JPH03505401A

JPH03505401A - 組換えタンパク質の培養培地への熱放出

Info

Publication number: JPH03505401A
Application number: JP1507967A
Authority: JP
Inventors: フィンケルマン，マルコルム・エー・ジェイ; リー，ティモシー・クオック―ティム
Original assignee: ジェネックス・コーポレーション
Priority date: 1988-06-27
Filing date: 1989-05-05
Publication date: 1991-11-28
Also published as: EP0422124A1; WO1990000200A1; EP0422124A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称組換えタンパク質の培養培地への熱放出発明の分野本発明は、組換え微生物から実質的に純粋なポリペプチドを単離する方法に関する。

発明の背景外来遺伝子を発現させるための微生物の使用は、タンパク質加水分解によるポリペプチドの不安定性、低レベルの発現、およびタンパク質産物の沈降を含む多くの実際的および生物学的な問題に直面している。沈降は、精製後のタンパク質の間違った折り畳みおよび生物学的活性の欠如に関係している。これらの問題を解決するために、種々の方法が開発され、形質転換宿主による遺伝子産物の発現が高められている。これらの方法には、発現レベルを調節するために種々のプロモーターを使用すること、通常は細胞中で不安定なタンパク質を安定化するために遺伝子融合体を使用すること、およびタンパク質を細胞質から細胞周辺腔に転移させるためにシグナルペプチドを使用することが含まれる。例えば、Ａ　ｂｒａｈａｍｓｅｎ、　Ｌ　、ら［欧州特許出願公開Ｎｏ、　０．２２５．８６０（１９８７年６月１６日公開）］は、所望の遺伝子産物の発現が熱シヨツク応答に左右される線状増殖の誘導によって大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）からシグナル配列を有する発現遺伝子産物を単離する方法を開示している。この応答は、３０〜４２℃ の温度で細胞周辺腔に存在するタンパク質が増殖培地に定量的に漏出する結果になる。これらの条件を用いるプロティンＡの高い発現および移送が報告されている。しかし、この方法はプロティンＡに融合させたシグナル配列をコードしている遺伝子に対して有用であるにすぎない。従って、これは全ての遺伝子に対して広く適用することができるというものではない。

通常、宿主細胞によって産生されたタンパク質は細胞内に閉じ込められるか、または周囲の増殖培地中に分泌される。前者の場合には細胞を破壊して所望のタンパク質の単離が可能になるようにしなければならず、一方、後者の場合にはそれを増殖培地から分離することができる。分泌されたタンパク質の場合であっても、タンパク質を単離しようとする調製物は比較的複雑であり、種々の他の物質を含んでいる。効率的な分離方法であるにもかかわらず、所望のタンパク質の純度および収率は低いことがある［Ｌ　ｏｆｄａｈｌ、　Ｓ　、ら、ＰＣＴ出願、公開番号Ｗ０８４１０３１０３．１９８４年８月１６日公開］。

Ｌ　ｏｆｄａｈｌら（上記）は、プロティンＡをコードしているＤＮＡ配列に機能的に連結させた所望のタンパク質またはポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有する組換えベクターを構築することによって、所望のタンパク質またはポリペプチドを選択的に単離する方法を開発した。次いで、発現させた融合タンパク質を、プロティンＡと結合するＩｇＧ支持の担体に吸収させ、続いて融合タンパク質を膜吸収させることによって選択的に単離する。次に、この融合タンパク質を、切断試薬（プロテアーゼ類、ヒドロキシアミン、臭化シアンあるいはギ酸を含む）を用いて唯一の切断部位で切断して精製されたタンパク質を得る。

上記の組換え法によって得られたポリペプチドを単離する方法にかかわらず、実質的に純粋なポリペプチドを選択的に産生させる方法が必要とされ続けている。

発明の要約本発明は、組換え宿主によって発現された実質的に純粋なポリペプチドの単離方法であって、（ａ）該ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有し、該宿主によって認識され該ＤＮＡ配列を発現させる発現シグナルをさらに含有するベクターで形質転換された微生物を、組換えタンパク質産生の条件下、水性栄養培地で培養し：（ｂ）１時間を越えない時間、該水性栄養培地を５０〜１００℃に加熱して、宿主から実質的に純粋なポリペプチドを放出させ；そして（Ｃ）該水性栄養培地から実質的に純粋なポリペプチドを回収すること；を特徴とする方法に関する。

予想外にも、組換え宿主を１時間を越えない時間、５０〜１００℃に加熱すると高レベルの実質的に純粋なポリペプチドが増殖培地に放出されることを発見した。この方法は、Ａ　ｂｒａｈａｍｓｅｎら（上記）が教示しているような宿主の線状増殖によるものではなく、事実、７０〜８０℃でほとんど即時かつ完全に細胞が死ぬ結果になる。

図面の説明第１図は、ポリアクリルアミド電気泳動によって分離したプロティンＧの全細胞大腸菌抽出物のデンシトメトリー・スキャンを示すものである。

第２図は、プロティンＧをコードしている遺伝子を含有するベクターで形質転換された大腸菌を含む水性栄養培地を５分間、８０℃に加熱した後に、ポリアクリルアミド電気泳動によって分離した上清のデンシトメトリー・スキャンを示すものである。主ピークはプロティンＧである。

好ましい態様の説明本発明は、タンパク質を産生ずる条件下で宿主を培養し、水性栄養培地を５０〜１００℃に１時間を越えない時間加熱し、そしてそのようにして得られた実質的に純粋なポリペプチドを単離することによって、組換え細菌宿主から実質的に純粋なポリペプチドを単離するための方法に関する。゛さらに長い加熱時間およびさらに高い温度を用いることもできるが、これらのさらに苛酷な条件のもとではタンパク質の分解が起こるので好ましくない。

好ましい細菌宿主には、ダラム陰性生物、特に大腸菌、Ｅｒｗｉｎｉａ種およびに１ｅｂｓｉｅＬ１ａ種が含まれる。最も好ましい宿主は大腸菌である。

水性栄養培地を５０〜１００℃で約５分間加熱するのが好ましい。

水性栄養培地を約８０℃で約５分間加熱するのが最も好ましい。最も好ましい条件下では、実質的に純粋なポリペプチドが有意の分解を伴わずに培養培地中に放出される。この方法は、内生のプロテアーゼが本方法の高温で不活性化され、従ってポリペプチドのタンノくり負加水分解が妨げられるという別の利点を有している。

「ポリペプチド」なる用語は、プロティンＧもしくはプロティンＧの免疫グロブリン結合性を有するプロティンＧ変異体、プロティンＡもしくはプロティンＡの免疫グロブリン結合性を有するプロティンＡ変異体、および本発明の方法によって実質的に純粋な形態で産生されうるポリペプチドであって、５０〜１００℃で不可逆的に変性せず、かつ加熱工程中に細胞壁を貫通することができる任意のペプチドを包含するものとする。このようなタンパク質には、ホルモンなどの小さいタンパク質、例えば副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、ガナドトロピン類（Ｆ　Ｓ　Ｈ，黄体形成ホルモン、絨毛膜生殖腺刺激ホルモン）、インスリン、ＡＣＴＨ，プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、メラニン細胞刺激ホルモン、チロトロピン、カルシトニン、エンケファリン、アンギオテンシン、および小さいサイト力イン類が含まれるが、これらに限定はされない。

好ましい態様では、組換え微生物はプロティンＧをコードしている遺伝子を含有するベクターを含んでいる。プロティンＧおよびプロティンＧの免疫グロブリン結合性を有するプロティンＧ変異体をコードしている遺伝子を含有するベクターは、例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８７１００３２９、同時係属の米国出願Ｎｏ、　０６３．９５９（１９８７年６月１９日出願）、および同時係属の米国出願Ｎｏ、　２０９．２３６（１９８８年６月２０日出願）［これらの開示の全体は本明細書の一部を構成するコに記載されている。これらのベクターは、例えばバクテリオファージ（特に、バクテリオファージλ）、大腸菌のトリプトファンオペロン、大腸菌のｌａｃオペロン、大腸菌のβ−グルクロニダーゼ遺伝子座などから導かれるプロモーターを含有していてもよい。同時係属の米国出願Ｎｏ、　０６３．９５９に開示されている適当な組換え宿主には、大腸菌ＧＸ７８２０、大腸菌ＧＸ７８２３、大腸菌ＧＸ８４６４、および大腸菌ＧＸ８４６５が含まれる。最も好ましい産生微生物は、ベクターｐＧＸ５２０４またはその同義変異体を含有する形質転換宿主である大腸菌ＧＸ１２０１または大腸菌ＧＸ６７０５である。

本発明の方法によって、高レベルの実質的に純粋なポリペプチドを、それを容易に発酵ブロスから単離しうる状態で得ることができる。「実質的に純粋な」なる用語は、５ＤＳ−ＰＡＧＥポリアクリルアミド電気泳動で実質的に１つの主バンドであり、他の小さいバンドの存在によって示されるように、通常は全細胞溶解液を不純なものにしている他のタンパク質を少量しか含んでいないポリペプチドを意味する。

組換え細胞は、細胞増殖を維持する炭素、窒素および必須無機物の同化可能な供給源を含む任意の適当な栄養培地中、任意の生理学的に適合しうるｐＨおよび温度条件下で培養することができる。組換えタンパク質を産生ずる培養条件は、宿主細胞の形質転換に用いたベクターの種類に従って変わるであろう。例えば、ある種の発現ベクターは、組換えポリペプチドが産生される結果になる遺伝子発現を開始させるために、細胞増殖培地へのある種の化学物質の添加またはある温度での細胞増殖を必要とする調節領域を含有している。

即ち、本明細書中で用いる組換え「タンパク質を産生ずる条件」なる用語は、いずれかの一群の培養条件に限定されることを意味するものではない。

発現されたタンパク質は、当業者には普通に知られている任意の方法を用いて発酵ブロスから回収することができる。第１段階として、死んだ細胞および不溶性の残骸を濾過または遠心によって水性栄養培地から除去する。次いで、プロティンＧまたはその他の組換えタンパク質を、固定化した免疫グロブリンへの吸収［Ｓ　ｊｏｑｕｉｓｔが米国特許Ｎｏ、　３．８５０．７９８（１９７４）ニ記載しテイルヨウナ］、イオン交換もしくはゲルクロマトグラフィー、沈澱（例えば、硫酸アンモニウムによる）、透析、濾過、またはこれらの方法の組合せなどの常法を用いて発酵培地から精製することができる。

本発明の方法は、リーダー配列を有するポリペプチドの発現に限定されない。さらに、本発明は、Ａ　ｂｒａｈａｍｓｅｎら［欧州特許出願０，２２５、８６０］が開示しているような大腸菌の線状増殖の誘導に依存するものではない。細胞の死は７０〜８０℃で加熱することによって完結する。即ち、このような温度での線状の増殖の誘導は不可能である。さらに、５分程度の短い時間、発酵培地が５０〜１００℃に加熱されるので、意味ある生理学的に関連した形態学的変化のための時間はほとんどない。

いずれかの特定の理論に結び付けられることを望むものではないが、５０〜１００℃での加熱によって得られる発現遺伝子産物の驚くべき純度レベルは透析様の効果によるものと仮定される。熱処理によって膜の完全性が完全に失われるときにそのような効果が予想されるであろう。本発明の実施の際に使用する温度が細胞質および外側の細胞膜の完全な破壊を引き起こすと予想されるので、細胞内容物の放出の唯一の残存する障壁は細胞エンベロープのペプチドグリカン（ＰＧ）層であろう。原形質内容物は、熱変性および凝結の結果としてＰＧ障障壁−閉じ込められる可能性が高い。この理論は、熱処理後の顕微鏡観察による４集した顆粒状の細胞質物質の観察によって支持される。可溶性のポリペプチド、例えばプロティンＧは、透析様の機序によって有意に妨げられることなくＰＧ層から拡散する。即ち、本発明に従って回収しうるポリペプチドは、上に挙げたように、加熱によって変性せず、可溶性のままであるものである。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例】　実質的に純粋なプロティンＧの調製プロティンＧの免疫グロブリン結合性を有するプロティンＧ変異体をコードしているベクターを含有する組換え大腸菌（：ＧＸ８４６５；米国出願Ｎｏ、　０６３．９５９（１９８７年６月１９日出願）を参照；本明細書の一部を構成する］を、３２℃、８００ｒｐｍ、　ｌ　ｖｖｍＳｐＨ７，２±０．１（滴定液＝１０％ＮａＯＨ，２Ｍ　Ｈ３Ｐ０４）の水性栄養培地（第１表参照）中で培養した。３２℃で６〜１２時間培養した後、１時間、４２℃にブロス温度を上げることによって組換えプロティンＧの発現を誘導した。４２℃で１時間の後、ブロス温度を３９℃まで下げ、この温度に３時間維持した。第１図に示すように、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による全細胞抽出物の分離とそれに続くゲルのデンシトメトリー・スキャンは、この抽出物が他のタンパク質によってかなり汚染されていることを示す。次いで、このブロスを８０℃に加熱し、この温度に１時間維持した。ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析用に定期的に試料を採取した。細胞ペレットおよび細胞不含の培地の両方について、８０℃の加熱の０１１５．３０および６０分後に分析した。

加熱前には、ペレットはかなり不純なプロティンＧを含有していた。この時点では、発酵培地中にプロティンＧは検出されなかった。

時間＝０（温度が８０℃に達したとき）で、かなりの実質的に純粋なプロティンＧのバンドが細胞不含の培地中に見い出された。対応する細胞ペレットはプロティンＧ量の減少を示した。時間＝１５では、痕跡量のプロティンＧのみがペレット中に残存していた。３０分後には、ペレット中にプロティンＧを検出することができなかった。

対照的に、８０℃で１５分間加熱した後には、実質的に純粋なプロティンＧが上溝中に観察された。上清中のプロティンＧの相対的な純度は、８０℃で１時間の継続加熱の後に実質的に低下することはなかった。しかし、プロティンＧバンドが不鮮明になることから明らかなように、８０℃で３０分の後にはある種の化学的変化が観察された。

このように、８０℃で加熱すると、実質的に全てのプロティンＧが上清中に放出され、、その他のタンパク質が細胞中に保持される結果になる。

第１表発酵培地の組成成分　　　　　　　濃度酸消化カゼイン　　　　　　　　　　３０ｇ／１本グルコース　　　　　　　　　　　　　　３０ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４５ｇ／１（ＮＨ４）ｚｓｏ４　　　　　　　　　　　　　　　　　３ｇ／ｌＭｇ５（Ｌ　 ”　　７Ｈ２００，２５ｇ／ｌＣａＣｌ２・　２ＨｇＯＯ，Ｉｇ／ＩＭ４４塩（１００Ｘ）　　　　　　　　　１０ｍｌ／１本ビオチン　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｇ／１本ニコチンアミド　　　　　　　　　　　　１．Ｏｍｇ／１本アンピシリン　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ／ｌ蒸留Ｈ２０１３６０ｍ１まで希釈５ＡＧ４１３０　　　　　　　　　　　０．２５ｍ１／１本＝オートクレーブ処理後の添加実施例２７０℃でのプロティンＧの放出８０℃の熱処理に代えて７０℃の熱処理を用いて実施例１の実験を繰返し、プロティンＧの放出を誘導した。この温度では、プロティンＧのブロスへの放出は完全ではないようであった。実質的に純粋ではあるが、ポリアクリルアミド電気泳動ゲルでの不鮮明なバンドから明らかなように、７０℃での長期の加熱の後にはプロティンＧは分解するようである。

実施例３８０℃で５分間のプロティンＧの放出８０℃での保持時間を約５分間に短縮することを除いて実施例１を繰返した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（第２図）によって観察されるように、この短い暴露によって実質的に純粋なプロティンＧの実質的に定量的な放出が得られた。さらに、長期の加熱によるプロティンＧの見掛けの分解（ゲル上のプロティンＧのバンドが広くなることによって示される）は大きく減少した。

実施例４実質的に純粋なプロティンＡの調製プロティンＡをコードしているベクターを含有する組換え大腸菌［菌株ＮＲＲＬ１５９１０；米国特許Ｎｏ、　４．６９１．００９］を、３７℃、８００ｒｐｍ、１００分、ｐＨ７，２±０．１（滴定液：１０％ＮＨ４ＯＨ，２Ｍ　Ｈ３Ｐ０４）の水性培地（第２表参照）中で培養した。増殖が均一になった後、ブロスを８０℃に５分間加熱し、次いで３０ ℃まで冷却した。組換えプロティンＡの分布の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、加熱前にはプロティンＡは細胞中に存在し、上清中には極めて少量しか検出することができないことが示された。８０℃に加熱した後には、実質的に全てのプロティンＡが細胞から放出され、実質的に純粋な形態でブロス上清中に存在した。

即ちミ８０℃で熱不活性化すると、プロティンＧの場合と同様に、実質的に全てのプロティンＡが上清中に放出され、その他のタンパク質が細胞中に保持される結果になる。

成分　　　　　　濃度トリプトン　　　　　　　　　　　　　　３０ｇ／ｌ酵母エキス　　　　　　　　　　　　１０ｇ／ＩＫ、ＨＰＯ４５ｇ／１（ＮＨ４）２Ｓ　Ｏａ　　　　　　　　　　　３ｇ／ｌＭｇ５０４　”　７　Ｈ２Ｏ０，２５ｇ／　ｌＣａＣｌ２”　２Ｈ２００，１ｇ／ＩＭ４４塩（１００Ｘ）　　　　　　　　１０ｍ１／１上記に本発明の詳細な説明したが、本発明の範囲あるいはそのいずれかの態様に影響することなく、広範囲かつ等価な条件、配合およびその他のパラメーター内で本発明を実施することができることは当業者の認めるところであろう。

圧Ｄオ丁牧）〜ジス−千〇β丁ｇ危ｑりと国際調査報告ＰＣＴ／υ５８９１０１９１７

Claims

【特許請求の範囲】

１．組換え宿主によって発現された実質的に純粋なポリペプチドの単離方法であって、（ａ）該ポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列を含有し、該宿主によって認識され該ＤＮＡ配列を発現させる発現シグナルをさらに含有するベクターで形質転換された宿主を、組換えタンパク質産生の条件下、水性栄養培地で培養し；（ｂ）１時間を越えない時間、該水性栄養培地を５０〜１００℃に加熱して、宿主から実質的に純粋なポリペプチドを放出させ；そして（ｃ）該水性栄養培地から実質的に純粋なポリペプチドを回収すること；を特徴とする方法。
２．回収が、水性栄養培地から死んだ細胞および不溶性の残骸を除去することからなる請求項１記載の方法。
３．宿主がグラム陰性細菌である請求項１記載の方法。
４．宿主が大腸菌、Ｅｒｗｉｎｉａ種およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ種からなる群がら選ばれる請求項１記載の方法。
５．宿主が大腸菌である請求項１記載の方法。
６．ポリペプチドが、プロテインＧもしくはプロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するその変異体、またはプロテインＡもしくはプロテインＡの免疫グロブリン結合性を有するその変異体からなる群から選ばれる請求項１記載の方法。
７．ベクターが、プロテインＧもしくはプロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するその変異体をコードしているＤＮＡ配列を含有する請求項１記載の方法。
８．ベクターがｐＧＸ５２０４である請求項７記載の方法。
９．宿主が、プロテインＡをコードしているベクターを含有する大腸菌株ＮＲＲＬ１５９１０である請求項１記載の方法。
１０．水性栄養培地を８０℃で約５分間加熱して宿主から実質的に純粋なポリペプチドを放出させる請求項１記載の方法。
１１．組換え宿主によって発現された実質的に純粋なプロテインＧまたはプロテインＧの免疫グロブリン結合性を有するその変異体の単離方法であって、（ａ）プロテインＧをコードしているＤＮＡ配列を含有し、該宿主によって認識され該ＤＮＡ配列を発現させる発現シグナルをさらに含有するベクターで形質転換された宿主を、組換えプロテインＧ産生の条件下、水性栄養培地で培養し；（ｂ）１時間を越えない時間、該水性栄養培地を５０〜１００℃に加熱して、宿主から実質的に純粋なプロテインＧを放出させ；そして（ｃ）該水性栄養培地から実質的に純粋なプロテインＧを回収すること；を特徴とする方法。
１２．宿主が大腸菌である請求項９記載の方法。
１３．ベクターがｐＧＸ５２０４である請求項９記載の方法。
１４．組換え大腸菌によって発現された、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有する実質的に純粋なプロテインＧ変異体の単離方法であって、（ａ）ベクターｐＧＸ５２０４で形質転換された大腸菌を、組換えプロテインＧ産生の条件下、水性栄養培地で培養し；（ｂ）１時間を越えない時間、該水性栄養培地を５０〜１００℃に加熱して、該大腸菌から実質的に純粋なプロテインＧを放出させ；そして（ｃ）該水性栄養培地から実質的に純粋なプロテインＧ変異体を回収することを特徴とする方法。
１５．組換え大腸菌によって発現された、プロテインＧの免疫グロブリン結合性を有する実質的に純粋なプロテインＧ変異体の単離方法であって、（ａ）ベクターｐＧＸ５２０４で形質転換された大腸菌を、組換えプロテインＧ産生の条件下、水性栄養培地で培養し；（ｂ）該水性栄養培地を約８０℃で約５分間加熱して、実質的に純粋なプロテインＧ変異体を放出させ；そして（ｃ）該水性栄養培地から実質的に純粋なプロテインＧ変異体を回収すること；を特徴とする方法。