JPH06500110A - タンパク質及び色素の分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質及び色素の分離 本発明はタンパク質の精製に関する。この明細書において、“タンパク質”とい う用語は天然タンパク質、非天然タンパク質及びリガンド結合部位を有するほど 十分大きな他のポリペプチドを含み、“精製°という用語は所定レベルの純度を 付与するよりもむしろ“より純粋にする”ことを意味する。

天然源からの又は特に遺伝子工学処理された宿主細胞がタンパク質を産生ずる醗 酵培地からのタンパク質の分離において、タンパク質含有液体は固体支持体に結 合されたタンパク質結合化合物からなるクロマトグラフィーカラムに多くは通さ れる。タンパク質結合化合物はタンパク質上でリガンド結合部位に結合するが、 −万能の物質はカラムを通過して、タンパク質はより純粋な形でカラムから後で 溶出される。

しかしながら、少量部のタンパク質結合化合物及び／又はその一部分は時々タン パク質と共に溶出し、特にタンパク質が医療用である場合にはそのタンパク質か ら後で分離されねばならない。単純に架橋セファデックス［１？、Ｔ、Ｍ、ファ ルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］のカラムに色素を吸着させるという提案が以 前あった。

５ｃｏｐｅｓ、Ｒ，に、、ｉｎ　”Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 、ＰｒＩｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ“（タンパク質精製、原理及 び実施）（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ、Ｙ、、ｔｌＳＡ、２ｎｄ　Ｅ ｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ、Ｌ４Ｌ−１５７）は色素含有カラムからの溶出液中の微量 の色素がアニオン交換剤で除去されつると述べていたが、それがタンパク質であ るか又はアニオン交換剤と結合すべき色素であるかについては開示せず、破壊剤 の使用については言及しなかった。英国特許出願ＧＢ−Ａ第２　０５３　２９６ 号明細書はアフィニティ媒体からヒト血清アルブミンを溶出させるため特に塩化 ナトリウム及びカプリル酸ナトリウムを含有した緩衝液の使用について開示して いた。

しかしながら、当業者が行ったことは色素汚染問題が知覚されていようとなかろ うと次の処理前に塩及びカプリル酸塩を透析することであった。我々がここに発 見したことは、色素−タンパク質結合を壊すためアニオン交換剤プロセスと高塩 ／カプリル酸塩濃度の使用との組合せが所望タンパク質から色素の効率的な分離 を果たすことである。

したがって、本発明の一面によればタンパク質結合化合物とそれが結合できる又 は結合されたタンパク質を含有した水性液体からタンパク質結合化合物の一部又 は全部を除去するためのプロセスを提供するが、そのプロセスは（１）タンパク 質とタンパク質結合物質との結合を壊すため液体を破壊物質に接触させ；　（２ ）タンパク質結合物質を樹脂に結合させるため液体をイオン交換樹脂に接触させ ；及び（３）樹脂を液体から分離するステップからなる。

ステップ（１）及び（２）は同時であっても又は液体が樹脂と接触したときにそ れが破壊剤となおも接触されているように少くともオーバーラツプしていてもよ い。

ステップ（３）はタンパク質結合物質を比較的含有しないタンパク質の溶液が得 られるように樹脂のカラムに液体を通すことで通常実施される。

本プロセスはタンパク質精製に関して文献で開示されたような合成織物色素化合 物を除去する上で特によく適している。多くの（おそらく何千もの）このような タンパク質はこのような色素の使用により精製できる。１つだけの色素チバクロ ン・ブルー３−　Ｇ　Ａ　（Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ３−ＧＡ）を選ぶため 、これはキナーゼ、デヒドロゲナーゼとアデニル含有補因子、例えばＮＡＤＰ　 及びＮＡＤ”を要するほとんどの他の酵素を精製する上で使用できる。

このようなタンパク質としてはアルコールデヒドロゲナーゼ、アデニル酸シクラ ーゼ、アデニル酸キナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソ キナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒド ロゲナーゼがある。チバクロン・ブルー３−ＧＡ色素はこれら種類のタンパク質 と結合するが、ジヌクレオチド結合部位を有さないタンパク質を精製するためチ バクロン・ブルー３−ＧＡ色素を用いることも可能である。これらにはアルブミ ン、リポタンパク質、血液凝固因子、インターフェロン及びチロキシン結合グロ ブリンがある。これらの色素化合物はアニオン交換剤が本発明のプロセスで最も 適するケースにおいて通常アニオン性であるが、但し一部はカチオン交換剤が最 も適するケースにおいてカチオン性である。タンパク質結合化合物は好ましくは ポリスルホン化芳香族化合物であり、最も好ましくはトリアジン色素である。プ ロジオン・ブラウン（Ｐｒｏｃｉｏｎ　Ｂｒｏｗｎ）　Ｍ　Ｘ　−５：　Ｂ　Ｒ 、チバクロン争ブルー３−ＧＡ（ヒト血清アルビミンの分離に適する）５、プロ ジオン・レッドＨ−８８Ｎ（カルボキシペプチダーゼＧ２の場合）、プロジオン ・イエロー（Ｐｒｏｃｉｏｎ　Ｙｅｌｌ、ｏｖ、）ＭＸ−ＡＧ　（ＩＭＦデヒド ロゲナーゼの場合）、プロジオン・レッドＨＥ−３Ｂ　（乳酸デヒドロゲナーゼ の場合）、プロジオン・グリーン（Ｐｒｏｃｉｏｎ　Ｇｒｅｅｎ）　Ｈ−４’Ｇ ・（ヘキソキナーゼの場合）、プロジオン・ブルー（Ｐｒｏｃｌｏｎ　Ｂｌｕｅ ）Ｍ　Ｘ　−４Ｇ　Ｄ　（リンゴ酸デ１ドロゲナーゼの場合）、プロジオン・レ ッドＨ−３Ｂ（３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼの場合）及びプロジオン・ ブルーＭＸ−Ｒ（Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼの場合）が例である。これら及び他 は下記表で要約・されている：色素自体が（色素をカラムに付着させるために常 用されるスペ・−サーと共に又はそれなしで）汚染を起こすか又はその問題は色 素の誘導体もしくは色素の合成に用いられる中間体により起こされる。

カチオン交換剤としてはファルマシアのＳ及びＣＭソファ−ト・フロー（Ｐａｓ ｔ　Ｐｌｏｗ）がある。

アニオン交換剤としてはファルマシアのＤＥＡＥファースト・フロー及びＱファ ースト・フローがある。好ましくはマトリックスはダウエックス−１（Ｄｏｖｅ ｘ−１）であり、これは好ましくは２％架橋された乾燥メツシュサイズ５０〜１ ００の強塩基性アニオン交換樹脂である。通常、強アニオン交換剤は弱交換剤よ りも良い。

タンパク質はヒトアルブミンのような血清由来タンパク質、リポタンパク質、因 子Ｖ［Ｉもしくは因子ＩＫのような血液凝固因子、チロキシン結合グロブリン又 はα−インターフェロンである。好ましくは、タンパク質はヒトアルブミン（Ｈ Ａ）又は（欧州特許出願ＥＰ−Ａ第３２２０９４号明細書で記載されたような） 色素結合ドメインを留めたその変異体もしくは断片あるいはＨＡ又はその変異体 もしくは断片と他のタンパク質との融合体である。水性液体は醗酵培地又はその 分画をタンパク質結合化合物に接触させた直接的又は間接的結果物であることが 適切である；この関係における“間接的１とはタンパク質結合化合物との接触後 における醗酵培地が本発明のプロセスが適用される前に１以上のプロセスステッ プで処理してよいことを意味する。“醗酵培地″とは、我々はタンパク質を産生 できる生物の醗酵から得られる培地を意味する。生物（その用語は細胞系を含む ）はタンパク質を産生ずるために形質転換又はトランスフェクトされていること が好ましく、そのタンパク質はその生物に対して通常異種である。生物は細菌〔 例えば、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）又は枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔ１１１ｓ））　、酵 母菌〔例えば、サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏ■ｙｃｅｓｃｅ ｒｅｖｉｓｉａｅ））　、非酵母菌〔例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐ ｅｒｇｌｌｌｕｓ　ｎｌｇｅｒ）　］　、昆虫細胞〔例えば、スポドブテラ・フ ルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）　）　ｓ植物細胞 〔例えば、アトロバ・ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａｂｅｌ　Ｉａｄｏｎｎａ）の毛 根細胞培養物〕又は哺乳動物細胞〔例えば、ヴエロ（Ｖｅｒｏ）細胞〕である。

好ましくは、生物は酵母である。本発明の実施上有用と考えられる酵母属の例は ビチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サツカロミセス、クルイヴエロミセス（Ｋｌｕｙｖｅ ｒｏｗｙｃｅｓ）　ｓカンジダ（Ｃａｎｄｌｄａ）　、）ルロプシス（Ｔｏｒｕ ｌｏｐｓｊｓ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）　、シゾサツカロミセス（ Ｓｃｈｌｚｏｓａｃｃｈａｒｏｓｙｃｅｓ）　、シテロミセス（Ｃ１ｔｅｒｏｓ ｙｃｅｓ）　、パキシレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、デバロミセス（Ｄｅｂａ ｒｏｍｙｃｅｓ）　、メチｓニコウィア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｖｉａ）、ロ ードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌ ｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ） 　、スポリジオボルス（Ｓｐｏｒｌｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス（Ｅ ｎｄｏｗｙｃｏｐｓｉｓ）等である。好ましい属はピチア、サツカロミセス、シ ゾサツカロミセス、クルイヴエロミセス、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｖｌａ）及び ハンセヌラからなる群から選択される属であるが、その理由はこれら酵母のＤＮ Ａを取り扱える能力が前記能の属に関する場合よりも現在高度に発達しているか らである。

サツカロミセスの例はサツカロミセス・セレビシェ（特に好ましい）、サツカロ ミセス・イタリクス（ｉｔａｌｉｃｕｓ）及びサツカロミセス・ロウキシイ（ｒ ｏｕｘｉｉ）である。クルイヴエロミセスの例はクルイヴエロミセス中フラギリ ス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）及びクルイヴエロミセス・ラクチス（ｌａｃｔｌｓ）で ある。ハンセヌラの例はハンセヌラ・ポリモルフｙ　（ｐｏ＋ｙａｏｒｐｈａ） 、ハンセヌラ争アノマラ（ａｎｏｗａｌａ）及びハンセヌラ・カブスラタ（ｃａ ｐｓｕｌａｔａ）である。ヤロウィア・リポリチカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が 適切なりロウイア種の例であり、シゾサツカロミセス・ボムベ（ｐｏｉｂｅ）が もう１つの適切な酵母である。

組換えＤＮＡ技術で適切な宿主中に挿入された遺伝子から発現されるヒトアルブ ミンの産生は当業界で周知であり、ここでは説明を要しない。具体的な従来技術 プロセスの例としては欧州特許出願ＥＰ−Ａ第１４７　１９８号〔デルタ・バイ オテクノロジー （Ｄｅｌｔａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　）　、欧州特許出願ＥＰ−Ａ第 ２０１　２３９号（デルタ）、欧州特許出願ＥＰ−Ａ第６００５７号〔ジェネン テック（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）　）　、欧州特許出願ＥＰ−Ａ第８８　６３２号 （ジエネンテック）、欧州特許出願ＥＰ−Ａ第２５１　７４４号（デルタ）及び 欧州特許出願ＥＰ−Ａ第２８６　４２４号（デル゛り）明細書で記載されたもの がある。

同様に、醗酵培地からタンパク質を精製するためのプロセスも当業界で公知であ る。良い概説は”ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｌｆ’１ｃａｔｉｏｎ−Ｐｒｉｎｃｉｐ ｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ″　（タンノくり質精製−原理及び実施）、 ２ｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇａｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ。

Ｙ、）、特にｐｐ、１４１−１５７でみられる。

好ましくは、水性液体は１以上の分離（例えば、クロマトグラフィー）ステップ に醗酵培地を通して得る。

本発明のプロセスはタンパク質結合化合物が例えば醗酵培地又はその産物からタ ンパク質を精製するために用いられた場合にタンパク質結合化合物をタンパク質 か°ら分離する上で特によく適しているが、そのプロセスはあらゆる適切なタン パク質結合汚染物質をタンパク質から分離するためにも通常使用できることに注 目されるべきである。そのプロセスの利点は、それがタンパク質を樹脂に結合さ せる必要がなく、このため比較的多量のタンパク質が所定容量の樹脂に対して精 製されうることである。

破壊物質は単一化合物でも又は混合物であってもよい。

好ましくは、それは塩（好ましくは、塩化ナトリウム又は塩化カリウム）とタン パク質及びタンパク質結合化合物間の疎水性相互作用を壊す化合物、例えば（好 ましくは、非イオン系）界面活性剤、有機溶媒又は好ましくは脂肪酸との混合物 からなる。タンパク質との疎水性相互作用の代わりの破壊剤としてはＮ−アセチ ルトリプトファン及びマンデル酸があり、これらは通常それらの塩、例えばナト リウム塩として使用される。脂肪酸はオクタン酸が好ましいが、但し他の脂肪酸 （好ましくはＣｓ　−Ｃ１ｏ及び好ましくは飽和）も用いてよい。脂肪酸は通常 その塩、例えばナトリウム塩の形で存在する。塩及び脂肪酸の濃度は該当する具 体的なタンパク質とタンパク質結合化合物に適合するように変えてよい。通常０ ．１〜３Ｍ、好ましくは０．５〜２．０Ｍの塩濃度が有用である。通常１０〜１ ００１阿、好ましくは２５〜６０１ｘ１最も好ましくは約５０ｍＭの脂肪酸濃度 が有用である。破゛壊物質が単一化合物である場合には、これら物質のいずれも 使用してよい。

イオン交換樹脂と接触される液体はタンパク質結合化合物含有カラムからタンパ ク質を溶出させるために用いられる緩衝液から通常大部分なる。それには破壊物 質又はその成分も加えてよい。例えば、溶出緩衝液がｐＨ７，０の５０５Ｍリン 酸緩衝液中に２Ｍ　ＮａＣ１を含有する場合、更に塩を加えることは不要であり 、脂肪酸のみが加えられる。ｐＨは所望であれば変えることができる。我々は約 ７．０のｐＨが適するが、但し通常５．０以上であればいかなるｐＨであっても あらゆる脂肪酸に適用しうることを発見した。

ｐＨは好ましくはタンパク質結合化合物が荷電されるようなｐＨであるべきであ る；例えばほとんどのポリスルホン化トリアジン色素はｐＨ２〜３以上で負に荷 電される。液体が緩衝液を含有することは常に必要というわけではない。

タンパク質及びタンパク質結合化合物の混合物をイオン交換樹脂及び破壊物質と 接触させる最も便利な手段は破壊物質を混合物に加え、しかる後得られた液体を イオン交換樹脂のカラムに通すことである。これは用いられる緩衝液及び樹脂の 量と失われるタンパク質の量を最少に抑える。しかしながら、最初にタンパク質 ／タンパク質結合化合物混合物を樹脂に接触させ、しかる後タンパク質を破壊物 質含有緩衝液で溶出させることも技術的に可能である。樹脂のより大きなカラム が通常このような態様で要求され、その際にはおそらく単純に捨てられるよりも むしろ適切な酸及び溶媒で厳重に洗浄されねばならないであろう。

カラムは慣用的な直線タイプでも又は半径流カートリッジであってもよい。

本発明は次に例により図１を参照して説明されるが、図１はヒトアルブミンを精 製するためカラムで使用できる織物色素（チバクロン・ブルー３−ＧＡ）及びス ペーサー（４−アミノブチル基）の構造について示す。

例Ｉ ＨＡ含有醗酵培地を精製カラムに通す産物のモデルとして、ヒト血清アルブミン の３１ｇ／ｓｌ溶液を２ＭＮａＣ１、ｐＨ７，０の５０ｍＭリン酸緩衝液中で調 製し、スペーサーに共有結合されたチバクロン・ブルー色素（図１）２１μｇ／ ａｔを加えた。その色素は色素分子をマトリックスに付着させるために用いられ るスペーサーと更に色素合成中間体を含有していた。疎水性相互作用の破壊剤と してＩＭオクタン酸ナトリウムを加え、５０＋ｇＭの濃度とした。次いでこの溶 液（２０ｍｌ）をダウエックス−１樹脂〔２％架橋；ダウケミカル社（Ｄｏｖ　 ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、）］の１１カラムに流速０　、　５　ｍｌ／ｓｉｎで通 した。ＨＡからブルー色素の除去は６２０　ｎｍでスペクトル測定した。

これらの条件下で、ブルー色素の約９７％が樹脂に結合した。カラムを通過した 未結合分画はカラムに適用されたＨＡの９７％以上を含有していた。

例２ 例１の操作後、ＨＡからの色素除去効率を緩衝液、２ＭＮａＣ１，カプリル酸塩 及びこれら成分の組合せの存在下で評価した。表１の結果かられかるように、塩 及び脂肪酸の組合せは個別的成分よりもかなり有効であつた。

Ａ　５０ｏ＋Ｍリン酸塩　ｐＨ７，０１９Ｎ／ＤＢ　５ｈＭリン酸塩＋　３２　 Ｎ１０ ＭＮａＣＩ Ｃ５０ｍＭリン酸塩＋　４６　Ｎ／Ｄ ５０ＩＩＭカプリル酸塩 Ｄ　組合せ（Ｂ　＋　Ｃ）　９７　９８Ｎ／Ｄ−測定せず 例３ 例２の比較をスペーサーに共有結合された千ノくクロン・ブルー３−ＧＡ（ブル ー）、プロジオン・グリーンＨ−４Ｇ（グリーン）、プロジオン・ブラウンＭＸ −５ＢＲ（ブラウン）及びプロジオン◆し・ソドＨＥ−３８（レッド）色素を用 いて繰り返した。結果は表２で示されてＢ　３２　４１　９３　５７ Ｃ４Ｂ　４５　９０　８３ Ｄ　９７　８５　８９　９２ Ａ−Ｄは表１のとおり 帆Ａ 例２の実験を異なるタンパク質で繰り返した。結果は表３で示されている。アル カリホスファターゼをブルー又はレッド色素と混ぜた。

４■　ＩＳＡフェリンＡ叶　卦　ＡＰ／ブルーＡＰ／し・ソドＡ　１９　８６　 Ｎ／ＤＮ／Ｄ　５２　Ｎ／ＤＢ　３２　Ｎ／Ｄ　４２　７３　８０　６３Ｃ４６ Ｂ７　７２９６　８０　７１ Ｄ　９７　８１　９４９１　８４　９２Ａ−Ｄは表１のとおり ＧＫ−グリセロキナーゼ ＡＤＨ−アルコールデヒドロゲナーゼ ＡＰ−アルカリホスファターゼ Ｎ／Ｄ−測定せず Ｆ工ＧＵＲＥ　１ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）鴫 平成５年３月４日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質結合化合物とそれが結合できる又は結合されたタンパク質を含有 した水性液体からタンパク質結合化合物の一部又は全部を除去するための方法で あって、 （１）タンパク質とタンパク質結合物質との結合を壊すため破壊物質に接触させ る；（２）タンパク質結合物質を樹脂に結合させるため液体をイオン交換樹脂に 接触させる；及び（３）樹脂を液体から分離するステップからなる方法。
2. ２．タンパク費結合化合物が合成織物色素又はその中間体もしくは誘導体である 、請求項１に記載の方法。
3. ３．タンパク質結合化合物がトリアジン色素又はその中間体もしくは誘導体であ る、請求項２に記載の方法。
4. ４．イオン交換樹脂が弦塩基性アニオン交換樹脂である、請求項１〜３のいずれ か一項に記載の方法。
5. ５．タンパク質がヒトアルブミン（ＨＡ）又は色素結合ドメインを留めたその変 異体もしくは断片あるいはＨＳＡ又は上記変異体もしくは断片と他のタンパク質 との融合体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. ６．破壊物資が塩と、タンパク質及びタンパク質結合化合物間の疎水性相互作用 を壊す化合物との混合物からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ７．疎水性相互作用を壊す化合物が脂肪酸又はその塩である、請求項６に記載の 方法。
8. ８．タンパク質及びタンパク質結合化合物の混合物が破壊物質と混ぜられ、しか る後得られた液体がイオン交換樹脂のカラムに通される、請求項１〜７のいずれ か一項に記載の方法。
9. ９．液体が破壊物質しかる後イオン交換樹脂に接触される、請求項１〜８のいず れか一項に記載の方法。
10. １０．（１）タンパク質が産生されるようにタンパク質を産生できる生物を醗酵 させる； （ｉｉ）ステップ（ｉ）から得られたタンパク質含有醗酵培地又はそこから誘導 され上記タンパク質を含有した液体を固定されたタンパク質結合化合物に接触さ せる；（ｉｉｉ）固定されたタンパク質結合化合物からタンパク質を分離する； 及び （ｉｖ）タンパク質と会合したあらゆるタンパク質結合化合物のうち少くとも一 部を除去するためステップ（ｉｉｉ）からのタンパク質を請求項１〜８のいずれ か一項に記載された方法に付す； ことからなるタンパク質の製造方法。
11. １１．請求項１〜１０のいずれか一項に記載された方法により得られたタンパク 質。