JPH06500331A

JPH06500331A - 固相用途のためのポリエチレングリコール誘導体

Info

Publication number: JPH06500331A
Application number: JP3515134A
Authority: JP
Inventors: バラニー，ジヨージ; アルベリチオ，フエルナンド; チヤング，ジエイン; ザリプスキー，サミユエル; ソール，ヌリア・エイ
Original assignee: University of Minnesota Twin Cities
Current assignee: University of Minnesota Twin Cities
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1991-08-27
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2016-01-09
Also published as: WO1992004384A1; JP2001081099A; EP0801082B1; JP2002080530A; DE69130333D1; DE69133235T2; EP0546055A1; EP0801082A3; DE69130333T2; EP0801082A2; DE69133235D1; EP0687691A3; JP3435541B2; JP3122460B2; EP0687691A2; EP0687691B1; DE69120821D1; EP0546055B1; DE69120821T2; JP3266600B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】固相用途のためのポリエチレングリコール誘導体発明の背景スペーサーアームは、現代の生化学の多くの領域において必須である。

スペーサーアームは、１つの分子をもう一つの分子にまたは不活性支持体に結合する分子として定義することができる。例えば、ポリエチレングリコールは、酵素を、酵素の活性を保留しながら、不溶性担体及び他の生体分子に結合するために有利に使用されてきた。Ｍ、５ｔａｒｋ及びに、Ｈｏｌｍｂｅｒｇ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ、、３４　：　９４２〜９５０　（１９８９）。

この概念は、固定された酵素を使用する工業的プロセス（例えば、親和力カラム精製プロセス）のための、そして診断評価（例えば、ＥＬＩＳＡ評価）のための重要な結果を有する。ポリエチレングリコールスペーサーアームが使用されてきた２つのその他の領域は、ペプチド合成及びシーフェンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）である。保護されたヌクレオチド及びアミノ酸残基の不活性支持体例えばシリカ、膜及びポリスチレン支持体への力・ノブリング速度は、しばしば支持体主体からの反応サイトの分離に釣り合って増加する。類似の効果が、固相の固定されたサンプルのシーフェンシングに関しても示された。Ｊ、に、Ｉｎｍａｎら、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　、Ａｎａｌｙｓｉｓ。

Ｐｒｅｖｉｅｒｏ　ａｎｄ　Ｃｏ１ｅｔｔｉ−Ｐｒｅｖｉｅｒｏ、（編集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、化オランダ、Ｂ　ｉ　ｏｍｅ　ｄ　出版社、８１〜９４頁ｅ１９７７）中て。

固相核酸若しくはペプチド合成またはシーフェンス分析の有効性は、反応性サイトを固定する固相または支持体によって影響される。ポリスチレンゲルまたは多孔性ガラスは、両方とも、例えば、ペプチドシークエンシングのための固体支持体として利用されてきた。多くの応用においては、このプロセスにおいて使用される溶媒は、ポリスチレン粒子の体積を変化せしめ、そしてこれは、反応カラムの閉塞及び背圧を引き起こす可能性がある。逆に、多孔性ガラスは完全に堅くそして体積が変化しないが、多孔性ガラス誘導体の化学的特性は、再現性を欠いてきた。

反応性基がポリマー粒子に結合され得るように誘導されたポリマー粒子、例えばポリスチレン粒子は、多くの応用において有用であることが証明された。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構造体は、それらが広い範囲の溶媒と適合性であるので、化学的に不活性なスペーサーアームとして使用されてきた。Ｉｎｍａｎら、上記文献。ＰＥＧスペーサーアームの使用は、支持体によって引き起こされる立体的な効果を最小にする。

ＰＥＧスペーサーアームは、細孔スペースの特性を、支持体結合された反応性部分が広い範囲の溶媒及び試薬と適合性であるように改質するというもう一つの有用な機能を与える。

ＰＥＧ改質されたポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）樹脂は、固相ベブチドシークエンシングにおける使用のために記述されてきた。Ｉｎｍａｎら、上記文献。ＰＥＧ−ＰＳ樹脂はまた、相移動触媒として利用されてきた。Ｗ、　Ｍ、　ＭｃＫｅ　ｎ　ｚ　ｉ　ｅら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｃｈｅｍ。

９７９）：　Ｊ、Ｇ、７３−ｅ　ｆ　ｆ　ｅ　ｒｎａｎら、Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｐｅｒｋｉｎ　ＩＩ、５１４〜５１７頁（１９８１）；Ｙ、Ｋｉｍｕｒａら、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　、旦、３８５〜３８６（１９８３）；Ｍ、Ｔｏｍｏ　ｉら、反応性ポリマー、旦：　２７〜３６　（１９８９）、ＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、固相ペプチド合成のための支持体として記述されてきた。

ら、Ｍａｋｒｏｍｏ　１．Ｃｈｅｍ、　、ユ８４：２６０３〜２６１７　（１９８３）。しかしながら、引用した方法によって製造されたＰＥＧ−ＰＳ樹脂は、数個の欠点をこうむる。高分子量ＰＥＧ　（例えば、４００ドルトンより大きい）に関しては反応は不十分にしか進まず、そして対称性２官能ＰＥＧは橋かけを形成する傾向があった。これらの問題１ｔ、エチレンオキシドの橋かけされたポリスチレンの上への直接のアニオン重合によって軽減された。Ｂａｙｅｒら、ペプチド：構造及び機能、Ｖ。

Ｊ、Ｈｒｕｂｙ及びり、　Ｈ，Ｒｉ　Ｃｈ　（編集）、Ｐｒｏｃ、８ｔｈ　Ａｍ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｍｐ、８７〜９０頁、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ　（１９８３）中で。Ｂａｙｅｒ及びＲａｐｐ、ドイツ特許ＤＥ　３５００１８０　Ａｌ（１９８６）、しかしながら、この方法を使用するとＰＥＧ連鎖長さは制御すること力（困難であり、そしてＰＥＧポリマーの均一性は不確かである。このプロセスに関するもう一つの問題は、ポリスチレンは高度に毒性であるクロロメチルエーテルを使用して官能化され、そして残留のクロロメチル基１まペプチド合成の間に副反応を引き起こす可能性があるとＬｌうことである。

ＰＥＧグラフトコポリマーを製造するもう一つの方法１ま、Ｚａｌｉｐｓｋｙらによってペプチド・構造及び機能、Ｃ，Ｍ、Ｄｅｂｅｒ、Ｖ。

Ｊ、Ｈｒｕｂｙ及びに、Ｄ、Ｋｏｐｐｌｅ　（編集Ｌ　Ｐｒｏｃ、９ｔｈＡｍ、Ｐｅｐ、Ｓｙｍｐ、、２５７−２６０頁、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ、Ｃｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ　（１９８５）中で記述されている。

この方法においては、規定された分子量（即ち、２０００〜４０００ドルトン）のある種のへテロ２官能ＰＥＧ誘導体が使用された。しかしながら、これらの誘導体は容易には入手できず、これはそれらの商業化を阻害する。

広い範囲の溶媒と共に使用することができる非毒性で効果的な固体支持体を製造する方法があれば、それはペプチド若しくは核酸の固相合成若しくはシーケンシングにおける使用のために、またはその他の固相応用のために価値あるものであろう。

発明の要約本発明は、ポリエチレングリコール誘導されたグラフト支持体に、これらの支持体を製造するための方法に、そしてこれらの支持体を使用して固相合成技術によってペプチドを合成する方法に関する。本発明のＰＥＧグラフト支持体は、固体支持体に共有結合している官能化されたＰＥＧ誘導体を含有して成る。１つの実施態様においては、これらのＰＥＧグラフト支持体は、式Ｉ：式■ ［式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素（Ｈ）、及び亘純なアルキルまたはアリール基例えばメチル、エチルまたはフェニルから成る群から独立に選ばれ、Ｘは、ＨまたはＨ２Ｎ−Ｂ−ＮＨ−Ｃ（０）−Ａ−Ｃ（０）−であり、そして、Ａ及びＢは、独立に、直鎖のまたは分岐したアルキル基例えばエチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレンまたは長さが約Ｃ−１０までのその他の基（例えば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸またはその他のこのような酸から誘導されたＡ；エチレンジアミンまたはその他の脂肪族ジアミンから誘導されたＢ）　、ＣＨ＝ＣＨ基（例えば、マレイン酸から誘導されたＡ）または芳香族基（例えば、フタル酸から誘導されたＡ：）工二レンジアミンから誘導されたＢ）である］によって表されそして図ＩＡ中に示される。ＳＳは固体支持体を表す。

末端アミノ基は、必要に応じてＮ”保護基例えばＢｏｃ、Ｆｍｏｃ及びその他の既知の保護基によフて保護することができる。括弧内部に示された、式のコア部分は、一連の容易に入手できるアミノ官能化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー誘導体に相当下る。

本発明のもう一つの実施態様においては、ペプチド合成がＰＥＧの末端以外の点で起こり得るように樹脂が構成される。このような樹脂は、図より中に図示されそして更に一般式■・式　■ ［式中、Ｙは、必要に応じてＮ”保護基によって保護されることができるジアミノモノカルボン酸であり、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、固体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜Ｃ１０のアルキル基例えばメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンであり、そしてＲ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれる〕によって表される。

本発明は、出発物質として１官能またはホモ２官能ポリエチレングリコールを使用して官能化された不活性支持体を製造するための数個のコンパクトな商業的に価値あるルートを与える。本発明のＰＥＧグラフト支持体は、固相ペプチド合成、核酸合成、及び固定された分子が使用されるその他の応用のために有利な物理的及び機械的特性を与える。

図面の簡単な説明図ＩＡ及びＩＢは、２つのポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）グラフト支持体の２つのタイプの一般的な構造を示す。

Ｘは、生体ポリマー連鎖の成長が始まる点を示す。

図２は、一連の、スペーサーアームリンカ−の製造を導く反応、アミノ官能化されたポリスチレン樹脂へのそれのカップリング、樹脂結合されたリンカーベのハンドルの取付、及びペプチドを合成するためのそれの使用を示す略図である。

図３は、別のＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体を導く一連の反応を示す略図である。

図４は、Ｏｒｎ残基から生体ポリマーを合成することができる、ＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体を導く一連の反応を示す略図である。

発明の詳細な説明本発明は、固体支持体に共有結合された官能化されたポリエチレングリコールを含有して成る樹脂に関する。１つの実施態様（こおＬＸで（ま、生成するグラフト支持体は、支持体に結合された対称的なポ１〕（オキシエチレン）ジアミン誘導体を含有して成り、そして式１二式Ｉ［式中、 Ωは、約Δ〜約１５０の整数であり、Ｒ＋、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、水素（Ｈ）、及び単純なアルキルまたはアリール基例えばメチル、エチルまたはフェニルから成る群から独立に選ばれ、ＳＳは、固体支持体であり、Ｘは、Ｈまたｌ；！ＨｚＮ−Ｂ−ＮＨ−Ｃ（０）−Ａ−Ｃ（０）−であり、そしてＡ及びＢは、独立に、直鎖のまたは分岐したアルキル基例え（ずエチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレンまたは長さがＣ−１０までの類似物（例えば、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸またはその他のこのような酸から誘導されたＡ：エチレンジアミンまたはその他の脂肪族ジアミンから誘導されたＢ）　、ＣＨ＝ＣＨ基（例えば、マレイン酸から誘導されたＡ）または芳香族基（例えば、フタル酸から誘導されたＡ：フェニレンジアミンから誘導されたＢ）である］によって表される。括弧された部分内部の、式のコア部分は、一連のポリオキシエチレンジアミンポリマーに相当する。−または複数のアミノ基は、必要に応じて既知のＮ′保護基によって保護することができる。

式Ｉのグラフト支持体を製造するための１つの方法は、アミノ官能化されたコアポリマーを、無水物を含むジカルボン酸誘導体と反応させて、カルボキシル官能性分子を製造することによる。この方法によれば、ジアミンポリマーを少な（とも２当量の活性化されたジカルボン酸誘導体と反応させる。この方法において有用であるジカルボン酸は、約１２までの炭素原子を有するアルキルジ酸、例えば、マレイン酸、コハク酸、グルタル酸またはアジピン酸：無水物例えば無水マレイン酸、無水コハク酸若しくは無水グルタル酸：または芳香族無水物、例えば無水フタル酸を含む。この方法の１つの実施態様においては、ジアミンポリマーを、無水コハク酸、無水マレイン酸または無水グルタル酸と反応させて、請求された化合物の代表例、ビス（スクシニル化された）、ビス（マレイル化された）またはビス（グルタリル化された）ＰＥＧを製造する。図２及び３は、製造及びアミン官能化された固体支持体の上へのこれらのＱ体の後続のカップリングを例示する。

２官能ＰＥＧジアミン化合物は、一般式■゛式■ ［式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、Ｈ、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれ、Ｘは、ＯＨ，ハロゲン及び活性エステルまたはチオエステルの活性化基から成る群から選ばれ、そしてＡは、約１０までの炭素原子を有する直鎖のまたは分岐したアルキル基、ＣＨ＝ＣＨ基及び芳香族基から成る群から選ばれる］を有する。

“活性エステル”という術語は、カルボキシル基をそれらがアミノ基と一層容易な反応を受けるように活性化する化合物を指す。本発明の組成物及び方法において使用することができる活性化基は、例えば、トリクロロフェニル（ＴＣＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（Ｐ　Ｐ　Ｐ）エステル及びメチルフェニルピラゾリノン（ＭＰＰ）エステルを含む。

前記ポリマーのコア部分として使用することができる対称的なジアミンは、式■ 及び式■中に示された構造の括弧された部分に対応するポリマーを含む。アミノ基の理論的含量を有するこのようなＰＥＧ誘導体は、灸数の既知のプロセスによって得ることができる。例えば、Ｄｕｃｋｍ１＋ｌｎ　ｎら、ＭａｋｒＯｍＯｌ、Ｃｈｅｍ、、↓８２　：１３７９　（１９８３）；Ｚａｌｉｐｓｋｙら、Ｅｕｒ、Ｐｏｌｙｍ、Ｊ、、１９：１１７７（１９８３）を参照せよ。この目的のために特に有用であるポリマーは、商標Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ”’（Ｔｅｘａｃｏ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、Ｂｅ１ｌａｉｒｅ、ＴＸ）の下で商業的に入手できる約６０００ドルトンまでの分子量を有する一連のポリ（オキシエチレン）ジアミンを含む。Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ”’ポリ（オキシエチレン）ジアミン樹脂は、ポリプロピレンオキシドでキャップされたポリエチレングリコールから構造的に誘導された脂肪族第一ジアミンである。これらの生成物は、高い全及び第一アミン含量によって特徴づけられる。所望の特性を有するその他の対称的なジアミンも使用することができる。幾つかの応用のためには、はぼ同じ一般構造を有する対称的なジカルボン酸で官能化されたポリマーを使用することができる。

本発明の方法によって製造されたカルボキシルで官能化されたスペーサーアームリンカ−は、次に、アミノ基によって官能化された適切な親（ｐａｒｅｎｔ）担体にカップリングさせる。本発明において固相として有用である担体は、巨大分子または固体、例えば膜、多孔性ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリジメチルアクリルアミド、綿または紙を含む。特に有用である固体支持体は、アミノ官能化されたポリスチレン、アミノメチルポリスチレン、アミノアセチルポリスチレン及びｐ−メチルベンズヒドリルアミンポリスチレンを含む。特に好ましい支持体は、アミノ官能化されたポリスチレン−ニー１％ジビニルベンゼンである。

親担体のすべてのアミノ基は、アミノ基を基にして１当量の担体を過剰のカルボキシル官能化された誘導体と反応させることによって覆うこと力吻きる。担体の上の殆どのアミノ基は、ポリエチレングリコール誘導体によって置換され、それによって１つの遊離の吊り下がったカルボキシル基を有するスペーサーアームを形成するようになった。

本発明のＰＥＧ誘導体の上へのアミノ官能性の導入は、多くの合成応用のために望ましい。これは、アミド部分の酸加水分解（図２参照）（これによってジアミンの上に元々存在していたアミノ基をさらすこと（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）になる）によって、または遊離の若しくは１保護された低分子量ジアミン（例えば、エチレン若しくはヘキサメチレンジアミン）をカルボキシレート末端基と更にカップリングさせることによって（図３参照）達成することができる。ビス（マレイル化された）ＰＥＧリンカ−によって改質された親担体（図２参照）に関しては、例えば、末端の吊り下がったマレイル基が、酸、例えば、トリフルオロ酢酸または希塩酸（ＨＣＩ）による制御された処理によって選択的に加水分解され、一方、今やＰＥＧを担体に結合している他方のマレイル基は本質的に安定である。これらの方法によって、アミノ官能化されＰＥＧ改質された物質が、急速に、効率的にそして経済的に得られる。

ＰＥＧ−ＰＳグラフトコポリマーを製造する方法のもう一つ実施態様においては、ジ酸または無水物を、まずアミノ官能化された支持体と反応させ、それによってアミド結合されカルボキシル官能化された支持体を形成させる。このカルボキシル官能化された支持体を、活性化しそして次に、上で述べたコア構造体によって代表される、過剰の２官能ジアミンポリマーと接触させる。

上で述べたＰＥＧグラフト支持体は、図ＩＡ中に示したようにＰＥＧ末端でキ伴ポリマーを組み立てることを可能にする。しかしながら、もう一つの実施態様においては、本発明の樹脂は、ペプチド合成がＰＥＧ末端以外の点で起こり得るように構成することができる。このような樹脂は、図ＩＢ中に例示され、そして更に一般式■：式■ ［式中、Ｙは、必要に応じてＮ″保護基によって保護されることができるジアミノモノカルボン酸でありｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、固体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐した０１〜ＣＩＯのアルキル基、例えばメチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンであり、そしてＲ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって表される。

このタイプのＰＥＧグラフト支持体（式■）は、誘導化された１官能化されたポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧモノアミンまたはＰＥＧモノメチルエーテル）を使用して合成される。商業的に入手できるＰＥＧ出発物質は、１官能Ｊ　ｅ　ｆ　ｆａｍｉｎｅ”ゝかまたはメトキシ及びヒドロキシル末端基を有するＰＥＧモノメチルエーテルかのどちらかである。ＰＥＧの上のアミノ基は、既に述べたようにジカルボン酸または無水物凹反応させることができる。その代わりに、ＭＰＥＧのカルボキシル官能化された誘導体は、例えば以下の式中に示されるように、エチルブロモアセテート、４−ブロモバレレートまたはイソシアンアセテートとの反応と、それに続く鹸化によって作ることができる。

図４は、式■のＰＥＧ樹脂の合成を図式的に示す。この方法に従うと、Ｎ’−Ｆｍｏｃ、Ｎ’−Ｂｏａ−Ｏｒｎ−ＰＳ樹脂（またはこのテーマに関する互換）を選択的に脱保護し、そして１官能ＰＥＧ酸をカップリングさせて生体ポリマー連鎖成長の基本的な方向に直交する分岐を生成させる。オルニチン残基（図４中に示したような）を、ＰＥＧ誘導体を固体支持体に結合するために使用する。しかしながら、カルボキシル基及び２つのアミノ基を有する他の化学的部分も使用する二とができる。

本発明の方法によって作られたポリエチレングリコール−ポリス千しン（ＰＥＧ　−ＰＳ）グラフト支持体は、特に有用である。本発明のＰＥＧ誘導体を使用して作られたＰＥＧ　−ＰＳ支持体は、固相応用のために数個の望ましい特性を有する；それらは、種々の溶媒中で膨潤し、たいていの固相合成に８いて使用される条件下で安定であり、そして固相応用、特に、固相ペプチド合成において使用されるバッチ及びカラム反応器の両方において良く挙動する。

同相ペプチド合成は、典型的には第一アミノ酸の固体支持体への刀ルボキ／ル末端の共有結合で始まる。Ｎ’保護されたアミノ酸のカルボキシル基は、峰ＥＧスペーサーアームの遊離末端（固体支持体に結合していない末端）上のアミノ基に（図ＩＡ、２及び３）またはＰＥＧ末端以外の点で（図ＩＢ及び４）結合しているハンドル部分に共有結合する。

“ハンドル“は、初期アミノ酸残基をポリマー状支持体に結合する役割を果す２官能スペーサーとして定義される。ハンドルの１つの末端はすんなりと開裂可能な保護基を一員とし、そしてハンドルの他の末端は官能化された固体支持体にカップリングする。固相ペプチド合成における本発明のスペーサーアームに関して使用することができるハンドルは、例えば酸で変化しゃすいｐ−アルコキシベンジル（ＰＡＢ）ハンドル、光で変化しゃすい０−ニトロベンジルエステルハンドル、並びにＡｌｂｅｒｉｃｉｏら、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、、５５　：　３７３０〜３７４３（１９９０）及びその中に引用された引用文献によって、そして両方と−も１９９０年８月３１日に出願された共に継続中のＧ、Ｂａｒａｎｙ及びＦ、ＡｌｂｅｒｉｃｉｏによるＵ、　Ｓ、出願連番第０７１５７６．２３３号及びＧ、Ｂａｒａｎｙによる連番第０７１５７６．２３２号中に述べられたハンドルのようなハンドルを含む。なおこれらのすべての教示は、引用によって本明細書中に組み込まれる。適切なハンドルは、アミノ官能化された支持体の上に単一のステップで定量的にカップリングして、ペプチド連鎖組立体のための十分に規定された構造の一般的な出発点を与える。ハンドル保護基は除去され、そしてＮ１保護された第一アミノ酸のＣ末端残基はハンドルに定量的にカップリングされる。一度ハンドルが固相にカップリングされ、そして初期アミノ酸またはペプチドがハンドルに結合されると、一般的な合成サイクルが進行する。この合成サイクルは、一般的に樹脂上のアミノ酸またはペプチドのＮ’−アミノ基の脱保護、洗浄、及び、もし必要ならば、中和ステップ、及びそれに続く次のＮ″保護れたアミノ酸のカルボキシル活性化された形との反応から成る。このサイクルを繰り返して興味のあるペプチドまたは蛋白質を生成させる。官能化された不溶性支持体を使用する固相ペプチド合成方法は、よく知られている。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ、Ａｍ。

ＨＢａｒａｎｙら、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　、３０　：　７０５〜７３９　（１９８７）。

本発明のＰＥＧ誘導体は、合成プロセスの間にペプチド連鎖を形成している反応するアミノ酸から不活性支持体を分離するスペーサーアームとして特に有用である。この隔絶を与えるスペーサーアームの選択は、固相応用における重要なパラメーターである。

本発明の好ましい実施態様においては、約２０００ドルトンの平均分子量を有する種々のＰＥＧスペーサーアームを、ポリスチレン主鎖の上のアミノ官能基と適切なハンドルの結合のための点との間に組み入れた。

生成したグラフト支持体は、はぼ等しい重量のＰＥＧ及びＰＳを含んでいた。これらの支持体は、物理的及び化学的特性例えば膨潤に関してそしてモデルペプチドの合成においてＰＳ支持体を凌ぐ再現性のある利点を示した。本発明のＰＥＧ　−ＰＳ支持体は、すべての反応ステップ及び洗浄のための溶媒としてアセトニトリルを使用してペプチド合成を実施することを可能にする。ＰＳを使用しそして溶媒としてアセトニトリルを用いる対照実験は、結果としてペプチド生成物をもたらさなかった。

もう一つの実施態様においては、困難なアンル担体蛋白質６５−７４デカペプチド配列（ｓ’ｅｑｕｅｎｅｅ）をＦｍｏｃアミノ酸を使用して合成する比較実験を実施した。この新しいＰＥＧ　−ＰＳに関しては、ＰＳ、Ｔｅｎｔａｇｅｌ” （ドイツ、Ｔｕｂ　ｉ　ｎｇｅｎのＲａｐｐ　Ｃ］〕ｅｍ、の商標）またはＰｅｐｓｙｎ　ＫＴＭ（イギリス、ケンブリッジのケンブリッジＲｅ５ｅａｃｈ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、の商標）のいずれに関するよりも高い純度でペプチドが製造された。ＰＥＧ　−ＰＳ材料は、流通式合成及びバッチ操作の両方に高度に適切であることが証明された。

高い流量においてさえ、殆ど無視できる背圧しか見い出されなかった。

ＰＥＧ　−ＰＳグラフト支持体の一般的な有用性は、多数の大きな（例えば、約３０〜６０の残基を有する）複雑なペプチド配列、例えばセクロピン同族体、カルシトニン、β−エンドルフィン、コルチコトロピン放出因子、２つの亜鉛フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）結合配列、及びＨＩＶ−１ｔａｔ蛋白質の数個の部分的配列の合成によって示された。本発明のＰＥＧ　−ＰＳリンカ−の使用から生じた合成効率における改善は、以下のものの１以上から発生するように見える＝　（ｉ）ポリマー主鎖の近くから反応サイトを除去するスペーサーアーム効果；　（ｉｉ）反応速度に対する付随的に好ましい影響を含む樹脂の疎水性性質を改質する一般的な環境上の効果：及び（伍）減少した二次的構造による構造的に困難なカップリングに対する特定の効果（水素結合生成）。

本発明のＰＥＧ誘導体はまた、核酸合成、または不活性支持体と反応ヌクレオチド若しくは核酸との間のスペーサーアーム若しくはリンカ−としての配列において使用することもできる。例えば、前記誘導体は、上で述べたようにポリスチレン樹脂に結合させ、そしてアミダイト媒体ＤＮＡ合成において使用することができる。ＰＥＧ　−ＰＳ樹脂は、アミダイトカップリング法において社媒として使用されるアセトニトリル中で膨潤する。

本発明を以下の実施例によって以下に更に例示する。

実施例実施例１．Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ”’ＥＤ−２００１のビス（マレイル化）誘導体の製造無水マレイン酸−（４，５ｇ、４６ミリモル）を、２５℃でテトシヒドロフラン（９０ｍＬ）中のＪｅｆｆａｍｉｎｅ”’ＥＤ−２００１（３０ｇ、１５ミリモル、３０ミリモルのアミノ官能性）の撹拌された溶液に一度に添加した。５時間後に、真空中での蒸発によって溶媒を除去し、そして生成したオイルを、５分間にわたつて０℃で冷たい撹拌されたエーテル（１００ｍＬ）に添加した。生成した白い懸濁液を、０℃で更に１５分間撹拌し、次に濾過によって収集し、エーテルで完全にリンスし、そして真空中で五酸化リンの上で乾燥した。収量：２８．９ｇ（８８％）。ＮＭＲデータ及び元素分析は、以下に示した予期された構造と一致した：［式中、ａ＋ｂ＝２．５］。

実施例２．Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ”’ＥＤ−２ＱＱｌのビス（クルタリル化）誘導体の製造ジクロロメタン（２００ｍＬ）中のＪｅｆ　ｆａｍｉｎｅ”’ＥＤ−２００１（４０ｇ、２０ミリモル、４０ミリモルのアミノ官能性）及び無水グルタル酸（５，０ｇ、４４ミリモル）の混合物を、２５℃で２時間撹拌した。完全なアシル化を示す陰性のニンヒドリンテスト結果を与えた均一な反応混合物を真空中で濃縮すると粘性のオイルが得られたが、これを４℃でエチルエーテル（３００ｍＬ）を含むビーカー中に激しく撹拌しながら注いだ（ｄｅｃａｎｔｅａ）。急速に生成した沈殿を、収−集し、更に冷たいエーテルで洗浄し、そして真空中で五酸化リンの上で乾燥した。収量＋３８ｇ（８６％）。ＮＭＲデータ及び元素分析は、構造と一致した。

トルエン（５００ｍＬ）中のポリエチレングリコールメチルエーテル（ＭＰＥＧ）　、Ｍ、２０００　（１００ｇ、５０　ミリモル）ｔｖ溶液を、Ｄ（Ｂｎ−３ｔａｒｋ）ラップ付属品によって水を除去しながら、共沸乾燥のために一晩還流した。溶液を、８０’Ｃに冷却し、カリウムｔ　ｅ　ｒ　ｔ。

−ブトキシド（１１，２ｇ、０．１モル）で処理し、そして次にエチルブロモアセテート（１１ｍＬ、Ｑ、１モル）及びトルエン（１０ｍＬ）の混合物を３０分にわたって添加した。反応を９０’Ｃで８時間継続し、それに続いて混合物をロータリーエバポレータ中で濃縮すると、茶色の粘性の溶融物が生成した。ジクロロメタン（５００ｍＬ）を添加してポリマーを抽出し、そして活性アルミナ（２００ｇ）を添加した。３０分後、濾過で有機相を収集し、部分的に濃縮しく〜１００ｍＬに）、エチルエーテル（７００ｍＬ）と合わせ、そして数時間−２０℃ にした。沈殿したポリマーを、濾過によって収集し、空気乾燥し、そして２５℃ で３時間水性水酸４３ｆトリウム（ＩＮ、５００ｍＬ）中に取った。この鹸化反応を、製水性ＨＣＩによるｐＨ３までの酸性化によって終了せしめ、そしてこの生成物をジクロロメタン（３ｘ２５０ｍＬ）中へ抽出した。

有機相を乾燥しくＭｇ５０４）、部分的に濃縮しく〜１００ｍＬに）、エチルエーテル（７００ｍＬ）と合わせ、そして数時間−２０℃にした。

最終生成物を濾過によって収集し、そして数日間Ｐ２Ｏ５の上で真空中で乾燥した。収量ニア５ｇ−（７３％）、カルボキシル基の滴定：理論の　。

９４％、ＮＭＲデータ及び元素分析：構造と一致。

実施例４．ＰＥＧジ酸誘導体をＭＢＨＡ樹脂にカップリングする手順Ｎ、　Ｎ− ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（３０ｍＬ）中の実施例１で製造したＰＥＧジ酸（２６ｇ、１１．８ミリモル、２３．６ミリモルのカルボキシル基）の撹拌された溶液に、ＤＭＦ　（３ｍＬ）中の１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ　；０．８１ｇ、６．０ミリモル）及びＤＭＦ　（８ｍＬ）中のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス〜（ジメチルアミノ）ホスホニウムへキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ；２．６３ｇ、６．０ミリモル）を添加した。ジクロロメタン（５ｍＬ）中のＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ；１．５６ｍＬ、９ミリモル）の溶液を１０分にわたって添加し、そして予備洗浄されたｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）ポリスチレン樹脂支持体（５，０ｇ、０．６ミリモル／ｇ、３．０ミリモルのアミノ基）が入った反応容器に移す前に、生成した溶液を更に１０分間撹拌した。この混合物を、サンプルに関するニンヒドリンテストが殆ど陰性になるまで、２日間振った。未反応アミノ基をアシル化によってキャップし、そして次に支持体を、実施例７中で述べるように、更に処理するためにジクロロメタンで洗浄もだ。

実施例５．ＰＥＧジ酸誘導体のＮｌｅ樹脂へのカップリングのための手順別の実験において、アミノメチルポリスチレン樹脂支持体（０，６８ミリモル／ｇ）を、標準的な手順によってＦｍｏｃ−ノルロイシン（ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）で誘導化した。生成したＦｍｏｃ−Ｎｌｅ　−樹脂（０，２３ｇ、０．５５ミリモル／ｇ、０．１３ミリモル）の一部を、ピペリジ：／−ＤＭＦ（３ニア、ｖ／ｖ）（２＋１０分）で脱保護し、そしてＤＭＦ及びジクロロメタンで洗浄した。一方、実施例２からのＰＥＧジ酸（０，８６ｇ、０．３９ミリモル、０．７８ミリモルのカルボキシル基）　、ＢＯＰ　（８８ｍｇ、０．２ミリモル）及びＨＯＢｔ（２７ｍｇ、０．２ミリモル）を、ＤＭＦ　（４ｍ、Ｌ）中に溶解し、そして次にジクロロメタン（２ｍＬ）中のＤＩＥＡ　（４５μＬ、０．２６ミリモル）の溶液を添加した。２５℃での予備活性化期間の後で、ＰＥＧ溶液を添加して脱保護し、そして樹脂を洗浄し、そして２５℃で５時間カップリングを実施すると、本質的に陰性のニンヒドリンテスト結果が得られた。ジクロロメタン（２ｍＬ）中の無水酢酸（４０μＬ、　０．　４ミリモル）の添加によって３０分間キャッピングを行った。最後のＰＥＧ−ＰＳグラフト支持体（０，４９ｇ）は、元素分析及びアミノ酸分析を基にしてＰＥＧ：ＰＳ：Ｎ１ｅ＝０．５１：０．４５：０．０４から成っていたが、これから、約４０％のＰＥＧ連鎖が橋かけ中に含まれていたことが計算できる。

実施例６．ＰＥＧ−Ｏｒｎ　（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂の製造アミノメチルポリスチレン樹脂支持体（６，０ｇ、０．９５ミリモル／ｇ、５７ミリモル）肴、標準的な手順によってＮ’−Ｆｍｏｃ、Ｎ’−Ｂｏｃ−オルニチンで誘導化した。この樹脂を、膨潤させ、そしてジクロロメタンで洗浄し、ジクロロメタン中の５％ＤＴＥＡで（ＩＸ５ｍｉｎ＋３ｘｌＯｍｉｎ）中和し、そしてジクロロメタンで洗浄した。

Ｏｒｎ誘導体のカップリングを、ＤＭＦ法においてＮ、Ｎ’　−ジイソプロピルカルボジイミド（Ｄ　Ｉ　ＰＣＤ　Ｉ）　／ＨＯＢ　ｔ　（各々３当量、１５分の予備活性化、４０ｍＬの反応容積）によって３時間媒介した。ＤＭＦ及びジクロロメタンによる洗浄が続いた。サンプルに関するニンヒドリンテストは陰性に近かったが、未反応サイトをＤＭＦ　（２０ｍＬ）中の無水酢酸（４，５ｍＬ、　５当量）及びトリエチルアミン（７，０ｍＬ。

５当量）での３０分間のキャッピングによってブロックした。保護された０ｒｎ −ＰＳ樹脂（０，７８ミリモル／ｇ、予期された重量増加に関してバランスを取った理論的なローディングにマツチする）を、ＤＭＦ。

ジクロロメタンで洗浄し、そしてピペリジン−ＤＭＦ　（１：　４、ｖ／ｖ）（２＋１０ｍ１ｎ）によって処理して、Ｎ’Ｆｍｏｃ基を選択的に除去した。ＤＭＦ、ジクロロメタン、２−プロパツール及びＤＭＦ−ジクロロメタン（３ニア、Ｖ　／　Ｖ　）によるさらなる洗浄は、実施例３中で述べたように製造したＭＰＧＥ酸誘導体のカップリングのための樹脂を製造した。ＤＭＦ−ジクロロメタン（３ニア、ｖ／ｖ、７５ｍＬ）中のＭＰＧＥ酸（３７ｇ、１８ミリモル）の溶液を、ＨＯＢｔ　（２，７５ｇ。

１８ミリモル）及びＤＩＰＣＤＩ　（２，８３ｍＬ、１８ミリモル）と１５分間合わせ、そして次にＨ−Ｏｒｎ　（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂に添加した。カップリングを５時間進めたところ、少し陽性のニンヒドリンテスト結果が得られた。１もつと小量のＭＰＧＥ酸誘導体及び活性化剤（９ミリモルのスケーノＤによる第二のカップリング、並びに既に述べた手順によるアシル化が続いた。最後のＭＰＧＥ−Ｏｒｎ　（Ｂｏｃ）−ＰＳ樹脂を、ジクロロメタン、ＤＭＦ、ジクロロメタン及びメタノールで洗浄し、そして真空中でＰ２Ｏ５の上で４８時間乾燥した。

０．３１ミリモル／ｇのローディングを有し、重量でＰＥＧ：ＰＳ：０ｒｎ＝０．５７：０、　３６：０．　０７　（元素分析及びアミノ酸分析を基にして）から成る１６．９ｇの樹脂（理論的な重量増加と良く一致する）が得られた。ＤＭＦ手順においてＢＯＰ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭを活性化及びカップリングのために使用した時にも類似の結果が得られた。

実施例７．末端マレニル基の除去のための手順実施例４中で製造されたＰＥＧ官能化された支持体を、シンターされた漏斗上でトリフルオロエタノールで洗浄し、シラン化された丸底フラスコに移した。トリフルオロエタノール／トリフルオロ酢酸／水（８：に１．５０ｍＬ）の混合物を添加し、そしてこの懸濁液を還流で（オイルバス温度、１００℃）加熱し、そして磁気で２４時間撹拌した。次に、この物質をジクロロメタン、ジクロロメタン中の５％ＤＩＥＡ及びメタノールで洗浄し、そして真空中でＰ２ｏｓ中で乾燥した。アミノ基含量をピクリン酸滴定によるか、またはＦｍｏｃアミノ酸によるローディングによってアリコートに関して測定した。最後のＰＥＧ　−ＰＳはＰＥＧ：ＰＳ＝０．４５：０．５５から成り、モして０，１７ミリモル／ｇのローディング（ＣＨＮ元素分析及びアミノ酸分析を基にして）を有する。この支持体中の約６５％のＰＥＧ連鎖がスペーサーとして作用していて、そして残りが橋かけ中に含まれていることが計算できる。

実施例８．エチレンジアミン添加のための手順実施例５からのＦ！Ｅｃ　−ｐｓ支持体（０，４ｇ、　０．　１２ミリモルの元のＮｌｅサイト）を、初期膨潤のためにジクロロメタンで洗浄し、次にＤＭＦ　（２ｍＬ）中のＤＩＰＣＤＩ　（９４μＬ、０．６ミリモル）及びＨＯＢｔ　（８１ｍｇ、０．６ミリモル）を、５分の予備活性化期間の間に樹脂に添加した。次に、ＤＭＦ　（０，５ｍＬ）中のエチレンジアミン（４０μし、０，６ミリモル）を、５時間の反応の間に樹脂に添加した。ＤＭＦ、ジクロロメタン及びメタノールによる最後の洗浄を行った。樹脂（０，４ｇ；このステップからは重量変化無し）をＰ２Ｏ５の上で真空中で乾燥したが、それに引き続く通常のＦｍｏｃ−Ａｌａによるローディング測定は０．１１ミリモル／ｇの置換レベル及び０．３０のＡｌａ：Ｎｌｅ比（橋かけの程度のより前の推定と一致する）を現した。

実施例９．ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト（ＰＥＧ−ＰＳ）によるバッチ式ペプチド合成５ｇｏ）ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（０，６ミリモル／ｇのローディングを有する）から出発して、実施例４及び７中で設定された手順に従ってＰＥＧ　−ＰＳを製造し、そして８．７ｇのＰＥＧ　−ＰＳ生成物を得た（０．１７ミリモル／ｇのローディング）。このＰＥＧ　−ＰＳの２ｇの部分を、ＢＯＰ＋ＨＯＢｔ手順（Ｄ、Ｈｕｄｓｏｎ。

（１９８７）Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、　、５３　：　６１７〜６２４によって結合された、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ　［５’　−（４’　−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）アミノエチル−３，５−ジメトキシフェノキシ）吉草酸ハンドルによって延長すると、完全に官能化されたニンヒドリン陰性生成物が得られ六。テストペプチド、アシル担体蛋白質６５〜７４を、Ｍｉ　ｌ　１　ｉｇｃ’ ｊｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈモデル９６００ペプチド合成機を使用して、標準的なりＯＰ＋ＨＯＢｔカップリングプログラム（Ｍｉ　ｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）によって合成した。次ぎ次の実験において、Ｐｅｐｓｙｎ　ＫＴ″、通常のポリスチレン及びＴｅｎｔａｇｅｌ？１″支持体をまた、同じ配列を製造するために使用した。生成したペプチドを、アミノ酸分析（ＡＡＡ）　、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法によって分析した。結果は、ＰＥＧ　−ＰＳを使用した合成が優れた純度で最高の収量で生成物を与えたことを示した。

実施例１０．ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト（ＰＥＧ　−ＰＳ）による連続流通ペプチド合成実施例６中で述べたようにして製造したＰＥＧ− Ｏｒｎ　（Ｂｏｃ）−ＰＳをＴＦＡ−ジクロロメタン（１：　１）（５＋２５ｍ１ｎ）　で処理して、Ｎ’−Ｂｏｃ基を選択的に除去した。ジクロロメタンによる洗浄、ジクロロメタン中の５％のＤＩＥＡ及びジクロロメタンによる中和が続いた。実施例９と同様にして、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬハンドルを付け、そしてＤＩＰＣＤＩ＋ＨｏＢｔカップリング手順（領０５Ｍの濃度）に従ってＭｉ１１ｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈモデル９０５０を使用して、挑戦的なデカ−アラニル− バニリン配列を作った。引き続く実験においては、通常のポリスチレン支持体を使用して同じ配列を作った。ＨＰＬＣを基にしてペプチドの純度は、ＰＳを使用した時の５３％と比較して、ＰＥＧ　−ＰＳを使用した時には７７％であった。

ＰＥＧ　ＰＳＦＩＧＵＲＥ　ＩＡＦ工ＧＵＲＥ　ＩＢＦ工ＧＵＲＥ　２＋Ｎ伏国際調査報告ｍ−１−−ＡｅｍＩｔｈ＃ａ　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０６１０３国際調査報告ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０６１０３Ｓ＾　５１３８３フロントページの続き（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　チャック、ジエインアメリカ合衆国イリノイ州６００６１バーノンヒルズ・ヒユーズブレイス８２０（７２）発明者　ザリプスキー、サミュエルアメリカ合衆国ニュージャーシイ州０８５４０プリンストン・ウィンドハムコート２エイ（７２）発明者　ソール、ヌリア・エイアメリカ合衆国ミネソタ州５５４０１ミネアポリス・アパートメントエイ−１１０８・サウスファーストストリート１５

Claims

【特許請求の範囲】

１．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、Ｈ、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれ、Ｘは、ＨまたはＨ２Ｎ−Ｂ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ａ−Ｃ（Ｏ）−であり、Ａ及びＢは、約１０までの炭素原子を有する直鎖のまたは分岐したアルキル基、ＣＨ＝ＣＨ基及び芳香族基から成る群から独立に選ばれ、そしてＳＳは、固体支持体であり、そして式中、アミノ基は、必要に応じてＮ■保護基によって保護される］を有する固相ペプチド合成のための樹脂。
２．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が、独立にＨ、メチル基またはエチル基である、請求の範囲１記載の樹脂。
３．Ａが、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン及びイソブチレンから成る群から選ばれる、請求の範囲１記載の樹脂。
４．一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｙは、必要に応じてＮ■保護基によって保護されることができるジアミノモノカルボン酸であり、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、固体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、そしてＲ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって表される固相ペプチド合成のための樹脂。
５．固体支持体が、アミノ官能性膜、多孔性ガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリジメチルアクリルアミド、綿及び紙から成る群から選ばれる、請求の範囲１から４のいずれか一項に記載の樹脂。
６．ポリスチレンが、アミノポリスチレン、アミノメチルポリスチレン、アミノアシルポリスチレン及びｐ−メチルベンズヒドリルアミンポリスチレンから成る群から選ばれる、請求の範囲１から４のいずれか一項に記載の樹脂。
７．ａ）ポリ（オキシエチレン）コア及びカルボキシル末端基を有する２官能化合物をアミノ官能化された固体支持体に、２官能化合物上のカルボキシル基の１つが固体支持体上のアミノ基と反応するのに十分な条件下でカップリングさせるステップ、及びｂ）アミノ官能性を導入してステップａで生成された樹脂の吊り下がった末端カルボキシル基を置き換えるステップを含む、固相ペプチド合成のための樹脂を製造する方法。
８．２官能化合物が、ポリ（オキシエチレン）ジアミンポリマー上のアミノ基をジカルボン酸（例えば、マレイン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸）または無水物（例えば、無水マレイン酸、無水コハク酸、無水グルタル酸、無水フタル酸）と反応させることによって製造される、請求の範囲７記載の方法。
９．ステップ（ａ）の生成物が、一般式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ｎは、約５〜約１５０の整数であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、Ｈ、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれ、Ｘは、ＯＨ、ハロゲン、または活性エステル若しくはチオエステルの活性化基から成る群から選ばれ、そしてＡは、約１０までの炭素原子を有する直鎖のまたは分岐したアルキル基、ＣＨ＝ＣＨ基及び芳香族基から成る群から選ばれる］によって表される、請求の範囲７または８記載の方法。
１０．ａ）保護されたジアミノモノカルボン酸に結合されたアミノ官能化された固体支持体を供給するステップ、ｂ）２つのＮ■−アミノ部分の１つから保護基を除去するステップ、及びｃ）単官能カルボキシル末端ポリエチレングリコール誘導体を脱保護されたＮ■ −アミノ基にカップリングさせて、それによって樹脂を製造するステップを含む、固相ペプチド合成のための樹脂を製造する方法。
１１．樹脂が、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｙは、必要に応じてＮ■保護基によって保護されることができるジアミノモノカルボン酸でありｎは、約５〜約１５０の整数であり、ＳＳは、固体支持体であり、Ａは、直鎖のまたは分岐したＣ１〜Ｃ１０のアルキル基であり、そしてＲ１、Ｒ２及びＲ３は、水素、アルキル基及びアリール基から成る群から独立に選ばれる］によって表される、請求の範囲１０記載の方法。