JPH06500128A - 免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム及びそれを含有するワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム及びそれを含有する ワクチン 本発明は免疫刺激及び免疫増強性再構成インフルエンザウイロソーム（ＩＲＩＶ ｓ）及びそれを含有するワクチンに関する。

免疫原性を増大させるための多くの種類の手法が膨大な経験的要素を留保する手 段に基づいて数十年にわたって開発されてきた。最も有力な方法（例えば、フロ イントの完全アジュバントと一緒に免疫原を投与する方法）は、思量の段に説明 する多（の種々の原理が組み合わされている：粒子は可溶性抗原ｊりもマクロフ ァージに＝引されやすく、抑制で＝＜免疫の（Ａ）　抗原粒子の作製 はうにそのバランスか傾いている。粒子の生成は、単純な熱誘導凝集、そして巧 みなポリマーイｉ工糧、例えばＢ型肝炎ウィルスの可溶性抗原などの抗原の自己 凝合、例えばミョウバン沈降物では、粒子形成の効果とゆっ（すした吸着の効果 との組合わせ作用が存在する。

（Ｂ）註魅聾　２− 長い歴史のある研究は、死滅ミコバクテリウム・ラベルクロシス（ｉｉｙＣｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌ’ｏｊｉｓ）菌、又は大腸菌ＬＰＳなどの 毒性の微生物抽出物によって達成され得る全免疫応答の増強を模擬する純粋、安 全、有効、かつ非毒性の小さな有としては未だ見いだされておらず、毒性と効能 とを断絶させるの、は困−である。

例えば、ＩＬ−２を抗稈と共１°同時投与すると・抗原及Ｕ！、＞９．’７ｏイ “′をす幾つかの証拠がある；　５ｔａｒｕｃｈ、　Ｍ、　Ｊ、及びｆｏｏｄ、 　Ｄ、　Ｄ、のＪ、　Ｉ＋ｕｕｎｏ１．１３０（１９８３）、　２P９ １を参照のこと。このアプローチがヒトにおける免疫計画に活用できるようにな る以前には、さらに膨大な調査が必要とされた。しかし、以下の段で説明する教 示から、これは陳腐なものになったようである。

（Ｄ）　免疫原の放出の減速化 大量の純粋タンパク質抗原を突然に適用することは免疫応答の抑制経路を活性化 させる危険性を包含し、静脈内経路を使用する場合には特にその危険性を内包す る。Ｎｏ５ｓａ１．　Ｇ、　Ｊ、　Ｖ、のＮｅｗ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｖａ ｃｃｉｎｅｓ、　Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　ＩｎｃAニューヨ ーク、バーゼル（Ｔｏｏｄｒｏｖ、　Ｌｅｖｉｎｅ編）、　（１９９０）　８５ を参照のこと。皮下貯蔵部位からゆっくりと放出させれば、広範に点在する樹状 細胞及びマクロファージに抗原が膨大にアクセスされ、またそうすれば、クロー ン増殖の最初の爆発後も抗原は依然として利用可能であり、二次応答のある種の 局面が提供されることになる。ゆっくりした放出は水酸化アルミニウムに抗原を 吸着させること（ミョウバン沈降物）：抗原を油中水エマルジョンに入れること ：抗原をリポソームに組込むこと；及び他の同様な操作によって行われる。この 方法は、Ａ項で説明している方法と概念的に近似している。

（Ｅ）　抗原と高度に免疫原性な物質との同時投与ある具体的なワクチンが高度 に免疫原性であれば、特定の免疫経路に向かう応答を導（ために有しているかも しれないこのワクチンのアジュバント効果及びその特性も「過剰となり（ｓｐｉ ｌｌ　ｏｖｅｒ）Ｊ　、それと同時に投与した抗原に対する応答をも導く場合が ある。例えば、死滅ポルデテルラ・ベルラスシス（ｋｉｌｌｅｄ　Ｂｏｒｄｅｔ ｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はコリネバクテリウム・バルバム（Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）細菌は強力な免疫原である：純粋なタ ンパク質を同じ注射で投与すれば、それに対する応答が増大する。ある種の免疫 原は（理由不明であることから）特定の方向下で応答を導く。例えば、Ｎｉｐｐ ｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓなどの寄生虫の抽出物は強 力なＩｇＥ応答を誘起させる。寄生虫抽出物と同時投与した純粋なタンパク質も ＩｇＥ応答を誘起する；　Ｎｏ５ｓａ１．　Ｇ、　Ｊ、　Ｖ、のＮｅｗ　Ｇｅｎ ｅｒａｔｉｏｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ、　１ｌａｒｃｅｌ@Ｄ ｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、　ニューヨーク、バーゼル（ｆｏｏｄｒｏｖ、Ｌｅｖｉ ｎｅｉｉｉ）、　（１９９０）　８５を参照のこと。

おそら（、この効果は、特定の物質によって引き起こされる特定のリンホカイン 産生に幾分関連しているであろう。ＩＬ−４などのリンホカインはアイソタイプ スイッチのパターンを導く。リンホカインのポリクローナル活性化特性も一般に は免疫応答の強化の基礎をなすものである。

（Ｆ）　重要な抗原の遺伝子の運搬体としての遺伝子操作された微生物抗原遺伝 子の運搬体としての遺伝子操作された微生物の概念については、Ｐａｎ１はワク ンニアウイルスのゲノムを遺伝子操作して、種々の病原体の重要な宿主保護抗原 をコードする遺伝子をさらに含有させた。これらは、ワクシニアウィルス粒子及 び抗原と共に感染させた細胞によって合成される。この概念の改良が、１．ａｎ ｇｆｏｒｄ、　Ｃ，Ｊ、、Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｓ、　Ｊ、　、　Ｓｍ１ｔｈ、　 Ｇ、　Ｌ、ら［１１ｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１２　i１９８６）、３１９ １］に よって導入された。細胞表面関連抗原は強いＴ細胞応答を分泌抗原よりも誘起さ せ易いという考えから、彼らは免疫グロブリン重鎖のトランスメンブランドメイ ンをコードするＤＮＡ配列をＰｌａｓｍｏｄｉｕ■ｆａｌｃｉｐａｒ北の可溶性 Ｓ抗原をコードする遺伝子と結合させ、得られた雑種（ハイブリッド）遺伝子を ワクノニアウイルスのゲノムに導入した。この構築物により、有意に増大された 免疫原性が得られた。

生サルモネラ、ＢＣＧ、及び麻疹ウィルスの使用も外来抗原を発現させることに 成功している。従って、生減衰ワクチンの利点は、組換えＤ　Ｎ　Ａを含有する ウィルスを基礎とするワクチンの利点と組み合わせることができる。

この考えはさらに発展し、種々のインターロイキンの遺伝子が、重要な抗原の遺 伝子を既に担持している遺伝子操作されたウィルスに挿入された。例えば、ワク ／ニアウィルス自身に対する免疫応答は、ＩＬ−２遺伝子をウィルスゲノムに挿 入することによって顕著に増大させることができ、免疫不全マウスを他の致命的 な感染から回復させることができるｌＲａｍ５ｈａｓ、　１．　Ａ、、Ａｎｄｒ ｅｖ、　Ｍ、　Ｅ、、Ｐｈ１ｌｉｐｓ、　Ｍ。

（Ｇ）　疎水性アンカー及び免疫刺激性複合体サポニン又はＱｕｉｌ　Ａ＼など の表面活性物質を免疫刺激複合体［アイスコムス（ｉ５ｃｏｍｓ）］を多くの実 験及び獣医ワクチンに使用した。これらは幾つかの抗原の免疫原性を改善し、特 にウィルスの膜タンパク質の免疫原性を改善した。

上記の「アジュバント方法」はすべて、幾つかの欠点を有している。

ミョウバン沈降物は局所反応、ならびにその炎症前（ｐｒｏｉｎｆｌａ＋ｎａｔ ｏｒｙ）及び脳障害発生の可能性など、望ましくない副作用があるために不都合 である。表面活性物質は多くの副反応を呈する　これは刺激的、炎症前約であり 、コレステロール及び溶菌細胞と結合する。インターロイキンは全身反応を引き 起こすので、大量のワクチン注射に常用するのは望ましくない場合がある。

重要な抗原の遺伝子の担体として遺伝子操作された微生物を使用することは安全 面の関心から妨げられている。高度に免疫原性な物質と抗原との同時投与は、限 定されたクラスの小ペプチドの場合に実行できるのみである。抗原粒子を精製す ることは同時に抗原量の有意な喪失を招く。体液性応答に対するリポソーム関連 抗原の免疫刺激作用は広範に認識される現象であるが、免疫増強は限定的であり 、この増強が引き起こされる機序は現在までのところ全体的に解明されていない 。

従って、本発明が関連する技術的な課題は、上述した不都合な点を有していない 免疫刺激及び免疫増強物質を提供することにある。

上記の技術的課題は、以下の請求の範囲にて特徴付けされている免疫刺激性の再 構成インフルエンザウイロソーム（ＩＲＩＶ）及びそのＩＲＩＶを含有するワク チンを提供することによって解決される。このＩＲＩＶは、マクロファージ又は Ｂ細胞などの抗原提示細胞に病原体の所望の抗原（又は全病原体）を能動輸送し 、次いで免疫系に対して該抗原を適切に提示させ、それにより免疫応答を誘起す るビヒクルとして使用できる。

従って、本発明は、以下の成分を含有するＩＲＩＶを提供するものである＝（ａ ）　リン脂質の混合物、 （ｂ）　本質的に再構成された機能的なウィルスエンベロープ、（Ｃ）　該ＩＲ ＩＶと細胞膜との融合を誘発でき、また抗原提示細胞、好ましくはマクロファー ジ又はＢ細胞によるエンドサイト−シス後の該ＩＲＩＶの細胞溶解を誘発できる 、生物学的に活性であるインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）又はその誘導体、 及び （ｄ）　抗原。

特徴（ａ）における「リン脂質の混合物」は、天然又は合成リン脂質又はその混 合物を含有している。これは、ホスファチジルコリン又はホスファチジルエタノ ールアミンなどのグリセロリン脂質、及びコレステロールの中から選ばれる少な くとも２つの別個の成分を含有する。特に４：１の比率にあるホスファチジルコ リン及びホスファチジルエタノールアミンが好ましい。本発明の好ましい態様は 、該リン脂質の混合物（ａ）と該本質的に再構成された機能的なウィルスエンベ ロープ（ｂ）との比率が約１＝１から約２０：１のものである。最も好ましいの は約１０：１である。

「本質的に再構成された機能的なウィルスエンベロープ」なる用語は、インフル エンザウィルスのエンベロープの膜部分の内部（下方）に天然に存在している成 分を実質的に含んでいない再構成されたインフルエンザウィルスエンベロープを 意味する。好ましい態様では、本質的に再構成された機能的なウィルスエンベロ ープは、単一ラメラの二層からなる形態をとっている。この欠如している成分に は、天然のインフルエンザウィルスエンベロープのマトリックスタンパク質があ る。

本発明のＩＲＩＶの成分としての「生物学的に活性であるＨＡ又はその誘導体」 なる用語は、生のＨＡの完全な生物学的活性を実質的に示し、かつそのために本 発明のＩＲＩＶがシアル酸含有レセプターを介してその標的細胞に吸着するのを 媒介できるＨＡ又は誘導体を意味する。さらに、このようなＨＡ酸成分循環して いる抗−インフルエンザ抗体によって認識され得る。この生物学的活性は本発明 のＩＲＩＶの本質的な特徴である。

従って、本発明のＩＲＩＶのＨＡ酸成分機能は下記のものと説明できる＝（１） ＨＡ酸成分標的細胞のシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）含有レセプターに 結合し、ウイロソームー細胞の相互作用を開始させる；及び（２）それは、膜融 合という事象によってＩＲＩＶの細胞質内への侵入を媒介し、輸送された抗原の 放出を最終的に導く：（３）殆どのヒトは疾患又はワクチン接種による前暴露の ためにＨＡに対して「プライムされている」と考えられるので、ＨＡ酸成分「認 識抗原」として働く。

従って、ＩＲＩＶの本質的な特徴は、それが、生物学的に活性なウィルス糖タン パク質（ＨＡ）又はその誘導体を抗原とは別にその表面に担持していることであ る。本発明のＩＲＩＶのこの成分は、細胞の細胞質膜との迅速な融合を誘発し、 また輸送された抗原を例えば該細胞の膜中に速やかに放出させる。従って、輸送 される抗原が非特異的に分解される場合のある細胞質内に該輸送抗原が長期に滞 留するという望ましくない事象が避けられる。

抗原はマクロファージ及び他の補助細胞にとって適合性であるに違いないという 事実が最も優勢である。この意味において、本発明のＩＲＩＶの粒子の性質は、 すべての微生物と同様にそれが粒子本体であるために好都合である。ヒトの体内 に抗体が存在すると（インフルエンザの場合、すべてのヒトはインフルエンザ抗 原に対する抗体を有している。この抗体は従前のインフルエンザ感染又はワクチ ン接種のいずれかに由来する）、該抗体によって認識される抗原がマクロファー ジのみならず、細胞外局在として小胞樹状細胞の表面に抗原が長期間保持される リンパ球様小胞に、侵入する速度を増加させる。マクロファージ及びリンパ球様 小胞に侵入するこの工程はオブソニアン化と呼ばれる。

抗体による結合は抗原の免疫原性の別の帰結である。溶液中にある特定の抗原Ａ は、特異性抗−Ａの抗体分子をその表面に現すＢ細胞とのみ結合するが、免疫複 合体はＦｃレセプターによってＢ細胞に接着することができる。輸入性リンパ管 内のＢ細胞はリンパ節のＢ細胞領域に侵入できることから、Ｆｃレセプターを介 したこの非特異的な結合はおそらく、リンパ球様小胞及びリンパ組織の他の塙所 に該抗原が輸送されることに基づく自然感染の１つの経路であろう［Ｎｏ５ｓａ ｌ、　Ｇ。

Ｊ、　Ｖ、のＮｅｗ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｗｏｏｄｒｏ ｖ、　Ｇ、　Ｃ，及びＬｅｖｉｎｅ、　Ｍ、　１．編）、１撃≠窒モ■戟@Ｄｅ ｋｋ ｅｒ、　Ｉｎｃ、　、　（１９９０）　８５］。この機構は単球による輸送に対 して付加的なものであろう。

それ故に、ＩＲＩＶの表面にインフルエンザ抗原が存在することはオプソニン化 の免疫学的な機構にとって有利である。

１つの態様では、本発明のＩＲＩＶは５５０アミノ酸の単一のポリペプチド鎖と して合成される完全なＨＡを含有しており、これは以後、アルギニン３２９の除 去によって２つの鎖、ＨＡ、（３６，３３４ダルトン）及びＨＡ２（２５，７５ ０ダルトン）に開裂される。これらの鎖は、ＨＡ、内の１４位のシスティン及び ＨＡｚ内の１３７位のシステインに関連したジスルフィド結合によって共有結合 的に連結している場合もあり、２鎖モノマーは非共有結合的に会合し、ＩＲＩＶ の表面にトリマーを形成している。これらのＨＡ、又はＨＡ２ペプチドは天然又 は合成起源から、又は遺伝子操作によって入手することができる。

好ましい態様では、本発明は該抗原が病原体（その部分を含む）から誘導されて いるＩＲＩＶに関する。このような病原体の好ましい例としてはウィルス、細菌 、寄生虫、該ウィルス、細菌もしくは寄生虫を模擬する抗−イディオタイプ（抗 −Ｉｄ）抗体、該ウィルス、細菌もしくは寄生虫に対する抗体、又は毒素が挙げ られる。ウィルスの例示としては、Ａ、Ｂ、Ｃ１ＤもしくはＥ型肝炎ウィルス、 ポリオウィルス、ＨＩＶ、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィルス、又はパラ インフルエンザウィルスが挙げられる。細菌には、シュードモナス、クレブシェ ラ、大腸菌、サルモネラ・チフス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ボルデテラ ・ベルラスシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、クロストリジ ウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｔｅｔａｎｉ）、又はコリネバクテリウ ム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ） がある。寄生虫の例示としてはプラスモディウム・ファルンパルム（Ｐｌａｓｍ ｏｄｉｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）が挙げられる。

本発明の特に好ましい態様は、該病原体がＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）の場合で ある。特に好ましいＨＡＶはＨＡＶ株ＲＧ−８Ｂ　ＸＡ１１２であり、これはブ ダベスト条約の要件の下、パスツール研究所の微生物培養のコレクション・ナシ ョナルにおいて１９９１年４月１１日に受託番号ｌ−１０８０として寄託されて いる。

別の好ましい態様では、本発明のＩＲＩＶは抗原として該ＨＡＶのＶＰＩ、ＶＦ ６、ＶＦ６、ＶＦ４又は外被タンパク質を含有している。

本発明のＩＲＩＶのさらに好ましい態様では、抗原は膜に局在している。不活化 ＨＡＶ抗原又はそのサブユニットはＩＲＩＶの表面にカップリングする場合があ る。これは、抗原と適当な架橋リンカ−分子（例えば、Ｎ−スクシンイミジル・ ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート、５ＰＤＰ）との共有結合によって 、又はＩＲＩＶの膜の種々のリン脂質もしくはグリコ脂質との自発的な親油的結 合によって行うことができる。

さらに好ましい態様では、抗原、好ましくは不活化ＨＡＶ抗原又はそのサブユニ ットは非共有結合的にＩＲ４Ｖの表面に吸着されている。

本発明の別の好ましい態様では、該抗原をＩＲＩＶの内部に局在させる。ＲＧ− ３Ｂ株又はその可溶性サブユニットの幾つかのＨＡＶ粒子をＩＲＩＶの再構成膜 によって閉じ込める。この抗原はＩＲＩＶのコア液内では可溶性状態にある。

本発明のさらに好ましい態様では、該ＨＡ誘導体はインフルエンザＨＡ融合ペプ チドである。抗原運搬体、ＩＲＩＶと免疫コンピーテント細胞の細胞膜との融合 は本発明の基本原理であるので、インフルエンザＨＡ融合ペプチド単独でも抗原 の放出を誘導するのに十分である。これは、細胞質体内（エンドサイトシーム） の内面に特徴的であるｐＨ値にて放出が起こるからである。細胞質体内、例えば マクロファージ内のｐＨは約５．０と測定された［ｆｆ１ｅｙ、　Ｄ、　Ｃ，及 び５ｋｅｈｅ１．　Ｊ、　Ｊ、のＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　５６　 （１９８７）、３６５コ。ｐＨ５では、ＩＲＩＶの表面のインフルエンザＨＡ融 合ペプチドは天然のインフルエンザウィルスの場合と同じく活性化される。

別の言様では、本発明は本発明のＩＲＩＶを含有するワクチンを提供する。この ワクチンは適当な製薬的に許容され得る担体及び／又は希釈剤をさらに含有する ことができる。このワクチンは通常の経路及び投与量によって投与できる。

添付の図面は以下の事項を示す： 第１図：　ＩＲＩＶの電子顕微鏡写真 ＩＲＩＶの表面に抗原が結合する前にホスホティング状態（ｐｈｏｓｐｈｔｉｎ ｇｓｔａｔｅ）でネガティブに染色した再構成産物の電子顕微鏡写真である・混 合リン脂質を生物学的に完全な活性インフルエンザ赤血球凝集素糖タンパク質ト リマーと共にスパイクした。

第２図・ｒＲＩＶの調製操作の原理 （ａ）　無傷のインフルエンザウィルス（ｂ）　リン脂質の混合物 （Ｃ）　無傷の不活化Ａ型肝炎ピリオン（ｄ）ＨＡ及びウィルスリン脂質を含有 する可溶性のインフルエンザ・スパイク・サブユニット抗原 （ｅ）　抗原無しのリン脂質膜 （ｆ）ＨＡＶ抗原の表面における共有結合架橋リンカ−（ｇ）　ウィルスから抽 出されたリン脂質、及び表面におけるＨＡＶ、及びＨＡなどのインフルエンザ・ スパイク・タンパク質を担持する他のリン脂質によって再構成された膜を含有す るＩ　ＲＩ　Ｖ００Ｂ図＝Ａ型肝炎ワクチンの寛容性 ＩＲＩＶ−ＨＡＶワクチンとＡ／−ＨＡＶワクチンとの比較第４図：Ａ型肝炎ワ クチンの免疫原性 ＩＲＩＶ−ＨＡＶ’７クチンとＡＩ−ＨＡＶ’）”）チンとの比較篤５図二種々 の再構成インフルエンザ小胞の生物学的融合活性以下に実施例を挙げて本発明を さらに説明する。

実施例１ 表面に非共有結合的に結合しているＡ型肝炎ウィルス抗原を用いたＩＲＩＶの調 製 （Ａ）　ホスファチジルコリン（例えば、レシチン、シグマ）（７５％）、ホス ファチジルエタノールアミン（シグマ）（２０％）、及びコレステロール（シグ マ）（５％）〔すべてのリン脂質１−２％（Ｗ／Ｖ）　＝領　０１３−０．０２ ７Ｍコの、０．０１Ｍトリス／塩酸、ｐＨ７，３を含有するＯ、ＩＭ　ＮａＣ１ 中分散液を、これらの成分をＶＩＲＴＩＳホモジナイザーによって混合すること により調製した。アセトン／水４・１　（Ｖ／Ｖ）から酸として再結晶したコー ル酸ナトリウムをこのミルク状分散液に、非音波処理リン脂質分散液に存在する 多重ラメラ構造体を崩壊させるに必要な少なくとも０．０３Ｍ（１，３％）の終 濃度で加えた。

ＮａＣ１７，９ｍｇ／菖１．クエン酸三ナトリウム・二水和物４．４ｗｇｈｌ、 ２−モルホリノエタンスルホン酸・−水和物（ＭＥＳ）２．１℃ｇ／璽ｌ及びＮ −ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸１．２ｍｇｋｌを 水中（ＩＮＮａＯＨによってｐＨを７．３に調Ｂ）に含有する緩衝液中、０．１ Ｍオクタエチレングリコール・モノ（ｎ−ドデシル）エーテル（ＣＩ２Ｅ８）［ ニツカ・ケミカルズ（東京）］７００．ｌ中にて、精製したインフルエンザウィ ルス９０Ａ／台湾のペレット（０，００２Ｍウィルス膜リン脂質）を溶解した。

この混合物を１７０．０００×Ｇで３０分間遠心し、インフルエンザ・スパイク ・タンパク質（ＨＡ）及びウィルスリン脂質を含有する上清を上記のミルク状リ ン脂質混合物に加えた。

得られた懸濁液全体を少なくとも１時間低温（４℃）で撹拌した。次いで、上記 のリン脂質分散液の調製に使用したものと同じ緩衝液（４℃）で平衡化したセフ ァデックスＧ−５０（中度の粒子径）カラム（８０Ｘ　１５ＣＩ）に、得られた 懸濁液を適用し、その緩衝液で溶出した（流速３２０ｍ１／時）。そのカラムを 超音波処理装置［Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ、　Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｅｕｒｏｐｅ　ＢＹ 、周波数５ＱｋＨｚ±１０％］を接続した水浴中に浸した。１０秒の超音波ショ ックを毎分繰り返し、小さな均一ラメラのＩＲＩＶを得た。試料容量及びカラム 寸法は、空隙容量ｖ０で溶出されるＩＲＩＶとコール酸ミセルとが完全に分離す るようなものであった。３Ｈ−標識化コール酸塩［ＮＥＮケミカルズ］を用いて コール酸塩の保持を試験した。最初のセファデックスＧ−５０クロマトグラフイ ーの後では１％以下のコール酸塩しか保持されず、リン脂質／コール酸塩のモル 比率は〉５０であった。４℃における１２時間の第２のクロマトグラフィーによ り、コール酸塩量が検出限界以下に減少し、リン脂質／コール酸塩の比率は＞５ ００（即ち、１０以下のコール酸分子／ＩＲＩＶ）であった。通常の溶血試験に よって残留Ｃｌ２Ｅａが存在しないことを試験した：その量は検出限界以下であ った（＞１０１００ｎ。Ｉ　ＲＩ　Ｖ（第１図）は、約１０ＯｒｌＩＯの平均直 径を示し、それは以下の態様でＨＡＶ抗原とコンジュゲートされた：ＨＡＶ抗原 １ｍｇを含有する精製し不活化したＨＡＶ懸濁液、株ＲＧ−３Ｂ　ＸＸＡｌ１２ （ＣＮＣｌ−１０８０）を超遠心（４時間、１００，０ＯＯＸＧ）によってペレ ット化した。上述のようにして調製したＩＲＩＶをそのペレットに加えた。再懸 濁した後、得られた懸濁液を２０℃で一晩（１６時間）撹拌した。ＨＡＶ抗原は ファンデル・ワールスカによってＩＲＩＶの表面に自発的に吸着した。

（Ｂ）　精製したインフルエンザウィルスＡ／シンカポール／６／８６を、０゜ １Ｍオクタエチレングリコール・モノ（ｎ−ドデシル）エーテル［ニツカ・ケミ カルズ、東京１日本コ、７．９冒ｇ／厘ＩＮａｃｆ　４．４冨ｇ／諺！クエン酸 三ナトリウム・二水和物、２．１ｍｇ／厘ｎＭＥｓ、及び１．２ｍｇ／富ＩＮ− ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ゛−２−エタンスルホン酸、ｐＨ７，３を含有 する緩衝液中で安定化した。この混合物を１００．０ＯＯＸＧで３０分間遠心し 、ＨＡを含有する上清を貯蔵した。

ホスファチジルコリン［ＰＣ；シグマ・ケミカルＣｏ、、セント・ルイス、Ｍ○ ］及びホスファチジルエタノールアミン［ＰＥ；シグマ］（７５％：２５％ｖｔ ／ｖｔ）を０、ＯＩＭ　ｌ−リス−Ｑ、ＩＭ　ＮａＣｌ５ｐＨ７，３中に懸濁し 、ホモジナイズした。再結晶したコール酸ナトリウム［シグマ］を終濃度０．０ ２Ｍで加え、多重ラメラ構造体を崩壊させた。この溶液にＨＡを含有する上清を 加え、得られた懸濁液を４℃で１時間撹拌した。上清を、領　０１Ｍトリス−０ ，１Ｍ　ＮａＣ１゜ｐＨ７，３で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム［フ ァルマンア・ファイン・ケミカルズ、アップサラ、スウェーデンコに適用した。

シールしたカラムを水浴中に入れた。溶出の間に、超遠心装置［Ｂｒａｎｓｏｎ ｉｃ、　Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｅｕｒｏｐｅ　ＢＹ、ザ・ネザーランズ］を使用して 超遠心ショック（５０ｋＨｚ；　１０ｓ／分）をその水浴に通した。ＩＲＩＶを 含有する空隙容量の画分をまとめ、同一の条件下で再度クロマトグラフィーにか けた。得られたＩＲＩＶは約１５０ｎ曽の平均直径を有していた。

既知量の抗原を有する精製不活化ＨＡＶ懸濁液を１００．０ＯＯＸＧで４時間遠 心し、ウィルスをペレット化した。適量のＩＲＩＶ懸濁液をそのペレットに加え 、振盪により穏やかに再懸濁した。その懸濁液を２０℃で４８時時間中かに撹拌 し、ＨＡＶをＩＲＩＶの表面に吸着させた。このバルク懸濁液を滅菌したリン酸 緩衝化食塩水ｐＨ７，４で希釈し、終濃度を２μｇＨＡＶ抗原／ｍｌとし、ビン 中で保存した。

架橋連結したＨＡＶ抗原を用いたＩＲＩＶの調製は第２図に模式図的に示してい る。

以下の改変を加えつつ実施例１の記載に従ってＩＲＩＶを調製した：適当な架橋 リンカ−分子を用いてＨＡＶ抗原分子をＩＲＩＶに接着させた。以下の操作を使 用した。

（Ａ）　ホスホエタノールアミン（Ｐ　Ｅ）を以下のようにしてＮ−スクシンイ ミジルピリジル・ジチオプロピオネート［５ＰＤＰ、ピース（Ｐｉｅｒｃｅ）］ とカップリングした： ＰＥ（２０μｍｏｌ）１５＋＋ｇを５ｍｌ容量がラスピン中で乾燥した。得られ た乾燥ＰＥを乾燥クロロホルム（モレキュラー・シーブで乾燥＞２ｗｌ中に再溶 解した。

次いで、トリエチルアミン（ＴＥＡＸ３鳳ｇ）３０μｍｏｌ、次に乾燥エタノー ル１Ｍｌ中、ＳＰＤＰ（Ｌｏｌｌｇ）３０μ＠ｏｌを加えた。次いで、得られた 混合物を窒素雰囲気下に室温にて、反応が終了するまで（即ち、遊離のＰＥが存 在しなくなるまで）１−２時間撹拌した。得られた反応生成物を回転エバポレー ターで乾燥した。

乾燥した脂質をクロロホルム中に再懸濁し、次ぎのようにして調製しておいたケ イ酸クロマトグラフィーカラムの上部に素早く適用した：ケイ酸２ｇをクロロホ ルム１０ｍ１に溶解させる。得られた溶液を、ガラスファイバーでプラグしたＩ ＱｍＡ容量のプラスチック製シリンジバーレル中に注いだ。余剰を漏出させ、シ リンジバーレルにプラスチック製の使い捨て３ウ工イ蛇口（ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ 　ｔａｐ）を取り付けた。上記の脂質を適用した後、カラムをクロロホルム４露 ｌで洗浄した。

最後に、まず４　：　０．２５（ｖ／ｖ）、次いで４　：　０．５（ｖ／ｖ）、 ４：１７５　（ｖ／ｖ）、そして最後に４　：　１　（Ｖ／Ｖ）という一連のク ロロホルム−メタノール混液でカラムを洗浄し、２ｍｌの画分を採取した。次い で、シリカゲル平板を使用し、クロロホルム−メタノール−水（６５：２５：４ 容量比）で展開する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、純粋な誘導体 を局在化させた。誘導体は遊離のＰＥよりも速（移動し、ホスホモリブデート又 はヨウ素によってスポットを視覚化した。

所望の生成物を含有する両分をまとめ、回転エバポレーターによる減圧蒸留によ って濃縮し、た。

（Ｂ）ＨＡＶ抗原を以下の操作によりチオール化した：　精製し不活化したＨＡ Ｖ５冨ｌを５冨ｇ／冒！−１の濃度でＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７， ５）中に溶解した。次いで、エタノール中、濃度２０　、ｃｚａｏｌ−’（６＋ ＋ｇ／ｍｌ−’）の５ＰＤＰ溶液を混合し、その１５０μｌをハミルトン・シリ ンジでＨＡＶタンパク質溶液５茸ｌに撹拌しながらゆっくりと加え、５ＰＤＰ： タンパク質のモル比、１５：１を得た。エタノールの濃度を５％以下に保持し、 タンパク質の変性を防止した。

得られた混合物を室！（２０℃）で３０分間反応させた。反応が停止した後、０ ゜０５Ｍクエン酸ナトリウム（Ｎａ３ＣｓＨｓＯｔ　・２Ｈ２０，１９，７ｇ！ −’）、０゜０５Ｍ　リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰ○４・７Ｈ２０，１３，４ ｇ！−’）、及び０゜０５Ｍ塩化ナトリウム（２，９ｇ−１”）、ｐＨ７，０を 含有する溶液で平衡化したセファデックスＧ−５０のゲルクロマトグラフィーに よって、そのタンパク質を反応体から分離した。

（Ｃ）　前処理したＩＲＴＶ及びＨＡＶ抗原を以下のようにしてカップリングし た・　ＩＲＩＶを実施例１のようにして調製した。ＰＨの代わりにＰＥ−８ＰＤ Ｐを使用した。

ＨＡＶ−３ＰＤＰを以下のようにして還元した：　クエン酸−リン酸緩衝液中、 ＨＡＶ−３ＰＤＰ溶液＜７）ｐＨをＩＭ　ＨＣＩ（Ｄ添加ｉ：よつｒｐＨ５，５ １：調節シタ。

０．２Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５，５（１ＯＩｆ中、酢酸ナトリウム１６５翼ｇ）中 、ＤＴＴ溶液、２．５Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ、３８０ｚｇ／翼り１０μ ｌをタンパク質溶液１ｍｊ’毎に加えた。得られた溶液を３０分間放置した。次 いで、ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７，０で平衡化したセファデックスＧ−５０カラムの クロマトグラフィーによってタンパク質をＤＴＴから分離した。チオールの酸化 を防止するため、すべての緩衝液は窒素で泡立たせ、酸素を除去した。タンパク 質の両分も窒素雰囲気下に採取した。

最後に、室温、−晩の撹拌によってＩＲＩＶをチオール化タンパク質と混合した 。

以下の改変を加えて実施例２に記載のようにしてＩＲＩＶを調製した：　ＨＡＶ 抗原を５ＰＤＰとはカップリングさせず、ＶＰＩタンパク質の表面に既に存在し ているジスルフィド架橋を遊離チオール基の前駆体部として使用した。遊離チオ ール基へのこの変換は以下のようにして行った：Ｑ、１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７， ４中、最終抗原濃度５ｍｇｈｌのＨＡＶ溶液溶液５壱ｆ製した。この溶液１冨ｌ 当たりにＤＴＴ溶液（実施例２に記載のようにして調製）１０μｌを加えた。得 られた混合物を３０分間放置した。次いで、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７，０で平衡化さ せたセファデックスＧ−５０カラムのクロマトグラフィーによって、タンパク質 をＤＴＴと分離した。タンパク質画分を窒素雰囲気下に採取し、実施例２のＩＲ ＩＶと混合した。

以下の改変を加えて実施例１に記載のようにしてＩＲＩＶを調製した。精製し不 活化した懸濁液中のＨＡＶｌｍｇを精製したインフルエンザウィルス９０Ａ／台 湾（ウィルス膜すン脂買０．００２Ｍ）のペレットに加え、実施例１に記載の方 法によってＩＲＩＶに組み込んだ。

実施例１．２．３又は４に従ってＨＡＶ−ＩＲＩＶを調製し、それを終濃度５０ ０ｎｇＨＡＶタンパク質ｍｌ−’でＰＢＳ（ｐＨ７，４）中に希釈した。このバ ルク溶液を孔サイズ０．２μ菖の膜［１１ｉ１１ｉ−ｐａｒｅ］に通して滅菌濾 過した。保存剤（チオマーサル（ｔｈｉｏｍｅｒｓａｌ））を終濃度１０−４で 加えた。得られた最終バルクワクチン０゜６冨ｌを滅菌条件下にワクチンバイア ルに充填した。国際基準に則って安定性及び効力試験を行った。

実施例６ Ｃ型肝炎に対する抗−イディオタイプＩＲＩＶワクチンの調製イディオタイプと しても知られている抗体分子（Ａｂｌ）の抗原結合部位は抗体（抗−イディオタ イプ、又はＡｂ２）の産生を誘導することが示されている。動物にある種のＡｂ ２を接種すると、抗原結合能がＡｂｌと類似している抗体（Ａｂ３）が産生され るので、Ａｂ２の結合部位は、元来はＡｂｌ（そして次ぎにＡｂ３）によって認 識される抗原決定基の「鏡像」として機能すると予想される［Ｊｅｒｎｅ、ＮＪ 、、　Ａｎｎ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（パリ）　１２５　Ｃ（１９７４）、　３７３］、抗原特異 的な抗体（Ａｂ３）を惹起させるために抗−１ｄ抗体（Ａｂ２）を使用する主要 な利点は、ワクチンの受容者が感染物質又は外来遺伝子を含有する物質とは決し て接触しないことである。

Ｃ型肝炎に対する抗−イディオタイプＩＲＩＶワクチンを以下のようにして調製 した二　以下の計画に沿ってヒツジをＡｂ、（ＰＢＳに濃度１ｍｇ／ｗｓｌで溶 解している）で免疫した。０日日に動物の種々の部位（縫部）に投与量２ｍｌを 筋肉注射した。７．１４及び２８日目に、両方の後脚に２ｍｌを２回投与した。

４２日目に、各ヒツジから血液３５０ｍ１を採取した。血清画分を分離し、常法 ［Ｇ１０Ｃｋ、　Ｒ，及びＬａｂｅｒｔ、Ｄ、　；狂犬病の実験手法、ＷＨｏ、 ４版、１９９１．出版中、を参照のことコに従ってさらに精製した。

精製した抗−１ｄＣ型肝炎抗体をペプシンによる消化によって開裂させ、得られ たＦ　（ａｂ’　）　２断片をＤＴＴで還元しく実施例２を参照のこと）、２つ のＦ　ａｂ’断片を得た。これらのＦ　ａｂ’断片は、実施例２のＩＲＩＶと直 接反応する遊離のスルフヒドリル基を含有していた。この調製物をＰＢＳ（ｐＨ ７，４）によってタンパク質濃度５０ａｇ／ｍｌにまで希釈し、ワクチンバイア ル中に０．６ｍｆづつ分取した。

実施例７ 不活化Ａ型肝炎ワクチンの安全性及び免疫原性・　実施例１に従って調製したＩ ＲＩＶ−ＨＡＶとミョウバン吸着ワクチンとの比較（Ａ）Ａ型肝炎ウィルス（Ｈ ＡＶ）をＭＲＣ−５ヒト二倍体細胞［受託番号ＡＴＣＣＣＣＬ　１７１の下にア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能］にて生育させた後 、精製した。ホルムアルデヒド（０，０５％）を用いて３７℃で１０日間処理し 、そのウィルスを不活化した。２つの組みのワクチンを試験した。ワクチンの第 １組は、実施例１（Ａ）に記載のＩＲＩＶに結合した不活化ウィルスから構成さ れている（ＩＲＩＶ−ＨＡＶ）。第２組のワクチンは、０゜４％ＡＡ’（ＯＨ） ３を含有するミョウバン吸着調製物であった（ＡＡ’−ＨＡＶ）。両ワクチンと もに、０．　５ｙｓｌ用量当たりＨＡＶ抗原１５０ｎｇを含有していた。血清反 応陰性の成人志願者（１５人づつの２グループ）にＯ５目に２回の筋肉内注射を し、７日日にデルタ領域内にブースター注射した。全身反応あるいは血液化学の 別の反応も全く検出されなかった。局所反応については、ＩＲＩＶ調製物はミョ ウバン吸着ワクチンよりも有意に低いパーセンテイジの反応しか惹起させなかっ た。これらの実験結果を以下の第３表にまとめる。

ＩＲＩＶ調製物はミョウバン調製物よりも免疫原性が高いことも見いだされた。

抗−ＨＡＶ免疫応答を試験するため、最後の注射の２１日及び２８日後に血液試 料を志願者から採取した。市販のＲＩＡ　［アボット（Ａｂｂｏｔｔ）］を使用 し、ＨＡＶ特異的な抗体について血清を試験した。得られた結果を以下の第４表 に示す。その欄の数字は抗−ＨＡＶ抗体の力価の範囲を示している。従って、Ｉ ＲＩＶ及びミョウバン吸着ワクチン製剤についての２１日目の抗−ＨＡＶ抗体力 価の範囲はそれぞれ、８２−９８８及び６９−８４４である。ＩＲＴＶ及びミョ ウバン吸着ワクチン製剤の２８日における相乗平均力価（範囲）はそれぞれ、４ ５３ＷＩＵ／１ｌ（９２−１２１０）及び３６１薦ＩＵ／厘Ｉ（６０−９２９） であった。このように、本発明のＩＲＩＶ調製物はミョウバン吸着ワクチンより も優れている。

（Ｂ）　１２０人のヒト志願者による第１相臨床試験において、単一１ＲＩＶア ジユバント化Ａ型肝炎ワクチンは、Ａ型肝炎に対して誘発される保護抗体力価を ミョウバン処方後の抗体力価よりも７倍高くすることが証明できた。他のリポソ ーム、ウイロソーム又はイムノソーム製剤では完全に生物学的に活性な融合ペプ チドが明らかに欠如しているので、現在までのところ、それらを用いてはこのよ うなヒトにおける高い免疫強化性は達成されていない。

ＨＡＶ血清反応陰性（＜１０真ＩＵ／＋＋Ａ’）の１２０人の健常成人のすべて に、液状、ミョウバン吸着、又は実施例１（Ｂ）に記載のＩＲＩＶワクチンのい ずれかを無作為に投与した。ワクチン（０、５ｍｌ）は、デルタ領域内に筋肉注 射で投与した。志願者は、ワクチン接種後約３０分間、即時型反応について観察 した。志願者それぞれに、免疫後４日間の有害反応のすべてを記録用紙に記録す るよう依頼した。抗−ＨＡＶ抗体を測定するための血清試料を、免疫時及びそれ から１４日後に採取した。

各ワクチン製剤には、用量０．　５ｍｊ！当たりＨＡＶ抗原１μｇが含有されて いる。ＩＲＩＶ−ＨＡＶ製剤の１回用量もインフルエンザＨＡＬＯμｇ及び総リ ン脂質１２５μｇを含有している。３つすべてのワクチンが滅菌されており、ま た毒物に対して無毒性であることが標準的な試験方法によって確かめられた。さ らに、３つの製剤はともに実験動物に対して良好な抗−ＨＡＶ抗体応答を惹起さ せた。

ＨＡＶ抗体について血清反応陰性の健常成人志願者４０人に、各製剤を筋肉的投 与した。各グループは年令及び性別について十分に適合していた。免疫に伴う有 害反応を第１表に示す。すべてのワクチンについて、注射部位の痛みが不平とし て最も頻繁に記録されたものであった。このような不快さは、液状製剤を投与し た１人のワクチン接種者（２，５％）、ミョウバン吸着ワクチンによって免疫し た９人（２３％）、そしてＩＲＩＶ調製物を投与した１人（２，５％）に中等度 と分類された。激しい痛みがミョウバン吸着ワクチンを投与した１人の被験者に 報告された。「痛み」反応を記録した他のすべての被験者ではそれは中等度であ った。

ミョウバン吸着ワクチンによる免疫は液状又はＩＲＩＶ製剤のいずれと比較して も、それよりも有意に（Ｐ＜０．０１）高い痛み及び膨潤／硬化の両傾向を伴っ た。

ワクチン接種が原因の全身反応は見いだされなかった。

ワクチン接種の１４日後に生じた抗−ＨＡＶ抗体応答を第２表に示す。液状ワク チンによる免疫により、相乗平均力価（ＧＭＴ）として１５．７ｍＩＵ／ｍ１が 得られ、被験者の３０％が血清変換された（＞２０ｍ１Ｕ／＋＋１）。ミョウバ ン吸着ワクチンは適度に高いＧＭＴ（２１，３ｍ１Ｕ／ｇ／）及び血清変換率（ ４４％）の両者を誘起したが、いずれも液状ワクチンを用いて得られるものより も有意に大きくはなかった。対照的に、ＩＲＩＶワクチン製剤は遥かに強力な抗 体応答を惹起させた。ＧＭ７１３９．８は他の２つのワクチンのいずれと比較し ても有意に（Ｐ＜０．０００１）高かった。１人を除いてすべてのワクチン接種 者は≧１００ｍＩＵ／ｗ＋１を示した。すべてのワクチン接種者が１４日までに 血清変換したことは、他のワクチン製剤が５０％以下であったことと比較すれば 、重要な事実である（Ｐ＜Ｑ、００５）。

第１表 ワクチン　痛み　膨潤／　発赤　発熱　頭痛　倦怠感硬化 液状　４２”　０’　ＯＯ００ ＡＪ（ＯＨ）３−吸着　８８　２３　０　０　０　０＋対＊又は且：Ｐ＜０．０ １ τ対１１又は＊＊：Ｐ＜０．　０１ ワクチン　０日　１４日　血清交換率 製剤　数〉２０冨ＩＵ／全数（％） 液状　ＧＯ１５，７（＜１Ｏ−１００）”　１２／４０　（３０％）！Ａ／（０ １１［）３−吸着　＜ｔｏ　２１．３　（１０−１００）＋１８／４０　（４４ ％）１被験者には０８目にワクチンを単一投与した。

５対＊又は＋：　Ｐ＜０．０００１ ＊＊対１１又は町　：ｐ＜Ｑ、００５ 実施例８ 種々の再構成インフルエンザウイロソームの生物学的融合活性インフルエンザウ ィルスの膜成分の融合反応における役割を詳細に試験するためには、これらの成 分を操作できることが必要である。この目的から、ウィルススパークタンパク質 の単離及び再構成のための方法が必要であり、それにより完全な生物学的融合活 性を有する再構成ウイロソームが得られる。ウィルスエンベロープを再構成する ために使用されていた殆どの方法は、洗浄剤を用いたウィルス膜の可溶化を基礎 としている。

文献に記載されている種々の方法を使用し、幾つかの再構成インフルエンザウィ ルスエンベロープを調製した： ［ＡＪ　高い臨界ミセル濃度（Ｃ，鳳、Ｃ１）の洗浄剤（例えば、オクチルグル コシド）を使用して調製されたＨｕａｎｇ、　Ｒ，Ｔ、　Ｃ，のウイロソーム［ Ｈｕａｎｇ、　Ｒ，τ、Ｃ，，ｆａｈｎ、に、、　Ｋｌｅｎｋ、　Ｈ，Ｄ、及び Ｒｏｔｔ、Ｒ，、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　９７　（１９７９）、　ｐｐ、２１２−２ １７１゜［Ｂ］　低い臨界ミセル濃度の洗浄剤（例えば、トリトンＸ−１００） を使用して調製されたｈｗａｓａｋｉ、　Ｌらのウイロソーム［Ｋａｗａｓａｋ ｉ、　Ｋ、　、　５ａｔｏ、　Ｓ、　Ｂ、及びＯｈ社ｓｋｉ。

Ｓ、１．、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　７３３　（１９ ８３）、　ｐｌ）、２６ｇ−２９０１゜［Ｃｌ　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０を洗 浄剤として使用して調製されたＨｏ５ｏｋａ、　Ｙ、らのウイロソーム［Ｈｏ５ ａｋａ、　Ｙ、　、　Ｙａｓｕｄａ、　Ｙ、及（Ｊ７ｕｋａｉＪ、、　Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、　４６　（１９８３）、　ｐｐ、１O１４−１０１ ７コ。

［Ｄ］　実施例１に記載しているＩ　ＲＩ　Ｖ。

さらに、以下の対照物を調製した： ［Ｅ］　ポジティブな対照としての精製インフルエンザウィルス懸濁液。

ＣＦ］　ネガティブな対照としてのＰＢＳ−ＮａＣ１，ｐＨ７，４゜再構成イン フルエンザウィルスエンベロープ溶液及びインフルエンザウィルス対照それぞれ から、１０＋＊Ｍ　ＮａＣＡを加えた重炭酸塩を含まないＲＰＭＩ　１６４０培 地中（ｐＨ７，４）、１０ｇｇ／ｌ／の赤血球凝集素の濃縮物を調製した。ネガ ティブ対照（Ｐ　Ｂ　５−ＮａＣ１＞を同じ培地中に希釈した（１：１０）。小 胞結合性及び融合実験のため、ＭＲＣ−５ヒト二倍体フィブロブラストを１２ウ エルのクラスター皿（ＮＵＮＣ）中で増殖させた。１ウエル当たり３４．０００ 細胞／ｌｌで細胞を接種し、３日後にそれを使用した。細胞はこの時点で、約７ ０−８０％全面成長していた。

各調製物について２０ウエルにつき、再構成エンベロープ溶液Ｑ、５ｚｌを各ウ ェルに加えた。室温にて３０分間小胞を細胞に結合させた。このインキュベート の間に、皿をスピン間１８０°で反転させ、５００９で３分間２ロ転させた。

この遠心工程により、小胞の結合性が約３倍高められる。この３０分後、得られ た細胞をＰＢＳ−ＮａＣ１ｐＨ７，４で４回洗浄し、非結合小胞を除去した。融 合実験のため、融合培地［１０ｍＭスクシネート、０．　２％ウシ血清アルブミ ン及び３５ｒｎＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ５，０を加えたＲＰＭＩ　１６４０］を各ウ ェルに加え（０゜５　ｍｌ／ウェル）、５つの調製物の融合活性を誘発した。１ 分後、各調製物について２ウエルにつき、この融合培地を無水エタノールと交換 して融合反応を停止させた。１０分が経過するまで、毎分この操作を行った。次 いで、Ｍａｙ　ＧｒＬｌｎｗａｌｄ　−Ｇｉｅｍｓａの方法に従って細胞を染色 した。　細胞をアルコール性Ｍａｙ−Ｇｒｔｌｎｗａｌｄ溶ｆ＆（Ｆｌｕｋａ　 Ｎｏ、　６３５９０）で覆った。５分後、細胞を素早くリン酸緩衝液ｐＨ６，５ で洗浄し、ギムザ溶液（Ｆｌｕｋａ　Ｎｏ、　４８９００）で染色し、同じリン 酸緩衝液で１＝１０に希釈した。さらに１０分経過後、細胞を流水で洗浄した： 　顕微鏡下では、細胞の細胞質は明るい青色に見え、細胞膜は暗い青色に、そし て核は暗い赤色に見える。

顕微鏡下にて、融合細胞（少なくとも２つの核を含有する細胞）を計数するため 、１０視野を評価し、調製物ごとに、及び各時間間隔で計算した。第５図は、２ つのウェルの平均値を示している＋　ＩＲＩＶｍ製物のみが、インフルエンザウ ィルス対照に匹敵する融合活性を有していることは明らかであった。調製物［Ｂ ］は、ポジティブ対照の約３０％の融合活性しか示さなかった。他の調製物は融 合活性を示さなかった（ネガティブ対照と比較して）。これらの結果から導かれ る結論として、本明細書に記載したＩＲＩＶだけしか完全な生物学的融合活性を 示さず、インフルエンザエンベロープ再構成のための他の方法では融合活性を備 えた小胞は得られず、これらは融合活性の大部分の喪失、ないしは完全な喪失を 導く、と言い得る。

Ｆ工Ｇ、１ へｇ！Ａ肝炎ワクチンの寛寥性 ＩＲＩＶ−ＨＡＶ　対ＡＩ−ＨＡＶ 二１履　■　２糎 ｊｌＨＶ４４１＆　ＡＨｆＡＶ 高い有意蓋（ｇｓ６．０（２） Ａ型肝炎ワクチン ！ＲＩＶ−ＨＡＶ　対　ＡＩ−ＨＡＶ シ５＝至 種々の再構成インフルエンザ小胞の生物学的融合；舌性細胞融合の時間（分） ４組：（Ｄ）　５１１１：Ｎ）　６組：（Ｆ）国際調査報告 国際調査報告 ＥＰ　９２０１０１４ Ｓ＾　６０４０３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｄ　９２８４−４ＣＮ　９２８４−４Ｃ （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、ＪＰ、　ＵＳＩ

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の成分を含有する免疫刺激性の再構成インフルエンザウイロソーム（Ｉ ＲＩＶ）： （ａ）リン脂質の混合物； （ｂ）本質的に再構成された機能的なウイルスエンベロープ；（ｃ）細胞膜と該 ＩＲＩＶとの融合を誘発でき、そして抗原提示細胞、好ましくはマクロファージ 又はＢ細胞によるエンドサイトーシス後に該ＩＲＩＶの細胞溶解を誘発できる生 物学的に活性であるインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）又はその誘 導体；及び （ｄ）抗原。
2. ２．本質的に再構成された機能的なウイルスエンベロープが単一ラメラの二層形 態にある請求項１に記載のＩＲＩＶ。
3. ３．該抗原が病原体から誘導されたものである請求項１に記載のＩＲＩＶ。
4. ４．該病原体が微生物病原体である請求項３に記載のＩＲＩＶ。
5. ５．該病原体がウイルス、細菌又は寄生虫又はそれらの部分である請求項３に記 載のＩＲＩＶ。
6. ６．該抗原が、病原体に特異的な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体である請 求項３に記載のＩＲＩＶ。
7. ７．該抗原が毒素又はトキソイドである請求項３に記載のＩＲＩＶ。
8. ８．該病原体がＡ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）である請求項５に記載のＩＲＩＶ。
9. ９．ＨＡＶがＡ型肝炎株ＳＢ−ＲＧＸＡ１１２（ＣＮＣＭＩ−１０８０）である 請求項８に記載のＩＲＩＶ。
10. １０．ＨＡＶが不活化されている請求項８又は請求項９に記載のＩＲＩＶ。
11. １１．該病原体からの誘導化抗原がＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４又は該ＨＡ Ｖの外被タンパク質である請求項８又は請求項９に記載のＩＲＩＶ。
12. １２．該抗原が該ＩＲＩＶの膜に局在している請求項１から請求項１１のいずれ かに記載のＩＲＩＶ。
13. １３．該抗原が該ＩＲＩＶの内部に局在している請求項１から請求項１１のいず れかに記載のＩＲＩＶ。
14. １４．該抗原が該ＩＲＩＶの表面に吸着されている請求項１から請求項１１のい ずれかに記載のＩＲＩＶ。
15. １５．該ＨＡ誘導体がＨＡ融合ペプチドである請求項１から請求項１４のいずれ かに記載のＩＲＩＶ。
16. １６．該混合物がホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを 含有する請求項１から請求項１５のいずれかに記載のＩＲＩＶ。
17. １７．ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンの比率が４１ である請求項１６に記載のＩＲＩＶ。
18. １８．（ａ）：（ｂ）の比率が約１：１から約２０：１である請求項１から請求 項１７のいずれかに記載のＩＲＩＶ。
19. １９．製薬的に許容され得る適切な担体及び／又は希釈剤も一緒に含有すること ある、請求項１から請求項１８のいずれかに記載のＩＲＩＶを含有するワクチン 。
20. ２０．請求項１から請求項１８のいずれかに記載のＩＲＩＶの適当な投与量を投 与することを特徴とする、免疫系の刺激が要求されている患者の免疫系を刺激す る方法。
21. ２１．請求項１から請求項１８のいずれかに記載のＩＲＩＶの適当な投与量を感 染症の予防が必要である患者に投与することを特徴とする、感染症を予防するた めの方法。