JPH06501005A - Ｆｇｆ−細胞毒素コンジュゲートによる腫瘍性病理生理学的状態の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ９号による政府の援助を得て行われたものである。政府は本発明に対して一定の 権利を有する。

本出願は、取り下げられた米国特許出願第０７１５８５，３１９号の一部継続よ り詳細には、細胞毒素剤とコンジュゲートさせた繊維芽細胞成長因子の使用に関 する。

に、この血管新生を通して供給される栄養と酸素がなければ、固体腫瘍は直径約 発芽し、毛管様の中空細管を形成して、最終的には細管と連結して毛管係蹄に入 でのＦＧＦの可能性に対する多大な興味を刺激してきた。

ＦＧＦに応答する多（の細胞が、細胞表面膜上に特定のレセプターを有していＲ ，Ｃ，１５５，５８３−５９０（１９８９）、およびツーアン（Ｈｕａｎｇ）お よびツーアン（Ｉｌｕａｎｇ）、ＯｋＤの２種類の塩基性ＦＧＦレセプターが報 告されているにューフエルドレセブターと称されるが、小さい方のレセプターは 酸性ＦＧＦに対していくふんニナッタ（オルウィン（Ｏｌｖｉｎ）ら、Ｊ、　ｏ ｆ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｔ　３９．４４３−４５４　（１９ｇ９）胞毒素 コンジュゲートを開示している。

分裂毒性（ｍｉｔｏｔｏｘｉｃ）を有するＦＧＦコンジュゲートを製造するため に、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）と細胞毒素の結合が行われてきた。ラッピ（ Ｌａｐｐｆ）らの論文（Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，１６０，９１７−９２３（１９８９） ）に詳細に記載されるように、塩基性ＦＧＦをサポリン−６（ＳＡＰ）（植物サ ポナリアオフィシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａｏｆｆｆｃｉｎａｌｉｓ）の種子 から単離されたリポソーム不活性化蛋白質（ＲＩ　Ｐ）　）と結合して、ＦＧＦ −５ＡＰを製造し、これは強力な分裂毒素（ｍｉｔｏｔｏｘｆｎ）であることが 示された。

ヒトメラノーマは、定常的に範囲が広がり、一般的な治療方法では極めて難治で ある癌の一例である。ハラパン（Ｈａｌａｂａｎ）らの論文（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　３゜１７７−１８６　（１９８ｇ））においては、メラ ノーマ細胞がｂＦＧＦ転写物を発現していることが報告され、ｂＦＧＦが細胞の オートクリン成長因子として働いているかもしれないと示唆されている。

メラノーマおよび、現在のところ治癒率の低いその他の癌性腫瘍を治療する改良 された方法の開発がめられている。

本発明の要約 本発明は、表面にＦＧＦレセプターを有する細胞の特異的ターゲティングおよび 致死を用いた治療方法を提供する。特に注目する点は、分裂毒性を有するＦＧＦ コンジュゲートから製造された腫瘍致死量の薬物の投与による、哺乳動物の腫瘍 性状態の治療である。

メラノーマの他、いくつかの癌、例えば卵巣癌、膵臓癌およびある種の結腸癌は 、ｂＦＧＦに対するレセプターを有しているという証拠がある。ヒトの癌から単 離された多くのヒト腫瘍細胞のセルラインについて放射性物質の結合による分析 試験を行ったところ、すべてではないが多くのセルラインが”’Ｉ−ＦＧＦと結 合した。細胞毒素コンジュゲート、特にＦＧＦとサポリン分子とのコンジュゲー ト（ＦＧＦ−５ＡＰ）が、ＦＧＦレセプターを発現しているセルラインに対する 、インビトロにおける細胞成長の強力な阻筈剤であることが見いだされた。これ らのセルラインを固体癌異種移植片としてヌードマウスの皮下に成長させたとき くインビトロでコンジュゲートの処理に反応したセルラインでは、ＦＧＦ−５Ａ Ｐコンジユゲートは腫瘍の体積を速やかに、たいていは投与から４８時間以内に 減少させることが示された。腫瘍の減少に効果的な投与量は、実験動物に毒性を 示さないことが確かめられた。同様にして、生理学的に許容される担体中の治療 効果量のＦＧｔコンジュゲートを投与することによって、ヒトの患者の治療を行 うことができる。特に、治療においては、フンシュゲートは細胞毒素剤をヒトメ ラノーマ、卵巣癌、奇形癌および神経芽細胞腫の細胞にターゲティングさせ、こ れらの細胞の増殖を阻害するために用いられる。コンジュゲートはまた、同様の 腫瘍性の病理生理学的状態におけるＦＧＦレセプター発現細胞へのターゲティン グのためにも用いられる。

本発明は、これらのＦＧＦコンジュゲートを用いる哺乳動物の治療方法を提供す る。このコンジュゲートは上述の腫瘍に対して有効であり、またＦＧＦ分裂刺激 に感受性のある細胞の増殖によって引き起こされるその他の腫瘍性病理生理学的 状態に対しても有効である。

図面の簡単な説明 図１から図５は、メルタング（夏ｅｌ　Ｔａｎｇ）ヒトメラノーマ細胞を注入さ れたヌードマウスをｂＦＧＦ−３ＡＰコンジユゲートにより処置した結果を示す 。

好ましい態様の詳細な説明 本発明は、インビトロおよびインビボにおいてＦＧＦ感受性細胞の成長と増殖を 抑制するための、細胞毒素剤とＦＧＦレセプターと反応性のあるＦＧＦポリペプ チドとのコンジュゲートを用いた治療からなる。ＦＧＦ分裂刺激に感受性のある 細胞の増殖によって引き起こされる腫瘍性病理生理学的状態に対して、ＦＧＦ− コンジュゲートが有効であることを示す。ＦＧＦ−コンジュゲートが有効である 腫瘍には、ヒトメラノーマ、ヒト卵巣癌、ヒト奇形癌および神経芽細胞腫が挙げ られるが、これらに限定されるものではない。

用いられるコンジュゲートは、塩基性ＦＧＦ、またはＦＧＦレセプターと反応性 のあるその他のＦＧＦポリペプチドのいずれか、および細胞毒素剤、特にサポリ ン等のリポソーム不活性化蛋白質（ＲＩＰ）を含むが、その他の細胞毒素剤もま た育利に用いることができる。入手が容易であるため、好ましくは塩基性ＦＧＦ を用いる。細胞毒素剤は、化学結合によってＦＧＦに結合させてもよく、あるい は、かかる組成物を組換えＤＮＡ手法を用いてキメラとして製造してもよい。

いずれの場合にもコンジュゲート分子は、複合体のＦＧＦ部分のレセプター結合 エピトープが、ＦＧＦレセプターにより認識されることができる状態で残るよう に設計され製造される。

ここに記載するＦＧＦコンジュゲート等の細胞毒素コンジュゲートは、免疫毒素 （イムノトキシン）よりも利点を有する。細胞毒素フンシュゲートは、腫瘍部位 に局所的に直接投与することができる。細胞毒素コンジュゲートは、化学的に定 義し、合成し、特徴づけることができ、さらに組換えＤＮＡ手法を用いて大量に 製造することができる。細胞毒素フンシュゲートは、一般に免疫毒素よりも少な い投与量で効果的である。

塩基性ＦＧＦ　（ｂＦＧＦ）および酸性ＦＧＦ　（ａＦＧＦ）の他に、ＦＧＦレ セプターとの結合を介するＦＧＦ分裂活性を有する多くの蛋白質が知られている 。

哺乳動物塩基性ＦＧＦは、約１６ｋＤの分子量および約９．６の等電点を有する １４６残基のペプチドであり、アミノ末端が延長されていてもよい。ａＦＧＦ以 外のＦＧＦ蛋白質としては、旦旦工、１Ｎ工／２、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６およ びＫＧＦ　（ＦＧＦ−７）がある（ベアード（Ｂａｉｒｄ）ら、Ｂｒ１ｔ、　Ｍ ｅｄ、　Ｂｕｌｌ、　４５゜４３８−４５２　（１９８９）を参照のこと）。こ れらはすべて、種々の正常二倍体中紅葉由来細胞および神経稜由来細胞において 、分裂活性を誘導する。このようなｒＦＧＦ分裂活性」の１つの試験方法は、培 養ウシ大動脈内皮細胞の増殖を刺激する能力の試験である（ゴスポダロウィッツ （Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ）ら、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｔ、　２５７゜ １２２６６−１２２７８　（１９８２）およびゴスポダロウィーｔツ（Ｇｏｓｐ ｏｄａｒｏｖｉｃｚ）ら、Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、。

７３、４１２０−４１２４　（１９７６））　）。ｒＦＧＦＪ　と（７）用語は 、一般ニ、１１１ｉ乳動物？Ｉ主１．。

見いだされるアミノ酸配列を有する蛋白質および、アミノ酸の置換、欠失、挿入 または付加を有し、なおＦＧＦレセプターとの結合による分裂活性を発現してい る修飾された配列を有する蛋白質の両方について一般に用いられる。ｂＦＧＦお よびａＦＧＦの精製された調製物は、しばしば分裂剤（ｉｉｔｏｇｅｎ）のいく つかの分子形態を含むことが認められる。ＦＧＦのアミノ酸配列の差異は、種の 違いによってもその種の個々の生物から得られたＦＧＦの間においても起こり得 ることを理解すべきである。また、この用語は天然資源から単離された蛋白質お よび合成（組換え手法または、可能であれば化学合成）によって製造された蛋白 質の両方を包含することを意図している。

ラン下垂体組織から得られた哺乳動物ｂＦＧＦのアミノ酸配列の一例が、エツジ ｘ　（Ｅｓｃｈ）らの論文（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、、　８２．６５０７−６５１１　 （１９８５））に報告されている。

これはまた、米国特許第４．９５６．４５５号（１９９０年９月１１日発行）に も記載されており、この記載を本明細書の一部としてここに引用する。ｒｂ　Ｆ ＧＦ」との用語は、一般に、ウシｂＦＧＦまたはヒトｂＦＧＦと莫賀的に等しい アミノ酸配列を有し、同様の分裂活性を有する蛋白質またはポリペプチドを表わ すものと理解すべきである。ヒトａＦＧＦ　（ジェイ（Ｊａｙｅ）ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ、　２３３．５４１−５４５　（１９８６））　、ウシｂＦＧＦ　（アブ ラハム（Ａｂｒａｈａｉ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．５４５−５４８　（１ ９８６））　、ｔ：、トｂＦＧＦ　（アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）ら、ＥＩＩ ＢＯＪ、　５．２５２３−２５２８およびアブラハム（Ａａｂｒａｈａｍ）ら、 Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ。、５１．６５７−６６１１　（１９８６））　、ラッ トｂＦＧＦ（シマサキ（Ｓｈｉｍａｓａｋｉ）ら、ｓ、Ｂ、Ｒ，ｃ、　（１９８ ｇ）およびクロカワ（Ｋｕｒ。

ｋａｗａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５０．　１６．　５２０１　 （１９８ｇ））をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、配列が決定されてい る。これらのｃＤＮＡからは、蛋白質配列決定によって見いだされたウシｂＦＧ ＦおよびａＦＧＦと同一の蛋白質の存在が予測される。

本明細書においては、ｒＦＧＦレセプター」の用語は、塩基性ＦＧＦ、塩基性お よび酸性ＦＧＦの両方、またはＦＧＦ活性を有するその他の蛋白質に結合し、こ れらを細胞内に移送しつるレセプターを表わす。これらには、例えばイマムラ（ Ｔ、　Ｉｇ＋ｕｕｒａ）らの論文（Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，、１５５，５８３−５９０ （１９８ｇ））　、およびモスカテリ（ｉｌｏｓｃａｔｅｌｌｉ）らの論文（Ｊ 、　Ｃｅ１１．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１３１．１２３−１３０　（１９８７） ９に記載されるレセプターがある。本明細書においては、ｒＦＧＦレセプターと 反応性のあるポリペプチド」の用語は、ＦＧＦレセプターと結合し、このことに よって細胞内に移送されつるポリペプチドを表わす。

塩基性ＦＧＦは商業的に、例えばアムジエン（Ａｔｎｇｅｎ、　Ｔｈｏｕｓａｎ ｄ　０ａｋｓ、　ＣＡ）およびアマジャム（＾５ｅｒｓｈａ露Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｌ　）から入手可能であり、種々のタイプの哺乳動物組織から得ること ができる。塩基性ＦＧＦの精製方法としては、例えば逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰ ＬＣ）およびヘパリンセファ０−スアフィニティクロマトグラフィーがある。

陽イオン交換ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣは、ポーレン（Ｂｏｈｌｅｎ）らの 論文（Ｐ、　Ｎ、＾、Ｓ、、　８１．５３６４−５３６８　（１９８４））に記 載されている。ヘパリンセフ１０−スアフイニテイクロマトグラフイーによる精 製は、米国特許第４，７８５．０７９号、ゴスポダロウィッツ（Ｇｏｓｐｏｄａ ｒｏｗｉｃｓ）らの論文（Ｐ、ＩＩｌ、Ａ、Ｓ、、　８１．６９６３−６９６７ （１９８４））およびゴスポダロウィッツ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｓ）の論 文（Ｉｌｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、。

１４７、１０６−１１９　＜１９８７））に記載されている。さらに、ｂＦＧＦ は組換え法により合成することもできる。組換え蛋白質の酵母および大ａｍ　（ Ｅ、　ｃｏｌｉ）における発現は、バール（Ｂａｒｒ）らの論文（Ｊ、　Ｒｉｏ ｔ、　Ｃｈｅｌｌ、、　２６３．１６４７１−１６４７８　（１９８ｇ））およ び米国特許第４．９５６，４５５号に記載されている。

ＦＧＦ−細胞毒素剤コンジュゲートは、固定化ヘパリンを含むカラムにより精製 することができる。適当なカラムとしては、ヘパリン−セファ０−スおよびヘパ リン−アガロースがある。結合したコンジュゲートは、ＮａＣ１等の塩の濃度勾 配により溶出することができ、ＩＭから３Ｍの間の濃度のＮａＣｌによって溶出 される。

細胞毒素剤とコンジュゲートされたＦＧＦは、目的とする特定の細胞に細胞毒素 剤をターゲティングするために用いられる。本明細書においては、細胞毒素剤と の用語は、細胞機能を阻害しつる分子を表わす。この用語には、細胞内に移送さ れた場合にのみ毒性を示す薬剤、および細胞表面において毒性の効果を表わすも のが含まれる。細胞毒素剤としては種々のものを用いることができ、特に蛋白質 合成を阻害するものを用いることができる。−例として、ｂＦＧＦはサポリンー ６　（ＳＡＰ）またはその他のＳＡＰ誘導体等のリポソーム不活性化蛋白質（Ｒ ＩＰ）と結合させることができる。ＳＡＰは植物サポナリアオフィシナリス（Ｓ ａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）の種子から単離される強力なＲＩ Ｐである（ステイープ（Ｓｔｉｒｐｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　２１６ ．６１７−６２５　（１９８３）を参照のこと）。ＦＧＦとＳＡＰとのコンシュ ゲージコンは、コンシュゲージ３ンのためにＳＡＰを修飾する必要がないという 利点を有している。このことは、細胞毒素のターゲティングに適した形態となる ように広（修飾しなければならないその他の細胞毒素剤と対照的である。その他 の適当な細胞毒素剤としては、例えばリシン、リシンＡ鎖、ゲロニン、ジフテリ ア毒、ジフテリア毒Ａ鎖、ホークライード抗ウィルス蛋白質（ＰＡＰ）およびシ ュードモナス（Ｐｓｅｕｄａａｏｎａｓ）菌体外毒素等があるが、これらに限定 されるものではない。あるいはまた、薬物をｌＩｉ胞毒素剤として用いることも 適用可能である。このような薬物の例としては、ドーノマイシンＩＦ（ドキソル ビシンおよびドキソルビシンを含む）等のアンスラサイクリン類、およびメトト レキセートおよびその類似体がある。

ＦＧＦは、反応性スルフヒドリル含有物質（ＳＰＤＰ等）を用いた誘導化により 、あるいはグルタルアルデヒドまたはカルボジイミド等のクロスリンク剤を用い た既知の化学反応によって、細胞毒素剤蛋白質と適切にコンジュゲートされる。

例えば、細胞毒素剤は、プロピオン酸Ｎ−スクシニミジル−３（２−ピリジルジ チオ）等の反応性スルフヒドリル剤を含む試薬を用いて誘導化し、これにＦＧＦ を加えて混合することができる。ＦＧＦコンジュゲートは、適当なカラムを用い て未反応生成物から分離することができる。あるいはまた、ｂＦＧＦは、シス− アコニターゼ法により糖部分を通じて１４−ブロモドキソルビシン等の薬物とコ ンジュゲートさせることができる（ジエン（Ｓｈｅｎ）およびライザー（Ｒｉｓ ｅｒ）、Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，、１０２，１０４８（１９８１）を参照のこと）。

あるいはまた、岨換え法により、キメラのＦＧＦ−コンジュゲートを調製するこ ともできる。このような方法は、ＩＬ−２またはＴＧＦαのコンジュゲートに適 用されており、チャウダリー（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ）らの論文（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ 、、　８４．４５３８−４５４２　（１９８７））およびローベルマンガルスキ ー（Ｌｏｒｂｅｒ＋＊ａｎ−Ｇａｌｓｋｉ）らの論文（Ｐ、　Ｎ。

Ａ、Ｓ、、　８５．１９２２−１９２６　Ｃ１９８８））に記載されている。ま た、マニアティス（ｌｌａｎｉａｔｉｓ）らの著書「モレキュラー・クローニン グ（ｌｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌａｎｉｎｇ：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（ １９８２））　Ｊも参照のこと。

ＦＧＦおよび細胞毒素剤を含むコンジュゲートは、ＦＧＦ媒介性の種々の病理生 理学的状態の治療に有効である。本明細書においては、ｒＦＧＦ媒介性病理生理 学的状態」との用語は、ｂＦＧＦ分裂刺激に感受性を有する細胞の増殖に起因す るかまたはこれによって特徴づけられる有害な状態を表わし、特にそのような腫 瘍性状態に注目している。

以下の実施例は、ＦＧＦ−コンジュゲートの製造および使用を説明することを意 図したものであるが、これらが本発明を限定するものではないことを理解すべｂ ＦＧＦとサポリンのコンジュゲートの作成アブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）らの論 文（Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉａｓ、、　５１．６５７−６６８　（１９８６））に記 載される１５４アミノ酸の配列に相当する組換えｂＦＧＦは、ファルミタリア力 ルロエルバ（Ｆａｒｍｉｔａｌｉａ　Ｃａｒｌｏ　Ｅｒｂａ）から入手した。サ ポリン−６は、ステイープ（Ｓｔｉｒｐｅ）らの論文（上述）の方法を、ラッピ （Ｌａｐｐｉ）らの論文（Ｂ、　Ｂ、　ｉ　Ｃ。

、　１２９．９３４−９４２　（１９８５））に従って修正して精製した。簡単 には、サポナリアオフィシナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉ ｓ）の種子を５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１）Ｈ７，２）　、０．１４ＭＮ ａＣ＋溶液（ｇ　ｍｌ／ｇ）中で挽いて抽出した。４℃において一晩撹拌したの ち、抽出物をチーズクロスでこし、２８０００　ｇで３０分間遠心分離した。上 清を沈殿および浮遊脂肪から分離した。以下、これを「粗抽出物」と称する。

粗抽出物を５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，５）に対して透析し、２８ ０００ｇで３０分間遠心分離し、ＣＭセルロースカラム（ＣＭ５２　：　ｆｈａ ｔｍａｎ、　ｌ１ａｉｄｓｔｏｎｅ、　Ｋｅｎｔ、σ、に、）にかけた。洗浄後 、同じ緩ｒｒ液中のＯ−０，３ＭＮａＣ］の勾配で溶出した。次にこの物質を水 に対して透析し、５０ｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，５）および０．１５６Ｍ 塩化ナトリウムで平衡化したＦＰＬＣモノＳカラム（Ｐｈａｒｓａｃｉａ、　Ｕ ｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いてクロマトグラフィー処理を行った。蛋 白質は、２０分間の０．１５６Ｍから０．１８６ＭのＮａＣ１勾配により溶出さ れた。得られたピーク物質を大量のミリＱ水０１ｉ１１ｉ−Ｑ　Ｗａｔｅｒ：　 ＭｉＬｌｉｐｏｒｅ。

Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＩＩ＾）に対して透析した。乾燥した物質の一部を秤量し、 ｌ　ｍｇ／＋ａｌとなるように水に溶解した。紫外線スペクトルを記録し、最大 吸収は２７７ｎｍにおいて１％吸光係数６．４であった。２８０　ｎｍにおける Ｅ　２８０は６．０であった。

標準物質としてＢＳＡを用いてローリ−法（Ｌｏｖｒｙら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｔ、　１９３．２６５−２７５　（１９５１））による蛋白質分析を行っ たところ、濃度は１．　０７ｍｇ／ｉｌであっファルマシアファインケミカルズ 社製、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を用いて、製造者の指し、２３℃におい て３０分間、時々撹拌しながら反応させた。過剰の試薬およびムおよびＯ，１Ｍ 塩化ナトリウム（ｐＨ７，５）中６　ｍｇ／＋＊１）と混合した。０゜１Ｍヨー ドアセタミド３５μｌを加えることにより、反応を停止させた。ざらにトを含む 両分は、ファストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ、ファルマシア）電気泳動後、銀染色 により検出し、適当な画分を回収して分析に用いた。

コンジュゲートの合成は、検出可能なりＦＧＦ　（ゲル電気泳動により確認）が 反応混合物に残留しなくなるまで進行させた。それぞれのピーク画分を、ヘパリ ン−セファロースによるクロマトグラフィー分離を行った後、電気泳動により分 析したところ、ＳＡＰはヘパリン−セファロースに結合しなかったのに対し、コ ンジュゲートは結合した。コンジュゲートのわずかの量のみがｌ、ＱＭＮａＣ１ ンジュゲートの一部には、おそらく１モルのサポリンに対して２モルのｂＦＧＦ がコンジュゲートしたと思われる、Ｍ　ｒ　＞６Ｆ１．０００と推定されるもの が含まれていゲートの明白な同定を行った。抗原としては、ベックマン（Ｂｅｃ ｋ詭ａｎ）　９９０ペプチド合成機を用いて化学合成した、アミノ酸１−２４を 含むｂＦＧＦのフラグメントを用いた。ウェスタンプロット分析により、コンジ ュゲートのすべての分子量の形のものがｂＦＧＦおよびＳＡＰの両方を含むこと が示された。抗血清は、ペプチドの中間部分を認識し、等モルのベースにおいて 精製ウシｂＦＧＦおよび組換えヒトｂＦＧＦと交差反応した。

電気泳動後の、ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル中のサン プルを、ニトロセルロール膜に電気ブロッティングし、空気中で乾燥した。この 膜をＴＲｌ５ｉｌ新生理食壇水（ＴＢＳ）で被覆し、１０分間振盪した。溶液を 吸引除去した。膜をＴＢＳ中の５％無脂乳（ＮＦＭ）で被覆し、１０分間振盪し た。溶液を吸引除去した。ＮＦＭ／ＴＢＳ中１　／１０００濃度の第１抗体（抗 ＳＡＰ抗血清または抗ｂＦＧＦ抗血清）を加え、−晩振盪した。溶液を吸引除去 した。

膜をＴＢＳで被覆し、１０分間振盪し、溶液を吸引除去した。膜を０．０５％Ｎ Ｐ４０／ＴＢＳで被覆し、１分間振盪し、溶液を吸引除去した。最後にＴＢＳお よびＮＰ４０／ＴＢＳによる洗浄を２回繰り返した。ＮＦＭ／ＴＢＳ中の希釈度 １　／２０００のワサビペルオキシダーゼ標識抗１ｇＧを加え、膜を２時間振盪 した。

ＴＢＳおよびＮＰ４０／ＴＢＳによる洗浄工程を繰り返した。２０ｍ１メタノー ル中の４−クロロ−１−ナフトール６０ｍｇ、２回蒸留水１００ｍ１および３０ ％Ｈ！０１６０μｌを新たに混合し、この溶液を膜に加えて発色させた。溶液を 吸引除去し、水で洗い流すことにより反応を停止させた。膜を乾燥した。

実施例■ ＦＧＦ／ＳＡＰコンジュゲートの活性 コンジュゲートが塩基性ＦＧＦレセプターを認識する能力を、モスヵテリ（Ｍ。

５ｃａｔｅｌｌｉ、　Ｄ、）らの論文（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１ ３１．１２３−１３０　（１９８７））に記載の方法に従って、ＢＨＫＩＥ胞に おいて試験した。簡単には、細胞を準集密まで増殖させ、Ｆ−１２，１４ｍＭ　 ＮａＨＣＯ，，２５ｍＭＨＥＰＥＳおよび領２％ゼラチンを含む３００μｌの緩 衝液中で、種々の濃度のｂＦＧＦまたはコンジュゲートの存在下に１０μｍの放 射性ヨウ素標識したｂＦＧＦとともに４℃において２時間インキュベートした。

次に、細胞を０．５ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回、２ＭＮａＣ１ を含むＰＢＳで２回洗浄した。高親和性レセプターヘノ結合は、０．５％）ライ ト：／Ｘ−１００を含むＰＢＳ　ｃｐｔ−ｉｓ、１）ｌ：１．溶解した膜分画の カウントを測定することにより決定した。

シーナ（Ｓｉｅｎａ）らの論文（Ｂｌｏｏｄ、　７２．７５６−７６５　（１９ ８８））の記載に従い、蛋白質合成のインビトロアッセイによって、ＳＡＰ蛋白 質の蛋白質合成阻害活性をｂＦＧＦ−５ＡＰコンジユゲートの蛋白質合成阻害活 性と比較した。コンジュゲートの細胞毒性活性は、新生児ハムスター腎臓繊維芽 細Ｆ！（ＡＴＣＣ受託番号：ＣＲＬ６２８１）を用いて試験した。ＢＨＫ細胞を ２４ウエルのプレートに５０００個／■ｌの濃度でまき、３７℃、５％Ｃｏ２に おいて一晩インキユベートした。翌朝、ＨＥＰＥＳｉｌ新ＤＭＥＭおよびＦ−１ ２培地（１：　１）に５％ＦＣＳを加えた培養液をウェルから吸引し、培養液の み、あるいはコンジュゲート、ｂＦＧＦまたはサポリンを含む培養液と交換した 。２日後、細胞を２回洗浄し、トリプシン処理して、クルター粒子計測器（Ｃｏ ｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｈｉａｌｅａｈ、　ＦＬ）を用いて細 胞数を計測した。

インビトロ蛋白質合成阻害アッセイによって試験したところ、コンジュゲートは サポリン活性を保持していることが示された。コンジュゲートは、予期されたよ うに、遊離のＳＡＰよりもやや活性が弱かった（約２倍）。このことは、コンジ ュゲート前にＳＡＰの誘導化のレベルが低い（０，８モル５ＰＤＰ１モル）こと 、および結合したｂＦＧＦの存在によりおそらく立体障害があることと一致する 。これに対し、ｂＦＧＦの放射性レセプターアッセイにより得られた結果は、結 合アッセイにおいてｂＦＧＦ−ＳＡＰがｂＦＧＦよりやや活性が高いかまたは同 等の活性を有することを示している。従って、ｂＦＧＦ中の遊離のスルフヒドリ ル基がＳＡＰとの結合に関与することは、ｂＦＧＦのレセプターの認識および結 合の能力を妨害するものではな（、どちらかといえばこの反応がｂＦＧＦを安定 化させることが明らかである。

塩基性ＦＧＦ−３ＡＰはＢＨＫ細胞に対して強力な細胞毒性因子である。しかし 、ＳＡＰのみでは、試験した最大投与量（１０−’Ｍ）においてさえも、これら の細胞に毒性効果を有しておらず、ｂＦＧＦのみでは増殖にわずかの阻害活性し か有していなかった。ｂＦＧＦとＳＡＰとの混合物はわずかに毒性を有していた が、試験した最大濃度の場合のみであった。増殖アッセイにおいては、細胞毒素 剤のｒＣ５゜は２５ｒ）Ｍであり、ｂＦＧＦの効力（１５ｐＭ）に匹敵した。コ ンジュゲートの分裂毒性活性がレセプター特異的であることを確認するために、 細胞毒素剤の特異性を競合実験において試験した。ＢＨＫ細胞を種々のレベルの ｂＦＧＦまたは神経増殖因子（ＮＧＦ）（ＦＧＦレセプターと結合しない）とと もにあらかじめ１時間インキュベートし、次にこの細胞を細胞毒素剤で処理した 。存在する塩基性ＦＧＦの量が増えるに従って、用量に依存した細胞毒性活性の 阻害があることも示された。これに対し、１０００倍過剰量のＮＧＦは全（効果 を示さなかった。

ＦＧＦ−コンジュゲートは、ある種の腫瘍性のＦＧＦ媒介性病理生理学的状態に 対して著しい効果を有している。場合によっては、このことは脈管形成における ＦＧＦの役割および関連する組織におけるＦＧＦレセプターの存在の結果である と考えられる。ＦＧＦ−コンジュゲートの有効性は、以下の実施例■および■に おいて示される。

実施例■ ウサギ角膜における脈管形成の阻害 以下の方法に従って、エルパックス（Ｅｌｖａｘ、エチレンビニルアセテート共 重合体樹脂、Ｄｕｐｏｎｔ、　ｆｆｌαｉｎｇｔｏｎ、　ＤＥ）ペレットを作成 した。洗浄し、乾燥したエルパックス約６０ｍｇを５００μｍの塩化メチレンに 溶解した。これに乾燥ｂＦＧＦ５０μｇを加えた。ドライアイス中で凍結したス ライド上に、５μｍを滴下した。ベレットを一晩冷凍庫中に静置し、次にデシケ ータ中で乾燥した。

ニューシーラント白ウサギをイノバールペット（Ｉｎｎｏｖａｒ　ｌ’ｅｔ）　 １ｍｌ／ｋｇで麻酔した。ウサギの目の角膜中に切開を形成し、スパチュラまた はビンセットを用いてポケットを開いた。ペレット１つをポケット中に挿入した 。ベレットは両方の目に挿入した。目を生理食塩水で洗浄し、１ｍｌのゲンタマ イシンを筋肉内注射した。５日間ウサギをそのままにしておき、脈管形成を観察 した。５日後、それぞれのウサギの左目を、実施例■に従って調製したｂＦＧＦ −５，ＡＰｌｏｏｎｇを含む０．２５％ＢＳＡ溶液２０μｌで処置した。右目は ０．２５％ＢＳＡのみ２０μｌで処置した。この処置は、１日に２＠、ウサギ角 膜上に溶液を点眼として滴下することにより行った。動物の処置を行った者は、 サンプルの正体を知らなかった。１０日後、顕微鏡下の分析により、動物の角膜 の脈管形成を評価した。

評価は処置養生法を知らない評価者によって行われ、最大脈管形成を＋十十、脈 管形成せずを−とじて、脈管形成を点数化した。

結果を表１に示す。表から明らかなように、ｂＦＧＦ−８ＡＰで処置した角膜に おける脈管形成は、対照と比較して著しく減少していた。

９９９　＋＋　＋ 実施例■ デュピュイトラン細胞に対するＦＧＦ−３ＡＰの効果デュビュイトラン常縮（手 の運動に影響する疾患）と診断された成人患者の手から外科手術によって組織を 取り除き、この組織から得られた細胞から初代培養細胞を調製した。この細胞は 、細胞１個あたり１０．０００から１５．０００個の塩基性ＦＧＦレセプターを 有していた。

この細胞を、ウェルあたり１０．０００個の濃度で、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ ２）を含むＨＥＰＥＳ緩衝ダルベコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、２４ウ 工ル組織培養プレートで一晩増殖させた。翌朝、培地を除去し、１０−ｓからＩ Ｑ−１２モルの範囲の濃度のｂＦＧＦ−５ＡＰコンジユゲートを含む培地と交換 した。対照としては、培地のみ、同様の濃度の塩基性ＦＧＦのみ、サボリンのみ 、およびＦＧＦとサボリンの両方を含むがコンジュゲートしていないものを用い た。細胞をインキュベータに戻し、７２時間培養した。このインキュベージジン の後に、細胞を洗浄し、トリプシンにより剥離させてクルター細胞計数器で計数 した。対照培地の細胞数を、処理したウェルの細胞数と比較した。ＦＧＦ−５Ａ Ｐについて、ｒｃ５ｏ、すなわち５０％のｍｍが死ぬ濃度を計算した。この細胞 致死アッセイの結果は、デュピュイトラン細胞が塩基性ＦＧＦ−３ＡＰに感受性 であることを示し、致死細胞の数はＦＧＦ−５ＡＰの用量に比例していた。同様 の結果を得るためには、大賀的により高い濃度のＳＡＰまたはＦＧＦ−３ＡＰが 必要であり、致死細胞の数は、特に、ＳＡＰのみでは明らかな用量依存性は示さ なかった。その他の３つの細胞サンプルについても同様の結果が得られた。

ＦＧＦ−細胞毒素コンジュゲートは、細胞死を引き起こす目的をもって、ＦＧＦ レセプターを発現しているｍ胞に細胞毒素剤をターゲティングするために用いう ることが見いだされた。試験の結果は、細胞１個あたりのＦＧＦレセプターの数 と、そのような細胞の５０％が死ぬ用量（ＩＣ，。）との間に、直接的な関係が あることを示している。ｂＦＧＦ−３ＡＰに４８時間から７２時間さらされてい たそれぞれのセルラインについて、ｂＦＧＦ−３ＡＰの毒性を決定した。細胞数 を計測し、細胞数を５０％減少させる濃度をそのセルラインについてのレセプタ ー数に対してプロットした。レセプターの数は、モスカテリ０１ｏｓｃａｔｅｌ ｌｉ、　Ｄ、）の論文（Ｊ、　ＣｅＬＬ　Ｐｈｙｓｉｌｏｇｙ、　１３１．１２ ３−１３０　（１９８７））の方法に従って決定した。

非常に高いレセプター数を有していることが知られている細胞（例えばＢＨＫ細 胞）については、ＩＣ，。は塩基性ＦＧＦのそのレセプターに対する親和性定数 と等しかった（ＢＨＫ細胞については、いずれも約２５ｐＭ）。この予期しない 結果は、細胞毒素剤の存在が、ＳＡＰはどの大分子であっても、コンジュゲート のＦＧＦ活性を減少させていないことを示している。これらの試験の結果は、多 数のＦＧＦレセプターを発現しているセルラインが、はるかに低い数のレセプタ ーを発現しているセルラインと比較して、コンジュゲートに対してより感受性が 高いことを示しているようである。

セルラインのＦＧＦレセプターの存在について、”Ｉ−ＦＧＦ結合アッセイ等に よって試験することもできる。このアッセイについては、実施例Ｖにおいて述べ る。どのセルラインがＦＧＦレセプターを有しているかをあらかじめ知ることは できない。

ヒトの癌に由来する多くの細胞について、ＦＧＦレセプターの存在を試験した。

試験したセルラインは、ＳＫ−Ｍｅｌ−１（ヒトメラノー？）　、ＳＫ−Ｎ−Ｍ Ｃ〉　（ヒト神経芽細胞腫）　、ＰＡ−１（ヒト卵巣奇形癌）、およびＡ４３１ （ヒト上皮癌）である。これらのセルラインは、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　１１０）より入手した。ＦＳａＩ　ＩＣ（ネズミ繊維肉腫、ビバリー・タイ チャー　（Ｂｅｖｅｒｙ　Ｔｅ１ｃｈｅｒ）ｃ　博士（Ｄａｎａ　Ｆａｒｈａｅ ｒ　Ｃａｎｅｒ　Ｉｎ５ｔｆｔｕｔｅ、　Ｂｏｓｔｏｎ）より入手）についても 試験した。

シ　その他のセルラインについても、同様に試験することができる。

実施例Ｖ ”Ｉ−ＦＧＦレセプター結合アッセイ １２ウェルの組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に、ウェルあたり１０’個 の細胞を植え、それぞれの培地で集密となるまで増殖させた。ＳＫ−Ｍｅｌ−１ 、ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびＰＡ−１は、１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補充した イーグル改変培地（ＭＥＭ）で増殖させた。ＦＳａｌｌＣは、５％ＦＣ３を含む α−ＭＥＭで増殖させた。Ａ４３１は、１０％ＦＣ５を補充したＲＲＭ１１６４ ０培地で増殖させた。”Ｉ−ＦＧＦ結合アッセイは、ニューフェルト（Ｎｅｗｆ ｅｌｄ、　Ｇ、）らの「ヒト血管内皮細胞における繊維芽細胞成長因子レセプタ ーの同定（Ｊ、　Ｃｅ１１、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１３６．５３７−５４２　 （１９９１））　Ｊの記載に従って、放射性標識レセプターアッセイを用いて行 った。簡単には、単層細胞を、０，２％ゼラチンおよび３μｇ／ｍｌヘパリン（ Ｓｉｇｍａ社製）を含む、補充していない新鮮な培地を用いて、３７℃、５％Ｃ Ｏ！で１時間培養し、次にこれを水冷した培地で洗浄し、１分間冷却した。

細胞を種々の濃度の”’Ｉ−ＦＧＦを含む同じ培地２５０μｌ中で、氷上で２時 間インキュベートした。次に細胞を水冷した０、９％リン酸緩衝生理食塩水（Ｐ ＢＳ）で穏やかに２回洗浄して結合していない”Ｉ−ＦＧＦを除去し、残存する 細胞結合放射能を、１％トライトンＸ−１００で抽出してベックマンガンマカウ ンターで計測した。非特異的な結合は、２００倍過剰量の放射性標識していない ＦＧＦを用いて特異的結合を阻害することにより決定した。

これらの実験の結果、ＳＫ−Ｍｅｌ−１、ＰＡ−１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣおよびＦＳ ａＩＩＣ細胞は、高親和性ＦＧＦレセプター（塩基性および酸性ＦＧＦのいずれ にも結合するが、塩基性ＦＧＦに優先的に結合するレセプター）を発現していた 。予期しなかったことに、Ａ４３１！ｉｌｌ胞はＦＧＦレセプターを有していな いことがわかった。

ＳＫ−Ｍｅｌ−１、ＰＡ−１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＦＳａ　Ｉ　ＩＣおよびＡ４３ １セルラインについて、インビトロ試験を行い、ＦＧＦ−８ＡＰまたはＳＡＰの みで処理したときの細胞の残存を測定した。次に、細胞残存と、実施例Ｖに従っ て決定したＦＧＦレセプターの存在との関係について決定した。インビトロ細胞 試験の実験方法と結果を実施例■に記載する。

実施例■ インビトロ細胞残存実験 ９６ウエルの組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に、ウェルあたり１０３個 の細胞を植え、それぞれの培地で培養した。１日後、培地を除去し、１μＭから １μＭのＦ　Ｇ　Ｆ　−Ｓ　Ａ　Ｐコンジュゲートまたは遊離ＳＡＰを含む培地 と交換した。細胞の処理は、それぞれの濃度について３つずつ実施し、細胞は３ ７℃、５％ＣＯ１に維持した。処置開始から７２時間後、培地を除去し、細胞を トリプシン処理してクルター計測器（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ 、　Ｉｎｃ、、Ｈｉａｌｅａｈ、　ＰＬ）で計数した。

結果は、処理したウェルからの平均細胞数をめて培地のみの対照に対して標準化 し、ＦＧＦ−３ＡＰまたはＳＡＰの濃度の関数として表わした。用量応答曲線か らＩＣ５゜の値、すなわち細胞数を５０％減少させるＦＧＦ−ＳＡＰまたはＳＡ Ｐの濃度を計算した。

表２に示されるように、ＦＧＦ−ＳＡＰが、ＦＧＦを発現しているそれぞれのセ ルラインの細胞成長の強力な阻害剤であることが明らかとなった。これに対し、 表２から、ＦＧＦ−８ＡＰがＡ４３１細胞において最小の細胞毒性効果を示すこ とがわかる。ＰＡ−１およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞において、ＳＡＰにともなう成 長阻害が見られたが、これはコンジュゲートより２から６オーダー高い濃度のＳ ＡＰにさらされた場合のみであった。ＦＧＦおよびＳＡＰを非共有結合の混合物 として加えた場合には、細胞毒性効果は全く見られなかった。

別のセルラインもまた、ｂＦＧＦ−３ＡＰコンジユゲートで７２時間処理した後 、インビトロ成長阻害を示した。これらのセルラインは、ヒトメラノーマセルラ インＳＫ−ＭＥＬ２４およびＳＫ−ＭＥＬ５（いずれもＡＴＣＣに寄託され、入 手可能である）およびヒト卵巣癌セルライン５ＮＯＶ−３（これもまた４八ＴＣ Ｃから入手可能である）である。親世代（ｐａｒｅｎｔａｌ　）型であるメルタ ングＱｌｅ！Ｔａｎｇ）細胞（Ｒｏｇｅｒ　ｆｉｌｌｉａｍｓ　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｒｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｐｒｏｖｉｄｅ獅モ■ B ＲＩより入手可能）を用いて、インビトロおよびインビボ試験を行った。この結 果については後述の実施例■およびＸにおいて考察する。

セルライン　Ｋｄ″　ＦＧＦ−Ｒ数　ＦＧＦ−５ＡＰ　５ＡＰＩＣｓｏゝ　ＩＣ ５ｏゝ ＳＫ−Ｍｅ　］−１１５７１９，００００，１影響なしＰＡ−１−３３，ＱＯＯ １，Ｑ　５（１０８に−Ｎ−ＭＣ４５，０００Ｇ、０１　１０００ＦＳａ　Ｉ　 Ｉ　Ｃ４１７，０００２，５影響なしＡ４３１　ＮＡ″′　Ｏ影響なし　影響な しａ　：Ｋｄ　（ｐＭ） ｂ　：　Ｉ　Ｃ５，（ｎＭ）は細胞数を５０％減少させる濃度を表わし、用量応 答曲線から計算した。それぞれの値は、少なくとも３つの測定値の平均値である 。

ｃ：ＮＡ＝非適用 インビトロで試験された癌性セルラインを、周知の方法によりインビボで試験す ることも可能である。これは、目的とする癌細胞を免疫不全のヌードマウスに皮 下移植し、実験動物中に異種移植片を形成させることにより行うことができる。

次に、腫瘍を有する動物を様々な方法に従って、種々の用量のＦＧＦ−細胞毒素 コンジュゲート、等用量の細胞毒素、およびその他の種々の対照で処置する。Ｂ ＡＬＢ／ｃマウスにおけるコンジュゲートの致死量（ＬＤｉｏ）を決定すること により、最初にＦＧＦ−コンジュゲートの適切な用量の範囲を決定することがで きる。ＦＧＦ−５ＡＰを用いたインビボの実験結果は、例えば、以下の実施例■ に記載される。

実施例■ ヌードマウスを用いたインビボ抗腫瘍性実験セルライ：／ＳＫ−Ｍｅｌ−１、Ｓ Ｋ−Ｎ−ＭＣおよびＡ４３１については８〜１０週齢の雄ｎｕ／ｎｕマウスを、 セルラインＰＡ−１については８〜１０週齢の雌ｎｕ／ｎｕマウスを、それぞれ 用いて実験を行った。ヌードマウスはロジャーウィリアムス（Ｒｏｇｅｒ　ｆｉ ｌｌｉａｍｓ）病院動物飼育施設において飼育した。ＦＳａＩＩＣ細胞について は８〜１０週齢の雄Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（タコニックラボラトリーズ（Ｔａｃ ｏｎｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇｅｒ諷ａｎｔｏｗｎ、　ＮＹ）を用 いた。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＦＧＦ−３ＡＰのＬＤ、。は、広範囲の出血 （たいていは腸管における）によって毒性を表わした場合に、５００μｇ／ｋｇ であった（ラブピ（Ｌａｐｐｉ。

Ｄ、　Ａ、　）ら、「塩基性繊維芽細胞成長因子−サポリン分裂毒素：内皮細胞 成長阻害剤（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｔ、　５ｕｐｐ１．、１４Ｅ：　 ２２２．１９９の」）。インビボの実験においては、２Ｘ１０’ｌの腫瘍細胞を ５匹の群のマウスの右後脇腹皮下に移植した。

最初の実験においては、１２５５ｇ／ｋｇのＦＧＦ−５ＡＰまたは８５　ｐｇ／ ｋｇの５ＡＰ（それぞれの処置群においてサポリンの分子濃度が等しい）を滅菌 ＰＢＳに溶解して、腫瘍移植から０．１．５．１０または１５日後に、尾部静脈 から静脈内に一回投与した。次の実験においては、１週間ごとに０．５μｇ／ｋ ｇのＦＧＦ−５ＡＰを４回反復して静脈内投与した。腫瘍移植５日後から、それ ぞれの腫瘍の進行を少なくとも週に２回測定して、腫瘍の体積を次式に従って計 算した：体積：Ｓ［（最小測定値）！（最大測定値）］÷２結果は処置群の平均 腫瘍体積が非処置対照群の平均腫瘍体積の何倍であるかによって表わした。誤差 は平均値の標準偏差である。種々の処置群についての平均腫瘍体積は、スチュー デントｔ−テストを用いて統計的な比較を行った（Ｓｔａｔｖｉｅｖ　ＳＥ、Ｂ ｒｓｉｎｐｏｗｅｒ、Ｃａ１ａｂａｓａｓ、ＣＡ）　。

ＦＧＦ−８ＡＰの予備的な毒性学的評価によれば、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて 致死量が５００　ｇｇ／ｋｇであり（ラッピ（Ｒａｐｐｉ）ら、Ｊ、　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｃｈｅｔ、　５ｕｐｐｌ。

、　１４Ｅ：　２２２　（１９９０））　、２５０２ｇ／ｋｇでは致死的ではな かった。したがって、ＦＧＦ−ＳＡＰの初期投与量として１２５μｇ／ｋｇを選 択した。ヒト腫瘍異種移植片を有するヌードマウスを用いてパイロット実験を行 い、腫瘍移植から１．５．１０または１５日後にＦＧＦ−ＳＡＰを静脈内に一回 投与した。ＦＧＦ−ＳＡＰは腫瘍体積の速やかな（たいていは投与から４８時間 以内に）減少を引き起こし、幾つかの動物においては、完全な腫瘍退行が認めら れた。第１５日まで処置が行われず、腫瘍体積が約５０〜１００ｍｍ”であった 場合においても、腫瘍サイズの一時的な減少が観察された。しかし、第３０日ま でには、処置群のマウスの腫瘍の平均体積は、対照群の腫瘍のわずか５〜３３％ と測定された。ＦＧＦ−５ＡＰは、この投与量のレベルにおいては、第１．５ま たは１０日に投与した場合には同等に効果的であったため、以後の研究において は第５日を処置日として選択した。この時点においては、腫瘍の体積は約４０〜 ５０ｍｍ”であった。

次に、インビボにおける投与量応答を決定するため、一定のＳＡＰ量に対してＦ ＧＦ−８ＡＰ量を広範囲に変化させて比較実験を行った。ＦＧＦ−ＳＡＰまたは ＳＡＰにより処置した異種移植片の第３０日の平均腫瘍体積と、処置していない 対照との比較を表３に示す。実験は、ＰＡ−１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣまたはＳＫ−Ｍ ｅｌ−１の異種移植片を有するヌードマウスを用いて行い、ＦＧＦ−５ＡＰが成 長を阻害し、遊離のＳＡＰでは効果がなかったことが示された（表３）。ＦＧＦ −５ＡＰに対する抗腫瘍性応答は、ＦＳａＩＩＣ異種移植片を持つ免疫反応性宿 主マウスにおいても観察されたが、ＦＧＦ−５ＡＰの効果はこの一回投与養生法 において特徴的に短命であった。Ａ４３１異種移植片を持つマウスにおいては、 ＦＧＦ−３ＡＰまたはＳＡＰによる成長阻害は観察されなかった。

嚢】−マウスに腫瘍を移植した５日後にＦＧＦ−８ＡＰまたはＳＡＰを静脈内に 一回投与した時の投与量の効果“投与量　第３０日における平均腫瘍体積（対照 に対する％）５（ｇｇ／ｋｇ）　ＳＫ−ＭｅＬ−Ｉ　ＰＡ−Ｉ　ＳＫ−１１−Ｍ ＣＦＳａＩＩＣ＾４３１ｂＦＧＦ−ＳＡＰ　１２５．０　３９ｔ１４ｃ３２”８ ″３１ｔ１５″８３±１３　１５０ｔ２６ＳＡＰ　８５．０　１１８±２２　１ ０３±５９０±７１０５±０１２８±５ｂＦＧＦ−３ＡＰ　Ｏ，５６１土１９ ＳＡＰ　０．３　９２±９ ｂＦＧＦ−５ＡＰ　０１０２５　７１±１５ＳＡＰ　Ｏ，０１７１００±３ ａ：宿主マウスの右後脇腹に２Ｘ１０’個の腫瘍細胞を皮下移植した。

ｂ＝処置群の異種移植片の平均腫瘍体積は、１つの処置群あたり２〜１１匹のマ ウスを用いて計算した。対照群は、２〜２４匹のマウスであった。誤差は平均の 標準偏差である。

Ｃ：処置群および対照群の腫瘍体積間の有意差は、ｐ≦０．０１であった。

より低い用量のＦＧＦ−３ＡＰのインビボにおける評価とともに、ＦＧＦ−３Ａ Ｐを静脈内に反復投与する実験を行った。表３に示されるように、ＦＧＦ−５Ａ Ｐを０．　５ｔｔｇ／ｋｇで一回投与した場合、腫瘍体積は一時的に減少したの みであり、その後迅速な腫瘍の進行が認められた。したがって、ＳＫ−Ｍｅｌ− １、ＰＡ−１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣまたはＦＳａＩＩＣ異種移植片を有するマウスの 群を、第５日から初めて１週間に１回、全体で４回、ＦＧＦ−３，ＡＰ　（０， ５：Ｉｇ／ｋｇ）で処！した。表４は、低用量のＦＧＦ−５ＡＰ養生法を反復投 与したときの平均腫瘍体積を、高用量を一回投与したときの体積と比較したもの を示す。反復投与処置を用いて実験した場合、それぞれの腫瘍のタイプよ二つい て、第３５日には有意な腫瘍減少が認められた。この強力な抗腫瘍効果は、高層 ！の一回処置にお（・ては一様に認めらかなる・・・た。

！ま　腫瘍を有するマウス６におけるＦＧＦ−５ＡＰ処置群の比較ＳＫ−Ｍｅ＋ −１１２３８±１２’　６８±１２３５　２６±７°　１１±２１ ＰＡ−１１２５４±１０３　７２±１３３５　５６±１１　１９±６゛ ＳＫ−Ｎ−ＭＣ１２５８±１１　８４±５３５　３０±１１’　１８±７１ ＦＳａＩ　ＩＣ１２３４±１２°　５１±３゜３５　９２±１８　４２±４゜ ａ：宿主マウスの右後側腹に２Ｘ１０’個の細胞を皮下に移植した。

ｂ：平均腫瘍体積は、各投与群について２〜１４匹のマウスを用いて計算した。

対照群は、２〜２４匹のマウスであった。誤差は平均の標準偏差である。

ｃ：ＦＧＦ−５ＡＰの一回投与は、第５日に１２５μｇ／ｋｇを投与することに より行った。

ｄ：第５日に０，５μｇ／ｋｇのＦＧＦ−３ＡＰを投与し、その後１週間ごとに 計４回投与した。

ｅ：処置群と対照群の腫瘍体積の統計的誤差は、ｐ≦０．Ｏｌであった。

実施例Ｖ〜■に示されるように、ＦＧＦに共有結合された細胞毒素、特にリポソ ーム不活性化蛋白質であるサポリンは、細胞表面にＦＧＦに対するレセプターを 発現している種々のタイプの腫瘍細胞に対して、インビトロにおいて強力な細胞 毒性効果を表わすと結論づけることができる。インビトロのデータは、遊離ＳＡ Ｐと比較してＦＧＦ−５ＡＰが、ＦＧＦレセプターを有するＳＫ−Ｍｅｌ−１、 ＰＡ−１およびＳＫ−Ｎ−ＭＣ異種移植片に対して非常に優れた細胞毒性を有し 、Ａ４３１異種移植片に対しては有意の抗腫瘍効果がないことを正しく予測して し・る（表２）。

低用量反復投与されたＦＧＦ−８ＡＰのインビボにおける効力は特に印象的なも のである。この養生法は、最初の処置で生き残った腫瘍細胞に対し、比較的毒性 のない用量のＦＧＦ−８ＡＰを繰り返し投与することの利点を示す。治療の観点 からは、コンジュゲートを１回以上安全に投与しうろことは、実際上極めて重要 である。

さらに、親世代型メルタングセルライン（ロジャー・ウィリアムス癌センター（ Ｒｏｇｅｒ　？ｉｌｌｆａｍｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｒｏｗｎ　 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、　Ｒｒjより入 手可能）を用いてインビボ試験を行った。これに先立ち、実施例■に従ってこの セルラインのインビトロ試験を行った。このセルラインのインビトロにおける成 長は、コンジュゲートによって７２時間処理した場合に、ＦＧＦコンジュゲート 、特にＦＧＦ−５ＡＰによる処理によって著しく阻害された。このセルラインの ＩＣ６゜は１ｐＭと計算された。

実施例■ ＦＧＦ−３ＡＰコンジユゲートの静脈内投与ヌードマウスにおいて、最初にメル タング細胞を皮下に注入した部位の腫瘍体積に対するＦＧＦ−５ＡＰ投与の効果 を評価するために、以下の実験を行った。

親世代型メルタング細胞は、ロジャー・ウィリアムス癌センター（Ｒｏｇｅｒ　 ｆｉｌ１４ａａｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｂｒｏｗｎ　Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ、　Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ、　ＲＩ）より入手可能なヒトメラノーマセ ルラインである。メルタング細胞をｂＦＧＦ−ＳＡＰコンジュゲートとともに皮 下に注入するか、あるいはメルタング細胞を皮下に注入した後にｂＦＧＦ−５Ａ Ｐコンジユゲートを注入することにより、以下のプロトコールを実施した。

表５ マウス数　腫瘍細胞注入　ＦＧＦ−３ＡＰ注入（細胞数　２　Ｘ　１０’個）　 （０，１２５■ｇ／ｋｇ）５　ＳＱ、第Ｏ臼　なし ５　ＳＱ、第０日　ＳＱ、第Ｏ日＊ ５　ＳＱ、第１　１ＶＩＩＢ ５　ＳＱ、第０日　ＩＶ、第５日 ５　ＳＱ、第０日　ＩＶ、第１０日 ５　ＳＱ、第Ｏ８ＩＶ、ｊＦｒ１５日 解剖　第９０日 ＊　：　ＦＧＦ−８ＡＰを細胞懸濁液と混合して、同時に注入した。

次に上述のプロトコールを繰り返した。すなわち、２つの独立した実験の結果と して、それぞれの養生法について１０匹ずつのマウスを処置した。プロトコール の結果を図１から図５に示す。ｂＦＧＦ−８ＡＰは、ＩＶ処装が最初の腫瘍移植 から第１５日まで遅れた場合であっても、投与後１〜２日以内に腫瘍体積の著し い減少を引き起こした。このマウスについてさらに実験を実施し、実験第４２日 におけるそれぞれのマウスの状態をまとめた。第０８に腫瘍移植細胞と混合した コンジュゲートを投与されたすべてのマウスにおいて、腫瘍が完全に退行してい た。しかし、ｆｖ処置マウスの一部においては、一時期腫瘍は完全に退行したが その後再成長した。

実施例Ｘ ヌードマウスへのＦＧＦ−ＳＡＰの皮下注入ヌードマウスの病巣に皮下注入した 場合の、メルタングセルライン腫瘍に対する効果を比較するために、以下のプロ トコールを実施した。

マウス数　腫瘍細胞注入　薬剤注入＊ （細胞数　２　Ｘ　１０’個） ５　ＳＱ、第０日　ＦＧＦ−５ＡＰ　ＳＱ、第１０日５　ＳＱ、第０日　ＳＡＰ 　ＳＱ、第１０日解剖　第９０日 ＊：ＦＧＦ−５ＡＰの用量は０．　１２５ｍｇ／ｋｇであり、ＳＡＰの用量は０ 、　０８４＋ｚｇ／ｋｇであり、それぞれのＳＡＰの用量は等しい。

このプロトコールの結果は、腫瘍部位におけるコンジュゲートの注入は、等用量 の細胞毒素サポリンのみの注入よりも優れていることを示す。すなわち、コンジ ュゲートにより処置した腫瘍は小さいままであったのに対し、ＳＡＰにより処置 した腫瘍は再成長した。

本発明において注目する状態を治療するために、薬学的に許容される賦形剤中に ＦＧＦ−細胞毒素剤コンジュゲートを含む、治療に有効な抗腫瘍量の薬剤を哺乳 動物に投与する。薬学的に許容される賦形剤としては、ＰＢＳおよび生理食塩水 がある。一般に、コンジュゲートは静脈内（ＩＶ）または皮下注射（ＳＱ）によ り投与することができる。コンジュゲートはまた、病変内の腫瘍部位そのものの 皮下に投与することもでき、または区画内（ｉｎｔｒａｃｏ＊ｐａｒｔｍｅｎｔ ａｌｌｙ）の腹膜間隙に投与することもできる。実験動物は、投与経路にかかわ らず、コンジュゲートの投与に対して十分な耐性（ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）を有し ていた。総合的に、コンジュゲートを含む薬剤は、腫瘍細胞がＦＧＦレセプター を発現しているタイプの癌に罹患した患者の治療に特に有用である。腫瘍細胞の あるタイプのものは、オートクリン成長因子としてもＦＧＦを必要とし、このよ うな腫瘍は、特にこれらのコンジュゲートが有利に用いられる標的であると考え られる。

サポリンまたはりシンＡ鎖または同様の蛋白質等の細胞毒素が蛋白質合成を阻害 Ｌ・そのことによってＤＮＡ合成を阻害するという効力は、広く知られている。

したがワて、投与されるフンシュゲートの用量は、ある意味では、選択される特 定の細胞毒素に依存する。しかし、このような腫瘍性疾患の治療のためには、１ 日量として体重１ｋｇあたり約０．０１ｍｇから約１００ｍｇの範囲の量のコン ジュゲートが用いられることが予想される。

ＦＧＦ−５ＡＰ等のＦＧＦコンジュゲートの毒性は、コンジュゲートに用いられ る細胞毒素によって様々であると予想される。上述の実施例においては、はとん どの実験動物は低用量のＦＧＦ−５ＡＰに十分な耐性があり、このことから、コ ンジュゲートの有効かつ無毒性の用量は、実験動物のみでなくヒトの患者につい ても確立することができるという結論が導かれる。ＦＧＦフンシュゲート、特に ＦＧＦ−５ＡＰが正常細胞に対して最小の毒性を有するという実質的な証拠があ る。リンドナー（Ｌｉｎｄｎｅｒ）らは、ＦＧＦ−３ＡＰが正常細胞にほとんど 細胞毒性を有していないことを見いだした（Ｃｉｒｃ、　Ｒｅｓ、　６８．１０ ６−１１３　（１９９１））　。正常状態においては、塩基性ＦＧＦレセプター はコンジュゲートの内在化効果を媒介するほど十分に高いレベルでは発現されて いないものと考えられる。これは、ファーレン（Ｔｈａｌｅｎ）らによる、塩基 性ＦＧＦの全身投与はほとんどもしくは全く毒性効果を有しティないという結果 （Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、　１．１５７−１６４　（１９８９））と一 致する。したがうて、そして驚（べきことに、腫瘍その他の病理生理学的状態は 、ＦＧＦレセプターを選択的に発現しているために、ＦＧＦ−コンジュゲートの 作用に対して鋭敏な感受性を有している。

実施例■ ヌードマウスにおけるＦＧＦコンジュゲートの毒性この研究における大部分の動 物は、ＦＧＦ−３ＡＰまたはＳＡＰによる処置に対して十分な耐性を有していた 。ＳＫ−Ｍｅｌ−１、ＰＡ−１、ＳＫ−Ｎ−ＭＣまたはＦＳａＩＩＣ異種移植片 を有するマウスの１０％において、最高用量のＦＧＦ−８ＡＰ　（１２５ｊｇ／ ｋｇ）を投与した場合に、体重減少およびこれに伴う皮下出血および浮腫、さら に究極的な死亡が、１０から１４日の闇に生じた。Ａ４３１異種移植片を有し、 この最高用量を投与したマウスの６０％近くにおいても早死が生じた。しかし、 解剖によって、生きている組織における全体的な非正常性がないことが明らかと なり、また、転移性疾病により死亡した動物はいなかった。これに対し、低用量 のＦＧＦ−８ＡＰ　Ｃ表３および４を参照のこと）については、十分な耐性を有 し、これによる死亡はなかった。さらに、低用量のＦＧＦ−５ＡＰの反復投与を 受けたマウスにおいては、蓄積的毒性は示されなかった（表４を参照のこと）。

したがって、低用量ＦＧＦ−ＳＡＰによるインビボ腫瘍の長期的処置は、有効性 がありかつ無毒性であることが明らかとなった。毒性のある副作用または早死は 、用いられた用量においては、遊離ＳＡＰを投与したマウスにおいても、非処置 対照マウスにおいても認められなかった。

現在のところ最も好ましい態様によって本発明を記述してきたが、添付の請求の 範囲によって定義される本発明の趣旨を逸脱することな（、様々な変更および修 正を加えることが可能であることを理解すべきである。

本発明の特定の性質は、以下の請求の範囲に記載される。

国際調査報告 −１ベゴＭ＾’２４＠ｌｓ４＋−帛−−−一・陣１ガ１１１１／刺ｂ＋ｗｗ―障 −Ａ＃ｌｌｌｍｍＮｅ０ｒ丁／ＩＩＣ＜Ｈノｎｃｇ＊ｎＴｋｋ−−ｄｗＭＩＩＷ Ｉ−−ｎｋｋｇｔｍｅｌｍ−一一輪−ｍｍｍｐ）＝ス；＝＝：ミー２；ニー＝二 ｄｅａｎｋｋ−ｄ−フロントページの続き （７２）発明者　力ラブレシ、ボール アメリカ合衆国ロード・アイランド州 ０２８０６　、バーリントン、グレン・アヴ工ニュー　２７ （７２）発明者　ベイズ、ジュリー・ジ−アメリカ合衆国ロード・アイランド州 ０２９１６　、ラムフォード、トライオン・アヴアメリカ合衆国ロード・アイラ ンド州 ０２９１６　、プロヴイデンス、工ヴアレット・アヴ二二二一　８８ （７２）発明者　フラケルトン、エイ・レイモンド、ジュニア アメリカ合衆国ロード・アイランド州 ０２９１６　、ラムフォード、バーニー・ストリート１７５ （７２）発明者　ラッピ、ダグラス・エイアメリカ合衆国カリフォルニア用９２ ０１４゜デル・マー、カミニド・デス・ラス・オラス１２８４２ （７２）発明者　ベアード、アンドリュー・ジエイアメリカ合衆国カリフォルニ ア州９２１２２゜サン・ディエゴ、ヴイア・パペル　５０３９

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ＦＧＦ媒介性腫瘍性病理生理学的状態を有する哺乳動物を治療する方法であ って、治療に効果的な抗腫瘍量のＦＧＦコンジュゲートの投与を含み、前記ＦＧ Ｆコンジュゲートが、細胞毒素剤と結合した、ＦＧＦレセブターと反応性のある ＦＧＦポリペブチドからなることを特徴とする方法。
2. ２．前記コンジュゲートが塩基性ＦＧＦから形成される、請求項１記載の方法。
3. ３．前記細胞毒素がリボソーム不活性化蛋白質である、請求項２記載の方法。
4. ４．前記細胞毒素がサポリンである、請求項３記載の方法。
5. ５．前記哺乳動物がヒトである、請求項４記載の方法。
6. ６．前記病理生理学的状態がメラノーマである、請求項５記載の方法。
7. ７．前記病理生理学的状態が卵巣癌である、請求項５記載の方法。
8. ８．前記病理生理学的状態が奇形癌である、請求項５記載の方法。
9. ９．前記病理生理学的状態が神経芽細胞腫である、請求項５記載の方法。
10. １０．前記ＦＧＦコンジュゲートが皮下投与される、請求項１記載の方法。
11. １１．前記ＦＧＦコンジュゲートが静脈内投与される、請求項１記載の方法。
12. １２．前記ＦＧＦコンジュゲートが病変内投与される、請求項１記載の方法。
13. １３．前記ＦＧＦコンジュゲートが区画内投与される、請求項１記載の方法。
14. １４．哺乳動物における腫瘍性病理生理学的状態の抗腫瘍治療用薬剤を製造する ためのＦＧＦコンジュゲートの使用であって、前記ＦＧＦコンジュゲートが、Ｆ ＧＦレセブターと反応性のあるＦＧＦポリペブチドに結合された細胞毒素を含む ことを特徴とする使用。
15. １５．前記コンジュゲートが塩基性ＦＧＦから形成される、請求項１４記載の使 用。
16. １６．前記細胞毒素がリボソーム不活性化蛋白質である、請求項１５記載の使用 。
17. １７．前記細胞毒素剤がサポリンである、請求項１６記載の使用。
18. １８．哺乳動物におけるＦＧＦ媒介性メラノーマの抗腫瘍治療用薬剤を製造する ためのＦＧＦコンジュゲートの使用であって、前記ＦＧＦコンジュゲートがＦＧ Ｆレセブターと反応性のあるＦＧＦポリペブチドに結合された細胞毒素を含むこ とを特徴とする使用。
19. １９．哺乳動物におけるＦＧＦ媒介性卵巣癌の抗腫瘍治療用薬剤を製造するため のＦＧＦコンジュゲートの使用であって、前記ＦＧＦコンジュゲートがＦＧＦレ セブターと反応性のあるＦＧＦポリペブチドに結合された細胞毒素を含むことを 特徴とする使用。
20. ２０．哺乳動物におけるＦＧＦ媒介性奇形癌の抗腫瘍治療用薬剤を製造するため のＦＧＦコンジュゲートの使用であって、前記ＦＧＦコンジュゲートがＦＧＦレ セブターと反応性のあるＦＧＦポリペブチドに結合された細胞毒素を含むことを 特徴とする使用。
21. ２１．哺乳動物におけるＦＧＦ媒介性神経芽細胞腫の抗腫瘍治療用薬剤を製造す るためのＦＧＦコンジュゲートの使用であって、前記ＦＧＦコンジュゲートがＦ ＧＦレセブターと反応性のあるＦＧＦポリペブチドに結合された細胞毒素を含む ことを特徴とする使用。