JPH06500531A

JPH06500531A - 改良されたキメラ毒素

Info

Publication number: JPH06500531A
Application number: JP3506048A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムズ、ダイアン; ジョン・アール・マーフィー
Original assignee: ボストン・メディカル・センター・コーポレーション
Priority date: 1990-03-02
Filing date: 1991-02-28
Publication date: 1994-01-20
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: US5616482A; ES2155821T5; US5763250A; FI923915A0; DE69132581T2; DK0517829T4; EP0517829A1; GR3036081T3; ATE200493T1; AU661819B2; FI923915A7; CA2076678A1; AU7493191A; EP0517829B1; JP3311346B2; US5863891A; DE69132581D1; WO1991013090A1; DK0517829T3; ES2155821T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１５、請求の範囲第１４項に記載の細胞を培養し、前記の培養細胞または上澄液から前記のキメラ毒素を単離することから成る、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素の製造法。

明　細　書本出願は、１９９０年３月２日出願のＵＳＳＮ第４８８．６０８号の部分係属出願である。

本発明は、組換えＤＮＡ技術を用いてキメラ毒素分子を構成することに関する。

文献には、キメラタンパク質をコードする融合遺伝子の多く例が挙げられている。例えば、ヴイラーカマロフ（ＨＩ　Ｉａ−Ｋａｇ＋ａｒｏｆ　ｆ’）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７５゜３７２７−３７３１　（１９７ｇ）には、非細胞質性細菌遺伝子に融合した真核性構造遺伝子から成る融合遺伝子が記載されている。融合遺伝子は、細胞質から輸送されるキメラタンパクをコードする。マーフィ（Ｍｕｒｐｈｙ）の米国特許第４．６７５，３８２号明細書は、参考として本明細書に引用されるものであるが、これには、組換えＤＮＡ技術を用いて、α−メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）のような細胞特異性リガンドにペプチドを結合を介して結合したジフテリア毒素（ＤＴ）分子の一部から成るハイブリッドまたはキメラタンパク質を生成させることが記載されている。ＤＴ−ＭＳＨキメラ毒素は、特定の標的細胞、すなわちα−ＭＳＨレセプターに陽性のヒトの悪性黒色腫細胞に選択的に毒性を有していた。

ジフテリア毒素に関連した融合タンパク質、ＤＡＢ　〜ＩＬ−２、であって、ＤＴの固有のレセブター結合ドメインがポリペプチドホルモンであるインターロイキン−２（ＩＬ−２）の一部と遺伝学的に置換されたものが、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）らのＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒ４ｎｇ、　１．４９３− ４９８　（１９８７）に記載されており、この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、順にＭｅｔ；ＤＴ残基１〜４８５；および成熟したヒトＩ　Ｌ−２のアミノ酸２〜１３３から成る６８，１４２ダルトンの融合タンパク質である。ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、Ｉ　Ｌ−２レセプターおよび選択的に興奮したリンパ球であって、高い親和性を有する形態のＩ　Ｌ−２レセプターを有するものに結合することが示されている（バッカ（Ｂａｃｈａ）ら、（１９８８）Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６７、６１２−６２２）　、更に、Ｄ　Ａ　Ｂ　４　ｇ　ｅ−Ｉ　Ｌ−２の細胞毒性作用は、固有のジフテリア毒素の細胞毒性作用と同様に、レセプターによって媒介されるエンドサイト−シス、酸性区画室の通過およびフラグメントＡ関連のＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼの標的細胞の細胞質ゾルへの放出を必要とする（バツカ（Ｂａｃｈａ）ら、上記文献）。

発明の要約一般的には、本発明はペプチド結合によって互いに結合したタンパク質フラグメントを有するキメラ毒素を特徴とする。このキメラ毒素は、順に、キメラ毒素のアミノ末端で始まり、（ａ）　ジフテリア毒素の酵素活性を有するフラグメントＡ１（ｂ）　ジフテリア毒素の開裂ドメイン１１に隣接するフラグメントＡを有する第一のフラグメント、（１１，）　ジフテリア毒素のフラグメントＢの疎水性のトランスメンブラン領域の少なくとも一部を有する第二のフラグメントであって、少なくとも５０、更に好ましくは少なくとも８０のジフテリア毒素アミノ酸残基のトランスメンブラン領域に対してＣ末端の欠失をも有し且つドメイン１２を持たないもの、（ｄ）　細胞特異性ポリペプチドリガンド、例えばインターロイキン（好ましくはインターロイキン−２）またはポリペプチドリガンドの結合ドメインの少なくとも一部を有する上皮成長因子（ＥＧＦ）　、の一部であって、酵素活性を有するフラグメントＡによって攻撃される細胞の所定のクラスに選択的にキメラ毒素を結合させるのに有効である部分を有する第三のフラグメント、を含んでいる。

好ましい態様では、キメラ毒素は、類似のＤＡ８４８６含有毒素の毒性より高いレセプター支持細胞に対する毒性（ＤＡＢ　含有毒素は、ＤＡＢ　が前記の（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）に記載されたＤＴのフラグメントと置き代わることを除いて、好ましい態様のキメラ毒素と同一の毒素、すなわち前記の（ｄ）に定義されたフラグメントに融合したＤＡＢ　から成る毒素である）；相似のＤＡＢ　含有毒素のに、よりも低いレセプター（すなわち、（前記の）第三のフラグメントが攻撃される細胞上で結合する部位）に対するＫ　ａ　（すなわち、一層大きな結合親和性）、ＤＡＢ　含有毒素の抗タンパク質付解性より大きなタンパク質分解性；相似のＤＡＢ　含有毒素によって示されるものより大きな、拮抗阻害剤、例えば、前記の（ｄ）のポリペプチド、によるその細胞毒性の耐阻害性；相似のＤＡＢ　含有毒素が同程度のりンバク質合成を阻害するのに要する暴露時間より短い暴露時間によって標的細胞中でのタンパク質合成を所定の程度まで阻害する能力；または相似のＤＡＢ　含有前８Ｂ素において見られるより速やかにタンパク質合成の阻害を開始する能力のうちの少なくとも１つ、更に好ましくは少なくとも２つ、更に一層好ましくは少なくとも３つを有する。

他の好ましい態様には、ジフテリア毒素が疎水性トランスメンブラン領域と生来のジフテリア毒素のアミノ酸残基４８４または４８５との間に何んらのジフテリア毒素配列を持たない、キメラ毒素−生来のジフテリア毒素のアミノ酸残基３８６に対してＣ末端のジフテリア毒素配列を欠くキメラ毒素；および前記に定義された第三のフラグメントに融合したＤＡＢ　を有するキメラ毒素がある。

他の好ましい態様には、ポリペプチドリガンドの部分が、キメラ毒素をＩ　Ｌ− ２レセプター支持細胞、特にＴ細胞に結合させるのに有効なインターロイキン− ２の一部分であるキメラ毒素；ポリペプチドリガンドの部分が、キメラ毒素をＥＧＦレセプターを支持する細胞に結合させるのに有効なＥＧＦの一部分であるキメラ毒素；キメラ毒素ＤＡＢ　−ＩＬ−２，およびキメラ毒素ＤＡＢ　−ＥＧＦがある。

リガンドがＩ　Ｌ−２またはその一部分である他の好ましい態様では、キメラ毒素は、ＤＡＢ　−ＩＬ−２によって示されるより大きなＩ　Ｌ−２レセプター支持細胞に対する毒性、ＤＡＢ　−ＩＬ−２のＫｄよりも低い８ＢＩ　Ｌ−２の高親和性レセプターに対するＫ　またはｄ　ゝＤＡＢ　−ＩＬ−２によって示されるより大きな抗夕ンバク質分解性のうちの少なくとも１つを有する。

リガンドがＥＧＦまたはその一部分である他の好ましい態様では、キメラ毒素は、ＤＡＢ　ＥＧＦによって示されるよりも大きなＥＧＦ−レセプター支持細胞に対する毒性、ＤＡＢ　ＥＧＦのＫｄよりも低いＥＧＦしセブターに対するＫ　、ＤＡＢ　ＥＧＦよりも大きな拮抗阻害剤、例えばＥＧＦ、による耐細胞毒性阻害性；タンパク質合成を同程度まで阻害するのにＤＡＢ４８６ＥＧＦが要する暴露時間より短い暴露時間で所定の程度までＥＧＦレセプター支持細胞でのタンパク質合成を阻害する能力；またはＤＡＢ　ＥＧＦで見られるより速やかにＥＧＦ− レセプター支持細胞でのタンパク質合成の阻害を開始する能力の少なくとも一つを有する。

本発明のキメラ毒素は、キメラ毒素のタンパク質フラグメントをコードする領域を有する融合遺伝子、本発明のキメラ毒素をコードするＤＮＡ配列、これらのＤＮＡ配列をコードする発現ベクター、この発現ベクターによって形質転換された細胞、およびキメラ毒素をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された細胞を培養し、この細胞またはその上澄液からキメラ毒素を単離することから成るキメラ毒素の製造法によって好ましくコードされる。

本明細書に用いられる生来のジフテリア毒素とは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｌｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅによって分泌される５３５アミノ酸のジフテリア毒素タンパク質を意味する。

生来のジフテリア毒素をコードする遺伝子の対立遺伝子の配列は、グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）らの（１９１！３）Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、、　ＵＳＡ、　８０．６８５３−６８５７に見出だすことができ、この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる。本明細書に用いられる酵素活性を有するフラグメントＡとは、生来のＤＴのＧｌｙｌからＡｒｇ１９３までのアミノ酸残基、または天然の配列の酵素活性を有する誘導体または類似体を意味する。本明細書で用いられる開裂ドメイン１１とは、生来のＤＴのＣｙｓ１８６とＣｙｓ２０１の領域範囲ないのプロテアーゼ感受性ドメインを意味する。本明細書において用いられるフラグメントＢとは、生来のＤＴの５ｅｒ１９４から５ｅｒ５３５までの領域を意味する。本明細書において用いられるフラグメントＢの疎水性トランスメンブラン領域とは、完全な膜タンパク質の二層スパンニングヘリックス（ｂｉｌａｙｅｒ−ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｈｅｌｉｃｅｓ）に構造上の類似性を有するアミノ酸配列を意味し、固有のジフテリア毒素のアミノ酸残基３４６からアミノ酸残基３７１までにほぼ位置しておりまたは誘導される。本明細書に用いられるドメイン１２とは、生来のＤＴのＣｙｓ４１６〜とＣｙｓ４７１の領域範囲を意味する。

本明細書に用いられるフラグメントＢの一般化された真核結合部位とは、真核細胞の表面上でのＤＴのその生来のレセプターへの結合に関与する生来のＤＴのＣ末端の５０アミノ酸残基内のの領域を意味する。本発明のキメラ毒素は、フラグメントＢの一般化された真核結合部位を持たない。

本明細書で用いられる毒性を有するまたは細胞毒性を有するとは、細胞中でのタンパク質合成を阻害する、細胞成長または分割を阻害する、または細胞を殺すことができることを意味する。

ＤＡＢ　は、順にメチオニン、および生来のＤＴのアミノ酸残基１〜４８５から成っている。

ＤＡＢ　は、順にメチオニン、生来のＤＴのアミノ酸残基１〜３８６、および生来のＤＴのアミノ酸残基４８４〜４８５から成っている。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、順にメチオニン、生来のＤＴのアミノ酸残基１〜４８５、およびＩ　Ｌ−２のアミノ酸残基２〜１３３から成る融合タンノくり質である。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、これが最初のメチオニン残基を欠くことを除いては、同一である。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、Ｉ　Ｌ−２のアミノ酸残基２〜１３３に融合したＤ　Ａ　Ｂ　ａ　８９から成っている。

ＤＡＢ　ＥＧＦは、ＥＧＦに融合したＤＡＢ３８９から成っている。

レセプターとは、細胞特異性ポリペプチドリガンド（前記の（ｄ）に記載）が結合する部位を意味する。

本発明のキメラ毒素は、下記の利点の一つ以上を示す：相似のＤＡＢ　含有毒素よりも大きな毒性；相似のＤＡＢ　含有毒素よりも大きなレセプターに対する親相性；大腸菌の細胞質で発現するとき相似のＤ　Ａ　Ｂ　４８Ｂ含有毒素が示すよりも大きな抗タンノくり買付解性；相似のＤＡＢ　含有毒素よりも大きな拮抗阻害剤、例えば前記の（ｄ）のポリペプチド、による抗細胞毒性：相似のＤ　Ａ　Ｂ　４８　Ｂ含有毒素がタンパク質合成を同程度まで阻害するのに要する暴露時間よりも短い暴露時間で所定の程度まで標的細胞におけるタンパク質合成を阻害する能力；または相似のＤＡＢ　含有毒素で見られるよりも速やかにタンパク質合成の阻害を開始する能力。

上皮成長因子の異常な発現は、胸部、膀胱、前立腺、肺および神経膠の悪性腫瘍のような悪性腫瘍の特徴である。本発明のキメラ毒素は、ＥＧＦレセプター陽性の腫瘍細胞に対するジフテリア毒素の細胞毒性作用を治療の標的とすることができる。これらのキメラ毒素において、ジフテリア毒素の結合ドメインの配列はヒトＥＧＦの配列によって置き換えられている。これらのキメラ毒素は、ジフテリア毒素と同じ機構によってタンパク質合成を阻害し、ＥＧＦレセプターを高い水準で発現するヒト腫瘍細胞に特異的に細胞毒性を有する。これらのキメラ毒素の吸収は、ＥＧＦレセプターの発現によって特徴付けられる悪性腫瘍の治療のための強力な治療薬としてこの分子を使用することができる速度論で起こる。

本発明の他の特徴および利点は、好ましい態様の下記の説明および請求の範囲から明らかになるであろう。

好ましい態様の説明まず、図面について簡単に説明する。

Δ厘第１図は、ＤＴ分子および各種の融合タンパク質の略図である。

第２図は、好ましい態様のプラスミドの構成を表わしたものである。

第３図は、各種のキメラ毒素をコードするＤＮＡ配列の制限地図である。

第４図は、培養細胞に対するキメラ毒素の投与量の変化の効果のグラフである。

第５図は、高親和性のＩ　Ｌ−２レセプターから［Ｉ］で標識したＩ　Ｌ−２を拮抗的に置換するキメラ毒素の能力をグラフに表わしたものである。

第６図は、合成ＥＧＦ遺伝子の配列である。

第７図は、ＤＡＢ　ＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦを模式的に表わしたものである。

第８図は、ＤＡＢ　ＥＧＦの細胞毒性に対する８ＧＥＧＦの影響を示すグラフである。

第９図は、ＤＡＢ　ＥＧＦの細胞毒性に対するＥＧＦの影響を示すグラフである。

第１０図は、Ａ４３１細胞のＥＧＦ結合能力に対するＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦの影響を示すグラフである。

第１１図は、ＥＧＦレセプターから［Ｉ］ＥＧＦを置換するＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦの効果を示すグラフである。

第１２図は、タンパク質合成の阻害に対するＤＡＢ　ＥＧＦへの暴露の長さの影響をグラフに表わしたものである。

第１３図は、タンパク質合成の阻害に対するＤＡＢ　ＥＧＦへの暴露の長さの影響をグラフに表わしたものである。

第１４図は、ＤＡＢ　ＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦと共に培養した細胞についてのタンパク質合成の阻害の速度論のグラフである。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、Ｍｅｔとそれに続くＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３に融合した成熟ＤＴのアミノ酸残基１〜４８５から成るキメラ毒素である。キメラ毒素ＤＡＢ　−ＩＬ−２のＤＴ部分は、ＤＴフラグメントＡの総てと、成熟した生来のＤＴの残基４８５にまでのびるＤＴフラグメントＢの部分とを包含している。

したがって、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、ジスルフィド橋梁結合Ｃｙｓ４６１とＣｙｓ４７１を越えて伸びている。

ＤＴの構造については、第１ａ図を参照されたい。（■Ｌ−２−毒素について採用された名称はＤ　Ａ　８４８Ｂ−Ｉ　Ｌ−２であり、Ｄはジフテリア毒素を表わし、ＡおよびＢはこれらのフラグメントについての野生型配列を表わし、ＩＬ −２はヒトインターロイキン−２の配列を表わしている。突然変異体の対立遺伝子はＤＡＢの後ろの括弧内に数字で示している。この数字表現は、融合タンバク質におけるＤＴに関連したアミノ酸の数を示している。ｔｒｃプロモーターからの発現およびｔｏｘシグナル配列の欠失により、Ｎ末端にメチオニン残基が付加するので、ＤＡＢ−Ｉ　Ｌ−２毒素の番号は生来のジフテリア毒素の番号を有する相から＋１である。）ＤＡＢ　−ＩＬ−２を有するｐＤＶ２４は、次のようにして構築した。ｐＵｃ１８　（二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）　）を、ＰｓｔＩおよびＢｇｌｌで消化して、複製の大腸菌起源、ポリリンカー領域およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（ａｍｐ γ）の３′部分を有するＰｓｔＩ−ＢｇｌＩフラグメントを回収した。プラスミドｐＫＫ−２３３−２（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）　）を、ＰｓｔｌおよびＢｇｌＩで消化して、２種類の転写ターミネータ−およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の５′部分を有するＰｓｔＩ−ＢｇｌＩフラグメントを回収した。ｐＤＷ２２は、これらの２つの回収したフラグメントを互いに連結することによって構築した。

ｐＤＷ２３は、プラスミドｐＤＷ１５からヒトＩＬ−２をコードするＢａｍＨＩ −Ｓａ　ｌ　Ｉフラグメントを単離しくウィリアムス（Ｖｊｌｌｉａｍｓ）ら、（１９８８）　ＮｕｃｌｅｉＣＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１８．１０４５３−１０４６７）　、これをＢａｍＨＩ／５ａｌＩで消化したｐＤＷ２２　（前記）に連結することによって構築した。

ｐＤＷ２４は、次のようにして構築した。ｔｒｃプロモーターと翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有するＢａｍＨＩ−Ｎｃｏｌフラグメントを、プラスミドｐＫＫ２３３−２（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｌａ）　）から単離した。ＤＴのアミノ酸残基１〜４８５をコードするＤＮＡ配列を、ｐＡＢｃ５０８をｓｐｈ　ＩおよびＨａｅｌｌで消化しくウィリアムス（Ｖｌ　１１　ｊａｍｓ）ら、（１９８７）　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｉｎｇ、　１．４９３−４９８　）　、Ｄ　Ｔのアミノ酸残基１〜４８５をコードする配列を含むＨａｅＩＩ−５ｐｈＩフラグメントを回収することによって得た。Ｎｃｏｌ／ＨａｅＩＩリンカ− （５°ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ３’　）をＨａｅＩＩ−ＳｐｈＩフラグメントに連結し、この構築物を予め単離したｔｒｃプロモーターを有するＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩフラグメントに連結した。これにより、ｔｒｃプロモーター、（ＭｅｔのＡＴＧ開始コドンを供給する）ＮｃｏＩ部位および生来のＤＴの残基１〜４８５をコードする配列をこの順序で有するＢａｍＨＩ−８ｐｈＩフラグメントが得られる。このフラグメントをＢａｍＨＩとｓｐｈ　Ｉで消化しておいたｐＤＷ２３に挿入した。生成するプラスミドをｐＤＷ２４と名付けた。ｐＤＷ２４によってコードされる融合タンパク質（Ｄ　Ａ　８４８８−ＩＬ−２）はｔｒｃプロモーターから発現し、Ｍｅｔとそれに続くヒトＩ　Ｌ−２のアミノ酸２〜１３３に融合した成熟ＤＴのアミノ酸１〜４８５とから成っている。

ＤＴの配列は、前記グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）らの文献（１９８３年）に記載されている。このＩＬ−２をコードする配列は、ウィリアムス（Ｗｉ　ｌ　Ｉ　ｉａｍｓ）ら、（１９Ｈ）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１６．１０４５３−１０４６７に記載されている方法によってアプライド・バイオシステムス・ディーエヌエイーシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤＮＡ−Ｓｙｎｔｈｅｓ　１ｚｅｒ）で合成した。この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる。Ｉ　Ｌ−２の配列は、ウィリアムス（Ｗｌｌ　ｌ　ｉａｍｓ）ら、（１９８８）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１６゜１０４５３−１０４８７１こＳ己載されている。オリゴヌクレオチドリンカーを用いる成熟ＤＴをコードする配列のＡＴＧへの融合は、ビシャイ（Ｂｊｓｈａｉ）ら、（１９８７）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、、　１８９゜５１４０−５１５１に記載されており、この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる。

ｐＤＷ２４を第２図に示す。ＤＡＢ　−ＩＬ−２に対応するインサートを太線で示している。第２図においては、黒塗りの円は、ＮｃｏＩ部位を示し、白い円はＮ５ｉ１部位を示し、白塗りの菱形はＣｌａＩ部位を示し、黒塗りの四角はＨｐａ１１部位を示し、白塗りの四角はｓｐｈ　１部位を示し、黒塗りの三角は５ａｌＩ部位を示している。

オリゴヌクレオチドおよび核酸は、次のようにして操作した。オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムス・３８０Ａ・ディーエヌエイーシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅａ＋ｓ　３ｇ０Ａ　ＤＮＡ−８ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）　（アプライドやバイオシステムス・インコーポレーテド（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅＩＩｌｓ　Ｉｎｃ、）　、フォスター・シティ− 、カリフオリニア）上でシアノエチルホスホルアミダイト化学を用いて合成した。合成に続いて、オリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド・ピューリフィケイション・カートリッジ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）（アプライド・バイオシステムス・インコーポレーテド（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、）　、フォスター・シティ−、カリフォリニア）上で、製造業者の指示にしたがって、クロマトグラフィによって精製した。精製したオリゴヌクレオチドを、ＴＥ緩衝液（１０＋ｇＭ）リス塩基、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に再懸濁した。相補性鎖をアニールするため、それぞれの鎖の等モル濃度を１００ｍＭＮａＣ１の存在にて混合し、９０℃で１０分間加熱し、ゆっくりと室温まで冷却した。

プラスミドＤＮＡは、アウセベル（Ａｕｓｅｂｅｌ）らの、カレント・プロトコールス・イン中モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィーリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）、ニューヨーク（１９８９年）のアルカリリーシス／塩化セシウム勾配法によって精製した。ＤＮＡを、製造業者にュー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）　、ビバリー、マサチューセッツ、およびベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ガイテンスブルグ、メリーランド）が勧める方法にしたがって、制限エンドヌクレアーゼを用いて消化した。プラスミドを構築するための制限フラグメントを、アガロース−ＴＨＥゲルから抽出し、（オリゴヌクレオチドリンカーを用いてまたは用いることなく）互いに連結し、標準的方法を用いて大腸菌を形質転換するのに用いた［アウセベル（Ａｕｓｅｂｅｌ）ら（１９８９年）、上記文献、およびマニアチス（Ｍａｎｉａｔｔｓ）ら（１９８２年）モレキュラー◆クローニング・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、Ｄ−ルド・スプリングｍ　／％−バー、ニューヨークコ。プラスミドＤＮＡは、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、（１９８７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、、　ＵＳＡ、　７４゜５４６３−５４８７のチェインターミネータ−法のクラフト（Ｋｒａｒｔ）らの変法（（１９８７）　Ｂｌｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　６．５４４−５４７　）にしたがってシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　（ユナイテドーステーツーバイオケミカルス（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｅａｆｓ）、クリーブランド、オハイオ）を用いて配列決定した。

改良されたジフテリア−Ｉ　Ｌ−２キメラ毒素の構造キメラ毒素の発現および精製は次のようにして行った。

本明細書に用いる総てのＤＴに関連するＩ　Ｌ−２融合タンパク質は、ｔｒｃプロモーター由来の大腸菌株ＪＭＩＯＩの細胞質中で発現させた（アマン（Ａｍａｎｎ）ら、（１９８５）　Ｇｅｎｅ、　４０．１８３−１９０、この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる）。組換え大腸菌を、ミクロゲン−７７− メンター（Ｍｉｃｒｏｇｅｎ　Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ　）　（二ニーｅフランスウィックφサイエンティフィク（Ｎｅｖ　Ｂｒｕｎｓ−ｖｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、エジソン、ニューシャーシー）中で、１０Ｂ／ｍｌのカザミノ酸（ディフコ（Ｄｉｆ’ｃｏ）　、デトロイト、ミシガン）、５０μｍ／ｍｌのアンピシリンおよび。。

５ｎｇ／ｍｌのチミンを補足したＭ９最少培地（マニアチス（Ｍａｎｌａｔｉｓ）ら、（１９８２）、上記文献）１０リツトルの容量中で成長させた。細菌の培養物を３０”Ｃで成長させ、５リットル／分の空気を流した。培養物の吸光度（Ａ５゜。

ｔＶ）が０．３に達したとき、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加してキメラｔｏｘ遺伝子の発現を誘導した。誘導がら２時間後に、細菌を遠心分離によッテ回収し、緩衝液＃１０１１０１（５０Ｈ２Ｐ　０４．１０ｓＭＥＤＴＡ、７５０ｍＭＮａＣ１゜０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　２　ＯＳｐ　Ｈ８、０）中に再懸濁し、超音波処理によってリーシスした。全細胞と残骸を２７，０００Ｘｇで遠心分離して除去した後、透明になった抽出液をフィルター滅菌し、抗ジフテリア毒素イムノアフィニティ力ラムに適用した。結合したタンパク質を４Ｍグアニジン塩酸塩で溶出し、β−メルカプトエタノールを添加して１％まで希釈した後、７．５×６００ｎＩＩＧ４００ＯＰＷカラム（トーソハース（Ｔｏｓｏ−Ｈａｓｓ）　）上で高圧液体クロマトグラフィによってサイズを決定した。使用前に、融合毒素をＨＥＰＥＳで緩衝したバンクのバランスした塩溶液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）、ｐＨ７，４に対して十分に透析した。精製したジフテリア毒素は、リスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（キャンベル・カリフォルニア）から購入した。毒性のないＣＲＭｌｏｏＩを製造するため、２−リットル三角フラスコ中てＣ７（βｔｏｘ−１００１）をｃ−ｙ培地（ラブオリ（Ｒａｐｐｕｏｌｉ）ら、（１９８３）　Ｊ、　Ｂａｃｔ、＋　１５３．１２０１−１２１０　）　１００ｍｌの容量で３５℃で２０時間振盪（２４Ｏｒｐｍ）Ｌながら培養した。細菌を、２０．０００Ｘｇで１５分間遠心分離することによって取り出した。ＣＲＭｌｏｏｌは、ＮＨ４ＳＯ４を７０％の飽和度まで添加することによって培養疫から沈澱させ、遠心分離により集めた。１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，２に対して透析を行った後、ＣＲＭｌｏｏＩをバラペンハイ？　−（Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ）ら（１９７２）、　Ｉｇｉｕｎｏｃｈｅｍ、、　９．　Ｈｌ−９０６により前に記載されている方法にしたがってＤＥ−５２上でイオン交換クロマトグラフィによって精製した。総ての精製したタンパク質の濃度は、ピアス・プロティン・アッセイ（ＰｉｅｒｃｅＰｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ）試薬（ピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　、ｏ　ツクフォード・イリノイ）を用いて測定した。

ＤＡＢ　（１００１）　−ＩＬ−２は、ＤＡＢ（１００１）　−１Ｌ−２におけるＣｙｓ４６２とＣｙｓ４７２との間のジスルフィド橋梁が開裂していること以外は、ＤＡＢ　−ＩＬ−２と同一のキメラ毒素である。ＤＡＢ　（１００１）　 −１Ｌ−２は、（ＤＡＢ　−ＩＬ−２を有する）プラスミドｐＤＷ２４のＤＴのフラグメントＢのほとんどをコードする５８７塩基対（ｂ　ｐ）のＣ１ａＩ−ＳｐｈＩ制限フラグメントをＤＴのＴＯＸ−１００１突然変異体対立遺伝子をコードするＤＮＡ由来の相似フラグメントで置き換えることによって構築した。ＴＯＸ−１００１は、毒性のないジフテリア毒素に関連したタンパク質ＣＲＭ１００１をコードし、Ｃｙｓ４７１をＴｙｒ４７１に変化させる単一点突然変異から生じることが示されている（イン・プロティンψカーボハイドレート・インタラクション・イン・バイオロジカル・システムス（Ｉｎ　Ｐｒｏｔｅ−ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　１ｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、アカデミツク・プレス・インコーポレーテド（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）　、ｏンドンー２９５〜２９６頁、この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる）。第３図は、ＤＡＢ　−ＩＬ−２をコードするＤＮＡおよびＤＡＢ　−ＩＬ−２によってコードされる対応する融合タンパク質の制限地図を示している。（第３図において、Ｎ５ｉＩとＨｐａｌｌルミｌｌ制限エンドヌクレアーゼの点刻した箱形は膜に関連するドメインをコードするジフテリア毒素フラグメントＢに関連した配列を表わしている。両親媒性ドメインはＮ５ｉｌとＣｌａＩ部位の間でコードされ、膜スパンニングドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｐａｎｎｉｎｇ　ｄｏｍａｉｎｓ）　と考えられるものはＣ１ａｌとＨｐａＩＩ部位の間でコードされる。斜線を入れた箱形は、内部のイン −フレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）欠失突然変異の相対的位置を示している。）Ｃｙｓ４７２のＴｙｒ４７２への突然変異を有するキメラ毒素をコードするｐＤＷ２６の構築を、第２図に示す。連結および形質転換の後に、遺伝子融合ＤＡＢ　（１００１）　４８６−ＩＬ−２のｔｏｘ−１００１部分のＤＮＡ配列を決定して、Ｃｙｓ４７１のＴｙｒ４７１への突然変異がリフローンされるようにした。

大腸菌（ｐＤＷ２６）をＭ９最少培地で培養し、細胞を集めて、溶菌、ＤＡＢ（１００１）　−ＩＬ−２と命名された融合毒素を、イムノアフイニテイクロマトグラフイおよびＨＰＬＣによって精製した。

高親和性Ｉ　Ｌ−２レセプターを支持するＨＴ　１０２／６ＴＧ細胞による［１４ｃ３−ロイシンの取り込みをブロックする、ＤＡＢ　−ＩＬ−２、ＣＲＭｌｏｏＩおよびＤＡＢ　（１００１）　−１Ｌ−２の投与応答容量を測定した。予想したように、ＤＡＢ　−ＩＬ−２はこれらの細胞に対して毒性が高いが（ＩＣ５ｏ−４Ｘ１０　Ｍ）　、ＣＲＭｌｏｏＩは毒性を持たなかった。

しかしながらＣＲＭｌｏｏｌとは対照的に、Ｃｙｓ４７２のＴｙ　ｒ４７２への突然変異を有する融合毒素であるＤＡＢ　（１００１）　−１Ｌ−２は野生型のＤＡ８４８６−　Ｉ　Ｌ−２と同様にＨＵＴｌ　０２／６ＴＧ細胞に対して毒性を有した。これらの結果は、フラグメントＢのジスルフィド結合が融合毒素の生物活性には必要とされないことを示している。

ＨＵＴ１０２／６ＴＧの細胞毒性のアッセイは、次のようにして行った。培養したＨＵＴｌ　０２／６ＴＧ細胞をＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　、グランド・アイランドφニューヨーク）にそれぞれ１０％ウシ胎児血清（セレクト（Ｃｅｌｌｅｃｔ）　、ギブコ（ＧＩＢＣＯ）　）　、２ｇＭグルタミン、およびペニシリンとストレプトマイシンを５０ＩＵおよび５０μｇ／ｍｌまで補足したものに保持した。細胞毒性のアッセイには、９６穴のＶ型底プレート（リンブローフロー・ラボラトリーズ（Ｌｉｎｂｒｏ−ＰｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、マツクレーン、ヴアージニア）に、完全培地中ウェル当たり５Ｘ１０４個の濃度で細胞を播種した。毒素または毒素関連物質を様々な濃度（１０− １２Ｍ〜１０　Ｍ）で加え、培養物を３７℃で５％ＣＯ２雰囲気中で１８時間インキュベーションした。インキュベーションの後、プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心分離し、培養液を除いて、１，０μＣｉ／ｍｌの［１４Ｃ］−ロイシン（二ニー・イングランド・ニューフレア（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　、ボストン、マサチューセッツ）を含む２００μｌのロイシン不含培地（ＭＥＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）に置き換えた。更に３７℃で９０分間後に、プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心分離し、培養液を取り除き、細胞に４Ｍ　ＫＯＨを加えて溶菌した。１０％トリクロロ酢酸を加えてタンパク質を沈澱させ、不溶性物質ヲ細胞ハーベスタ−（スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ）　、スターリング、ヴアージニア）を用いてガラス繊維フィルター上に集めた。フィルターを洗浄し、乾燥して、標準的な方法によって計数した。培地のみで培養した細胞数をコントラストとして用いた。総てのアッセイは、４回行った。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２の細胞毒性作用には、Ｃｙｓ４６２−Ｃｙｓ４７２の間のジスルフィド結合は必要でないので、細胞質ゾルにフラグメントＡを放出するのにどのＤＴフラグメントＢ配列が必須であるかを決定することは興味あることであった。数個のイン−フレーム欠失突然変異体をＤＡＢ　−ＩＬ−２のフラグメントＢコード部に導入した（第１ｂ、２および３図）。

第１ｂ図は、ＤＡＢ　−ＩＬ−２およびＤ　Ａ　Ｂ　４ｇ　ｅ−Ｉ　Ｌ−２から誘導される各種の突然変異体の構造を示している。第１ｂ図において、幅広の線は融合タンパク質を示しており、狭い繋がっている線は欠失を表わし、線の上の数はＤＡＢの命名におけるアミノ酸残基数であり、線の下の数は生来のＤＴのアミノ酸残基の数に対応している。交差線は両親媒性領域を表わし、黒くなった部分はトランスメンブラン領域に対応し、ＩＬ−２−２−１３３はＩ　Ｌ−２のアミノ酸残基２〜１３３を示し、Ａｌａはアラニン、Ａｓｎはアスパラギン、Ａｓｐアスパラギン酸、Ｃｙｓはシスティン、Ｇｌｙはグリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、工ｌｅはイソロイシン、Ｍｅｔはメチオニン、ＴｈｒはスレオニンＴｙｒはチロシンであり、Ｖａｌはバリンである。

第一の突然変異体ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、ｐＤＷ２４から３０９ｂｐのＨｐａｌ　ｌ−５ｐｈＩ制限フラグメントを取り除き、これをオリゴヌクレオチドリンカー２６１／２７４　（第１表）で置き換えて、プラスミドｐＤＷ２７（第１図）を生成させることによって構築した。このリンカ−はＰｒｏ３８３からＴｈｒ３８７間でのフラグメントＢ配列を保存し、この位置でＩＬ−２配列へのイン−フレーム融合を行うことができる。したがって、ＤＡＢ　−ＩＬ−２では、Ｔｈ　ｒ　３８７とＨｉｓ４８５との間の９７個のアミノ酸が欠失している。

第１表：オリゴヌクレオチドリンカー構築物　オリゴヌクレオチド　リンカ−同定数ＤＡＢ３８９−ＩＬ−２２７４’　５°−ＣＧ　ＧＧＴ　ＣＡＣＡＡＡ肛ＣＡＴ　Ｇ−３’２６１　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ｍ　Ｔｃｃ１／２　ｈｐａｌｌ　１／２５ｐｈｌＤＡＪ３２９５−ＩＬ−２２９２５°−ＣＧＡＴ　ＧＧＴ刑ＣＡＴ　Ｇ−３゜２９３　ＴＡ　ＣＣＡ　ＣＡＣ１／２　Ｃ１ａｌ　ｌ／２５ｐｈｌＤＡＢ　（Δ２０５−　３３７　５’−ＴＡ　ＡＡＴ　ＡＴ−３゜２１１９）４８６−ＩＬ−２３３８ＡＣＧ　ＴＡＴ　ＴｒＡ　ＴＡＧ　Ｃ１／２　Ｎ５ｉｌ　１／２　Ｃ１ａｌＤＡＢ（Δ２０５−　３３７　同上同様にして、１９１アミノ酸のイン−フレーム欠失は、ｐＤＷ２４からＣｏａｌ −５ｐｈＩ制限フラグメントを取り除き、これを２９２／２９　Ｂオリゴヌクレオチドリンカー（第１表）で置き換えて、ＤＡＢ　−ＩＬ−２をコードするプラスミドｐＤＷ２８を形成させることによって構築した。この場合には、イン−フレーム欠失はランボット（Ｌａｍｂｏｔｔｅ）ら、（１９８０）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　８７゜８３７−８４０によって真核細胞の細胞質ゾルへのフラグメントＡの放出において働いていることが予言された推定上の膜スパンニングヘリックスを包含している。

精製されたＤＡＢ　−ＩＬ−２およびＤ　Ａ　Ｂ　２９．−Ｉ　Ｌ−２は、電気泳動での移動度がそれぞれ５７　ｋＤａおよび４７　ｋＤａであった。ＨＵＴ１０２／６ＴＧについての投与量応答分析を、第４図に示す。第４図において、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は黒塗りの四角で示しており、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は黒塗りの円で示しており、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は白塗りの円で示し、ＤＡＢ　（Δ２０５ −２８９）　−ＩＬ−２（下記を参照されたい）は白塗りの四角で示され、ＤＡＢ　（Δ２０５−２８９）　−１Ｌ−２（下記を参照されたい）は白塗りの三角で示しである。Ｄ　Ａ　Ｂ　４　ｇ　ｅ−Ｉ　Ｌ−２およびＤＡＢ　−ＩＬ −２のＩｃ５ｏは、それぞれ約４Ｘ１０　ＭおよびｌＸ１０　Ｍであった。

これとは極めて対照的に、ＤＡＢ　−ＩＬ−２のＩＣは、約１，０００倍低かった（４　Ｘ　１０−７Ｍ　）。

これらの結果は、Ｔｈ　ｒ　３８７とＨｉｓ４８６との間のフラグメントＢ配列がフラグメントＡの細胞質ゾルへの放出に主要な役割を果していないことを示唆している。

一方、５ｅｒ２９２とＴｈｒ３８７との間の配列は、フラグメントＡの効率的な放出に必須である。

意外なことには、ＤＡＢ　−ＩＬ−２はＤ　Ａ　Ｂ　４８　ｅ−　Ｉ　Ｌ−２より遥かに大きな活性を有していた。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、生来のＤＴ残基３８７〜４８３を欠き、高い毒性作用を有するか、はぼ生来のＤＴ残基３４６および３７１の間に位置している疎水性のトランスメンブランセグメントをそのままにしている。

トランスメンブラン領域の特性決定については、参考として本明細書の開示の一部とされるランボット（Ｌａｌｌｂｏｔｔｅ）ら、（１９８０）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　８７．８３７−８４０を参照されたい。生来のＤＴ残基２９１〜４８１を取り除いており、毒性が極めて低下させられている、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、トランスメンブラン領域（３４６〜３７１）を欠いている。

ＨＵＴｌ　０２／６ＴＧ細胞に対するＤＡＢ　−ＩＬ−２の効力が低い理由が、高親和性Ｉ　Ｌ−２レセプターへの結合が変化していることに関連しているという可能性を除外するため、［１２５１］　−ｒ　Ｉ　Ｌ−２を用いて一連の拮抗置換実験を行った。第５図は、高親和性ＩＬ−２レセプターから［Ｉ］で標識したＩ　Ｌ−２の黒塗りの丸で表わした標識されていないｒｌＬ−２よる拮抗置換を示しており、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は白塗りの三角で表わしており、ＤＡＢ３８９−　Ｉ　Ｌ−２は黒塗りの四角で示し、ＤＡＢ　−ＩＬ−２は黒塗りの三角で示し、ＤＡＢ　（Δ２０５−２８９）　−ＩＬ−２（下記を参照されたい）は白丸で示し、ＤＡＢ　（Δ２０５−２８９）３８９−ＩＬ−２（下記を参照されたい）は、白塗りの四角で表わしている。ＣＩ］　−ＩＬ−２の濃度は１０ｐＨであり、比活性は約０．７μＣｉ／ｐＨであった。第２表に示されるように、ＤＡＢ　−ＩＬ−２およびＤＡＢ　−ＩＬ−２はいずれも見掛けのＫｄがＤＡＢ　− ＩＬ−２のものよりも約３分の１であった（Ｋ　−８ｘｌＯＭ対Ｋｄ−２，５Ｘ１０　Ｍ）。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２およびＤＡＢ　−ＩＬ−２はいずれも、ＤＡＢ　−ＩＬ−２よりも高親和性Ｉ　Ｌ−２レセプターへの結合性が高いことを拮抗置換実験が示していることは特に重要である（Ｋｄ−８Ｘ１０　および８．４Ｘ１０　Ｍ対Ｋｄ−２，５Ｘ１０　Ｍ）。これらの結果は、質量がより小さい毒素族（ｔｏｘｏｐｈｏｒｅｓ）へのＩＬ−２配列の融合は一層好ましいレセプターの相互作用のためのＩ　Ｌ−２結合ドメインを配置する役割を果たしている。

ＤＡＢ　−ＩＬ−２は、ＤＡＢ　−ＩＬ−２よりも強く高親和性Ｉ　Ｌ−２レセプターに結合するがその細胞毒性は少なくとも１，０００分の１である（第４図）ことに留意することは興味深い。これらの結果は、標的レセプターに対する強い結合は、それ自体はＤＴに関連するＩ　Ｌ−２融合毒素に生物活性にとって重要ではなく、５ｅｒ２９２とＴｈｒ３８７との間のフラグメントＢ配列が中毒過程における後レセプター結合（ｐｏｓｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇ）という事象にとって必須であることを示唆している。

第２表：ｒＩＬ−２およびＤＡＢ−Ｉ　Ｌ−２関連の融合タンパク質のＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞上で高親和性ＩＬ−２リセブターから［１２５１］−ｒｌＬ− ２を置換する相対的能力ｒＩＬ−２およびＤＡＢ−Ｉ　Ｌ−２融合毒素による［１］−ｒＩＬ−２の拮抗置換は、次の通りに行った。放射能標識したＩ　Ｌ−２結合性分析は、本質的にワング（Ｗａｎｇ）ら、（１９８７）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６６、１０５５−１０６９が記載した方法によって行った。細胞を集めて、細胞培養液で洗浄した。ＨＵＴｌ　０２／６ＴＧ細胞を、未標識のｒｌＬ−２またはＤＡＢ −Ｉ　Ｌ−２融合毒素の増加濃度の存在または非存在下にて［１］−ｒｌＬ−２（０，７μＣｉ／ｐＨ）を用いて、５Ｘ１０６／ｉｔの濃度に再懸濁し、３７℃ で５％ＣＯ２雰囲気で３０分間インキュベージタンした。次に、この反応物を、８０％の５５０流体（アキュメトリック・インコーボレーテド（Ａｃｃｕｍｅｔｒｉｃ　Ｉｎｃ、）　、エリザベスタウン、ケンタラキー）＝２０％パラフィン油（ｄ　−１，０３ｇ／ｍり　０）混合物上に重ね合わせて、微量遠心分離を行った。それぞれの試料の水性相とベレットは、それぞれ遊離および結合したリガンドを表わしているが、これをニューフレアー・シカゴ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｈｉｃａｇｏ）ガンマ−カウンターで計数した。見掛けの解離定数Ｋ　は、レセプターに結合するｄ′ 放射指標３ｒｌＬ−２の５０％を置換するのに要する未標識リガンドの濃度からめた。

両親媒性領域（ＤＡＢ　−ＩＬ−２におけるアミノ８Ｂ酸２１０〜２５２）が、中毒過程において役割を果たしているという仮定を試験するために、（ＤＡＢ　（Δ２０５−２８９）　−ＩＬ−２を含む）ｐＤＷ３０および（Δ２０５−２８９）　−１Ｌ−２を含む）ｐＤＷ３１（第２図および第３図、第１表）を形成するためのｐＤＷ２４およびｐＤＷ２７の両方からのＮ５ｉＩからＣ１ａＩまでの領域をコードする８５アミノ酸のイン−フレーム欠失を構築した。連結および形質転換の後に、ＤＡＢ−Ｉ　Ｌ−２に関連する融合タンパク質を、前記と同様にして発現させ、精製した。第４図に示されるように、両親媒性領域を含むフラグメントＢ配列の欠失することにより、イン・ビトロでの高親和性ＩＬ −２レセプター陽性の細胞に対する細胞毒性は顕著に喪失する。ＤＡＢ　（Δ２０５− ２８９）　−Ｉ　Ｌ−２はＤＡＢ　−ＩＬ−２とはとんど同様に高親和性レセプターから放射能標識したＩＬ−２を置換するが、ＤＡＢ　（Δ２０５−２８９）　４８６−ＩＬ−２はこのレセプターに４分の１の強さで結合する（第５図）ことに留意することは興味あることである。

タンパク質分解性分解に対する耐性の増加ＤＡＢ　−ＩＬ−２によってコードされるキメラ毒素は、ＤＡ８４８６−　Ｉ　Ｌ−２によってコードされるキメラ毒素よりもタンパク質分解性分解に対する耐性が大きい。ＤＡＢ　−ＩＬ−２ハイブリツド毒素を前記のように精製し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析すると、このハイブリッド毒素は（完全なキメラ毒素よりも小さなサイズのバンドが相対的に存在しないことから明らかなように）、極めてわずかな分解生成物しか生成しない。一方、精製したＤＡＢ　−ＩＬ−２は、完全なキメラ毒素よりも低分子量の多数の濃いバンドを生じる。これらの低分子量のバンドは、抗−ＤＡＢ４８．−Ｉ　Ｌ−２抗体と反応することから、それらは分解生成物であるという結論が支持される。

ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）は、１２％ゲルおよびミニ−プロティンＩＩ（旧ｎ１−Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＩ）ゲル装置（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、レムリ（Ｌａｅｍｓ＋ｌｉ）　、Ｎａｔｕｒｅ。

２２７、６８０−６８５　（１９７０）の方法にしたかって行った。タンパク質を１２，５％トリクロロ酢酸で５分間固定し、ディーザル法（（Ｄｉｅｚａｌ）ら、（１９７２）＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｃｖ、。

４８、６１７−６２４　）によってコマジ・ブリリアント・ブルーで染色した。

ＤＴ−ＥＧＦキメラ毒素をコードする融合遺伝子の構築ＤＡＢ　ＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦは、当業者に知られている方法によってＤＡＢ　−ＩＬ−２およびＤ　Ａ　Ｂ　３ｇ。−Ｉ　Ｌ−２を構築した方法止類似の方法で構築することができる。ＥＧＦに融合したＤＡＢ　をコードするプラスミドを構築するため、（Ｉ　Ｌ−２に融合したＤＡＢ　をコードする）プラスミドｐＤＷ２４を５ｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して、ＩＬ−２：７−ド配列を除去する。生成するＤＴ残基１〜４８５をコードする配列を含むｐＤＷ２４ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメントを、ＥＧＦをコードする合成の５ｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントに連結して、ＥＧＦに融合したＤ　Ａ　８４８６をコードするプラスミドを生じる。第６図に示されるＥＧＦフラグメントは、大腸菌での発現に好ましいコドンを用いて、記載されている方法にしたがって合成した（グロスジャン（Ｇ　ｒｏｓ　ｊ　ｅａｎ）ら、（１９８２）Ｇｅｎｅ、　Ｌ８．１９９−２（１９を参照されたい、尚、この文献は参考として本明細書の開示の一部とされる）。

この合成フラグメントは、５′および３′末端に、プラスミドへの挿入およびＤＴコード配列へのイン−フレーム融合に適当なリンカ−を有している。

ＥＧＦに融合したＤＡＢ　をコードするプラスミドを構築するため、ｐＤＷ２４の代わりに（Ｉ　Ｌ−２に融合したＤＡＢ　をコードする）ｐＤＷ２７を用いることを除き同様な方法を行うことができる。ＩＬ−２コードＤＮＡをｓｐｈ　！およびＨｉｎｄＩＩＩで消化してｐＤＷ２７から除いて、その場所にＥＧＦコードＤＮＡをインサートし、ＥＧＦにイン−フレーム融合したの構築に用いた同じ合成ＥＧＦフラグメントを用いることができる。

前記の方法は、本発明のキメラ毒素を作成する唯一の方法ではないことは、当業者には明らかであろう。精製には、ｐＤＷ２４、ｐＤＷ２７およびそれらから誘導されるプラスミドにおける変化であって、食品医薬品局のグツド・マニュファクチャリング・ブラクティシズ（Ｇｏｏｄ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｐｒａｃｔｌｓｅｓ）に従うことを目指した変化、例えば本発明のキメラ毒素の発現に用いられるプラスミドにおける１ａｃｌｑ遺伝子（アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　）の包含、およびアンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐ　）をＴｎ５（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　）からのネオマイシン／カナマイシン耐性の遺伝子に代えることがある。これらの変更は、当業者により過度の実験をすることなく行うことができる。

ＤＴ−ＥＧＦキメラ毒素の生物活性ＤＡＢ　ＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦは、ＤＴのレセプター結合ドメインが除去されて、ヒトＥＧＦをコードするＤＮＡに置き代わった融合遺伝子の生成物である。第７図に示されるように、生成タンパク質は、ＤＴの酵素学的に活性を有するフラグメントＡおよび細胞質ゾルにフラグメントＡをトランスロケーションするのに必要なりＴのフラグメントＢの詣質結合ドメインを含んでいる。ＤＡＢ　ＥＧＦは、ＤＡＢ　ＥＧＦとＤＴ３ｇ９　４３６のアミノ酸残基４８４に対して接している５′の９７アミノ酸が欠失している点が異なっている。これらのＤＡＢ　ＥＧＦとＤＡＢ３８９ＥＧＦのＥＧＦ部分は、８Ｂレセプター結合性を支配している。したがって、これらの分子は、ＥＧＦレセプター発現によって特徴付けられる腫瘍細胞に対するＤＴの細胞毒性を特異的に標的とする能力を有する。

ＤＴ−ＥＧＦキメラ毒素はＥＧＦ−レセプター−支持線胞にとって毒性を有するヒト細胞ラインのパネルに対するＤＡＢ　ＥＧＦの細胞毒性を評価して、Ａ４３１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）である多数のＥＧＦレセプターを有するヒト類表皮癌細胞ラインと比較した。結果を第３表に示す。

この研究には、多数のＥＧＦレセプターを発現することが報告されているヒト腫瘍細胞ライン（例えば、ＢＴ−２０、ヒーラ、ＬＮＣａｐおよびｔＪ−８７ＭＧ）並びに僅かのＥＧＦレセプターしか発現しないがまたはまったく発現しないヒト腫瘍細胞ライン（例えば、ｃ９１／ＰＬ、ＢｅＷｏおよびＡ３７５）および正常な組繊細胞ライン（例えば、ＷＩ−３８、Ｈｓ６７およびＨＥＰＭ）が用いられた。細胞毒性は、次のようにして評価した。

９６大のプレートの３つのウェルに、細胞のタイプに適したアッセイ培地に細胞をＤＡＢ　ＥＧＦと共に接種した（第３表を参照されたい）。ＤＡＢ　ＥＧＦ濃度は、１０　Ｍと１０−７Ｍの間であった。２０時間インキュベーションした後、細胞を［１４Ｃ］　ロイシンで標識し、トリプシン処理を行い、ガラス繊維フィルターマット上に集め、計数を行ってコントロール取り込みの割合を決定した。Ｄ　Ａ　Ｂ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　＋、：対するＩｃ５ｏが０．５ｎ８未満である細胞ラインを、感受性であると考えた。

第３表：　様々な細胞ラインに対するＤＴ−ＥＧＦキメラ毒素の効果腫瘍細胞ライン細胞ライン　組織／型　感受性Ａ４３１　外陰部上皮癌　十＾５４９　肺癌　十ＫＢ　口腔上皮癌　十ＢＴ−２０胸部腺癌　十ＨｅＬａ　Ｓ３　子宮頚癌　十Ｔ４７Ｄ　胸部腺管癌　十ＬＮＣａＰ、ＦＧ　前立腺癌　十ＨＯ８骨肉腫　十 υ−８７）ＩＧ　多形性神経膠芽腫　十Ｃ９１／ＰＬ　ＨＴＬＶ−１形質転換したＴ細胞　−ＢｅＷｏ　絨毛癌　− Ａ３７５　悪性黒色腫　− ＭＣＦ−７胸部腺癌　− ８Ｎυ−Ｃ２Ｂ　盲腸癌　− 正常な細胞ライン細胞ライン　組織　感受性Ｗｌ−１８二倍体肺線維芽細胞　− Ｈｓ　６７　胸腺　− ＣＣＤ−１８Ｃｏ　結腸線維芽細胞　−Ｈｌ５Ｍ　平滑筋、空腸　− ＰＨ７４ｓ　Ｉｎｔ　胎児小腸　− ＨＥＰＭ　胎児口蓋開音　− 用いた成長条件および推移計画は（下記に示したものを除き）ＡＴＣＣによって画定されたものであった。

培地は、下記の通りであった。

Ａ４３１　（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５５）、　ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ５。

Ａ３４９　（ＡＴＣＣＣＣＬ１８５）、　ハム（Ｈａａ＋）のＦ１２＋１０％ＦＣ８。

ＫＢ　（ＡＴＣＣＣＣＬ１７）、　ＤＭＥＭ＋ＮＥＡＡ＋１０％ＦＣ５。

ＢＴ−２０（ＡＴＣＣＨＴＢ１９）　、　ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ　。

ヒーラＳ３　（ＡＴＣＣＣＣＬ２．２）、ハムのＦ１２＋１０％ＦＣ５。

Ｔ４７Ｄ　（ＡＴＣＣＨＴＢ１３３）、　ＲＰＭ１１６４０＋１０％ＦＣ８。

ＬＮＣａＰ、　ＦＧ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１７４０）、　ＲＰＭ１１６４０＋１０％ＦＣｓ　、ＨＯ５（ＡＴＣＣｃＲＬ１５４３）　、　ＭＥＭ＋１０％ＦＣ５。

Ｕ−８７ＭＧ　（ＡＴＣＣＨＴＢ１４）　、　ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ　。

Ｃ９１／ＰＬ（ｏバート・シュワルツ（Ｒｏｂｅｒｔ　５ｖａｒｔｚ）　、）ＪＥ！＋Ｃ，ボストン、マサチューセッツ、成長条件については、バッカ（Ｂａｃｈａ）ら、（１９８８）Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６７、６１２を参照されたい）、ＲＰＭＩ　１６４０＋１５％ＦＣＳ　；ＢｅＷｏ　（ＡＴＣＣＣＣＬ９８）”ムのＦ１２＋１５％ＦＣ３。

Ａ３７５　（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１９）、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ８。

ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣＴＢ２２）、ＭＥＭ＋１０％ＦＣ５。

５ＮＵ−Ｃ２Ｂ　（ＡＴＣＣＣＣＬ２５０）、ＲＰＭ１１６４０＋１０％ＦＣ８、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣＣＣＬ７５）。

イーグル（Ｅａｇｌｅ）のバサル（Ｂａｓａｌ）　＋　１０％ＦＣＳ　。

Ｈｓ６７　（ＡＴＣＣＨＴＢ１６３）、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ　。

ＣＣＤ−１８Ｃｏ　（ＡＴＣＣＣＲＬ１４５９）、ＭＥＭ＋１０％ＦＣ８。

ＨＩＳＭ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６９２）、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ５。

ＦＨ７４ｓ　Ｉｎｔ　（ＡＴＣＣＣＣＬ２４１）、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ８。

ＨＥＰＭ（ＡＴＣＣＣＲＬ１４８６）、ＭＥＭ＋１０％ＦＣ５０ＭＥＭ−ダルベツコの改良イーグル培地：ＭＥＭ−最少必須培地；ＮＥＡＡ−非必須アミノ酸；ＦＧ８−ウシ胎児血清；ＡＴＣＣ−アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏｌ　Ｉｅｃｔｉｏｎ）。

ＤＡＢ　ＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦの細胞毒性４８８　Ｈ９がＥＧＦレセプターによって選択的に媒介されることを示すために、Ａ４３１細胞を、アッセイ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ５）中ヒトＥＧＦ　（アップステートーバイオテクノロジーズ、インコーポレーテド（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）　（１０−７Ｍ）であるＥＧＦレセプターの特異的拮抗剤の存在下にてＤＡＢ　ＥＧＦ　（第８図）またはＤＡＢ　ＥＧＦ　（第９図）と共に９６穴プレートの３つのウェルで培養した。第８図において、黒塗りの四角はＤＡＢ　ＥＧＦを示し、黒塗りの三角８ＢはＤＡＢ　ＥＧＦ＋ＥＧＦを示す。第９図において、黒塗りの四角はＤＡＢ　ＥＧＦを示し、黒塗りの三角はＤＡＢ　ＥＧＦ＋ＥＧＦを示す。３７℃で２０時間インキュベーションした後、細胞を［１４Ｃ］ロイシンで標識し、トリプシン処理し、ガラス繊維フィルターマット上に集め、計数を行って、コントロール取り込みの割合を決定した。これらの結果は、ＥＧＦの非存在下では、よび３Ｘ１０　Ｍであることを示している。ＥＧＦは、この活性をほぼ完全に破壊する。同様に、抗−ＥＧＦ（バイオメディカル・チクノロシーズ、インコーポレーテド（Ｂｉｏａｌｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）　）および抗 −ＥＧＦレセプター（アップステート・バイオチクノロシーズ、インコーポレーテド（Ｕｐｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。

Ｉｎｃ、）　）も、ＤＡＢ４８６ＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦの細胞毒性を完全に破壊するが、非特異性拮抗剤であるトランスフェリン（ングマ（ＳｌｇＩＩａ））、抗−トランスフェリン（ダコ（Ｄａｋｏ）　）および抗−トランスフェリンレセプター（ダコ（Ｄａｋｏ））は何んら効果を持たない。これらの結果は、ＤＡＢ　ＥＧＦおよびＤＡＢ　ＥＧＦが強力且つ特異的な薬剤であることを示している。

ＤＡＢ　ＥＧＦは、ＤＡＢ　ＥＧＦよりも約１０倍３８９　４８Ｂ強力であることに留意されたい。

ＤＡＢ　ＥＧＦは、ＥＧＦと同様に、ＥＧＦレセブターのダウンレギュレーションを誘導し、ＤＴ−ＥＧＦキメラ毒素のＥＧＦレセプターに特異的な性状についての別の証拠を提供している。ＥＧＦの結合およびインターナリゼーンヨンによって、ＥＧＦレセプターのダウンレギュレーションが誘導され、これは［Ｉ］ＥＧＦ結合能の減少として検出することができる（クルツブ（Ｋｒｕｐｐ）　ら、（１９８２）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、　２５７．１１４８９　）。

ＤＡＢ　ＥＧＦがＥＧＦレセプターにインターナリゼ−ションと、続いてダウンレギュレーションを誘導する能力を評価し、生来のＥＧＦによって誘導されるものと比較した。結果を第１０図に示す。第１０図において、白塗りの四角は、ＥＧＦを示し、黒塗りの菱形はＤＡＢ　ＥＧＦを示している。２４穴のプレートの３個のウェルにおけるＡ４３１細胞を、ＤＭＥＭ＋０．１％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）中でＥＧＦまたはＤＡＢ３８９ＥＧＦ（１０−８Ｍ）と共に所定の時間３７℃でブレインキュベーションした。次いで、細胞を氷上に置き、（０，２Ｍ酢酸、０．５ＭＮａＣ１を用いて）酸ストリッピングを行い、結合しているがインターナライズしていないＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦを除去した。

ＥＧＦ結合能は、細胞を氷上で［Ｉ］ＥＧＦを用いてインキュベーションすることによって測定した。９０分のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、可溶化し、計数した。

ＥＧＦレセプター依存性の相互作用は、ＥＧＦと同様にＤＡＢ　ＥＧＦが第１１図に示されるようにＥＧＦレセプターから［１２５Ｉ〕ＥＧＦを置換するという事実によっても示される。第１１図において、白抜きの四角はＥＧＦを示し、黒塗りの菱形はＤＡＢ　ＥＧＦを示している。第１１図の結果は、コントロール（拮抗なし）ｃｐｍのパーセントとして表わしている。Ｄ　Ａ　Ｂ　ｓ　８９ＥＧＦがＡ４３１細胞に結合する高親和性の［ＩＦＥＧＦを置換する能力は、次のようにして評価した。

２４穴プレートの３個のウェルに接種したＡ４３１細胞を結合性培地（リン酸緩衝食塩水ｐＨ７，２＋０．１％ＢＳＡ＋１５＋ａＭナトリウムアジド＋５０ｗＭ２−デオキシグルコース）中で３７℃で１時間ブレインキュベーションした後、ＤＡＢ　ＥＧＦまたはＥＧＦの存在下にて結合培地中で［ＩＦＥＧＦと共にインキュベーションした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、可溶化し、計数した。結果は第４表にまとめられている。

第４表において、ＥＣは、［ＩＦＥＧＦの５０％の置換を生じる濃度である。

フォールドオーバー　フォールドオーバーと辷」」ヱムムリｔ！ｏｍａｉｔ４：ｉｔＤユ±４１］」レセプターに結合した後、生来のＤＴの細胞での吸収が、クラスワンをコートした小胞のエンドサイト−シスによって起こる（ミドルプルツク（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）ら、（１９７ｇ）　Ｊ、　Ｂｌｏｔ、　Ｃｈｅｔｓ、、　２５３．７３２５）　、　Ｄ　Ｔは次にエンドソームに見出だされ、そこで低ｐＨによって形態的変化が誘発されて、ＤＴの酵素フラグメントＡの細胞質ゾＥＧＦおよびＤＡＢ３８９ＥＧＦの細胞毒性も同じ経路に依存しているがどぅがを決定するため、Ａ４３１細胞をクロロキン（ＩＯＭ）（シグマ（Ｓｉｇ■ ａ）　）の存在または非存在下にて、ＤＡＢ４８６ＥＧＦ、ＤＡＢ　ＥＧＦまたはＥ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　＋　１０９６　Ｆ　ＣＳ　ヲ含ム９６　穴フ１／　−ト（１）６個ずつのウェルで培養した。クロロキンはエンドソームの酸性化を防止する親すリゾーム性化合物である（キム（Ｋｉｍ）　ら、（１９８５）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　９０．１５５２）　。３７℃で２０時間インキュベーションした後、細胞を［３Ｈ］ロイシン、で標識し、トリプシン処理を行って、ガラス繊維フィルターマット上に集め、計数を行った。結果は、第５表に示され、コントロール（Ｄ　Ａ　Ｂ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　＊　ｆ：はＤＡＢ　ＥＧＦなし）の取り込みのパーセントとして表わされ、３回の実験の平均を表わしている。これらの結果は１、クロロキンがＤＴ−ＥＧＦキメラ毒素の細胞毒性をブロックすることを示している。

第５表二　クロロキンに対するＤＡＢ−ＥＧＦキメラ毒素−細胞毒性の感受性コントロール取り込みのパーセントＤＡＢ４８６ＥＧＦ濃度　無添加　クロロキン０　１００　ｌｌｌ５ＤＡＢ３８９ＥＧＦ濃度細胞質ゾルへのトランスロケーションに続いて、フラグメントＡはＮＡＤの開裂とＡＤＰ−リボースの延長因子２　（ＥＦ−２）への共有結合を触媒して、タンパク質合成を阻害する（バッカ（Ｂａｃｈａ）ら、（１９８３）　Ｊ、　ＢｉｏｌＣｈｅｉ、、　２５８．１５８５）　。Ｄ　Ａ　Ｂ　Ｅ　Ｇ　Ｆがタンパク賃金成を阻害する機構を評価するため、Ａ４３１細胞をＤＴ。

ＤＡＢ　ＥＧＦまたは完全培地を含む２４穴プレートの３個ずつのウェルで培養した。３７℃で２０時間インキュベーションした後、細胞を洗浄し、精製したＤＴフラグメントＡ（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））の存在下にて、リーシス緩衝液（１０ｄ）リス、１０ｍＭＮａＣ１゜３ｍＭＭｇ　Ｃ１１０ｄチミジン、１ｉＭＥＧＴＡ、１％２ゝトライトン（ＴＩ？ＩＴＯＮ）Ｘ　−１００）中で［３２Ｐ］　ＮＡＤと共にインキュベーションした。ＴＣＡ沈澱性抽出物をガラス繊維フィルターマット上に集めて、計数して、ＡＤＰ−リボシル化に利用可能なコントロールＥＦ−２の割合を定量した。これらの実験の結果を、第６表に示す。

ＤＡＢ　ＥＧＦは、ＤＴと同様に、ＡＤＰリボシル化に利用可能なＥＦ−２の量を（投与量依存法で）減少させた。

第６表：　ＤＡＢ　ＥＧＦによるＥＦ−２のＡＤＰ−に利用可能なＥＦ− ２のコントロール水準のパーセント毒性が強い。第８および９図に示されているように、ＤＡＢ　ＥＧＦのＡ４３１細胞でのタンノくり賃金成のＤＡＢ　ＥＧＦの強い効力も、ＤＡＢ４８６ＥＧＦおよびＤＡＢ３８９ＥＧＦがＡ４３１細胞を殺す速や力）さを測定する実験でも示されている。第１２および１２図ｉ１、タンパク質合成の最大の阻害を誘導するのに要する（Ａ４３１細胞のＤＡＢ４８６ＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦへの）暴露時間を示している。細胞をＤＡ８４８６ＥＧＦ（５ｘｌＯＭ）（第１２図）またはＤＡＢ　ＥＧＦ（５Ｘ１０−９Ｍ）（第１３図）に所定の時間暴露した後未結合のＤＡＢ　ＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦを洗浄して除いた。完全培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ）で−晩インキユベーションした後、細胞を［１４Ｃ］ロイシンで標識した。結果は、ＤＡＢ　ＥＧＦに１５分間暴露した後には、はぼ最大のタンパク質合成の阻害が起こるが、ＤＡＢ　ＥＧＦについては７５分を超える暴露が必要なことを示している。

ＤＡＢ　ＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦで処理したＡ４３１細胞におけるタンパク質合成の阻害の速度論を、第１４図に示す。タンパク質合成阻害の速度論を検討するため、Ａ４３１細胞を完全培地中でＤＡＢ　ＥＧＦ（５Ｘ１０　Ｍ）またはＤＡＢ　ＥＧＦ　（５ｘｌＯ−９Ｍ）と共に３７℃でインキュベーションした。

所定の時間に、ＤＡＢ　ＥＧＦまたはＤＡＢ　ＥＧＦを除き、細胞を［１４Ｃコ　ロイシンで１時間標識した。この結果は、ＤＡＢ　ＥＧＦを用いて１時間インキュベーションしたところ、タンパク質合成は５０％減少するが、最大の阻害は４時間までに起こることを示している。

ＤＡＢ　ＥＧＦを用いてインキュベーションした場合には、タンパク質合成の最大の阻害は、６時間以上後に起こる。

使用本発明の改良されたキメラ毒素は、医学的疾患、例えば癌またはポリペプチドリガンドが選択的に結合することができる好ましくない細胞群が存在することを特徴とする他の病気に罹っている哺乳動物、例えばヒトに投与される。投与されるタンパク質の量は、病気の型、病気の重さ、病気に罹っている哺乳動物の種のサイズによって変化する。通常は、癌の治療に用いられる他の細胞毒性薬剤に用いられる量の範囲であるが、場合によっては改良されたキメラ毒素の特異性および強くなった毒性のために一層少ない量を必要とすることになる。改良されたキメラ毒素は、任意の従来の方法、例えば注射または所定の時間に放出される移植によって投与することができる。ＭＳＨで改良されたキメラ毒素の場合には、局所用クリームを用いて主要な癌細胞を殺し、注射または移植組織片を用いて転移細胞を殺すことができる。改良されたキメラ毒素は、任意の、毒性がなく、製薬上許容可能なキャリヤー物質と配合することができる。

他の態様他の態様は、下記の請求の範囲にある。例えば、当業者に知られている方法によって、ＤＡＢ　およびＤＡＢ　がインターロイキン４（ＩＬ−４）に融合し８Ｂていることを特徴とするキメラ毒素が構築されている。

ＤＡＢ　−ＩＬ−４は、ＤＡＢ　−ＩＬ４よりも約１０倍細胞毒性が強い。ＤＡＢ　は、インターロイキン６とも融合されている。ＤＡＢ　およびＤＡＢ　は、ヒト絨毛膜のゴナドトロピンにも融合さ８Ｂれている。本発明の改良されたキメラ毒素は、中毒を起こす細胞の特定の群に特異的な結合ドメインを有する任意の細胞に特異的なポリペプチドに融合したＤＴの部分を有している。ポリペプチドホルモンはこれらのリガンドに有用である。

例えばαまたはβＭＳＨの結合ドメインを用いて作成されるようなキメラ毒素は、メラノサイトに選択的に結合することができ、黒色腫の治療に有用な改良されたＤＴ−ＭＳＨキメラ毒素を構築することができる。用いることができる他の特異的に結合するリガンドには、インシュリン、ソマトスタチン、インターロイキンＩおよび１１１、および顆粒球コロニー刺激因子が挙げられる。細胞に特異的に結合するドメインを有する他の有用なポリペプチドリガンドは、（卵巣細胞に特異的な）卵胞刺激ホルモン、（卵巣細胞に特異的な）黄体形成ホルモン、（甲状腺細胞に特異的な）甲状腺刺激ホルモン、（子宮細胞、並びに膀胱および腸管細胞に特異的な）パップレシン、（胸部細胞に特異的な）プロラクチン、およびある種の骨細胞に特異的な）成長ホルモンである。これらのリガンドを用いる改良されたキメラ毒素は、癌または細胞タイプの他の疾患であってこれに特異的結合性があるものの治療に有用である。

多くの細胞特異性リガンドについては、結合ドメインが配置されているそれぞれのリガンド内の領域が知られている。更に、固相ポリペプチド合成における最近の進歩により、この技術に熟達した者が、リガンドの各種のフラグメントを合成し、標識される細胞のクラスへそれらが結合する能力を試験することによって、実際的に任意のこのようなリガンドの結合ドメインを決定することができる。したがって、本発明のキメラ毒素は全リガンドを包含する必要はなく、所望な細胞結合能を示すリガンドのフラグメントのみを包含するだけで十分である。

同様に、このリガンドの類似体またはその細胞結合領域であって若干の配列変化があるものを合成して、それらが細胞に結合する能力を試験し、本発明のハイブリッド分子に取り込むことができる。他の可能性のあるリガンドは、単クローン性抗体または単クローン性抗体の抗原結合性一本鎖類似体であって、その抗原が標的細胞膜の表面常に発現したレセプターまたは他の部分であるものを包含する。

〕ントローノｔめ濯】ソ込め１ＸＦＩＧ、　４　子素ＣＭ）ＦＩＧ、　５　口］　を臀す（Ｍ）ぎ窪９÷圓酷〆蕎しＦＩＧ、７１５　１５　３０　７５邊を寿シ命（２０１呼Ａ）（み）ＦＩＧ、　１２、Ｉ　、ａ　ｍ＋　ｒａフ　（４ト　）ＦＩＧ、　１３ｏ　ｕ”＋　ＯＬｌ’）　０ｏＦ−ＬＯへ国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　Ｈ８２１４−４８Ｋ　８２１４−４Ｂ／／　Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＵ　８３１４−４ＣＣ１２Ｎ　１５／１８Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＢＧ、ＣＡ、ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ、Ｎ０２ＰＬ、ＲＯ，ＳＵＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ペプチド結合によって互いに結合したタンパク質フラグメントから成るキメラ毒素であり、このキメラ毒素のアミノ末端から始まり、順に（ａ）ジフテリア毒素の酵素活性を有するフラグメントＡ、（ｂ）ジフテリア毒素の開裂ドメインＩ１に隣接する前記のフラグメントＡを有する第一のフラグメント、（ｃ）ジフテリア毒素のフラグメントＢの疎水性のトランスメンブラン領域の少なくとも一部を有する第二のフラグメントであって、少なくとも５０のジフテリア毒素アミノ酸残基の欠矢を有しかつこの欠失がトランスメンブラン領域の前記の部分に対してＣ−末端であり、かつドメインＩ２を持たない第二のフラグメント、（ｄ）細胞特異性ポリペプチドリガンドの一部から成る第三のフラグメントであって、前記の部分が前記のポリペプチドリガンドの結合ドメインの少なくとも一部を有し、前記の結合ドメインの一部が酵素活性を有するフラグメントＡによって攻撃される細胞の所定の群に選択的に前記のキメラ毒素を結合させるのに有効なもの、を含んで成り、前記のキメラ毒素は、前記の第三のフラグメントに融合したＤＡＢ４８６から成る毒素よりも強い毒性、前記の第三のフラグメントに融合したＤＡＢ４８６から成る毒素よりも低い前記のキメラ毒素が結合する前記の所定の群の細胞上の部位についてのＫｄ；前記の第三のフラグメントに融合したＤＡＢ４８６から成る毒素が示すより大きな抗タンパク質分解性の分解；前記の第三のフラグメントに融合したＤＡＢ４８６が示すよりも大きな前記の細胞特異性ポリペプチドリガンドによるその細胞毒性の阻害に対する耐性；前記の第三のフラグメントに融合したＤＡＢ４８６がタンパク質合成を同じ程度まで阻害するのに要する暴露時間よりも短い暴露時間で所定の程度までタンパク質合成を阻害する能力；または前記の第三のフラグメントに融合したＤＡＢ４８６が示すよりも一層速やかにタンパク質合成の阻害を開始する能力のいずれかを存することを特徴とする、キメラ毒素。
２．前記の欠失の長さが、少なくとも８０個のジフテリア毒素アミノ酸残基である、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素。
３．ジフテリア毒素の前記のフラグメントＢが、生来のジフテリア毒素のアミノ酸残基３８６に対してＣ−末端のいかなるジフテリア毒素配列も持たないものである、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素。
４．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）がＤＡＢ３８９から成るものである、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素。
５．前記のポリペプチドリガンドの前記の部分が、上皮成長因子レセプターを有する細胞に前記のキメラ毒素を結合させるのに有効な上皮成長因子の一部である、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素。
６．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）がＤＡＢ３８９から成り、（ｄ）がＥＧＦから成る、請求の範囲第５項に記載のキメラ毒素。
７．前記のキメラ毒素が、ＥＧＦに融合したＤＡＢ４８６から成る毒素よりも強い毒性；ＥＧＦに融合したＤＡＢ４８６から成る毒素よりも低い前記のキメラ毒素が結合する前記の所定のクラスの細胞上の部位についてのＫｄ；ＥＧＦに融合したＤＡＢ４８６から成る毒素が示すより大きな抗タンパク質分解性の分解；ＥＧＦに融合したＤＡＢ４８６が示すよりも大きな前記の細胞特異性ポリペプチドリガンドによるその細胞毒性の阻害に対する耐性；ＥＧＦに融合したＤＡＢ４８６がタンパク質合成を同じ程度まで阻害するのに要する暴露時間よりも短い暴露時間で所定の程度までタンパク質合成を阻害する能力；またはＥＧＦに融合したＤＡＢ４８６が示すよりも一層速やかにタンパク質合成の阻害を開始する能力のいずれかを有するものである、請求の範囲第５項に記載のキメラ毒素。
８．前記のポリペプチドの前記の部分が、前記のキメラ毒素をＴ細胞に結合させるのに有効なインターロイキン２の一部である、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素。
９．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）がＤＡＢ３８９から成り、（ｄ）がＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３から成る、請求の範囲第８項に記載のキメラ毒素。
１０．前記のキメラ毒素が、ＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３に融合したＤＡＢ４８６から成る毒素よりも強い毒性；ＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３に融合したＤＡＢ４８６から成る毒素よりも低い前記のキメラ毒素が結合する前記の所定のクラスの細胞上の部位についてのＫｄ；またはＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３に融合したＤＡＢ４８６から成る毒素が示すより大きな抗タンパク質分解性の分解のいずれかを有するものである、請求の範囲第８項に記載のキメラ毒素。
１１．前記のキメラ毒素が前記のタンパク質フラグメントをコードする領域を有する融合遺伝子によってコードされるものである、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素。
１２．請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素をコードする、ＤＮＡ配列。
１３．請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡ配列を含有してなる、発現ベクター。
１４．請求の範囲第１３項に記載のベクターで形質転換された細胞。
１５．請求の範囲第１４項に記載の細胞を培養し、前記の培養細胞または上澄液から前記のキメラ毒素を単離することから成る、請求の範囲第１項に記載のキメラ毒素の製造法。