JPH0822869B2 - サイトロジンｓ誘導体およびそれを含有する抗癌剤 - Google Patents

サイトロジンｓ誘導体およびそれを含有する抗癌剤

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JPH0822869B2
JPH0822869B2 JP62074259A JP7425987A JPH0822869B2 JP H0822869 B2 JPH0822869 B2 JP H0822869B2 JP 62074259 A JP62074259 A JP 62074259A JP 7425987 A JP7425987 A JP 7425987A JP H0822869 B2 JPH0822869 B2 JP H0822869B2
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寛 北川
勇 菅原
博 岡崎
昭男 福田
ハンス・ゲルト・ベルシャイト
仁子 沼田
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俊二 千田
明彦 松尾
博 渡部
嚴夫 黒羽
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/12—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D493/14—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
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Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規なサイトロジンＳ誘導体特にサイトロジ
ンＳ−免疫グロブリン複合体に関する。
本発明のサイトロジンＳ誘導体は、癌細胞に選択的に
作用し、抗癌剤として有用である。
［従来の技術］ サイトロジンＳはストレプトミセスY-11472（寄託番
号DSM-2658）を培養して得られる粗サイトロジン混合物
を酸処理することにより製造され、抗癌作用を有するこ
とが報告されている（特開昭60-48994号公報）。
サイトロジンＳの抗癌作用はそれ自体非常に優れてい
るが、生体に投与した場合に癌細胞に特異的に作用し、
バイオアベラビリティのより高い薬剤の出現が望まれて
いる。
［問題点を解決するための手段］ 本発明者等は癌細胞への選択特異性がより優れたサイ
トロジンＳ誘導体を開発すべく鋭意研究した結果、サイ
トロジンＳ自体の抗癌作用を損うことなしにサイトロジ
ンＳ−免疫グロブリン複合体を得ることに成功し、本発
明を完成した。
本発明によれば次のサイトロジンＳ誘導体およびそれ
を含有する抗癌剤が提供される。
１）一般式（Ｉ） 〔式中Ｘは式-NH2,-NH-R1-NH2,-NH-R1-COOH,-NH-R1-SH, または を有する基（式中R1は任意の置換基で置換されていても
良い２価の炭化水素基、R2は２価の炭化水素基、R3は２
価の有機基、IgGは免疫グロブリン残基、ｎは１〜15の
整数を示す）を示す〕で表わされるサイトロジンＳ誘導
体及びその塩。
２）式中R3は２価の炭化水素基または式 または で表される基（式中R1、R2およびR4はは２価の炭化水素
基を示す）である上記第１項記載のサイトロジンＳ誘導
体。
３）R2がプロピレン基であり、R4がメチレン基である上
記第２項記載のサイトロジンＳ誘導体。
４）ｎが５〜12である上記第１項〜第３項のいずれかの
項に記載のサイトロジンＳ誘導体。
５）IgGが癌胎児性抗原（CEA）に対する抗体の残基であ
る上記第１項〜第４項のいずれかの項に記載のサイトロ
ジンＳ誘導体。
６）一般式（Ｉ）においてＸが-NH2,NH-R1-NH2, または を有する基（式中R1は任意の置換基で置換されていても
良い２価の炭化水素基、R2は２価の炭化水素基、R3は２
価の有機基、IgGは免疫グロブリン残基、ｎは１〜15の
整数を示す）を示す〕であるサイトロジンＳ誘導体を製
造するにあたり、式（II） を有するサイトロジンＳをアンモニウム塩またはNH2-R1
-NH2（式中R1は前述したものと同一である）で表わされ
る化合物の存在下でアルカリ金属シアノボロハイドライ
ドで還元して前記式（Ｉ）においてＸが-NH2または-NH-
R1-NH2であるサイトロジンＳ誘導体を製造し、必要によ
り得られた生成物を式（III） （式中R2は前述したものと同一である）を有するマレイ
ミド化合物と反応させて式（Ｉ）において または であるサイトロジンＳ誘導体を製造し、さらに必要によ
り得られた生成物を式（IV） （式中R4は２価の炭化水素基、IgGは前述したものと同
一であり、ｎ′は１〜20の整数を示す）を有するチオー
ル化免疫グロブリンと反応させて式（Ｉ）においてＸが であるサイトロジンＳ誘導体を製造することを特徴とす
るサイトロジンＳ誘導体の製造法。
７）式中R3が または である前記第６項に記載のサイトロジンＳ誘導体の製造
法。
８）一般式（Ｉ）においてＸが -NH-R1-SHまたは を有する基（式中R1は任意の置換基で置換されていても
良い２価の炭化水素基、R3は２価の有機基、IgGは免疫
グロブリン残基、ｎは１〜15の整数を示す）であるサイ
トロジンＳ誘導体を製造するにあたり、前記式（II）を
有するサイトロジンＳをNH2-R1-SH（式中R1は前述した
ものと同一である）で表わされる化合物の存在下でアル
カリ金属シアノボロハイドライドで還元して前記式
（Ｉ）においてＸが-NH-R1-SHであるサイトロジンＳ誘
導体を製造し必要により得られ生成物を式（Ｖ） （式中R2およびIgGは前述したものと同一でありｎ′は
１〜20の整数を示す）を有するマレイミド化免疫グロブ
リンと反応させて、式（Ｉ）においてＸが である、サイトロジンＳ誘導体を製造することを特徴と
するサイトロジンＳ誘導体の製造法。
９）R3が である前記第８項に記載のサイトロジンＳ誘導体の製造
法。
10）一般式（Ｉ）においてＸが -NH-R1-COOHまたは を有する基（式中R1は任意の置換基で置換されていても
良い２価の炭化水素基、R3は２価の有機基、IgGは免疫
グロブリン残基、ｎは１〜15の整数を示す）であるサイ
トロジンＳ誘導体を製造するにあたり、前記式（II）を
有するサイトロジンＳをNH2-R1-COOH（式中R1は前述し
たものと同一である）で表わされる化合物の存在下でア
ルカリ金属シアノボロハイドライドで還元して前記式
（Ｉ）においてＸが-NH-R1-COOHであるサイトロジンＳ
誘導体を製造し、必要により得られた生成物をカルボジ
イミド類の存在下で、式（VI） NH2IgG）1/n （VI） （IgGは前述したものと同一であり、ｎは１〜15の整数
を示す）を有する免疫グロブリンと反応させて式（Ｉ）
においてＸが であるサイトロジンＳ誘導体を製造することを特徴とす
るサイトロジンＳ誘導体の製造法。
11）R3がR1である前記第10項に記載のサイトロジンＳ誘
導体の製造法。
12）前記式（Ｉ）を有するサイトロジンＳ誘導体を含有
する抗癌剤。
上記式（Ｉ）において、R1の好ましい例としては既存
のα−アミノ酸、β−、γ−、ε−アミノ酸、β−，γ
−，ε−チオールアミンより導かれる基があげられる。
R2の好ましい例としてはメチレン、エチレン、プロピ
レンのような低級アルキレン基、ｐ−フェニレン、ｍ−
フェニレンのようなフェニレン基、シクロヘキシンのよ
うなC4〜C7シクロアルキレン基、フェニレニルメチルの
ようなフェニレニル低級アルキル基およびシクロヘキシ
レニルメチルのようなC4〜C7シクロアルキレニル低級ア
ルキル基があげられる。R3の好ましい例としては、式 又は-R1-で表わされる基があげられ、R4の好ましい例と
してはメチレン、エチレン、プロピレンのような低級ア
ルキレン基、ｐ−フェニレン、ｍ−フェニレンのような
フェニレン基、シクロヘキシレンのようなC4〜C7シクロ
アルキレン基、フェニレニルメチルのようなフェニレニ
ル低級アルキル基およびシクロヘキシレニルメチルのよ
うなC4〜C7シクロアルキレニル低級アルキル基があげら
れる。IgGで示される免疫グロブリン残基は免疫グロブ
リンからｎ個のアミノ基を除いたグロブリン残基を意味
する。但し、式（Ｉ）におけるIgGは免疫グロブリン に導入したチオール基 の一部が残っているものを含む。これはチオール化免疫
グロブリン（IV）における全てのチオール基がサイトロ
ジンＳ誘導体と反応するのではなく、一部未反応のチオ
ール基が残存するためである。
免疫グロブリンとしては癌細胞に特異的に結合する抗
体であることが好ましい。
1/nはサイトロジンS1分子に対する免疫グロブリン分
子の数を示し、1/1〜1/15である。すなわち、免疫グロ
ブリン１分子に対し、サイトロジンS1〜15分子が結合す
ることを表わすものである。
式-NH2,-NH-R1-NH2, -NHR1-COOH, -NHR1-SH, で表わされる化合物は免疫グロブリン複合体を製造する
ための中間体であるが、サイトロジンＳの抗癌作用を保
持しているのでそれ自体としても抗癌剤となりうるもの
である。
一般に抗癌剤と免疫グロブリンとの複合体を作成する
には、２価架橋試薬、縮合剤もしくはスペーサーを用い
て抗癌剤と免疫グロブリンを結合させる手法が用いられ
る。この目的のために抗癌剤はその分子中のアミノ基、
カルボキシル基、チオール基のような官能基を介して２
価架橋試薬、縮合剤もしくはスペーサーと結合させられ
るが、サイトロジンＳはこれ等の官能基を有しないた
め、化学的に修飾してアミノ基、カルボキシル基もしく
はチオール基を含んだ誘導体を作成する必要がある。
サイトロジンＳの抗癌作用を失なわずにこれ等誘導体
を作成する方法として糖鎖にあるオキソ基にアミノ基を
導入する方法がある。一般的なオキソ基の還元法として
はリチウムアルミニウムハイドライド（LiAlH4）、ナト
リウムボロハイドライド（NaBH4）等があるがアンスラ
サイクリン環にあるオキソ基を還元することなく選択的
に糖鎖のオキソ基を還元する試薬としてナトリウムシア
ノボロハイドライド（NaBCNH3）あるいはリチウムシア
ノボロハイドライド（LiBCNH3）を用いることができ
る。アンモニウム塩およびアミノ基を有する有機化合物
存在下でこれ等還元試薬を用いると選択的に糖鎖のオキ
ソ基が還元アミノ化されサイトロジンＳの誘導体が生成
される。
すなわち式（II） を有するサイトロジンＳをアンモニウム塩および、NH2-
R1-NH2,NH2-R1-COOH,NH2-R1-SHで表わされるアミノ基を
有する有機化合物の存在下でアルカリ金属シアノボロハ
イドライドで還元することにより前記式（Ｉ）において
Ｘが-NH2または-NH-R1-NH2,-NH-R1-COOH,-NHR1-SHであ
るサイトロジンＳ誘導体が得られる。
アンモニウム塩の例としては酢酸アンモニアム、プロ
ピオン酸アンモニウム、塩化アンモニウムがあげられ、
アミノ基を含む有機化合物例としては、リジン、システ
インのような既存のα−アミノ酸、γ−アミノ酪酸のよ
うな、β−，γ−，ε−アミノ酸や、グリシンエチルエ
ステルのようなアミノ酸エステル、アミノエタンチオー
ル、アミノチオフェノールのようなチオールアミンがあ
げられる。
アルカリ金属シアノボロハイドライドの例としてはリ
チウム（またはナトリウム）シアノボロハイドライドが
あげられる。
上記反応は、水混和性の有機溶媒（例えばメタノー
ル、エタノール等）やpHを８に調節した一級及び二級ア
ミンを含まない緩衝液（例えば、リン酸塩、ホウ酸塩を
用いた緩衝液や2,4,6−トリメチルピリジン−塩酸緩衝
液等）にサイトロジンＳおよびアンモニウム塩、アミノ
基を有する有機化合物を溶解し、この溶液にアルカリ金
属シアノボロハイドライドを加えて室温または氷冷下で
反応させることによって容易に実施される。反応混合物
中の生成物は常法によって例えばpHを８に調整したのち
ジクロルメタン等適当な有機溶媒中で抽出し、抽出液か
ら溶媒を留去することによって、または、分取HPLCを用
いることによって採取される。かくして得られたサイト
ロジンＳの誘導体のうち、Ｘが-NH2及び−NH-R′‐NH2
である誘導体は次いで前記式（III）を有するマレイミ
ド化合物と反応させて前記式（Ｉ）においてＸが 及び であるサイトロジンＳ誘導体が得られる。副生成物とし
てＮ−ヒドロキシサクシンイミドが生成する。
マレイミド化合物（III）の例としては、Ｎ−γ−マ
レイミドブチリルオキシサクシンイミド〔GMBS,R2：C
H2 ３〕、サクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）−シクロヘキサンカルボキシレート メタマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステル およびサクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート 等があげられる。
上記反応は適当な溶媒、例えばジクロルメタン、ジク
ロルエタン、クロロホルム、ピリジン、トリエチルアミ
ン等の存在下、室温または氷冷下でサイトロジンＳアミ
ノ誘導体をマレイミド化合物と混合することによって容
易に実施される。
このようにして得られたマレイミド基が導入されたサ
イトロジンＳ誘導体は、チオール基を持つ全ての蛋白質
あるいは化合物と付加反応を起こすことができる。すな
わち、マレイミド基にある二重結合がチオール基と親電
子付加反応を起こすのである。したがって、後述するよ
うにチオール基が導入された免疫グロブリンのチオール
基がマレイミド基に付加することにより、複合体を形成
することができる。
複合体を製造するために用いられる免疫グロブリンは
一般に癌細胞にのみ生じる膜蛋白に対する単クローンも
しくは多クローン抗体であることがのぞましく、また人
由来でない抗体を用いる場合は抗体のFc部分をとり除い
たものが臨床的には望ましい。しかしながらサイトロジ
ンＳの付加効率を考えると抗体全体を用いる方がよい。
特に好適な免疫グロブリンとして癌胎児性抗原（Carc
inoembryonicantigen）（CEA）あるいはα−フェトプロ
テイン（AFP）を抗原して得られた単クローン抗体が挙
げられる。癌胎児性抗原に対する単クローン抗体は、抗
原をマウスに投与し、そのマウスの脾臓を摘出し、脾細
胞をHAT感受性のミエローマ細胞とポリエチレングリコ
ール法により融合させ、HAT培地を選択培地として用
い、ハイブリドーマを選択し、これをマウスに移植する
通常の方法によって製造される。
免疫グロブリンを、複合体作成のためにマレイミド基
が導入されたサイトロジンＳと反応させるに先立ち、免
疫グロブリンにチオール基が導入される。チオール基を
導入するために免疫グロブリンを式（VII） （式中R4は前述したものと同一であり、R5はチオール基
保護基例えばアセチルのようなアシル基または２−ピリ
ジルチオ基を示す）を有するＮ−サクシンイミド化合物
と反応させて前記式（IV）を有するチオール化免疫グロ
ブリンを得る。Ｎ−サクシンイミド化合物（VII）の好
適な例としてはＮ−サクシンイミジル−Ｓ−アセチルチ
オアセテート があげられる。SATAは免疫グロブリン中のアミノ基と反
応し、チオール基がアセチル基で保護された形、すなわ
ち のアミド結合を生じ、副生成物としてＮ−ヒドロキシサ
クシンイミドを生ずる。チオール基の脱保護は例えばヒ
ドロキシルアミンを用いてpH7.5で行なわれ、反応性の に変換される。
このチオール基は条件によっては酸化されやすく結果
として免疫グロブリンポリマーを生じることがある。こ
のためチオール基の脱保護はマレイミド基の導入された
サイトロジンＳ誘導体との反応の直前に25℃で１時間位
行うのが好ましい。
このチオール基は反応に用いるSATAの量により免疫グ
ロブリン１分子あたり１〜20好ましくは５〜20個が導入
されるがこの導入によってもグロブリンの抗体としての
活性は失なわれない。
またSATAに代えてＮ−サクシンイミジル３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート をチオール導入試薬として用い、脱保護剤としてジチオ
スレイトールを用いると、免疫グロブリン中のアミノ基
との間で なる基が形成される。
このようにしてチオール基が導入された免疫グロブリ
ン（IV）はマレイミド基が導入されたサイトロジンＳと
反応させることにより本発明の免疫グロブリン複合体が
製造される。
この反応は水混和性有機溶媒（例えばメタノール、エ
タノール、ジメチルホルムアミド等）にとかしたマレイ
ミド基が導入されたサイトロジンＳをチオール基が導入
された免疫グロブリンの水溶液にpH7.5で混合すること
よって容易に実施される。
Ｘが-NH-R1-SHであるチオール基が導入されたサイト
ロジンＳ誘導体は、マレイミド基を導入された全ての蛋
白質あるいは化合物と付加反応を起こすことができる。
すなわち、マレイミド基にある二重結合がチオール基と
親電子付加反応を起こすのである。したがって、後述す
るようにマレイミド基が導入された免疫グロブリンのマ
レイミド基にチオール基が付加することにより、複合体
を形成することができる。
複合体を製造するために用いられる免疫グロブリンは
先に説明したとおりである。
免疫グロブリンを、複合体作成のためにチオール基が
導入されたサイトロジンＳと反応させるに先立ち、免疫
グロブリンにマレイミド基が導入される。マレイミド基
を導入するために免疫グロブリンを式（III） 〔式中R2は前述したものと同一である〕を有するマレイ
ミド化合物と反応させて前記式（Ｖ）を有するマレイミ
ド化免疫グロブリンを得る。マレイミド化合物（III）
の好適な例は、前述のＮ−γ−マレイミドブチリルオキ
シサクシンイミド等があげられる。
マレイミド化合物（III）は、免疫グロブリン中のア
ミノ基のカルボニル基に対する求核置換反応によって免
疫グロブリン中のアミノ基とアミド結合を形成し、式
（Ｖ）の であるマレイミド化免疫グロブリンおよび副生成物とし
てのＮ−ヒドロキシサクシンイミドを生成する。
このマレイミド基は反応に用いるマレイミド化合物
（III）の量により免疫グロブリン１分子あたり１〜20
好ましくは５〜20個が導入されるがこの導入によっても
グロブリンの抗体としての活性は失なわれない。
このようにしてマレイミド基が導入された免疫グロブ
リン（Ｖ）はチオール基が導入されたサイトロジンＳと
反応させることにより本発明の免疫グロブリン複合体が
製造される。
この反応は水混和性有機溶媒（例えばメタノール、エ
タノール、ジメチルホルムアミド等）またはpH7.5の緩
衝液（免疫グロブリンを溶解するのに使用したものと同
等である）にとかしたチオール基が導入されたサイトロ
ジンＳをマレイミド基が導入された免疫グロブリンの水
溶液にpH7.5で混合することによって容易に実施され
る。
Ｘが-NH-R1-COOHであるサイトロジンＳ誘導体は全て
の蛋白質あるいは化合物のアミノ基と適当な縮合剤を用
いることによってペプチド結合によって結合し得る。す
なわち縮合剤によってカルボキシル基が活性エステル化
しこれが蛋白質または化合物中のアミノ基へ求核反応す
ることによりペプチド結合を形成する。
したがって、免疫グロブリン本来が持つ、アミノ基
（リジン残基等の側鎖）にサイトロジンＳは新たに導入
されたカルボキシル基によってペプチド結合を介して導
入され、複合体を形成し得る。
Ｘが-NH-R1-COOHであるサイトロジンＳ誘導体は、複
合体作成のために縮合剤によって活性エステル化され
る。活性エステル化するために前記式（Ｉ）においてＸ
が-NH-R1-COOHであるサイトロジンＳ誘導体をカルボジ
イミド類と反応させる。
カルボジイミドの好適な例としては、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド、1,3−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミド塩酸塩、ジエチルカルボジイ
ミド、ジフェニルカルボジイミド、ジベンジルカルボジ
イミド、サイアナミド等があげられる。この反応は、水
混和性有機溶媒（例えばメタノール、エタノール、ジメ
チルホルムアミド等）またはpH7.5の緩衝液（免疫グロ
ブリンを溶解するのに使用したものと同等である。）
に、サイトロジンＳ誘導体及びカルルボジイミドを溶
解、室温にて１時間反応させた後、免疫グロブリン水溶
液にpH7.5でこれを加えることによって行なわれる。
このサイトロジンＳ誘導体の結合は、反応に用いるサ
イトロジンＳ誘導体の量により、免疫グロブリン１分子
あたり１〜20、好ましくは５〜20個が結合されるが、こ
の結合によってもグロブリンの抗体としての活性は失な
われない。
本発明の複合体中においてサイトロジンＳと免疫グロ
ブリンの結合比は１〜15:1であり、免疫グロブリン１分
子に対して１〜15分子のサイトロジンＳが結合してい
る。このように抗癌剤成分の結合比が高いので本発明の
複合体は強い抗癌作用を奏するという優れた効果を有し
ている。
サイトロジンＳ誘導体（Ｉ）の臨床における投与量
は、投与経路にもよるが通常はサイトロジンＳとして成
人１日当り１〜20mgの範囲である。
投与方法としては、静脈内、腹腔内、直腸内投与が可
能であり、静脈内投与の場合は通常の静脈内注射の他点
滴静注が可能である。
サイトロジンＳ誘導体（Ｉ）を含有する製剤は、通常
の賦形剤、添加剤を用いて通常の方法によって製造され
る。
注射用製剤としては、例えば注射用粉末製剤とするこ
とが出来る。その場合は適当な水溶性賦形剤例えばマン
ニトール、蔗糖、乳糖、マルトース、ブドウ糖、フルク
トース等の一種または二種以上を加えて水で溶解し、バ
イアルまたはアンプルに分注した後凍結乾燥し密封して
製剤とすることができる。
坐剤用としては、カカオ脂や、脂肪酸トリグリセライ
ドに脂肪酸モノグリセライド、脂肪酸ジグリセライドを
種々の割合で混合した半合成基剤等の親油性基剤、ポリ
エチレングリコールやグリセロゼラチン等の親水性基剤
を加温溶解したものを加えて均一に混和し型に入れて成
形し坐剤とすることができる。
以下に本発明の実施例を示す。
［実施例］ 実施例１ サイトロジンS10mgをメタノール2mlに溶解した。この
溶液にサイトロジンＳに対し10モル当量に相当する5.8m
gのアンモニウムアセテートのメタノール溶液（濃度10m
g/ml）と３モル当量に相当する1.4mgのナトリウムシア
ノボロハイドライドのメタノール溶液（濃度10mg/ml）
を加え25℃で４時間反応せしめた。反応で得られた混合
液を５℃に冷やした20mlの0.5％酢酸水溶液に加え5mlの
ジクロルメタンで２回抽出し未反応のサイトロジンＳを
除去した。得られた酢酸水溶液を飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液でpH8に合せた。この水溶液を20mlのジクロル
メタンで３回抽出することによりアミノ誘導体を得た。
ジクロルメタン溶液を無水硫酸ナトリウムにより脱水し
ジクロルメタンを減圧蒸留することにより4.8mgのサイ
トロジンＳアミノ誘導体（以下アミノサイトロジンＳと
する）を得た。純度は高速液体クロマトグラフィー（以
下HPLCという）により分析した。その条件は以下のとお
りである：カラム;SSC-Aquasil PE-2、4.6mm×250mm
（センシュー科学）、溶媒;2.0％トリエチルアンモニウ
ムホスフェイト（pH3）、75％、アセトニトリル、25
％。保持時間：サイトロジンＳ（25.0分）、アミノサイ
トロジンＳ（12.9分）。さらに、HPLCによって得た当該
サイトロジンＳ誘導体をFAB/MSスペクトロメーター（日
本電子社JMS-DX300）によってその質量数を測定したと
ころ942（Ｍ＋H+）なる質量スペクトルを得、計算によ
り求めた質量数との一致を観た。
誘導体の吸収スペクトルは、495nmにサイトロジンＳ
のアンスラサイクリン環に由来する特異吸収が観測され
た。これは出発物質のサイトロジンＳと同一波形を示
し、誘導体の抗ガン作用が損われていないことを示して
いる。
実施例２ 実施例１で得られたアミノサイトロジンS4.8mgを2ml
のジクロルメタンに溶解した。この溶液にアミノサイト
ロジンS5モル当量に相当する3.8mgのＮ−γ−マレイミ
ドブチリルオキシサクシンイミド（ベーリングダイアグ
ノステイクス製、以下GMBSという）のシグロルメタン溶
液（濃度10mg/ml）を加え25℃で２時間反応せしめた。
反応混合物は分取用薄層クロマトグラフィー（以下TLC
という）により精製しサイトロジンＳのGMBS誘導体を得
た。薄層クロマトグラフィーの条件は以下のとおり：薄
層プレイト;2mmシリカゲル60F-254（メルク製）、展開
溶媒；メタノール：ジクロルメタン＝1:4、Rf値:GMBS誘
導体（0.82）、アミノサイトロジンＳ（0.29）。得られ
たGMBS誘導体を薄層プレートより抽出した後、抽出液を
無水硫酸ナトリウムにより脱水し溶媒を減圧蒸留するこ
とにより2.7mgのサイトロジンＳのGMBS誘導体を得た。
またさらに、GMBS誘導体の純度をHPLCにて分析し、つ
いで精製を行った。分析に使用したカラム及び条件は以
下のとおりである。；カラム;SSC-Aquasil PE-2、4.6mm
×250mm（センシュウ科学）、溶媒;2.0％トリエチルア
ンモニウムホスフェイト（TEAP,pH3.0）中、アセトニト
リルを０％−30％直線グラジエント方式にて30分間かけ
て変化させ、アセトニトリル30％の状態をさらに30分間
継続する、流速;1ml/min、保持時間；サイトロジンS36
分、GMBS誘導体38分および38.6分。精製に使用したカラ
ム及び条件は以下のとおりである。：カラム;Senshu Pa
k NP-318-4252,10mm×250mm（センシュウ科学）、溶媒;
2.0％TEAP（pH3.0）中アセトニトリル10％〜30％直線グ
ラジエント方式にて20分間かけて変化させアセトニトリ
ル30％の状態をさらに15分間継続後、同様に30％〜100
％５分間で変化させる、流速;4ml/min、保持時間;GMBS
誘導体28分および28.5分。HPLCの溶出液をSEP-PAK
（C18）カートリッジ（日本ウォーターズ社製）にか
け、サイトロジンＳ誘導体を吸着せしめ、0.5％酢酸水
溶液にて洗浄後、0.5％酢酸−メタノール溶液にて溶出
させる。溶出液を回収、減圧乾固させGMBS誘導体約3.2m
gを得た。この純度は再度HPLCにて検定しその条件は前
述の分析条件に同じである。
さらに、HPLCによって得た当該サイトロジンＳ誘導体
をFAB/MSスペクトロメーター（日本電子社製JMS-DX30
0）によってその質量数を測定したところ1215（Ｍ＋
H+）なる質量スペクトルを得、計算により求めた質量数
とMSスペクトル測定時に使用するチオグリセロールとの
複合体の質量数であることを確認した。また、誘導体の
吸収スペクトルは495nm付近においてアンスラサイクリ
ン環の特異吸収をよく保持していた。
一方、マレイミド基の導入確認は、アミノエタンチオ
ールを反応させ、TLC及びHPLCのスポット及びピークの
位置が変化することによっても再度確認した。分析に使
用したHPLCのカラム及び条件は前述のとおりである。保
持時間：アミノサイトロジンS19.5分及び20.5分、GMBS
誘導体アミノエタンチオール付加物23分及び23.5分。
（対象実験として出発物質のアミノサイトロジンＳにア
ミノエタンチオールをGMBS誘導体と全く同条件下混合
し、反応を試みた。その結果アミノサイトロジンＳはチ
オールの混入によってHPLCのピークに何ら影響はうけな
かった。） 実施例３ 18mgのラビット免疫グロブリン（シグマ製）を1mlの1
mM、EDTAを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.5）に溶解す
る。この溶液に10μｌの100mMN−サクシンイミジル−ｓ
−アセチルチオアセテート（ベーリングダイアグノステ
イクス製、以下SATAという）ジメチルホルムアミド溶液
を加え25℃で20分間反応せしめた。上記反応混合液に50
μｌの1Mトリス塩酸溶液（pH7.8）を加え25℃で５分間
放置した。しかるのち1mM、EDTAを含む50mMリン酸緩衝
液（pH7.5）で事前に平衡化したPD-10カラム（ファルマ
シア製）で反応混合物を分取することにより免疫グロブ
リンのSATA誘導体を得た。このSATA誘導体にSATAに対し
50モル当量相当の0.25mM、EDTAを含む0.5mMヒドロキシ
ルアミン水溶液（pH7.5）を加え25℃で１時間反応させ
ることにより脱アセチル化を行った。SH基を導入した免
疫グロブリンを含む上記水溶液に実施例２で得られたGM
BS誘導体をSH基に対して10モル当量ジメチルホルムアミ
ド20μｌに溶かした溶液を加え５℃で12時間反応させ
た。反応後1mMのEDTAを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.5）
で平衡化したセファデックスG-25（ファルマシア製）の
20mm×400mmカラムを用いて球状蛋白質16万に相当する
画分を分取した。蛋白質及びサイトロジンＳの画分を知
るために溶出液を280nmと495nmでモニターした。
得られたサイトロジンＳと免疫グロブリンの複合体は
透析により脱塩の後凍結乾燥し20mgを得た。サイトロジ
ンＳの特異的吸収495nmと複合体の乾燥重量から免疫グ
ロブリン１分子あたりの結合サイトロジンＳ量を計算し
たところ免疫グロブリン１分子あたり５個のサイトロジ
ンＳが結合していた。さらにSATAの量を免疫グロブリン
に対して増やすことにより12個のサイトロジンＳを結合
させることができた。
第１図に免疫グロブリン１分子あたり約12個のサイト
ロジンＳが結合した複合体のUVスペクトルを示す。複合
体のUVスペクトルはサイトロジンＳの結合比が増すにつ
れて、サイトロジンＳの特異吸収部分が増大していく。
実施例４ サイトロジンS5mgをメタノール1mlに溶解した。この
溶液にサイトロジンＳに対して６モル当量に相当するγ
−アミノ酪酸2.6mgのメタノール溶液（濃度1mg/ml）を
加えトリエチルアミンでpHを８に調節した後、３モル当
量に相当する1.4mgのナトリウムシアノボロハイドライ
ドを加え25℃で24hr反応せしめた。反応で得られた混合
液をTLCにて生成物の有無を確認した後HPLCにて純度を
分析し、精製を行った。実施例２と同一条件におけるTL
CによるRf値は、サイトロジンS0.57、γ−アミノ酪酸誘
導体0.28であった。実施例２と同一条件下でのHPLCによ
る分析における保持時間は、サイトロジンS36分、γ−
アミノ酪酸誘導体29分であった。実施例２と同様の条件
下でHPLCによって精製した結果、γ−アミノ酪酸誘導体
約1.5mgを得た。
さらに当該誘導体をFAB/MSスペクトロメーター（JMS-
DX300）によってその質量数を測定したところ、1028
（Ｍ＋H+）なる質量スペクトルを得、計算により求めた
質量数との一致を観た。
また、誘導体の吸収スペクトルは495nm付近にサイト
ロジンＳのアンスラサイクリン環の特異吸収をよく保存
していた。
実施例５ サイトロジンＳ γ−アミノ酪酸誘導体2.5mgをDMFに
溶解し（濃度50mg/ml）、これにサイトロジンＳ誘導体
の等モル当量に相当するジシクロヘキシジルカルボジイ
ミド515μｇのDMF溶液（濃度50mg/ml）を加える。室温
で1hr反応させた。
ラビット免疫グロブリン（シグマ製）20mgを50mMリン
酸緩衝液（pH7.5）1mlに溶解し、これに上記のサイトロ
ジンＳ誘導体DMF溶液を加え室温で30分間反応させる。
ラビット免疫グロブリンに対しサイトロジンＳ γ−ア
ミノ酪酸誘導体は20モル当量に相当する。次いで、素速
く1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.8）を加え攪拌して10分間
放置する。これを50mMリン酸緩衝液であらかじめ平衡化
してあるPD-10カラム（ファルマシア製）にかけ分離精
製を行った。
得られた複合体は免疫グロブリン１分子あたり12個の
サイトロジンＳを結合していた。
実施例６ サイトロジンS5mgをメタノール1mlに溶解した。この
溶液にサイトロジンＳに対して６モル当量に相当するリ
ジン3.3mgの１モル酢酸水溶液（濃度10mg/ml）と３モル
当量に相当する1.4mgのナトリウムシアノボロハイドラ
イドを加え25℃で24hr反応せしめた。反応で得られた混
合液をTLCにて生成物の有無を確認した後HPLCにて純度
を分析し、精製を行った。実施例２と同一条件における
TLCによるリジン誘導体のRf値は0.20であった。実施例
２と同一条件下でのHPLCによる分析におけるリジン誘導
体の保持時間は27分および28分であった。実施例２と同
様の条件下でHPLCによって精製した結果、リジン誘導体
約2.6mgを得た。
さらに当該誘導体をFAB/MSスペクトロメーター（JMS-
DX300）によってその質量数を測定したところ、1071
（Ｍ＋H+）なる質量スペクトルを得、計算により求めた
質量数との一致を観た。
また、誘導体の吸収スペクトルは495nm付近にサイト
ロジンＳのアンスラサイクリン環の特異吸収をよく保存
していた。
実施例７ サイトロジンS5mgをメタノール1mlに溶解した。この
溶液にサイトロジンＳに対して６モル当量に相当するア
ミノエタンチオール1.7mgのメタノール溶液（濃度1mg/m
l）と３モル当量に相当する1.4mgのナトリウムシアノボ
ロハイドライドを加え25℃で24hr反応せしめた。反応で
得られた混合液をTLCにて生成物の有無を確認した後HPL
Cにて純度を分析し、精製を行った。実施例２と同一条
件下におけるTLCによるアミノエタンチオール誘導体のR
f値は0.25であった。実施例２と同一条件下でのHPLCに
よる分析におけるアミノエタンチオール誘導体の保持時
間は28分であった。実施例２と同様の条件下でHPLCによ
って精製した結果、アミノエタンチオール誘導体約1.6m
gを得た。
さらに当該誘導体をFAB/MSスペクトロメーター（JMS-
DX300）によってその質量数を測定したところ、1002
（Ｍ＋H+）なる質量スペクトルを得、計算により求めた
質量数との一致を観た。
また、誘導体の吸収スペクトルは495nm付近にアンス
ラサイクリン環の特異吸収をよく保存していた。
一方、−SH基の導入確認はＮ−エチルマレイミドを反
応させ、TLC及びHPLCのスポット及びピークの位置が変
化することによっても再度行った。（アミノエタンチオ
ール誘導体では観測される変化がサイトロジンＳ及びア
ミノサイトロジンＳでは観測されなかった。） 実施例８ サイトロジンS5mgをメタノール1mlに溶解した。この
溶液にサイトロジンＳに対して６モル当量に相当するシ
ステイン2.7mgのメタノール溶液（濃度1mg/ml）と３モ
ル当量に相当する1.4mgのナトリウムシアノボロハイド
ライドを加え25℃で24hr反応せしめた。反応で得られた
混合液をTLCにて生成物の有無を確認した後HPLCにて純
度を分析し、精製を行った。実施例２と同一条件下にお
けるTLCによるシステイン誘導体のRf値は0.35であっ
た。実施例２と同一条件下でのHPLCによる分析における
システイン誘導体の保持時間は32分であった。実施例２
と同様の条件下でHPLCによって精製した結果、システイ
ン誘導体約1.8mgを得た。
さらに当該誘導体をFAB/MSスペクトロメーター（日本
電子社製）によってその質量数を測定したところ、1046
（Ｍ＋H+）なる質量スペクトルを得、計算により求めた
質量数との一致を観た。
また、−SH基の導入確認は実施例７と同様にＮ−エチ
ルマレイミドを反応させ、スポット及びピーク（TLC及
びHPLC）の位置が変化することによっても再度確認し
た。
実施例９ 11mgのラビット免疫グロブリン（シグマ製）を1mlの1
mM、EDTAを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.5）に溶解す
る。この溶液にラビット免疫グロブリンに対して10モル
当量に相当するＮ−γ−マレイミドブチリルオキシサク
シンイミド（ベーリングダイアグノステイクス製以下GM
BS）191μｇのDMF溶液（濃度50mg/ml）を加え、25℃で2
hr反応せしめた。上記反応液に50μｌの1Mトリス塩酸緩
衝液（pH7.8）を加え25℃で５分間放置した。しかる後1
mMEDTAを含む50mMリン酸緩衝液（pH7.5）であらかじめ
平衡化したPD-10カラム（ファルマシア製）で反応混合
物を分取することによりラビット免疫グロブリンのマレ
イミド基導入型誘導体を得た。
先の実施例７で得られた−SH基導入型サイトロジンＳ
誘導体をこのマレイミド基導入型ラビット免疫グロブリ
ンと反応せしめた。
ラビット免疫グロブリンに導入されたマレイミド基の
２モル当量にあたるサイトロジンＳアミノエタンチオー
ル誘導体1.5mgをDMFに溶解（濃度100mg）し、先のマレ
イミド基導入型ラビット免疫グロブリン水溶液に加え、
５℃で12hr反応せしめた。
得られた複合体は免疫グロブリン１分子あたり12個の
サイトロジンＳを結合していた。
実施例10 サイトロジンS5mgをメタノール1mlに溶解した。この
溶液にサイトロジンＳに対して６モル当量に相当するグ
リシンエチルエステル3.2mgのメタノール溶液（濃度1mg
/ml）と３モル当量に相当する1.4mgのナトリウムシアノ
ボロハイドライドを加え25℃で24hr反応せしめた。反応
で得られた混合液をTLCにて生成物の有無を確認した後H
PLCにて純度を分析し、精製を行った。実施例２と同一
条件におけるTLCによるグリシンエチルエステル誘導体
のRf値は0.34であった。実施例２と同一条件下でのHPLC
による分析におけるグリシンエチルエステル誘導体の保
持時間は32分および33分であった。実施例２と同様の条
件下でHPLCによって精製した結果、グリシンエチルエス
テル誘導体約1.4mgを得た。
さらに当該誘導体をFAB/MSスペクトロメーター（JMS-
DX300）によってその質量数を測定したところ、1028
（Ｍ＋H+）なる質量スペクトルを得、計算により求めた
質量数との一致を観た。
また、誘導体の吸収スペクトルは495nm付近にサイト
ロジンＳのアンスラサイクリン環の特異吸収をよく保存
していた。
実施例11 ７〜10週令の雌性BALB/cマウスに、25μｇの精製ヒト
CEAを、フロインドの完全アジュバントとともに腹腔内
に投与した。10週間後、25μｇのCEAを生理食塩水に溶
かし、静脈内に投与した。投与後３日目に脾臓を摘出
し、脾細胞と非産生型ミエローマ細胞X63-Ag8.653とを
融合した。細胞融合およびそれにつづく培養・クローニ
ングの方法は、基本的にOiら（Oi V.T.＆ Herzenberg
L.A.,Selected Methods in Cellular Immunology,B.B.M
ishell＆S.M.Shiigi Eds,P351,Freeman＆Co.,Sanfranci
sco 1980）の方法に準じた。脾細胞とミエローマ細胞の
割合を10:1とし軽く遠心しペレットにした後、42.5％ポ
リエチレングリコール（M.W.2,000,15％ジメチルスルホ
キシドを含む）の0.5mlを滴加、37℃の条件下で２分間
ゆっくり攪拌した。その後RPMI培地にて20倍希釈した。
遠心後15％牛胎児血清加RPMT-1640培地にて懸濁し、96
穴マイクロタイタープレートに５×105細胞ずつ分配し
た。37℃で一夜培養後HAT培地（100μＭヒポキサンチ
ン、４×10-4μＭアミノプテリン、1.6×10-2チミジ
ン）を一滴ずつ加えた。このHAT培地によるハイブリド
ーマの選択は細胞融合後2,3,5,7,10,13日目に各穴の半
量の培地を新鮮なHAT培地と交換することにより行っ
た。培養上清の抗CEA活性を、RIAあるいはEIAにより検
定し、活性を示した細胞を更に大きな培養系に移すか、
あるいは限界希釈法によりクローン化した。このように
して得られた融合細胞を前もって0.5mlのテトラメチル
ペンタデカンで処理された同系マウスの腹腔内に移植す
ると、１〜２週間後には数mlの腹水が得られ、この中に
は、５〜10mg/mlの濃度の均一なモノクローナル抗体が
含まれていた。
このようにして得られたCEAに対するモノクローナル
抗体（MA204）とサイトロジンＳの複合体を実施例３と
同様の方法で作成した。
サイトロジンＳと免疫グロブリン複合体の抗癌作用の
テスト 培地としてRPMI1640-10％牛胎児血清中で継代培養し
た腫瘍細胞株、L1210（５×104細胞/ml）200μｌを96穴
ミクロプレート上に分配する（１×104細胞／ウェ
ル）。濃度を調整した10μｌのサイトロジンＳ（CYT）
およびサイトロジンＳ−免疫グロブリン複合体（CYT-Ra
b IgG）をこの細胞培養液に加え37℃で18時間培養し
た。その後25μｌのトリチウム標識チミジンを0.5μCi/
ウェルずつ加え37℃で６時間さらに培養した。しかるの
ち細胞は細胞採取器によりフィルター上に集められ、乾
燥させたのち液体シンチレーションカウンターにより標
識チミジンの細胞へのとりこみ量を測定し細胞のDNA合
成能を求め比較した。結果を第２図に示す。第２図から
CYT-Rab IgGがCYTの抗癌作用をほぼ維持していることが
わかる。同様の方法でCEA産出細胞株であるColo 205に
ついてサイトロジンＳ−抗CEA単クローン抗体複合体の
効果を調べた。結果を第３図に示す。
試験薬剤の使用量は次のとおりである。
MA 204はRab IgGに比べて選択特異性が大きいので、
第３図においてCYT-MA 204がCYT-Rab IgGより細胞増殖
抑制効果が大きい。このことは本発明のサイトロジンＳ
−免疫グロブリン複合体が癌細胞へ選択特異的に作用し
うることを示唆している。
アクラシノマイシン免疫グロブリン複合体との比較 本発明に用いたサイトロジンＳと構造が類似した次式
を有するアクラシノマイシンＡ の免疫グロブリンとの複合体を、実施例３に示した方法
により、比較のため作成したところ、サイトロジンＳが
抗体１分子あたり５〜12個付加することができるのに対
しアクラシノマイシンは２分子付加するにとどまった。
両抗体複合体のL1210に対するDNA合成抑制効果をトリチ
ウムで標識チミジンの細胞内へのとりこみ量で測定し
た。結果を第４図に示す。第４図からサイトロジンＳ複
合体の細胞に対する活性がアクラシノマイシン複合体の
ものより高いことがわかった。
【図面の簡単な説明】
第１図はサイトロジンＳ−免疫グロブリン複合体のUVス
ペクトルを示す。 第２図は、サイトロジンＳ（CYT）およびサイトロジン
Ｓ−ラビット免疫グロブリン複合体（CYT-Rab IgG）のL
1210細胞に対する細胞増殖抑制効果を示すグラフであ
る。 第３図はサイトロジンＳ（CYT）、サイトロジンS-MA 20
4免疫複合体（CYT-MA 204）、サイトロジンＳ−ラビッ
ト免疫グロブリン（CYT-Rab IgG）MA 204およびCYT-MA
204と過剰のMA 204の混合物のColo 205細胞株にする細
胞増殖抑制効果を示すグラフである。 第４図は、サイトロジンＳ、サイトロジンＳ−免疫グロ
ブリン複合体、アクラシノマイシンおよびアクラシノマ
イシン免疫グロブリン複合体のL1210細胞におけるトリ
チウムチミジンの取込率を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡崎 博 東京都調布市入間町３−９−11−402 (72)発明者 福田 昭男 東京都目黒区中目黒３−12−16 (72)発明者 ハンス・ゲルト・ベルシャイト ドイツ連邦共和国 デー−6231 シュヴア ルバッハ．ラインラントシュトラーセ21 (72)発明者 沼田 仁子 埼玉県川越市山田1760 (72)発明者 碓井 淳子 埼玉県所沢市上安松976−８ コーポスミ レ103号 (72)発明者 千田 俊二 埼玉県川越市南台３−７−22 日本ヘキス ト寮 (72)発明者 松尾 明彦 埼玉県所沢市並木７−１，８−403 (72)発明者 渡部 博 埼玉県比企郡鳩山町大字石坂1486−462 鳩山ニュータウン138−８ (72)発明者 黒羽 嚴夫 埼玉県狭山市狭山台２丁目１番地 ２街区 23号棟206号室

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（Ｉ） 〔式中Ｘは式-NH2、-NH-R1-NH2、-NH-R1-COOH、-NH-R1-
    SH、 または を有する基｛式中R1は２価の炭化水素基またはα−アミ
    ノ酸から誘導される２価の残基、R2は２価の炭化水素
    基、R3は２価の炭化水素基または式 または で表わされる基（式中、R1、R2およびR4は２価の炭化水
    素基を示す）、IgGは免疫グロブリン残基、ｎは１〜15
    の整数を示す｝を示す〕で表わされるサイトロジンＳ誘
    導体またはその塩。
  2. 【請求項２】R2がプロピレン基であり、R4がメチレン基
    である特許請求の範囲第１項記載のサイトロジンＳ誘導
    体。
  3. 【請求項３】ｎが５〜12である特許請求の範囲第１項ま
    たは第２項記載のサイトロジンＳ誘導体。
  4. 【請求項４】IgGが癌胎児性抗原（CEA）に対する抗体の
    残基である特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれかの
    項に記載のサイトロジンＳ誘導体。
  5. 【請求項５】一般式（Ｉ） 〔式中Ｘは式 を有する基｛式中R3は２価の炭化水素基または式 または で表わされる基（式中、R1、R2およびR4は２価の炭化水
    素基を示す）、IgGは免疫グロブリン残基、ｎは１〜15
    の整数を示す｝を示す〕で表わされるサイトロジンＳ誘
    導体またはその塩を含有する抗癌剤。
JP62074259A 1986-06-25 1987-03-30 サイトロジンｓ誘導体およびそれを含有する抗癌剤 Expired - Lifetime JPH0822869B2 (ja)

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NZ220805A NZ220805A (en) 1986-06-25 1987-06-23 Cytorhodin s derivatives,a process for their preparation and their use as medicaments
FI872783A FI872783A7 (fi) 1986-06-25 1987-06-23 Cytorodin s-derivat, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning som laekemedel.
PT85154A PT85154B (pt) 1986-06-25 1987-06-24 Processo para a preparacao de derivados da citorrodina s e de um agente anticancerigeno que os contem
CN198787104384A CN87104384A (zh) 1986-06-25 1987-06-24 作为药剂的细胞若丁s衍生物的制备及其应用方法
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