PL206260B1 - Immunogenna kompozycja liposomowa, jej zastosowanie, sposoby jej wytwarzania i kompozycja szczepionki - Google Patents

Immunogenna kompozycja liposomowa, jej zastosowanie, sposoby jej wytwarzania i kompozycja szczepionki

Info

Publication number
PL206260B1
PL206260B1 PL348604A PL34860499A PL206260B1 PL 206260 B1 PL206260 B1 PL 206260B1 PL 348604 A PL348604 A PL 348604A PL 34860499 A PL34860499 A PL 34860499A PL 206260 B1 PL206260 B1 PL 206260B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
liposome composition
immunogenic
immunogenic liposome
antigenic
composition
Prior art date
Application number
PL348604A
Other languages
English (en)
Other versions
PL348604A1 (en
Inventor
Gary Fuji
Donald V. Cramer
William A. Ernst
Jill Adler-Moore
L.Jeanne Perry
Original Assignee
Molecular Express Incmolecular Express Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Express Incmolecular Express Inc filed Critical Molecular Express Incmolecular Express Inc
Publication of PL348604A1 publication Critical patent/PL348604A1/xx
Publication of PL206260B1 publication Critical patent/PL206260B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest immunogenna kompozycja liposomowa, jej zastosowanie, sposoby jej wytwarzania i kompozycja szczepionki.
Stosowanie szczepionek od dawna stanowi bezpieczny i skuteczny sposób ochrony dużych populacji przed różnorodnymi chorobami infekcyjnymi. Immunizacja przeciw wirusom i innym mikroorganizmom jest zazwyczaj bezpieczna i skuteczna i w dużej mierze przyczyniła się do zwiększenia długowieczności ludzi w krajach rozwiniętych. Może jednak wystąpić sporo skutków ubocznych w zależności od rodzaju szczepionki albo od konkretnego immunogenu. Niedostateczna inaktywacja nienaruszonego wirusa doprowadzała w przeszłości do niezamierzonych infekcji zamiast do ochrony po zaszczepieniu (Tigertt, 1959, Military Med. 124:342). Czasem immunizacja za pomocą nienaruszonych drobnoustrojów, takich wirus grypy, może przyspieszyć rozwój chorób autoimmunologicznych skierowanych bezpośrednio przeciw normalnym tkankom, takich jak zespół Guillain Barre'a (Langmuir i wsp., 1984, J. Epidemiol. 119:841). Poza samymi czynnikami, obecno ść różnych substancji w komórkach lub złożone pożywki mogą doprowadzić do wywołania poważnych reakcji alergicznych przeciw obcym białkom (Yamane i Uemura, 1988, Epidem, Inf. 100:291). Ponieważ skuteczne procedury szczepień często wymagają wielokrotnych immunizacji, te szkodliwe przypadki mogą zmniejszyć skuteczność szczepionki i mogą zmniejszyć ogólną akceptację procedur szczepienia. Ostatnio testowane są współczesne metody biologii molekularnej w celu dostarczenia zwiększonego bezpieczeństwa i skuteczności nowych preparatów szczepionkowych. Potencjalne, badane obecnie strategie obejmują: szczepionki oparte na technikach rekombinowania DNA (Conry i wsp., 1994, Cancer Res. 54: 1164; Hu i wsp., 1988, J. Virol. 62: 176), wytwarzanie prostych syntetycznych peptydów jako antygenów (Nardelli i wsp., 1992, Vaccines 8:1405; Watari i wsp., 1987, J. Exp. Med. 165:459) oraz bezpośrednie wstrzyknięcie materiału genetycznego do tkanek w celu pobudzenia odpowiedzi ochronnych (Ulmer i wsp., 1993, Science 259: 1745). W szczególności wiele badań skoncentrowało się obecnie na zastosowaniu prostych antygenów peptydowych do wywoływania specyficznych odpowiedzi immunologicznych. Ta strategia jest atrakcyjna, ponieważ daje możliwość dostarczania specyficzności immunologicznej, szczelniejszej kontroli procesów wytwarzania oraz usunięcia większości drugorzędnych źródeł surowców lub zanieczyszczeń związanych z wytwarzaniem immunogenu.
Jednakże zastosowanie oczyszczonych białek lub fragmentów peptydowych do szczepienia zależy od doprowadzania tych materiałów do miejsca immunizacji przy pomocy wydajnych nośników antygenu. Potencjalnie jednymi z najbezpieczniejszych nośników są kompleksy szczepionek oparte na lipidach/liposomach. Liposomy są od dawna uważane za technologie handlowo żywotne, ponieważ mogą one zmniejszać toksyczności leków, przedłużać krążenie we krwiobiegu oraz zmieniać biodystrybucję i farmakokinetyki leków (Fujii, 1996; Vesicles, wyd. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY, str. 491). Gdy liposomy podawane są in vivo, krążą one we krwi i są usuwane przez fagocytarny układ monocyty/makrofagi, szczególnie w wątrobie, śledzionie, węzłach chłonnych oraz w tkance płucnej (Claasen, 1996; Vesicles, wyd. M. Rosoff, Marcel Dekker, New York NY , str. 649). Zdolność liposomów do kierowania wzorem dystrybucji antygenów sugeruje, że immunogen liposomalny może być w stopniu maksymalnym eksponowany na układ odpornościowy. Do chwili obecnej przetestowano kilka systemów lipidowych, w tym peptydy skoniugowane z lipidami (Nardelli i wsp., 1992, Vaccines 8:1405; Watari i wsp., 1987, J. Exp. Med. 165:459), rekonstrukcję całych podjednostek białkowych w obecnoś ci lipidów (Morein i Simons, 1985, Vaccines 4:166; Gregoriadis, 1995, Tibtech 13:527) oraz łączenie białek z utworzonymi wcześniej liposomami (Therien i Shahum, 1989, Immunol. Lett. 22:253; Alving i wsp., 1985, Vaccines 4:166). Chociaż wykazano, że te strategie są immunologicznie aktywne, to trudności techniczne związane z produkcją na wielką skalę białek i ich lipidowych nośników, jak również ograniczenie kosztami, zmniejszają ich atrakcyjność jako technologii handlowej. A zatem niezbędny jest ulepszony system lub sposób wytwarzania antygenów białkowych, aby wykorzystać możliwości oferowane przez liposomy przy opracowywaniu szczepionek.
Niniejszy wynalazek dotyczy immunogennej kompozycji liposomowej, która zawiera: tworzące pęcherzyki lipidy; oraz konstrukt antygenowy zawierający fuzję co najmniej jednej wirusowej, bakteryjnej, grzybiczej, pasożytniczej lub rakowej determinanty antygenowej i domeny hydrofobowej, która składa się z 15 do 500 reszt aminokwasowych i jest związana z błoną takiej kompozycji liposomowej.
Korzystnie konstrukt w takiej kompozycji jest zsyntetyzowany chemicznie i korzystnie jest białkiem fuzyjnym.
PL 206 260 B1
Korzystnie domeną hydrofobową w konstrukcie jest peptyd, a korzystniej domena hydrofobowa zawiera jeden lub więcej aminokwasów wybranych z grupy składającej z Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
Determinanta antygenowa w konstrukcie antygenowym korzystnie pochodzi z antygenu wybranego z grupy składającej z gB HSV, gD HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA albo NA INFV, P6 H. influenzae, P5 H. influenzae, białka fimbrii i białka D.
Korzystnie konstrukt antygenowy zawiera ponadto region łącznikowy łączący determinanty antygenowe z domeną hydrofobową, który korzystnie jest peptydem i wówczas korzystnym konstruktem antygenowym jest białko fuzyjne.
Korzystnie region łącznikowy składa się z od 1 do około 200 reszt aminokwasowych, które korzystnie są wybrane z grupy składającej z Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
Kompozycje określone powyżej, w tym kompozycja z konstruktem antygenowym zawierającym region łącznikowy, korzystnie zawierają ponadto farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i korzystnie także jeden lub więcej adiuwantów.
W korzystnej kompozycji liposomowej wedł ug wynalazku liposomy stanowią jednowarstwowe pęcherzyki. W takiej kompozycji konstrukt antygenowy jest zsyntetyzowany chemicznie, domena hydrofobowa w konstrukcie jest białkiem i składa się z aminokwasów wybranych z grupy składającej się z Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val, a determinanty antygenowe pochodzą z antygenu wybranego z grupy składającej się z gB HSV, gD HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA INFV, NA INFV, P5 H. influenzae, P6 H. influenzae, białka fimbrii i biał ka D.
Taka kompozycja liposomów jednowarstwowych korzystnie zawiera ponadto jeden lub więcej adiuwantów.
Konstrukt antygenowy w takiej kompozycji korzystnie zawiera ponadto region łącznikowy łączący determinanty antygenowe z domeną hydrofobową, który składa się z 1 do 200 reszt aminokwasowych, korzystnie wybranych z grupy składającej się z Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
Immunogenna kompozycja liposomowa według wynalazku zawiera ponadto lipidową emulsję i olej.
W zakres wynalazku wchodzi też zastosowanie kompozycji liposomowej według wynalazku, również tej zawierającej jeden lub więcej adiuwantów. Lek wytwarzany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku przeznaczony jest korzystnie dla ssaków, bardziej korzystnie dla ludzi, a także korzystnie dla ptaków.
W przypadku, gdy lek jest przeznaczony dla ludzi, korzystnie determinanta antygenowa jest wybrana z grupy składającej się z gB HSV, gD HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA INFV, NA INFV, P5 H. influenzae, P6 H. influenzae, białka fimbrii i białka D.
W zakres wynalazku wchodzi też kompozycja szczepionki zawierająca skuteczną ilość kompozycji według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
Korzystnie kompozycja szczepionki zawiera ponadto jeden lub więcej adiuwantów.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania immunogennej kompozycji liposomowej obejmującego:
rozpuszczenie lipidów tworzących pęcherzyki i konstruktu antygenowego określonego powyżej w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym;
tworzenie błony lipidowej albo rozpyłowego proszku lipidowego przez odparowanie rozpuszczalnika organicznego;
uwodnienie błony lipidowej albo proszku; i zdyspergowanie uwodnionej błony lipidowej albo proszku z wytworzeniem immunogennej kompozycji liposomowej.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzi sposób wytwarzania immunogennej kompozycji liposomowej, który obejmuje:
rozpuszczenie konstruktu antygenowego określonego powyżej w wodnym buforze;
uwodnienie proszków lipidowych lub błon lipidowych w buforze zawierającym konstrukt antygenowy określony powyżej i zdyspergowanie proszków lub błon lipidowych z wytworzeniem immunogennej kompozycji liposomowej.
PL 206 260 B1
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania immunogennej kompozycji liposomowej, który obejmuje:
rozpuszczenie konstruktu antygenowego określonego powyżej w wodnym buforze; i dodanie konstruktu antygenowego określonego powyżej do utworzonych wcześniej liposomów z wytworzeniem immunogennej kompozycji liposomowej.
Krótki opis rysunków
Na figurze 1 pokazano skuteczność kompozycji liposomowej według wynalazku w ochronie przeciw HSV2.
Na figurze 2 pokazano porównanie skuteczności kompozycji liposomowej według wynalazku z innymi kompozycjami szczepionki.
Na figurze 3 pokazano krzywą przeżywalności myszy przedstawiając zdolność liposomowej HSV2g(1-23)-HD do wzbudzania ochronnej odpowiedzi odpornościowej.
Niniejszy wynalazek dotyczy immunogennej kompozycji liposomowej, która zawiera konstrukt antygenowy zaprojektowany w celu zwiększenia skuteczności i bezpieczeństwa immunizacji przeciw wielu czynnikom mikrobiologicznym i nowotworom (rakom). Immunogen może być kodowany przez kasetę genową, która składa się z domeny hydrofobowej (HD) sfugowanej ze specyficzną sekwencją antygenową. Przygotowuje się plazmid zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą HD i epitop antygenowy, który wyraża się w odpowiednim gospodarzu, takim jak, na przykład, E. coli, P. pastoris, komórki owadzie albo komórki CHO (Genetic Engeneering News, 18:17(1998). Po wyrażeniu i oczyszczeniu białka jest ono formułowane w liposomie. W obecności błony, białko łączy się z podwójną warstwą lipidową w celu wytworzenia stabilnej struktury z częścią hydrofobową zwią zaną z bł oną i epitopem antygenowym zorientowanym w stronę ś rodowiska wodnego. Plazmid moż na skonstruować tak, aby zawierał miejsca restrykcyjne w kluczowych lokalizacjach, a także aby różne epitopy antygenowe można było łatwo podstawić, dostarczając możliwości wykorzystania różnych epitopów antygenowych i zapewniając maksymalną ochronę po immunizacji. Jedną z unikatowych właściwości tej kasety jest to, że składnik białkowy może być wytwarzany w komórkach gospodarza w dużych ilościach, łatwo oczyszczany, a następnie włączony do liposomów. Zapewnia to maksymalną elastyczność przy określaniu najbardziej odpowiedniego epitopu, który pobudza ochronę przed czynnikami mikrobiologicznymi albo rakami, zachowując jednocześnie zdolność do osiągnięcia ostatecznego celu, jakim jest wytwarzanie na dużą skalę i dystrybucja handlowa szczepionki.
Wytwarzanie konstruktu antygenowego jak opisano powyżej dostarcza szeregu korzyści: (1) epitopy można łatwo zmieniać w celu zapewnienia maksymalnej elastyczności przy projektowaniu szczepionki; (2) do cząsteczki nośnikowej można wstawiać wiele epitopów; (3) jeżeli to pożądane, można dołączyć duże sekwencje antygenowe (np. biała otoczki albo domeny receptorowe) albo podjednostki; (4) wyrażane białko nośnikowe jest rozpuszczalne i można je łatwo oczyścić przy zastosowaniu standardowych technik przygotowywania białek. Synteza konstruktów antygenowych jako rozpuszczalnego w wodzie produktu fuzji minimalizuje potencjalne problemy oczyszczania na dużą skalę powodowane przez hydrofobowe regiony białka. A zatem konstrukcja białka mającego domenę hydrofobową do wstawienia do błony liposomu, a jednocześnie ciągle rozpuszczalnego w wodzie, jest bardzo korzystna. W niektórych sytuacjach w czasie oczyszczania można zastosować niewielkie ilości czynnika upłynniającego, takiego jak guanidyna, mocznik, siarczan dodecylu sodu, glukozyd albo deoksycholan oktylowy.
Konstrukt antygenowy, który jest składnikiem immunogennej kompozycji lipidowej według niniejszego wynalazku może zawierać dwa lub więcej antygenów. Takie konstrukty mogą być przedstawione jako:
H2N-Miejsce antygenowe I-HD-Miejsce anytygenowe II-COOH
Niniejszym rozważano również zastosowanie pojedynczych transbłonowych helis pochodzenia naturalnego albo syntetycznego, albo wiązek helikalnych (2-12). Miejsca antygenowe mogą znajdować się na końcu N albo C albo mogą być umieszczone pomiędzy pętlami utworzonymi między poszczególnymi nićmi w wiązce.
Stosowany tu termin antygen dotyczy dowolnej substancji (w tym białka albo białkapolisacharydu, lipopolisacharydu, jednostki bakteryjnej, całego patogenu albo markera nowotworowego), która kiedy jest obca dla zwierzęcia będącego gospodarzem i po dotarciu do tkanki takiego zwierzęcia, stymuluje makrofagi, komórki prezentujące antygen, i wytwarzanie przeciwciał swoistych wobec antygenu oraz reaguje specyficznie in vivo i in vitro z takimi przeciwciałami. Ponadto, antygen stymuluje proliferację i/lub aktywację limfocytów T z receptorami dla antygenu i reagujących krzyżowo
PL 206 260 B1 antygenów (np. komórek naturalnych zabójców (NK), cytotoksycznych komórek T i pomocniczych komórek T) i może reagować z limfocytami w celu zainicjowania serii odpowiedzi określanych jako odporność komórkowa. W kompozycjach immunogennych według wynalazku korzystne jest, jeżeli antygen jest obecny w ilości 0,1-20 mg/ml antygenu-HD. Bardziej korzystnie antygen jest obecny w iloś ci okoł o 0,5-5 mg/ml antygenu-HD.
Determinanta antygenowa jest częścią antygenu albo konstruktu antygenowego, która określa jego specyficzność antygenową. Zwykle determinanta antygenowa albo hapten jest peptydem, białkiem lub polisacharydem w naturalnie występujących antygenach. W antygenach sztucznych, może on być substancją o niskim ciężarze cząsteczkowym, taką jak pochodna kwasu arsanilowego. Determinanta antygenowa będzie reagować specyficznie in vivo albo in vitro z przeciwciałem albo limfocytami T indukowanymi przez antygenową postać determinanty antygenowej (np. determinanta antygenowa przyłączona do substancji immunogennej).
Determinanta antygenowa, którą można zastosować przy wykonywaniu wynalazku, może pochodzić, na przykład, z antygenów przedstawionych poniżej:
Patogeny wirusowe
Wirus Antygen Odnośnik
1 2 3
Choroba niebieskiego języka owiec Strukturalny Murray i Eaton, 1996, Austral. Vet.J.73:207
Opryszczki bydlęcej (IBR) Franz i wsp., 1996, Veterini Medicina 41: 213
Rotawirus biegunki cieląt E2 Bruschke i wsp., 1997, Vaccine 15: 1940; Ludeman i Katz, 1994, Biologicals 22: 21
Cytomegalowirusa gp58 Wagner i wsp., 1992, J. Virol. 66: 5290
GB Wang i wsp., 1996, J. Inf. Dis. 174: 387
Poliepitop Ag Thomson i wsp., 1996, J.Immunol. 157:822
PrM Fonseca i wsp., 1994, Vaccine 12: 279
E Fonseca i wsp., 1994, Vaccine 12: 279
E/NS1 Venugopal i Gould, 1994, Vaccine 12:967
NS1/NS2 Green i wsp., 1997, Virol. 234: 383
Otoczka B Simmons i wsp., 1998, Am. J. Trop. Med. Hyg. 58: 655
Kapsyd typ 4 Gagnon i wsp., 1996, J. Virol. 70: 141
Nosówka(psia) F/H Pardo i wsp., 1997, Am. J. Vet. Res. 58: 833
Ebola GP/NP. Vanderzanden i wsp., 1998, Virol. 246:134
Epstein-Barr EBNA 1,2,3,4,6 Moss i wsp., 1992, Sem. Immunol. 4: 97
Pryszczycy VPI Filgueria i wsp., 1995, Vaccine 13: 953
Zapalenie wątroby typu A A/B combo Ag Bruguera i wsp., 1996, Vaccine 14: 1407
Zapalenie wątroby typu B HbsAg Thanavala i wsp., 1995, PNAS 92: 3358; Skelly i wsp., 1981, Nature 290: 51
Zapalenie wątroby typu C E2/NS1 Weiner i wsp., 1992, PNAS 89: 3468; Taniguchi i wsp., 1993, Virol. 195:297
NS3 Khudyakov i wsp., 1995, Virol. 206: 666
NS4 Khudyakov i wsp., 1995, Virol. 206: 666
NS5 Khudyakov i wsp., 1995, Virol. 206: 666
E1 Lechner i wsp., 1998, Virol. 243: 313
Opryszczka pospolita I GD Long i wsp., 1984, Inf. Immun. 37: 761
PL 206 260 B1 cd. tabeli
1 2 3
Opryszczka pospolita IIC GB McDermott iwsp., 1989, Virol 169: 244
GD Long i wsp., 1984, Inf. Immun. 37: 761
Opryszczka B Hunt i Melendez, 1969, Lab. Animal Care 19:221
Cholera świń E1 van Rijn i wsp., 1994, J. Virol 68: 3934
Niedobór odporności człowiekad HIV Molccular Immunology Database
Brodawki człowieka L1 Suzich i wsp., 1995, PNAS 92: 11553; Stauss i wsp., 1992, PNAS 89:7871
E6 Stauss i wsp., 1992, PNAS 89: 7871
E7 Stauss i wsp.. 1992. PNAS 89: 7871
Grypy HA/N Laver i Webster, 1976, Virol. 69: 511
NP Martinon i wsp., 1993, Eur. J. Immunol. 23: 1719
Japońskie zapalenie mózgu E Kimura-Kuroda i Yasui, 1988, J. Immunol 141: 3606
Marburg GP Hevey i wsp., 1997, Virol. 239: 206
Choroba Mareka (drób) GA Boyle i Heine, 1993, Immun. Cell Biol. 71: 391
GB Boyle i Heine, 1993, Immun. Cell Biol 71: 391
Odra HA Cordoso i wsp., 1998, J. Virol. 72: 2516
NP Cordoso i wsp., 1998, J. Virol. 72: 2516
Norwalk Kapsyd 56 kD Ball i wsp., 1998, J. Virol. 72: 1345
Choroba Newcastle (drób) F Reddy i wsp., 1996, Vaccine 14: 469
HN Reddy i wsp., 1996, Vaccine 14: 469
Paragrypa F/HN Morein i wsp, 1983, J. Gen. Virol 64: 1557
Parwowirus (psy) VP2 Lopez de Turiso i wsp., 1992, J. Virol. 66: 2748
Wścieklizna G Wiktor i wsp., 1984, PNAS 81: 7194
Syncytialny oddechowy białko F Falsey i Walsh, 1996, Vaccine 14: 1214
podjednostka FG Neuzil i wsp., 1997, Vaccine 14: 525; Hemming i wsp., 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8: 22
Zaraza bydła H/F Naik i wsp., 1997, Vaccine 15: 603
Rotawirusc VP4 Zhou i wsp., 1994, J. Virol. 68: 3955
VP7 Zhoui wsp., 1994, J. Virol. 68: 3955
VP6 Palombo i wsp., 1994, J. Gen. Virol. 75:2415
Różyczka E1 Trudel i wsp., 1985, J. Virol. Meth. 12:243
Varicella-Zoster GE Fowler i wsp., 1995, J Virol. 214: 531; Arvin, 1996, Inf. Clin. Dis. N. Amer. 10: 529
Żółta gorączkab E Gould i wsp., 1986, J. Gen. Virol. 67: 591
NS1 (48kD) Schleschinger i wsp., 1987, J. Immunol.135: 2805
a. Praca przeglądowa, patrz Pass, 1996, Inf. Ag. Dis. 5: 240; Avery, 1998, Curr. Op. Cardiol. 13: 122.
b. Wszystkie te wirusy są flawowirusami - przegląd w Venugopal i Gould, 1994, Vaccine 12: 966.
c. Praca przeglądowa, patrz Adimora i wsp., 1994, Inf. Dis. Clin. N. Amer. 8: 859.
d. Lista antygenów HIV, patrz HIV Molecular Immunology Database, publ. Theoretical Biology and Biophysics, New Mexico (1995).
e. Lista antygenów Rotawirusów, patrz Rotavirus Antigens, Hoshino i Kapikian, 1994, Curr. Top. Microbiol.Immunol.185: 179.
PL 206 260 B1
Toksyny bakteryjne*
Bakterie Toksyna Odnośnik
Bacillus anthracis Wąglika Leppla, 1982, PNAS 79: 852
Bordetella pertussis Krztuśca Weiss i Hewlett, 1986 J Ann. Rev. Microbiol. 40:
Clostridium botulinum Jadu kiełbasianego Simpson, 1981, Pharmacol. Rev. 33: 155
Clostridium difficile Difficile Knoop i wsp., 1993, J Clin. Microbiol. Rev. 6: 251
Clostridium tetani Tężca Eidels i wsp., 1983, Microbiol. Rev. 47:596
Corynebacterium diphtheriae Dyfterytu Pappenheimer, 1977, Ann. Rev. Biochem. 46: 69
Escherichia coli Enterotoksyna Gill i Richardson, 1980, J. Int: Dis. 141: 64
Pseudomonas aeruginosa Egzotoksyna A Iglewski i Kabat, 1977, PNAS 72: 2284
Shigella dysenteriae Shiga Keusch i Jacewicz, 1975, J. Inf. Dis. 131: S33
Vibrio cholerae Cholery Finkelstein, 1973, Crit. Rev. Microbiol. 2: 553
*Ogólna praca przeglądowa, patrz Middlebrook i Dorland, 1984, str. 199. Patogeny bakteryjne
Bakteria Antygen Odnośnik
1 2 3
Bacillus sp PA/LF/EF Singh i wsp., 1998, Inf. Immun. 66: 3447
Bordetella sp Pertaktyna/P.69 Anderson i wsp., 1996, Vaccine 14: 1384
Borrelia sp OspA/OspB Ma i wsp., 1996, Vaccine 14: 1366
OspC Mathiesen i wsp., 1998, Inf. Immun. 66:4073
Brucella sp L7/L12 Bachrach i wsp., 1994, Inf. Immun. 62: 5361
Omp 16 Tibor i wsp., 1994, Inf. Immun. 62: 3633
Campylobacter sp Omp 18 Konkel i wsp, 1996, Inf. Immun.
Chlamydiaf MOMP Sparling i wsp., 1994, PNAS 91: 2456
Ehrlichia sp Rikihisa. 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 286
Escherichia sp PAL Chen i Henning, 1987, Eur. J. Biochem. 163: 73
Haemophilusf sp P1 Loeb, 1987, Inf. Immun. 55: 2612
P2 Munson i wsp., 1983, J. Clin. Invest. 72: 677
P4 Green i wsp., 1991, Inf. Immun. 59: 3191
P5 Munson i Granoff J985, Inf. Immun. 49: 544
P6 Green i wsp., 1990, Inf. Immun. 58: 3272
Białko D Akkoyunlu i wsp., 1996, Inf. Immun.
D15 Thomas i wsp., 1990, Inf. Immun. 58: 1909; Yang i wsp., 1998, Inf. Immun. 66: 3349
białko 98 kD Kimura i wsp., 1985, Inf. Immun. 47: 253
HtrA Loosmore i wsp., 1998, Inf. Immun. 66: 899
Helicobacter pylori Ureaza A Michetti i wsp., 1994, Gastroenterol. 107:1002
Ureaza B Michetti i wsp., 1994, Gastroenterol. 107:1002
Vac A Kleanthous i wsp., 1998, Brit. Med. Bull. 54: 229
PL 206 260 B1 cd. tabeli
1 2 3
Katalaza Radcliff i wsp., 1997, Inf. Immun. 65:4668
Legionella sp Pp1A Ludwig i wsp., 1996, Inf. Immun. 64:1659
Leptospira sp OMA Brown i wsp., 1991, Inf. Immun. 59: 1772
Listeria sp LLO Harty i Bevan, 1992, J. Exp. Med. 175:1531
Mycobacterium leprae białko 35kD Triccas i wsp., 1996, Inf. Immun. 64:5171
18kD Baumgart i wsp., 1996, Inf. Immun. 64:2274
Ag85A Launois i wsp., 1994, Inf. Immun. 62:3679
Mycobacterium tuberculosum MPB59 Roche i wsp., 1994, Inf. Immun. 62: 5319
Ag85 A Launois i wsp., 1994, Inf. Immun. 62:3679
Mycoplasma 90Kd Franzoso i wsp., 1993, Inf. Immun. 61:1523
Neisseriaf sp OMV Anderson i wsp., 1997, Vaccine 15: 1225
Por Sparling i wsp., 1994, PNAS 91: 2456
Pseudomonas sp OprF Hughes i wsp., 1992, Inf. Immun. 60:3497
Oprl Specht i wsp., 1996, Vaccine 14: 1111
Polisacharyd-O Hatano i Pier, 1998, Inf. Immun. 66: 3719
Salmonella sp OMP/Por Alurkar i Kanat, 1997, Inf. Immun. 65:2382
Vi Plotkin i Bouveret-LeCam, 1995, Arch. Int. Med.
Staphylococcus sp CP Fatton i wsp., 1996, Inf. Immun. 64: 1659
RAP (38kD) Balaban i wsp., 1998, Science 280: 438
Streptococcus spM Beachey i wsp., 1988, Vaccine 6: 192
Treponema palladiumf TROMP Sparling i wsp., 1994, PNAS 91: 2456
Yersinia sp F1/N Leary i wsp., 1997, Microbiol Pathogen. 23: 167
f. Praca przeglądowa, patrz Adimora et al., 1994. Inf. Dis. Clin. N. Amer. 8: 859. Patogeny grzybowe
Organizm Antygen Odnośnik
Aspergillus Kurup i Kumar, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 439
Candida Pra1 Setandreu i wsp., 1998, J. Bacteriol. 180: 282
Coccidioides białko 48kD Kirkland i wsp., 1998, Inf. Immun. 66: 424
CF Yang i wsp., 1997, Inf. Immun. 65: 4068
PRA Kirkland i wsp., 1998, Inf. Immun. 66: 3519
Cryptococcus Mitchell i Perfect, 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8: 515
Histoplasma Deepe, 1997, Clin. Microbiol. Rev. 10: 585
Paracoccidioides brasiliensis Brummer i wsp., 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6: 89
Pneumocystis carinii GpA Gigliotti i wsp, 1998, Inf. Immun. 66: 3179
PL 206 260 B1
Patogeny pasożytów
Organizm Antygen Odnośnik
Cryptosporidium Current i Garcia, 1991, Clin. Microbiol. Rev. 4: 325
Entamoeba histolytica SREHP(K2) Stanley i wsp., 1990, PNAS 87: 4976
Ariel Mai i Samuel son, 998, Inf. Immun. 66: 353
170kD Lotter i wsp., 1997, J. Exp. Med. 185: 1793
Giardia lamblia VSP Stager i wsp., 1997, Int. J. Parasitol. 27: 965
Leishmania sp gp63 Kahli wsp., 1990, Inf. Immun. 58: 3233
Nramp-1 1998, Inf. Immun. 66: 1910
TSA Webbiwsp., 1998, Inf. Immun. 66: 3279
Plasmodium sp białko 27 kD Contreras i wsp., 1998, Inf. Immun. 66: 3579
AMA-1 Anderson i wsp., 1998, Vaccine 16: 240
CS Nardin i wsp., 1998, Vaccine 16: 590;
epitopy prot 1998, Inf. Immun. 66: 2895
białko 195 Kd Patarroyo i wsp., 1987, Nature 328: 629
białko 55 kD Patarroyo i wsp., 1987, Nature 328: 629
białko 35 kD Patarroyo i wsp., 1987, Nature 328: 629
Schistosoma sp Sm28GST Ballone i wsp., 1987, Nature 326:149
Trypanosoma sp białko 56 kD Harth i wsp., 1994, Mol. Microbiol. 11:261
Nowotwory**
Nowotwór Antygen Odnośnik
Sutka MUC-1 Denton i wsp., 1993, Canc. Lett. 70: 143
Okrężnicy CEA Conry i wsp., 1994, Canc. Res. 54: 1164
Białaczka BCR/ABL Chen i wsp., 1992, PNAS 89:1468.
Chłoniak Self Ag Kwak i wsp., 1992, New Eng. J. Med. 327: 1209
Czerniak MART-1 Kawakami i wsp., 1994, PNAS 91: 3515
MAGE-1 Traversari i wsp., 1992, J. Exp. Med. 176: 1453
p97 Hu i wsp., 1988, J. Virol. 62: 176
Jajnika MUC-1 Jerome i wsp., 1993, J. Immunol. 151: 1654
Trzustki MUC-1 Bashford i wsp., 1993, IntJ. Canc. 54: 778
Ogólna praca przeglądowa, patrz Finn, 1993, Curr. Op. Immunol. 5: 701.
Dodatkowe przykłady antygenów i patogenów, które można zastosować, znajdują się w Milich, 1989 (Adv. Immunol. 45:195), Hoshino i Kaplan, 1994 (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 185: 179) albo Venugopal i Gould, 1994 (Vaccine 12:966). Zgodnie z jednym z wykonań, używa się podjednostki gp 120 genu env i p27 genu gag z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). W innym wykonaniu, determinanta antygenowa może pochodzić z antygenu wybranego spośród gD lub gB HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA albo NA INFV, P5 lub P6 H. influenzae, białka fimbrii i białka D.
Stosowany tu termin wektor dotyczy kwasu nukleinowego, (np. DNA) pochodzącego z plazmidu, kosmidu, fagmidu lub bakteriofaga albo pochodzenia syntetycznego, do którego można wstawić albo wklonować fragmenty kwasów nukleinowych. Wektor może zawierać jeden albo większą liczbę
PL 206 260 B1 unikalnych miejsc restrykcyjnych do tego celu i może być zdolny do autonomicznej replikacji w określonym gospodarzu albo organizmie, tak, że klonowana sekwencja ulega reprodukcji. Cząsteczka wektora może nadawać jakiś dobrze zdefiniowany fenotyp organizmowi gospodarza, który jest albo selekcjonowany albo łatwo wykrywany. Niektóre składniki wektora mogą być cząsteczkami DNA zawierającymi elementy regulatorowe do transkrypcji, translacji, stabilności RNA i replikacji oraz inne sekwencje DNA.
Stosowany tu termin kaseta DNA dotyczy sekwencji genetycznych w obrębie wektora, które mogą kierować ekspresją opisanego tu białka fuzyjnego. Kwas nukleinowy stanowiący kasetę jest zorientowany pod względem pozycji i sekwencji w obrębie wektora, tak, że kwas nukleinowy w kasecie może ulegać transkrypcji do RNA, a gdzie to konieczne, translacji do produktu będącego białkiem fuzyjnym. Korzystnie kaseta ma swoje końce 3' i 5' przystosowane do łatwego wstawiania do wektora, tj. ma miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych na obydwu końcach.
Jakkolwiek korzystnie konstrukty antygenowe są wytwarzane przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA, jest zrozumiałe, że konstrukty można syntetyzować dowolną metodą znaną w tej dziedzinie, np. metodami chemicznymi. Może to być szczególnie wygodne, gdy trzeba użyć niepeptydowego łącznika lub gdy domena hydrofobowa zawiera aminokwasy nie występujące w naturze lub mimetyczne. A zatem, korzystnie stosuje się metody rekombinacji do wytwarzania antygenowych białek fuzyjnych, ale konstrukty antygenowe z immunogennej kompozycji liposomowej według niniejszego wynalazku mogą też być wytwarzane przy zastosowaniu syntezy chemicznej lub przez połączenie metod rekombinacji DNA i chemicznych.
Oprócz korzystnego peptydu łącznikowego można zastosować inne łączniki znane w tej dziedzinie w celu połączenia antygenu z domeną hydrofobową. Przykłady takich łączników obejmują, ale nie wyłącznie, glikole polietylenowe, polisacharydy, kwasy polisialowe, kwas bursztynowy, kwas butanodiowy, kwas adypinowy oraz typowe związki sieciujące, takie jak: SMPT (4-sukcynoimidyloksykarbonylo-a-metylo-a-(2-pirydyloditio)-toluen, DSP (ditiobis(sukcynoimidylopropionian), EGS (bis(suscynoimidylobursztynian glikolu etylenowego), SMCC (4-sukcynoimidyloksykarbonylo-4-(N-maleimidometylo)cykloheksan-1-karboksylan) i SPDS (N-sukcynoimidylo-3-(2-pirydyloditio)-propionian)(Patrz także katalog Pierce Chemical Co., Rockford, IL.)
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem liposom pełni krytyczną rolę w dostarczaniu antygenu, ponieważ kompleks antygen-liposom jest bezpośrednio prezentowany układowi immunologicznemu po usunięciu z krwiobiegu przez komórki układu immunologicznego. Ponadto, wybór dróg immunostymulacji może być zmieniony przez wprowadzenie zmian w składzie lipidowym liposomu. Na przykład, różne cząstki immunostymulacyjne, takie jak lipid A (Asano i Kleinermtan, 1993, J. Immunother. 14:286), P3CSS (Lex i wsp., 1986, J. Immunol. 137:2676), muramylo di- i tripeptyd-PE (Fidler i wsp., 1981, PNAS 78:1680; Alving i wsp., 1985, Vaccines 4:166) oraz lipidy kationowe (Walker i wsp., 1992, PNAS 89:7915) mogą być użyte do wywarzania liposomy, aby pobudzić różne drogi immunologiczne. Inne adiuwanty, takie jak na przykład MF59, Quil A, QS21 lub alum można zastosować w połączeniu z kompleksem antygen-liposom. Dodatkowo, w celu wywołania reakcji immunologicznej można dodać cząsteczki immunoregulacyjne, takie jak cytokiny.
Liposomy stosowane przy wykonywaniu niniejszego wynalazku można wytworzyć z bardzo różnorodnych tworzących pęcherzyki lipidów, włączając w to fosfatydylowe etery i estry, takie jak fosfatydyloetanoloamina (PE), fosfatydyloseryna (PS), fosfatydyloglicerol (PG) i fosfatydylocholina (PC); glicerydy, takie jak dioleoiloglicerobursztynian; cerebrozydy; gangliozydy; sfingomieliny; steroidy, takie jak cholesterol; oraz inne lipidy, jak również inne zaróbki, takie jak witamina E lub palmitynian witaminy C (patrz także patenty USA nr nr 4,235,871; 4,762,720; 4,737,323; 4,789,633; 4,861,597 i 4,873,089). Przykłady lipidów opartych na PC obejmują, ale nie wyłącznie, (C-18) distearoilofosfatydylocholinę (DSPC); (C-16) dipalmitoilofosfatydylocholinę (DPPC); (C-14) dimirystoilofosfatydylocholinę (DMPC) oraz (C-18, nienasycony) dioleoilofosfatydylocholinę (DOPC). Korzystnie lipidy są w fazie ciekłej w temperaturze ciała (około 38-39°C). A zatem lipidy z Tm powyżej temperatury ciała, takie jak DSPC i DPPC są mniej korzystne (choć mogą być nadal przydatne). Lipidy z Tm poniżej temperatury ciała, takie jak DMPC lub DOPC są korzystniejsze. Ponadto korzystnie kompozycja lipidową zawiera nie więcej niż około 10% cholesterolu. Szczególnie korzystne kompozycje lipidowe zawierają około 0-10% cholesterolu, około 0-15% PG i około 0-100% PC. W pewnych korzystnych wykonaniach, kompozycja może dodatkowo zawierać około 1-10% adiuwanta (-ów); korzystnie adiuwant jest obecny w ilości mniejszej niż około 5%.
PL 206 260 B1
Wytwarzanie liposomów jest dobrze znane w stanie techniki. Ogólnie rzecz biorąc, liposomy są wytwarzane różnymi technikami, włączając w to wstrzykiwanie etanolu (Batzri i wsp., 1973, Biochem. Biophys. Acta. 298:1015), wstrzykiwanie roztworu eterowego (Deamer i wsp., 1976, Biochem. Biophys. Acta. 443:629; Schieren i wsp, 1978, Biochem. Biophys. Acta. 542:137), usuwanie detergentu (Razin, 1972, Biochem. Biophys. Acta. 265:241), odparowywanie rozpuszczalnika (Matsumato i wsp., 1977, J. Colloid Interface Sci. 62: 149), odparowywanie organicznych rozpuszczalników z chloroformu w wodnych emulsjach (REV's)(Szoka Jr. i wsp., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:4194), przetłaczanie MLV's lub EUV's przez porowate membranę poliwęglanową (Olson i wsp., 1979, Biochem. Biophys. Acta. 557:9), zamrażanie i rozmrażanie mieszanin fosfolipidowych (Pick, 1981, Archives of Biochem. and Biophysics, 212:186), jak również sonifikację i homogenizację.
Zgodnie z konwencją liposomy są klasyfikowane według rozmiarów, a 3-literowe oznaczenie jest używane do oznaczenia typu omawianego liposomu. Wielowarstwowe pęcherzyki określane są ogólnie jako MLV. Małe jednowarstwowe pęcherzyki określane są jako SUV, a duże jednowarstwowe pęcherzyki są określane jako LUV. Określenia te są czasem uzupełniane nazwą składu chemicznego liposomu. Omówienie nazewnictwa i podsumowania znanych typów lizosomów można znaleźć w Storm i wsp., 1998, PSIT: 1:19-31.
W zastosowaniach według wynalazku wykorzystana jest kompozycja liposomowa, tj. kompozycja, która w kombinacji z dowolną dodaną zaróbką albo nośnikiem, będzie dawała w wyniku wykrywalną odpowiedź immunologiczną gospodarza. Tam, gdzie kompozycja będzie stosowana jako kompozycja szczepionki w połączeniu z dowolną dodaną zaróbką albo nośnikiem będzie ona powodowała, że gospodarz wytwarza swoistą i wystarczającą odpowiedź immunologiczną, tak, aby uzyskać ochronę gospodarza przed następującą później ekspozycją na mikroorganizm (szczepienie profilaktyczne) albo aby uzyskać ochronę u już chorego gospodarza (szczepienie terapeutyczne).
Wynalazek będzie teraz ogólnie opisany tym samym będzie lepiej zrozumiały przez odniesienie się do następujących szczegółowych przykładów, które są dostarczone jako ilustracja i nie jest ich zamiarem ograniczanie wynalazku o ile nie jest to zaznaczone.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d I-HSV2
Wytwarzanie HSV2gD(1-23)-TM. N-końcowy 23-aminokwasowy odcinek z białka otoczki gD HSV2 połączono z odcinkiem transbłonowym (TM) poprzez syntezę chemiczną w automatycznym syntetyzatorze peptydów. Zsyntetyzowany peptyd przecięto standardową metodą cięcia HF i preparaty oczyszczono przez preparatywną chromatografię HPLC przy zastosowaniu kolumny Waters C18 i 100% acetonitrylu z 1% TFA jako fazy ruchomej. Wykazano przez spektrometrię mas i elektroforezę kapilarną, że peptyd jest czysty w co najmniej 95%.
Wytwarzanie liposomów. Liposomy przygotowuje się przez sonikację według wcześniej opisanych procedur (Fujii i wsp., 1997, Biochemistry 36:4959). Pokrótce, lipidy (z albo bez białka) rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chloroform/metanol. Cienkie błony lipidowe wytwarza się przez odpipetowanie porcji lipidowych roztworów do okrągłodennych szklanych probówek i odparowanie rozpuszczalnika w 65°C pod strumieniem azotu. Bł ony umieszcza się pod próż nią na co najmniej osiem godzin w celu usunięcia resztek rozpuszczalnika organicznego. Wytwarzanie liposomów uzyskuje się przez uwodnienie błon lipidowych buforem i inkubowanie zawiesiny w 65°C przez
5-10 minut przed sonikacją próbki. Następnie, w celu wysterylizowania preparatu liposomy filtruje się przez filtr 0,22 μm. Liposomy kalibruje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, a tworzenie agregatów śledzi się przez co najmniej cztery tygodnie.
Szczególnie korzystna formulacja liposomowa HSV2gD(1-23)-TM ma stosunek molowy DMPC:Chol:DMPG (dimirystoilofosfatydylocholina: cholesterol: dimirystoilofosfatydyloglicerol) jak 15:2:3 z 2,5% wagowych Lipidu A.
Procedury szczepienia i testowania indukcji reakcji immunologicznej na antygen wirusowy
Samicom myszy BALB/c lub C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni) wstrzykuje się podskórnie testowany preparat szczepionki lub bufor raz na tydzień przez dwa, trzy lub cztery tygodnie. Miejsca iniekcji obserwuje się pod kątem niekorzystnych reakcji, takich jak rozwój ziarniniaka i/lub tworzenie strupów.
Gdy zwierzęta immunizuje się za pomocą szczepionki drogą donosową, znieczula się je halotanem, a kompozycję (10-20 μθ podaje się do nozdrzy do wdychania za pomocą sterylnej końcówki mikropipety (Gallichan i wsp., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).
W regularnych odstępach w czasie procesu szczepienia i po prowokacji wirusem mierzy się reakcję immunologiczną myszy na antygen wirusowy. Test neutralizacji wirusa przeciwciałem przepro12
PL 206 260 B1 wadza się przy pomocy 24-studzienkowej płytki zawierającej po 1x105 komórek BHK, do których dodaje się różne rozcieńczenia mysiej surowicy zmieszanej z wirusem. Po 48-72 godzinach inkubacji w 37°C w inkubatorze z CO2 tworzą ce się monowarstwy komórek bada się pod kątem cytotoksyczności oraz określa się miano neutralizujących przeciwciał. Wytrącające się przeciwciała wobec wirusa mierzy się przez inkubację różnych rozcieńczeń surowicy z 5-10 μο antygenu wirusowego lub 25-50 μ!
zawiesiny szczepu HSV2 (1x105 PFU). Liposomy zawierające epitop antygenu są również używane jako cele w testach przeciwciało/ELISA, jak opisano wcześniej (Tuso i wsp., 1993, Transplantation 55:1375). Wyniki tego ostatniego testu będą zastosowane do mierzenia poziomu wiązania i konfiguracji izotypowej przeciwciał.
Odpowiedź nadwrażliwości typu późnego na antygen wirusowy u szczepionych myszy testuje się metodą poduszeczki łapy. Szczepione zwierzęta znieczula się halotanem i wstrzykuje się im 50 μl inaktywowanego ultrafioletem HSV2 do poduszeczki jednej tylnej łapy i 50 μl zlizowanych, niezakażonych komórek do poduszeczki drugiej tylnej łapy. Dwadzieścia cztery, czterdzieści osiem i siedemdziesiąt dwie godziny później u myszy mierzy się za pomocą miernika Verniera stopień obrzmienia poduszeczki łapy, a następnie porównuje się z pomiarami odniesienia. Aktywność komórek T u tych zwierząt mierzy się również wytwarzaniem cytokin w odpowiedzi na inkubację śledzionowych komórek T z antygenem wirusowym. Od szczepionych zwierząt pobiera się śledziony, a następnie homogenaty śledziony wytwarza się przez łagodne rozdrabnianie za pomocą sterylnego tłoczka i przepuszczenie komórek przez nylonowe sito. Zawiesiny komórek przepłukuje się i umieszcza w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania po 1x106 komórek/studzienkę. Po inkubacji komórek w 37°C przez 3-4 dni i przy różnych ilościach antygenu wirusowego, supernatanty ze studzienek zbiera się i testuje na obecność cytokin. Do określania profilu cytokin (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ, β-aktyny oraz TNF-α z PharMingen, Inc. (San Diego, CA)) stosuje się dostępne handlowo zastawy ELISA dla cytokin. Wykrywanie białka cytokin w supernatantach hodowli tkankowych metodą kanapkową-ELISA przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) swoistych dla określonych cytokin. Płytki ELISA pokrywa się przez noc szczurzym mAb przeciw mysiej cytokinie. Płytki blokuje się 3% płodową surowicą cielęcą w PBS przez 2 godziny, następnie jednakowe objętości każdej próbki badanej dodaje się do poszczególnych studzienek. Do każdej studzienki dodaje się biotynylowane swoiste wobec cytokiny szczurze anty-mysię mAb, a następnie peroksydazę z awidyną. Reakcję barwną uzyskuje się po dodaniu substratów kolorymetrycznych. Płytki odczytuje się w spektrofotometrze ELISA, a stężenie cytokin oblicza wg krzywej standardowej uzyskanej z kontrolnych rekombinowanych cytokin.
HSV-2 zapalenia mózgu u myszy jako model do testowania liposomowych preparatów szczepionek
Szczepione lub nieszczepione (kontrolne) samice myszy BALB/c (w wieku 10-12 tygodni) prowokuje się śródotrzewnowo letalną dawką(1x105PFU) HSV-2 pasażowanego z mózgu. Myszy prowokowane dopochwowo letalną dawką HS V-2 są wcześniej traktowane podanym podskórnie estrogenem 1 tydzień przed testem i jeden dzień (-1) przed prowokacją. Następnie myszy znieczula się z dootrzewnową iniekcją acepromazyny i ketaminy. HSV22 (10-30μΟ podaje się dopochwowo przy użyciu sterylnych końcówek mikropipety po dokonaniu pędzlowania pochwy za pomocą suchego Calgiswab (McDermott i wsp., 1984, J. Virol. 51:747). Zwierzęta obserwuje się przez 80 dni po prowokacji pod kątem: przeżywalności (codziennie), utraty wagi (codziennie przez pierwsze 2 tygodnie, a następnie raz na tydzień), pojawienia się sierści oraz objawów neurologicznych (zmniejszoną aktywność, wleczenie lub paraliż kończyn).
Indukowany przez antygen test proliferacji komórek T. Uczulenie gospodarza na antygen gD mierzy się przy zastosowaniu indukowanego przez antygen testu proliferacji komórek T. Homogenaty śledziony wytwarza się przez łagodne rozdrabnianie za pomocą sterylnego tłoczka i przepuszczanie komórek przez nylonowe sito. Komórki zawiesza się w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą (FCS), 10 mM bufor Hepes, L-glutaminę (2 mM), penicylinę (25 j. m./ml) i streptomycynę (25 μg/ml). Komórki hoduje się w stężeniu 1 x 106 komórek/ml z i bez gD (5-20 μg/ml) w 96-studzienkowych U-dennych płytkach przez 4 dni w 5% CO2. Hodowle znakuje się pulsowo 20 μl barwnika rezazurynowego przez 3 godziny, a następnie mierzy się fluorescencję w Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
PL 206 260 B1
Analiza mRNA specyficznego dla cytokiny. Komórki T od immunizowanych i nieimmunizowanych zwierząt bada się pod kątem poziomów mRNA specyficznych dla cytokiny dla głównych cytokin, które mogą wpływać na uczulenie związane z immunizacja, w tym IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10.
Komórki T otrzymuje się ze śledzion, jak opisano poprzednio. Całkowity RNA izoluje się przy zastosowaniu modyfikacji (Cosenza i wsp., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) metody opisanej przez Chomczynsky i Sacchi (Chomczynsky i wsp., 1987, Analyt. Biochem. 162: 156). Świeże albo zamrożone komórki (2 x 106) rozbija się w 1 ml roztworu do denaturacji (4 mM tiocyjanian guanidyny, 25 mM cytrynian sodu (pH 7,0), 0,5% sarkozyl i 0,1 mM 2-merkaptoetanol. RNA wytrąca się przez inkubowanie z jedną objętością izopropanolu przez noc w -20°C. Stężenie całkowitego RNA doprowadza się do 260 nM i próbki przechowuje się w -80°C do czasu przeprowadzenia analizy.
Analizę cytokin przeprowadza się przy zastosowaniu modyfikacji metody opisanej przez Cosenza i wsp. (Cosenza i wsp., 1995, Liver Transpl. Surg. 1: 16). Jednoniciowy cDNA wytarza się przez transkrypcję 2 μg całkowitego RNA w 20 μl całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy ptasiego wirusa mieloblastocytozy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Specyficzne dla sekwencji startery oligonukleotydowe dla cytokin mysich (tabela 1) stosuje się do powielenia fragmentów DNA o przewidywanej wielkości dla każdego z genów cytokin będącego przedmiotem zainteresowania.
T a b e l a 1
Startery oligonukleotydowe użyte do półilościowej analizy cytokin z myszy
Oligonukleotyd Sekwencja kwasu nukleinowego Spodziewana wielkość
IL-2 5' TGATGGGACCTACAGGAGCTCCTGAG (Id. Sekw. Nr: 1) 167bp
3' G AGTC AAATCC AG AAC ATGCCGC AG( Id. Sekw. Nr: 2)
IL-4 5' CGAAGAACACCACAGAGAGTGAGCT (Id. Sekw. Nr: 3) 180bp
3' GACTCATTCATGGTGCAGCTTATCG (Id. Sekw. Nr: 4)
IL-5 5' ATGACTGTGCCTCTGTGCCTGGAGC (Id. Sekw. Nr: 5) 242bp
3 CTGTTTTTCCTGGAGTAAACTGGGG (Id. Sekw. Nr: 6)
IL-6 5' TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG (Id. Sekw. Nr: 7) 154bp
3' TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC (Id. Sekw. Nr: 8)
IL-10 5- TCAAACAAAGGACCAGCTGGACAACATACTGC (Id. Sekw. Nr: 9) 426bp
3' CTGTCTAGGTCCTGGAGTCCAGCAGACTCAA (Id. Sekw. Nr: 10)
IL-12 5' TCGCAGCAAAGCAAGATGTG (Id. Sekw. Nr. 11) 315bp
3' GAGCAGCAGATGTGAGTGGC (Id. Sekw. Nr: 12)
INF 5' AGCGGCTGACTGAACTCAGATTGTAG (Id. Sekw. Nr: 13) 843bp
3' GTCACAGTTTTCAGCTGTATAGGG (Id. Sekw. Nr: 14)
TNF-α 5' GGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGC (Id. Sekw. Nr: 15) 307bp
3' ACATTCGAGGCTCCAGTGAATTCGG (Id. Sekw. Nr: 16)
β-aktyna 5' TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC (Id. Sekw. Nr: 17) 348bp
3' TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG (Id. Sekw. Nr: 18)
Mieszanina do reakcji PCR składa się z 1 μl cDNA, 2,5 μl 10 x buforu do PCR, 1 μl każdego ze starterów 5' i 3', 2,5 μl 10 x dNTP (2 mmol/l) i 0,125 μl termostabilnej polimerazy DNA z T. aquaticus (Boehringer Mannheim) w końcowej objętości 25 pi. Startery specyficzne dla β-aktyny stosuje się do powielenia fragmentu o wielkości 548 bp jako kontrolę wewnętrzną. Na mieszaninę PCR nawarstwia się olej mineralny i amplifikację przeprowadza po inkubacji mieszaniny przez 7 minut w 94°C, w 38 cyklach z 30 sekundową denaturacją w 94°C, 45 sekundowym przyłączeniem startera w 60°C, 60 sekundowym wydłużaniem w 72°C i 7 minutami inkubacji w 72°C. Produkty PCR rozdziela się w żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Prążki uwidacznia w świetle UV, fotografuje i ocenia ilo14
PL 206 260 B1 ściowo densytometrycznie ze zdjęcia przy zastosowaniu oprogramowania Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond CA).
Pomiar cytokin poprzez ELISA. Stosuje się dostępne handlowo zestawy ELISA dla cytokin w celu okreś lenia profilu cytokin wydzielanych przez komórki CD4+ T ze ś ledziony od immunizowanych i nieimmunizowanych zwierząt. Wykrywanie cytokin w supernatantach hodowli tkankowych metodą kanapkową-ELISA przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) swoistych dla określonych cytokin. Pokrótce, płytki ELISA pokrywa się na noc szczurzym mAb przeciw mysiej cytokinie. Płytki blokuje się 3% płodową surowicą cielęcą w PBS przez 2 godziny, następnie do poszczególnych studzienek dodaje się jednakowe objętości każdej próbki badanej Do każdej studzienki dodaje się swoiste wobec cytokiny bitotynylowane szczurze anty-mysie mAb, a następnie peroksydazę z awidyną. Reakcję barwną uzyskuje się po dodaniu substratów kolorymetrycznych. Płytki odczytywane są w spektrofotometrze ELISA, a stężenie cytokin oblicza się z krzywej standardowej uzyskanej z kontrolnych rekombinowanych cytokin.
Odpowiedzi CTL anty-HSV2. Po zaszczepieniu, ocenia się obecność cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych dla antygenu. Limfocyty śledzionowe otrzymuje się jak opisano uprzednio. Limfocyty z każdej traktowanej grupy są łączone razem (n=5), a następnie hodowane przez 3 dni bez antygenu przy 107 komórek/studzienkę w 12-studzienkowych płytkach hodowlanych. Komórki docelowe chłoniaka EL-4 (H21) (ATTC) inkubuje się z peptydem odpowiadającym epitopowi HSV2 gB dla CTL umiejscowionemu między resztami 495-505 (Hanke i wsp., 1991, J. Virol. 65: 1177) dla komórek ograniczonych dla H2 i inkubuje się przez 4 godziny w 37°C. Komórki docelowe przemywa się i do każdej studzienki dodaje się 100 μl próbki zawierające 1 x 104 komórek. Efektorowe limfocyty przemywa się, dodaje do studzienek w różnych stężeniach i hoduje przez 4 godziny w 37°C. Stosując zestaw CytoTox 96 (Promega, Madison WI), procent specyficznej lizy oblicza się z dehydrogenazy mleczanowej (LDH) supernatantu mierzonej w standardowym czytniku płytek ELISA (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA) przez rejestrację absorpcji przy 490 nm. Oznaczenia lizy specyficznej dla antygenu HSV2 dokonuje się zgodnie ze standardowymi kryteriami. Dane wyraża się jako procenty specyficznej lizy = 100 x[(eksperymentalne - spontaniczne efektorowe - spontaniczne docelowe)/( minimalne docelowe - spontaniczne docelowe)]
Wyniki
Krzywa przeżywalności, przedstawiona na fig. 1, ukazuje efektywność peptydu liposomowego w ochronie myszy przed systematyczną prowokacją letalną dawką HSV2, jak również ustala liczbę zaszczepień potrzebnych do osiągnięcia 100% ochrony. Fig. 1 pokazuje liczbę dawek szczepionki liposomowej HSV2gD(1-23)-TM potrzebną do zabezpieczenia myszy BALB/c przed śmiertelnym działaniem HSV2. Grupom 7 myszy podano 2, 3 lub 4 immunizacje przed prowokacją letalną dawką HSV2. Przy czterech szczepieniach, żadna z myszy immunizowanych liposomową szczepionką nie wykazywała komplikacji neurologicznych związanych z zakażeniem HSV2 oraz żadnych innych objawów zakażenia wykrywanych w badaniu. Co ważniejsze, wszystkie te myszy przeżyły letalną dawkę ekspozycji na HSV2. Przy dwóch do trzech immunizacjach tygodniowo, mniej niż 100% myszy zostało zabezpieczonych. Przeciwnie, myszy, którym podano cztery szczepienia placebo (tj. buforu), nie były chronione przed prowokacją HSV2.
Liposomowe HSV2gD(1-23)-TM testowano również w trzech grupach myszy C57BL/6 i stwierdzono, że wywoływały również podobne efekty ochronne porównywalne z wynikami otrzymanymi dla myszy BALB/c. W tabeli 2 podsumowano otrzymane wyniki. Myszy z grupy 1 zaszczepiono podskórnie w 1 i 4 tygodniu, myszy z grupy 2 zaszczepiono podskórnie w 1 tygodniu, a doodbytniczo w 4 tygodniu, natomiast myszy z kontrolnej grupy 3 nie otrzymały żadnych szczepionek. Po tygodniu od ostatniego szczepienia (w 4 tygodniu) myszy prowokowano dootrzewnowo letalną dawkę HSV2, następnie obserwowano przez trzy tygodnie pod kątem stanów chorobowych i umieralności. Podobnie jak w przypadku myszy BALB/C, w grupach myszy, które otrzymywały szczepionki z liposomowym HSV2gD(1-23)-TM obserwowano znaczącą liczbę osobników przeżywających, zarówno w przypadku iniekcji podskórnej, jak i początkowych dawek podskórnych, po których podawano wzmocnioną dawkę śluzówkową.
PL 206 260 B1
T a b e l a 2
Podsumowanie wyników porównujących przeżywalność myszy C57BL/6 przy różnych szczepieniach liposomowym HSV2gD(1-23)-TM.
Grupa Sposób szczepienia Przeżywalność (n=7)
1 2 3
1 Tydzień 1 - podskórnie Tydzień 4 - podskórnie 6/7 (86%)
2 Tydzień 1 - podskórnie Tydzień 4 - doodbytniczo 5/7 (71%)
3 Kontrola - bez szczepienia 1/7 (14%)
Na fig. 2 przedstawiono porównanie liposomowego HSV2gD(1-23)-TM z innymi sposobami prezentacji antygenów. Każdej grupie 7 myszy podano 4 immunizacje przed prowokacją letalną dawką HSV2. Ponownie, czterokrotne szczepienie szczepionką liposomowa HSV2gD(1-23)-TM dało 100% ochroną myszy przed letalną dawką HSV2. Cztery immunizacje nieliposomowym HSV2gD(1-23)-TM lub liposomami bez HSV2gD(1-23)-TM, nie były zdolne dostarczyć skutecznej ochrony przed letalną prowokacją HSV2. Wynik ten pokazuje jasno, że zarówno liposomy, jak i wytworzone technikami inżynierii składniki białkowe muszą być ze sobą związane w celu osiągnięcia skutecznej odpowiedzi immunologicznej. Szczególnie znaczące jest stwierdzenie, że szczepionka liposomowa HSV2gD(1-23)-TM zapewnia dużo lepszą ochronę niż immunizacje wirusem inaktywowanym termicznie, ponieważ na ogół uważa się, że szczepionki oparte na wirusach dostarczają na ogól dobrego bodźca dla odpowiedzi odpornościowej (Desrosiers, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovir. 8:1457).
Przy końcu badania, myszy uśmiercono i zbierano surowicę w celu scharakteryzowania natury odpowiedzi odpornościowej w tym czasie. W surowicy szczepionych myszy zaobserwowano wysokie miana przeciwciał (1:100), które w sposób specyficzny rozpoznawały peptyd użyty do wywołania odpowiedzi odpornościowej, jednocześnie powodując precypitację aktywnych cząstek wirusowych. Wyniki te sugerują, że przeciwciała rozpoznawały epitop na powierzchni wirusa. Przeciwciała te precypitowały również liposomy z HSV2gD(1-23)-TM, nie wytrącając liposomów bez peptydu, co sugeruje, że rozpoznają one swoiście epitop gD wirusa HSV2.
W tabeli 3 poniżej dostarczono podsumowania testów immunologicznych, z których wynika, że liposomowy HSV2gD(1-23)-TM podawany podskórnie raz w tygodniu, wywołuje silniejszą odpowiedź odpornościową w porównaniu ze standardowymi adiuwantami. Szczepienie antygenem zmieszanym z niekompletnym adiuwantem Freunda lub alumem, nie spowodowało u myszy ochrony przed prowokacją wirusem. Dane uzyskane z testu z neutralizującymi przeciwciałami oraz odpowiedzi nadwrażliwości opóźnionej pokazywały, że wyniki badania przeżywalności korelują z najwyższym mianem przeciwciał (odpowiedź komórek B) oraz stanem najmocniejszego obrzęku poduszeczki łapy (odpowiedź komórek T) obserwowanymi dla grupy szczepionej liposomowym HSV2gD(1-23)-TM. Dodatkową zaletą związaną ze szczepieniem liposomowym HSV2gD(1-23)-TM jest to, że w przeciwieństwie do wyników otrzymanych dla myszy szczepionych antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda, u żadnej myszy traktowanej liposomowym HSV2gD(1-23)-TM nie zaobserwowano podrażnienia ani zapalenia w miejscu szczepienia (zanotowano zaczerwienienie w miejscu szczepienie u 17/17 myszy dla immunizacji antygenem w niekompletnym adiuwancie Freunda, podczas gdy nie zauważono żadnego zaczerwienienia 0/17 u myszy szczepionych liposomowym HSV2gD(1-23)-TM). W przypadku użycia alumu, u 17/17 myszy zaobserwowano dające się wymacać ziarniniaki w miejscu szczepienia, podczas gdy immunizacja liposomowym HSV2gD(1-23)-TM nie wywołała tworzenia się ziarniniaka u żadnej z myszy. Podsumowując, wyniki te sugerują, że odpowiedź komórek B i/lub komórek T (oceniana na podstawie mian neutralizujących przeciwciał i przez obserwację obrzęku poduszeczki łapy) uczestniczy w odpowiedzi immunologicznej, wywołanej przez liposomowy HSV2gD(1-23)-TM, chroniącej przed letalnymi dawkami HSV2.
PL 206 260 B1
T a b e l a 3
Podsumowanie wyników porównujących odpowiedź immunologiczną dla szczepionki liposomowej HSV2gD(1-23)-TM, HSV2gD(1-23)-TM w niekompletnym adiuwancie Freunda, HSV2gD(1-23)-TM w alumie oraz grupy kontrolnej, której wstrzykiwano jedynie PBS.
Sposób szczepienia Przeżywalność (n=7) Miano neutralizujących przeciwciał (dzień prowokacji) % obrzęku poduszeczek względem myszy kontrolnych
Liposomowy HSV2gD(1-23)-TM 5/7 1:1638 8%
Antygen HSV2gD(1-23)-TM w niekompletnym adiuwancie Freunda 0/7 1:717 3%
HSV2gD(1-23)-TM w ałunie 0/7 1:1024 5%
PBS 0/7 1:486 0%
P r z y k ł a d 2 - HSV2
Przygotowanie HSV2gD(1-23)-HD. Konstrukt genowy, kodujący HSV2gD(1-23)-HD utworzono używając zachodzących na siebie oligonukleotydów, kodujących epitop gD dołączony do domeny hydrofobowej (HD), złożonej z 45 aminokwasów. Tworzenie konstruktu polegało na sukcesywnym wydłużaniu i amplifikacji obszaru kodującego genu. Tak powstały fragment poddano ligacji z wektorem ekspresyjnym pTrcHis, a następnie sekwencjonowano dla sprawdzenia. Ekspresję na małą skalę zaindukowano 1 mM IPTG i potwierdzono powstawanie produktu przez analizę typu Western, używając mysich przeciwciał otrzymanych podczas badań z liposomowym HSV2gD(1-23)-TM. Białko analizowano również przez w żelu SDS-PAGE, a znaleziony prążek, który odpowiada oczekiwanemu ciężarowi cząsteczkowemu (około 6kDa) oceniono barwieniem Coomassie. Po stwierdzeniu ekspresji odpowiedniego białka na małą skalę, założono 10 litrową hodowlę E. coli, zawierającej konstrukt pTrcHis/HSV2gD(1-23)-HD, co dało powstanie około 60 g osadu komórek. Po indukcji, ekspresję HSV2gD(1-23)-HD sprawdzano wykorzystując analizę typu Western w poszczególnych punktach czasowych fermentacji. Bakterie z około 30 gramów pasty komórkowej zlizowano w prasie Frencha w buforze, zawieraj ącym 1% deoksycholanu i 5 mM imidazolu. Po odwirowaniu resztek komórek, stwierdzono obecność HSV2gD(1-23)-HD głównie w rozpuszczalnej frakcji supernatantu.
Oczyszczania produktu dokonano przez przepuszczenie supernatantu, zawierającego rozpuszczalne białko HSV2gD(1-23)-HD przez kolumnę chelatującą ze złożem Sepharose, naładowanym niklem. Aby wypłukać pozostałe, niezwiązane białka, kolumnę przepłukiwano sukcesywnie roztworami, zawierającymi 5 mM imidazolu, 200 mM imidazolu, a następnie 5mM imidazolu z 1% deoksycholanu. W końcu białko HSV2gD(1-23)-HD wymyto 200 mM imidazolem z 1% deoksycholanem. Frakcje zawierające największą ilość białka identyfikowano na żelu SDS-PAGE barwieniem Coomassię i analizę typu Western. Następnie zidentyfikowane frakcje pików zawierające HSV2gD(1-23)-HD połączono razem i zagęszczono, stosując koncentrator Millipore Ultraprep. Końcowy koncentrat zawierał czyste HSV2gD(1-23)-HD, jak oceniono obecnością pojedynczego prążka na żelu SDS-PAGE, zabarwionym barwnikiem Coomassie. Z pierwszych ekspresji uzyskano około 2-3 mg HSV2gD(1-23)-HD do formulacji liposomowej i badań szczepionkowych.
Przygotowanie liposomów i procedury szczepień, badanie indukcji odpowiedzi immunologicznej, model mysiego zapalenia mózgu, związanego z HSV2, indukcję proliferacji komórek T przez antygen, analizę mRNA zależną od cytokin, mierzenie poziomu cytokin w teście ELISA oraz odpowiedzi CTL anty-HSV2 przeprowadzano zgodnie z opisami w przykładzie 1.
Wyniki
Krzywa przeżywalności, przedstawiona na fig. 3, pokazuje zdolność HSV2gD(1-23)-HD do wzbudzania ochronnej odpowiedzi immunologicznej. Obserwowany % przeżywalności dla tej konkretnej kompozycji wynosił 40%. W porównaniu, traktowane buforem zwierzęta kontrolne nie przeżywały, podczas gdy grupa kontrolna HSV2gD(1-23)-HD wykazywała 100% przeżywalności.
P r z y k ł a d III-HIV
Wytwarzanie HIV(gp120-HD) i HIV(.\gp120-HD) w komórkach COS-1. Do badania konformacyjnego epitopów, otrzymuje się sekwencję gpD z plazmidu pHXB2-env zawierającego gen gp 160 (NIH AIDS Research and Reagent Program, Rockville, MD) przez amplifikację plazmidowego DNA w reakcji PCR i klonowanie produktu o wielkości 1536 bp w celu sekwencjonowania metodą dideoksy
PL 206 260 B1 nukleotydów. Stosując starter 5' (sensowny) odpowiadający pierwszym 21 bp genu HIV gp120 ATGAGAGTGAAGGAGAAATAT i starter 3' (antysensowny) odpowiadający nukleotydom 1515 do 1536 TGCTCTTTTTTCTCTCTGCAC, eliminujące białko gp41 HIV, klonuje się i powiela w reakcji PCR fragment gp120. Ponadto, każdy starter jest oflankowany przez konwencjonalne miejsca enzymów restrykcyjnych pasujące do miejsc wielokrotnego klonowania w wektorze ekspresyjnym pcDNA4-His. Produkt PCR poddaje się ligacji z pcDNA4-His zawierającym domenę HD jako plazmidem z kasetą genową (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). Mutanty delecyjne wytwarza się w reakcji amplifikacji PCR przy zastosowaniu pary starterów 5' i 3', która eliminuje nukleotydy kodujące reszty białka gp120; obejmuje to Δ136-151gp120, Δ128-194gp120 i Δ123-203gp120. Startery zawierają sekwencje dogodnych miejsc restrykcyjnych umożliwiające ligację dwóch produktów genowych. Każda mutacja jest zatem zastępowana przez dwa aminokwasy kodowane przez wybrane specyficzne miejsce restrykcyjne. Ostateczne geny sprawdza się przez sekwencjonowanie DNA przy zastosowaniu protokołu i odczynników z zestawu AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech Piscataway, NJ), a wyniki rozdzielano w zestawie do sekwencjonowania ALFExpress kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i analizowano przy zastosowaniu oprogramowania AM v.3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Plazmidy transfekuje się do komórek COS-1 (ATCC, Rockville, MD) stosując odczynnik DEAE-dekstran. Stabilne transformanty selekcjonuje się przy zastosowaniu zeocyny (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) i klonuje przez ograniczone rozcieńczenia. Białka gp120-HD oczyszcza się przez selektywne powinowactwo do podłoża stałego ze związanym niklem. Klony, które wytwarzają wysokie poziomy białka, ocenia się w analizie Western albo analizie FACS. Łącznik histydynowy HIV(gp120)-HD, HIV.-\136-151gp120, HIV.-\128-194gp120 i HIV.-\123-203gp120 usuwa się przez odcięcie enterokinazą po zakończeniu oczyszczania. Jeżeli to konieczne, w celu dalszego oczyszczenia białek HIVgp120-HD i HIV.\gp120-HD przeprowadza się chromatografię wykluczania ze względu na wielkość cząstek, jonowymienną albo chromatografię oddziaływań hydrofobowych.
Wytwarzanie HIV-HD. Sekwencja nukleotydowa zwierająca trzy epitopy (dla CTL, komórek pomocniczych T i komórek B) wybiera się spośród sekwencji wykrytych w różnych białkach HIV (KQIINMWQEVGKAMYACTRPNYNKRKRIHIGPGRAFYTTK (Id. Sekw. Nr: 19) i uzyskuje się pochodne tej sekwencji białkowej stosując preferencję kodonów w E. coli (Looman i wsp., 1987, EMBO J. 6:2489). Syntetyczny gen kodujący sekwencję HIV składa się razem przez syntezę, hybrydyzację, PCR i ligację zachodzących na siebie oligonukleotydów. Złożony gen pełnej długości kodujący fragmenty HIV powiela się w reakcji PCR, a następnie wstawia przez ligację do wektora ekspresyjnego. Ostateczne geny sprawdza się przez sekwencjonowanie DNA.
Plazmidy pTrcHis zawierające HIV-HD transformuje się do E. coli. Bakterie inkubuje się w pożywce LB z ampicyliną (50 μg/ml) w 37°C do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej. W tym czasie, dodaje się IPTG w celu zaindukowania hybrydowego promotora trp/lac. Pomiary wykonuje się co godzinę w celu określenia optymalnej ekspresji białka HIV-HD po indukcji. W czasie optymalnej ekspresji, komórki zbiera się przez odwirowanie. Osady komórkowe lizuje się i zwirowuje. Lizaty testuje się pod kątem obecności białka. Białka HIV-HD oczyszcza się przez selektywne powinowactwo do podłoża stałego ze związanym niklem. Jeżeli to konieczne, przeprowadza się chromatografię wykluczania ze względu na wielkość cząstek, jonowymienną albo chromatografię oddziaływań hydrofobowych w celu dalszego oczyszczenia HIV-HD.
Przygotowanie liposomów. Liposomy przygotowuje się przez sonikację według wcześniej opisanych procedur (Fujii i wsp., 1997, Biochemistry 36:4959). Pokrótce, lipidy (z albo bez białek) rozpuszcza się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chloroform/metanol. Cienkie błony lipidowe wytwarza się przez odpipetowanie porcji lipidowych roztworów do okrągłodennych szklanych probówek i odparowanie rozpuszczalnika w 65°C pod strumieniem azotu. Błony umieszcza się pod próżnią na co najmniej osiem godzin w celu usunięcia resztek rozpuszczalnika organicznego. Wytwarzanie liposomów uzyskuje się przez uwodnienie błon lipidowych buforem i inkubowanie zawiesiny w 65°C przez 5-10 minut przed sonikacją próbki. Następnie, w celu wysterylizowania preparatu liposomy filtruje się przez filtr 0,22 μm. Liposomy kalibruje się za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, a tworzenie agregatów śledzi się przez co najmniej cztery tygodnie.
Procedury szczepienia i testowania indukcji reakcji immunologicznej na antygen wirusowy.
Samicom myszy BALB/c lub C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni) wstrzykuje się podskórnie testowany preparat szczepionki lub bufor w tygodniu 1, 4 i 8. Miejsce iniekcji obserwuje się pod kątem niekorzystnych reakcji, takich jak rozwój ziarniniaka i/lub tworzenie strupów. Gdy zwierzęta immunizuje się za pomocą szczepionki drogą donosową, znieczula się je za pomocą halotanu, a kompozycję (10-20 μθ
PL 206 260 B1 podaje się do nozdrzy do wdychania za pomocą sterylnej końcówki mikropipety (Gallichan i wsp., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).
Pomiar odpowiedzi przeciwciał poprzez ELISA. W regularnych odstępach w czasie procesu szczepienia (np. 1 x na tydzień) mierzy się reakcję immunologiczną myszy na antygen wirusowy. Liposomy zawierające epitop antygenu są również używane jako cel w testach przeciwciało/ELISA, jak opisano wcześniej (Tuso i wsp., 1993, Transplantation 55:1375). Wyniki tego ostatniego testu będą stosowane do mierzenia poziomu wiązania i konfiguracji izotypowej przeciwciał.
Odpowiedź nadwrażliwości typu opóźnionego (DHT). Odpowiedź DTH na antygen wirusowy u szczepionych myszy testuje się próbą poduszeczki łapy. Szczepione zwierzęta znieczula się halotanem i wstrzykuje się im albo 50 μl inaktywowanego ultrafioletem antygenu lizosomalnego do poduszeczki jednej tylnej łapy albo 50 μl buforu do poduszeczki drugiej tylnej łapy. Dwadzieścia cztery, czterdzieści osiem i siedemdziesiąt dwie godziny później stopień obrzmienia poduszeczki łapy u myszy mierzy się za pomocą miernika Verniera, a następnie porównuje z pomiarami linii podstawowej.
Analiza mRNA specyficznego dla cytokiny. Komórki T od immunizowanych i nieimmunizowanych zwierząt bada się pod kątem poziomów mRNA specyficznych dla cytokiny dla głównych cytokin, które mogą wpływać na uczulenie związane z immunizacją, w tym IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Komórki T otrzymuje się ze śledzion jak opisano poprzednio w 1 i 4 tygodniu po immunizacji. Całkowity RNA izoluje się przy zastosowaniu modyfikacji (Cosenza i wsp., 1995, Liver Transpl. Surg. 1:16) metody opisanej przez Chomczynsky (Chomczynsky i wsp., 1987, Analyt. Biochem. 162: 156). Świeże albo zamrożone komórki (2 x 106) rozbija się w 1 ml roztworu do denaturacji (4 mM tiocyjanian guanidyny, 25 mM cytrynian sodu (pH 7,0), 0,5% sarkozyl i 0,1 mM 2-merkaptoetanol. RNA wytrąca się przez inkubowanie z jedną objętością izopropanolu przez noc w -20°C. Stężenie całkowitego RNA doprowadza się do 260 nM i próbki przechowuje się w -80°C do czasu przeprowadzenia analizy.
Analizę cytokin przeprowadza się przy zastosowaniu modyfikacji (Cosenza i wsp., 1995, Liver Transpl. Surg. 1: 16) metody opisanej przez Chomczynsky i wsp., 1987, Analyt. Biochem. 162:156. Jednoniciowy cDNA przygotowuje się przez transkrypcję 2 μg całkowitego RNA w 20 μl całkowitej mieszaniny reakcyjnej przy zastosowaniu odwrotnej transkryptazy ptasiego wirusa mieloblastocytozy (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Specyficzne dla sekwencji startery oligonukleotydowe dla cytokin mysich (tabela 1) stosuje się do powielenia fragmentów DNA o przewidywanej wielkości dla każdego z genów cytokin będącego przedmiotem zainteresowania. Mieszanina do reakcji PCR składa się z 1 μl cDNA, 2,5 μl 10 x buforu do PCR, 1 μl każdego ze starterów 5' i 3', 2,5 μl 10 x dNTP (2 mmol/l) i 0,125 μl termostabilnej polimerazy DNA z T. aquaticus (Boehringer Mannheim) w końcowej objętości 25 μ!. Startery specyficzne dla β-aktyny stosuje się do powielenia fragmentu o wielkości 548 bp jako kontrolę wewnętrzną. Na mieszaninę PCR nawarstwia się olej mineralny i amplifikację przeprowadza po inkubacji mieszaniny przez 7 minut w 94°C, w 38 cyklach z 30 sekundową denaturacją w 94°C, 45 sekundowym przyłączeniem startera w 60°C, 60 sekundowym wydłużaniem w 72°C i 7 minutami inkubacji w 72°C. Produkty PCR rozdziela się w żelu agarozowym w obecności bromku etydyny. Prążki uwidacznia w świetle UV, fotografuje i ocenia densytometrycznie ilościowo ze zdjęcia przy zastosowaniu oprogramowania Molecular Analyst (Bio-Rad, Richmond CA).
Pomiar cytokin poprzez ELISA w komórkach T śledziony. Aktywność komórek T u tych zwierząt mierzy się również przez wytwarzanie cytokin w odpowiedzi na inkubację śledzionowych komórek T z antygenem wirusowym. Śledziony pobiera się od zwierząt szczepionych, a następnie homogenaty śledziony otrzymuje się przez łagodne rozdrabnianie za pomocą sterylnego tłoczka i przepuszczenie komórek przez nylonowe sito. Zawiesiny komórek przepłukuje się i umieszcza w 96-studzienkowej płytce do mikromiareczkowania po 1x106 komórek/studzienkę. Po inkubacji komórek w 37°C przez 3-4 dni i przy różnych ilościach antygenu wirusowego, supernatant ze studzienek zbiera się i testuje na obecność cytokin. Stosuje się dostępny handlowo zestaw ELISA dla cytokin w celu określenia profilu cytokin. Wykrywanie cytokin w supernatantach hodowli tkankowych metodą kanapkową-ELISA przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) swoistych dla określonych cytokin. Pokrótce, płytki ELISA pokrywa się przez noc szczurzym mAb przeciw mysiej cytokinie. Płytki blokuje się 3% płodową surowicą cielęcą w PBS przez 2 godziny, następnie jednakowe objętości każdej próbki badanej są dodawane do poszczególnych studzienek. Do każdej studzienki dodaje się swoiste wobec cytokiny bitotynylowane szczurze anty-mysie mAb, a następnie peroksydazę z awidyną. Reakcję barwną uzyskuje się po dodaniu substratów kolorymetrycznych. Płytki odczytywane są w spektrofotometrze ELISA, a stężenie cytokin oblicza się wg krzywej standardowej uzyskanej z kontrolnych rekombinowanych
PL 206 260 B1 cytokin. Wszystkie zestawy ELISA dla cytokin (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-γ oraz TNF-α) są zakupione w PharMingen, Inc. (San Diego, CA).
Indukowana przez antygen proliferacja komórek T
Uczulenie gospodarza na antygenami HIV mierzy się stosując, indukowaną przez antygen proliferację komórek T. Homogenaty śledziony są izolowane jak opisano uprzednio. Komórki zawiesza się w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą (FCS), 10 mM bufor Hepes, L-glutaminę (2 mM), penicylinę (25 j. m./ml), streptomycynę (25 μg/ml) i gentamycynę (80 μg/ml). Komórki hoduje się w stężeniu 1 x 106 komórek/ml z i bez peptydu HIV-HD (5 μg/ml) w 96-studzienko wych U-dennych płytkach przez 3-4 dni w 5% CO2. Hodowle znakuje się pulsowo 20 μl barwnika rezazurynowego przez 3 godziny, a następnie mierzy się fluorescencję w Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Odpowiedzi CTL anty-HIV. Po zaszczepieniu, sprawdza się obecność cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych dla antygenu w komórkach T śledziony. Limfocyty śledzionowe otrzymuje się jak opisano uprzednio. Limfocyty z każdej traktowanej grupy łączy się razem (n=5), a następnie hodowane przez 3 dni bez antygenu przy 107 komórek/studzienkę w 12-studzienkowych płytkach hodowlanych. Komórki docelowe chłoniaka L5198Y (H21) (ATTC) inkubuje się z peptydem odpowiadającym epitopowi HIV dla CTL dla komórek ograniczonych do H2 i inkubuje się przez 4 godziny w 37°C. Komórki docelowe przemywa się i do każdej studzienki dodaje się 100 μl próbki zawierającej 1 x 104 komórek. Efektorowe limfocyty przemywa się, dodaje do studzienek w różnych stężeniach i hoduje przez 4 godziny w 37°C. Stosując zestaw CytoTox 96 (Promega, Madison WI), procent specyficznej lizy oblicza się na podstawie pomiaru dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w standardowym czytniku płytek ELISA (HTS 7000+ BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA) przez rejestrację absorpcji przy 490 nm. Oznaczenia lizy specyficznej dla antygenu HSV2 dokonuje się zgodnie ze standardowymi kryteriami. Dane wyraża się jako procenty specyficznej lizy = 100 x[(eksperymentalne - spontaniczne efektorowe - spontaniczne docelowe)/( minimalne docelowe - spontaniczne docelowe)]
P r z y k ł a d IV - Wirus grypy (INFV)
Wytwarzanie INFV-HD. Sekwencja nukleotydowa wybranych epitopów pochodzi z sekwencji białka z zastosowaniem preferancji kodonów u E. coli (Looman i wsp., 1987, EMBO J . 6:2489). Sekwencja(-e) antygenowa(e) wstawiona(-e) do kasety genowej odpowiada epitopom z NP (147-161, TYQRTRALVRTGMDP; 55-69 (Id. Sekw. Nr:20), RLIQNSLTIERMVLS (Id. Sekw. Nr:21)) i HA (91-108, SKAFSNCYPYDVPDYASL (Id. Sekw. Nr:22). Można wytworzyć szczepionkę dla kombinacji epitopów składającą się z epitopu T-B jak opisano w Brumeanu i wsp., 1997 (HA 110-120/HA 150-159, SFERFEIPKEGGWLTEKEGYSP (Id. Sekw. Nr:.23)) (Brumeanu i wsp., 1997, J. Virol. 71:5473). Po otrzymaniu odpowiednich sekwencji, syntetyczny gen kodujący sekwencję INFV-HD składa się razem przez syntezę, hybrydyzację, PCR i ligację zachodzących na siebie oligonukleotydów. Złożony gen pełnej długości kodujący fragmenty INFV powiela się w reakcji PCR, a następnie wstawia przez ligację do wektora ekspresyjnego. Ostateczny gen sprawdza się przez sekwencjonowanie DNA.
Plazmidy zawierające LNFV-HD transformuje się do E. coli. Bakterie inkubuje się w pożywce LB z ampicyliną (50 μg/ml) w 37°C do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej. W tym czasie, dodaje się IPTG w celu zaindukowania hybrydowego promotora trp/lac. Pomiary wykonuje się co godzinę w celu określenia optymalnej ekspresji białka INFV-HD po indukcji. W czasie optymalnej ekspresji, komórki zbiera się przez odwirowanie. Osady komórkowe lizuje się i zawirowuje. Lizaty testuje się pod kątem obecności białka. Białka LNFV-HD oczyszcza się przez selektywne powinowactwo do niklu związanego do podłoża stałego. Jeżeli to konieczne przeprowadza się chromatografię wykluczania ze względu na wielkość cząstek, jonowymienną albo chromatografię oddziaływań hydrofobowych w celu dalszego oczyszczenia INFV-HD
Model infekcji wirusowej. Szczep INFV zastosowany do pokazania skuteczności szczepionki jest izolatem wirusa A/PR/8/34 nazwanym PR8. Wirus hodowano w 10 do 12 dniowych jajach kurzych z zarodkami przez inokulację omoczni, a następnie inkubowano w urządzeniu typu rocker w 37°C przez 40-48 godzin i 20-24 godziny w 4°C, po czym odzyskiwano z płynu omoczniowego. Wirusowy test hemaglutynacji z 0,5% kurzymi krwinkami czerwonymi przeprowadzano w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania w celu określenia jednostek hemaglutynacji (HAU)/ml zawiesiny wirusowej.
W mysim modelu BALB/c, pokazano, że 1200 HAU szczepu PR8, podanych donosowo przy pomocy sterylnej końcówki mikropipet ora myszy uśpionej metofanem, prowadzi do powstania wi20
PL 206 260 B1 docznych objawów infekcji przed upływem 4 dni, włączając w to zmniejszoną ruchliwość, brak zabiegów pielęgnacyjnych, 20% utratę masy ciała i śmierć w ciągu dwóch tygodni. Przy zastosowaniu testu cytolitycznego MDCK przeprowadzanego w 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania z zakończeniem przy 50%, wysokie miano zakaźnego wirusa stwierdzono w homogenatach płuc otrzymanych 4 dni po infekcji.
Procedury szczepienia i testowanie pod kątem indukcji odpowiedzi immunologicznej na antygen wirusowy
Samicy myszy BALB/c (w wieku 6-8 tygodni) wstrzykuje się podskórnie w tygodniach 1, 2 i 8 testowany preparat szczepionki lub bufor. Miejsce iniekcji obserwuje się pod kątem niekorzystnych reakcji, takich jak rozwój ziarniniaka i/lub tworzenie strupów. Gdy zwierzęta immunizuje się za pomocą szczepionki drogą donosową znieczula się je za pomocą metofanu, a kompozycję (10-20 μθ podaje się do nozdrzy do wdychania za pomocą sterylnej końcówki mikropipety (Gallichan i wsp., 1993, J. Inf. Dis. 168:622).
Wykrywanie RNA INFV w tkance płuc za pomocą RT-PCR. Wykrywanie RNA INFV za pomocą RT-PCR przeprowadza się na płucach zwierząt eksperymentalnych pobieranych 4 dni po prowokacji wirusem w celu ustalenia skuteczności immunizacji dla zapobiegania infekcji wirusowej. Próbki płuc pobrane od myszy nagle zamraża się, miele i zamrożony proszek przechowuje w - 70°C do czasu dalszej obróbki. Izolację całkowitego RNA i analizę RT-PCR pod kątem wirusowego RNA przeprowadza się przy zastosowaniu modyfikacji opisanych uprzednio technik (Chomczynsky i wsp., 1987, Analyt. Biochem. 162:156; Shirwan i wsp., 1993, J. Immunol. 151:5228; Lakeman i Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857). Startery, które mają zostać użyte są specyficzne dla genu matriks (fragment 7) wirusa grypy A (Atmar i wsp., 1996, J. Clin. Microbiol. 34:2604). Test RT-PCR przeprowadza się przy zastosowaniu odczynników i protokołu Titan One Tube RT-PCR. System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Pokrótce, 1 pg do 1 μg całkowitego RNA stanowiącego matrycę inkubuje się w obecności 0,2 mM dNTP, 0,4 μM antysensownego startera FAMI (5'-CAGAGACTTGAAGATGTCTTTGC-3' (Id. Sekw. Nr:24), 0,4 μM sensownego startera, FAM2 (5'-GCTCTGTCCATGTTATTTGGA-3' (Id. Sekw. Nr:25), 5 mM DTT, 5 jedn. inhibitora RNazy, 1,5 mM MgCl2 i enzymów AMV/Expand High Fidelity w następujących warunkach: jeden cykl w 60°C przez 30 minut; 94°C przez 2 minuty; dziesięć cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund; dwadzieścia pięć cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund ze wzrostem o pięć sekund w każdym cyklu; a następnie jeden cykl w 68°C przez 7 minut. O pozytywnym wyniku świadczy pojawienie się prążka o wielkości 212 bp w 1,5% żelu z agarozy NuSieve (FMC Bioproducts, Rockland, ME) zabarwionego bromkiem etydyny i sfotografowanego na transiluminatorze UV (BioRad Gel Doc 1000). Wykazano, że metoda ta jest czuła i wysoce specyficzna do pomiarów obecności wirusowego DNA (Lakeman i Whitley, 1995, J. Inf. Dis. 171:857).
Sekwencja domeny HA1. Sekwencje domeny HA1 (fragment 4) można ustalić przez powielenie domeny HA1 z wirusowego RNA w reakcji RT-PCR, a następnie otrzymany fragment o wielkości 1100 bp klonuje się do sekwencjonowania i sekwencjonuje się przy zastosowaniu metody terminacji z użyciem dideoksy-nukleotydów. Test RT-PCR przeprowadza się z użyciem systemu Titan One Tube RT-PCR Układ tak, jak zaznaczono powyżej z następującymi różnicami; starterami do amplifikacji są: starter cDNA (5'-AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAAC-3' (Id. Sekw. Nr:26) i starter do PCR (5'-CAATGAAACCGGCAATGGCTCC-3' (Id. Sekw. Nr:27) (Pyhala i wsp., 1995 J. Gen. Virol. 76:205), warunki będą następujące: jeden cykl w 60°C przez 30 minut; 94°C przez 2 minuty; dziesięć cykli w 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund; dwadzieścia pięć cykli w 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund ze zwiększeniem wydłużenia o pięć sekund w każdym cyklu; a następnie jeden cykl w 68°C przez 7 minut. Produkt o wielkości 1100 bp klonuje się w wektorze do klonowania TA PCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu sekwencjonowania. Sekwencjnowanie DNA przeprowadza się przy zastosowaniu protokołu i odczynników z zestawu AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech Piscataway, NJ), a rozdział w zestawie do sekwencjonowania ALFExpress kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i analizę przy zastosowaniu oprogramowania AM v. 3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Pomiar odpowiedzi przeciwciał za pomocą ELISA. W regularnych odstępach w czasie procesu szczepienia mierzy się reakcję immunologiczną myszy na antygen wirusowy. Liposomy zawierające epitop antygenu są również używane jako cel w teście przeciwciało/ELISA, tak, jak opisano wcześniej (Tuso i wsp., 1993, Transplantation 55:1375). Wyniki tego ostatniego testu będą stosowane do mierzenia poziomu wiązania i konfiguracji izotypowej przeciwciał.
PL 206 260 B1
Indukowana przez antygen proliferacja komórek T.
Uczulenie gospodarza na antygeny INFV mierzy się stosując indukowaną przez antygen proliferację komórek T. Śledziony usuwa się z szczepionych myszy i homogenaty przygotowuje się przez łagodne rozdrabnianie śledziony za pomocą sterylnego tłoczka i przepuszczenie komórek przez nylonowe sito. Komórki zawiesza się w pożywce RPMI 1640 zawierającej 10% płodową surowicę cielęcą (FCS), 10 mM bufor Hepes, L-glutaminę (2 mM), penicylinę (25 j.m./ml), streptomycynę (25 μg/ml) i gentamycynę (80 μg/ml). Komórki hoduje się w stężeniu 1 x 106 komórek/ml z i bez chemicznie syntetyzowanych peptydów odpowiadających antygenom (5 μg/ml) w 96-studzienkowych U-dennych płytkach przez 3-4 dni w 5% CO2. Hodowle znakuje się pulsowo 20 μl barwnika rezazurynowego przez 3 godziny, a następnie mierzy się fluorescencję w Cytofluor II (Perspective Biosystems, Inc., Farmington, MA).
Odpowiedzi CTL anty-INFV. Po zaszczepieniu, sprawdza się obecność cytotoksycznych limfocytów T (CTL) specyficznych dla antygenu w śledzionowych komórkach T. Limfocyty śledzionowe otrzymuje się jak opisano uprzednio. Limfocyty z każdej traktowanej grupy są łączone razem (n=5), a następnie hodowane przez 3 dni bez antygenu przy 107 komórek/studzienkę w 12-studzienkowych płytkach hodowlanych. Komórki guza komórek tucznych P815 lub docelowe chłoniaka L5178 (H21) (ATTC) inkubuje się z peptydem odpowiadającym epitopowi INFVdla CTL (aminokwasy 147-158) dla komórek ograniczonych dla H2 i inkubuje się przez 4 godziny w 37°C. Komórki docelowe przemywa się i do każdej studzienki dodaje się 100 μl próbki zawierające 1 x 104 komórek. Efektorowe limfocyty przemywa się, dodaje do studzienek w różnych stężeniach i hoduje przez 4 godziny w 37°C. Stosując zestaw CytoTox 96 (Promega, Madison WI),oblicza się procent specyficznej lizy na podstawie pomiaru dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w standardowym czytniku płytek ELISA (HTS 7000+BioAssay Reader, Perkin Elmer, San Jose, CA) przez rejestrowanie absorpcji przy 490 nm. Oznaczenia lizy specyficznej dla antygenu HSV2 dokonuje się zgodnie ze standardowymi kryteriami. Dane wyraża się jako procenty specyficznej lizy = 100 x[( eksperymentalne -spontaniczne efektorowe - spontaniczne docelowe)/( minimalne docelowe - spontaniczne docelowe)]
P r z y k ł a d V - Nietypowalne H. influenzae (NTHi) i H. Influenzae typ b (Hib)
Klonowanie białek NTHi. Sekwencję genu pełnej długości kodującego P6 otrzymano ze szczepu NTHi przez powielenie w reakcji RT-PCR mRNA P6 (Deich i wsp, 1988, J. Bacteriol. 170:489; Nelson i wsp., 1988, Inf. Immun. 56: 128; Looman i wsp., 1987, EMBO J. 6:2489). Amplifikację przeprowadza się przy zastosowaniu odczynników i protokołów z systemu Titan One Tube RT-PCR System (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Pokrótce, bakterie inkubuje się w obecności 0,2 mM dNTP, 0,4 μM antysensownego startera H-InvfP6AS (5'-GAGTCCGCTGCTCTACCAAC -3' (Id. Sekw. Nr:28), 0,4 μM starter sensowny, H-InvtP6S (5'-AATTTCCAGCTTGGTCTCCA -3' (Id. Sekw. Nr:29), 5 mM DTT, 5 jedn. inhibitora RNazy, 1,5 mM MgCl2 i enzymów AMV/Expand High Fidelity w następujących warunkach: jeden cykl w 60°C przez 30 minut; 94°C przez 2 minuty; dziesięć cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund; dwadzieścia pięć cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 68°C przez 45 sekund ze wzrostem wydłużenia o pięć sekund w każdym cyklu; a następnie jeden cykl w 68°C przez 7 minut. O pozytywnym wyniku świadczy pojawienie się prążka o wielkości 867 bp w 1,0% żelu z agarozy NuSieve (FMC Bioproducts, Rockland, ME) zabarwionym bromkiem etydyny i sfotografowanym na transiluminatorze UV (BioRad Gel Doc 1000). Produkt PCR bp klonuje się w wektorze do klonowania TA PCR 2.1 w celu sekwencjonowania przy zastosowaniu protokołu i odczynników (Invitrogen, Carlsbad, CA). Otrzymywanie preparatu plazmidowego na małą skalę przeprowadza się przy zastosowaniu standardowej metody lizy alkalicznej (Maniatis, 1989 Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Wyd. 2-gie, Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, str. 125). Wstawkę - produkt PCR sekwencjonuje się przy zastosowaniu konwencjonalnej metody terminacji z użyciem dideoksy-nukleotydów oraz protokołu i odczynników z zestawu AutoCycle (Amersham Pharmacia Biotech Piscataway, NJ), rozdział w zestawie do sekwencjonowania ALFExpress kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) i analizę przy zastosowaniu oprogramowania AM v. 3.02 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Wytwarzanie NTHi(P6)-HD. Po otrzymaniu genu kodującego P6, syntetyczny gen kodujący NTHi(p6)-HD składa się razem przez syntezę, hybrydyzację, PCR i ligację zachodzących na siebie oligonukleotydów. Fragment HD dodaje się na końcu N albo C białka przez łącznik składający się z glicyny i seryny. Umożliwia to testowanie efektu relatywnego położenia HD względem antygenu na odróbkę przez układ immunologiczny. Złożony gen pełnej długości kodujący fragmenty HIV powiela się w reakcji PCR, a następnie wstawia poprzez ligację do wektora ekspresyjnego. Ostateczny gen sprawdza się poprzez sekwencjnowanie DNA.
PL 206 260 B1
Plazmidy zawierające NTHi(p6)-HD transformuje się do E. coli. Bakterie inkubuje się w pożywce LB z ampicyliną (50 μg/ml) w 37°C do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej. W tym czasie, dodaje się IPTG w celu zaindukowania hybrydowego promotora trp/lac. Pomiary wykonuje się co godzinę w celu określenia optymalnej ekspresji białka NTHi(P6)-HD po indukcji. W czasie optymalnej ekspresji, komórki zbiera się przez odwirowanie. Osady komórkowe lizuje się i zwirowuje. Lizat i osad komórkowy testuje się pod kątem obecności białka. Roztwór 1'-2% dezoksycholanu sodu stosuje się do ekstrakcji białka NTHi(P6) z lizowanego osadu komórkowego. NTHi(P6)-HD oczyszcza się przez selektywne powinowactwo do niklu związanego do fazy stałej. Jeżeli to konieczne przeprowadza się chromatografię wykluczania ze względu na wielkość cząstek, jonowymienną albo chromatografię oddziaływań hydrofobowych w celu dalszego oczyszczenia NTHi(P6)-HD.
Przygotowanie liposomów. Znane są trzy powszechne sposoby, pozwalające na przygotowanie stabilnych liposomów NTHi(P6)-HD. W pierwszym liposomy są tak wytwarzane, że lipidy i białka są wspólnie rozpuszczane w rozpuszczalniku organicznym (chloroform/metanol), a następnie suszone do cienkiej błony. Po rozpuszczeniu w buforze wodnym, lipidy i białka tworzą duże, dwuwarstwowe struktury. Powstała zawiesina jest poddawana sonikacji w celu wytworzenia małych jednowarstwowych pęcherzyków (-SUV). Ta metoda jest dobra dla małych białek, jednakże, może nie być najbardziej odpowiednia do wykorzystania w opisywanych eksperymentach, ponieważ ekspozycja białek na ostre rozpuszczalniki może doprowadzić do ich denaturacji. Aby uniknąć niepożądanych zmian konformacyjnych białek, korzystne może być zastosowanie drugiej metody, w której przed hydratacją błony lipidowej, NTHi(P6)-HD jest solubilizowany w odpowiednim buforze. Po hydratacji z lipidami, białko spontanicznie asocjuje z nowopowstałą błoną i jest włączane w dwuwarstwowe struktury SUV podczas sonikacji. Trzecia metoda polega na przygotowaniu liposomów bez białka NTHi(P6)-HD oraz dodawaniu uformowanych już SUV, pozwalając tym samym na integrację HD z podwójną błoną lipidową. Liposomy są przygotowywane przez sonikację próby zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami (Fuji i wsp., 1997, Biochemistry 36:4959). W skrócie polega to na tym, że lipidy (z białkiem lub bez) są rozpuszczane w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chloroform/metanol. Błony lipidowe są tworzone przez rozpipetowanie próbek roztworu lipidów do probówek szklanych z okrągłym dnem, odparowanie rozpuszczalnika w 65°C w strumieniu gazowego azotu. Tak utworzone błony są umieszczane w próżni na przynajmniej 8 godz. w celu odparowania pozostałości rozpuszczalnika. Alternatywnie, proszki lipidów o żądanym składzie można wytworzyć techniką, taką jak suszenie rozpyłowe, a następnie stosować w miejsce błon lipidowych. Wytworzenie liposomów jest dokonane przez hydratację błon lipidowych lub proszków w buforze i inkubowanie zawiesiny w 65°C przez 5-10 minut przed sonikacją. Następnie liposomy filtruje się przez 0,22 m filtr w celu wysterylizowania preparatu. Liposomy mierzy się przy pomocy dynamicznego rozproszenia światła, a kształtowanie się agregatów następuje przez co najmniej cztery tygodnie. Jest możliwe, że konformacje białka NTHi(P6)-HD, może potrzebować zachowania. Zatem z trzech sposobów podejścia, które mogą być stosowane przewidujemy, że korzystnymi sposobami są albo dodanie białka jako składnika mieszaniny przed hydratacją albo dodanie liposomów po uprzednim uformowaniu.
Szczepy bakteryjne. Szczepy NTHi 9333 (wyizolowany z płynu kręgowego) 35056 (izolat z zakażenia górnych dróg oddechowych), 43095 (izolat z zapalenia ucha środkowego), 49766 (izolat z zropienia płuca, szczep referencyjny przy testach wrażliwości antybakteryjnej) (ATCC) oraz szczep Hib 51654 (ATCC) stosowano w celu wykazania skuteczności w modelu zakażenia bakteryjnego. Przed użyciem zamrożoną próbkę wysiewa się na świeżą pożywkę płynną Brain Heart Infusion uzupełnioną NAD (2 μg/ml) oraz hemem (10 μg/ml) i inkubowana przez 24 godziny w 37°C w 10% ditlenku węgla. Dla każdego organizmu wykonano krzywą standardową, przedstawiającą zależność liczby jednostek tworzących kolonie i mętności zawiesiny w 480 nm, aby ustawić wielkość inokulum bakterii potrzebnych do testów bakteryjnych jak i ustalenia dawki prowokacji dootrzewnowej.
Procedury szczepień oraz badanie wywołania odpowiedzi immunologicznej na antygen bakteryjny.
Grupę nowonarodzonych szczurów (6 osobników na grupę) immunizowano w dniach 5, 12, 19 i 26 po porodzie lub w dniach 5 i 26 preparatem szczepionkowym lub buforem. Szczepienie ogólnoustrojowe szczurów przeprowadzono iniekcją podskórną szczepionek liposomowych. Gdy zwierzęta immunizuje się szczepionką drogą donosową, szczury poddaje się je narkozie metofanem, a badaną substancję (20 μθ podaje się używając sterylnej końcówki na mikropipetorze (Gallichan i wsp., 1993, J. Inf. Dis. 168:622). Młode szczury hodowano z karmiącymi matkami, obserwując ewentualne niekorzystne skutki szczepienia, takie jak tworzenie się ziarniniaków, stanów zaczerwienienia lub strupów w miejscu szczepienia. W tydzień po ostatnim szczepieniu, noworodki szczurze poddawano narkozie
PL 206 260 B1 halotanem, następnie pobierano krew przez punkcję sercową. Wydzieliny śluzówki zebrano przez przemycie błon śluzowych roztworem soli. Zwierzęta poddano eutanazji ditlenkiem węgla. Miana przeciwciał bakteriobójczych w surowicy i płynach śluzowkowych mierzono tak jak opisano poniżej.
Dla badania prowokacji otrzewnowej, noworodki szczurze (26 dniowe) infekowano bakteriami, następnie monitorowano ich krew i płyn mózgowo-rdzeniowy pod kątem obciążenia bakteriami, porównując ze szczurami nieszczepionymi. Badanie krwi i płynu mózgowo-rdzeniowego w kierunku bakterii w dwa dni po infekcji wykazało, że zwierzęta były znacząco obciążone bakteriami (1x104 CFU/ml krwi, 1x104 CFU/ml płynu mózgowo-rdzeniowego). Surowicę szczepionych szczurów, zawierającą wysokie miana przeciwciał przeciw bakteryjnych podawano dożylnie sześciodniowym szczurom. Następnego dnia noworodkom szczurów podawano dootrzewnowo NTHi jak opisano poniżej. Noworodki szczurze obserwowano pod kątem stanów chorobowych i umieralności, szczury, które przeżyły uśmiercano po 26 dniach, a pobraną z nich krew i płyn mózgowo-rdzeniowy hodowano badając obecno ść NTHi.
Dootrzewnowa prowokacja z użyciem NTHi. 24 godzinną, pasażowaną in vivo hodowlę NTHi doprowadzano do gęstości 5x107 - 5x109 CFU/ml, następnie 100 pl takiej hodowli wstrzykiwano dootrzewnowo 5-10 dniowym szczurom (Smith i wsp. 1973, Inf. Immun 8:278). Tak prowokowane szczury pozostawiano przy matce karmiącej. Po 18-96 godzinach po prowokacji, przy podawanej dawce przynajmniej 90% noworodków szczurzych umierało przy tej dawce pasażowanych bakterii.
Pomiar antygenowo swoistej odpowiedzi przeciwciał w teście ELISA. Surowicę oraz próbki śluzówki każdego szczura, testowano na obecność przeciwciał IgG i IgA swoistych względem antygenu P6. Zarówno uzyskane na drodze klonowania, natywne P6, jak i białko NTHi(P6)-HD dodawano do odpowiednio przygotowanych 96-studniowych płytek i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po całonocnej inkubacji płytki blokowano w 1% roztworze albuminy bydlęcej w buforze diwęglanowym o pH=9,6 przez 30 minut w 37°C. Następnie płytki przepłukiwano 0,05% Tween 20/ PBS. Rozcieńczenia każdej surowicy i próbki śluzówki dodaje się do płytek pokrytych antygenem z późniejszą inkubacją przez 2 godziny i płukaniem buforem Tween/PBS przy końcu inkubacji. Przeciwciała monoklonalne specyficznie rozpoznające IgA lub IgG, połączone z alkaliczną fosfatazą dodaje się do studzienek na jedną godzinę w 37°C. Następnie studzienki przepłukuje się buforem Tween /PBS i w celu zainicjowania reakcji barwnej dodaje się do studzienek substrat PNPP w buforze dietanoloaminowym, pH 9,5. Po zatrzymaniu reakcji 0,75N roztworem wodorotlenku sodu, płytkę odczytano przy długości fali 405 nm w spektrofotometrze do płytek ELISA Spectramax. Stężenia szczurzych IgA i IgG obliczano z krzywej wzorcowej otrzymanej na podstawie próbek kontrolnych o znanych stężeniach szczurzych IgA i IgG, opłaszczonych na 96 studzienkowych płytkach i traktowanych jak opisano powyżej.
Test na przeciwciała antybakteryjne. Próbki surowicy testowane pod kątem obecności przeciwciał antybakteryjnych hodowano w 56°C przez 30 min aby zinaktywować dopełniacz. Badane surowice jałowo rozcieńczono w buforze PBS. 24 godzinną hodowlę bakteryjną doprowadzono do gęstości 5x104 CFU/ml sterylnym buforem PCM złożonym z PBS z dodatkiem 0,15 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2 oraz albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Surowice z nieszczepionych noworodków szczurzych używano jako źródła dopełniacza. Surowice te łączono razem, rozdzielono na małe objętości i trzymano w temperaturze -70°C aż do momentu użycia. Bakterie (20 pl), elementy systemu dopełniacza (20 pl) oraz 40 pl 1% BSA w buforze PCM dodawano do każdej studzienki na 96 studzienkowej płytce. W celu ustalenia początkowej gęstości bakterii, po 10 pl badanych próbek wysiewano w czasie 0 na świeże szalki z agarem BHI, zawierającymi odżywczy agar dodatkowo uzupełniony NAD i hemem. Po jednogodzinnej inkubacji badanych próbek w 37°C w obecności 10% ditlenku węgla przez 1 godzinę z wytrząsaniem, 10 pl z każdej studzienki wysiewano w dwóch powtórzeniach, a następnie inkubowano przez noc w 37°C w obecności 10% ditlenku węgla w celu ustalenia liczby CFU na studzienkę. Jako kontrole stosowano studzienki bez surowicy, aby potwierdzić, że sam dopełniacz nie powoduje zabicia bakterii, jak również studzienki z badaną surowicą, ale bez elementów dopełniacza, aby potwierdzić, że dopełniacz obecny w próbkach został skutecznie zinaktywowany. Wszystkie testy wykonano w trzech powtórzeniach, a rozcieńczenia powodujące 50% skuteczności zabijania bakterii stosuje się do porównania aktywności między badanymi surowicami.
P r z y k ł a d VI - Wirus zapalenia wątroby typu C
Przygotowanie HCV(E2/NS1)-HD i HCV(E2/NSWVR1)-HD w komórkach CHO.
Sekwencję nukleotydową kodującą HCV E2/NS1 otrzymano po amplifikacji w reakcji PCR odpowiedniego szczepu wirusa HCV). Starter po stronie 5', odpowiadał pierwszym 21 nukleotydom sekwencji genu E2/NS1 (CAAACCATGATCGCCCACGGA), zaś starter po stronie 3' odpowiadał amino24
PL 206 260 B1 kwasom od 622 do 628 (GAAGTTGACAGTGCAGGGGTA). Reakcja PCR z wymienionymi starterami pozwalała na amplifikację sekwencji E2/NS1 z pominięciem sekwencji kodującej domenę śródbłonową (Cocquerel, L. i wsp., 1998, J. Virol. 72(3):2183-91). Dodatkowo, każdy starter był oflankowany dogodnymi miejscami restrykcyjnymi. Produkt reakcji PCR wprowadzano przez ligację do wektora pcDNA3.1His, zawierającego domenę HD jako plazmid z kasetą genu (Invitrogen, Inc., San Diego, CA). HCV(E2/NS1 AHVR1)-HD skonstruowano przez wydeletowanie pierwszych 27 aminokwasów z HVR1 z genu E2/NS1 (od pozycji 384 do 410). Mutanta delecyjnego wytworzono stosując reakcje PCR z następującym starterem na końcu 5': CAACTCATCAACACCAATGGC oraz tym samym co poprzednio starterem na końcu 3' dla kontroli typu dzikiego. Końcowe geny sprawdzono przez sekwencjonowanie. Otrzymanymi plazmidami transfekowano komórki CHO (Deen, K.C. i wsp., 1988, Nature 331:82) (ATCC, Rockville, MD) używając czynnika lipofekcyjnego (Lipfectamine, Gibco/BRL Gaithersburg, MD) zgodnie z protokołem zalecanym przez producenta. Stabilne transformanty selekcjonowano z wykorzystaniem G418 (Gibco/BRL Gaithersburg, MD) i klonowano w ograniczonych rozcieńczeniach. Klony produkujące białko na wysokim poziomie identyfikowano wykorzystując analizę typu Western. Białka HCV(E2/NS1)-HD i HCV(E2/NS1 AHVR1)-HD oczyszczano wykorzystując powinowactwo do niklu związanego do fazy stałej. Łącznik histydynowy po oczyszczaniu usuwano przez trawienie enterokinazą. W razie potrzeby przeprowadzano chromatografię wykluczania ze względu na wielkość cząstek, jonowymienną i/lub oddziaływań hydrofobowych w celu dokładniejszego oczyszczenia białek HCV(E2/NS1)-HD i HCV(E2/NS1AHVR1)-HD.
Przygotowanie białek HCV(HVR1)-HD i HCV(C)-HD w E. coli. Sekwencje nukleotydowe wybranych epitopów zaprojektowano na podstawie sekwencji białkowych, stosując kodony preferowane w E. coli (Looman i wsp., 1987, EMBO J. 6:2489). Sekwencje antygenów wstawianych w kasety genowe odpowiadały następującym epitopom: Np. (147-161, TYQRTRALVRTGMDP:55-69, RLIQNSLTIERMVLS) i HA (91-108 SKAFSNCYPYDVPDYASL). Po otrzymaniu odpowiednich sekwencji, sztuczny gen kodujący HCV-HD, oflankowany dogodnymi miejscami restrykcyjnymi, składano na drodze syntezy, hybrydyzacji i ligacji zachodzących na siebie oligonukleotydów. Pokrótce, składanie fragmentów przeprowadzano przez podgrzanie do 65°C i łączenie oligonukleotydów w czasie obniżania temperatury aż do osiągnięcia temperatury pokojowej. Po dwuminutowej inkubacji w lodzie, fragmenty poddawano ligacji przy zastosowaniu ligazy DNA. Złożony pełnej długości gen kodujący fragmenty HCV amplifikowano przez PCR, cięto enzymami restrykcyjnymi oraz izolowano z żelu po elektroforezie. Tak przygotowany gen HCV poddawano ligacji z plazmidem ekspresyjnym, zawierającym gen HD (np. pTrcHis lub pQUE30), przeciętym w ten sam sposób. Wytworzone plazmidy sprawdzano przez sekwencjonowanie DNA.
Plazmidy zawierające HCV-HD transformowano do komórek E. coli. Bakterie hodowano w pożywce LB z ampicyliną (50 μg/ml) w 37°C do osiągnięcia środkowej fazy wzrostu logarytmicznego. W tym momencie dodawano IPTG w celu indukcji hybrydowego promotora trp/lac. Dokonywano sprawdzenia ekspresji HCV-HD co godzinę, w celu ustalenia odpowiedniego czasu indukcji. W punkcie czasowym odpowiadającym optymalnej ekspresji, zbierano komórki bakteryjne przez wirowanie. Osady komórek lizowano, a w otrzymanych lizatach sprawdzano obecność białka. Białka HCV-HD oczyszczano wykorzystując powinowactwo do niklu związanego do fazy stałej. Łącznik histydynowy po oczyszczaniu usuwano poprzez trawienie enterokinazą. W razie potrzeby przeprowadzano chromatografię wykluczania ze względu na wielkość cząstek, jonowymienną i/lub oddziaływań hydrofobowych w celu dokładniejszego oczyszczenia białek HCV-HD.
Przygotowanie liposomów i procedury szczepień, badanie indukcji odpowiedzi immunologicznej, pomiary odpowiedzi przeciwciał w teście ELISA, testy DTH, analizę mRNA zależną od cytokin, mierzenie poziomu cytokin w teście ELISA, indukcję proliferacji komórek T przez antygen oraz odpowiedzi CTL anty-HIV przeprowadzano zasadniczo tak, jak w przykładzie 3 powyżej.

Claims (37)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Immunogenna kompozycja liposomowa, znamienna tym, że zawiera: tworzące pęcherzyki lipidy; oraz konstrukt antygenowy zawierający fuzję co najmniej jednej wirusowej, bakteryjnej, grzybiczej, pasożytniczej lub rakowej determinanty antygenowej i domeny hydrofobowej, która składa się z 15 do 500 reszt aminokwasowych i jest związana z błoną takiej kompozycji liposomowej.
    PL 206 260 B1
  2. 2. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto jeden lub więcej adiuwantów.
  3. 3. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że konstrukt antygenowy jest zsyntetyzowany chemicznie.
  4. 4. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że domeną hydrofobową jest peptyd.
  5. 5. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że domena hydrofobowa zawiera jeden lub więcej aminokwasów wybranych z grupy składającej z Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
  6. 6. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że determinanta antygenowa pochodzi z antygenu wybranego z grupy składającej z gB HSV, gD HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA, NA INFV, P6 H. influenzae, P5 H. influenzae, białka fimbrii i białka D.
  7. 7. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że konstrukt antygenowy zawiera ponadto region łącznikowy łączący determinanty antygenowe z domeną hydrofobową.
  8. 8. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 7, znamienna tym, że regionem łącznikowym jest peptyd.
  9. 9. Immunogenna kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że konstruktem antygenowym jest białko fuzyjne.
  10. 10. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 8, znamienna tym, że region łącznikowy składa się z od 1 do około 200 reszt aminokwasowych.
  11. 11. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 10, znamienna tym, że reszty aminokwasowe są wybrane z grupy składającej z Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
  12. 12. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że konstruktem antygenowym jest białko fuzyjne.
  13. 13. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
  14. 14. Immunogenna kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że konstrukt antygenowy zawiera ponadto region łącznikowy łączący determinantę antygenową z domeną hydrofobową.
  15. 15. Immunogenna kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że zawiera ponadto jeden lub więcej adiuwantów.
  16. 16. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że liposomy stanowią jednowarstwowe pęcherzyki.
  17. 17. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 16, znamienna tym, że zawiera ponadto jeden lub więcej adiuwantów.
  18. 18. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 16, znamienna tym, że konstrukt antygenowy jest zsyntetyzowany chemicznie.
  19. 19. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 16, znamienna tym, że domena hydrofobowa jest białkiem.
  20. 20. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 19, znamienna tym, że domena hydrofobowa składa się z aminokwasów wybranych z grupy składającej się z Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
  21. 21. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 16, znamienna tym, że determinanty antygenowe pochodzą z antygenu wybranego z grupy składającej się z gB HSV, gD HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA INFV, NA INFV, P5 H. influenzae, P6 H. influenzae, białka fimbrii i białka D.
  22. 22. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 16, znamienna tym, że konstrukt antygenowy zawiera ponadto region łącznikowy łączący determinanty antygenowe z domeną hydrofobową.
  23. 23. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 22, znamienna tym, że region łącznikowy składa się od 1 do 200 reszt aminokwasowych.
  24. 24. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 23, znamienna tym, że reszty aminokwasowe wybrane są z grupy składającej się z Ala, Arg, Asp, Cys, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
  25. 25. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera ponadto lipidową emulsję i olej.
  26. 26. Immunogenna kompozycja liposomowa według zastrz. 1, znamienna tym, że jest kompozycją liposomów jednowarstwowych.
    PL 206 260 B1
  27. 27. Zastosowanie kompozycji liposomowej określonej w zastrz. 1 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia-gospodarza.
  28. 28. Zastosowanie kompozycji liposomowej określonej w zastrz. 2 do wytwarzania leku do indukowania odpowiedzi immunologicznej u zwierzęcia-gospodarza.
  29. 29. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że zwierzęciem - gospodarzem jest ssak.
  30. 30. Zastosowanie według zastrz. 29, znamienne tym, że gospodarzem jest człowiek.
  31. 31. Zastosowanie według zastrz. 30, znamienne tym, że determinanta antygenowa jest wybrana z grupy składającej z gB HSV, gD HSV, gp120 HIV, gB CMV, E2 HCV, HA INFV, NA INFV, P5 H. influenzae, P6 H. influenzae, białka fimbrii i białka D.
  32. 32. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że zwierzęciem - gospodarzem jest ptak.
  33. 33. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość kompozycji określonej w zastrz. 1 i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik.
  34. 34. Kompozycja szczepionki według zastrz. 33, znamienna tym, że zawiera ponadto jeden lub więcej adiuwantów.
  35. 35. Sposób wytwarzania immunogennej kompozycji liposomowej, znamienny tym, że obejmuje: rozpuszczenie lipidów tworzących pęcherzyki i konstruktu antygenowego określonego w zastrz. 1 w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym;
    tworzenie błony lipidowej albo proszku rozpyłowego przez odparowanie rozpuszczalnika organicznego;
    uwodnienie błony lipidowej albo proszku; i zdyspergowanie uwodnionej błony lipidowej albo proszku z wytworzeniem immunogennej kompozycji liposomowej.
  36. 36. Sposób wytwarzania immunogennej kompozycji liposomowej, znamienny tym, że obejmuje: rozpuszczenie konstruktu antygenowego określonego w zastrz. 1 w wodnym buforze; uwodnienie proszków lipidowych lub błon lipidowych w buforze zawierającym konstrukt antygenowy określony w zastrz. 1; i zdyspergowanie proszków lub błon lipidowych z wytworzeniem immunogennej kompozycji liposomowej.
  37. 37. Sposób wytwarzania immunogennej kompozycji liposomowej, znamienny tym, że obejmuje: rozpuszczenie konstruktu antygenowego określonego w zastrz. 1 w wodnym buforze; i dodanie rozpuszczonego konstruktu antygenowego określonego w zastrz. 1 do utworzonych wcześniej liposomów z wytworzeniem immunogennej kompozycji liposomowej.
PL348604A 1998-09-22 1999-09-22 Immunogenna kompozycja liposomowa, jej zastosowanie, sposoby jej wytwarzania i kompozycja szczepionki PL206260B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10135198P 1998-09-22 1998-09-22
US40072399A 1999-09-21 1999-09-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL348604A1 PL348604A1 (en) 2002-06-03
PL206260B1 true PL206260B1 (pl) 2010-07-30

Family

ID=26798150

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL348604A PL206260B1 (pl) 1998-09-22 1999-09-22 Immunogenna kompozycja liposomowa, jej zastosowanie, sposoby jej wytwarzania i kompozycja szczepionki

Country Status (30)

Country Link
EP (1) EP1115382B1 (pl)
JP (1) JP2002526436A (pl)
KR (1) KR100592825B1 (pl)
CN (1) CN1555254A (pl)
AP (1) AP2010A (pl)
AT (1) ATE468108T1 (pl)
AU (1) AU766772B2 (pl)
BG (1) BG65675B1 (pl)
BR (1) BR9914004A (pl)
CA (1) CA2344173C (pl)
CY (1) CY1110718T1 (pl)
CZ (1) CZ20011013A3 (pl)
DE (1) DE69942393D1 (pl)
DK (1) DK1115382T3 (pl)
EA (1) EA004797B1 (pl)
EE (1) EE200100168A (pl)
ES (1) ES2345695T3 (pl)
GE (1) GEP20053444B (pl)
HU (1) HUP0105391A3 (pl)
ID (1) ID29082A (pl)
IL (2) IL141675A0 (pl)
MX (1) MXPA01002973A (pl)
NO (1) NO330685B1 (pl)
NZ (2) NZ510442A (pl)
OA (1) OA11657A (pl)
PL (1) PL206260B1 (pl)
SK (1) SK287670B6 (pl)
UA (1) UA75327C2 (pl)
WO (1) WO2000016746A2 (pl)
ZA (1) ZA200101829B (pl)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006235507B2 (en) * 2005-04-12 2012-08-30 Duke University Method of inducing neutralizing antibodies to human immunodeficiency virus
EP2438926B1 (en) 2009-06-04 2016-03-23 M Bio Technology Inc. Vaccine for mycoplasma infection
EA034702B1 (ru) * 2011-04-26 2020-03-10 Молекулар Экспресс, Инк. Липосомные композиции
WO2015048635A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Duke University Mper-liposome conjugates and uses thereof
WO2018187515A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Avidea Technologies, Inc. Peptide-based vaccines, methods of manufacturing, and uses thereof for inducing an immune response
KR102901149B1 (ko) * 2022-09-05 2025-12-17 주식회사 차백신연구소 에멀전 제형의 면역증강제 조성물 및 이의 제조 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8405493D0 (sv) * 1984-11-01 1984-11-01 Bror Morein Immunogent komplex samt sett for framstellning derav och anvendning derav som immunstimulerande medel
US5374548A (en) * 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
SE462375B (sv) * 1985-10-15 1990-06-18 Morgaardshammar Ab Centro Traadblock
US4861597A (en) * 1986-05-20 1989-08-29 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Novel functionallized liposomes and a process for production thereof
FR2754543B1 (fr) 1996-10-11 1998-12-31 Pasteur Institut Souche de bordetella deficiente dans la production de toxine et exprimant une proteine hydride, liposomes comprenant de la fha et leurs utilisations comme vaccins, et utilisation de la fha pour stimuler les reponses immunitaires

Also Published As

Publication number Publication date
CA2344173C (en) 2010-02-23
SK287670B6 (sk) 2011-05-06
ATE468108T1 (de) 2010-06-15
AP2001002096A0 (en) 2001-03-31
WO2000016746A8 (en) 2000-08-10
KR100592825B1 (ko) 2006-06-23
CN1555254A (zh) 2004-12-15
EP1115382B1 (en) 2010-05-19
BG105372A (en) 2001-10-31
CY1110718T1 (el) 2015-06-10
AP2010A (en) 2009-06-29
UA75327C2 (en) 2006-04-17
IL141675A0 (en) 2002-03-10
MXPA01002973A (es) 2003-03-27
ES2345695T3 (es) 2010-09-29
NO20011406D0 (no) 2001-03-20
DE69942393D1 (de) 2010-07-01
AU766772B2 (en) 2003-10-23
JP2002526436A (ja) 2002-08-20
NO330685B1 (no) 2011-06-06
HUP0105391A2 (hu) 2002-05-29
SK3222001A3 (en) 2001-09-11
OA11657A (en) 2004-12-08
KR20010075261A (ko) 2001-08-09
AU6035199A (en) 2000-04-10
BG65675B1 (bg) 2009-06-30
GEP20053444B (en) 2005-02-25
ZA200101829B (en) 2002-06-05
NZ510442A (en) 2003-10-31
WO2000016746A3 (en) 2000-11-23
BR9914004A (pt) 2001-07-24
NZ528055A (en) 2005-01-28
CZ20011013A3 (cs) 2002-03-13
DK1115382T3 (da) 2010-09-06
HK1039064A1 (en) 2002-04-12
HUP0105391A3 (en) 2006-02-28
NO20011406L (no) 2001-04-24
PL348604A1 (en) 2002-06-03
EE200100168A (et) 2002-06-17
EA200100269A1 (ru) 2001-12-24
ID29082A (id) 2001-07-26
CA2344173A1 (en) 2000-03-30
IL141675A (en) 2007-06-17
WO2000016746A2 (en) 2000-03-30
EA004797B1 (ru) 2004-08-26
WO2000016746A9 (en) 2000-09-21
EP1115382A2 (en) 2001-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2437585T3 (es) Vesículas de tipo virosoma que comprenden antígenos derivados de gp41
JP3602448B2 (ja) 核酸呼吸器シンシチウムウイルスワクチン
AU2004246974B2 (en) Functionally reconstituted viral membranes containing adjuvant
CA2169297C (en) Protein- or peptide-cochleate vaccines and methods of immunizing using the same
Mannino et al. Lipid matrix-based vaccines for mucosal and systemic immunization
JP2018135388A (ja) シュードモナス抗原および抗原の組み合わせ
CN102365095B (zh) 分裂gp41
CA2344173C (en) Immunogenic liposome compositions
CN106606775A (zh) 脂质体a群链球菌疫苗
Gould-Fogerite et al. Cochleate delivery vehicles: applications in vaccine delivery
HK1039064B (en) Immunogenic liposome compositions
CN102307592A (zh) 新型gp41抗原
Levi A synthetic approach to influenza vaccines

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120922