DE19943743C2

DE19943743C2 - Verfahren zur Identifizierung von Bindungspartnern mit positions-spezifischen Arrays

Info

Publication number: DE19943743C2
Application number: DE19943743A
Authority: DE
Inventors: Eberhard Krause; Jens Schneider-Mergener; Thomas Bittorf
Original assignee: JERINI BIOTOOLS GmbH
Current assignee: Jerini AG
Priority date: 1999-09-03
Filing date: 1999-09-03
Publication date: 2002-02-07
Anticipated expiration: 2019-09-04
Also published as: WO2001018545A2; AU7644200A; DE19943743A1; EP1212622A2; WO2001018545A3; DE10082703D2; CZ2002660A3; JP2003511652A; CA2386607A1; PL353995A1; HUP0203074A2

Abstract

Beschrieben ist ein Verfahren zur massenspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positionsspezifischen Arrays, wobei man DOLLAR A auf ein Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionsspezifisches Ligat-Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt, DOLLAR A das auf dem Trägermaterial fixierte positionsspezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Liganden inkubiert, anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Liganden entfernt und DOLLAR A der/die an das Ligat-Array gebundene/n Ligand/en weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mas senspektrometrischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positions-spezifischen Arrays.

Mit der fortschreitenden Entschlüsselung des menschlichen Genoms wird es mehr und mehr offensichtlich, daß die Funktion von Genen sowie das Verhalten von Genprodukten sehr schwierig oder in den meisten Fällen unmöglich vor herzusagen ist. Aus diesem Grund wird es immer wichtiger, Verfahren zu entwickeln, um die Funktion von Genen zu er mitteln. Die Funktion setzt sich dabei im wesentlichen aus dem dynamischen Auftreten und Verschwinden der Pro teine und ihre Interaktion mit Liganden zusammen, die in der Mehrzahl ebenfalls Proteine darstellen. Die Regulati on der Funktion von Proteinen ist ein extrem komplizier ter Prozeß, der auf verschiedenen Ebenen beeinflußt wird, so z. B. durch posttranslationale Modifikationen, ihre Halbwertszeiten, Kompartimentierung, aber auch dynami schen Veränderungen der Tertiärstruktur. Die Untersuchung der Funktion und der Interaktionen aller Proteine inner halb einer Zelle wird "Proteomics" genannt (Dove A.: Proteomics: translation genomics into products? In: Nature Biotechnology 1999 März, 17, S. 233-236; Hochstrasser D. F.: Proteome in perspective. In: Clin Chem Lab Med 1998 November, 36 (11), S. 825-836), die Gesamtheit aller Proteine einer Zelle wird als "Proteom" bezeichnet. Dieses Forschungsge biet wird einen enormen Einfluß auf die Identifizierung von Wirkstoffzielen, Wirkstoffzuschnitt und Wirkstoffent deckung haben.

Die zur Darstellung des Proteoms einer Zelle derzeit fast ausschließlich verwendete Methode ist die zweidimensiona le Polyacrylamid-Gelelektrophorese (2D-PAGE). Die Protei ne werden in der ersten Dimension durch eine isoelektri sche Fokussierung getrennt. Eine dazu orthogonal ausgeführte SDS-Elektrophorese bildet die zweite Dimension. Diese Methode ermöglicht heute die Analyse tausender Pro teine aus einem zweidimensionalen Gel innerhalb einiger Tage. Inzwischen ist man sich jedoch der Tatsache bewußt, daß es schwierig ist, mehr als 50 bis 60 Prozent eines Proteoms auf einem einzelnen 2D-Gel aufzutrennen, was an den sehr unterschiedlichen chemischen und physikalischen Eigenschaften der zellulären Proteine liegt. Des weiteren kommen die meisten zellulären Proteine in sehr geringen Mengen in der Zelle vor.

Zu einer weiteren Analyse wird das im 2D-Gel aufgetrennte und als Bande oder Spot isolierte Protein vor seiner Elu tion aus der Matrix meist proteolytisch verdaut. Dazu muß die Matrix des Gels geschrumpft werden und die Bedingun gen im Gel für den Verdau geeignet sein. Der Verdau dau ert zudem mehrere Stunden.

Blüggel und Immler (Biospektrum 5/98, S. 39-44) beschrei ben im Anschluß an die oben genannten Verfahrensschritte eine weitere Charakterisierung von Peptid Fragmentspek tren mittels Massenspektrometrie. Diese nur für die Ana lyse eines einzelnen Proteinspots geeignete Methode ist jedoch sehr umständlich und immer noch weit von den für die effektive Analyse geforderten Automatisierungsgraden entfernt.

Ein Schlüsselaspekt bei Proteomics und Wirkstoffindung ist die Identifizierung von Signalkaskaden (pathways) in Zusammenhang mit Rezeptor-Ligand-Interaktion-vermittelter Stimulierung von Zellen. Diese Signalkaskaden beinhalten Kaskaden von Protein-Protein-Interaktionen, die lediglich nichtkovalente physikalische Interaktionen von Netzwerk proteinen, aber auch Kontakte enzymatischen Typs, wie Phosphorylierung, Dephosphorylierung oder proteolytische Interaktionen sein können.

Die im Augenblick vorhandene Methode der Wahl zur Identi fizierung von zellulären interagierenden Partnern ist das "two-hybrid" Screeningsystem in Hefe (z. B. Colas und Brent, TIBTECH 1998, 16 S. 355-363). Dieser in vitro An satz führt jedoch oftmals zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen.

Die US 5,821,047 beschreibt einen weiteren aktuellen An satz zur Identifizierung von zellulären interagierenden Partnern, das sogenannte "phage display". Das Verfahren umfaßt die Fusion eines zu untersuchenden Proteins an die carboxyterminale Domäne des Gen III coat Proteins des fi lamentösen Phagen M13. Mit diesem auf der Oberfläche des Phagen M13 präsentierten Fusionsprotein wird dann nach neuen Liganden des zu untersuchenden Proteins gescreent.

Eine weitere interessante und sich verbreitende Technik ist die Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biomolekular-Interaktionsanalyse Massenspektrometrie (BIA/MS) (Nelson R. W. und Krone J. R.: Advances in surface plasmon resonance biomolecular interaction analysis mass spectrometry (BIA/MS). In: J Mol Recognit 1999 März-April, 12 (2), S. 77-93). Es bleibt abzuwarten, wie sich dieser Ansatz im Hinblick auf Signifikanz der Daten als auch auf nötige Automatisierung als praktikabel erweisen wird.

Dazu werden auf Cellulosemembranen mit der sogenannten "Spot-Synthesetechnik" synthetisierte Peptide verwendet, um molekulare Erkennungsereignisse zu untersuchen.

Alle oben beschriebenen Verfahren zur Analyse des Pro teoms und der Untersuchung im Bereich der Proteomics wei sen erhebliche Nachteile auf. Sie sind experimentell auf wendig und zeitintensiv und erfassen bei der Analyse nicht alle Proteine einer Zelle auf einmal. Die 2D-PAGE ist zudem für viele Proteine nicht sensitiv genug und für die Proteomics-Analyse ungeeignet, da sie keine Interak tionen von Proteinen einer Zelle erfassen kann.

Alle vorgenannten Verfahren und Methoden sind zudem für eine in der Wirkstoff-Entwicklung mehr und mehr gefragte Automatisierung ungeeignet.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Ver fahren zur Identifizierung von zellulären interagierenden Partnern für die Proteom-Analyse zur Verfügung zu stel len, das eine schnelle, preiswerte und zuverlässige Ana lysemethode zur Identifizierung von zellulären interagie renden Partnern darstellt und sich ohne große Probleme automatisieren läßt.

Diese Aufgabe wird durch die in Anspruch 1 angegebenen Merkmale gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur massenspektrome trischen Identifizierung von Bindungspartnern mit positi onsspezifischen Arrays, wird auf ein Trägermaterial mit tels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionspezifischer Ligat- Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt. Das auf dem Trägermaterial fixierte positions-spezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Liganden inkubiert, anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Liganden entfernt und der/die an das Ligat-Array gebundene/n Ligand/en weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert.

Überraschenderweise konnte gefunden werden, daß die Kom bination von Inkubation eines Liganden-Gemisches mit ei nem auf einem Träger gebundenen positions-spezifischen Array und anschließender Analyse der gebundenen Proteine mittels Massenspektrometrie die oben genannten Probleme des Standes der Technik vermeidet und eine preiswerte, schnelle, robuste und zuverlässige Methode zur Proteom-Analyse darstellt. Weiterhin kann dieses Verfahren ohne große Probleme vollständig automatisiert werden, so daß eine hoher Probendurchsatz bei geringen Kosten gewährlei stet ist.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, daß das Ligat-Array ein Peptidarray, Array aus Nucleinsäuren oder anderen organochemischen Verbindungen oder über Fragmentkondensation von Peptiden erhaltenes Proteinarray ist. Es ist insbesondere bevorzugt, daß das Gemisch von Liganden ein Zelllysat, Gemisch von Nucleinsäuren oder Gemisch von anderen organochemischen Verbindungen ist.

Es werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst aufwendige Aufbereitungsschritte der aufgeschlossenen Zellen vermieden, da in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens alle Proteine einer Zel le ohne Reinigung auf einmal analysiert werden können. Die Verwendung von positions-spezifischen Arrays erlaubt zudem eine Standardisierung des Verfahrens. Das für das Verfahren verwendete Trägermaterial für das Peptidarray kann fest oder flexibel sein und besteht bevorzugterweise aus Harzbeads, Polymerpins oder Chipmaterial. Besonders bevorzugt ist es, wenn das verwendete Trägermaterial aus einer Polymermembran besteht, wie zum Beispiel einer Ny lon-, Cellulose- oder modifizierten Cellulose oder modi fizierten Polypropylenmembran.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Zelllysat normalerweise ein Vollzelllysat verwendet, es kann jedoch auch ein durch Zentrifugation, Filtration oder andere geeignete Verfahren vorfraktioniertes Voll zelllysat verwendet werden. Das Zelllysat kann ein Lysat aus prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen sein, es können auch transformierte oder transgene Zellen verwen det werden.

Besonders bevorzugt ist es, wenn als Zelllysat ein ³⁵S-Methionin-markiertes oder ³⁵S-Cystein-markiertes Lysat verwendet wird.

Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver fahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das Zelllysat zu sammen mit mindestens einem definierten Cofaktor verwen det wird. Als Cofaktoren können zum Beispiel Proteine oder Metallionen verwendet werden.

Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray ver wendeten Peptide zwischen 3 und 30 Aminosäuren lang sind. Bevorzugt sind Peptide zwischen 6 und 15 Aminosäuren Län ge, besonders bevorzugt sind Peptide von 13 Aminosäuren Länge. Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemäße Aus führungsform, bei der die für das Peptidarray verwendeten Peptide über einen Linker an das Trägermaterial fixiert sind. Dieser Linker kann Protease-sensitiv oder chemisch spaltbar sein.

Ein weiteres bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Peptidarray ein SPOT-Peptidarray ist.

Nicht an das Peptidarray gebundenes Protein kann erfin dungsgemäß mittels Waschen mit einem Puffer oder durch Fällung entfernt werden.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e vor der Proteasebehandlung vom Trä germaterial gelöst und anschließend einer Gelelektropho rese unterzogen wird/werden.

Die Charakterisierung der Protease-behandelten Proteine oder der Liganden oder abgespaltenen Liganden erfolgt er findungsgemäß mittels Massenspektrometrie, bevorzugt mit tels MALDI oder ESI Massenspektrometrie, ganz besonders bevorzugt mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tatsache, daß sich alle Schritte der Proteomics-Analyse vollständig automatisieren lassen.

Die SPOT-Synthese (R. Frank, Tetrahedron 1992, 48, 9217-9232, DE-OS 40 27 675) ist eine etablierte Methode zur ortsadressierten Synthese von Peptiden und deren Scree ning auf Bindung zu Proteinen (A. Kramer, J. Schneider-Mergener, Meth. Mol. Biol. 1998, 87, 25-39, A. Kramer, A. Schuster, U. Reineke, J. Schneider-Mergener, METHODS (Comp. Meth. Enzymol.) 1994, 6, 388-395.). Neben Peptiden sind auf diese Weise auch andere Verbindungsklassen wie z. B. Peptoide (T. Ast, N. Heine, L. Germeroth, J. Schnei der-Mergener, H. Wenschuh, Tetrahedron Lett. 1999, 40, 4317-4318) zugänglich.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit den unterschied lichsten Ligaten anwendbar. Geeignete Ligate, welche sich zu den erfindungsgemäßen positionsspezifischen Ligat-Arrays aufbauen lassen, sind beispielsweise, ohne auf diese beschränkt zu sein, Peptide, β- und γ-Peptide, Pep toide, (Oligo-)Harnstoffe, (Oligo-)Thioharnstoffe, (Oligo-)Carbamate, (Oligo-)Carbonate, Triazine, (Oligo-)Sulfonamide, Azatide sowie Glyco-Konjugate der vorgenannten Verbindungen, (Oligo-)Saccharide, PNA (Peptide-Nulceic-Acid), Hydantoine, 2-Piperazone, Isochinoline, Benzodiazepine, pharmakologisch aktive Ver bindungen und Wirkstoffe (beispielsweise Antidepressiva, β-Blocker, cardiovascular aktive Verbindungen, Antarrhythmika, Antihistaminika, Tranquilantien, H₂-Blocker, Acidose-Therapeutika, Aminoglycosid-Antibiotika, Amoebicide, Anästhetika, Analgetica, Androgene, Antacida, Anthelmintica, Antiallergika, Antiandrogene, Antibiotika, Anticholinergika, Anticoagulantien, Anticonvulsiva, Anti dote, Antiemetica, Antifibrinolytika, Antihypertensiva, Antihypertonica, Antihypotonica, Antimalariamittel, An timycotica, Antiparkinson-Mittel, Antiphlogistika, Antip soriatica, Antipyretica, Antirhematica, Antiscabiasa, An tiseborrhoica, Antiseptica, Antitumormittel, Antitussiva, Atemanaleptika, Bronchiolytika, Calciumantagonisten, Car diotonica, Cerebrotonica, Chemotherapeutica, Cholesterin senker, Cytostatika, Dehydropeptidase-Inhibitoren, Des infizentia, Diagnostika, Diuretica, Expektorantien, Fi brinolytika, Fungicide, Gestagene, Glucocorticoide, Gona dorelin (LH-RH)-Agonisten, Hypnotica, Immunstimulantien, Immunsuppressiva, Keratolytika, β-Lactamase-Inhibitoren, Laxativa, Lebertherapeutika, Lichtschutzmittel, Lipidsen ker, LipolyseInhibitoren, Lipotropica, Lokalanästhetika, Malariamittel, Miotica, Muskelrelaxantien, Mydriatica, Neuroleptika, Neurotropica, Ophthalmologika, Parasympa thicomimetika, Prostatatherapeutika, Protelytika, Phy chotropika, Rhinologika, Röntgenkontrstmittel, Sedativa, Spasmolytika, Spermatocide, Sympathicomimetika, Throm bocyten-Aggregationshemmer, Trypsin-Inhibitoren, Tuberku lostatika, Ulcustherapeutika, Vasoconstrictoren, Vasodi latatoren, Venemittel, Virustatica, Vitamine) oder Natur stoffe (beispielsweise Steroide, Terpene, Alkaloide, Fla vonoide, Fettsäuren, Lipide, Pheromone, Riechstoffe, An tikörper, Hormone, Gifte, Abwehr-, Signal- und Wuchsstof fe, Enzyme) und andere als die oben genannten organoche mischen Verbindungen.

Die Erfindung soll anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben werden.

Dabei zeigt Fig. 1, daß ³⁵S-markierte Proteine an immo bilisierte Peptide binden, welche die intrazelluläre EPOR-Domäne repräsentieren. Cellulose-gebundene überlap pende Peptide (13mere, 10 Aminosäuren Überlappung), die die gesamte intrazelluläre Domäne des EPOR abdecken (Peptid Nummer 1 repräsentiert Aminosäuren 248-260, Num mer 2 Aminosäuren 251-263 usw. für Sequenzinformation siehe Fig. 3), wurden mit Lysaten von EPO stimulierten (A) oder unbehandelten (B) J2E erythroleukämischen Zellen nach Markierung mit ³⁵S-Methionin/Cystein inkubiert. Ge bundene Proteine wurden durch Autoradiographie detek tiert.

Fig. 2 zeigt eine in vitro Translation von cDNA's, die für verschiedene Signalmoleküle kodieren. Die cDNA's wur den subkloniert und einer in vitro Translation unter der Verwendung von T7 und T3 Polymerase wie beschrieben un terzogen (eine von beiden Reaktionen diente als interne Kontrolle). Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde mit tels PAGE getrennt. Radioaktive Proteine wurden durch Au toradiographie nach fluorographischer Verstärkung detek tiert. Das Molekulargewicht ist auf der rechten Seite an gegeben (in kDa).

Fig. 3 zeigt ein Bindungsmuster von JAK2, SHP1 und PLCγ an immobolisierte Peptide der EPOR-Sequenz. (A) Sequenzen von Cellulose-gebundenen überlappenden Peptiden. (B) Ra dioaktiv markierte Proteine wurden mit den immobilisier ten Peptiden wie beschrieben inkubiert und durch Autora diographie sichtbar gemacht. (C) Die Sequenz der gesamten intrazellulären Domäne ist gezeigt und Regionen mit den stärksten radioaktiven Signalen sind für die entsprechen den angegebenen Proteine mit Kästen markiert.

Fig. 4 zeigt ein MALDI Mass Fingerprint des Spots E2 (Thyrosin-Protein-Kinase JAK3).

Fig. 5 zeigt die MS-Fit-Rechnung des Spots E2 aus Fig. 4 dar

Fig. 6 zeigt die ³⁵S-Aktivität nach Inkubation einer Bi bliothek aus 1600 Dipeptoiden mit ³⁵S-Methionin markier tem Zell-Lysat.

Identifizierung von Bindungspartnern des Erythropoetin-Rezeptors mit positions-spezifischen Peptidarrays und Massenspektrometrie

Um potentielle intrazellulär interagierende Partner des Erythropoetin Rezeptors (EPOR) zu identifizieren, wurden Zelllysate von Erythropoetin (EPO) stimulierten und nicht-stimulierten Zellen mit Cellulosemembran-gebundenen EPOR-spezifischen Peptidscans inkubiert, der Proteinge halt verschiedener ausgewählter Spots einer Gelelektro phorese unterzogen und distinkte Banden mittels Massen spektrometrie analysiert.

In früheren Experimenten konnte gezeigt werden, daß Inku bation eines Sets von an eine Cellulosemembran gebundenen überlappenden Peptiden, die vom cytoplasmatischen Teil des 55 kDa Tumor-Nekrosisfaktor Rezeptor (TNF-R55) stamm ten, mit einem ³⁵S-Methionin markierten Jurkat Zelllysat zu einer Bindung von zellulären Proteinen an distinkte Spots des TNF-R Scans führte. Die durch diesen Ansatz hervorgehobenen TNF-R Regionen entsprachen exakt den vor her als für die verschiedenen biologischen Funktionen dieses Rezeptors verantwortlich beschriebenen intrazellu lären TNF-R Regionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß ein durch das Hefe "two-hybrid" System neu entdecktes Protein FAN spezifisch mit distinkten Spots des TNF-R Scans interagierte, der einer Region entsprach, die für die Aktivierung der neutralen Sphingomyelinase bekannt ist. Die Verwendung der zwei Techniken führte deshalb zu einer relativ schnellen Identifizierung eines neuen an der TNF Signalkaskade beteiligten Proteins. Dennoch war dieser Prozeß relativ arbeitsaufwendig, da eine große Zahl von durch das "two-hybrid" System erhaltenen cDNA Klonen (< 50) auf eine Bindung an eine bestimmte Region des Rezeptors hin zu charakterisieren waren.

Um einen direkteren Weg zur Identifizierung von intera gierenden Partnern in der zellulären Signalkaskade unter Umgehung des Hefe "two-hybrid" Systems zu untersuchen, wurde versucht, Proteine direkt von den Spots zu erhalten und diese sie durch tryptischen Verdau, Massenspektrome trie und Datenbankanalyse zu analysieren. Um diesen neuen experimentellen Ansatz zu testen, wurde in diesem Fall ein Cellulosemembran-gebundener von EPO-R stammender Pep tidscan synthetisiert, der dann mit EPO-ansprechenden J2E Erythroleukämischen Zelllysaten inkubiert wurde, die mit ³⁵S-Methionin/Cystein markiert waren (siehe Fig. 1). Es konnte eine Bindung an distinkte Rezeptor-spezifische Spots beobachtet werden. Überraschenderweise gab es einen klaren Unterschied in der Bindung bei der Verwendung ei nes Lysats einer mit EPO stimulierten J2E Zelle.

Die intrazellulären Domänen der Cytokinrezeptoren sind bekannterweise aus strukturellen Modulen für die Bindung von spezifischen zellulären Signalproteinen zusammenge setzt. Es wird vermutet, daß die Fähigkeit, mit bestimm ten Targets zu interagieren, Kompetenz und Spezifität bei der Regulation der Genexpression bewirkt. Um eine neue Strategie zur Analyse der Interaktionen zwischen zellulä ren Proteinen und Peptiden, welche die intrazelluläre Do mäne des EPO Rezeptors repräsentieren, zu untersuchen, wurden durch die Spot-Synthese hergestellte Cellulose-gebundene Peptide angewendet. Zelluläre Proteine der Erythroleukämischen EPO-ansprechenden Zellinie J2E wurden in vivo durch die Inkorporation von ³⁵S-Aminosäuren mar kiert und wie beschrieben mit den immobilisierten Pepti den inkubiert. Fig. 1 zeigt die Bindungsmuster von Zell lysaten aus mit EPO stimulierten oder unbehandelten Zel len. Es konnten starke Protein/Peptid Interaktionen hauptsächslich mit Peptiden beobachtet werden, die der proximalen Membranregion des EPOR entsprachen. Die Stimu lierung mit EPO erhöht offensichtlich die Affinität eini ger Proteine zu bestimmten Peptiden, hingegen bleibt die Mehrheit der Interaktionen unverändert.

Um die Bindungseigenschaften einzelner Proteine zu unter suchen, für die bekannt war, daß sie mit dem EPOR intera gieren, wurde eine Auswahl von in vitro translatierten Proteinen in demselben System verwendet. Das Vorhanden sein und Reinheit von einzelnen radioaktiven Proteinen der erwarteten Größe wurde durch PAGE überprüft (Fig. 2). Nachfolgende Versuche wurden unter der Verwendung von Präparationen durchgeführt, die eine radioaktiv markierte Proteinspezies enthalten um sicherzustellen, daß alle ge fundenen Interaktionen spezifisch sind.

Das Bindungsmuster von drei Signalmolekülen, die bekann termaßen am EPOR-Komplex beteiligt sind, ist in Fig. 3 dargestellt. Die markierten Proteine interagieren spezi fisch mit den von EPOR stammenden Peptiden. JAK2 wird als die entscheidende Kinase betrachtet, die EPOR-induzierte Signalaktivitäten vermittelt und für das Fehlen jeglicher intrinsischer Enzymaktivitäten in der intrazellulären Do mäne substituiert. JAK2 bindet vornehmlich an die sehr Membran-proximalen Aminosäuren und zusätzlich an Peptide, die einer distalen Region des Rezeptors entsprechen.

Die Membran-proximale Bindung stimmt mit den Daten über EPOR-Mutanten überein, die wiederholt gezeigt haben, daß JAK2 mit stark carboxyterminal trunkierten Rezeptorformen Immunopräzipitiert. Zusätzlich beseitigen Mutationen in der Region nahe der Membran die JAK2-Bindung und -Funktion gleichermaßen. Eine zweite Interaktionsstelle wurde in einem mehr distalen Teil des Rezeptors identifi ziert. Interessanterweise bindet SHP1, eine Tyrosinphos phatase, die bekannterweise funktionell an der EPO-induzierten Signalkaskade beteiligt ist, mit hoher Affi nität an dieselben Peptide, die Aminosäuren 386-398 und ebenso an die proximale Membran-Aminosäuresequenz wie für JAK2. Es wurde früher gezeigt, daß die Phosphatase, wel che die SH2-Domäne enthält, an das Phosphotyrosin 429 im carboxyterminalen Teil des aktivierten Rezeptors bindet. Die hier vorgelegten Ergebnisse wurden mit unphosphory lierten Peptiden erhalten, obwohl eine Phosphorylierung durch eine Kinase, die in dem für die in vitro Translati on verwendeten Reticulocytenlysat vorliegen könnte nicht vollständig auszuschließen ist. Das Bindungsmuster zeigt, daß vielleicht zusätzliche Interaktionen unabhängig von einer Phosphorylierung existieren. JAK2 und SHP1 wurden als funktional zusammenhängend beschrieben und interagie ren ebenso in in-vitro Experimenten. Wie oben genannt, enthält das für die in vitro Translation verwendete Lysat zusätzliche nichtradioaktive Proteine, die in der Bin dungsreaktion stören können. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, daß JAK2 an die bevorzugte SHP1 Stelle bindet und umgekehrt. Wenn Bindung von "kaltem" JAK2 und SHP1 an die Peptide annehmen, kann radioaktives Jak2 und SHP1 wechselwirken und dadurch indirekt an die Peptide gebun den werden. Die genaue Stelle der Interaktion für PLCγ und den EPOR ist bisher noch nicht beschrieben. Ob PLCγ-Bindung eine Bindung an spezifische Tyrosine innerhalb des EPOR benötigt, bleibt festzustellen. Unsere Daten deuten auf eine Bindungsdomäne in der Nähe des C-Terminus hin, die möglicherweise zu der vorgeschlagenen SH2-Phosphotyrosin Interaktion führt.

Um den oben beschriebenen Ansatz weiter zu vertiefen, wurde untersucht, ob es möglich ist, Proteine zu identi fizieren, die an Peptide gebunden sind, welche von der Rezeptorsequenz stammen. Dazu wurden Peptide verwendet, die eine starke Interaktion mit zellulären Proteinen zeigten, mit Zelllysaten inkubiert und die Proteine nach ausgiebigem Waschen wie beschrieben eluiert. Nach Tren nung auf Acrylamid wurden diese Proteine gefärbt, in-Gel enzymatisch verdaut, die Fragmente isoliert und einer Massenspektrometrie unterzogen. Die Reinheit und Menge der in den Gelbanden vorhandenen Proteine war für absolut ausreichend, um die aus den Peptidspots erhaltene Pro teinspezies über Peptid Mass Fingerprints zu identifizie ren. Einige dieser Proteine sind für Funktionen in Zusam menhang mit EPOR nicht beschrieben. Zum Beispiel wurde die Janus Kinase JAK3, von der bekannt ist, daß sie an IL-2,4,7,9,15 Signalkaskaden beteiligt ist, als ein Bin departner von Peptiden aus der EPOR-Sequenz identifiziert (Fig. 4 und Fig. 5). Weitere Untersuchungen über die funktionelle Relevanz der identifizierten Proteine fol gen.

In-Gel-Verdau

Ein von Shevchenko et al. (1) verwendetes und leicht mo difiertes In-Gel-Verdau Verfahren wurde angewendet. Die Proteinspots wurden ausgeschnitten, mit 50% Acetonitril in 25 mM Ammoniumbicarbonat, durch Dehydrierung in Aceto nitril geschrumpft und in einer Vakuumzentrifuge getrock net.

Die Gelstücke wurden 10 µl 5 mM Ammoniumbicarbonat mit 300 ng Trypsin aufgequollen. Nach 60 min, wurde 5 µl 5 mM Ammoniumbicarbonat hinzugefügt, um die Gelstücke während des tryptischen Verdaus feucht zu halten (37°C, über Nacht). Um die Peptide zu extrahieren, wurden 15 µl 0,5% Trifluoressigsäure (TFA) in Acetonitril hinzugefügt und die Proben für 5 min beschallt. Die Peptide wurden direkt aus der abgetrennten Flüssigkeit mittels MALDI Massenspe trometrie analysiert.

MALDI Massenspetrometrie und Datenbanksuche

Die massenspektrometrischen Messungen wurden auf einer Voyager-DE STR BioSpectrometrie Workstation MALDI-TOF Massenspektrometer (Perseptive Biosystems, Inc.) durchge führt. 2 µl der Analyselösung wurde mit 2 µl alpha-Cyano- 4-hydroxyzimtsäure (4-HCCA) Matrixlösung, bestehend aus 10 mg Matrix in 1 ml 0,3% TFA in Acetonitril-Wasser (1 : 1, v/v) gelöst, gemischt. Von der erhaltenen Mischung wurde 1 µl auf die Probenplatte aufgebracht. Die Proben wurden bei Raumtemperatur (24°C) luftgetrocknet. Alle Messungen wurden im Reflektionsmodus bei einer Beschleunigungsspan nung von 20 kV, 70% Gitterspannung und einer Verzögerung von 200 ns durchgeführt. Jedes erhaltene Spektrum war das Mittel aus 256 Laserbeschüssen. Die Massenspektren wurden unter der Verwendung bekannter Trypsinfragmente als in terne Standards kalibriert. Die bestimmten Peptidmassen wurden mit theoretischen Massen von Proteinen aus der NCBInr. 11.09.98 Datenbank unter der Verwendung des Such programms MS-FIT verglichen (http://falcon.ludwig.ucl.ac.uk/msfit.htm).

Bestimmung von Bindungspartnern einer Peptoid-Bibliothek

Eine Bibliothek aus 1600 Dipeptoiden (Membrangröße: 9 cm × 9 cm) der allgemeinen Formel I

worin R₁ und R₂ für beliebige Reste stehen,
wurde mit einem ³⁵S-Methionin markiertem Zell-Lysat inku biert. Die Positionen A, B und C, stellen dabei die fol gen Verbindungen dar:

Dipeptoid A

Dipeptoid B

Dipeptoid C

Claims

1. Verfahren zur massenspektrometrischen Charakterisie rung bzw. Identifizierung von Bindungspartnern mit positionsspezifischen Arrays, wobei man
auf einem Trägermaterial mittels positionsspezifisch aufgebrachter kleiner Volumina von Reaktionspartnern ein positionspezifisches Ligat-Array herstellt, wobei man schrittweise mindestens zwei aufeinander folgende Reaktionen ausführt,
das auf dem Trägermaterial fixierte positions spezifische Ligat-Array mit einem Gemisch von Ligan den inkubiert,
anschließend nicht an das Ligat-Array gebundene Li ganden entfernt und
den/die an das Ligat-Array gebundenen Liganden weiter mittels Massenspektrometrie charakterisiert bzw. i dentifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ligat-Array ein Peptidarray, Array aus Nuc leinsäuren oder anderen organochemischen Verbindungen oder über Fragmentkondensation von Peptiden erhalte nes Proteinarray ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch von Liganden ein Zelllysat, Gemisch von Nucleinsäuren oder Gemisch von anderen organoche mischen Verbindungen ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der auf dem Trägermaterial hergestellte Ligatarray ein Peptidarray ist,
das auf das Trägermaterial fixierte positions spezifische Peptidarray mit einem Zelllysat inkubiert,
anschließend nicht an das Peptidarray gebundenes Pro tein entfernt und
das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e nach Proteasebehandlung mittels Massenspektrometrie cha rakterisiert bzw. identifiziert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial fest oder flexibel ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus Harzbeads, Po lymerpins oder Chipmaterial besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus einer Polymer membran besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete Trägermaterial aus einer Nylon-, Cellulose-, modifizierten Cellulose- oder modifizier ten Polypropylenmembran besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein Vollzelllysat verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein durch Zentrifugation oder Filtration vorfraktioniertes Vollzelllysat verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekenn zeichnet, daß man als Zelllysat ein Lysat aus proka ryontischen oder eukaryontischen Zellen verwendet.

12. verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein Lysat aus transformierten Zellen verwendet.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zelllysat ein ³⁵S-Methionin- oder ³⁵S-Cystein-markiertes Lysat verwen det.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zelllysat zusammen mit mindestens einem definierten Cofaktor verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man Cofaktoren Proteine oder Metallionen verwen det.

16. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwi schen 3 und 30 Aminosäuren lang sind.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide zwi schen 6 und 15 Aminosäuren lang sind.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Peptidarray verwendeten Peptide 13 Aminosäuren lang sind.

19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Ligat-Array verwendeten Ligate über einen Linker an das Trägermaterial fixiert sind.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker Protease-sensitiv ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, daß der Linker chemisch spaltbar ist.

22. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Peptidarray ein SPOT-Peptidarray ist.

23. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere Charakterisierung bzw. Identifizie rung der Liganden mittels MALDI oder ESI Mas senspektrometrie erfolgt.

24. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht an das Peptidarray gebundene Protein mittels Waschen mit einem Puffer entfernt.

25. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das nicht an das Peptidarray gebundene Protein durch Fällung entfernt.

26. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das/die an das Peptidarray gebundene/n Protein/e vor der Proteasebehandlung vom Trägermaterial löst und anschließend einer Gelelektrophorese unter zieht.

27. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Charakterisierung bzw. Identifizierung der Protease-behandelten Proteine mittels MALDI oder ESI Massenspektrometrie erfolgt.