JPH06500539A - 担体に結合した又は遊離のペプチド類又はオリゴヌクレオチド類の迅速合成方法、本方法により調製された偏平材料とその使用、並びに本方法を実施するための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 担体に結合した又は遊離のべブチド頚又はオリゴヌクレオチド類の迅速合成方法 、本方法により調製された偏平材料とその使用、並びに本方法を実施するための 装置技術分野 本発明は、担体に結合した又は遊離のペプチド類又はオリゴヌクレオチド類を迅 速に合成する方法、本方法により調製された偏平材料とその使用、並びに本方法 を実施するための装置に関する。

背景技術 タンパク質は実際に全ての生物学的プロセス、例えば酵素触媒反応、輸送、貯蔵 、相関連動、機械的支持機能、免疫保護、神経刺激誘導、成長と分化の制御等に 於いて重要な役割を果たしている。タンパク質は１個または数個の線状ポリペプ チド鎖により構成され、その各種の機能はこれらの鎖の３次元の折りたたみと会 合によってもたらされる。折りたたみ及び３次元の構造は鎖のアミノ酸一次配列 により決定される。自然界に見られる多彩なタンパク質の構造は２０個のアミノ 酸構成成分の組み合わせにより作られる。短い部分配列（オリゴペプチド類）は タンパク質全体の配列の一部の構造と機能をまねることができ、又オリゴペプチ ドは化学的合成法により作ることができる。従って、合成オリゴペプチドはタン パク質の構造分析の際の重要な補助手段の一つである。

Ａ　Ｌ　Ｋ　Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｋ　Ｗ　Ｐ　Ｐ　Ｇ　Ｈ　Ｆ　Ｅ　Ｓ　 ！ｉｔ　Ｔ　−ＡＬＫＰＭＳＴＴＲＱ タンパク質の大きさと複雑さのためにその系統的研究には非常に多くのペプチド を必要とする。

Ａ）オーバーラツプしたペプチドによるかなりの長さのタンパク質鎖の内部に於 ける一つの官能性部位の局在化（Ｉｔ　Ｚ、　Ａｔａｓｓｉ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、月５．１−２０（１９８４）；Ｈ，隨Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｒ，Ｈ，Ｍ ｅｌｏｅｎ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｊ、　Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ堰A　ＵＳＡ ８１、３９９８　（１９８４）参照）。

Ｂ）機能に対して必須のアミノ酸残基の置換分析による解読（Ｒ，Ａ、　）Ｉｏ ｕｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　 ８２．５１３１　（１９８５）；　）１．　Ｌ　Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｒ，Ｈ，Ｍｅ ｌ盾■氏@ａ ｎｄ　Ｓ、　Ｊ、　Ｂａｒｔｅｌｉｎｇ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１．３９９８　（１９８４）参照j。

酵素反応、抗体結合のような微生物学的試験反応は非常に敏感であるから、ごく 少量（ｎｇ乃至μｇ）のペプチド基質で充分である。そのような試験を迅速に簡 単に実施するためには、ペプチド基質を一つの固体の担体材料に固定化して反応 溶液から容易に取り出し得るようにするのが有利である。そうすればペプチドと の反応は残留した反応溶液の中で、或いは担体に結合した物質を後から分析する ことにより定量的に測定することができる。

このような系統的研究を実施し得る範囲は、主としてペプチド合成の速さと担体 の技術的／化学的構想に左右される。迅速なペプチド合成は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄの開発し１　た逐次合成の原理に従って同相で実施できる（Ｒ，Ｂ、　Ｍｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、ＣｈｅａＳａｃ、　８５．２１４９　（ １９６３）参照）。

発明の開示 次に、試験の目的に必要な量の、適当な担体材料又は偏平材料に固定化したオリ ゴペプチドを、１作業日に付き非常に多く（数百）生産する有利な方法に付いて 述べる。

それは本発明によれば、一種又は数種の官能基を付与した担体から始めて、与え られたアミノ酸配列に応じて逐次的に所要のペプチドを適当な合成方法により合 成する、担体に結合した又は遊離のペプチド類を迅速に合成する方法であって一 担体として偏平材料を使用し、 一カップリンクのために、活性化した誘導体の形の所要のアミノ酸又は所要のジ ペプチド又はオリゴペプチドの溶液の少量のアリコートを平面状担体の上に点状 又は線状に塗布し、 一濡れることにより生成した反応面の中でカップリング反応を実施し、−必要に 応じて生成したペプチドを適当な分離剤を用いて平面状担体から分離することを 特徴とする方法を提供する。

一つの特殊の実施態様によれば、数種乃至非常に多種の異なるペプチドを一つの 偏平材料の上で同時に並べて、相互に接触しない点状又は線状の反応平面上で合 成する。

更に一つの特殊の実施態様によれば、偏平材料としてアミノ酸又はペプチドのカ ップリングに適した化学反応性官能基を有する多孔性又は非多孔性フィルム、メ ンプラン、又はそのような紙を使用する。

担体材料としては、機械的に安定で使用する試薬や溶剤に化学的に不活性の偏平 材料が用いられる。これは多孔性又は非多孔性の材料で、要望により下地に貼り つけたものでも、又自立性であってもよい。例えばフィルム、シート、メンプラ ン、紙等が使用できる。ここで重要なことは、この偏平材料が化学的に反応可能 のグループ（官能基）を有し、ここにペプチド構成用のＣ末端を備えた構成成分 （保護されたアミノ酸、ジペプチド、又はオリゴペプチドが適している）が共有 結合し得ることである。

化学合成に用いられる本担体材料は利点として微生物学的試験反応での使用にも 適している。ペプチドと担体材料との間の結合がペプチド合成の開会ての化学反 応に対して安定であるならば、調製されたペプチドを分離又はその後の固定化を 行わずに直接使用することが可能である。

担体材料が多孔性であればその内部の表面も合成に利用できる。その場合の洗浄 操作は溶剤を担体材料に充分含浸させて行えばよい。非多孔性の担体材料では表 面積が非常に小さくなる。洗浄操作としては簡単にすすぐだけでよい。

出願した方法によるペプチド合成に対しては、例えばセルロース（官能基として ヒドロキシル基を有し直接使用可能）、ガラス又は合成御脂、例えばポリエチレ ン、ポリプロピレン、テフロン等の偏平材料で、その表面に適当な化学的官能基 を、例えばアクリル酸又はその誘導体のグラフト共重合により導入した材料が適 している。

更に例えばアミノプロピル基、或いはグリシン又はジグリシンのアンカー基の導 入によっても表面に官能基を付与することができる。

それぞれの反応面の大きさは、担体にもたらされた容積、担体材料の吸収特性及 び溶剤の揮発性によって決まる。選択した担体、例えば紙製担体の特異的官能性 と関連して、その都度の液体の容積は勿論ペプチド合成の選定したスケールにも 左右される。又その都度の液体の容積は、２個の反応面の間の最小間隔、従って 間接的に与えられた１個の担体の上に設けることのできる反応面の数を決定する 。例えば表２参照。

担体の使用形態と化学的前処理に応じて、単位面積当たりの反応性官能基の付着 量を広い範囲で変えることができる（例えばｌｐ＋ｘｌ〜１μｍｌ／ｃｍつ。

使用し得る紙の好例としてはＷｈａｔｍｎ　Ｃｈｒｌ、　Ｗｈａｔｍａｎ　５４ ０．　Ｗｈａｔｍａｎ　３　ＭＭがある。Ｗｈａｔｍａｎ　５４０の方がＴｈａ ｔｍａｎ　Ｃｈｒｌよりも機械的に安定であるので好ましい。

紙片の大きさ及び反応面、或いは斑点又はスポットの配置は自由に選定できる。

免疫学者は８個のスポット用のミクロ点滴板の寸法を優先する。この場合には標 準のミクロ点滴板を選び、その窪みの中心に小さい穴を開けて、一枚の紙片（８ ，５Ｘ　１２゜５　ｃｍ）を裁断してそのスポットの位置に鉛筆で印をつけるた めの見本としてこの標準のミクロ点滴板を使用すればよい。

ペプチドは逐次的に、予め定めた配列に従って、公知の固相ペプチド合成法　（ Ｅ、　Ｗａｎｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｖｌ：　Ｍｅｔ ｈｏｄｅｎ　ｄｅｒ　ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅ＋ｎｉ■A第４版、 １５巻（編集者Ｅ、　Ｍｕｌｌｅｒ）、　Ｔｈｉｅｍｅ、　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ 、　１９７４；　Ｇ、　Ｂａｒａｎｙ、　Ｒ，Ｂ、Ｍｅｒｒ奄■ ｉｅｌｄ　ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、２巻（編集者Ｅ、　Ｇｒｏｓｓ、 　Ｕ、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）、　Ａｃａｄ−ｅｍｉｃ　oｒｅ ｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７０．　ｐ、　１）により表面の官能基の所 で構成される。その操作はＦ＋ｏｏｃ／１Ｂｕ−法（Ｃ，−Ｄ、　Ｃｈａｎｇ、 　Ｕ、　Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏ− ｔｅｉｎ@Ｒｅｓ、　１１゜ ２４６　（１９７８）；　Ｅ、　Ａｔｈｅｒｔｏｎ、　Ｈ，Ｆａｘ、　Ｄ、　Ｈ ａｒｋｉｓｓ、　Ｃ，Ｊ、　Ｌｏｇａｎ、　Ｒ，Ｃ，５ｈｅ垂垂≠窒пB Ｂ、　Ｊ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｊ、　Ｃｈｅａ　Ｓｏｃ、　Ｃｈｅａ　Ｃｏ ｍｕｎ、　５３７　（１９７８））によるのが好ましい。

２０個の必須アミノ酸の他に、任意の修飾したアミノ酸及び人工のアミノ酸を組 み込むことができる。

ペプチドの化学的構成に必要なアミノ酸の構成成分（適当に保護した活性化した アミノ酸誘導体）は、好ましくは沸点の高い蒸発速度の低い適当な溶剤（例えば Ｎ−メチルピロリジノン、沸点２０３℃）の濃縮した溶液（０，１〜０．３Ｍ） として密栓できる小さい容器に収める。

アミノ酸のペプチドへの結合は、Ｃ末端から始めて逐次的に、場合によっては多 くのペプチドに対して平行してそれぞれ同一の２個の反応段階の周期的実施によ って行われる。次にその結合を説明すれば例えば次の通りである。

ｌ）ペプチド化合物の形成二活性化したアミノ酸溶液の１アリコート（０，１− １０μｌ）を平面状担体の予め定めた点又は線の上に滴下する。濡れることによ って加えた容積により限られた大きさの反応面（スポット）が形成される。種々 の多くのペプチドを平行して相当する大きさの一つの担体表面上で合成しようと する場合には、反応面が重なることのないように、間隔を置いて滴下位置を定め る。反応時間は例えば５〜３０分である。続いて担体を適当な密栓できる容器に 収めるか或いは濾過装置の上で例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて 数回洗浄する。滴下位置は担体に印（例えばセルロース紙に鉛筆による印）を付 けて設定できる。指示薬を用いて（例えばブロモフェノールブルー；　Ｖ、Ｋｒ ｃｈｎａｋ、　Ｊ、　Ｖａｇｎｅｒ、　Ｐ、　５ａｆａｒ、　Ｋ　Ｌｅｂｌ。

Ｃｏ１１ｅｃｔ、　Ｃｚｅｃｈ、　ＣｈｅｆｆＬＣｏｗ＋ｕｎ、５３．２５４２ 　（１９８８））反応面上の遊離のアミノ官能基を直接着色することも可能であ り、その場合には印をつける必要はない。

２）　Ｎ末端保護基の分離：このためには担体を分離液で充分処理する。有利な 方法であるＦｅｏｃ／１Ｂｕ−法ではＦｍｏｃ−保護基を例えばピペリジンの２ ０％ＤＭＦ−溶液で分離し、例えば２〜１０分後にＤＭＦで数回洗浄する。場合 によっては次に指示薬溶液により反応面が現れてくるまで処理する。続いて例え ばエタノールで数回洗浄後空気中（場合によっては最高４０℃のヘアドライヤー ）で乾燥する。

全てのペプチド配列が完成したならば、好ましくはＮ末端のアミノ基を例えば無 水酢酸によりアシル化してブロックする。それには担体をアシル化溶液（例えば 無水酢酸５％とジイソプロピルエチルアミン５％とのＤＭＦ−溶液）で処理して からＤＭＦとエタノールで数回洗浄する。

次にアミノ酸側鎖の保護基を（選定した合成方法に相当した）適当な酸処理によ って分離する。それには担体を分離溶液で処理する。Ｆ＋ｎＯＣ／１Ｂｕ−法を 用いた特殊の実施態様によれば（使用したアミノ酸誘導体の次のリスト参照）、 例えば１０分間トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　５０Ｌアニソ一ル５％、チオアニ ソール１％のジクロロメタン溶液で処理する。続いて担体を先ずジクロロメタン 、次にＤＭＦ、更にエタノールで数回洗浄してから空気中で乾燥する。保護基の 分離には又ＴＦＡ５０％、トリイソブチルシラン２％のＤＣＭ−溶液で約６０分 間処理し、続いてＤＣＭＳＤＭＦ、エタノールで洗浄してもよい。

ペプチドはこうして生物学的に使用可能の固定化した基質として調製される。こ こでペプチドを共有結合した担体を全体として例えば試験反応溶液で処理するこ ともでき、或いはシートを切り抜いて個々の反応面を分離し、個別に処理しても よい。

ペプチドを上記のように担体に構成する最も簡単な方法は、相当するＣ末端のア ミノ酸構成成分を安定なアミノ結合又はエステル結合を介して直接担体表面の反 応性官能基に結合する方法である。更に特殊の実施態様によれば、先ず所謂三官 能リンカー試薬（Ｅ、　Ａｔｈｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　ＣｈｅＩＩＬ Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、＋　５３８−５４６　（P９８ １）参照）を担体の官能基に結合する。ここに形成されたペプチドを次にペプチ ド・リンカ−結合の化学的性質に応じて例えば適当な反応条件下でＣ末端のカル ボキシル基又はカルボキシアミド基を用いて分離し、可溶性の形で試験の目的に 使用することができる（不安定なリンカ−り。しかし、リンカ−試薬は又大きな 反応の相手、例えば抗体又は酵素へのペプチドの接近を容易にするためにスペー サー（ｓｐａｃｅｒ）として用いることも可能である（安定なリンカ−り。

紙製担体の使用の場合には２段階に実施する。

第一段階（Ａ）：　先ず再活性化したアミノ官能基を一様に分布する。それには 普通セルロースのヒドロキシル基をＮ−Ｆｍｏｃで保護したアミノ酸誘導体によ りエステル化し、続いてピペリジンの２０％ＤＭＦ−溶液で処理して遊離する。

第二段階（Ｂ）：　もう一つのＮ−Ｆｍｏｃ−アミノ酸を導入したアミノ官能基 に点状又は線状につなげる。次に残りの全てのアミノ官能基をアシル化してブロ ックし、Ｆｍｏｃを分離する。

本発明の範囲内で又両方の誘導体導入の段階にＦｍｏｃ−グリシンも使用された 。しかしＦｍｏｃ−保護解除と暫くの保存の間に恐らくジケトピペラジン生成の 結果として少なくない量のｃｒｙ−ｃｒｙ−アンカーが失われた。更にペプチド のｃｒｙ−ｃｉｙ−末端は抗体の結合を妨げるよってあり、又いくつかの血清は 非特異的にＡｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙに結合するようである。Ｆｍｏｃ−β−Ａｌａ の方が適している。β−アラニンは普通のアミノ酸ではなく、天然のタンパク質 には存在しない。この場合β−Ａｌａ−β−Ａｌａ−アンカーはジケトピペラジ ンを形成せず、スペーサーにより延長されている。β−Ａｌａ−β−Ａｌａのス ポットを設けてＢＰＢで着色した乾燥偏平材料では一２０℃で数箇月保存しても そのアミノ酸官能基の損失は見られなかった。３０℃までの温度での暫くの保存 に対してＦｍｏｃて保護したアンカーは安定である。その説明には図６を参照さ れたい。この図は紙片の上のスポットの典型的な配置（ＢＰＢで着色したβ−Ａ ｌａ−β−Ａｌａ−アンカー）を示す。この寸法はこの場合９６個のスポットの ためのミクロ点滴板に合わせた。

ここで提示した方法は従来の技術（Ｇｅｙｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４；　 Ｆｒａｎｋ　ａｎｄ　Ｋｒａｕｓｅ、ドイツ特許出願Ｐ　３９３５５７２．　ｌ ）に比べて次のような利点を有する。

−極めて簡単な取扱二アミノ酸誘導体を化学的にカップリングしてペプチドを生 成するには、活性化したアミノ酸溶液の少量を表面状担体の上に滴下するだけで よい。

一更に少量の反応容積、例えば０．１〜Ｉμ！、が可能で、高価なアミノ酸誘導 体の使用を更に削減できる。

一セルロース紙又はグラスファイバー紙のような担体は容易に入手又は購入でき る。

−個々のペプチドの合成スケールは、反応性官能基の面積当たりの付着量を変え 得るので、広い範囲内で選定できる。

−ピペット操作の段階を（特に自動操作の場合）非常に迅速に実施できるので、 単位時間当たり更に多くのペプチドを調製することができる。

上記の方法は又相当するやり方をとれば担体に結合した或いは遊離のオリゴヌク レオチドの迅速合成にも適用することができる。オリゴヌクレオチド合成の化学 的機序と経過に就いては例えば欧州特許８４１０００５９．９を参照されたい。

前述の方法は又自動化も可能である。それには、活性化したアミノ酸溶液又はヌ クレオチド溶液のアリコート分取と滴下に対して、又はその他の洗浄溶液と反応 溶液の供給に対して自動ピペット装置が使用できる。その場合平面状担体は適当 な洗浄、濾過装置に取り付ける必要がある。

市販のｘ／ｙ−プログラム可能のＴＬＣ−スポツタ−又はピペット操作ワークス テーションは本発明の方法の自動化に適した装置である。ｌｏｒ＋ｊ’までの容 積を任意の位置に正確にもたらすことが可能で、その際数千のペプチドを１個の 取扱の容易な偏平材料担体の上で合成することができる。それにはＦｏｎｄｏ　 ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２５１．７６７−７７３　（１９９１）の リソグラフィーの技術による二つのオーダーがある。最小の液量（約１０ｎｌ） の場合でも、各ペプチドがｎ−ｆｆｌ０Ｉの量作られるので、分離と詳細なキャ ラクタリゼーションにはその量で充分である。

発明を実施するための最良の形態 実施例１ シトメガロウイルスの３６／４０　Ｋ−タンパク質の免疫原の断片（ＣＭＶ２６ ）の分析。図１＝クローン化した免疫原の断片ＣＭＶ２６　のアミノ酸−次配列 。それから、それぞれ１個のアミノ酸だけずれた、重複したデカペプチド配列が 導かれた。図２Ａ−Ｃ二合成しようとする全てのデカペプチドと割り当てた番号 のリスト及びアミノ酸カップリングを同時に平行して実施するための仕様書。

平面状担体：セルロース紙（Ｔｈａｔｍａｎ　Ｓｈｒ＋又は５４０．イギリス製 ）を５．５刈０．５Ｃ１ｎの寸法に裁断し、その上に鉛筆で１ｃｍの間隔で５０ 個の点の印を付け、この紙片をすり合わせの栓で密閉可能の円筒状のガラス容器 に入れ、Ｆｍｏｃ−グリシン　０．２Ｍ ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＲＬ）　０．３　Ｍジイソプロピルカルボ ジイミド（ＤＩＣＤ）　０．２４　ＭＮ−メチルイミダゾール　（Ｍｅｌｔ）　 ０．２　ＭのＤＭＦ−溶液１Ｍｌ で室温で３時間処理した後、ＤＩｉｌＦ各１０−で３回洗浄した。続いてピペリ ジンの２０％ＤＭＦ−溶液で１０分処理（Ｆｍｏｃ−基の分離）した後、ＤＭＦ 各ｉｏ−で３回、無水エタノール各１０ｗｌ１で２回洗浄し、ヘアドライヤーで 乾燥した。こうしてセルロース紙のヒドロキシル基にエステル化したグリシン（ 遊離のアミノ基）の量は定量の結果０．２〜０．３μｍｏｌ／ｃｍ”であった。

この紙片をガラス又はポリエチレンの平らなシャーレに入れ、Ｆｍｏｃ−グリシ ン０゜３　ＭＳＨＯＢｔ　０．４５　Ｍ、　ＤＩＣＤ　０．３６　ＭのＮ−メチ ルピロリジノン（ＭＰＤ）溶液の各アリコートＬｔｔｌ）を紙片の印を付けた点 に塗布し、シャーレにガラス板をかぶせた。

２０分後紙片をガラスシリンダーに入れてＤ！ｉｌＦ各１ｏＩＩＩ／で３回洗浄 した。続いて紙片に残った、最初のグリシンカップリングの遊離のアミノ基を全 てアシル化でブロックした。それには無水酢酸５％、ジイソプロピルエチルアミ ン５％のＤＭＦ−溶液３−で１０分処理した。続いてＤＭＦ各１０−で３回洗浄 、ピペリジンの２０％ＤＭＦ−溶液で処理、再度ＤＭＦで３回洗浄した。次にブ ロモフェノールブルー（ＢＰＢ）の０．３％ＤＭＦ−溶液３−を加えて、２回目 のグリシンカップリングの反応面を青に着色した。続いてエタノール各ｌＯ−で ２回洗浄し乾燥した。

このように前処理したセルロース平面状担体は印を付けた反応面の所に、ペプチ ドの形成用の遊離の一次のアミノ官能基を有するジグリシンアンカー基を提供す る。

図２Ａに示した４９個のデカペプチドに通し番号を付けて、相当する番号の反応 面に於いて前述のように同時に平行して合成した。活性化したアミノ酸溶液の分 布は図２Ｂと２０とに示したリストを基にして実施した。

合成方法：　Ｆｍｏｃ／１Ｂｕ−法 使用したアミノ酸誘導体： Ｆｏｏｃ　Ａｌａ Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ） Ｆ＋ｎｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｍｏｂ） Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ） Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｂｕｔｔｈｉｏ） Ｆｍｏｃ−Ｇｉｎ（Ｔｍｏｂ） Ｆ＋１１ｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ） Ｆｅｏｃ−Ｇｌｙ Ｆ＋ｏｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｅ）−ＰｆｐＦ加ｃ−１１ｅ Ｆｗｃ−Ｌｅｕ Ｆｅｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏａ） Ｆ＋ｏｏｃ−Ｍｅｔ ＦＩＩＯｃ−Ｐｈｅ Ｆｍｏｃ−Ｐｒ。

ＦＷＩｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ） ＦｌｌｏｃｍＴｈｒ（ｔＢｕ） Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ） Ｆｗｃ−Ｖａｌ アミノ酸側鎖（−）のＣｙｓのＢｕｔｔｈｉｏ以外の全ての保護基はＴＦＡ　２ ０〜５０％のジクロロメタン溶液により分離できる。Ｂｕｔｔｈｉｏ−基はその 後で例えばジチオトレイトール（ＤＴｒ）又はジチオエリトリトール（ＤＴＥ） により除くことができる。

アミノ酸誘導体は標準の方法、例えばｌ−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＨＯＢ ｔ）の１．５倍の過剰量とジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣＤ）の１．２ 倍の過剰量とのＮ−メチルピロリジノン溶液を用いた１時間の処理により活性化 できる。その他の活性化の方法として例えば対称的無水物、ペンタフルオロフェ ノールエステル又はＢＯＰを用いても同様に可能である。予め算定した消費量に 応じて溶液０．２〜ｌ−を作った。アリコートｌμＩを塗布した。ＢＰＢで青色 に染めた反応面が５〜２０分後に黄色に変色したが、これは遊離のアミノ基が完 全に反応したことを示した。Ｆｕ＋ｏｃ−保護基の分離はピペリジンの２０％Ｄ ＭＦ−溶液を用いて５分間実施した。生成したペプチドの末端アセチル化は無水 酢酸５％、ジイソプロピルエチルアミン５％のＤＭＦ−溶液により１０分間で達 成された。アミノ酸側鎖の保護基をＴＦＡ２０％、トリイソブチルシラン１％の ジクロロメタン溶液により２０分で分離した後、担体を各ＩＯ−のジクロロメタ ンで３回、ＤＭＦで３回、エタノールで３回洗浄し、乾燥した。

このペプチドを用いて、例えばラビット血清中の抗ＣＭＶ２６抗体の配列特異性 結合を呈色試験により検出した。

図３＝呈色試験の系統的表示。表面に結合したペプチド（Ｐ）をラビット抗ＣＭ Ｖ　２６血清によりインキュベートし、過剰の血清を洗い流してから、酵素βガ ラクトシダーゼと共有結合したヤギ由来の抗ラビット抗体によりインキュベート する。抗Ｃｌ１ｌＶ２６抗体がペプチドと結合できる場合にのみ第２の抗体を介 して酵素が結合され、この酵素は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β −Ｄ−ガラクトピラノシドの分割の際のその活性によって検出される。その際へ キサシアノ鉄（Ｉ［［）カリウムのような穏やかな酸化剤の存在下で水及びアル コールに不溶の青いインジゴ色素が形成される。

図４＝呈色試験後の偏平なセルロース担体の写真。反応面１１乃至１６及び３１ 乃至３３の箇所のペプチドはポジティブに反応する。

合成洗剤（例えば尿素、ドデシル硫酸ナトリウム、メルカプトエタノール）で担 体を処理すれば、結合した抗体は再び分離し、インジゴ色素はＤＭＦで洗い落と すことができる。その後で固定化したペプチドを備えた担体を再度使用すること ができる。この操作はペプチドが分離又は破壊されるような反応条件に用いられ ない限り、何度でも繰り返すことが可能である。同一の担体てｌＯ回以上抗体結 合試験を実施した後いくつかの反応面を切り取ってペプチドをＮａＯＨＩ　Ｍで 分離した。このＣＭＶ２６−Ｇｌｙ−ｃ＋ｙ−ペプチドはＨＰＬＣ−分析並びに 高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ）によりはっきりと検出された。

実施例２ シトメガロウィルスの３６７４０　Ｋ−タンパク質の同じ免疫原の断片（ＣＭＶ ２６）の分析。

平面状担体ニゲラスファイバー紙（Ｔｈａｔｍａｎ　ＱＭ−んイギリス製）を５ ．５刈０．５ｃｍの寸法に裁断し、その上に鉛筆でそれぞれ１ｃ＋ｎの間隔で５ ０個の点の印を付け、この紙片をすり合わせの栓付きの三角フラスコ（２５０ｄ ）の中で、アミノプロピルトリエトキシシランの２％無水トルエン溶液５０−に より１晩還流冷却器を付けて煮沸した。

その後担体を各１０−のトルエンで３回、アセトンで３回洗浄し、１１０”Ｃで １時間乾燥した。こうして導入されたアミノプロピル基（遊離のアミノ基）の量 は定量の結果３０〜５０ｒ＋＋ｏｏｌ／ｃｍ２であった。

全ての化学的操作を、実施例１で第１のグリシンカップリングの後のセルロース 紙に対して記述したのと全く同じように実施した。抗体結合試験の結果は同一で あった。

実施例１及び２は、本出願の方法により調製された、結合したペプチドを備えた 偏平材料に対して一つの重要な応用の可能性を実証する。即ちこの材料は、人間 医学及び獣医学の分野に於いて細菌及びウィルスの感染を非常に特異的に検出す るための診断の目的に用いることができる。そのような感染は、罹った生物体の 免疫反応によってウィルス又は細菌のタンパク質に対する抗体の形成を引き起こ す。ウィルス又は細菌に特異性のあるペプチドにより血清中のそのような抗体を 検出し、それによって病原体の種類と亜綱とを決定することが可能になる。この 特異性のあるペプチドの発見に対しても、（実施例で示したように）偏平材料に 結合した一連のペプチドを調製し試験することにより、この同じ方法が使用でき る。

実施例３ ＣＭＶ２６に関連のある４個のオリゴペプチドを、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−誘 導体を備えた紙製担体の上のスポットで合成し、ジケトピペラジンの形成により これらを担体から分離した。詳細を図５Ａ−Ｂ及び表１に示す。ここで図５Ａ： 粗ペプチドの）！ＰＬＣのトレース、図５Ｂ＝ペプチド１５の高速原子衝撃質量 分析（陽イオンベース）、１４　Ａｃ−Ｇ−Ｇ−５−Ｌ−３−３−ＤＫＰ　７５ ５．４　７５６．４　−　２．８８１．９８　−　１．０Ｏｘｘ　６６１５　Ａ ｃ−Ｇ−３−Ｌ−３−３−Ｌ−ＤＫＰ　８１１．４　８１２．４　−　２．９０ ０．９７　−　２．０ＯＸＸ　５２１６　Ａｃ−３−Ｌ−３−Ｓ−Ｌ−Ａ−ＤＫ Ｐ　８２５．４　８２６．４　−　２．９０　−　０．９９２．０Ｏｘｘ　５４ １７　Ａｃ−Ｌ−３−５−Ｌ−Ａ−Ｎ−ＤＫＰ　８５２．４　８５３．４　０， ８９１．９８　−　１．００２．００ＸＸ　５７ＲＡｃ−ＤＫＰ　２６８．２２ ６７．２　−　−　−　−　−　ｘｘ約７５（ａ）　Ａｃ−ＤＫＰは高速原子衝 撃質量分析では陰イオンベースで［Ｍ−８１−としてのみ測定実施例４ プロピレン製チップを備えた普通のミクロピペットを用いて０．１μｌ迄の容積 を手で滴下した。２種類の材質の紙を使用した場合の典型的な測定データの一部 を表２に示す。

実施例５ 一般式ＮｚｐＮ＋の１６個のジヌクレオシドモノリン酸の全てを調製した。その 際化学的機序に関しては、欧州特許８４１０００５９．９並びにＦｒａｎｋ　ｅ ｔ　ａｌ、　ｉｎ　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　１１　（１９８３ ）　４３６５−４３７７に準拠した。又使用した担体は実施例１によったが、細 部に就いては次の点を挙げておく。

平面状担体としては、実施例１のジ−β−Ａｌミーアンカーを備えたＴｈａｔｍ ａｎ　５４０紙片を用いる。最初の開始構成成分Ｎ１としてそれぞれ５°−Ｄ！ ＪＴｒ−ヌクレオシド−３゛−コハク酸（ＮＭＰ溶液）を使用し、実施例１にな らって滴下によりアミノアンカーにカップリングする（ＤＩＣＤとＨＯＢｔ使用 ）。これらのコハク酸塩は不安定なリンカ−の−例である。続いて引用した従来 の技術により公知のキャップ形成を行う。

ＤＭＴｒ基はジクロロ酢酸の３ｘジクロロメタン溶液により分離できる。カップ リングには第２の構成成分Ｎ２ｐとして５°−ＤＩＪＴｒ−ヌクレオシド−３′ −〇−リン酸クロロフェニルを（ＭＳＮＴのピリジン溶液と併用）、空気中の湿 度を避けるためにアルゴン雰囲気中で滴下する。ＤＭＴｒ基を前述のように分離 する。

得られたスポットを打ち抜き、それぞれ３０％のアンモニア水で処理し、その上 清を反応生成物（ジヌクレオシドモノリン酸）に就いて、高速原子衝撃質量分析 によりＧｒＯＬｊａｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、、　１０　（１９８２）　４６７１−４６７８に準じて調べ驕B ７１　イ 図２ム 入バコ〜１２６ＰＰＰ 図２ｉ 図２ム ：Ａｐ１ｇ＞〕６＞Ｌｌｌ／ＬＬ３５ＨＨｆ−ＬＫＨ乙−６コ゛ｋｌ！ＩＮ−２ ７Ｐ−１Ｃｙｃｌｅ　Ｏ Ｇ：　ｌ　２　３　４　５　６１５　１６２１　２３３４３６３７３９４０４１ ．４２４コ　４４ＩｖＩ　三 ”ｘｌ　Ｌ　２３　２４　２５　２６　２７　２＋１　２９　３０国際調査報告 １ｍｅｎｗｌｌｏ−＾ｕｋ−１’＝−Ｎ−，ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０１５２９国 際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／Ｃ０７Ｋ　７１０６ 　ＺＮＡ　Ｚ　８３１８−４Ｈ７１０８７５３７−４Ｈ ７／１０　７５３７−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１５／１０ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、 ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ、　 ＥＳ。

Ｆ　Ｉ、　ＧＢ、　ＨＵ、Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＣ，Ｍ Ｇ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎ０９Ｒ○、Ｒ○、　ＳＤ、ＳＥ、ＳＵ、　ＵＳ Ｉ （７２）発明者　ギーラー、シナン ドイツ連邦共和国　デー−３３００ブラウンシュヴアイク、マシエローデル・ヴ エーク

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．一種又は数種の官能基を付与した担体から始めて、与えられたアミノ酸配列 に応じて逐次的に所要のペプチドを適当な合成方法によって合成する、担体に結 合した又は遊離のペプチド類を迅速に合成する方法に於いて、−担体として偏平 材料を使用し、 −カップリングのために、活性化した誘導体の形の所要のアミノ酸又は所要のジ ペプチド又はオリゴペプチドの溶液の少量のアリコートを平面状担体の上に点状 又は線状に塗布し、 −濡れることにより生成した反応面の中でカップリング反応を実施し、−必要に 応じて生成したペプチドを適当な分離剤を用いて平面状担体から分離することを 特徴とする前記方法。
2. ２．数種乃至非常に多種の異なるペプチドを一つの偏平材料の上で同時に並べて 、相互に接触しない点状又は線状の反応平面上で合成することを特徴とする請求 項１の方法。
3. ３．偏平材料としてアミノ酸又はペプチドのカップリングに適した化学反応性官 能基を有する多孔性又は非多孔性フィルム、メンブラン、又はそのような紙を使 用することを特徴とする請求項１又は２の方法。
4. ４．前記偏平材料がセルロース、ガラス又は有機のポリマーから成り、その表面 が適した化学的官能基を備えていることを特徴とする請求項３の方法。
5. ５．前記表面への官能基の付与をアミノプロピル基、グリシン又はジグリシンの アンカー基の導入によって実施することを特徴とする請求項３又は４の方法。
6. ６．合成しようとするペプチドを、（ａ）Ｃ末端を直接前記偏平材料と結合する か或いは（ｂ）前記偏平材料と一種のリンカーを介して結合して構成することを 特徴とする請求項４又は５の方法。
7. ７．反応性官能基の面積当たりの付着量が１ｐｍｏｌ〜１μｍｏｌ／ｃｍ２であ ることを特徴とする前記請求項の何れか１項の方法。
8. ８．一種又は数種の官能基を付与した担体から始めて、与えられたヌクレオチド 配列に応じて逐次的に所要のオリゴヌクレオチドを適当な合成方法によって合成 する、担体に結合した又は遊離のオリゴヌクレオチド類を迅速に合成する方法に 於いて、 −担体として偏平材料を使用し、 −カップリングのために、活性化した誘導体の形の所要のヌクレオチド又は所要 のジヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの溶液の少量のアリコートを平面状担 体の上に点状又は線状に塗布し、 −濡れることにより生成した反応面の中でカップリング反応を実施し、−必要に 応じて生成したオリゴヌクレオチドを適当な分離剤を用いて平面状担体から分離 する ことを特徴とする前記方法。
9. ９．数種乃至非常に多種の異なるオリゴヌクレオチドを一つの偏平材料の上で同 時に並べて、相互に接触しない点状又は線状の反応平面上で合成することを特徴 とする請求項８の方法。
10. １０．偏平材料としてヌクレオチドのカップリングに適した化学反応性官能基を 有する多孔性又は非多孔性フィルム、メンブラン、又はそのような紙を使用する ことを特徴とする請求項８又は９の方法。
11. １１．請求項４、５又は７の対策を使用することを特徴とする請求項８、９又は １０の方法。
12. １２．合成しようとするオリゴヌクレオチドを、（ａ）３′末端を直接前記偏平 材料と結合するか或いは（ｂ）前記偏平材料と一種のリンカーを介して結合して 構成することを特徴とする請求項１１の方法。
13. １３．平面状担体を備えた１個の自動ピペット操作装置を特徴とする請求項１又 は８の方法を実施するための装置。
14. １４．請求項１乃至７の何れか１項により調製されたペプチド類を結合した偏平 材料。
15. １５．請求項８乃至１２の何れか１項により調製されたオリゴヌクレオチド類を 結合した偏平材料。
16. １６．微生物学的目的、特に人間医学又は獣医学に於いて細菌又はウイルスの感 染を特異的に検出するための診断の目的への請求項１４の偏平材料の使用。
17. １７．雑種形成の目的への請求項１５の偏平材料の使用。