JPH06503553A

JPH06503553A - 改良されたドメイン間幾何を有するキメラ毒素類

Info

Publication number: JPH06503553A
Application number: JP3511509A
Authority: JP
Inventors: マーフィー，ジョン・アール; ウィリアムズ，ダイアン・ピィ
Original assignee: ザ・ユニバーシティ・ホスピタル
Priority date: 1990-06-13
Filing date: 1991-06-12
Publication date: 1994-04-21
Also published as: EP0535088A4; AU8056691A; CA2083487A1; EP0535088A1; WO1991019745A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

改良されたドメイン間幾何を有するキメラ毒素類発明の背景本発明は、キメラ毒素分子を構築するための組換えＤＮＡ技術の使用に関する。多くのホルモン類、毒素類および他の生物活性蛋白類によって主張される非常に選択的な効果は、このような蛋白類が１種類以上の機能的に異なったポリペプチドドメインを有するので、ある程度可能である。いくつかの植物および細菌毒素は、例えば、細胞結合、膜トランスロケーンコン、および中毒の原因となる個々のドメイン類で進化した。種々のドメイン類によって授けられる特性の組合せによって、非常に有効な生物活性分子が得られる。ジフテリア毒素（ＤＴ）は天然マルチドメイン蛋白の例である。ＤＴは多くのドメイン類からなり、それらの各々は固有の機能を授け、それらの全ては組み合わせて非常に活性な毒素分子を生じる。ＤＴは、分子のアミノ末端で始まる、以下のとおり特徴付けられ得る：疎水性リーダーシグナル配列Ｓ（アミノ酸Ｖａｌ− Ｂ−Ａｌａ−１）；　ｒ延長因子２」と称される真核蛋白合成因子のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性アデノシンニリン酸（ＡＤＰ）リボシル化を触媒するドメインを含む酵素的に活性な断片Ａ（アミノ酸Ｇ１ｙ＋　Ａｒｇｕｓ）　：切断ドメインを含有するプロテアーゼ感受性ジスルフィドループ１．（アミノ酸ＣＶＳ＋ａｓ　Ｃｙｓ、。１）；ならびにトランスロケーションドメインおよび第２ジスルフイドループ（＋２、アミノ酸Ｃ）’Ｓｎｓ＋　Ｃ）’Ｓ４ｔ＋）をフランクする普遍性（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ）結合ドメインを含む断片Ｂ（アミノ酸５ｅｒｎ４−Ｓｅｒｓｓｓ）。ＤＴが感受性真核細胞を中毒させるプロセスは、少なくとも以下の工程を含む＝（１）ジフテリア毒素の結合ドメインは感受性細胞の表面の特異的セッター類に結合する：　（ｉｔ）そのレセプターに結合する一方、毒素分子はエンドサイトーンス小胞中に取り入れられる；（ｆｆｉ）取り入れられる前、またはエンドサイト−シス小胞内で、該毒素分子は断片ＡおよびＢの間の１１切断ドメイン中の蛋白分解切断を受ける。（■）エンドサイトーンス小胞のｐＨが６未満に低下すると、毒素は、自然に、エンドソーム膜中に挿入される。（ｖ）該膜中に包埋されると、毒素のトランスロケーションドメインは断片Ａの細胞質ゾル中への導出を促進する；　（ｖｉ）断片Ａのドメインに残存する触媒活性は中毒細胞の死の原因となる。／ニードモナス（Ｐ　ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）エキソトキシンＡによる、およびことによるとある種の別の天然毒素による細胞死滅の機構は非常に類似している。種々の官能性ドメイン類（ポリペプチドまたは非ペプチドのいずれか）を含有するヒト生産毒素分子の治療的効果は、長年、真価が認められてきた。ポール・エールリッヒ（Ｐａｕｌ　Ｅｈｒｌｉｃｈ）、エールリッヒ（１９０６）、コレクチ’７ド・スタデイズ・オン・イムニティ（Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　Ｉ　ｍｍｕｎｉｔｙ）、２　：　４４２−４４７は、特異的標的に対する親和性を有する分子（標的または細胞結合ドメイン）と細胞毒性薬として作用する分子（細胞毒性ドメイン）を併有した二官能性分子の構築物を示唆する最初のものである。それ以来、多くの生物的および化学的部分が、選択的細胞毒性、すなわち、標的された細胞毒性の程度を示す分子を生産する試みにおいて種々の方法で結合された。初期の試みは、非ペプチド毒素の、可溶性分子または抗体へのコンンユゲーシコンによって特徴が表された。より最近は、分子遺伝学の出現は、新規なマルチドメインキメラ毒素蛋白をコードするキメラ遺伝子の工学を承認した。例えば、マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）、Ｕ、Ｓ、特許第４．６７５．３８２号を参照。これは本明細書に引用記載されており、ＤＴの酵素活性（毒素）ドメイン、ＤＴの切断ドメイン、ＤＴのトランスロケーションドメイン、および第２蛋白から誘導された細胞特異的結合ドメインを含むハイブリッド蛋白類の構築物を教示する。上記マーフィーの文献に開示されているハイブリッド蛋白類は、毒性を授けるＤＴ毒素ドメイン類と、非常に選択的な細胞結合特性を授ける別の蛋白、例えばインターロイキン２（ＩＬ−２）由来のドメインとを併有する。該構成成分の固有の特性の改良、すなわち、例えばモノクローナルのようなより非常に特異的な細胞結合剤の使用、および、例えば植物または細菌毒素のような大きい効力の毒素の使用は、改良された毒素コンジュゲート体への主要なルートであった。二官能性分子の細胞結合実体および細胞死滅実体を結合する方法は、これらの分子の性能を改良する試みにおいても考慮された。これらの試みは、主要成分の活性を保存すること、溶解度を増加させること、細胞特異的結合剤に結合された細胞毒性剤の割合を増大させること、または中毒において必要な工程、例えば毒素ドメインの、分子の残存部からの切断を行うことの容易さを増大させることに向けられた。種々のスペーサーまたはリンカ一部材は、上記の長所を現実化する試みにおいて、コンジュゲート−毒素類のドメイン類（または非ペプチド官能性実体）間に置かれた。ロウランド（Ｒｏｖｌａｎｄ）ら、（１９７５）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２５５：４８７は、化学的毒素類および抗体間のリンカ−としてのポリグルタミン酸（分子量＝３５，０００）の使用が抗体に対する毒素の結合を指向することが好ましいと報告している。「この結合工程でＩｇの化学的構造による妨害を最小にすることによって、コンジュゲート体が、高濃度の薬物を伴い、かつ抗体活性をあまり損失させずに生産される。・・・不活性中間担体を介して抗体に細胞毒性剤を連結することの概念は、種々の薬物、種々の担体およびより純度の高い抗体調製物の使用の可能性を伴って、将来の改良された癌化学治療について広い範囲を提供する。」モンシニイ（Ｍｏｎｓｉｇｎｙ）ら、（１９８０）ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１１９：１８１は、薬物および担体間でのスペーサーを含有するペプチドの挿入によって、例えば抗体の如き担体にコンジュゲートしたダウノルビシンのような薬物の活性を最大にすることを報告している。スペーサー・アーム、２−（１−チオーβ−Ｄ−グリコピラノシル）−エタノイル−Ｌ　− ａｒｇ−Ｌ−１ｅｕは、血清プロテアーゼによってではなく、リゾソームブロテアーゼによって切断され得る。「技術的理由のために、および薬物の活性が置換または化学的修飾されると部分的または全体的に損失されるので、我々は、薬物−一担体コンンユゲート体が血清中で安定であり、標的細胞の内側に遊離薬物を誘導するリゾソームプロテアーゼによって特異的に分裂され得るようなスペーサーを案出した。」アーノン（Ａｒｎｏｎ）ら、（１９８２）、イムノロジカル・リビュー（Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ、）、６２：５は、抗体にダウノマイシンを結合するためのデキストランの使用を報告している。「この方法を使用する理由は２つあった。第一に、より高い細胞毒性活性に誘導すべき、抗体分子当たり多量の薬物結合かえられることが予想される。第二に、薬物および担体間のスペーサー・アームとしてのマクロ分子の使用が立体障害をあまり伴わずに、故に、より高い効力で、コンジュゲート体表面の薬物部分のより高い暴露を可能にする際の長所を証明できた。」トウリイット（Ｔ　ｒｕｅｔ）ら、（１９８２）、ブロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、７９　：　６２６−６２９は、１〜４アミノ酸残基長さのスペーサー・アームによってダウノルビンンをスクシニル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合させることを報告している。該スペーサー・アームの目的は、薬物およびＢＳＡ分子間でリソソーム切断させることであった。ネヴイル（Ｎｅｖｉｌｌｅ）ら、（１９８９）、ＪＢＣ，２６４：１４６５３− １４６６１は、切断可能な架橋剤がＤＴ−抗原コンジュゲート体の効力を３〜１０倍増強することを報告している。架橋剤は酸性ｐＨで切断可能であり、か（して、酸性区画において切断される。大きい効力は、大きいトランスロケーションに誘導する増強された細胞内毒素−毒素レセプター相互作用に左右されると思われる。該コンジュゲート体は切断の後ではなく前に立体的に妨害されると思われる。非ペプチド架橋剤、ビス−マレイミドエチオキシプロパンが使用された。グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、ＰＣＴ／ＵＳ８５１００１９７は、毒性および抗体がスペーサーペプチドによって結合される毒素−抗体コンジュゲート体を開示している。「本発明は、細胞毒性断片を標的細胞にトランスロケートするのに適している幾何、このようなトランスロケーションの前にその結合断片を保持する能力、および／または細胞毒性部分を可溶化する能力を有する毒素コンジュゲート体を提供するように設計される。本発明の１つの態様では、該スペーサーは、該分子の細胞毒性部分を細胞膜に容易に接近させるように設計される。典型的な抗体（結合）断片のサイズがほとんどの細胞毒性断片のものよりも非常に大きい場合に、ここには、抗体または抗体断片の完全なバルクによって押し付けられた毒性部分による細胞膜への接近の相当な立体妨害がある。・・・このトランスロケーションを有効にするために、該スペーサーは、Ａ部分を細胞膜に到達させるのに充分にフレキシブルであり、かつそれに充分な能力を持たせるのに充分に延長されることが必要で一般に、本発明は、キメラ毒素のアミノ末端で開始される、順次、（ａ）ジフテリア毒素の酵素的に活性な断片Ａ：（ｂ）ジフテリア毒素の断片Ａに隣接している切断ドメイン１．を含む断片：（ｃ）（ｉ）ジフテリア毒素の断片Ｂの疎水性膜内外領域の少な（とも一部分であって、該断片が少な（とも５０個、好ましくは少なくとも８０個のジフテリア毒素アミノ酸残基の欠失を有し、該欠失が該膜内外領域の該部分に対するＣ−末端であり、該断片がドメイン１２を含まないもの、または（ｉｉ）ジフテリア毒素の断片Ｂの疎水性膜内外領域の少なくとも一部分を含む断片であって、該ジフテリア毒素の該断片Ｂが天然ジフテリア毒素のアミノ酸残基３８６に対するＣ−末端にジフテリア毒素配列を含まないものを含む断片：（ｄ）スペーサー（以下に定義する）、および（ｅ）細胞特異的ポリペプチドリガンドの一部分であって、該細胞特異的ポリペプチドリガンドが細胞増殖因子、好ましくはリンホカイン、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターロイキン４（ＩＬ−４）であるものを含むペプチド結合によって一緒に結合した蛋白断片を含むキメラ毒素を特徴とする。細胞特異的ポリペプチドリガンドの該部分はポリペプチドリガンドの結合ドメインの少なくとも一部分を含み、該結合ドメインの該部分はキメラ毒素を、該リガンドに対するＴ−細胞またはＢ−細胞担持レセプターの如きリンパ球のような標的細胞に選択的に結合させるのに有効である。本明細書で使用する場合、細胞増殖因子は、哺乳動物の細胞にある細胞表面レセプターに結合し、細胞の増殖の原因となる蛋白を意味する。好ましい細胞増殖因子は、リンホカイン類であり、すなわち、リンパ球に結合してその増殖を刺激する細胞増殖因子である。好ましい具体例では、Ｄ　Ａ　Ｂ　３＋ｎは細胞毒性部分、すなわち上記（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）である。（ＤＡＢ３８Ｑは、メチオニン、それに続く天然ＤＴの残基１−３８６、それに続く天然ＤＴの残基４８４および４８５からなる。）ＤＡＢ３．、の構築は、本明細書に引用記載する、１９９０年３月２日出願のＵＳＳＮ　４８８゜６０８に開示されている。好ましい具体例としては、スペーサーが：少な（とも５個のアミノ酸長さ、好ましくは１０〜３０個のアミノ酸長さであり、ＤＴ断片ＤＡＢ４ｉｓ　（ＤＡＢ４８５はメチオニンに天然ＤＴの最初の４８４個のアミノ酸残基が続（ものからなる）およびＩＬ−２のアミノ酸残基２−１３３の間にある場合、１．０００以上、より好ましくは１．１２５以上、最も好ましくは１．１３５以上のＢ、。１．値を有し：少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％の、リシン、セリン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、アスパラギンまたはアルギニンからなる群からのアミノ酸からなり；　、Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−８ｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ− Ｔｈｒ　（以下、（１−１０）と記す）、Ｐｒ。 −Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ　（以下、（１−７Ｇ１ｙ）と記す）、Ｐｒ。 −Ｔｈｒ−８ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　（以下、（１−７Ｌｙｓ）と記す）、またはそれらの多重体（多重体の数は、以下、肩文字で記す、例えば（１−１０）２と表し、これは（１−１０）サブユニットの２倍直列コピー（２ｔａｎｄｅｍ　ｃｏｐｉｅｓ）を示す）のいずれかと少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％相同であり。該キメラ毒素の標的細胞に対する親和性を、当該スペーサーを欠損している以外は該キメラ毒素と同一である第２キメラ毒素の標的細胞に対する親和性よりも大きくシ；あるいは、該キメラ毒素に、当該スペーサーを欠損している以外は該キメラ毒素と同一である第２キメラ同一によって示された標的細胞に対する細胞毒性よりも少なくとも２倍大きい標的細胞に対する細胞毒性を示させるものが挙げられる。本明細書で使用する場合、ジフテリア毒素または天然ジフテリア毒素は、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）によって分泌されるジフテリア毒素蛋白の５３５アミノ酸残基成熟形態を意味する。天然ジフテリア毒素をコードする遺伝子の対立遺伝子の配列は、本明細書中に引用記載する、グリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、（１９８３）、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８０　：　６８５３−６８５７において見られる。本明細書で使用する場合、酵素的に活性な断片Ａは天然ＤＴのアミノ酸残基Ｇ１ｙｌ＝Ａｒｇ１９３、または該天然配列の酵素的に活性な誘導体または類似物を意味する。本明細書で使用する場合、切断ドメイン１．は天然ＤＴのＣｙｓ１８６およびＣｙｓ２０１に及ぶ領域内のプロテアーゼ感受性ドメインを意味する。本明細書で使用する場合、断片Ｂは天然ＤＴの５ｅｒ１９４〜５ｅｒ５３５の領域を意味する。本明細書で使用する場合、断片Ｂの疎水性膜内外領域または疎水性ドメインは、内在性膜蛋白（ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の二層−スパンニング螺旋と構造類似性を有しており、かつ、天然ジフテリア毒素のアミノ酸残基３４６〜アミノ酸残基３７１にほぼ位置するか、またはそれらから誘導されるアミノ酸配列を意味する。本明細書で使用する場合、ドメイン１□は天然ＤＴのＣｙｓ４６１およびＣｙｓ４７１に及ぶ領域を意味する。本明細書で使用する場合、断片Ｂの普遍性真核結合部位（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇ　５ｉｔｅ）は、ＤＴを真核細胞の表面上のその天然レセプターに結合させる原因となる天然ＤＴのＣ −末端の５０個のアミノ酸残基内の領域を意味する。断片Ｂの普遍性真核結合部位は本発明のキメラ毒素に含まれない。本明細書で使用する場合、スペーサーは以下の特徴を１つ以上有するポリペプチドである・（１）ジフテリア毒素断片ＤＡＢ４ｓｓの配列およびＩＬ−２のアミノ酸残基２−１３３の間にある場合、１０００以上、好ましくは１．１２５以上、最も好ましくは１１３５以上の正規化されたＢ値（Ｂ、。、。）（本明細書に引用記載する、カープラス（Ｋａｒｐｌｕｓ）ら、（１９８５）、ナトウルヴイーセンシャフテン（Ｎａｔｕｒｖｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ）、７２：２１２の定義に従う）を有するアミノ酸残基を有する：（２）そのアミノ酸残基の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％かりシン、セリン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、アスパラギンまたはアルギニンからなる群から選択される；（３）配列Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒまたは該配列の多重体を有する：（４）（３）で挙げた配列または該配列の多重体と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％相同である。（５）配列Ｐｒｏ−Ｌｙｓ− ３ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙまたは該配列の多重体を有する；（６Ｘ５）で挙げた配列または該配列の多重体と少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％相同である。（７）配列Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　− ５ｅｒ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓまたは該配列の多重体を有する：または（８Ｘ７）で挙げた配列または該配列の多重体と少なくとも６０％、好ましくは少な（とも８０％相同である。ポリペプチド配列中の残基のＢ、。１．値は、カープラスら（上記文献）の方法（Ｂ、。、１法）を使用して、例えば、選択した蛋白配列の各々の箇所でアルファ炭素原子間のフレキンビリティを予想するＦＬＥＸＰＲＯ（インテリジェネティクス（Ｉ　ｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、マウンテン・ビ、−（ＣＡ））のようなコンピュータープログラムを用いて決定することができる。ＦＬＥＸＰＲＯは隣接アミノ酸におけるアルファ炭素原子の原子温度因子（Ｂ値またはデバイ−ワラ−（Ｄｅｂｙｅ−Ｗａｌｌｅｒ）因子とも称される）の平均値から、選択したアミノ酸残基の鎖フレキンビリティを計算する。該Ｂ値は蛋白における該原子のその平均位置からの平均平方置換である。フレキシブルな配置はそれらの置換が大きくてもよいので、高いＢ値を有する。ＦＬＥＸＰＲＯにおけるあるアミノ酸のＢ、。、１値は、その隣接するアミノ酸のＢ、。、。値によって影響される。ＦＬＥＸＰＲＯによって計算されたあるアミノ酸の予想フレキシビリティは、該配列におけるその箇所に最も近い７個のアミノ酸のＢ７゜１．、値（近隣を考慮に入れる）の加重和である。ウエートは、２個の最外アミノ酸については領２５；その次の２個については０．５；中央アミノ酸に隣接する２個については０．７５；および中央アミノ酸自体については１である。各アミノ酸について、該ウエートは、Ｂ７゜２．、値（近隣を考慮に入れる）によって多重化される。アミノ酸配列をＦＬＥＸＰＲＯにインプットすると、該プログラムはＢ　５ｅｔｓ値を計算し、７−アミノ酸残基断片および該７−アミノ酸残基断片の各々についてのピークＢ、。１．、値を表示する。１未満の正規化されたＢ値は、硬性アミノ酸を示し、１よりも大きい値はフレキシブルなアミノ酸を示す。多（の蛋白の所見は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、システィン、メチオニンおよびヒスチジンのアミノ酸類が硬性の傾向があり、リジン、セリン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、アスパラギン、およびアルギニンのアミノ酸類がフレキシブルの傾向があることを示唆している。（カープラスら（上記文献））。スペーサーとして使用される配列は、例えば、それらが天然である否かに拘わらず、キメラ毒素を構築するのに使用されるポリペプチド類の１つから、他の天然配列から、または合成配列からのようにいずれの供給源からも誘導され得る。本発明は、また、蛋白断片をコードする領域を含む融合遺伝子によってコードされるキメラ毒素、該キメラ毒素をコードするＤＮＡ配列、キメラ毒素をコードする該Ｄ　Ｎ　Ａ配列を含有する発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換される細胞、および該形質転換細胞を培養し、培養細胞または上清からキメラ毒素を単離することを含むキメラ毒素を生産する方法を特徴とする。本発明は、また、配列Ａｌａ　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｔｈｒまたは該１０残基サブユニツトの直列反復体（スペーサーをコードするＤＮＡにおける官能性または二官能性１／２制限酵素認識部位リンカ−配列の包含から生じる各端部（または直列反復体の個々のサブユニット間）で１または２種類のさらなる残基を有するまたは有しない）を有するスペーサーペプチド類、該スペーサーペプチド類（官能性または二官能性１／２制限酵素認識部位りンカー配列を有するかまたは有しない）をコードするＤＮＡセグメント、これらのＤＮＡを含有するベクター、これらのベクターで形質転換された細胞、および該形質転換細胞を培養し、該培養細胞または上清からスペーサーを単離することを含むスペーサーペプチドを作製する方法を特徴とする。好ましい具体例としては、スペーサーをコードするＤＮＡセグメントであって、スペーサーがサブユニットＡｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−５ｅｒ− Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−ＬＹＳ−Ｔｈｒの直列反復体であり、該スペーサーにおけるサブユニ・ントの各存在をコードするＤＮＡ配列がスペーサーまたはキメラ毒素におけるサブユニットの全ての他の存在をコードするＤＮＡ配列と非相同であり、該非相同性が直列反復サブユニットをコードする配列間の組換えを防止するのに充分であるＤＮＡセグメントが挙げられる。本発明は、また、各サブユニットをコードするＤＮＡがすべての他のサブユニツトをコードするＤＮＡと非相同であるような各サブユニット−暗号配列のコドンを選択することによってスペーサー−ペプチド−コード化ＤＮＡの直列反復サブユニット間の組換えを防止する方法であって、該非相同性が直列反復サブユニツト間の組換えを防止するのに充分である方法を特徴とする。本発明は、また、スペーサー（官能性または二官能性１／２制限酵素認識部位リンカ−配列を有するかまたは有しない）をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された細胞、および該形質転換細胞を培養し、該培養細胞または上清からスペーサーを単離することを含むスペーサーを生産する方法を特徴とする。本発明の分子は、キメラ毒素のリガンド部分が結合するレセプターを有する細胞に対する改良された結合親和性および改良された細胞毒性を示す。自己免疫疾患、同種異系移植片反応、および他のリンパ球依存性症状の管理において、インターロイキン（または他の増殖因子）レセプターを認識する細胞結合部分を使用するキメラ毒素は標的細胞の部位について固有のインターロイキン（または他の増殖因子）と競合しなければならない。かくして、初期細胞結合工程の最適化は、細胞結合部分がインターロイキンレセプターのようなリガンドを認識するキメラ毒素において特に重大である。本発明の他の特徴および長所は、以下に記載する好ましい具体例および請求の範囲から明らかであろう。好ましい具体例の記載４、

【図面の簡単な説明】

図面第１図はＤＴ分子および種々の融合蛋白の線図である。第２図は好ましい具体例のプラスミド類の構築の模式図である。改良されたドメイン間幾何を有するキメラ毒素の構造および合成りＡＢ４Ｈ（１１０）−ＩＬ−２は、以下の順序で、Ｍｅｔ　；成熟天然ＤＴのアミノ酸残基１〜Ｈｉｓ”’：　Ｇｌｙ；アミノ酸残基Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ（（１−１０）と称する；Ｈｉｓ：成熟天然ＤＴのＡｌａ４ｇ！、およびＩＬ−２のアミノ酸残基２〜１３３からなるキメラ毒素ポリペプチドである。キメラ毒素ＤＡ８４ｍｓ−（１１０）　ＩＬ−２のＤＴ部分は、ＤＴ断片Ａの全ておよび成熟天然ＤＴの残基４８５に延長するＤＴ断片Ｂの一部分を含む。ＤＴの構造に関する第１図ａを参照。第１図すはＤＡ８４ｍｓ−Ｉ　Ｌ−２の構造を示す。第１図すにおいて、幅広い棒は、融合蛋白を示し、細い連結線は欠失を表し、棒上の数字はＤＡＢ命名法（以下に記載する）におけるアミノ酸残基番号であり、棒の下の数字は天然ＤＴのアミノ酸残基ナンバリングに対応し、クロスハツチングは両親媒性領域を示し、暗くした部分は膜内外領域と対応し、ＩＬ−２−２−１３３はＩＬ−２のアミノ酸残基２ −１３３を示し、Ａ１ａ＝アラニン、Ａｓｎ＝アスパラギン、Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｃｙｓ＝７ステイン、Ｇ１ｙ＝グリシン、Ｈｉｓ＝ヒスチジン、Ｉ　１ｅ＝イソロイシン、Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｔｈｒ＝トレオニン、Ｔｙｒ＝チロシンおよびＶａｌ＝バリンである。（ＤＴ−ＩＬ−２毒素について採用された命名法は、ＤＡＢ＋ｓｓ　（１１０）　ＩＬ　２によって説明され、ここで、Ｄはジフテリア毒素を示し、ＡおよびＢはこれらのＤＴ断片に関する野生型配列を示し、かっこに入っている数字はスペーサーポリペプチドを表し、ＩＬ−２は成熟ヒトインターロイキン−２配列を示す。下付き数字は融合蛋白におけるＤＴ関連アミノ酸の数を示し、その最後はスペーサーのＣ−末端にあり、そこで該スペーサーが挿入される。ＤＴの最後の２つのコドンが１／２５ｐｈＩ部位としての機能も果すことに注意する。ｔａｘシグナル配列の欠失およびｔｒｃプロモーターからの発現がメチオニン残基のＮ−末端への付加を生じるので、ＤＡＢ−ＩＬ−２融合毒素のナンバリングは天然ジフテリア毒素のものを有する相の外に＋１である）。ＤＡＢ＜ａｓ　（１１０）　ＩＬ　２は、ＤＡＢ４ａｓ　ＩＬ　２から構築した。ＤＡＢ４１１６　１Ｌ−２を担持するｐＤＷ２４は、以下のとおり構築した。ｐＵｃ１８にュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ））をＰｓｔＩおよびＢｇｌＩで消化し、複製のイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）起源、ポリリンカー領域、およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（ａｍｐ　 ’　）の３°部分を担持するＰｓｔｌ−ＢｇｌＩ断片を回収した。プラスミドｐＫＫ−２３３−２（ファルマンア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ）　）をＰｓｔＩおよびＢｇｌＩで消化し、２つの転写ターミネータ−およびβ−ラクタマーゼ遺伝子の５°部分を担持するＰｓｔＩ−ＢｇｌＩ断片を回収した。これらの２つの回収した断片を一緒に連結することによってｐＤＷ２２を構築した。プラスミドｐＤＷ１５からヒトＩＬ−２をコードするＢａｍＨＩ−３ａｌＩ断片を単離しくウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、（１’９８８）、ヌークリインク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１６　：１０４５３−１０４６７）、ＢａｍＨＩ／５ａｉｌ消化ｐＤＷ２２（上記に記載）にそれを連結することによってｐＤＷ２３を構築した。ｐＤＷ２４を以下のとおり構築した。ｔｒｃプロモーターおよび翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を担持しているＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片をプラスミドｐＫＫ２３３ −２（ファルマシア）から単離した。５ｐｈＩおよびＨａｅＩ［でｐＡＢｃ５０８（ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、（１９８７）、蛋白工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、１　：　４９３−４９８）を消化し、ＤＴのアミノ酸残基１〜４８５をコードしている配列を含有するＨａｅｎ−８ｐｈＩ断片を回収することによって、ＤＴのアミノ酸残基１〜４８５をコードしているＤＮＡ配列を得た。該Ｈａｅｎ−３ｐｈＩ断片にＮｃｏＩ／ＨａｅＩＩリンカ− （５°ＣＣＡＴＧＧＧＣＧＣ３’）を連結し、次いで、該構築物を、予め単離したｔｒｃプロモーターを担持するＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ断片に連結した。この結果、以下の順序で、ｔｒｃプロモーター、ＮｃｏＩ部位（ＭｅｔにＡＴＧ開始コドンを供給する）、および天然ＤＴの残基１〜４８５をコードする配列を有するＢａｍＨＩ−５ｐｈＩ断片を生じる。この断片を、１３ａｍＨＩおよび５ｐｈｘで消化したｐＤＷ２３に挿入した。得られたプラスミドをｐＤＷ２４と称した。ｐＤＷ２４を第２図に示す。ＤＡＢ４ａｓ　Ｉ　Ｌ−２に対応する挿入を太線で示す。第２図において、黒塗り円はＮｃｏＩ部位を示し、白抜き円はＮｓｉ　Ｉ部位を示し、白抜き菱形はＣｌａＩ部位を示し、黒塗り正方形はＨｐａＩＩ部位を示し、白抜き正方形は５ｐｈＩ部位を示し、黒塗り三角形は５ａｌＩ部位を示す。ｐＤＷ２４によってコード化された融合蛋白（ＤＡＢ４ｓｓ　Ｉ　Ｌ　２）は廿Ｃプロモーターから発現され、ヒトＩＬ−２のアミノ酸２〜１３３に融合したＭｅｔ、次いで、成熟ＤＴのアミノ酸１〜４８５からなる。ポリペプチドスペーサー、（１−１０）をコードしているＤＮＡを合成し、ｐＤＷ２４に挿入した。ｐＤＷ２４をＤＴ配列の３°末端の５ｐｈＩ部位で切断し、スペーサー（またはその多重体）をコードしている合成配列を挿入した。該（１ −１０）スペーサーの１．２および３倍コピーをコードしている合成配列の配列を第１表に示す。第１表：　スペーサー配列ＣＴ　ＣＣＧ　ＡＣＣＡＧＣＴＣＴ　ＡＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　Ｇ２、ｃｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　−ＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＡＧＣＡＧＣＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ−＾１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＨｉｓＧＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＡＧＣＡＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　Ｇ３　、　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　−ＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＧ　ＡＣＴ　ＡＧＣＡＧＣＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＣＡ−＾１ａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ａｌａ−ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＡＣＣＴＣＴ　ＴＣＴ　ＡＧＣＡＣＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＣＧ　ＣＡＴ　ＧＣＴ−ＣＧＡ　ＧＧＡ　ＴＧＧ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＧ　ＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧＣＧＴＡ　ＣＧＡ−官能性５ｐｈＩ部位２３　２４　２５　２６　２７　２ｇ　２９　３０　３１　３２Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　１ｌｉｓＣＣＧ　ＡＣＣＡＧＣＴＣＴ　ＡＧＣＡＣＴ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＡＴ　Ｇ１／２　Ｓｐｈ■部位にアニーリングできる４−塩基延長は、各スペーサー配列をコードしているＤＮＡ断片のいずれの末端にも存在する。各スペーサーにおいて、コドン置換は、５ｐｈＩ部位を１つだけ再生するようにこれらの５ｐｈＩ認識部位の１つを破壊する。第１表、配列１に関して、第１０コドンの３位におけるＧの代わりのＴの使用は、スペーサーの３°末端で５ｐｈＩ部位の発生を防止する。配列２では、Ｇ１ｙコドンの２位におけるＣの代わりのＧの使用はスペーサーの５°末端で５ｐｈＩ部位の発生を防止する。配列３は、配列１の５′末端で官能性５ｐｈＩ部位を維持し、その部位で配列２のスペーサーを連結し、配列２のスペーサーの３°に再生５ｐｈｒ部位を残し、配列３のスペーサーのいずれの末端にも二官能性５ｐｈｒ部位を残すことによって作製される。かくして、第１表からの配列１の、ＤＡＢ４８６−　Ｉ　Ｌ　２またはＤＡＢ３．、−ＩＬ−２の５ｐｈＩ部位への挿入は以下のスプライス／ジャンクション：天然ＤＴのＨｉｓ”’残基：　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ；３°延長によってコードされたＨｉｓ残基、天然ＤＴのＡｌａ”’：およびＩＬ−２配列の第２アミノ酸を有する融合蛋白を生じる。第１表からの配列２の、ＤＡＢ４８６　ＩＬ−２またはＤＡＢ３゜−ＩＬ−２の５ｐｈＩ部位への挿入は以下のスプライス／ジャンクション：天然ＤＴのＨｉｓ ”’；オリゴヌクレチドの５゛末端で３′延長から誘導されたＧ１ｙ残基；　、Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔｈｒ　 −Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　 −・５ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ：　３’延長によってコードされたＨｉｓ残基；天然ＤＴのＡ１ａ４８５．およびＩＬ−２配列の第２アミノ酸を有する融合蛋白を生じる。第１表からの配列３の、ＤＡＢ４８６　ＩＬ−２またはＤＡＢｓａｓ　Ｉ　Ｌ− ２の５ｐｈＩ部位への挿入は以下のスプライス／ジャンクンコン：天然ＤＴのＨ１Ｓ４８４残基：オリゴヌクレチドの５゛末端で３゛延長から誘導されたＧ１ｙ残基；Ａｌａ−Ｐ　ｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔｈｒ　| ３ｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｓｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｔｈｒ　−Ｓｅｔ　−５ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｈｒ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ；　３°延長によってコードされたＨｉｓ残基。天然ＤＴのＡ１８４８３．およびＩＬ−２配列の第２アミノ酸を有する融合蛋白を生じる。３つのサブユニットを、イン・ビトロで配列１および２を連結することによって付加して配列３を得てもよく、次いで、これをキメラ毒素に挿入するか、あるいは、配列２にあるキメラ毒素の５ｐｈＩ部位に配列１を挿入してもよい。各々、（１−１０）の２倍および３倍コピーをコードする第１表からの配列２または３の挿入は類似構造を生じる。（１−１０）配列の反復体が存在する場合、逐次的（１−１０）暗号配列間のＤＮＡホモロジーを最小にするようなコドンが選択される。これは、（１−１０）コード化ＤＮＡの逐次的コピー間の相同性組換えから生じると思われる再配列を防止する。ｃｔｙおよびＨｉｓ残基（スペーサー配列の各末端でリンカ−によってコードされた）の存在は、リンカ−のＢ、。、１値に影響を及ぼさない（データは示さない）。ＤＡＢ４ｓｓ　ｒＬ−２の配列にＦＬＥＸＰＲＯプログラム（上記）を適用することによって、（１−１０）スペーサー配列を同定した。第２表はＦＬＥＸＰＲＯによって決定されたＤＡＢａａａ　ＩＬ２における１０個の最もフレキシブルな７−アミノ酸セグメントを示す。融合蛋白の最もフレキシブルな７アミノ酸伸張がＢ、。２、値１．１３５を有するＤＡＢ４ｓｇ　ＩＬ　２のアミノ酸残基４８７〜４９３であることが判明した。こわらの７個のアミノ酸はＩＬ−２のアミノ酸残基２−８と一致する。これらの７個のアミノ酸はＤＡＢｓａｓ　ＩＬ−２およびＤＡＢｚｓｓ　Ｉ　Ｌ−２（試験した他のＤＴキメラ毒素の毒性特徴を完全に欠いている分子）にある最もフレキシブルなものでもあった。ＩＬ−２の最初の１０個のアミノ酸残基は結晶中の規則的な配列を形成しないことが知られており（ブランドツバ−（Ｂ　ｒａｎｄｈｕｂｅｒ）、（１９８７）、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）、２３８　：１７０７−１７０９）、か（して、フレキシブルであるので、ＩＬ−２の全体の最初の１０個のアミノ酸残基を（１−１０）スペーサーとして使用した。ＤＢＡ４８６　１　Ｌ−２に挿入すると、第３表に示すとおり、（１−１０）スペーサーは新しい構築の最もフレキシブルな配列である。第３表：ＤＡＢａａａ　ＩＬ　２からＤＡＢｓｓｅ　（１１０）　ＩＬ　２をｔｌｌｌ’ ａした。ＤＡＢ３＋＋ｅ　ＩＬ−２ハ、ｐＤＷ２４カラ３０９　ｂ　ｐ　ＨｐａＩＩ−８ｐｈＩ制ｆｆｌ断片ヲ除去し、それをオリゴヌクレオチドリンカー２６１／２７４　（第４表）と置換してプラスミドｐＤＷ２７を得ることによって構築された（第１図）。第４表・オリゴヌクレオチドリンカーこのリンカ−は、Ｐｒｏ３８３からＴｈｒ３８７の断片Ｂ配列を修復し、この位置でＩＬ−２配列にイン−フレーム融合させる。がくして、ＤＡＢａａａ　ＩＬ −２において、Ｔｈｒ３８７およびＨｉｓ４８５間の９７個のアミノ酸を欠失した。上記のとおり、スペーサー（第１表を参照）をコードしているＤＮＡを５ｐｈＩ部位ＴｐＤＷ２７１：挿入する。：、　とｌ：よっｒＤＡＢｓｇｅ　（１１０）　ＩＬ−２を構築した。ＤＡＢｓａｓ　（１１０）−１Ｌ　２は、３０９ｂｐ　ＨｐａＩ［−５ｐｈＩ断片の除去およびそれをＰｒｏ３８３からＴｈｒ３８７の断片Ｂ配列を修復するリンカ−と置換することによってｐＤＷ２４（ＤＡＢ４１６−ＩＬ−２）から直接得られてもよ（、該ポリペプチドリンカ−をコードし、該ＩＬ−２配列にイン−フレーム融合させる。ＤＴの配列はグリーンフィールド（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ）ら、（１９８３）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、８０　：　６８５３−６８５７に開示されている。ＩＬ−２をコードする配列は、本明細書に引用記載する、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、（１９８８）、ヌークリイック・アシッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）、１６　：　１０４５３−１０４６７ｉ：、開示されティルアフライト・バイオシステムズ・ディエヌエイ・ンンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ　−Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で合成された。ＩＬ−２の配列はウィリアムスら（１９８８）ヌークリイック・アシッズ・リサーチ、１６　：１０４５３−１０４６７に開示されている。オリゴヌクレオチドリンカーを使用する成熟ＤＴをコードしている配列のＡＴＧへの融合は、本明細書に引用記載する、ビシャイ（Ｂｉｓｈａｉ）ら、（１９８７）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔ、）、１６９：５１４０−５１５１に開示されている。ＤＴ断片をスペーサーの存在下または不在下でネズミ・インターロイキン４（ＩＬ−４）に融合したキメラ毒素も構築した。当業者に公知の方法によって、ＤＡＢ４ａａ−ＩＬ−４、ＤＡＢ３゜−ＩＬ−４およびＤＡＢ３８１１　（１−１０）”−ＩＬ−４を構築した。すなわち、まず、ＤＡＢａａａ−（１１０）”　Ｉ　Ｌ　２融合物（ｐＤＷ２７から誘導）を含有するプラスミドを５ｐｈＩおよび）（ｉｎｄｍで消化してＩＬ−２暗号配列を除去し、次いで、ＩＬ−４をコードするＤＮＡのセグメントを挿入することによってＤＡＢｘｓｅ　（１−１０）！Ｉ　Ｌ　４を構築した。ＩＬ−４コ一ド化断片は、スペーサーコード化ＤＮＡの３゛末端への挿入およびイン−フレーム融合をさせるリンカ−を含む。ＤＡＢ４８６　１Ｌ−４およびＤＡＢ３゜−Ｉ　Ｌ−４は、各々、ｐＤＷ２４およびｐＤＷ２７の類似処理によって作製された。ネズミＩＬ−４の配列は、本明細書に引用記載する、シー（Ｌｅｅ）ら、（１，９８６）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニスーｚイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８３　＋　２０６１−２０６５に開示されている。これらの構築に使用した配列はＤＮＡＸ（カリフォルニア）から入手した。オリゴヌクレオチドおよび核酸を以下のとおり合成および操作した。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３８０　Ａ　ＤＮＡシンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ・インコーホレイテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩ　ｎｃ、　）、カリフォルニア州フォスター・シティ）でシアノエチルホスホルアミダイト化学を使用して、オリゴヌクレオチドを合成した。合成の後、オリゴヌクレオチドを、製造者による指示に従って、オリゴヌクレオチド・ビューリフイケーシコン・カートリッジ（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ＣａｒｔｒｉｄｇｅｓＸアプライド・バイオシステムズ・インコーホレイテッド、カリフォルニア州フォスター・シティ）上でクロマトグラフィーによって精製した。精製したオリゴヌクレオチドをＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基、ＩｇＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に再懸濁した。相補鎖をアニールするために、等モル濃度の各鎖を１００＋＋Ｍ　ＮａＣ１の存在下で混合し、９０℃に１０分間加熱し、ゆっくりと室温に冷却させた。プラスミドＤＮＡを、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、［（１９８９）、カーレント・プロトコルズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊ　ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ）、ニューヨークコのアルカリ性溶解／塩化セシウム勾配法によって精製した。ＤＮＡを、製造者にニュー・イングランド・バイオロジー（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢ　１ｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ビバリーおよびベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、メリーランド州ゲイザースバーグ）によって推奨されるように制限エンドヌクレアーゼで消化した。アガロース−ＴＢＥゲルからプラスミド構築のための制限断片を抽出し、−緒に連結しくオリゴヌクレオチドリンカーの存在下または不在下で）、標準的な方法を使用してイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換するのに使用した。アウスベルら、（１９８９）、上記文献およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）、モレキュラー・クローニング・ラボラトリ−” マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリングｅハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・”　ｚ＜−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ）、ニューヨークを参照。プラスミドＤＮＡ配列決定は、シークエナーゼ（ユナイテッド・スティン・バイオロジカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａｉｃａｌｓ）、オハイオ州クリーブランド）を使用して、クラフト（Ｋｒａｆｔ）ら、（１９８８）、ノくイオ・テクニクス（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、６：５４４−５４７によって変形されたサンが−（Ｓ　ａｎｇｅｒ）ら、（１９８７）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。ＵＳＡ）７４　：　５４６３−５４６７のジデオキシ鎖読み終わり法（ｄｉｏｘｙ　ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）に従って行った。キメラ毒素の発現および精製キメラ毒素の発現および精製は以下の通りであった。ここで使用する全てのＤＴ −関連ＩＬ−２融合蛋白は、ｔｒｃプロモーターからのイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）菌株ＪＭＩＯＩの細胞質中で発現された［本明細書に引用記載する、アマン（Ａ＋ａｎｎ）ら、（１９８５）、ジーン（Ｇｅｎｅ）、４０　＋　１８３−１９０１　、組換えイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）を、マイクロゲン・ファーメンタ −（Ｍｉｃｒｏｇｅｎ　Ｆ　ｅｒｍｅｎｔｏｒ）　［二ニー・プランスヴイック・サイエンクティフイク（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｖｉｃｋ　５ｃｉｅｎｃｔｉｆｉｃ）、ニュー・シャーシー州エディソン］中、１０１容量で、１０菖ｇ／ｍｌカサミノ酸［ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）、ミシガン州デトロイトコ、５０μｇ／諺ｌアンピシリンおよび０．５％ｇ／ｍｌｆミンを補足したＭ９最小培地［マニアテイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、（１９８２）上記文献］中で増殖させた。細菌培養物を３０℃で増殖し、５１／分で空気を散布した。培養物の吸光度（Ａｓ。。ｎｍ）が０．３に達した時、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドの添加によってキメラｔａｘ遺伝子の発現が誘発された。誘発の２時間後、遠心によって細菌を収穫し、緩衝液＃１１０１（ＤＯＩ　ＫＨ２ＰＯ４，１０１Ｍ　ＥＤＴＡ、７５０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８，０）中に再懸濁し、音波処理（ブランソン・ソニファ−（Ｂｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒ）によって溶解した。全細胞およびデブリを、２７．ＯＯＯｘｇでの遠心によって除去し、次いで、清澄抽出液をフィルター滅菌し、抗ジフテリア毒素イムノアフィニティカラムに適用した。結合した蛋白を４Ｍグアニジン・塩酸塩で溶離し、β−メルカプトエタノールの添加によって１％に低下させ、次いで、７．５ｘ６００ｍｍ　Ｇ４０ｏｏｐｗカラム（トーソーハース（ＴｏｓｏＨａｓｓ））上で高速液体クロマトグラフィーによって大きさによって分類した。使用前に、融合毒素をＨＥＰＥＳ緩衝化ハンクス平衡塩類溶液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））（ｐＨ７，４）に対して徹底的に透析した。精製したジフテリア毒素をリスト・バイオロジカル・ラボラトリーズ（Ｌ　ｉｓｔＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（カリフォルニア州キャンベル）から購入した。ピアース・プロティン・アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓ５ａｙ　ｒｅａｇｅｎｔＸピアース・ケミカル・コーポレイシコン（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、イリノイ州ロックフォード）を使用することによって全精製蛋白の濃度を測定した。細胞毒性種々のキメラ毒素の、ＨＵＴ１０２／６ＴＧ細胞（高親和性ＩＬ−２レセプターを有する）およびＹＴ２Ｃ２細胞（生親和性（ｐ　７５）レセプターだけを有する）によって［１’Ｃ］−ロイシン取込みを遮断する用量応答能力を測定した。第４表は、［”Ｃａ−ロイシン取込みを５０％抑制するのに必要な毒素の濃度（ＩＣ，。）をモルで示す。第５表　細胞毒性第５表に示すとおり、スペーサーペプチドの添加によって、ＤＡＢｓａｅ　Ｉ　Ｌ　−２キメラ毒素の毒性は約５倍増大する。（１−１０）スペーサーの２倍コピー（ＤＡＢｓａｅ−（１−１０）”　ＩＬ−２）または（１−１０）スペーサーの３倍コピー（ＤＡＢ３ａ＊　（１１０）３−Ｉ　Ｌ　２）の効果は実質的にスペーサーの１倍コピー（ＤＡＢｓｓｅ　（１１０）　ＩＬ２）と同一の効果を有する。Ｄ　Ａ　Ｂ　４．、またはＤＡＢｓａｅを（ＩＬ−２構築物について使用したと同一のスペーサーを用いるかまたは用いずに、第１表参照）ＩＬ−４に融合したキメラ毒素も分析した。ＩＬ−４−レセプター担持細胞に対する細胞毒性に関して試験すると、ＤＡＢｓｓｓ−（１１０）”−Ｉ　Ｌ　４は、ＤＡＢ４ｍｓ−Ｉ　Ｌ−４よりも約１０倍大きい細胞毒性であることが判明したＤＡＢｓａｅ　ＩＬ　４よりも２〜１０倍大きい細胞毒性であることが判明した。ＤＴ断片のメラニン細胞刺激性ホルモンへの融合物へのスペーサーの付加は細胞毒性への影響を持たなかった。以下のとおり、細胞毒性アッセイを行つた。ＩＬ−２キメラ毒素について、培養ＨＵＴ　１０２／６ＴＧ（ラド（Ｔｓｕｄｏ）ら、（１９８６）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　ｒｏｃ。Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８３：９６９４）またはＹＴ２Ｃ２（テシガワリ（Ｔｅｓｈｉｇａｗａｒｉ）ら、（１９８７）、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ　、　Ｅ　ｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、１６５　：　２２３）細胞を、１０％ウシ胎児血清（セレクト（Ｃｅｌｌｅｃｔ）、ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭグルタミン、ならびに各々５０　ＩＵおよび５０ μｇ／ｍｌまでのベニ／リンおよびストレプトマイシンで補足したＲＰＭＩ　１６４０培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）、ニューヨーク州グランド・アイランド）中に維持した。細胞を完全培地中ウェル当たり５Ｘ１０’の濃度で、９６ウ工ルＶ字底プレート（リンブローフロー・ラボラトリーズ（Ｌｉｎｂｒｏ−Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、バージニア州マクリーン）に接種した。毒素または毒素関連物質を変動濃度（１０”Ｍ〜１０−’Ｍ）に添加し、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃ で１８時間、該培養物をインキュベートした。インキュベーション後、該プレートを１７０Ｘｇで５分間遠心し、該培地を除去し、１．０μＣｉ／Ｗ［”Ｃ］− ロイシン（二ニー・イングランド・ヌークリア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）、マサチューセッツ州ボストン）を含有するロイシン不含培地（ＭＥＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））　２００μｌと置換した。３７℃でさらに９０分後、該プレートを１７０ｘｇで５分間遠心し、培地を除去し、４ＭＫＯＨの添加によって細胞を溶解した。１０％トリクロロ酢酸の添加によって蛋白を沈殿させ、次いで、セルハーベスタ−（スカトロン（Ｓ　ｋａｔｒｏｎ）、バージニア州スターリン）を使用してガラス繊維フィルター上で不溶性物質を収集した。標準的な方法に従って、フィルターを洗浄し、乾燥させ、計数した。培地だけで培養した細胞を対照として供した。ＣＴ４Ｒ細胞（ウィリアム・イー・ボール（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｅ、　Ｐａｕｌ）、ＮＩＨ）、Ｐ８１５細胞（ＡＴＣＣ）またはＣＴＬＬ２（ＡＴＣＣ）をウェル当たり細Ｆ＆ｌＸｌ０’個で接種し、４０時間インキュベートした以外は、同様の方法でＩＬ−４キメラ毒素を試験した。競合置換試験第６表は、種々のキメラ毒素による高親和性ＩＬ−２レセプター（ＨＵＴＩＯ２細胞ンおよび中親和性ＩＬ−２レセプター（ＹＴ２Ｃ２細胞）から［Ｉ　Ｈｌ　］−標識ＩＬ−２の競合置換を示す。第６表　競合置換第６表に示すとおり、（１−１０）スペーサーペプチドのＤＡＢｓｓｓ−ＩＬ　２への挿入によって結合親和性は増大する。スペーサーの２倍コピーの挿入（ＤＡＢｓｓｓ−（１１０）２−ＩＬ−２）またはスペーサーの３倍コピーの挿入（ＤＡＢｓｓｓ−（１１０）３−　Ｉ　Ｌ　２）は、実質的にスペーサーの単一コピーの挿入（ＤＡＢｓｕ　（１１０）　ＩＬ　２）と同一の効果を有する。［１２’Ｉ］−ｒｌ　Ｌ−２の組換え体Ｉ　Ｌ−２（ｒｌ　Ｌ−２）およびキメラ毒素の競合置換を以下のとおり測定した。実質的にはワン（Ｗａｎｇ）ら（１９８７、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ　、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）、１６６　：１０５５−１０６９）によって記載されたとおり、放射性標識ＩＬ−２結合アッセイを行った。細胞を収穫し、細胞培養培地で洗浄し、５　Ｘ　１０６／ｍｌに再懸濁し、５％ＣＯｉ下、３７℃で３０分間、増加濃度の非標識ｒｌＬ−２またはキメラ毒素の存在または不在下、［４６１コーｒＩＬ−２（０，７μＣｉ／μＣ上ル）とインキュベートした。次いで、該反応を８０％５５０液（アキュメトリック・インコーホレイテッド（Ａｃｃｕｍｅｔｒｉｃ　Ｉ　ｎｃ、　）、カンザス州エリザベスタウン）：２０％パラフィン油（ｄ＝１．０３９／ｍＡ’）の混合物上にかぶせ、微量遠心した。次いで、遊離および結合リガンドを表す各試料の水性相およびペレットを、各々、ヌークリア・シカゴ・ガンマカウンター（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｈｉｃａｇｏ　ｇａ＋ｕ＋ａ　ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。レセプターに結合する放射性標識ｒｌＬ−２の５０％を置換するのに必要な非標識リガンドの濃度から見かけの解離定数に６′ を決定した。使用本発明の改良キメラ毒素を、例えば癌またはポリペプチドリガンドが選択的に結合し得る望ましくない細胞の類の存在によって特徴付けられる他の症状のような医学的疾患に罹患している、例えばヒトのような哺乳動物に投与する。投与される蛋白の量は疾患の種類、疾患の広範性、および疾患に罹患している哺乳動物の種の大きさで変化するであろう。一般に、使用量は、癌の治療に使用される他の細胞毒性剤に対して使用されるこれらの範囲であろうが、場合によっては、改良キメラ毒素の特異性および増大した毒性のためにより低い量が必要であろう。いずれの慣用の方法を使用しても、例えば、注射によってまたは時間放出型移植によって、改良キメラ毒素を投与することができる。該改良キメラ毒素はいずれの非毒性の医薬的に許容される担体物質と組合わせることもできる。他の具体例は以下の請求の範囲内である。！リンカ−２７４／２６１ ↓ ＦＩＧ、　２国際調査報告ｍ　−一一一＋ｍ　ＦＰ、−、、、、爵

Claims

【特許請求の範囲】

１．ペプチド結合によって一緒に結合された蛋白断片を含むキメラ毒素であって、該キメラ毒素が、キメラ毒素のアミノ末端で開始され、順番に、（ａ）ジフテリア毒素の酸素的に活性な断片Ａ、（ｂ）ジフテリア毒素の断片Ａと隣接する切断ドメインｌ１を含む第１断片、（ｃ）ジフテリア毒素の断片Ｂの疎水性膜内外領域の少なくとも一部分からなる第２断片であって、該第２断片が少なくとも５０個のジフテリア毒素アミノ酸残基の欠失を有し、該欠失が腹内外領域の該部分に対するＣ−末端においてであり、該第２断片がドメインｌ２を含まない第２断片、（ｄ）スペーサー、（ｅ）細胞特異性ポリペプチドリガンドの一部分であって、該細胞特異性ポリペプチドリガンドが細胞増殖因子であり、当該部分がポリペプチドリガンドの結合ドメインの少なくとも一部分を含み、該結合ドメインの当該部分がキメラ毒素を標的細胞に選択的に結合させるのに有効である細胞特異性ポリペプチドリガンドの一部分からなるキメラ毒素。
２．細胞増殖因子がリンホカインである請求項１記載のキメラ毒素。
３．欠失が少なくとも８０個のジフテリア毒素アミノ酸残基長さである請求項１記載のキメラ毒素。
４．ジフテリア毒素の断片Ｂが天然ジフテリア毒素のアミノ酸残基３８６に対するＣ−末端でいずれのジフテリア毒素配列も含まない請求項１記載のキメラ毒素。
５．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）がＤＡＢ３８９からなる請求項１記載のキメラ毒素。
６．スペーサーが少なくとも５個のアミノ酸長さである請求項１記載のキメラ毒素。
７．スペーサーが１０〜３０個のアミノ酸長さである請求項１記載のキメラ毒素。
８．スペーサーが、ＤＴ断片ＤＡＢ４８５の配列およびＩＬ−２のアミノ酸残基２−１３３の間に置かれる場合に、１．０００以上のＢｎｏｒｍ値を有する請求項１記載のキメラ毒素。
９．スペーサーが、ＤＴ断片ＤＡＢ４８５の配列およびＩＬ−２のアミノ酸残基２−１３３の間に置かれる場合に、１．１２５以上のＢｎｏｒｍ値を有する請求項１記載のキメラ毒素。
１０．スペーサーが、ＤＴ断片ＤＡＢ４８５の配列およびＩＬ−２のアミノ酸残基２−１３３の間に置かれる場合に、１．１３５以上のＢｎｏｒｍ値を有する請求項１記載のキメラ毒素。
１１．スペーサー中のアミノ酸の少なくとも６０％がリシン、セリン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、アスパラギンまたはアルギニンからなる群由来である請求項１記載のキメラ毒素。
１２．スペーサー中のアミノ酸の少なくとも８０％がリシン、セリン、グリシン、プロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、トレオニン、アスパラギンまたはアルギニンからなる群由来である請求項１記載のキメラ毒素。
１３．スペーサーが【配列があります】である請求項１記載のキメラ毒素。
１４．スペーサーが配列【配列があります】と少なくとも６０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
１５．スペーサーが配列【配列があります】と少なくとも８０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
１６．スペーサーが【配列があります】の多重体である請求項１記載のキメラ毒素。
１７．スペーサーが【配列があります】の多重体と少なくとも８０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
１８．スペーサーが【配列があります】の多重体と少なくとも６０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
１９．スペーサーが【配列があります】である請求項１記載のキメラ毒素。
２０．スペーサーが配列【配列があります】と少なくとも６０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
２１．スペーサーが配列【配列があります】と少なくとも８０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
２２．スペーサーが【配列があります】の多重体である請求項１記載のキメラ毒素。
２３．スペーサーが【配列があります】の多重体と少なくとも８０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
２４．スペーサーが【配列があります】の多重体と少なくとも６０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
２５．スペーサーが【配列があります】である請求項１記載のキメラ毒素。
２６．スペーサーが配列【配列があります】と少なくとも６０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
２７．スペーサーが配列【配列があります】と少なくとも８０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
２８．スペーサーが【配列があります】の多重体である請求項１記載のキメラ毒素。
２９．スペーサーが【配列があります】の多重体と少なくとも８０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
３０．スペーサーが【配列があります】と少なくとも６０％相同である請求項１記載のキメラ毒素。
３１．スペーサーが、標的細胞に対するキメラ毒素の親和性を、標的細胞に対する第２キメラ毒素の親和性よりも大きくし、該第２キメラ毒素が、スペーサーを欠いている以外はキメラ毒素と同一である請求項１記載のキメラ毒素。
３２．スペーサーが、キメラ毒素を、標的細胞に対する第２キメラ毒素によって示される細胞毒性よりも少なくとも２倍大きい標的細胞に対する細胞毒性を示すようにし、該第２キメラ毒素が、スペーサーを欠いている以外はキメラ毒素と同一である請求項１記載のキメラ毒素。
３３．ポリペプチドリガンドの当該部分がキメラ毒素をＴ細胞に結合させるのに有効なインターロイキン−２の一部分である請求項１記載のキメラ毒素。
３４．ポリペプチドリガンドの当該部分がキメラ毒素をＢ細胞に結合させるのに有効なインターロイキン−４の一部分である請求項１記載のキメラ毒素。
３５．キメラ毒素が、蛋白断片をコードする領域からなる融合遺伝子によってコードされる請求項１記載のキメラ毒素。
３６．請求項１記載のキメラ毒素をコードするＤＮＡ配列。
３７．請求項３５記載のＤＮＡ配列を含有する発現ベクター。
３８．請求項３６記載のベクターで形質転換された細胞。
３９．請求項３７記載の細胞を培養し、該培養細胞または上清からキメラ毒素を単離することからなる請求項１記載のキメラ毒素を製造する方法。
４０．配列【配列があります】またはその直列反復体を有するスペーサーペプチド。
４１．請求項４０記載のスペーサーペプチドをコードするＤＮＡセグメント。
４２．さらに各末端でリンカーを含むことを特徴とする請求項４１記載のＤＮＡセグメント。
４３．請求項４２記載のＤＮＡセグメントによってコードされるペプチド。
４４．請求項４１記載のＤＮＡセグメントを含有するベクター。
４５．請求項４４記載のベクターで形質転換された細胞。
４６．請求項４５記載の細胞を培養し、該培養細胞または上清からスペーサーを単離することからなる請求項４０記載のスペーサーペプチドを製造する方法。
４７．スペーサーがサブユニット【配列があります】の直列反復体であり、該スペーサー中のサブユニットの各存在をコードする配列が分子中のサブュニットの全ての他の存在をコードする配列と非相同であり、非相同性が直列反復サブュニットをコードする配列間の組換えを防止するのに充分である請求項４１記載のＤＮＡセグメント。
４８．各サブュニットをコードするＤＮＡが分子中の全ての他のサブュニットをコードするＤＮＡと非相同であるように各サブユニット暗号配列のコドンを選択することからなり、該非相同性が直列反復サブユニット間の組換えを防止するのに充分である、スペーサーーペプチドーコード化ＤＮＡの直列反復サブュニット間の組換えを防止する方法。