５ｙｎｔｈ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１９（１８）（１９８９）３１９ ９−３２０９）は、環状ポリエーテルアミドの製造の出発原料として示唆されて いる。この著者はまた、ｍ〉２の類縁体も同じ応用が可能であることを示唆して いる。Ｎ■２ＣＨ２Ｃ■２（ＯＣＲ２−Ｃｕ２）　２０ＣＨ２ＣＯＯＨは、大環 構造エーテルの出発原料として示唆されている［Ｊｕｌｌｉｅｎら、Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、２９（１９８８）３８０３−３８０６）。

最近（１９９１，１，２０）　、式Ｎ■２ＣＨｚＣ［１ｚ（ＯＣＨ２ＣＨ２）。

０ＣＲ２ＣＯＯＦＩ（ｎ＝１〜１０）で示されるアミノ−ＰＥＧ−カルボン酸、 一部のそれらの反応性誘導体、それらから製造した蛋白質接合体が開示されてい る（　ＥＰ−Ａ−４１０，２８０）。

架橋部に構造−（ＯＣＬＣＨｚ）ｎ−をもつ接合体は、本願の優先日以前に合成 されている。５１ａｏ＋ａ　＆　Ｒａｎｄｏは、親水性および疎水性の画架橋部 を介してコレステロールを単糖に連結した［Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　１９ （１９８０）４５９５−４６００およびＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　８８（１９８１）２１３−２２１　；ヘテロニ官能性カップリング剤〕 。それらの目的で最善の接合体は橋部： （−ＮＨＣＬＣＨｚ（ＯＣＬＣＨｚ）ｎＯｃＬｃｏ−）ｎ’を有する。式中、ｎ ＝１、ｎ′＝１または２である。

Ｓｌａｍａ　＆　Ｒａｎｄｏは、整数ｎを大きくすることによって一０ＣＨ２Ｃ Ｏ２−構造を増加させることはしなかった。理由は分からないが、その代わりｎ ′を２にすることで、全構造−ＮＨＣＨ２Ｃｕｔ（ＯＣＨｚＣＨｚ）。ＯＣＲ２ ＣＯ−を倍加した。橋部−（ＯＣＨｚＣＨ２）ｎ−（ｎは様々な整数である）を 含有する酵素−抗体接合体は知られている（ＥＰ−Ａ−２５４，１７２およびＦ Ｒ−Ａ−２，６２６，３７３）。後者の出願では、市販のポリエチレングリコー ル（ＰＥＧ）が、カップリング剤の出発原料の一つとして使用されている。これ では、橋部の長さに関して均一な接合体物質を得ることは困難である。オキサア ルキレン構造、たとえば−ＯＣＨ，Ｃｔｌ、−は、アルデヒド基およびチオール 基それぞれでの選択的カップリングのためのへテロ三官能性試薬として示唆され ている（ＥＰ−＾−２４０，２００および１０−＾−８９／　１２６２４）。

上に挙げた刊行物に加えて、スエーデン特許庁は、優先権出願の請求の範囲にと くに関連のある刊行物として、国際タイプサーチレポートに、ＥＰ−Ａ２−３４ ５．７８９、ＷＯ−Ａｌ−８８１０３４１２、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｏ＋ｍ、　１６４（１９８９−１１）：３を引用している 。

本発明は、個々の分子のスペクトルが、と（に親水性水性メジウム中において、 改良された均一性と良好な生物学的利用性を有する接合体物質を提供する。この 目的は、均一な、一定の長さの両親媒性橋部構造を挿入することによって達成さ れた。本発明の接合体は、ｉｎ　ｖｉｖ。

およびｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける診断的使用および治療的使用（薬剤）にとくに 適している。

本発明の接合体は、橋部−Ｂ−が構造 −３ｒＲＣＯＮＩ’１ＣＨ２ＣＨｚ（ＯＣ［＋２Ｃ［１２）。０（Ｃｔｌｚ）ｍ ＣＯＹ−（１）から構成されることを特徴とするものである。

式■における遊離の結合価は、それぞれＡおよびＡ′に連結する。これは直接ま たはさらに架橋−Ｂ−内に存在する２価の不活性構造を介して行われる。−Ｂ− の長さくよ、通常、１８０原子よりも短（、＜１００原子であるカベ、１３原子 より長（、好ましくは１６原子より長し）。

ｎは〉０の整数、たとえば１〜２０であり、ｎｌ！、接合体（接合体物質）の各 分子において橋部を同一の位置に連結するように均一である。ｍは１また：ま２ である。合成の観点から、ｎは好ましくは１０または＜１０である。接合体がＰ ＥＧの独特の両親媒性を示すためには、整数ｎ１マ２より大きくなければならず 、好ましく：ま３よりまた＋１４より大きい。すなわち、基準の様々な組合せに 基づき、整数ｎの間隔は、１〜２０．１〜１Ｏ１１〜９．２〜２０．２〜１０． ２〜９．３〜２０．３〜１０．３〜９．４〜２０．４〜１０．４〜９．５〜２０ ．５〜１０、および５〜９である。

Ｓｒは、その各結合価で飽和炭素原子に直接結合する。

ｒ＝１または２である。すなわち、Ｓｒはジスｌレフイド基またはチオエーテル 基である。ＳｒがＡに直接結合する場合には、硫黄原子の一方はＦに由来しても よ０゜Ｙは−ＮＨ−１−ＮＩＩＮ［Ｉ−または−Ｎ［１Ｎ＝ＣＨ−であり、その 左端１よ式Ｉの右末端に示したＣｏ基に結合し、その右端：ｉ飽和炭素原子また はカルボニル基（Ｙが−ＮＨＮＢ−の場合のみ）Ｉこ結合する。Ｙの右端に結合 する原子は式Ｉｉこ（ま示されていない。

Ｒは好ましくはアルキレン（１〜４個の炭素原子、多くの場合１または２個の炭 素原子を有する）であり、１または２以上（１〜３、好ましくは〈２）のヒドロ キシ（ＯＨ）基で置換されていてもよい。Ｒ中では、１個の同一の炭素原子には 、多くても１個の酸素原子が結合する。

親水性メジウム中における利用性の点から、Ｒは、多くの場合、直鎖状、分岐状 および環式アルキレンからなる群より選ばれる高級アルキレンで同等に置き換え ることができる。ただし、高級アルキレンは、高い疎水性を補償するために、親 水性の置換基をもたねばならない。

その他の条件としては、ｒ＝１の場合、Ｂには１−アザ−２，５−ジオキソ−シ クロペンクン−１，３−ジイル基を含有させその３位で硫黄原子にその１位でＲ に結合させるか、また類似の１，４−ジイル基を含有させその４位で硫黄原子に 結合させることができる。

好ましい実施態様においては、橋部−Ｂ−は、芳香環を含有してはならない。

ポリマーは合成ポリマーでも、またバイオポリマーであってもよい。ポリマーの 語は、３個以上の、好ましくは１０個を越える反復モノマー単位が互いに連続し て結合している化合物を意味する。ポリマーの語はまた、ガラスや他の重合シリ ケートのような無機ポリマーも包含する。

合成ポリマーの例には、ポリ〔ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート〕、ポ リ　〔（メタ）アクリルアミド〕、ポリ（ビニルアルコール）等、およびこれら のポリマーの誘導体型がある。

バイオポリマーの語は、基本骨格が生物起源のポリマーを意味する。この表現に は、誘導体化されたバイオポリマーも包含される。バイオポリマーは、一般的に 、核酸もしくは多糖および／またはポリペプチド構造を示す。

ポリペプチドを含む蛋白質（たとえばアルブミンおよび免疫グロブリン）および 多糖たとえば可溶性および不溶性多糖（デキストラン、デンプン、ヘパリン、セ ルロース等）が重要である。

とくに興味があるポリマー（たとえばポリペプチドおよび／または多糖構造をも つポリマー）は通常、ヒドロキシ（−ｏｎ）　、カルボキシ（−ＣＯＯＩ’ｌ） 　、アミノ（−級または二級）および／またはメルカプト（−３Ｈ）のような官 能基をもっている。与えられたポリマーが適当な官能基をもたない場合には、一 般に基の挿入が行われる。

化合物ＦおよびＦ′は、接合体に付与すべき性質によって選択される。したがっ て、化合物は、担体化合物、生物親和性化合物、分析的に検出可能な化合物、水 性メジウムに不溶性または可溶性の化合物、治療活性化合物（薬剤）、酵素、免 疫刺激剤、トキシン等である。とくに重要なトキシンは、細胞内で作用を発揮す るペプチド細胞毒で、細胞壁を透過するためのペプチドセグメントと細胞内での 毒性のための他のセグメント（ジフテリアトキシン、リシン、シュードモナスエ キソトキシン等）とからなる。他の種類のペプチドトキシンには、免疫刺激を介 してその作用を発揮するものがある（たとえば、Ｔ細胞とクラスＩＩＭＨＣ抗原 をもつ細胞に同時に結合して細胞障害性Ｔ細胞を活性化することによる）。後者 のタイプの例には、ブドウ球菌エンテロトキシンＡがある。

生物親和性化合物、すなわち生物特異的親和性を示す化合物は、その生物親和性 の相対物のターゲッターとして接合体の一部分に使用できるので、とくに興味が ある。

例としては、抗体およびその抗体活性フラグメントならびに相当する抗原／ハプ テン、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ−フラグメント／Ｆｃ一部分および相当す る受容体（たとえば、ＩｇＧはプロティンＡおよびＧに結合する）、アビジン／ ストレプトアビジンおよびビオチン、レクチンおよび相当する炭水化物構造、酵 素および対応する基質、補酵素、補因子、ならびに補基質等がある。各種クラス （とくにｒｇＧ）およびサブクラスの抗体ならびに各種特異性は、本発明の接合 体の一部である。抗体（およびそのフラグメント）の特異性は、たとえば腫瘍細 胞および／または腫瘍抗原／ハプテン、ホルモン、ホルモン受容体等に対してで ある。

と（に興味がある不溶性ポリマーは、クロマトグラフィー、イムノアッセイ、血 液分画等に関連した吸着剤として使用されるポリマーである。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ診断の領域では、分析的に検出可能な化 合物と、生物特異的親和性を示す化合物（ターゲッター）の間の接合体は、ター ゲッターに対する相対物の検出および局在の決定に極めて重要である。分析的に 検出可能な化合物は、放射活性、酵素活性（酵素基質、補基質、補酵素等を含む ）、蛍光性、化学発光性、生物発光性、粒子性（たとえばラテックス）等を示す 化合物である。

治療の目的では、生物親和性化合物は、薬剤および治療効果を発揮する他の物質 に接合させることができる。

本発明の接合体の合成のために、本発明者らは、一般式■ −Ｚ、ＲＣＯＮＨＣＨ，ＣＩ’＋２（ＯＣｔ１２ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍＺ＋ ’　（ＩＩ　）で表される新規なヘテロ三官能性試薬を開発した。式中、ｍおよ びｎは上記式Ｉの場合と同じ意味である。好ましくは、ｍおよびｎは均一である 。すなわち、試薬物質はｍおよびｎが異なる化合物の混合物ではない。Ｒは上述 したと同じ意味のアルキレン基である。ｚｌはＲ３−反応性求電子基、チオール （−ＳＯ）または保護チオール（たとえばＡｃ５−）である。ただしチオール基 およびヒドロキシ基はＲ中の一つの同一炭素原子に結合していてはならない。

ｔｌｓ−反応性求電子基の例には、 （ｉ）　ハロゲン、飽和炭化水素に、好ましくはα−ハローアルキルカルボニル の形で結合したハロゲン（たとえばｚ、ｃｎ、ｃｏ−１この場合ｚ１は好ましく はブロモまたはヨードである）； （ｉｉ）　活性化チオール、好ましくは、飽和炭素原子に結合した、いわゆる反 応性ジスルフィド（−３ＳＩ？、）　。

（旦）　３．５−ジオキソ−１−アザ−シクロペンタ−３−エン−１−イル。チ オール基に対する反応性に関しては、３．５−ジオキソ−１−アザ−シクロペン タ−３−エン−１−イルに代えて、カルボニル基、ニトロ基またはシアノ基と混 成ｐｉ電子系を形成する他の炭素−炭素二重結合も同等に使用できる。

反応性ジスルフィドは、合成化学に関連してよ（知られている（　ＥＰ−Ａ−０ ６３，１０９；　０６４．０４０および１２８．８８５参照）。

Ｒ１は、−３−３−Ｒ、とＲＳ−の間の［１，−３Ｒを放出する化学反応によっ て、すなわちチオール−ジスルフィド交換反応が進んで、Ｒ，−３Ｒが引出され て熱力学的に安定化するように決定される。多くのチオール化合物（Ｒ、’　５ １１）が、水溶液中においてはチオン型への自然互変具によりこの基準に従う。

すなわち、千オン型は相当するチオール型よりも安定である。この種類の互変異 性の前提条件のひとつは、チオール基の硫黄原子が芳香環の一部を構成する炭素 原子に結合し、その環は（ａ）へテロ環で、環内のへテロ原子から奇数個原子の 距離にチオール硫黄原子が位置するか、（ｂ）非ヘテロ環で、電子求引基で置換 されていることである。

Ｒ１の例には、５−ニトロ−２−ピリジル、５−カルボキシ−２−ピリジル、２ −ピリジル、４−ピリジル、２−ベンジルチア゛ゾリル、４−ニトロ−３−カル ボキシフェニルおよび上述のピリジル基のＮ−オキシドがある。

Ｚｌ′は活性化カルボキシ、すなわち電子基である。

例としては、カルボン酸ハライド（−ＣＯＣ／、−ＣＯＢｒ、および−ＣＯＩ） 　、混合カルボン酸無水物（−ＣＯＯＯＣＲ＋）　、反応性エステルたとえばＮ −スクシンイミジルオキシカルボニル、−Ｃ（＝＝ＮＩ’１）−０Ｒｚ、４−ニ トロフェニルカルボキシレート（−ＣＯ−ＱＣ，ｔ１４ＮＯ２）等を挙げること ができる。Ｒ１およびＲ２は低級アルキル（Ｃ＋〜ＣＳ）であり、Ｒ２はまたベ ンジルまたはその結合価のひとつがＮＨ中のＨを置換している０２〜Ｃ３アルキ レンであってもよい（その３−および／または４−位が低級アルキル（Ｃ＋〜Ｃ ｏ）またはベンジルで置換されていてもよいオキサゾリン−２−イルのような環 状構造を与える）。

２１′末端は、 （ｉ）　−ＮＩ’ｌＲ＋、たとえば−級および二級アミン中［Ｒ＋は水素および 低級アルキル（Ｃ＋−ｓ）から選択される〕、ヒドラジン／ヒドラジド中すなわ ちＮｌｌ、Ｎｔｌ、ならびにＮＨ，ＮＨ−およびＮＢ２ＮＨ−ＣＯ−が脂肪族、 好ましくは飽和炭素原子に結合した化合物中、 （ｉｆ）　−０■、たとえばアルコール中、から選ばれる核基をもつ化合物Ｆ′ と選択的に反応できる。

試薬■の２１′末端における化合物Ｆ′との化学反応は、Ｆ′が式Ｒ中の−（Ｃ ［１２）Ｉｌｌに、上記（ｉ）の基の場合にはアミド基もしくはヒドラジド基（ それぞれ−ＣＯＮＨＮＨ−および−ＣＯＮＢＮ＝Ｃ−）　、上記（ｉｆ）の基の 場合にはエステル基を介して、共有結合することを意味する。必要に応じて、Ｚ ｌはついで、チオール−ジスルフィド交換反応におけるチオール基に変換（還元 ）できる。後者の場合、Ｆ′はチオ−ル化される。

ｚＩ末端は、チオール基（Ｓ１１）またはＪＩＳ−反応性電子求引基を有する化 合物Ｆと選択的に反応できる。Ｆがチオール基を有する場合には、反応は直接行 われる。最終生成物においては、化合物Ｆは式■中のＲにチオエーテル（−３− ）もしくはジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）基を介して結合することになる。

試薬Ｈの使用は、それ自体公知の方法で行われる。反応メジウムはＺＩおよびｚ 、１の副反応を避けるように選択される。Ｆおよび／またはＦ′がバイオポリマ ーである場合には、反応は水性メジウム中で行うのが好ましく、選択性を達成す るためには、ｐ■は、２１′における反応では８〜９．５に、ｚＩにおける反応 では〈８にする。非プロトン性メジウムは多くの場合、２１′に対して不活性で あり、これは、それらが一般的にいえば好ましいものであることを意味する。結 果として、ＦおよびＦ′が互いに、式Ｉで表される橋部を介して連結した接合体 が得られる。

式■の試薬をそのＺＩまたは２１′末端のいずれかで、適当な二官能性化合物と 反応させることにより、延長された橋部を導入することができる。たとえば、ｚ 、′をアルキレンジアミン、アルキレンジヒドラジン、アルキレンジヒドラジド 等と反応させ、それらのＮ［Ｉ２−基の１個のみが消費された場合、残りの遊離 ＮＦＩ２−基を他の化合物たとえばＦまたはＦ’　（好ましくは活性化された、 カルボキシ基を有する）との反応に使用できる。

橋部の延長はまた、化合物Ｆおよび／またはＦ′を、本発明の試薬の使用によっ てそれらを互いに連結する前に、Ａ−Ｂ’−Ｚ’　（１頁参照）のタイプの適当 な二官能性試薬と反応させることによって達成できる。Ｂ′は上記Ｒと同じ基か ら選択できる。化合物ＦおよびＦ′それぞれが最初に同じ試薬Ｚ−８’−Ｚ’と ２′基で反応させ、ついで導入されたＺ基を介して互いに連結された場合、基Ｂ ′は接合体中に２回現われることになる（頭部対頭部連結）。

式■の試薬または化合物ＦおよびＦ′の一方のいずれかに始まる連鎖延長に有用 な多数の二官能性試薬が知られている。特定の例としては、４−（Ｎ−マレイン イミジル）−酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、ヨード酢酸Ｎ−スクシンイミ ジルエステル、Ｓ−アセチル−２−メルカプト酢酸Ｎ−スクシンイミジルエステ ル、３−（ピリジル−２−ジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル 、アルキレンジアミン、アルキレンジアシルヒドラジド等を挙げることができる 。アルキレンは上述の場合と同じ意味である。

接合体の合成のためのそれ自体公知の方法には、たとえば炭水化物構造中の隣接 ジオールを２個のアルデヒドに酸化し、ついで−ＣＯＮＨＮＩＩ！基と反応させ 、ＣＯＮ！ｌＮ＝Ｃ−基を与える。炭水化物構造を有する重要な化合物Ｆおよび Ｆ′は糖蛋白質である。二官能性試薬Ｚ−Ｂ’−２’には、または１つのポリマ ーと反応させたのちでも、−ＣＯＮＨＮＨ２基が存在してもよい。

本発明の試薬から出発した連鎖延長では、−８−が（２）　−ＣＯＲ’−３ｒ− ＲＣＯＮＨＣＬＣＨｈ（ＯＣＬＣ■２）ｎＯ（ＣＨｚ）ｍＣＯＮＨＮＨ−れは構 造−ｎ＝が構造−Ｃ＝Ｎ−の部分であることを意味する。この構造は、アルデヒ ド基とＮＨ２−ＮＨＣＯ−基の間の反応で形成されていてもよい。

（３）　−ＣＯ（（Ｊｌ、）ＩｎＯ（ＣＨ２ＣＨ２０）ｎＣＦ１２ＣＨ２ＮＨＣ ＯＲ’−３ｒ−ＲＣＯＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＦＩ２ＣＨｚ）。０（ＣＨ，） ｍＣＯＹ−：Ｃ１１２ＣＢ、（ＯＣＨ２ＣＩ’１２）ｎＯ（ＣＢ２）ｆｆｌＣＯ ＮＨＮＨ−Ｒ’Ｎ［ｌｎ＝　；計が（２）の場合と同様に結合する。

さらに変化が可能である。ｒは上述の場合と同じ意味である。

採用される試薬を変えることで、Ｙ末端から出発して異なる連鎖延長を構築する ことができる。

試薬（式■）は、式■ ＮＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨｚＣＨ２）ｎＯｃｃＨ２）ｍｃＯＯＦＪ　（ｍ　） （式中、ｍは整数１または２であり、ｎは整数１〜２０、たとえば２〜２０であ る）で表される化合物に出発して製造することができる。

式■で表され、ｍ＝１および２、ｎ＝１〜１０のある種の化合物の合成について は、以前に報告がある［Ｊｕｌｌｉｅｎら：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ 、　２９（１９８８）３８０３−３８０６：■ｏｕｇｈｔｏｎ＆　５ｏｕｔｈｂ ｙ：５ｙｎｔｈ、　Ｃｏｍｌｌ１ｕｎ、　１９（１８）（１９８９）３１９９− ３２０９；およびＥＰ−＾−４１０，２８０（公告１９９１−１−２０）　：な らびにＳｌａｍａ＆　Ｒａｎｄｏ　：　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　８ｇ（１９８１）２１３−２２１およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１ ９（１９８０）４５９５−４６００）。

式■で表される試薬は、式■の化合物を、式Ｚ−Ｂ−Ｚ’（Ｚ＝Ｚ、、　Ｂ’＝ Ｒ先に定義された通り、２′活性化カルボキシである）のそれ自体公知の二官能 性試薬（１頁参照）と反応させることにより合成できる。反応後に、−ｃｏｏｎ 官能基を、活性化カルボキシ基、たとえば２１′＝活性化エステル、たとえばＮ −スクシンイミジルオキシカルボニル、４−ニトロフェニルオキシカルボニル、 ２．４−ジニトロフェニルオキシカルボニル等に変換する。

式Ｕ（ｍ＝１、ｎ＝２〜２０）で表される化合物およびその誘導体において、Ｎ Ｈ，−および／または−ｃｏｏｎ−基をそれぞれ、容易にＮＨ２−および／また は−ＣＯＯＨ−基に変換できる基に置き換えた化合物は新規であり、本発明の別 個の態様に関する。この態様は、顕著な両親媒性、すなわち水ならびに有機溶媒 および脂質に同時に溶解する性質を有する。多数の様々な二官能性物質を提供す る。これは、バイオ分子を包含する接合体の製造に使用される試薬を形成する橋 部に望ましい性質である。

式■の新規な化合物およびそれらの新規な誘導体は、一般式： ＸＣＨｚＣ１］ｚ（ＯＣＨ２ＣＨｚ−）ｎＯｃＩ’１２Ｙ　（■）を有するポリ エーテルで表される。ｎは整数２〜２０、好ましくは３〜２０である。ＸはＨ， Ｎ−であり、そのプロトン化型（’ｌＩｍＮ−）または好ましくは加水分解もし くは還元によりＩＴ、Ｎ−に変換可能な置換Ｈ２Ｎ−である。例としては、非置 換アミノ（１１２Ｎ−）　；ニトロ；アミド（カルボアミド）たとえば低級アシ ルアミド（ホルミルアミド、アセチルアミド１０１．ヘキサノイルアミド）、ア シル残基のα炭素原子に電子水引置換基を有するアシルアミド基、とくにＣＦ３ Ｃ０ＮＨ−１Ｃ１１３ＣＯＣ）Ｉ、Ｃ０ＮＩＩ−等；環に置換基をもっていても よいフタルイミジル：カルバメート、とくにＲ，’０ＣＯＮＨ−および（Ｒ＋’ ０ＣＯ）（Ｒｚ’０ＣＯ）Ｎ−１たとえばＮ−（ｔ−ブチルオキシカルボニル） アミノ（Ｂｏｃ）、環に置換基をもっていてもよいＮ−（ベンジルオキシカルボ ニル）アミノおよびジ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル）アミノ（それぞれＺお よびジＺ）；窒素原子に結合した炭素原子が芳香系に対してαであるアルキルア ミノたとえばＮ−モノベンジルアミノおよびジベンジルアミノ、Ｎ−トリチルア ミノ（トリフェニルメチルアミノ）等、ならびにメチル炭素原子（ベンジル炭素 原子を含む）がシリコン（Ｓｔ）原子で置換された類縁基、たとえばＮ、Ｎ−ジ （ｔｅｒｔ−ブチルシリル）アミノ；３−および／または５−位が低級アルキル で置換されていてもよい４−オキソ−１，３，５−）リアジン−１−イルを挙げ ることができる。

上述のおよび以下に述べるＲ１′およびＲ２′は、低級アルキル、とくに二級お よび三級アルキル基、ならびに環に置換基をもっていてもよい１〜３個のフェニ ル基で置換されたメチル基を意味する。低級アルキルおよび低級アシル基は１〜 ６個の炭素原子を有する。

Ｙは、カルボキシ（−ＣＯＯＢ、−ＣＯＯ−を含む）、またはカルボキシに好ま しくは加水分解もしくは酸化によって変換可能な基である。最も重要な基はエス テル基であり、この場合、カルボニル炭素原子またはオルトエステル中の相当す る原子が式Ｉの右端におけるメチレン基に結合している。例には、アルキルエス テル基（−ＣＯＯＲ，’）、オルトエステル基［−Ｃ（ＯＲｓ’　）　ｓ）およ び反応性エステル基、たとえばＮ−スクシンイミジルオキシカルボニル、４−ニ トロフェニルオキシカルボニル、４−および／または５−位に低級アルキルを有 するまたは有しない５員環型（オキサゾリン−２−イル）を含むアルキルイミデ ート基［−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ−Ｒ１’）がある。Ｒ３１は先にＲ３′について定義 した意味を有する。

Ｙの他の基には−ＣＩＯ１−ＣＮ、　−ＣＯＮＲ，’Ｒ，’　（この場合、Ｒ， ）およびＲ，ｌは先の定義と同じ意味である）、および−ＣＯＮＨ２がある。

本発明の化合物は、既知の出発原料から、それ自体公知の方法の組合せによって 合成できる。適当な合成経路は、 Ａ、連鎖の形成 り、末端官能基の変換 Ｃ０対称ポリエーテルの非対称エーテルへの変換り、バイシンメトリックな連鎖 の２つの同一のフラグメントへの開裂 である。

反復単位−〇ＣＩ（２ＣＨ２−を有する便利な出発原料は市販品を入手できる。

たとえば、２〜６個の反復単位を有するオリゴエチレングリコールがある。同一 の末端基をもつ他の適当な化合物には相当するジカルボン酸およびジアミンがあ る。

異なる末端基を有する便利な出発原料は、末端基が純粋なポリエチレンオキシド 橋によって間隔を置いて配置されたω−ヒドロキシモノカルボン酸である。５つ までの反復単位を有するこのような化合物は、先行技術に記載されている（Ｎａ ｋａｔｓｕｊｉ、Ｋａｗａｍｕｒａ　＆　０ｋａｈａｒａ：５ｙｎ−ｔｈｅｓｉ ｓ　（１９８１）　ｐ、　４２］。

Ａ、連鎖の形成 反復単位−０Ｃｆ１２ＣＩ’＋２−と同一または異なる末端基を有する連鎖の合 成には、ウィリアムソンのエーテル合成を適用できる。この方法はアルコールの アルキル化である（ＱＺ″＋）ＩＯＱ’　−Ｑ−０−Ｑ′または逆にＱＯ１ｌ＋ 　Ｚ’Ｑ’→Ｑ−０−Ｑ”）。

（ｉ　）　Ｑ＝Ｘ’ＣＨ２（ＯＣ１’１２ＣＨｚ）ｐ−（式中、Ｘ′は、ＸＣＩ ’ｌ、−または１もしくは２工程以上でｘｃｎ　２−に変換可能な基で、ウィリ アムソンのエーテル合成の条件下に安定である）および （ｕ　）　Ｑ’＝−（ＯＣＨ２Ｃ［ｌ２）ｒＣＨ２Ｙ’　（式中、Ｙ′は、Ｙま たは１もしくは２工程以上でＹに変換可能な基で、ウィリアムソンのエーテル合 成の条件下に安定である）を選択する。ｐおよびｒは０または正の整数であり、 ｐ＋ｒ＝ｎである。

ウィリアムソンのエーテル合成は、Ｄ項に記載するバイシンメトリック型の連鎖 の合成にも適用できる。

Ｙ′がＹでない場合は、Ｙ′は強酸に安定な基から選択するのが好ましい。たと えば、Ｙ′は−ＣＨ，ＯＲ，’、−ＣＨ＝ＣＲ，’Ｒ，’とすることが好ましい 。この場合、Ｒ４′は低級アルキル基（Ｃ＋〜Ｃ６）、好ましくは５個までの炭 素原子を有し、置換されていてもよい３個までのフェニル基でα位が置換されて いてもよい二級または三級アルキル基であり、Ｒ５′およびＩＴ、）は水素、低 級アルキル（Ｃ＋〜Ｃｇ）または置換されていてもよいフェニル基である。

上記式中、２″は中等度ないし高度の反応性を有する離脱基であり、たとえばハ ロ、アルカンスルホネート、アレンスルホネート好ましくはトルエンスルホネー ト（トシレート）、およびパーフルオロアルカンスルホネート好ましくはトリフ ルオロメタンスルホネート等である。

ウィリアムソンのエーテル合成は不活性溶媒中、通常は塩基、多くの場合強塩基 たとえば水素化ナトリウム等の存在下に行われる。適当な長さの成分を組合せる ことにより、延長工程を連続して、原理的には任意の連鎖−（ＯＣＨ２ＣＩ’ｌ ｚ）。を製造することができる。

連鎖ハマタ、化合物Ｘ″−Ｃ（Ｘ”　）＝ＣＨ２へ（Ｄ　ＨＯＱまたは）ＩＯＱ ’のミカエル付加によって、１０ＣＲ，ＣＨ２単位で延長することができる。こ の場合、ＱおよびＱ′はそれぞれ前の意味と同じである。基Ｘ′およびｘｍはそ れぞれ−ＯＱおよびＯＱ’が化合物Ｘ“−Ｃ（Ｘ”）＝ＣＨ２中の２−炭素原子 に導かれるように、またＱおよびＱ′中の末端基がそれぞれ適用される条件下に 安定であるように選択されなければならない。

Ｘ″′は水素、Ｘ′は容易にアミノまたは置換アミノに変換可能な基たとえばニ トロとすることができる。また、Ｘ″オヨヒｘ′ハソレソれ、変換後、基Ｘ’− Ｃ（Ｘ”　）ＣＨ２−が基ＨＯＯＣＣＨ２−またはその誘導体に変換できる基と することができる。好ましくは、Ｘ′はメタンスルフィニル　Ｘ　ｎｒはメチル チオであり、これは付加工程で得られた生成物の加水分解を必要とする。この加 水分解はアルデヒドを与え、これはついで相当するカルボン酸に酸化することが できる。ミカエル付加の条件は、ウィリアムソンのエーテル合成の場合と同様で ある。

連鎖延長の第三の方法は、ラネーニッケルまたは硫黄に対して高い親和性を有す る相当する試薬を用いた千オンエステルの還元である。適当な千オンエステルは 、次式で表される。

Ｘ’　ＣＨｚ（ＯＣｔｈＣＩｈ）ｑＯＣＨ２Ｃ３−（ＯＣ１ｈＣ１’ｈ）ｓ−Ｃ ＨｚＹ’または　Ｘ’　ＣＨ２（ＯＣＨ２Ｃ１１２）ｐＯ−Ｃ３ＣＦ１２（ＯＣ Ｈ２ＣＨ２）ｑ−ＣＩ’１２Ｙ’式中、Ｘ′およびＹ′は前と同じ意味であり、 ｑおよびＳは０または正の整数であって、ｑ＋５＝ｎ−１であり、ｎは前の意味 と同じである。

チオンエステルは、アルキル化剤たとえばヨウ化メチル、ジメチル硫酸またはジ アゾメタンの作用による、相当するチオールエステルの転位によって合成できる 。チオールエステルは、カルボン酸／ｈライドのチオール化合物との反応によっ て合成できる。他の別法には、カルボン酸エステルを、カルボン酸エステルに存 在する場合の二重結合酸素に選択的な硫黄転移試薬と反応させる方法がある。こ の種の試薬の例には、五硫化リンまたは好ましくはローエソン試薬〔２，４−ビ ス（４−メトキシフェニル’）　−１，２，３，４−ジチアホスフェタン−２， ４−ビススルフィド〕がある。この転移では、官能性末端基がカルボキシ酸素を 含んでいてはならない。

Ｂ、末端基の変換 式 ％式％ （式中、Ｘ′−は、ＸＣ■２−または１もしくは２工程以上でＸＣＩＩ　２−変 換可能な基で、Ｙ′は、Ｙまたは１もしくは２工程以上でＹに変換可能な基であ る）で示される化合物を、所望の変換および最終生成物を与えるか、または必要 に応じて、カップリング工程に使用できる中間生成物を与える反応条件に付すこ とができる。

Ｘ’（またはＸＣＬ−）　＋７）例はヒドロキシメチル、−Ｃｔ１２０Ｒ４’、 −ＣＨ＝ＣＲ５’　Ｒ８’　（Ｒ４’、Ｒ２ＨおよびＲ、ｌは前と同じ意味であ る）である。Ｘ′がヒドロキシメチルである場合には、変換はたとえば、塩基の 存在下にスルホニルハロゲニドとの反応、ついでアンモニアおよび、必要に応じ て、さらに適当に置換されたアミノ基たとえばフタルイミドを与える試薬との反 応によって行われる。Ｘ′がＲ４’　０ＣＨ２−である場合には、Ｒ４′をたと えば酸触媒加水素分解によって除去する。生成したヒドロキシメチル基をついで 、前述のように、窒素原子を含有する基に変換する。Ｘ′がＣＲ５’Ｒ，’＝Ｃ Ｈ−である場合には、アルキレン基の＝■−をたとえばオゾン化によってアルデ ヒド基に酸化する。アルデヒド基はついで、還元アミノ化によってアミノメチル 基に変換する。

Ｙ’（さらに−ＣＨ２Ｙ）の例はヒドロキシメチル、−ＣＨ２０１？、’、−Ｃ Ｈ＝ＣＲ５’　Ｒ６’　（Ｒ４’、Ｒ５１およびＲ、ｌは前と同じ意味である） である。Ｙ′がヒドロキシメチルである場合には、反応はカルボキシ基（−ＣＯ ＯＨ）への酸化によって行われる。Ｙ′が−ＣＯ２０１？４’である場合には、 Ｒ４１はたとえば酸触媒加水分解によって除去し、Ｒ４Ｌが少なくとも１個のα 位フェニルを含有する場合には、除去は酸触媒加水素分解によって行うことがで きる。生成したヒドロキシメチル基をついで、前述のように変換する。また、そ の基を直接、相当するカルボキシ基（−ＣＯＯｔｌ）へ酸化する。Ｙ′が−ＣＨ ＝ＣＲ５’Ｒ６’である場合には、アルキレン基の＝■−はたとえば、さらに酸 化できる中間体のアルデヒド（たとえばオゾン化による）を介して、カルボキシ 基（−ＣＯＯＨ）に酸化する。

酸化は適当な三級アルコールたとえばｔ−ブタノールの存在下に行い、直接、相 当するエステルを形成することができる。

Ｃ１対称ポリエーテルＸ＋ＣＨｚ（ＯＣ［ＩｚＣ［１ｚ）ｎＯｃＨ２Ｘ＋の非対 称エーテルへの変換 対称エーテルはより短いポリエチレンオキシドエーテルから、連鎖延長たとえば ウィリアムソンのエーテル合成を用いて合成できる。２個の同一な基Ｌ　（Ｌは 前述のように、Ｘ′またはＹ′である）の一方の他の基への変換は、所望の種類 の部分反応、ついで未反応出発原料および二重反応副生成物からの非対称生成物 の分離によって実施できる。

このような変換の例は次の通りである。

ａ）　ＸＩがカルボキシ基である場合には、ジカルボン酸を相当するジ（アシル ハライド）に変換し、ついでこれを不足量のアンモニアと反応させ、続いて残っ た酸ノ１ライド基を加水分解する。生成したアミドカルボン酸を反応混合物から 分離したのち、そのアミド基を選択的にアミノメチル基に還元する。別法として 、分離は、還元工程後に、連続イオン交換分離工程によって行われる。

ｂ）　Ｘ、がアミノメチルである場合には、ジアミノ化合物をアシル化カルボン 酸誘導体たとえばカルボン酸クロリドまたは相当する無水物の不足量と反応させ る。ついで、モノアシル化生成物を出発原料およびジアシル化生成物から分離し たのち、そのアミノメチル基を、たとえば相当するアルデヒドを介してカルボキ シ基へ酸化し、そのアシル基は加水分解で除去する。この方法のとくに有用な変 法は環状無水物との反応である。後者の場合、中間生成物はアミノ酸、出発化合 物はジアミン、副生成物はジカルボン酸であるので、イオン交換分離が容易であ る。

ｃ）　Ｘ、が中等度ないし高度の親油性な、たとえばトリチルオキシメチルまた はアリルオキシメチルである場合には、生成物、出発原料および副生成物の間の 分配係数が有意に異なるので、一方の基の部分除去または変換は液体分配による 分離が容易である。これは、適当な親油基が、親油性基Ｘｌたとえばトリチルで モノ置換されたオリゴエチレングリコールを有する対称ポリエーテルに導入され た場合にも当てはまる。

ｘｌがヒドロキシメチルである場合、反応は、ウィリアムソンのエーテル合成で 、たとえば過剰のハロ酢酸の添加により実施できる。反応後、混合物を適当な低 級アルコール（ｃ＋−ｃｇ）、たとえばイソプロパツールでエステル化する。適 当なアルコールの選択により、反応混合物中の成分の分配係数の差はさらに顕著 になる。これは、出発原料およびジ置換副生成物からの生成物の分離を容易にす る。たとえば、ジエステルは中性溶液で水相から有機溶媒に移るのに対し、モノ エステルは酸性ｐ［Ｉで移る。

比較的揮発性の化合物については、出発原料の大部分は蒸留によって除去される 。たとえば、ジエチレングリコールまたはトリエチレングリコールである。

Ｄ、バイシンメトリックな連鎖の２つの同一フラグメントへの開裂 式 ％式％ （式中、Ｘ′およびＹ′はそれぞれ前の意味と同じである）を有する化合物は、 特殊なケースを提供する。開裂は二重結合の酸化によって行われる。すなわち、 Ａの場合には直接２個の同一のカルボキシ基へ、Ｂの場合には２個の同一なアル デヒド基に、ついで還元アミノ化によりアミノメチル基へ変換される。

出発の、 Ｘ’　ＣＩ’１ｚ−（ＯＣＨｚＣＨ２）　ｎ−０ＣＲ２ｃＨ＝ｃＢｃＨ２０−（ ＣＨｚｃＩＩｚｏ）ｎ−ＣＩＩ２ｘ’　オよび Ｙ’　ＣＨ２−（ＯＣＨ２ＣＨ２）　ｎ−０Ｃ１ｆ１２ＣＩＩ＝ＣＩＩＣ１１１ ０−（Ｃｔ１２Ｃｔｌ　２０）ｎ−ＣＨ２ｙ’は、それぞれ、ウィリアムソンの エーテル合成により、Ｆ１０Ｃ■２ＣＨ＝ＣＨＣ１１，ＯＨを、２当量（１’） Ｘ’　ＣＨｚ−（ＯＣＪＣＬ）ｎ−Ｚ’およびＹ’ＣＨｚ−（ＯＣｆｌｚＣ［１ ｚ）ｎ−Ｚ”（式中、Ｘ′、Ｙ′、Ｚ′は前の意味と同じである）と反応させる ことによって合成するツカ好マシイ。別経路テハ、Ｚ’−ＣＨｚＣＨ＝ＣＨＣＨ ２Ｚ’をそれぞれ、２当量のＸ’　ＣＨｚ−（ＯＣＨｚＣＨ２）ｎ−ＯＨおよび Ｙ’ＣＩＩ、−（ＯＣＨｚＣＨ２）ｎ−ＯＢと反応させる、類似の方法も利用で きる。

たとえば、基−ＣＨ２ｃＨ＝ｃＨｃＨ！−は、基〔式中、Ａは置換されていても よい低級アルキリデン（好ましくはＣ１−Ｃ６）、好ましくはジメチルメチレン である。この場合、基Ａは酸加水分解によって除去される。

ついで、形成した中間の１．２−ジオールをたとえば過ヨード酸で酸化したのち 、生成したアルデヒド基をアミノメチル基またはカルボキシ基にそれ自体公知の 方法で変換する。

本発明は、明細書の一部である添付の請求の範囲によって定義される。

以下の例示は３部に分割されている。すなわち、第１部は、式ＩＶ（ｍ＝１）で 表されるアミノ−ＰＥＧ−カルボン酸の合成を例示する。第２部は、式■で表さ れるヘテロ二官能性試薬および式Ｉの橋部構造を有する接合体の合成を例示し、 第３部には、Ｔ細胞免疫刺激物質（超抗原）ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ Ａ）と腫瘍抗原に対する抗体との接合体について得られた結果をまとめる。

例５および６（第２部）には、免疫グロブリンとペプチドの接合体の合成を例示 する。比較実験では、本発明の橋部をもつことにより、接合体の溶解性が上昇し 、したがって、水性メジウム中のペプチドの利用性を増大させることが明らかに された。比較は、同じペプチドおよび抗体からなるが、本発明のではない短い疎 水性橋部を有する接合体に対して行った。

実験の部、第１部 ８−ヒドロキシ−３，６−シオキサーオクタン酸イソプロピルエステル（１） チップの形状のナトリウム（２３ｇ、ｌ、　Ｑｍｏｌｅ）を１、窒素気相下ジエ チレングリコール（５００＊Ｊ）に少量ずつ添加した。ナトリウムが完全に反応 したのち、混合物を室温に冷却し、ブロモ酢酸（７６ｇ、０．５ｍｏｌｅ）を撹 拌下に加えた。１００℃で１８時間反応させたのち、過剰のジエチレングリコー ルを約４　ｍｇＨｇで留去した。ついで、イソプロピルアルコール（４００ｓ＋ １）　、およびアセチルクロリド（５１ｇ、０、６５ｍｏｌｅ）を加えた。６５ ℃で１８時間撹拌したのち、混合物を室温に冷却し、酢酸ナトリウム（３，５９ ，０，１５ｍｏｌｅ）で中和した。混合物を濾過し、濾液をほぼ蒸発乾固し、つ いで水（２００＋＋ｌ）に溶解した。水相を１．１．１−トリクロロエタン（３ Ｘ　５０厘ｌ）で抽出した。プールした有機相を水（２０ｔｌ）で洗浄した。生 成物はプールした水相からジクロロメタン（５ＬＪ）で抽出し、蒸発させると油 状物（５５９）が得られた。

１１−ヒドロキシ−３，６，９−１−リオキサーウンデカン酸イソプロピルエス テル（２） チップ形状のナトリウム（２３９、ｌ、Ｑｗｏｌ、ｅ）を、窒素気相下トリエチ レングリコール（７０（１＋／）に少量ずつ添加した。ナトリウムが完全に反応 したのち、混合物を室温に冷却し、ブロモ酢酸（７６ｇ、０．５ｍｏｌｅ）を撹 拌下に加えた。１００℃で１８時間反応させたのち、過剰のジエチレングリコー ルを約４　ｍｍＨｇで留去した。ついで、イソプロピルアルコール（４００ｔｌ ）　、およびアセチルクロリド（５１ｇ、０、６５麿ｏｌｅ）を加えた。６５℃ で１８時間撹拌したのち、混合物を室温に冷却し、酢酸ナトリウム（３，５９， ０，１５麿ｏｌｅ）で中和した。混合物を濾過し、濾液をほぼ蒸発乾固し、つい で水（２００ｍｊ＋）に溶解した。水相を１．１．１−）ジクロロエタン（３Ｘ 　５（ｂＡ’）で抽出した。プールした有機相を水（２Ｔｏ／）で洗浄した。生 成物はプールした水相からジクロロメタン（５０ｍＡ’）で抽出し、蒸発させる と油状物が得られた。

’Ｈ−ｎ、ａ＋、　ｒ、　（ＣＤ（Ｊ’３）　；　１．２６（ｄ、６Ｈ）　：　 ３．０７（ｓ、　２Ｂ）　；　３．６〜３、８（ｍ、　１２１）　；　４．１１ （ｓ、　２Ｈ）　；　５．０９（ｍ、　１Ｂ）８−（Ｎ−７タルイミドイル）− ３，６−シオキサーオクタノール（３） ８−クロロ−３，６−シオキサーオクタノール（３６５９，２，２ｍ＋）ｌｅ、 ）ジエチレングリコールおよびＳＯＣ／２から製造）を、ジメチルホルムアミド （４００ｆ）に溶解し、フタルイミドカリウム（３７０ｇ、２．０ｍｏｌｅ）を 撹拌下に加えた。１００℃で１８時間撹拌したのち、ジメチルホルムアミドを減 圧下に留去した。残留物をトルエン（１，５１）に４０〜５０℃で懸濁し、塩化 カリウムを濾去した。生成物を冷却して（−１０℃）結晶化した。母液を濃縮し て結晶化操作を繰り返すと、母液から第二の分画が得られる。

’　Ｈ−ｎ、　ｍ、　ｒ、　（ＣＤＣら）　；　２．９０（ｓ、　ＩＨ）　；　 ３．５１〜３．５８（ｍ、　２０）　：３．６０〜３．６８（ｍ、　６１’ｌ） 　；　３．７３〜３．７８（ｔ、２Ｈ）；　３．８９〜３．９４（ｔ。

２Ｂ）：　７．７０〜７．８９（！ｌ、４Ｈ）１７−（Ｎ−フタルイミドイル） 　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン酸イソプロピルエス テル（４）ジクロロメタン（３０ｍ／）中ピリジン（２，８ｔｌ、３５■ｏｌｅ ）の溶液を、ジクロロメタン中８−（Ｎ−フタルイミドイル）−３，６−シオキ サーオクタノール（３）（８，５９，３６＋ｕ＋ｏｌｅ）およびトリフルオロメ タンスルホン酸無水物（１０，２ｇ、３６ｍｍｏｌｅ）の溶液に、約−５℃で撹 拌しながら滴下した。約３０分後に、有機相を０．５Ｍ塩酸および水で洗浄した 。乾燥しくＮａ２５Ｏ４）、濾過したのち、８−ヒドロキシ−３，６−シオキサ ーオクタン酸イソプロピルエステル（１）（１２ｇ、４８ｍｌ１ｏｌｅ）および Ｎａ２Ｐ０４（６，５ｇ、４６．ｏｌｅ）を加え、混合物を室温で２０時間激し く撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を蒸発させた。残留物を１．１．１−） ジクロロエタンおよび水に分配した。有機相を蒸発させると、油状物（１３ｇ） が得られた。

’１１−ｎ、　ｍ、　ｒ、　（ＣＤＣＩ、）　；δ１．２６（ｄ、　６■）　： 　３．５８〜３．７６（ｍ、　１８Ｈ）　；　３．９０（ｔ、　２■）　；　４ ．１１（ｓ、　２Ｈ）　；　５．０９（鵬、　１ｆｌ）　：　７．７０〜７．８ ９（ａ、　４Ｈ） １７−　（Ｎ−フタルイミドイル）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ −ヘプタデカン酸（５） １７−（Ｎ−フタルイミドイル’）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ −ヘプタデカン酸イソプロピルエステル（４）（１３９）をテトラヒドロフラン （５０，／）および塩酸（濃、５部ｍｌ）に溶解した。室温に１６時時間−たの ち、溶液を水（２００＋＋１）で希釈し、テトラヒドロフランを減圧下に除去し た。水相をトルエン（１×）で洗浄し、ジクロロメタン（２×）で抽出した。乾 燥しくＮａ２５Ｏ４）、有機相を蒸発させると、生成物が油状物（８，５９）の 形で得られた。

’ＩＴ−ｎ、　ｔａ、　ｒ、　（ＣＤＣＡ’３）　；δ３．５７〜３．７６（＋ ｅ、　１８Ｈ）　；　３．９１（ｔ。

２Ｈ）　；　４．１１（ｓ、　２Ｂ）　；　４．８（ｂｒ、　ＩＦ＋）　：　７ ．６５〜７．９０（ｍ、　４Ｈ）１７−アミノ〜３．６．９．１２．１５−ペン タオキサ−ヘプタデカン酸イソプロピルエステル（６） １７−　（Ｎ−フタルイミドイル）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ −ヘプタデカン酸（５）　（８，５９）を、１５０＋＋／のエタノールおよび３ ｔｌのヒドラジンヒトラードに溶解した。

この溶液を室温で１６時間撹拌し、ついで塩酸（１００ｍＡ’、３Ｍ）を加えて ３時間還流した。室温に冷却して濾過したのち、ｐＨを調整しくｐＨ９、Ｎａ０ Ｈ）　、濾液をほぼ蒸発乾固した。水を加えて、再びほぼ蒸発乾固し、ついでｐ Ｈを調整しくｐＨ４、ＭＣＩり　、蒸発乾固した。生成物をイソプロパツール（ １００＋＋Ａ’）およびアセチルクロリド（２ｍｌ＞によって室温で一夜処理し たのち、蒸発させた。残留物を水中に集め、アルカリ性のｐ［Ｉで（７〜１１） ジクロロメタン中に抽出した。蒸発させると、生成物（３，３ｇ）が得られた。

’Ｈ−ｎ、　ｍ、　ｒ、　（ＣＨ３０Ｄ）　；δ１．２６（ｄ、　６ｔｌ）　； 　３．１７（ｔ、　２＋１）　；３、６５〜３．８０（ｍ、　１８Ｈ）　：　４ ．１６（ｓ、　２Ｈ）　；　５．０７（ｍ、　Ｌｌｌ）７．７．７−１リフェニ ル−３，６−シオキサーヘブタノールジエチレングリコール（１００１７’、　 ０．９４麿ｏｌｅ）中ピリジン（８冨ｆ　０．１ｍｏｌｅ）の溶液に、トリフェ ニルメチルクロリド（２８ｇ、０．　Ｉｎ＋ｏｌｅ）を加え、混合物を５０℃で ２０時間撹拌した。生成した結晶を濾過し、水で洗浄した。収量３１ｇ、融点１ ０３〜１０５℃ ’　Ｈ−ｎ、　ｒａ、　ｒ、　（ＣＦＩ３０Ｄ）　；　δ２．４２（ｂｒ、　１ ８）：　３．２５（ｔ、　２１１）；３．５５〜３．７２（ｉ、　６１’ｌ）； 　７．２０〜７．３２（０１，９Ｈ）；　７．４４〜７．５３（ａ＋、　６Ｈ） １０、１０．１０−　トリフェニル−３，６，９−）リオキサーデカノール（８ ） トリエチレングリコール（１，０００ｍ／、　７．３ｍｏｌｅ）中ピリジン（５ ４＠１．０．６７ａ＋ｏｌｅ）の溶液に、トリフｚ：／ｌｚメｆ”ルクロリド（ １８７９，０，６７麿ｏｌｅ）を加え、混合物を６０℃で１６時間撹拌した。生 成物を４部に分け、各部（＝　２５０ｇｊりを水（１，０００ｍ１）およびジク ロロメタン（２５０鳳ｌ）と振盪した。有機相をプールし、蒸発させた。収量約 ２５９９１３．１３．１３−　トリフェニル−３，６，９，１２−テトラオキサ −デカノール（９） テトラエチレングリコール（８００ｍＡ’、　４．２ｍｏｌｅ）中ピリジン（３ ８＋＋／、　０．４８麿ｏｌｅ）の溶液に、トリフ　ｚ　二にメチルクロリド（ １２９９，０，４８ａ＋ｏｌｅ）を加え、混合物を８０℃で２０時間撹拌した。

水（８００ｍｊ’）を加え、混合物をジクロロメタン（３Ｘ　２００ｍ１）で抽 出した。プールした有機相を水（１５０ｍｊ’）で洗浄し、蒸発させると、生成 物がシロップとして得られた。生成物には少量のジ置換体および未反応原料が含 まれていた。収量２００ｇ ペンタエチレングリコール（２５ｇ、１２ｍｍｏｌｅ）中ピリジン（３８ｍＣ０ ，４８ｍｏｌｅ）の溶液に、トリフニーにメチルクロリド（１２ｈ、０．４８ｍ ｏｌｅ）を加え、混合物を８０℃で２時間撹拌した。水（１００ｍＡ）を加え、 混合物をジクロロメタン（４０■りで抽出した。水相を、トルエンおよびエタノ ールの存在下に共沸蒸留を使用して蒸発させた。残留物を上記と同様にして、ピ リジン（１ｍｌ＞およびトリフェニルメチルクロリド（２，５９）で処理した。

同じ操作をもう一度適用した。３つの有機相をプールし、蒸発させた。

生成物には少量のジ置換体および未反応原料が含まれていた。収量１０９ ヘキサエチレングリコール（１００ｇ、１２＋ｕ＋ｏｌｅ）中ピリジン（２，８ 謂１．１２ｍｏｌｅ）の溶液に、トリフェニルメチルクロリド（９，７９，３４ ｍｏｌｅ）を加え、混合物を８０℃で３時間撹拌した。水（４００ｍ／）を加え 、混合物をジクロロメタン（１５０ｍＪ）で抽出した。水相を、前例に記載した ように、もう一度処理したが、量および反応条件は本例の場合と同様にした。プ ールした有機相を蒸発させ、水（１００ｍ１）で洗浄し、ジクロロメタン（５０ ｍ１）で抽出した。生成物には少量のジ置換体および未反応原料が含まれていた 。

収量４１．６　ｑ ４−メチルベンゼンスルホン酸７．７．７−）ジフェニル−３，６−シオキサー へブチルエステル（１２）ピリジン（１０諺ｌ）中７．７．７−）ジフェニル− ３，６−シオキサーヘブタノール（７）（３，５９，２６ｍ＋５ｏｌｅ）の溶液 に、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（５９，２６■ｏｌｅ）を加えた。混合物 を室温で３０分間撹拌したのち、水（１ｍｌ＞を加えて、撹拌をさらに１０分間 継続した。ジクロロメタン（１００ｍｌ）を加えて、混合物を塩酸（ＩＭ）でピ リジンが完全に除去されるまで抽出した。ついで有機相を（ＮａＨＣＯｓ、飽和 ）で洗浄した。乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）、蒸発後、生成物をジエチルエーテル／ヘ キサンから結晶化した。収量２ｇ４−メチルベンゼンスルホン酸１０．１０．１ ０−　トリフェニル−３，６，９−ジオキサ−デシルエステル（１３）ピリジン （１（ｂ／）中１０．１０．１０−）リフェニル−３，６，９−トリオキサ−デ カノール（８）（４，８ｇ、１２１ＩＩｌｏｌｅ）の溶液に、ｐ−トルエンスル ホニルクロリド（５ｇ、２６ａ＋ｍｏｌｅ）を加えた。混合物を室温で１時間撹 拌したのち、水（１ｍＡ’）を加えて、撹拌をさらに１０分間継続した。混合物 をジクロロメタン（５０諺ｌ）で希釈し、１Ｍ塩酸（２Ｘ　１００ｍ１り、水（ ５０ｓ＋７）およびＮａＨＣＯ３（飽和、５０ｄ）で洗浄した。有機相を蒸発さ せ、生成物をシリカゲル上（トルエン：酢酸エチル、９：１）で精製したのち、 生成物をジクロロメタン／エーテルから結晶化した。収量４．２９’Ｈ−ｎ、ｍ 、ｒ、　（ＣＤ（Ｊｓ）；　δ２．２０（ｓ、　３１１）；　３．２４（ｍ、　 ２Ｂ）：３．６０〜３．８０（ｍ、８Ｈ）；　４．２０（ｏｒ、２Ｈ）；　７． ２０〜７．９０（ｍ。

１９Ｈ） ４−メチルベンゼンスルホン酸８−（Ｎ−フタリミドイル）−３，６−シオキサ ーオクチルエステル（１４）ピリジン３０肩ｌに８−（Ｎ−フタリミドイル）− ３，６−シオキサーオクタノール（３）（８２，２ｇ、Ｑ、　３ｍｏｌｅ）を溶 解し、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（５６，９９，０，釦ｏｌｅ）を１時間 を要し、０℃で撹拌しながら加えた。混合物をついで、１０℃で１６時間撹拌し た。固体ケーキが生成し、これに氷（０，５Ａｇ）を塩酸（濃、２００００諺ｌ 混合して加え、混合物を５０℃で４時間撹拌したのち、酢酸エチル（２００ｇ／ ）を加えた。完全な反応混合物を濾過すると、生成物が固体の形で得られた。収 量９７９ ’［１−ｎ、ｔｒ、　（ＣＤＣＡ！ｓ）：　δ２．４４（ｓ、　３Ｂ）；　３． ５２〜３．７３（ｍ。

８Ｂ）　：　３．８７（ｔ、　２Ｂ）；　４．０９（ｑ、　２Ｈ）：　７．３１ 〜７．８６（ｍ、　８Ｈ）１７−（Ｎ−フタリミドイル）　−３，６，９，１２ ，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカノール（１５） ジメチルホルムアミド（１５＠ｊ’）に溶解した１０．１０．１０−トリフェニ ル−３，６，９−トリオキサ−デカノール（８）（０，７８９，２ｍｍｏｌｅ） を水素化ナトリウム（８０％、０．２４９．８ｍｍｏｌｅ。

２Ｘヘキサンで洗浄）に滴下した。混合物を３０分間３０℃に加温後、４−メチ ルベンゼンスルホン酸８−（Ｎ−フタリミドイル）−３，６−シオキサーオクチ ルエステル（１４）（０，８７ｇ、２ＩｎｌＩＩｏｌｅ）を固体で加えた。−夜 室温で撹拌したのち、無水酢酸（５ｍｌ）を加え、混合物をさらに３時間室温に 放置した。水（２ｍｌ）を加え、３０分後にトルエン（２５肩りとＮａ肛０３溶 液（５０ｍ１）に分配した。トルエン相を蒸発させ、含まれていた約１ｇの物質 をジクロロメタン中に集め、Ｑ、　２ｍｌのトリフルオロ酢酸および約０．２ｍ ｌの水で、室温において１０分間処理した。ついで反応混合物を蒸発させた。生 成物をシリカゲルカラム上（クロロホルム：メタノール、１９：１）で精製した 。収量約０．７ｇ’Ｂ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＣＤＣ／３）；　δ３．５９〜３．６ ７（ｍ、　２０Ｈ）；　３．７１〜３．７５（ｉ、　４Ｈ）　；　３．９０（ｔ 、　２■）；　７．７１〜７．８６（ｓ、　４Ｈ）１７−（Ｎ−フタリミドイル ）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカン酸ｔｅｒｔ−ブチ ルエステル（１６）ジクロロメタン（５１）中１７−　（Ｎ−フタリミドイル） −３，６，９，１２，１５−ペンタオキサ−ヘプタデカノール（１５）（１９０ ｍ＋９）の溶液に、ピリジニウムジクロメート（０，６４ｇ、４ｅｑ）、無水酢 酸（１ｍｌ＝　２０ｅｑ）およびｔ−ブチルアルコール（１ｍｌ、　３０ｅｑ） をこの順序に加えた。反応混合物を３時間室温で撹拌したのち、酢酸エチル（２ ５ｍ１）を加えた。１０分後、液体をシリカゲルを含有するカラム（５（４Ｘ　 ５　ｃ＋＋）に通し、カラムをさらに酢酸エチルで溶出した。蒸発させたのち、 残留物をシリカゲルカラム上（クロロホルム：メタノール、１９：１）で精製し た。収量約０、１　ｑ ’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＣＤＣ／３）；　δ１．４７（ｓ、　９Ｈ）；　３．５ ｇ〜３．７６（ｍ。

１８Ｈ）　：　３．９０（ｔ、２Ｈ）；　４．０２（ｓ、２■）；　７．７０〜 ７．８７（ｍ、４Ｈ）１４．１４．１４−トリフェニル−６４，７，１０，１３ −テトラオキサ−テトラデセン（１７） アリルプロミド（２ｍＡ’、１．１ｅｑ）およびｔｏ、　１０．１０−トリフェ ニル−３，６，９−）リオキサーデカノール（８）（８，５９，２２＋ｍｏｌｅ ）をジメチルホルムアミド（２５ｔｌりに溶解し、０℃で３０分を要し、水素化 ナトリウム（１ｇ）中に滴下した。３時間室温で撹拌したのち、メタノールを溶 液が透明になるまで加えた。トルエン（１００ｇ／）および水（１０Ｔｏ／）を 加え、反応混合物を抽出した。トルエン相を飽和食塩溶液で洗浄し、ついで乾燥 した（Ｎａ２ＳＯ４）。精製物は、溶媒の蒸発後、シロップとして得られた（ｌ ｈ）。

３．６．９−トリオキサ−１１−ドデセン−１−オール（１８）１４、１４．１ ４−トリフェニル−６４，７，１０，１３−テトラオキサ−テトラデセン（１７ ）（５，５９，１３ｍｍｏｌｅ）をジクロロメタン（５０翼ｌ）に溶解したのち 、トリフルオロ酢酸（１，２ｔｌ。

１５、６ｍｍｏｌｅ）および水（ＩＩＮ、５５ｓａ＋ｏｌｅ）を加え、反応混合 物を１０分間激しく撹拌した。生成物（１，５９）が、シリカゲルカラム上で精 製後に得られたＣＣＨＣｌ３：　ＭｅＯＨ１９：１）。

３、６．９．１２．１５．１８−へキサオキサ−２０−ヘナイコセンー１−オー ル（１９） ３．６．９−）リオキサー１１−ドデセンー１−オール（１８）（２，０７９， １０，９ｔｌ１ｍｏｌｅ）および４−メチルベンゼンスルホン酸１０．１０．１ ０−　トリフェニル−３，６，９−ジオキサ−デシルエステル（１３）　（５， ９５９，１０，９ｍｍｏｌｅ）をジメチルホルムアミドに溶解し、撹拌下、室温 で１０分を要して、水素化ナトリウムに滴下した。２時間後、ジクロロメタンと 水を加えた。相を分離し、有機相にトリフルオロ酢酸（１ｍＬ　１３ｍｍｏｌｅ ）と水（１ｍｌ、　５５ｓａ＋ｏｌｅ）を加えた。混合物を１時間激しく撹拌し たのち、蒸発乾固した。メタノール（７０％）を加えたのち、トリフェニルメタ ノール（２ｇ）を濾去し、溶媒を蒸発させた。シリカゲルカラム上で精製後（Ｃ ＨＣＩｓ　：　ＭｅＯｔｌ、９７：３）、精製物（２，５９）が得らテトラヒド ロフラン中３．６．９．１２．１５．１８−ヘキサオキサ−２０−へカイコセン −１−オール（１９）（０，３３９、ｌ　ｍｍｏｌｅ）の溶液に、ブロモ酢酸（ ０，１５９，１，１ｍｍｏｌｅ）および水素化ナトリウム（０，１５９，５ｍｍ ｏｌｅ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌したのち、過剰の試薬を分解する ために水を加え、ｐＨを１に調整した（１１（Ｊ）。混合物をジエチルエーテル （５０ｔｌ）で洗浄し、ついでジクロロメタン（２Ｘ５０ｍｌ）で抽出した。乾 燥しくＮａ２５Ｏ４）　、溶媒を蒸発させると、生成物（０，２６ｇ）が得られ た。

メタノール（３０ｍＡ’）中３．６．９．１２．１５．１８．２１−へブタオキ サ−２３−テトラデセン酸（２０）　（０，２１ｖ、Ｑ、５５ｍｍｏｌｅ）の溶 液に、約−６０℃で３０分間オゾンを徐々に通じた。混合物を３０分間放置した のち、溶液に３０分間空気を通じ、ついでメタノール（５０＋１）中に溶解した ジメチルスルフィド（５０μｌ、０．６５ｍｍｏｌｅ）を滴下した。この溶液の 温度を１時間で室温まで上昇させ、ついで、塩化アンモニウム（０，２ｇ）の水 （５ｍＡ’）溶液およびシアノヒドリドホウ酸ナトリウム（０，２９，３，１ｍ ｍｏｌｅ）を加えた。室温に１８時間装いたのち、溶液のｐｔｌを約１に調整し くＨＣｌ）　、溶媒を蒸留して除去した。水酸化ナトリウム（ＩＭ）に溶解し、 ジクロロメタンで抽出し、蒸発させると、油状物（０，２５ｇ）が得られる。純 粋な生成物はアミノ機能のｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル誘導体を調整すること により得られた。

すなわち、０．１７ｇの油状物と水酸化ナトリウム（０，４ｖ）を水（３ｍｌ） に溶解し、ジオキサン（５１１）に溶解した二次酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステル （０，１２ｇ）を加えた。１６時間撹拌したのち、ジオキサンを蒸発させ、水相 をｎ−ヘキサン（２Ｘ　１０冨ｌ）で洗浄し、ｐＨを約４に調整しく　ＨＣＡ’ ）、ついで混合物をジクロロメタン（５Ｘ　５０ｍ１）で抽出した。

乾燥しくＮａ２５Ｏ４）　、溶媒を蒸発させると油状物が得られ、これをシリカ ゲルカラム上で精製した（ＣＢＣｊ’３　：　ＭｅＯｆｌ　：ＡｃＯＨ，４５： 　４　：　１）。収量は０．１５ｇであった。

’　Ｉ’ｌ−ｎ、　Ｉｌ、　ｒ、　（Ｄ２０．５００ｋｌｔｌｚ）　；　δ　１ ．３１（ｓ、　Ｈ）；　３．１４（ｔ。

２８）　；　３．４８（ｔ、　２Ｈ）：　３．５９（＋ｅ、　２４１）：　３． ８４（ｓ、　２Ｈ）水素化ナトリウム（３，８９，８０％、　１３０ｍｍｏｌｅ ）およびブロモ酢酸（７，６９，５５ｍｏｌｅ）をこの順序で、テトラヒドロフ ラン（１５（１＋ｊｌ’）中８−（Ｎ−フタルイミドイル）−３，６−シオキサ ーオクタノール（３）（１０，１ｇ、３５ｓａ＋ｏｌｅ）の溶液に加えた。４時 間室温で撹拌したのち、無水酢酸（４０ｔｌ）を加え、混合物をさらに１８時間 撹拌し、ついで混合物を濾過し、少量の水の存在下に蒸発させた。シリカゲル上 で精製すると（ＣＨＣＩ３：　ＭｅＯＨ１３：２）、生成物が得られた。収量１ ．２ｇ １１−アミノ−３，６，９−トリオキサ−ウンデカン酸メチルエステル（２３） １１−（Ｎ−フタルイミドイル）　−３，６，９−トリオキサ−ランチカン酸（ ２２）（１，２ｇ、３．５Ｂｏｌｅ）のエタノール（２５ａｌｌ）　中溶液＋： 、ヒドラジンヒトラード（０，７麿／、１４ｓａ＋ｏｌｅ）を加え、１８時間室 温で撹拌したのち、塩酸（３，７１１／、濃）と水を加えた。混合物を２時間還 流し、ついでほぼ蒸発乾固したのち、水を加え、ｐｔｌを約９に調整した（Ｎａ ＯＨ）。

蒸発乾固したのち、メタノール（２００ｍＡ’）およびアセチルクロリド（２ｍ ｌ）を加え、室温で６６時間撹拌した。生成したメタノールエステルをシリカゲ ルカラム上で精製した。

’Ｈ−ｎ、ｓ、ｒ、（Ｄ２０）　；δ　３．１７（ｔ、２ｔｌ）；　３．６５〜 ３．８０（ｍ。

１３８）；　４．２０（ｓ、　２Ｈ） ３、６．９．１２．１５．１８．２１．２４．２７−ノナオキサ−２９−トリコ 水素化ナトリウム（５０１９，１，６ｍｍｏｌｅ）を、ジメチルホルムアミド（ Ｌｏｇ／）中３．６．９．１２．１５．１８−へキサオキサ−２０−へナイフセ ン−１−オール（１９）　（０，６ｇ、１．９ｍｍｏｌｅ）および４−メチルベ ンゼンスルホン酸７，７．７−トリフェニル−３，６−シオキサーへブチルエス テル（１２）　（０，９ｇ、１、８ｍｍｏｌｅ）の溶液に加えた。この混合物を 室温で５６時間撹拌し、ついで水（ＩＴｏＪ）とジクロロメタン（１５＋＋４） を加えた。混合物を振盪し、有機相を蒸発させ、シリカゲルカラム上で精製した （ＣＨ（Ｊ’３：　ＭｅＯｆｌ、９：１）。生成物をジクロロメタン（２０ｍ１ ）に溶解し、トリフルオロ酢酸（３滴）と水（５滴）を加え、ついで混合物を４ 時間撹拌し、蒸発させた。残留物をメタノール：水（７０：　３０）で抽出し、 濾液を蒸発させて得られた油状物をテトラヒドロフラン（１０厘Ｉりに溶解し、 これに水素化ナトリウム（約５ｅｑ）およびブロモ酢酸（約２　ｅｑ）を加え、 混合物を室温で１６時間撹拌した。水を加えて過剰の水素化ナトリウムを分解し 、混合物を蒸発させ、ついでシリカゲルカラム上で精製した（ＣＨＣＡ’、　： 　ＭｅＯＨ１３：１）。収量１．１４’ｆｌ−ｎ、ｍ、ｒ、　（ＣＤＣＡ’３） 　；δ２．８９（ｓ、　２Ｈ）；　２．９７（ｓ、　２Ｈ）、３．５０〜３．７ ８（Ｉｌｌ、　３０Ｈ）；　４．０２（ｄ、　２■）；　５．２０（ｍ、　２１ １）、５．９１３、６．９．１２．１５．１８．２１．２４．２７−ノナオキサ −２９−トリコンチン酸（２４）　（０，１１９，０，２３＋＊ｍｏｌｅ）のメ タノール（２５ｍｌ）中の溶液に、約７０℃で３０分間オゾンを徐々に通じた。

３０分間後に、溶液に３０分間空気を通じ、ついでジメチルスルフィド（５０μ Ｌ　Ｏ１６５ｍｍｏｌｅ）を加えた。この溶液の温度を１時間で室温まで上昇さ せ、ついで、塩化アンモニウム（０，１９，０，２３ｍｍｏｌｅ）の水（５ｍｌ ＞溶液およびシアノヒドリドホウ酸ナトリウム（０，１９，１，６ｍ＋＊ｏｌｅ ）を加えた。室温に１６時間装いたのち、溶液のｐＨを約１に調整しく　ＨＣｊ ｌ’）、溶媒を蒸留させた。乾燥した物質をジクロロメタンで抽出し、ついでこ れを蒸発させた。残留物は油状物（０，１ｇ）であった。純粋な生成物はアミノ 機能のｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル誘導体を調製することにより得られた。す なわち、油状物と水酸化ナトリウム（０，４ｇ）を水（３ｍｌ）に溶解し、ジオ キサン（５ａｉ！＞に溶解した二次酸ジｔｅｒｔ−ブチルエステル（０，１６ｇ ）を加えた。１６時間撹拌したのち、ジオキサンを蒸発させ、水相をｎ−ヘキサ ン（２Ｘ１０諺りで洗浄し、ｐＨを約４に調整しく　ＩＩ（Ｊ）、生成物をジク ロロメタンで抽出した。

合成されたアミノ−ＰＥＧ−カルボン酸の式％式％ 二官能性試薬およびカップリング生成物の製造構造式は別紙に示す。

例１ １７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデ カン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの製造 １７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸イソプロ ピルエステル（実験の部、第１部参照）（１，１９，３，２ｍｍｏｌｅ）を、３ ｍｇの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液に溶解し、室温に３０分間放置した。１．５ｍ ｇの６Ｍ塩酸を加え、混合物を蒸発乾固した。残留物をジクロロメタンに取り、 濾過し、溶媒を蒸発させると１７−アミノ−３、６，９，１２，１５−ペンタオ キサヘプタデカン酸５４５ｗｑが得られた。この化合物４６０重９　（１，３９ ｍｍｏｌｅ）を１０ｍ１のホウ酸塩緩衝液ｐ■８．４に溶解した。この溶液に窒 素ガスを通じて空気を除去した。５ｍｇのジオキサン中４３２１（１，５２ｍｍ ｏｌｅ）のＮ−スクシンイミジル２−ヨードアセテートの溶液を１分間を要して 滴下し、この間５ＭＮａ０Ｂを加えてｐｎを８．４に保持した。反応溶液を１５ 分間、窒素ガスを通じながら撹拌した。薄相クロマトグラフィー（溶出液：ＣＢ 、（Ｊ、−ＭｅＯＨ６０：　３５）によれば、反応はほぼ数分で完結した。１５ 分後に、反応溶液のｐＨを３に調整し、溶液を凍結し、乾燥した。反応混合物を 逆相カラムＰＥＰ−ＲＰＣ３０／２６　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ　ＡＢ）上、０〜１３％のアセトニトリル勾配を０．１％トリフルオロ酢 酸とともに用いて分離し、ついで１３％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡでイソ クラティック分離を行い分画した。所望のピークからのフラクションをプールし 、凍結乾燥すると、１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペ ンタオキサヘプタデカン酸（Ａ）３５１ｍｇが得られた。収率ニア６％。

生成物の構造はそのＮＭＲスペクトルによって確立された。’ＩＩ　ＮＩＩＲス ペクトル（０２０）をδ値で示す。

ヒドロキシスクシンイミド（４，５＋＋ｖ、３９μ５ｏｌｅ）を反３、６．９． １２．１５−ペンタオキサヘプタデカン酸（Ａ　）（１８，３鳳９．３９ＩＩｍ ｏｌｅ）を０．５５ｍ１の乾燥ジオキサンに溶解し、反応バイアルに加えた。バ イアルに窒素ガスを通じて空気を除去したのち、０．１５ｍＺの乾燥ジオキサン 中８．０ｍｇ（３９ｊｍｏｌｅ）のジシクロへキシルカルボジイミドの溶液を反 応バイアルに滴下した。バイアルに窒素ガスを充填し、密閉して、暗所に置いた 。反応溶液を３．５時間撹拌した。生成した沈殿を濾過して除去した。濾液中の 生成物Ｂの生成率は、ＮＩＩＲ分析によって８９％と測定された。

例２ （１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタ デカノイルアミノ）免疫グロブリン（Ｃ）の製造 Ａ、　モノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ２１５免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ａの モノクローナル抗体（Ｍａｂ　Ｃ２１５）（３４属９．０．２１８１１ｍｏｌｅ ）を、０．９％塩化ナトリウムを含有するＯ、　１Ｍホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，１ ，１７，７ｍＡ’に溶解し、この溶液を反応バイアルに加えた。１７−ヨートア セチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカン酸　Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステル（Ｂ）３．６厘９（６，４μｍｏｌｅ）を含む ジオキサン溶液１４６ａｌを緩衝溶液に注入し、２５分間室温で撹拌して反応を 完結させた。反応バイアルはホイルで覆って遮光した。過剰の試薬（Ｂ）を、５ ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５に２６／４０カラム上、溶出液として０．９％塩化ナト リウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５を用いた分画化によって除去した 。所望の生成物Ｃを含む分画をプールした。溶液（２２＋＋１）を、Ｙｉ１３θ フィルターを通してＡｍ１ｃｏｎセルで８１１１に濃縮した。濃度および置換度 は、アミノ酸分析によれば、それぞれ４．７ｍｇ／ｍｌおよび１ｌａｂ　Ｃ２１ ５あたり１８スペーサーであった。

Ｂ、モノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ２４２免疫グロブリンクラスＩｇＧ１のモノ クローナル抗体（）ｊａｂ　Ｃ２４２）を、例２Ａに記載の操作に従い、それぞ れ１５．２０および２２倍モル過剰の１７−ヨードアセチルアミノ−３、６，９ ，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス テル（Ｂ）と反応させ、ノナ、ドデカおよびテトラデカ（１７−ヨードアセチル アミノ）−３、６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）− Ｍａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を得た。

Ｃ，モノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ 免疫グロブリンクラスＩｇＧ２ａのモノクローナル抗体（Ｍａｂ　Ｃ）を、例２ ＾に記載の操作に従い、それぞれ１４および１８倍モル過剰の１７−ヨードアセ チルアミノ−３、６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル（Ｂ）と反応させ、テトラおよびヘプタ（１７−ヨ ードアセチルアミノ）　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノ イルアミノ）−菫ａｂＣ（Ｃ）２−メルカプトプロピオニルアミノ−Ｅｕ３−標 識−ブドウ球菌エンテロトキシンＡ　（ＳＥＡ）の製造Ａ、　Ｅｕ’＋標識５Ｅ Ａ（Ｄ）の製造ＳＥＡ　（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、からの 凍結乾燥製品）（２■９．７２ｎｍｏ１ｅ）を１２２ｕｌのｍ１ｌｌｉ−Ｑ水に 溶解し、１５ｍＡ’のポリプロピレンチューブに加えた。１０ｈＡ’の０．１Ｍ ホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，６、ついで１７８ｔ／のｍ１１１ｉ−Ｑ中２１６０ｒｖ ｏｌｅのＥｕ”−キレート試薬（Ｐｈａｒ＋＊ａｃｉａ　Ｗａｌｌａｃ　Ｏｙ） を加えた。室温に一装置くと反応は完結した。反応溶液を５ｅｐｈａｄｅｘＧ２ ５ＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒ＋ａａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ）上、 溶出液として０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ８，０を用いた分画化によって除去し た。所望の生成物りを含む分画をプールした。

溶液（３ｍｌ）を、ＹＭ５フィルターを通してＡ■１ｃｏｎセルで容量Ｑ、　８ ＋１に濃縮した。濃度はアミノ酸分析によれば、１、７１１９／　ｍｌであった 。置換度はＥｕ（Ｊ３標準溶液と比較して、ＳＥＡあたりＱ、　３Ｅｕ”″と測 定された。

８１．３−（２−ピリジルジチオ）プロピルアミノＥｕ”標識ＳＥ＾（Ｅ）およ び３−メルカプトプロピオニルアミノＥｕ”＋標識ＳＥＡ（Ｆ）の製造 ０、７５１１／の０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ８，０中Ｅｕ”″−３ＥＡ（１， ２４Ｍ９．４４．８ｎｍｏｌｅ）を、１５ｇ／のポリプロピレンチューブに加え た。１ｍｌのエタノール中１．６ｍｅの３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオ ン酸Ｎ−スクシンイミジルエステルの溶液３５μｌをチューブに加え、反応溶液 を室温で３０分間撹拌した。得られた生成物Ｅは単離しないでそのまま、生成物 Ｆに還元した。

上記反応溶液に、２０μｌの０．２Ｍ　Ｅｕ”−クエン酸溶液および５０μｌの ２Ｍ酢酸を加えて、ｐＨを５に調整した。ついで、０．１ｗ５ｌの０．９％基塩 化ナトリウム中、１１のジチオスレイトール（Ｍｅｒｃｋ）を加え、反応溶液を 室温で２０分間撹拌した。ついで５０μｌの０．９％塩化ナトリウム溶液を加え て全容を１ｍｌに調整した。反応溶液（１ｍｌ＞を５ｅｐｈａｄｅｘＧ２５　Ｎ ＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ）上に置 き、所望の生成物Ｆを、０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐ ）１７．５．１．５ｍＡ’を添加して溶出した。溶出した生成物Ｆを１５＋＋４ のポリプロピレンチューブに集め、ジスルフィド化合物への再酸化を避けるため 、生成物Ｇの合成に直ちに使用した。

Ｂ２．２−メルカプトプロピオニルアミノ−ブドウ球菌エンテロトキシンＡ　（ ＳＥＡ）（Ｆ２）の製造ネイティブなＳＥＡ（Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　Ｉｎｃからの凍結乾燥製品）または組換え操作で製造されたＳＥＡ　（ｒＳ ＥＡ）に例３Ｂ１に記載の操作により、２倍モル過剰の３−（２−ピリジルジチ オ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステルを反応させた。

置換度は、Ｃａｒｌｓｓｏｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１７３（１９７ｇ）７２ ３−７３７〕のＵＶ−分析で測定し、ＳＥＡあたり１．９メルカプトプロピオニ ル基であった。

胆 ５ＥＡ−モノクローナル抗体接合体（ＧｌまたはＧ２）の製造Ａ、　Ｅｕ３＋− ３ＥＡと１ｌａｂ　Ｃ２１５の接合体（Ｇ１）例３Ｂに記載の４−メルカプトプ ロピオニルアミノＥｕ”標識ＳＥ＾（Ｆ）の溶液に、０．９％塩化ナトリウム含 有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７、５中オクタデカ（１７−ヨートアセチルアミ ノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）　１ｌａ ｂ　Ｃ２１Ｃ２１５（Ｃ）（４の溶液１．２ｍｌを加えた。室温に一夜放置する と反応は完結した。ついで、水１ｍｌ中２０μｌのメルカプトエタノールの溶液 ５μＪ（１，２μｍｏｌｅ）を添加して、未反応ヨードアルキル基を遮断した。

反応溶液を室温に４時間放置したのち、濾過した。次に、濾液を５ｕｐｅｒｏｓ ｅ　１２ＨＲ１６１５０カラム（Ｐｈａｒａ＋ａｃｉａ　ＢｉｏｓｙｓｔｅＩＩ ｌｓＡＢ）上、溶出液として０．９％塩化ナトリウム含有０．００２Ｍリン酸塩 緩衝液ｐＨ７，５を用いて分画化した。所望の生成物Ｇを含む分画をプールし、 分析した。アミノ酸分析による蛋白質含量は０．２２ｘｇ／　ｍｌであった。置 換度は、Ｅｕ”の定量により、ＩｇＧあたりＳＥＡ１個と測定された。この生成 物については、免疫刺激作用および抗体結合能も検討した。

化合物Ｃに対する化合物Ｆの量を増加させると、置換度の上昇が認められた。

Ｂ、ｒＳＥＡと１ｌａｂ　Ｃ２１５の接合体（Ｇ２）オクタデカ（１７−ヨート アセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミ ノ）　Ｍａｂ　Ｃ２１５（Ｃ）を、例４＾に記載の操作に従い、１．８倍モル過 剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と反応させた。

接合体の組成を、Ｐｈａｓｔ−ＧｅｌＴ１′勾配４〜１５上ドデシル硫酸ナトリ ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、結合をＰｈ ａｓｔ　ＩＭＡＧＥ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓ−ｔｅｇｓ　ＡＢ） で走査した。得られた接合体の組成は、３個のＳＥＡをもツＭａｂ　Ｃ２１５が ６％、２個のＳＥＡをもつものが１５％、１個のＳＥＡをもつものが２８％、非 置換Ｍａｂ　Ｃ２１５が５１％であった。

別の実験で、２．７倍過剰のＦ２を使用した場合は、得られた接合体の組成は、 ３個のＳＥＡをもつＭａｂ　Ｃ２１５が１５％、２個のＳＥＡをもつものが２５ ％、１個のＳＥＡをもつものが３４％、非置換Ｍａｂ　Ｃ２１５が２６％であっ た。

Ｃ，ｒＳＥＡとＭａｂ　Ｃ２４２の接合体Ｃ１，テトラデカ（１７−ヨードアセ チルアミノー３、６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ） Ｍａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を、例４＾に記載の操作に従い、３．２倍モル過剰の２ −メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と反応させた。接合体の組 成を例４Ｂの記載と同様に分析したところ、４個のＳＥＡをもつＭａｂ　Ｃ２４ ２が４％、３個のＳＥＡをもつものが１２％、２個のＳＥＡをもつものが２８％ 、１個のＳＥＡをもつものが３６％、非置換１１ａｂ　Ｃ２４２が２０％であっ た。

同じ反応を行ったが、カラムで分画化する前に生成物を０．２Ｍヒドロキシルア ミンで４時間処理して、ＭａｂＣ２４２とスペーサー、およびＳＥＡとメルカプ トプロピオニル基の間の不安定な結合を除去した。生成した接合体の組成は、４ 個のＳＥＡをもツＭａｂ　Ｃ２４２が１％、３個のＳＥＡをもつものが１２％、 ２個のＳＥＡをもつものが２７％、１個のＳＥＡをもつものが３６％、非置換ｊ ａｂ　Ｃ２１５が２４％であった。

Ｃ２，ドデカ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタ オキサヘプタデカノイルアミノ）　ｌ［ａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を例４Ａに記載の 操作に従い、３倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ ２）と反応させた。得られた接合体組成は、３個のＳＥＡをもつＭａｂ　Ｃ２４ ２が６％、２個のＳＥＡをもつものが２６％、１個のＳＥＡをもつものが３６％ 、非置換Ｍａｂ　Ｃ２４２が３１％であった。

Ｃ３，ノナ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオ キサヘプタデカノイルアミノ）　１ｌａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）を、例４＾に記載の 操作に従い、３倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ ２）と反応させた。得られた接合体の組成は、２個のＳＥＡをもつＭａｂ　Ｃ２ ４２が１３％、１個のＳＥＡをもつものが３９％、非置換のＭａｂ　Ｃ２４２が ４６％であった。

Ｄ、ｒＳＥＡと１ｌａｂ　Ｃの接合体 Ｄ１．ヘプタ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタ オキサヘプタデカノイルアミノ）　Ｍａｂ　Ｃを、例４＾に記載の操作に従い、 ５．４倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と反 応させた。接合体の組成を例４Ｂの記載と同様に分析したところ、４個のＳＥＡ をもつものが１５％、３個のＳＥＡをもつものが２４％、２個のＳＥＡをもつも のが２９％、１個のＳＥＡをもつものが１９％、非置換の１ｌａｂ　Ｃが３％、 ダイマー型が１０％であった。

同じ反応を０．２Ｍヒドロキシルアミンの存在下に行い、Ｍａｂ　Ｃとスペーサ ー、およびＳＥＡとメルカプトプロピオニル基の間の不安定な結合を除去した。

生成した接合体の組成は、３個のＳＥＡをもツＭａｂＣが１１％、２個のＳＥＡ をもつものが２４％、１個のＳＥＡをもつものが３０％、非置換１１ａｂ　Ｃが １８％、ダイマー型が１７％であった。

Ｄ２．　テトラ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペン タオキサヘブタデカノイルアミノ）　Ｍａｂ　Ｃを、例４＾に記載の操作に従い 、５．７倍モル過剰の２−メルカプトプロピオニルアミノ−ｒＳＥＡ（Ｆ２）と 反応させた。得られた接合体の組成は、４個のＳＥＡをもつＭａｂ　Ｃ２が８％ 、３個のＳＥＡをもつものが１８％、２個のＳＥＡをもつものが３０％、１個の ＳＥＡをもつものが２６％、非置換Ｍａｂ　Ｃが５％、ダイマー型が１２％であ った。

例５ ヒトアロ抗原ＨＬＡ−＾２．１から誘導されるペプチド配列１４５〜１６６の、 モノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ２１５のカップリング（Ｈ） １．６ｍＡ’の０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５ に溶解したオクタデカ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５ −ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）−免疫グロブリンＧ２ａ（Ｃ）（５， ４ｕｉ、３４．５ｍｍｏｌｅ）を５ｍｇのＲｅａｃｔｉバイアルに加えた。この 溶液に、窒素ガスを通じて空気を除去したのち、撹拌しながら、ＨＬＡ　−Ａ２ ．１ペプチド配列１４５〜１６５、ＨｉｓＬｙｓＴｒｐＧｌｕＡｌａＨｉｓＶａ ｌＡｌａＧｌｕ−ＧｌｎＬｅｕＡｒｇ＾１ａＴｙｒＬｅｕＧ１ｕＧ１ｙＴｈｒＣ ｙｓＶａｌ（２，５露ｙ、０．８　μｍｏｌｅ）を固体の状態で少量ずつ添加し た。反応溶液のｐＨは７．４であるようにチェックした。バイアルを密閉する前 に、溶液にさらに窒素を通じた。バイアルをホイルで覆い、反応溶液を室温で一 夜撹拌した。未反応ヨードアルキル基を遮断するために、水１ｍｌ中１０μ！の メルカプトエタノールの溶液１０．５μ１（１５μ５ｏｌｅ）を加えて、反応溶 液を４時間撹拌した。反応溶液を濾過し、５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２■Ｒ１０７５ ０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ　ＡＢ）上、溶出液と して０．９％塩化ナトリウム含有２１１１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５を用いて 分画化した。所望の生成物Ｈを含む分画をプールした。蛋白質濃度および変換度 は、アミノ酸分析により、それぞれ１７６μｇ　／　Ｗ　ｌ蛋白質およびＩｇＧ あたり１１ペプチドと測定された。

ペプチドを５薦９添加した同様の合成においては、ＩｇＧあたり１７ペプチドの 生成物が得られた。

例６ ヒトアロ抗原１’ｌＬＡ　−Ａ２．１から誘導されるペプチド配列９９〜１１３ の、モノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ２１５のカップリング（Ｉ） １、６ｍｇの０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５に 溶解したトリデカン（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５− ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）免疫グロブリンＧ２ａ　（４ｍｇ、２５ ．６ｎｍｏｌｅ）を５ｍｇのＲｅａｃｔｉバイアルに加えた。この化合物は、試 薬Ｂの過剰量を減らしたほかは、例２Ａの化合物Ｃと同様に製造した。

溶液に窒素ガスを通じて空気を除去した。ＨＬＡ−＾２．１ペプチド、ＭｅｔＴ ｙｒＧｌｙＣｙｓＡｓｐＶａｌＧｌｙＳｅｒＡｓｐＡｒｇＰｈｅＬｕｅＡｒｇ− ＧｌｙＴｙｒ（４，７ｍｖ、２．１　ａ　ｍｏｌｅ）を０．２ｍｇのアセトニト リルに墾濁し、Ｑ、ｌ＋＋ｊｌ’の０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸 塩緩衝液ｐＨ７，５をを加えて溶解した。この溶液をＲｅａｃｔｉバイアルに滴 下した。反応溶液のｐＨは７．５であるようにチェックした。バイアルを密閉す る前に、溶液にさらに窒素を通じた。バイアルをホイルで覆い、反応溶液を一夜 撹拌した。未反応ヨードアルキル基を遮断するために、水１ｍＡ’中１０μｌの メルカプトエタノールの溶液ｌＯμＩｃ１．４μｍｏｌｅ）を加えた。反応溶液 を４時間撹拌し、濾過し、ついで５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２ＨＲ１０１５０カラム 上、溶出液として０．９％塩化ナトリウム含有２ａｌｌｌＪン酸緩衝液ｐＨ７， ５を用いて分画化した。所望の生成物（Ｉ）を含む分画をプールした。蛋白質濃 度および変換度は、アミノ酸分析により、それぞれ１９６μｇ　／　＊　ｌ蛋白 質およびＩｇＧあたり７ペプチドと測定された。

帆ユ １７−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルアミノ〕−３，６，９，１２ ，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸のＮ−ヒドロキシスフトンイミドエステル （Ｋ）の製造Ａ、１７−　［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルアミノ］ 　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸（Ｊ）の製造 １７−アミノ−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸（６６す 、０．２ｍｍｏｌｅ）を３．５ｍｇのＩＭホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，４に溶解した 。ｐＦＩは８１に低下した。０．８ｍｇのジオキサンに溶解した９−（２−ピリ ジルジチオ）−プロピオン酸スクシンイミジルエステル（６９ｍｇ、０．２２ｍ ｍｏｌｅ）を上記溶液に加えた。反応溶液のｐＨは７．６に低下した。反応は１ ０分間で完結し、これは薄層クロマトグラフィー（溶出液：　ＣＨ２ＣＡ’２− １１ｅＯＨ６０：　３５）で明らかであった。

１０分後に、反応溶液のｐＨを５Ｍ塩酸で４．５に調整し、溶液を凍結乾燥した 。反応混合物を逆相カラムＰＥＰ−ＲＰＣＨＲ１６／　１０　（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ）上、０．１７％のアセトニトリル勾配を０ ．１％ＴＦＡとともに用いて分離し、ついで１７％アセトニトリルと０．１％Ｔ Ｆ＾でイソクラティック分離を行い分画した。所望の化合物Ｊを含むフラクショ ンをプールし凍結乾燥した。分画化を１３回反復した。収量　：　３９翼９ 生成物Ｊの構造はそのＮＩＩＲスペクトルの補助によって確立された。

Ｂ、１７−　［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルアミノ］　−３，６， ９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエ ステル（Ｋ）の製造 ヒドロキシスクシンイミド（１，８１５ｍｇ、１６．３μｍｏｌｅ）を反応バイ アル中に秤量した。１７−　［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルアミ ノ］　−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカン酸（Ｊ　）　（６ ，０＋＋ｇ、１６．４　μａ＋ｏｌｅ）を０、５５真１の乾燥ジオキサンに溶解 し、反応バイアルに添加した。溶液に窒素ガスを通じた。２００ｍＡ’のジオキ サン中、６、８ｇｇ（３２，８μｍｏｌｅ）のジシクロへキシルカルボジイミド の溶液をＲｅａｃｔｉバイアルに加え、反応溶液にさらに窒素ガスを通過させた のち、バイアルを密閉した。反応を２４時時間待させ、生成した沈殿を濾過して 除去した。濾液中のＮＭＲ分析により、反応はほぼ完全に化合物Ｋに進んでいる ことが明らかにされた。

性ｌ ジ（１７−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルアミノ）　−３，６，９ ，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）免疫グロブリンＧｌ（Ｌ ）の製造免疫グロブリンクラスＩｇＧ　ｌのモノクローナル抗体（Ｍａｂ　Ｃ２ ４２）　（６ｇ＋９．８８μ５ｏｌｅ）を、０．９％塩化ナトリウムを含有する ０、１Ｍホウ酸塩緩衝液ｐ［１３，Ｑ、　２．２３ｍ１に溶解、５ｍｇのＲｅａ ｃｔｉバイアルに加えた。この溶液を上記緩衝液０．７７諺ｌで最終濃度２諺９ 蛋白質／ｍｌに希釈した。１７−（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルア ミノ−３，６，９゜１２、１５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロキシス クシンイミドエステル（Ｋ　）（０，２６鳳す、４４７μ５ｏｌｅ）のジオキサ ン１００μ！中溶液をＲｅａｃｔｉバイアル中の溶液に注入した。反応溶液を２ ５分間、室温で撹拌したのち、冷蔵庫中に一夜放置した。この反応溶液を、５ｕ ｏｅｒｄｅｘ　７６ｈｒ　１０／８０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　ＡＢ）上、溶出液として０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン 酸塩緩衝液ｐＨ７，５を用いて分画化した。所望の生成物（Ｌ）を含む分画をプ ールしく７諺ｌ）　、ＹＩＩ３０フィルターを通して＾ｍ１ｃｏｎセルで１、５ ｍｇに濃縮した。温度および置換度は、アミノ酸分析により、それぞれ３．５１ ｍり蛋白質／　ｍ　ｌおよびＩｇＧあたり２スペーサーと測定された。

例９ ２個のモノクローナル抗体分子の生成物（Ｎ）への架橋Ａ、ジ（１７−［３−チ オプロピオニルアミノ］　−３，６，９゜１２、１５−ペンタオキサへブタデカ Ａ、ジ（１７−［３−チオプロピオニルアミノ）　−３，６，９゜１２、１５− ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）−免疫グロブリンＧｌ　（Ｍ）の製造 ０、１ｍｇの０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液１）１１７． ５に溶解したジ（１７−［３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルアミノ〕− ３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）免疫グロブリ ンＧｌ　（Ｌ）　（２，５１＋９．１６ｍｍｏｌを、Ｅ１１ｅｎａ＋ａｎチュー ブに添加した。ｐＨは１Ｍ酢酸で４．７に調整した。ついで、３００μｌの０． ９％基塩化ナトリウム中、　９＋＋ｇのジチオスレイトールの溶液１００μ／（ ２，３１９）を加えた。反応溶液を室温に２５分間放置し、ついで、５ｅｐｈａ ｄｅｘ　ｇ２５　ＮＡＰ　１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ　ＡＢ）上、溶出液としては０．９％塩化ナトリウムおよび２ｍｑＥＤＴＡ を含有する０、１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７、５を用いて脱塩した。生成物Ｍはｌ 、　５ｍｇの容量に溶出し、遊離メルカプト基の再酸化を避けるために、直ちに 生成物（Ｎ）の合成に使用した。

Ｂ、架橋されたモノクローナル抗体（Ｎ）の製造例９Ａに記載の（１７−［３− チオプロピオニルアミノ］−３，６，９，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカ ノイルアミノ）−免疫グロブリンＧｌ（Ｍ）の溶液０．７属！およびトリ（１７ −ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサヘプタデカノ イルアミノ）免疫グロブリンＧｌ　（１，２６ｍｇ）の溶液０．３５ｍ１を、５ ｍｇのＲｅａｃｔｉバイアルに加えた（後者の化合物は、より少ない過剰量の試 薬Ｂとモノクローナル抗体Ｍａｂ　Ｃ２４２を用いて、化合物Ｃと同様に製造し た）。

反応溶液に、窒素ガスを通じて、ついでバイアルを密閉し、ホイルで覆って遮光 し、室温に一夜放置した。未反応ヨードアルキル基を遮断するために、水ｉ＋＋ １中２０μｌのメルカプトエタノールの溶液２．５μｍ０．６μａ＋ｏｌｅ）を 加えた。反応溶液を６時間室温に放置し、ついで、５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２　Ｈ Ｒ１０／３０カラム（Ｐｈａｒｖａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＾Ｂ）上、溶 出液として０．９％塩化ナトリウム含有５ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７、５を用い て分画化した。ダイマー生成物Ｈを含む分画をプールした。

例１０ ［１７−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）　−３，６，９゜１２、１５− ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）　−ｒＳＥＡ（Ｐ）の製造 Ａ、１７−　（３−（２−ピリジルチオ）プロピオニルアミノ）　−３，６，９ ，１２，１５−ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ）−ｒＳＥＡ（０）の製造 １７−［３−（２−ピリジルチオ）プロピオニルアミノ〕−３，６，９，１２， １５−ペンタオキサヘプタデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｋ 　）（０，５３１＋９．８９６ｎｉｏｌｅ）のジオキサン４８μｌの溶液を、ｌ ｌｌ１の０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５中３． ６７ｍｇ（１２８ｎｍｏｌｅ）のｒＳＥＡ溶液に注入した。反応は、室温３０分 で完結した。

置換度の分析のために、１００μ！を採取した。残部は、生成物Ｐに還元するま で、凍結保存した。

置換度は、反応溶液１００μＪを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０　ＮＩＣＫカラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＡＢ）で脱塩し、溶出液をＣａｒ ｌｓｓｏｎら　（Ｂｉｏｃｈｅａ＋、Ｊ、　、１７５（１９７６）　７２３〜７ ３７］のＵＶ−スペクトロスコピーで分析して測定した。ｒＳＥＡに２．７のス ペーサーがカップリングした。

Ｂ、［１７−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）−３゜６、９．１２．１５ −ペンタオキサヘプタデカノイルアミノ〕−ｒＳＥＡＣＰ＞の製造 生成物Ｏを含む反応溶液（０，９ｍ／）のｐＨを２ＨＣ１で４．４に調整し、０ ．９％塩化ナトリウム７．５μｌに溶解したジチオスレイトール２．９ｎｇを加 えた。還元は３０分で完結した。

反応溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５　ＮＡＰ　１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａＢｌｏｓｙｓｔｅｍｅ　ＡＢ）に加え、１．５＋＋４の０．９％塩化ナトリウ ム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７，５で溶出し、直ちに例１１の生成物Ｑの 合成に使用した。

利 ダブルスペーサ−を有するＳＥ＾−モノクローナル抗体接合体Ｑの製造 ドデカ（１７−ヨートアセチルアミノー３．６．９．１２．１５−ペンタオキサ ヘプタデカノイルアミノ）　Ｍａｂ　Ｃ２４２（Ｃ）　（４，２舅９．２７ｒｖ ｏｌｅ、　１０ｍ１の０．９％塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ ７，５中）を、（１７−（３−メルカプトプロピオニルアミノ）　−３，６，９ ，１２，１５−ペンタオキサへブタデカノイルアミノ）−ｒＳＥＡ（Ｐ）の（１ ，１７ｍｇ、４２ｒ＋ｍｏｌｅ、　１ｍｌの上記緩衝液中）と、４３時間、窒素 下、暗所で反応させた。ついで、１．１４μｍｏｌｅのメルカプトエタノールを 加えた。さらに１時間後に、反応溶液を５ｕｐｅｒｄｅｘ　２００　ＨＲ１６／ ２５カラムで分画した。生成物を、０．９％塩化ナトリウム含有２ｍＭリン酸塩 緩衝液ｐＨ７，５で溶出した。所望の生成物Ｑを含む分画をプールし、例４Ｂの 記載と同様にして分析した。接合体の組成は２個のＳＥ＾をもつＭａｂ　Ｃ２４ ２が９％、１個のＳＥ＾をもつものが２５％、非置換Ｍａｂ　Ｃ２４２が６６％ であった。

ｎ＝４．７．９．１２．１４．１８ ：ｌ：　−−４、！ Σ　ｚ　Ｏ−〇 実験の部、第２部 以下の実験に使用した細菌トキシンは、Ｔｏｘｉｎ　Ｔｅｃｈ−ｎｏｌｏｇｉｅ ｓ　（ＷＩ　；　ＵＳＡ）から入手したか、または大腸菌から組換え蛋白質とし て製造したブドウ球菌エンテロトキシンＡ　（ＳＥＡ）である。

抗体は、Ｃ２１５、Ｃ２４２およびｒｈＹ−ｉ、　２虐＾ｂとした。Ｃ２１５は ヒト結腸癌細胞系に対するＩｇＧ２ａ　■Ａｂであり、数種のヒト結腸細胞系の ３４ｋＤ蛋白抗原と反応する。これらのｍＡｂについての文献は先に示した。接 合体は、第１部に記載したようにして製造した。

優先日前には、Ｅｕ”標識ＳＥ＾−Ｃ２１５■＾ｂ接合体についてのみ検討が行 われた。優先口の年に、結果は非標識ＳＥＡ　−Ｃ２１５、ＳＥＡ−Ｃ２４２お よびＳＥＡ　−Ｔｈｙ−１，２ｖｒ＾ｂ接合体について確認された。今回導入さ れた結果は非接合体に関するものである。

ＭＩＩＣクラス■を欠くかＭＨＣクラス■は少量、検出不能量しか発現しない結 腸癌細胞に対する５ＥＡ−Ｃ２１５ｍ＾ｂ接合体ならびに非接合ＳＥ＾およびＣ ２１５ｍＡｂにより仲介される細胞障害作用の測定には、エフェクター細胞とし て各種ヒトＳＥＡで増強されたＴ細胞系を、標的細胞として結腸癌細胞およびＭ ＨＣクラスＩＩ　”Ｒａｊｉ細胞パネルを採用した。

結腸癌細胞系、Ｃｏ１ｏ２０５．５Ｗ６２０およびＷｉＤｒは■Ｌ＾−Ｄｌｌｌ 。

ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱに対する朧Ａｂでの染色ならびにＦＡＣ３分析 によって明らかなように、すべて蓋■Ｃクラス■の発現を欠いていた。ＳＥＡ増 強Ｔ細胞系は、組換えＩＬ−２（２０単位／ｍｌ）の存在下にＳＥＡでプレコー トした、マイトマイシンＣ処置ＭＦＩＣクラスＩＩ”ＢＳＭｌノンパ腫細胞によ る毎週の再刺激によって、末梢血から確立された。これらのＴ細胞系はＳＥＡで コートされたＲａｊｉまたはＢＳＭ細胞に対して強力な細胞障害作用を示したが 、コートされていない細胞、またはブドウ球菌エンテロトキシンＢ　（ＳＥＢ） でコートされた細胞には障害性を示さなかった。このＳＥＡによって誘導される 殺滅は、遮断ＨＬＡ−ＤＲ抗体、ＭＨＣクラスＩＩ−Ｒａｊｉ変異細胞およびＨ ＬＡ−ＤＲ）ランスフエクトし一細胞の使用により明らかなように、ＳＥＡと標 的細胞上のＭＩＩＣクラス■の相互作用に依存する（Ｄｏｈｌｓｔｅｎら、Ｉｍ ｍｕｎｏ−１ｏｇｙ　７１（１９９０）９６−１００）　、これらのＴ細胞系は 、Ｃ２ｌ５−ＳＥ＾接合体によって活性化されて、Ｃ２１５”ＭＩＩＣクラス■ −結腸癌細胞を殺滅した。これに反し、非接合ＳＥＡおよびＣ２１５ａ＋Ａｂは Ｃ２１５”ＭｔｌＣクラス■−結腸癌細胞を殺滅するＴ細胞はきわめてわずかし か誘導できなかった。ブドウ球菌エンテロトキシン抗体接合体依存性の細胞仲介 細胞障害性は、Ｃ２１５＋腫瘍細胞へのＳＥＡ−Ｃ２１５−＾ｂ接合体の結合に 依存した。この結合の特異性は、過剰の非接合Ｃ２１５ｍＡｂが結腸癌細胞の溶 解を阻害し、この作用は無関係なＣ２４２およびｖ６／３２　ｍＡｂにはない事 実によって明らかであった。ＣＤ４＋およびＣＤ８″″Ｔ細胞はＳＥＡ　−Ｃ２ １５処ｆｆ１ｃ２１５＋結腸癌細胞の殺減作用を示したが、ＳＥＡ処置細胞は溶 解しなかった。ＭＨＣクラス■−腫瘍細胞に結合したＳＥＡ　−Ｃ２１５ｍＡｂ 接合体とＴ細胞の相互作用には、ＩＩＨＣクラス■４細胞のＳＥ＾誘導殺減作用 について以前に示されているのと同様、特異的ＶβＴＣＲ配列が関与しているよ うに思われる。

これは、Ｃ２１５−ＳＥＡ接合体との、自己由来ＳＥＡ特異的Ｔ細胞系ではなり 、ＳＥ＾特異的Ｔ細胞の相互作用によって指示された。Ｃ２４２ｉＡｂおよびＴ ｈｙ−１，２ｍＡｂ接合体は０２１５ｍＡｂ接合体と同様の活性を示す。

クロミウム標識および標的細胞のＳＥＡとのインキュベーション ０．７５Ｘ１０６個の標的細胞と、■５０μＣｉのＳ＋クロミウム（＾ｍｅｒｓ ｈａｓ　Ｃｏｒｐ、、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｅｉｇｈｔ、Ｅｎｇｌａｎｄ）を 、１００μｌの容量で、３７℃において４５分間インキュベートした。細胞は、 ２．８％（ｖ／ｖ）７．５％ＮａＨＣＯ３，１％ピルビン酸ナトリウム、２％２ ００ＩＩＭＬ−グルタミン、１％　ＩＭＨｅｐｅｓ、　１％　１０　ｍ　ｑ　／ 　ｍ　ｌ　ゲンタマイシンおよびｌＯ％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、　Ｇｉｂｃｏ、 　Ｐａ１ｓｌｅｙ、　ＧＥＲ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ 、　Ｐａ１ｓｌｅｙ、　ＧＥＲ）を含む完全培地中に保持し、た。インキュベー ション後、細胞をＦＣＳを含まない完全培地で１回洗浄し、３７℃で６０分間イ ンキュベートし、洗浄し、ｌＯ％ＦＣ３含有完全培地に再懸濁した。Ｕ字底９６ ウエルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂ−ｒｉｄｇｅ、ＵＳ Ａ）の各ウェルに５Ｘ１０３の標的細胞を添加した。

細胞障害性のアッセイ エフェクター細胞を、様々なエフェクター／標的細胞比で、ウェルに加えた。各 ウェルの最終容量は２ｏｏＩ１１とした。各試験は３回行った。プレートを３７ ℃で４時間インキュベートしたのち、放出したクロミウムを収穫した。ｆｉｔ（ ｒの量はガンマ−カウンター（Ｃｏｂｒａ　Ａｕｔｏ−ｇａｍｍａ。

Ｐａｃｋａｒｄ）で測定した。細胞障害性百分率は、式％式％） で算出した。式中、Ｘは試験サンプルについて得られたクロミウム放出（ｃｐｌ ｌ）であり、Ｍは培地とインキュベートした標的細胞のクロミウムの自然放出で あり、Ｔは標的細胞を１％ドデシル硫酸ナトリウムとインキュベートして得られ る総りロミウム放出である。

結果 ＳＥＡ　−Ｃ２４２、ＳＥＡ　−Ｃ２１５および５ＥＡ−抗Ｔｈｙ−１，２ｍＡ ｂ接合体は、それぞれそのｍＡｂの関連エピトープを発現する細胞、およびＭＩ ＩＣクラス■“細胞に結合する。一方、非接合ＳＥＡはＭＨＣクラス■“細胞に のみ、結合した。非接合Ｃ２１５、Ｃ２４２およびＴｈｙ−１，２ｍＡｂは、関 連細胞に結合するが、Ｒａｊｉ細胞には結合しない（表１）。

ヒトＴ細胞系は、ＳＥＡ−Ｃ２１５ａ＋Ａｂ接合体の存在下にＭＩＴＣクラスｎ −３Ｗ６２０、Ｃｏ１ｏ２０５およびＷｉＤｒ細胞ヲ溶解シタカ、非接合ＳＥＡ およびＣ２１５ｍＡｂの存在下には溶解しながった（図１）。結腸癌細胞の溶解 は、１０〜１１００ｎ／　ｍｌのＳＥＡ　−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体で認められた 。５Ｗ６２０に対して、ＳＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体は、様々なエフェクター 細胞対標的細胞比で、高レベルの溶解がみられた（図１）。これに反し、非接合 ＳＥＡまたはＣ２１５ｍＡｂは、試験したすべてのエフェクター細胞対標的細胞 比で、３１６２０に対して細胞障害性はまった（示さなかった。これはＭＩＩＣ クラスＩＩ　−Ｃｏｌｏ２０５細胞の溶解能は接合体に限定され、非接合ＳＥＡ およびＣ２１５ｍＡｂでは誘導できないことを示す。ＳＥＡおよびＳＥＡ　−Ｃ ２１５ｍＡｂ接合体はＭＨＣクラスＩＩ　”Ｒａｊｉ細胞およびインターフェロ ン処置ＭＩＩＣクラスＩＩ　”Ｃｏ１ｏ２０５細胞のＴ細胞による殺滅を誘導す るが、Ｃ２１５ｍＡｂは誘導しなかった（図１）。

５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体が誘導する溶解作用には、標的細胞上のＣ２１５ ｍＡｂ分子への接合体の特異的結合が関与しているかどうかを明らかにするため 、過剰の非結合Ｃ２１５ａ＋ＡｂおよびＣ２４２ｍＡｂにより遮断試験を実施し た。この場合、Ｃ２４２ｍＡｂは結腸癌細胞上の０２１５■Ａｂ関連抗原とは無 関係な抗原に結合する。Ｃ２１５ｍＡｂの添加は細胞障害性を強力に遮断したが 、Ｃ２４２ｍＡｂはまったく影響しなかった。同様に、５ＥＡ−Ｃ２４２ｍＡｂ による溶解は過剰非接合Ｃ２４２ｍＡｂにより特異的に遮断されたが、Ｃ２１５ ｍＡｂによっては遮断されなかった。

ＳＥＡ　−Ｃ２１５■＾ｂ接合体の、麗ＨＣクラスｌｌ５Ｗ６２０結腸癌細胞の Ｔ細胞依存性溶解の誘導能は、ＣＤ４　”、ＣＤ８“Ｔ細胞集団のいずれにおい ても認められた（表２）。ＳＥＡは、これらのＴ細胞サブセットのいずれをも５ Ｗ６２０細胞の殺滅を仲介するように活性化することはないが、１Ｉｔｌｃクラ ス■“Ｒａｊｉ細胞の溶解は誘導した（表２）。

ＳＥＡ−Ｃ２１５ｉＡｂ接合体は、ＳＥＡ増強Ｔ細胞系により５Ｗ６２０および Ｒａｊｉ細胞の溶解を誘導したが、ＳＥＢ増強Ｔ細胞系によっては溶解を誘導し なかった（図３）。ＳＥＡおよびＳＥＢ系の特異性は、Ｒａｊｉ細胞に曝露した 場合の、ＳＥＡおよびＳＥＢそれぞれに対するそれらの選択的応答によって示さ れる。これは、ＳＥＡ　−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体が、非接合ＳＥＡと同じＶβＴ ＣＲ特異性を維持していることを示している。

図の説明 図１　：５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体は、ＭＨＣクラス■−結腸癌細胞に対し てＣＴＬを指向させる。左上のパネルは、ＳＥＡ　−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体、Ｓ ＥＡ、　Ｃ２１５およびＣ２１５とＳＥＡの混合物（Ｃ２１５＋５ＥＡ）の不存 在下、またはＩＩＩｇ／ＷＩＩ！濃度での存在下、様々なエフェクター細胞対標 的細胞比での、５Ｗ６２０細胞に対するＳＥ＾応答ＣＴＬの作用を示す。他のパ ネルはＣ２１５＋１ＩｔｌＣクラス■−結腸癌細胞系５Ｗ６２０、Ｃｏ１ｏ２０ ５およびｆｉＤｒ％ＭＨＣクラスＩＩ　’Ｃ２１５”インターフェロン処置Ｃｏ １ｏ２０５細胞ならびにＣ２１５−１１ｔｌＣクラス■″″Ｒａｊｉ細胞に対し て、ＳＥＡ応答ＣＴＬを標的化する５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体、およびＳＥ Ａの能力を示す。エフェクター細胞対標的細胞比は３０：１とした。数種の濃度 での非接合Ｃ２１５ｍＡｂの添加は、これらの細胞系に対するＣＴＬの標的化を まったく誘導しなかった。ＨＬＡ−ＤＲ，ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱに対 するｍＡｂを用いた５Ｗ６２０細胞、Ｃｏ１ｏ２０５およびＷｉＤｒ細胞のＦＡ Ｃ３分析では、表面ＭＨＣクラス■発現はまったく検出できなかったが、肛＾− ＤＲ，−ＤＰおよび−ＤＱの豊富な発現がＲａｊｉ細胞に、ＨＬＡ−ＤＲおよび ＤＰの発現がインターフェロン処置Ｃｏ１ｏ２０５細胞に検出された。Ｃｏ１ｏ ２０５細胞は、ＣＴＬアッセイに使用する前に４８時間、１０００単位／ｍｌの 組換えインターフェロン−γで処置した。

図２：ＳＥ＾−Ｃ２１５ＩＩＡｂ接合体およびＳＥＡ−Ｃ２４２ｍＡｂ接合体に よって誘導される結腸癌細胞に対するＣＴＬの標的化は、ｍＡｂの抗原選択性に 依存する。ＳＥＡ−Ｃ２１５−＾ｂ接合体および５ＥＡ−Ｃ２４２ｍＡｂ接合体 （３ｐｇ／１１１）の存在下でのＳＥＡ応答ＣＴＬによるＣｏ１ｏ２０５細胞の 溶解は、それぞれ非接合Ｃ２１５およびＣ２４２ｍＡｂ接合体（３０ｐｇ／　ｍ Ｊ）の添加によって遮断される。非接合ｍＡｂまたは対照培地（−）は接合体の 前１０分に標的細胞に添加した。

図３：ＳＥ＾−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体でコートされた結腸癌細胞の溶解は、ＳＥ Ａ応答ＣＴＬによって仲介されるが、ＳＥＢ応答ＣＴＬによっては仲介されない 。自己ＳＥ＾およびＳＥＢ選択的Ｔ細胞系は、５ＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体、 非接合のＣ２１５ｍＡｂとＳＥＡの混合物（Ｃ２１５＋ＳＥ＾）および非接合の Ｃ２１５ｍＡｂとＳＥＢの混合物（Ｃ２１５＋５ＥＢ）の不存在下（対照）、ま たは１ｘｇ／ＩＩｌ濃度での存在下、エフェクター細胞対標的細胞比１０：１で 、５Ｗ６２０およびＲａｊｉ標的細胞に対して使用した。

図４：ＳＥ＾−Ｃ２４２ｍＡｂ接合体および５ＥＡ−抗−Ｔｈｙ−１，２ｍＡｂ 接合体により、それらの標的細胞（それぞれＣｏ１ｏ２０５腫瘍細胞およびＥＬ −４腫瘍細胞）に対して誘導される細胞障害性。

表　１ ＳＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５ＲａｊｉＰｏｓ Ｃ２１５ｍＡｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５Ｒａｊｉ　Ｎｅｇ ＳＥＡ−Ｃ２４２ｍＡｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５ＲａｊｉＰｏｓ Ｃ２４２ｍＡｂ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｐｏ５Ｒａｊｉ　Ｎｅｇ ＳＥＡ−抗−Ｔｈｙ−１，２ａ＋Ａｂ　ＥＬ〜４　Ｐｏｓ抗−Ｔｈｙ−１，２Ｉ ＩＡｂ　ＥＬ−４Ｐｏ５ＳＥＡ　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｎｅｇ Ｒａｊｉ　Ｐｏｓ 対照　Ｃｏ１ｏ２０５　Ｎｅｇ Ｒａｊｉ　Ｎｅｇ ＥＬ−４Ｎｅｇ 細胞は、対照（ＰＢＳ−ＢＳＡ）の各種添加物とともに氷上で３０分間インキュ ベートし、洗浄し、以下に記載するように処理した。Ｃｏ１ｏ２０５細胞に結合 したＣ２１５およびＣ２４２ｍＡｂならびにＥＬ−４に結合した抗−Ｔｈｙ−１ ，２の染色は、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウス１ｇを用いて検出した。Ｉ？ａｊｉ 細胞に対するＳＥＡの染色はウサギ抗−３ＥＡ血清を用い、ついでＦＩＴＣ−ブ タ抗ウサギ１ｇによって検出した。Ｃｏ１ｏ２０５ならびにＲａｊｉ細胞に対す るＳＥＡ−Ｃ２１５ｍＡｂ接合体の染色は、Ｃ２１５ｍＡｂおよびＳＥＡについ て上述の操作を用いて検出した。ＥＡＣＳ分析はＢｅｃｔｏｎ　＆　Ｄｉｃｋｉ ｎｓｏｎからのＦＡＣＳスタープラス上で実施した。第２および第３工程の染色 はバックグランドを明瞭にするためにのみ使用した。

」羞工臣慰昌這！！４駐ソ準−−−〜 ＣＤ４”　５Ｗ６２０　２　５　５０ ＣＤ４”　Ｒａｊｉ　Ｏ４１４３ ＣＤ８”　５Ｗ６２０　０　１　２３ ＣＤ８＋Ｉ？ａｊｉ　２　７２　６８ Ａ）　ＣＴＬ　（ＳＥＡ−３）　ハ、エフェクタ一対標的比３０：１で、ＳＥＡ およびＣ２１５−ＳＥＡの不存在下（対照）または１ｇ／ｍＡ’の存在下に使用 した。

エフェクター／標的比 ＳＥＡ／Ｃ２１５−５；ＥＡ　（ｎｇ／ｍ１）１０’　１０’　１０’　１０’ 　１ｏ２７（７３１０’　１０５ＳＥＡ／ＣＣ２１５−５ＥＡ（ｎ／ｍ／〕ＳＥ Ａ／Ｃ：２１５−ＳＥＡ（ｎｇ／ｍ１）ＳＥＡ／ＣＣ２１５−５ＥＡ（ｒｒ／ｃ ＝ｌ／比細胞障害性（％） 国際調査報告 ｍ＋＊＋ｖｎ＋＋ｅｅ＊Ｉｌｌｅｍｋ＊ｌ＋ａｅｌｌｅ、　ＰＣＴ／ＳＥ　９１ １００４９７ｌ１１．ユｍｍａ＋　＆工、−＋Ｉ−ｗ＋−ＰＣＴ／ＳＥ　９１１ ００４９７２．　ＣｌａＬｍ１１９−１７：　ｐｏｌｙｅｅｈｅｒｓ　ｆｔｎｔ ｅｒｍｅ＋ｎａｔｓｓ　Ｌｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｒｔｈ＠ｂｔｒ ｕｎｃｔｔｏｎａｉ　ｃｏｕｐＨｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔｓ＋。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＳＥ　９１１００４９７ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９ ５　Ｃ９２８４−４ＣＬ　９２８４〜４Ｃ Ｙ　９２８４〜４Ｃ ４７／４８　Ｚ　７４３３−４Ｃ ４９１００Ａ　９１６４−４Ｃ Ｃ０７Ｃ２０５／１４　７１８８−４Ｈ２１７１０８７４５７−４Ｈ ２３５１０６７１０６〜４Ｈ ２７１／１６　７１８８−４Ｈ Ｃ０７Ｄ　２０９／４８ ２４３／３２　７１６７−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１７１０６　８５１７−４ＨＧＯＩＮ　３３１５３２　Ａ　８３１０ −２Ｊ３３１５４７　９０１５−２Ｊ （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＡＵ 、ＣＡ、ＪＰ、ＵＳ Ｉ （７２）発明者　オーケルブロム、エーヴアスウェーデン国ニス−７５２５２ウ プサラ。

タールグウクスヴエイエン１５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．接合体物質（Ａ−Ｂ−Ａ′）のＡおよびＡ′はそれぞれ有機化合物Ｆおよび Ｆ′からの残基であり、少なくともその−方はポリマー（担体）であってこれら の化合物の性質が接合体中に維持され、−Ｂ−はＡおよびＡ′を共有結合させる 橋部である接合体において、橋部−Ｂ−は、構造 −ＳｒＲＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍＣＯＹ−（ Ｉ）〔式中、 （ｉ）ｎは整数、たとえば１〜２０、好ましくは＞２であり、橋部が接合体（接 合体物質）の個々の分子における同一の位置を連結するためにｎは均一であり、 （ｉｉ）ｍは、１または２であり、 （ｉｉｉ）Ｒは、１〜４個の炭素原子、好ましくは＜２個の炭素原子を有し１も しくは２個以上（１〜３、好ましくは＜２）のヒドロキシ（ＯＨ）基で置換され ていてもよいアルキレン基であり、 （ｉｖ）Ｓｒは、両方向で飽和炭素原子に結合し、ｒは１または２であり、 （ｖ）Ｙは、−ＮＨ−、−ＮＨＮＨ−または−ＮＨＮ＝ＣＨ−であり、その左端 でＣＯに結合し、その右端で飽和炭素原子またはカルボニル基（−ＮＨＮＨ−の 場合のみ）に結合する〕からなることを特徴とする接合体。 ２．ポリマーはポリペプチドまたは多糖構造を有することを特徴とする請求項１ 記載の接合体。 ３．ポリマーは抗体またはその抗体活性フラグメントであることを特徴とする請 求項１〜２のいずれかに記載の接合体。 ４．ポリマーは水性メジウムに可溶性であることを特徴とする請求項１〜３のい ずれかに記載の接合体。 ５．抗体またはその抗体活性フラグメントではないＡおよびＡ′の実体は分析的 に検出可能な基であることを特徴とする請求項３記載の接合体。 ６．担体ポリマーは抗体またはその抗体活性フラグメントであり、担体ポリマー ではないＡおよびＡ′の実体はたとえば細菌起源の免疫刺激剤であることを特徴 とする請求項１〜５のいずれかに記載の接合体。 ７式 −Ｚ１ＲＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｍＺ１′（Ｉ ＩＩ）〔式中、 （ｉ）ｎは整数、たとえば１〜２０、好ましくは＞２であり、 （ｉｉ）ｍは、１または２、好ましくは１であり、（ｉｉｉ）Ｚ１はＳＨ−反応 性求電子基またはチオール（ＳＨ−）もしくは保護チオール、たとえばアシル化 チオールたとえばＡｃＳ−であり、 （ｉｖ）Ｒは、１もしくは２個以上（１〜３、好ましくは＜２）のヒドロキシ（ ＯＨ）基で置換されていてもよいアルキレン基（１〜４個の炭素原子、好ましく は＜２個の炭素原子を有する）であり、 （ｖ）Ｚ１′は活性化カルボキシである〕で示される二官能性カップリング試薬 。 ８．Ｚ１′は、−方の硫黄原子がＲに結合している反応性ジスルフィド：メルカ プト；２，５−ジオキソ−１−アザ−シクロペンタ−３−エン−１−イル；およ びハロ好ましくはブロモまたはヨードの中から選択されることを特徴とする請求 項７記載の二官能性カップリング試薬。 ９．式 ＸＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２−）ｎＯＣＨ２Ｙ（ＩＶ）〔式中、 ｎは整数２〜２０、好ましくは３〜２０であり、Ｘは、Ｈ２Ｎ−または好ましく は加水分解もしくは還元によりＨ２Ｎ−に変換可能な置換Ｈ２Ｎ−、たとえば（ ａ）ニトロ；アミド（＝カルボアミド）たとえば低級飽和アシルアミド；フタル イミドイル；（ｂ）カルバメート；置換された炭素原子が芳香系に対してαであ る低級アルキルアミノ；および（ｄ）４−オキソ−１，３，５−トリアジン−１ −イルであり、 Ｙは、カルボキシ（−ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯ−）またはカルボキシに好ましく は加水分解もしくは酸化によって変換可能な基、たとえば（ａ）カルボニル炭素 原子または相当する原子が式（Ｉ）の右端におけるメチレンに結合しているエス テル基、または（ｂ）−ＣＨＯ、（ｃ）−ＣＮ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ１′ Ｒ２′（式中、Ｒ１′およびＲ２′は、低級アルキル、とくに二級および三級ア ルキル基、環が置換されていてもよい１〜３個のフェニル基で置換されたメチル である）〕で示されることを特徴とするポリエーテル。 １０．ＸはＮＨ２−であることを特徴とする請求項９記載のポリエーテル。 １１．Ｘはアシルアミド、たとえばＣＨ３ＣＯＮＨ−、およびα炭素原子に電子 求引置換基を有するＣＨ３ＣＯＮＨ−（たとえばＣＦ３ＣＯＮＨ−またはＣＨ３ ＣＯＣＨ９ＣＯＮＨ−）、ならびにホルミルアミド（ＨＣＯＮＨ−）であること を特徴とする請求項９記載のポリエーテル。 １２．Ｘはフタルイミドイルまたはカルバメート、たとえばＲ１′ＯＣＯＮＨ− および（Ｒ１′ＯＣＯ）（Ｒ２′ＯＣＯ）Ｎ−（式中、Ｒ１′およびＲ２′は、 低級アルキル基、とくに二級および三級アルキル基、または環が置換されていて もよい１〜３個のフェニル基で置換されたメチルである）であることを特徴とす る請求項９記載のポリエーテル。 １３．ＸはＢｏｃ、ＺまたはジＺであることを特徴とする請求項９または１２の いずれかに記載のポリエーテル。 １４．Ｘは窒素原子を置換する炭素原子が芳香系に対してαであるアルキルアミ ノ、たとえばＮ−モノベンジルアミノであることを特徴とする請求項９記載のポ リエーテル。 １５．Ｙはカルボキシ基であることを特徴とする請求項９〜１４のいずれかに記 載のポリエーテル。 １６．Ｙは、カルボニル炭素原子またはその相当する原子において式（ＩＶ）の 右端のメチレンに結合するエステル基であることを特徴とする請求項９記載のポ リエーテル。 １７．Ｙは、アルキルエステル基（−ＣＯＯＲ１′）：オルトエステル基〔−Ｃ （ＯＲ３′）３〕または反応性エステル基、たとえばＮ−スクシンイミド−１− イルオキシカルボニル、４−ニトロフェニルオキシカルボニルおよび２，４−ジ ニトロフェニルオキシカルボニル（式中、Ｒ１′およびＲ２′は、低級アルキル 基、とくに二級および三級アルキル基、ならびに環が置換されていてもよい１〜 ３個のフェニル基で置換されたメチルである）であることを特徴とする請求項９ または１６記載のポリエーテル。