JPH06501839A - Ｍａｐ２プロテインキナーゼファミリー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＭＡＰ２プロティンキナーゼファミリー１、　序論 本発明は、ＭＡＰ２プロティンキナーゼの新たに同定されたファミリーに関する 。それは、部分的には、中枢神経系やその他で発現されるＥＲＫＩ　ＥＲＫ２お よびＥＲＫ３と称する３種のＭＡＰ２プロティンキナーゼのクローニングおよび 特性決定に基づいている。本発明は、組み換えＭＡＰ２キナーゼ核酸およびタン パク質、組み換えＭＡＰ２キナーゼ分子を含む細胞系および微生物、並びに組み 換えＭＡＰ２キナーゼ分子を利用する生物学的に活性な化合物の存在を検出する ためのバイオアッセイを提供するレセプターチロシンキナーゼにより開始される リン酸化反応のカスケードは、インシュリンレセプターを含めた成長因子レセプ ターの可能な変換機構として提案された（Ｃｏｂｂ　ａｎｄ　Ｒｏｓｅｎ、　１ ９８４、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　７３８：ｌ−８ ；　Ｄｅｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓａｃ、 　Ｔｒａｎｓ、　１２ニア６８−７７１）ｏ　Ｃｏｈｅｎ　（１９８５，Ｅｕｒ 、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５１・４３９−４４８）は、酵素活性の正常な 調節におけるタンパク質リン酸化の役割に関する彼の論文の中で、ホルモン作用 における増幅および多様性が２つの主要な機構、すなわちタンパク質の可逆的リ ン酸化と“第２メツセンジヤー”の形成、により達成されると述へている。多く の重要な調節タンパク質は細胞プロティンキナーゼおよび幾つかのタンパク質ホ スファターゼによりリン酸化型と非リン酸化型の間で相互変換される。

一部のホルモンは、比較的少数の化学媒介物質である“第２メンセンツヤ−”の 生産を制御するトランスメンブランングナル系を活性化することによって、細胞 の内部にそれらの情報を伝達すると考えられる。これらの第２メツセンジヤーは その後プロティンキナーゼとホスファターゼ活性を調節し、これにより多くの細 胞内タンパク質のリン酸化状態を変更し、結果的にリン酸化の程度により調節さ れる酵素の活性を制御することが知られている（図１参照）。他のホルモンのレ セプターはそれ自体がプロティンキナーゼであるか、もしくは直接プロティンキ ナーゼと相互作用してプロティンキナーゼのシグナリングカスケードを開始させ る。これらの一連の現象は、種々のホルモンの作用と関係した多様性を解明する と考えられる（Ｃｏｈｅｎ、１９８５．　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 １５１：４３９−４４８；　Ｅｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ａ ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６：５６７−６１３）。

インシュリンは、大部分の細胞調節物質と同様に、調節タンパク質に含まれるセ リン残基とトレオニン残基のリン酸化状態の変化により、多くの細胞プロセスに 対してその効果を発揮する。インシュリンは、固有の千ロノン特異的プロティン キナーゼ活性を有するそのレセプターを介してその効果を発揮する（Ｒｏｓｅｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　ＵＳＡ　８０：３２３７−３２４ｆｌ　Ｅｂｉｎａ　ｅｔ　ａｔ、、　１９ ８５．　Ｃｅ１ｌ　４０ニア４７−７５８）　、数種の腫瘍遺伝子によりコード されるタンパク質もプロテインーチロシンキナーゼであることに注意されたい。

例えば、トランスメンブラン・トランスフォーミングタンパク質のＰ　６８　” ’−”’はインシュリンレセプターと多くの類似性を育し、５０％のアミノ酸同 一性を共有する（論議のために、Ｂｏｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０． 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：２７１３−２７１９を参照されたい ）。

中枢および末梢神経系のニューロンの発生と機能に必要な神経栄養物質である神 経成長因子（ＮＧＦ）も、少なくとも部分的に、細胞内タンパク質のリン酸化を 変更することにより、細胞機能に影響を及ぼすと考えられる。ＮＧＦは幾つかの 細胞タンパク質のリン酸化の変化を促進することが観察された（Ｖｏｌｏｎｔｅ 　ｅｔ　ａｌ。

、　１９８９．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０９：２３９５−２４０３ ；　Ａｌｅｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８゜Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 　１０６：１５７３−１５８１；　）Ｉａｌｅｇｏｕａ　ａｎｄ　Ｐａｔｒｉｃ ｋ、　１９８０゜Ｃｅ１ｌ　２２：５７１−５８１；　Ｈａｍａ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８ ３：２３５３−２３５７：　Ｒｏｍａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、 　Ｎｅｕｒｏｓｃｒ、　７：１２９４−１２９９中で論じられた）。さらに、Ｎ ＧＦは数種の異なるプロティンキナーゼの活性を調節するようだ（Ｂｌｅｎｉｓ 　ａｎｄ　Ｅｒｌｋｓｏ口。

１９８６、　ＥＭＢＯＪ、　５：３４４１−３４４７；　Ｃｒｅｍｉｎｓ　ｅｔ 　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０３：８８７−８９ ３；　Ｌａｎｄｒｅｔｈ　ａｎｄ　Ｒｉｅｓｅｒ、　１９８５．　Ｊ、　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ、　１００：６７７−６８３；　Ｌｅｖｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１ ９８８．　Ｍｏ１．　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、　２：２０１−２２６；　Ｍｕｔｏ ｈ　ｅｔ　ａｌ、＋　１９８８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１ ５８５３−１５８５６：　Ｒｏｗｌａｎｄ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２ニア５０４−７５１３）。ＭｕｔＯｈら（１ ９８８，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１５８５３−１５８５６）は 、ＮＧＦがＰｃｔ２ラット褐色細胞腫細胞系（ＮＧＦ機能の研究に常用されるモ デル系）でリポソームタンパク質Ｓ６をリン酸化し得るキナーゼ（Ｓ６キナーゼ ）の活性を増強するようだと報告している。ＶＯＩｏｎｔｅら（＋９８９．　Ｊ 、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０９：２３９５−２４０３）は、ＰＣ１２細胞 でのプリン類似体によるＮ　Ｇ　Ｆ応答の差示的阻害がＰＫＮ　（１’ＪＧＦ− 調節セリンプロティンキナーゼ）の阻害と関連があるようだと述べている。さら に、環状ＡＭＰ依存性プロティンキナーゼ（ＰＫＡ）およびプロティンキナーゼ Ｃ（ＰＫＣ）の活性化物質は、ＮＧＦに対する細胞応答の全部てはないが一部を 模倣すると報告されている（Ｌｅｖｉ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｍｏ１． 　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、　２：２０１−２２６）　ｏ　Ｍｉｙａｓａｋａら　（ １９９０，Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５：４７３０−４７３５）　は、ＮＧ Ｆが微小管結合タンパク質−２をリン酸化するＰＣ１２細胞中のプロティンキナ ーゼを刺激すると報している。面白いことに、細胞タンパク質のリン酸化の変化 とＮＧＦとを関連つける報告が多数存在するにもかかわらず、リガンドの低親和 性結合にとって十分なＮＧＦレセプターのサブユニットをコードするｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａ配列の解析は、この低親和性レセプターの細胞質領域のタンパク質−チロジ ンキナーゼドメインの証拠を何も提示していない０ｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４７：５４５−５５４）。

２．２．　ＭＡＰ２プロティンキナーゼリポソームタンパク質Ｓ６は、インシュ リン、成長因子および種々のトランスフォーミングタンパク質を含めた多様なマ イトンエン刺激に応答して、複数のセリン残基をリン酸化する真核細胞４０Ｓリ ポソームサブユニツトの構成成分である（論議のために、Ｓｔｕｒｇｉｌｌ　ｅ ｔ　ａｌ、、　＋９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３４ニア１５−７１８を参照され たい）。最近、活性型の８６キナーゼが精製され、免疫学的におよび分子的にそ の特性か決定された（Ｅｒｉｃｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍａｌｌｅｒ、　１９８６．　 Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６１：３５０−３５５；　Ｅｒ１ｃｓｏｎ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８７．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．７：３１４７−３１５５ ；　Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、ＬＩＳＡ　８５：３７７−３３８１：　Ｇｒｅｇｏｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｒｎ。

２６４：１８３９７−１８４０１）。Ｓ６キナーゼの再活性化およびリン酸化は 、インシュリンで刺激された微小管結合タンパク質−２（ＭＡＰ２）プロティン キナーゼにより　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで起こり、このことはプロティンキナーゼカ スケードの別の証拠を提供する（Ｓｔｔ＋ｒｇｉｌｌ。

１９８８、前掲；　Ｇｒｅｇｏｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．前掲）。ＭＡ Ｐ２キナーゼはセリン残基とトレオニン残基の両方で微小管結合タンパク質−２ （ＭＡＰ２）をリン酸化することが観察された（Ｒａｙ　ａｎｄ　Ｓｔｕｒｇｉ ｌｌ、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８４：１５０２−１５０６：　Ｂｏｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１． 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３０：２７８−２８６）　ｏこれらの観察は、インシュリ ン作用の重要な段階が少なくとも２つのセリン／トレオニンプロティンキナーゼ （Ｓｔｕｒｇｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３４ニア １５−７１８＋　Ｇｒｅｇｏｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ−２６４：１８３９７−１８４０１；　Ａｈｎ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９９０．　Ｊ、　Ｂｒｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５：１１４９５−１１５０ １）、すなわちＭＡＰ２キナーゼと８６キナーゼ、のリン酸化による逐次活性化 を伴うことを示唆している。ＭＡＰ２キナーゼはＳ６キナーゼ活性化に先立って インシュリンにより一時的に活性化されると考えられる。

ＭＡＰ２キナーゼはｉｌ　ｖｉｔｒｏでＳ６キナーゼをリン酸化し、その活性の 増加を引き起こす（Ｇｒｅｇｏｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６４：１８３９７−１８４０１＋　Ｓｔｕｒｇｉｌｌ　ｅｔ　ａ ｌ、、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３３４ニア１５−７１８）。従って、ＭＡ Ｐ２キナーゼはこのプロティンキナーゼカスケードにおける有望な中間体である 。トレオニンおよびチロシン残基でのリン酸化がＭＡＰ２キナーゼ活性にとって 必要であるという発見（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．　Ｎａ ｔｕｒｅ、　３４３：６５１−６５３）は、それが、多くの池のタンパク質と同 様に、多重リン酸化により調節されることを示唆している。リン酸化は１つまた は幾つかのシグナル変換経路により伝達され得る。

インシュリンによる刺激のほかに、ＭＡＰ２キナーゼ活性は細胞増殖および／ま たは分化を促進する多種多様な細胞外シグナルによって速やかに増強することか できる。この点て、ＭＡＰ２キナーゼはタンパク質のホスホチロシン含有量が成 長因子との接触およびウィルスによる形質転換（Ｒｏｓｓａｍｏｎｄｏ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９８９．　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６９４０−６９４３ ）およびｖ−ｒｏｓ腫瘍遺伝子の活性化（ＢｏｕＨｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９ ９（１，Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：２７１３−２７１９）後に増 加するｐ　ｐ　４２　（Ｃｏｏｐｅｒ　ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ、　１９８１．　 Ｍｎ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１：１６５−１７８）と同等であるだろう 。例えば、ＭＡＰ２キナーゼ活性は次の細胞内で刺激される：インシュリンに応 答して末期的に分化した３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞（Ｒａｙ　ａｎｄ　Ｓｔｕｒｇｉ ＩＩ、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ 　８４：１５０２−１５０６）；カテコールアミン分泌を誘発するシグナルに応 答して有糸分裂後の副腎クロム親和性細胞（Ｅｌｙ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｒｉｏｌ、　１１０ニア３ｌ−７４２）；神経成長因子−誘発ニューロ ン分化に応答してＰＣ１２細胞（Ｖ。

１ｏｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、＋９８９．　Ｊ、　Ｃｅ目、Ｂｉｏｌ、１０９：２ ３９５−２４０３＋　Ｍｉｙａｓａｋａｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、　２６５：４７３０−４７３５）；およびＴリンパ球（Ｎｅｌ　ｅｔ　 ａｌ、、　１９９０．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１４：２６８３−２６８９） 。ＭＡＰ２キナーゼは多くの異なる経路で、広範な細胞型においてシグナル変換 の重要な役割を演するらしい。

ＲａｙとＳｔｕｒｇｉｌｌ　（１９８８，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６ ３：１２７２１−１２７２７）は、ＭＡＰ２キナーゼの幾つかのクロマトグラフ ィー性質を開示し、部分精製酵素の生化学的特徴を報告している。ＭＡＰ２キナ ーゼは疎水性のクロマトグラフィーマトリックスに対し親和性を有することか観 察された。部分精製酵素の分子量はゲル濾過クロマトグラフィーで３５．０００ 、グリセロール勾配遠心で３７．０００であると観測された。クロマトグラフィ ー画分のＭＡＰ２キナーゼ活性は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により検出された４０ｋＤａのリンタンパ ク質の存在と関連のあることが分かった。ＭＡＰ２キナーゼはＡＴＰに対して７ μＭのＫｍを有し、ＧＴＰは利用しないようたった。ＭＡＰ２キナーゼは活性の ためにチロシンおよびセリン／トレオニン残基でのリン酸化を必要とすることが 観察された。ＲａｙとＳｔｕｒｇｉ　ＩＩ（前掲）はＭＡＰ２キナーゼの精製に おいて直面した幾つかの問題、特にｉｎ　ｖｉｔｒｏてＭＡＰ２をリン酸化する ことが観察された汚染キナーゼ類の存在を挙げている。その上、クロマトグラフ ィー分離後に、ごく少量の部分精製タンパク質が利用できたにすぎなかった。上 で論じたように、Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏら（１９８９，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８６：６９４０−６９４３）は、ＭＡＰ２キ ナーゼが種々のマイトジェンによる細胞刺激の後にチロシンで一時的にリン酸化 される少量の４２ｋＤａタンパク質、ｐｐ４２のチロシン−リン酸化型であり得 ることを示唆した。Ｒｏｓｓｏｍｏｎｄｏら（前掲）は、ｐｐ４２のリン酸化と ＭＡＰ２キナーゼの活性化が同じマイトジェンに応答して起こり、２つのタンパ ク質が二次元ポリアクリルアミドゲル上で共泳動しかつ類似のペプチドマツプを 有し、そして２つのタンパク質がアニオン交換、疎水相互作用およびゲル濾過媒 体上での逐次精製において共線化することを観察した本発明は、微小管結合タン パク質２　（ＭＡＰ２）をリン酸化するプロティンセリン／トレオニンキナーゼ の新たに同定されたファミリーに関する。それは、部分的には、中枢神経系で発 現される細胞外シグナル調節キナーゼｌ、２および３　（ＥＲＫＩ、ＥＲＫ２、 ＥＲＫ３）と称する新規Ｍ　Ａ　Ｐ　２プロテインキナーゼのクローニングおよ び特性決定に、並びに抗血清を用いたＥＲＫファミリーの一員であるＥＲＫ４の 同定に基づいている。従って、ここで用いる’ＭＡＰ２キナーゼ”という用語は ＭＡＰ２キナーゼファミリーの一員を意味し、ＥＲＫＩ、ＥＲＫ２、およびＥＲ Ｋ３を含むが、これらに限定されないものである。

本発明は、組み換え核酸分子およびＭＡＰ２キナーゼファミリーの構成員に相当 するタンパク質、さらに組み換えＭＡＰ２キナーゼ分子を含む微生物、トランス ンエニソク動物および細胞系を提供する。本発明の別の態様において、本発明は 、神経成長因子活性を含むがこれに限定されない細胞因子活性を検定する方法を 提供し、その際ＭＡＰ２キナーゼの活性化が細胞因子活性の指標として役立つ。

これらの方法は、所望の細胞因子活性の存在について化合物をスクリーニングす るのに非常に有効である。特定の態様では、アルツハイマー病、末梢神経障害、 および糖尿病の治療に有用であり得る化合物か本発明方法を使うことにより同定 できる。

図１．細胞レセプターへのホルモン結合とその結果起こるタンパク質リン酸化の 変化との関係を示す略図。

図２．Ａ、ＮＧＦ−処理した、または対照のＰＣ１２細胞から単離した最終Ｑ− セファロース＃２画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析。最終精製カラム（Ｑ−セファロ ース＃２）から得られた画分のアリコートを濃縮し、その後１５％５ＤＳ−ＰＡ ＧＥで分析した。最大のＭＡＰ２キナーゼ活性を含む画分は、インシュリン−刺 激ＭＡＰ２キナーゼＢＳＡについて記載したように、約４３，０００　ｋＤの分 子量を有する顕著なバンド（矢印）を含んでいたことに注意されたい。オボアル ブミンとントクロムＣをサイズ標準として示しである。

Ｂ、ＥＲＫＩ　ｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列（配列番号・ｌ）およびその 推定タンパク質産物（配列番号：２）。星印は全てのプロティンキナーゼの中で 最も保存されている残基を表す。

配列が決定された９つのトリプシン消化ペプチドの配列には下線が引いである。

アミノ酸シークエンシングにより正確に決定された残基は全てｃＤＮＡコード化 タンパク質配列と合致し、疑わしい残基はｃＤＮＡコード化タンパク質配列から 証明された。表示した第４および第７ペプチドは本文に記載したマイナーペプチ ド成分を表していた。

図３．ＥＲＫ２とＥＲＫ３のｃＤＮＡおよびＥＲＫｌψ偽遺伝子のヌクレオチド 配列および推定タンパク質配列。開始および終止コドンを四角で囲っである。プ ロティンキナーゼのサブドメインのおおよその位置をローマ数字で示す。星印は 全てのプロティンキナーゼの中で最も保存されている残基を表す（Ｈａｎｋｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　１９８８、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：４２−５２）。ポンド記 号はこれらの残基のとれか表示した配列において保存されないかを表す。

Ａ、２つのＥＲＫ２　ｃＤＮ、へクローンのうちの１つのヌクレオチド配列（配 列番号＝３）および推定タンパク質配列（配列番号：４）。Ｉｔ！！のＥＲＫ２ 　ｃＤＮ、Ａのタンパク質コード領域は正確に合致するか、フランキング領域の 配列が分岐している。

Ｂ６分析した２つのＥＲＫ３　ｃＤＮＡクローンのうちの１つの完全なヌクレオ チド配列（配列番号：５）および推定タンパク質配列（配列番号：６）。他のＥ ＲＫ３　ｃＤＮＡの配列は正確に合致するが、フランキング配列の量において差 異かあった。

Ｃ，ＥＲＫＩψとＥＲＫＩのヌクレオチド配列の部分配列の整合、ＥＲＫＩタン パク質配列質相列するアミノ酸（四角て囲ったＥＲＫＩψの未熟終止コドンを含 む）のみを示しである。ダッシュ記号はヌクレオチド配列とアミノ酸配列の両方 における欠失を示す。

図４．ＥＲＫとＦＵＳ　３、ＫＳＳＩおよびヒトｃｄｃ２タンパク質配列との比 較。

Ａ、コンピュータにより形成された整合（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ　Ｃｏｍｐｕｔｅ ｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ）１ａｖｅｎ、　ＣＴ）を 可視的に最適化した。ローマ数字はプロティンキナーゼにおいて保存されたサブ ドメインを示す（Ｈａｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ、。

！９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：４２−５２）。点線はＥＲＫＩ配列との同 一性を、ダッシュ記号は配列整合を高めるために導入されたスペースを示す。

Ｂ、ｃｄｃ２−配列の長さにわたり決定された、Ａで整合させた配列間の同一性 ％。２つの配列間の不適正塩基対、挿入および欠失は等しく加重した。

図５．ＥＲＫＩ−１ＥＲＫ２−およびＥＲＫ３−特異的プローブの使用は別のＥ ＲＫ遺伝子の証拠を提供する。

、Ａ、ＥＲＫプローブのそれぞれの特異性（「物質および方法Ｊに記載）は、３ つの３通りのサザーンプロット（それぞれ各レーンに示した通りのＥＲＫＩ、Ｅ ＲＫ２およびＥＲＫ３のｃＤＮＡ挿入物を含む線状化プラスミドを含む）を、プ ロットの下に示したＥＲＫプローブのそれぞれとハイブリダイズさせることによ り証明した。

Ｂ、ＥｃｏＲｌ−消化ラットおよびヒトゲノムＤＮＡを含むサザーンプロットの ＥＲＫ−特異的プローブによる検索。Ｄ　Ｎ　Ａ断片の大きさはキロベースで示 した。

Ｃ，Ｂｇ１２、ＢａｍＨｌおよびＨｉｎｄ３で消化したラットゲノムＤＮＡを含 むサザーンプロットのＥＲＫ−特異的プローブによる検索。ＤＮＡ断片の大きさ はキロベースで示した。

図６８組織、アストログリア培養物およびＰ１９胚性がん腫細胞系におけるＥＲ Ｋ転写物の独立調節。

Ａ、成体神経系、成体末梢組織および胎盤における各ＥＲＫの異なる発現パター ン。各ＥＲＫの特異的プローブ（図３参照）を、示した成体組織および脳領域か らのＲＮＡｌ０μｇを含むノザンプロットとハイブリダイズさせた。ＡＤＲ１副 腎；ＲＥＴ、１４Ｍ：　ＳＣ，Ｎ、　、座骨神経＋Ｓ、Ｃ，、を髄、Ａ、ＢＲ１ 成体脳；　ＣＢＬ、小脳；　ＨＢＲ１後脳：ＭＢＲ１中脳、ＤＩＥＮ、視床下部 ；５ＴＲ１線条：ＨＩＰ、海馬；ＣＴＸ、新皮質；ＯＬＦ、嗅球；５ＫＩＮ、皮 膚；　ＨＲＴ、心臓；ＭＵＳ、筋肉：　ＬＵＮＧ、肺；ＩＮＴ、腸、ＫＩＤ、腎 臓；ＬＩＶ、肝臓；　ＳＰＬ、牌臓、ＴＨＹ、胸腺；　ＰＬＡＣ１胎盤。

Ｂ、ＥＲＫ転写物は発生上は神経系と末梢組織において調節される。ラット脳、 を髄、海鳥（ＨＩＰＰ）、肝臓および心臓の表示した発生段階（Ｅ：胚日齢；Ｐ ：出生後日齢＋ＡＤ：成体）から単離した全ＲＮＡ　１０ｐｇは各ＥＲＫ−特異 的特異的プローブ＼イブリダイゼーションについて比較した。

Ｃ，ＥＲＫ２およびＥＲＫ３転写物はアストロダリア培養物において低レベルで 発現された。成熟ラット脳（ＢＲＮ）またはアストロダリア培養物（Ａ　Ｓ　Ｔ ）からの全ＲＮＡ　１０ｐｇは各ＥＲＫ−ＲＫ−プローブを使って検索した。

Ｄ、Ｐ１９胚性がん腫細胞の分化における個々のＥＲＫ遺伝子の独立調節。成熟 ラット脳由来の、またはレチノイン酸−誘発された（ＮＥＵＲ）あるいはＤＭＳ Ｏ−誘発された（ＭＵＳＣ）未分化のＰ１９細胞（ＳＴＥＭ）由来の全ＲＮＡ　 １０ｐｇを使用してノザンプロットを調製し、示したようにプローブで検索した 。

ＬＡＮＧＦＲは低親和性ＮＧＦレセプターのためのプローブを表し、ＧＡＰＤＨ 対照プローブは等量のＲＮＡが各レーンに負荷されたことを示す。

図７．Ｅ、ｃｏｌｉての活性ＥＲＫ２の発現。

Ａ、ＥＲＫ２またはベクターのみを発現するＥ、ｃｏｌｉの溶解物からの等量の タンパク質の銀染色ゲル。矢印は組み換えＥＲＫ２を示す。

Ｂ、　Ａに示した同量のＥ、ｃｏｌｊ抽出物と約４０ｎｇの部分精製ＥＲＫＩの 抗血清８３７によるイムノプロット。

Ｃ，１６２，２７０または５４０μｇの精製組み換えＥＲＫ２の銀染色（左）お よび自己リン酸化（右）。

Ｄ、ＭＢＰと共に０．１５．３０．４５および６０分間インキュベートした精製 組み換えＥＲＫ２のキナーゼ活性。

図８．抗ペプチド抗体の特異性。

Ａ、ＰＣ１２細胞および成熟ラット脳由来の１００μｇの可溶性タンパク質のク ーマシーブルー染色。

Ｂ０部分精製ＥＲＫ１、組み換えＥＲＫ２、およびＰＣＩ２細胞由来の１００μ ｇの可溶性タンパク質、胚性脳（ＥＭ　ＢＲ）および成体脳（ＡＤ　ＢＲ）由来 の１００μｇの可溶性（Ｓ）および粒状（ｐ）タンパク質（Ｂｏｕｌｔｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９９１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３０：２７８−２８６に記載の 通りに調製した）と抗血清９５６とのイムノプロット。

Ｃ０複製したプロットを抗血清８３７で検索した。

図９．インシュリンー刺激ラットＩ　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞およびＮＧＦ−刺激ＰＣ １２細胞由来の１２ｐ−標識ＥＲＫタンパク質の免疫沈降。

Ａ、ＥＲＫＩはインシュリンにさらした（＋）またはさらさない（−）”Ｐ−標 識ラットＩ　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞（左）およびＮＧＦにさらした（＋）またはさら さない（−）ＰＣ１２細胞（右）からの抗血清８３７により免疫沈降させた。線 の表示は１１６．８４．５８．４８．５．３６．５および２６．６ｋＤａの分子 量標準を示す。

Ｂ、ＮＧＦにさらしてまたはさらさないてパートＡと同様に行ったが、変性免疫 沈降を使用した。

Ｃ，ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞からの免疫沈降したＥＲＫＩのホスホアミノ酸分 析。ホスホアミノ酸標準の位置を示しである。標識の４時間後、ＥＲＫＩはＮ　 Ｇ　Ｆの不在下てセリンにおいてリン酸化されただけだった。

図１０．免疫沈降ＥＲＫタンパク質のイムノプロット。ＥＲＫはインシュリン− 処理（＋）または未処理（−）ラットＩ　ＨＩＲｃＢｍ胞からの１ｍｇの上清タ ンパク質から、変性条件下で、抗血清８３７を使って免疫沈降された。免疫沈降 タンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ホスホチロシン（Ｐ−Ｙ）に対する抗 体またはＥＲＫ抗血清６９１を用いて検索した。ＥＲＫて表したレーンはＥＲＫ ＩとＥＲＫ２の両方が存在するフェニルセファロース画分のアリコートを含む。

図１１．ＮＧＦ−処理または未処理ＰＣＩ２細胞がらの上清のＭｏｎ０Ｑでのク ロマトグラフィー。ＮＧＦで処理したまたは処理しないＰＣ４２細胞の上清から のｌ　Ｏｍｇのタンパク質をＭ　ｏ　ｎ　ｏ　Ｑカラムでクロマトグラフィーに かけた。ＭＢＰの場合のキナーゼ活性を上のパネルに示す。番号を付けた画分は 沈降させ、表示した抗体、９５６．８３７または抗ホスホチロシン（αＰ−Ｙ） を用いてイムノプロットを行った。

５、　発明の詳細な説明 本発明の開示をより明確なものとするために、本発明の詳細な説明を以下のサブ セクションに分割することにする（ｉ）　ＭＡＰ２キナーゼタンパク質のクロー ニング：（ｉｉ）ＭＡＰ２プロティンキナ−セファミリ−の池のメンバーの同定 ： （ｉｉｉ）組み換えＭＡＰ２プロティンキナーゼの発現：（ｉｖ）　抗ＭＡＰ２ プロティンキナーゼ抗体の生産：（Ｖ）　ＭＡＰ２キナーゼ活性のバイオアッセ イ：および（ｖｉ）　本発明の有用性。

５．１．　ＭＡＰ２キナーゼタンパク質のクローニング本発明によれば、既知の ＭＡＰ２キナーゼ配列、例えば、限定するものではないが、図２Ｂ（配列番号： ｌ）、３Ａ（配列番号＝３）、および３Ｂ（配列番号：５）に示される配列、お よび／またはＡＴＣＣに寄託されて、それぞれ受託番号４０８０８．４０８０９ および７５００９を指定された、プラスミドｐＢＳ−ｒＥＲＫｌ、　ｐＢＳ−ｒ ＥＲＫ２、またはｐＢＳ−ｒＥＲＫ３に含まれる配列、に相同な配列を含むクロ ーン化核酸を同定することにより、ＭＡＰ２プロティンキナーゼをクローニング することができる。また、精製したＭＡＰ２キナーゼタンパク質からこのような 配列情報を得ることも望ましいだろう。

精製ＭＡＰ２キナーゼはＭＡＰ２キナーゼ活性を含む組織、例えばＴリンパ球、 インシュリン−処理した、末期的に分化した３Ｔ３−Ｌｌ脂肪細胞、カテコール アミンを分泌するように誘導された有糸分裂後の副腎クロム親和性細胞、神経成 長因子で処理したＰＣＩ２細抱、脳組磯、インシュリンー処理したラットＩＨｒ Ｒｃ　Ｂ細胞、およびシースター（ｓｅａｓｔａｒ）やアフリカッメガエル（Ｘ ｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）卵母細胞のような下等真核生物から得られる。Ｐ Ｃ１２細胞からのＭＡＰ２キナーゼの精製は、インシュリン−処理したラットｌ 　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞からのＭＡＰ２キナーゼの精製に類似するよってある（図２ Ａ）。

本発明の特定の態様では、限定するものではないが、次のようにしてＭＡＰ２キ ナーゼをかなりの程度に精製することかできる（Ｂｏｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 、１９９１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３０：２７８−２８６）。ＭＡＰ２キナーゼ 含有細胞を用いて、ＭＡＰ２キナーゼの粗製調製物からなる無細胞抽出物を調製 する。例えば、ＰＣ１２細胞を、１０％つ／胎児血清と５駕ウマ血清を含むＤＭ Ｅ培地で培養し、次に、ＮＧＦ処理に先立って、無血清培地中で約１時間インキ ュベートする。その後、約４ｎＭの！ＩＩＩてＮＧＦを加え、細胞を５分間イン キュベートする。別法として、インシュリン−処理したラットｌ　ＨＩＲｃ　Ｂ 細胞も使用できる。次いで培地を除き、細胞を洗い、２０ｍＭｐ−二ト０フェニ ルホスフェート、２０＋ｎＭ）リス−）１ｃＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＧＴＡ、 ５０　ｍＭフン化ナナトリウム５０ＭＭオルトバナジウム酸ナトリウム、および ５　ｍＭペンズアミンン（ＭＡＰ２キナーゼ）を含む水冷ホモジナイゼーンヨン 溶液に細胞をかき取る。

未処理細胞の等しい数の培養皿を対照として収穫することが望ましい。好ましく は、以後の全工程を４℃て行う。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーの３０−５０スト ロークを用いて細胞を破砕し、ホモジネートを４０００　Ｘ　ｇで５分間遠心す る。次に、上清を９７．０００　Ｘ　ｇて６０分間遠心する。得られた上滑は、 好ましくはすぐに、検定し、その後液体窒素下で貯蔵する。

Ｍ　Ａ　Ｐ　２キナーゼの精製のために、１５０−２００のｌ５０−Ｃｍ”皿の インシュリン−処理したラットＩ　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞を合わせた可溶性画分（２ ２５−３００ｍｌ）は（水を用いて）３．５ｍＳの伝導度に、および４ｃＩＭｃ 、ＡＭＰ、０．５ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリドおよび０．１μ■ ペプスタチンの濃度に調整し、続いてＱ−セファロースカラム（１，５Ｘ　１９ 　ｃｍ）でクロマトグラフィーにかける。カラムは４０ＭＭｃＡＭＰを含む緩衝 液Ａ　（１０％グリセロール、２５ｍＭ）リス−）１ｃＩ、ｐＨ７，５，５０Ｍ Ｍオルトバナジウム酸ナトリウム、ｌ　ｍＭジチオトレイトール、５０ｍＭＮａ Ｆ、２０　ｍ！Ｊβ−グリセロールホスフェート、ｌ　ｍＭ　ＥＧＴＡ、　１０ 　ｍＭベンズアミジン、１０　ｍＭ　ｐ−ニトロフェニルホスフェート、０．５ ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリド、および０．１　μＭペプスタチン ）の４−５倍容量で洗う。その後、緩衝液Ａ中のＯ−０，４Ｍ　ＮａＣｌの勾配 によりタンパク質を溶離する。刺激されたＭＡＰ２キナーゼ活性を含む両分をプ ールし、フェニル−セファロースカラム（１，５ｘ　１８　ｃｍ）にかける。カ ラムは０．２５Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液への５倍カラム容量で洗い、グリセロ ールを含まない緩衝液Ａ中の０．２５−０．０２５ＭＮａＣ１の下降勾配と０− ６５％エチレングリコールの上昇勾配でタンパク質を溶離する。フェニル−セフ ァロースカラムからキナーゼ活性をプールし、Ｓ−セファロースの５ｍｌカラム （１，５ｘ　３　ｃｍ）続いてホスホセルロースの５ｍｌカラム（１，５ｘ　３ 　ａｍ）に直接加える。両方の場合に、ＭＡＰ２キナーゼ活性を含む非吸着物質 と２倍カラム容量の洗液を集める。ホスホセルロースカラムからのＭＡＰ２キナ ーゼ活性は直接ＱＡＥ−セファロースカラム（１ｘ　２４　ｃｍ）にかける。カ ラムを５倍容量の緩衝液Ａで洗い、タンパク質を緩衝液Ａ中のＯ−０，４Ｍ　Ｎ ａＣＩの勾配で溶離する。その後、ＭＡＰ２キナーゼ活性を含む両分をプールし 、Ｂｒ１ｊ−５８を加えて０．０１％の最終濃度（以後の全工程に含まれる）と し、限外濾過によって試料を１．５−２　ｍｌに濃縮して、０．２ＭＮａＣ１お よび０．０１〜Ｂｒｉ　ｊ−５８を含む緩衝液、八で平衡化したしｌｔｒｏｇｅ ｌ　ＡｃＡ３４カラム（ｌ　ｘ　１１２　ａｍ）に負荷する。ケル濾過カラムか らの両分を２゜４　ｍＭ　ロイペプチンを含むチューブに集める。活性含有画分 を濃縮し、伝導度か３　ｍＳに低下するまで０．Ｏ１〜Ｂｒｉ　ｊ−５８を含む ２５　ｍＭトリス、ｐＨ７，５、ｌ　ｍＭ　ＤＴＴ、　１０　ｍＭ　リン酸ナト リウム、０．１μＭペプスタチン、０．５ｍＭ　フェニルメチルスルホニルフル オリドで希釈し、その後Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ−セルロース（０，７ｘ　１８　ｃｍ） にかける。活性は緩衝液Ａ中のＯ−０，２５Ｍ　ＮａＣｌの勾配で溶離する。

活性含有画分をプールし、必要に応して上記のように濃縮および希釈し、そして ＭｏｎｏＱ　ＨＲ５１５またはＱ−セファロース（０，５Ｘ　９　ｃｍ）カラム のいずれかにがける。緩衝液、Ａ中の０−０゜２５ＭＮａＣ］の勾配（〜１ｏｎ ｏＱから）てＭＡＰ２キナーゼ活性を溶離する。両分を検定し、直ちに液体窒素 中で凍結する。

精製した〜１ＡＰ２キナーゼをトリプシンで消化し、得られたペプチドをセクシ ョン６．１に記載するようにＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ａｂｅｒｓｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、 　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４ ：６９７０−６９７４）にかける。次に、ピークの１つから得られたペプチドを ２回目のクロマトグラフィー分離にかける。ＭＡＰ２キナ−セタンバク質配列の 断片を正確に決定するために、当業者には理解されるように、ペプチドの反復精 製を行って、メジャー成分ペプチドとマイナー成分ペプチドとを区別することが 必要だろう。

ペプチドの配列は当分野で知られたいずれかの方法を用いて決定することができ る。例えば、酵素含有画分をプールし、０．０５％Ｌｕｂｒｏｌと８．５％　ト リクロロ酢酸（Ｗ／Ｖ）の最終濃度を加えてタンパク質を沈殿させる。アセトン で洗った後、タンパク質を電気泳動緩衝液に溶解し、２５０　ｐｍｏｌをＳＤＳ 中の１０％ポリアクリルアミドケルに負荷する。タンパク質を電気泳動的にニト ロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ、　Ｋｅｅｎｅ 、　ＮＨ）に移行させる。トリプシンでのｉｎ　５ｉｔｕ消化のために（Ａｂｅ ｒｓｏｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：６９７０−６９７４）　４３　ｋＤａバ ンドを切り出し、ニトロセルロース上でほんのわずかに速く移動するマイナー成 分を残す。切り出したニトロセルロース片から放出されたペプチドは、２、　ｌ 　Ｘ　１００　ｍｍ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＲＰ−３００カ ラムを装着した１３０Ａ型クロ７トグラフイーシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ、、　Ｆ。

５ｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）てＨＰＬＣにかける。０．１％トリフルオロ酢酸 中で、５０μＩ／分の流速で、１００分間の０−７０％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリ ルの勾配を用いて分離を行う。溶出物の吸光度を２１４　ｎｍで監視し、溶出し た成分を手動で集める。ペプチドをＷｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃペーパーの１　ａ ｍディスク上で乾かし、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の１２０Ａ型 フエニルチオヒダントインアナライザーを備えた４７０Ａ型アミノ酸ンークエン サーを使って、製造元の説明書により配列解析を行う。

マイクロシーフェンシングを可能にする適量のＭＡＰ２キナーゼタンパク質の精 製は、Ｎ１ＡＰ２キナーゼｃＤＮＡのクローニングを可能にする。かかるクロー ニングの戦略は、既知アミノ酸配列のセグメントに基づいて相補オリゴヌクレオ チドプローブを作製し、このプローブを使って、ＭＡＰ２キナーゼをコードする ｍＲＮＡを合成する組繊から作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングす ることである。最初に、精製ＭＡＰ２キナーゼタンパク質から誘導されたアミノ 酸配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを推定し、このプライマーを作製 して、標準スクリーユング法またはポリメラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐ ＣＲ）　（Ｓａｉｋｉ　ｅｒ　ａｔ、、　１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０： １３５０−１３５４）において使用する。遺伝暗号の縮重（数種のトリブレット か同一のアミノ酸を規定する）のために、所定のアミノ酸配列に対して数種のオ リゴヌクレオチドを合成して、複数の可能なヌクレオチド配列の組合わせを得る べきである。得られたオリゴヌクレオチドは縮重プライマーと呼ぶことにする。

例えば、本発明の特定の態様では、精製ＭＡＰ２キナーゼタンパク質から得られ たトリプシン消化ペプチド配列のセグメントに対するコード鎖または非コード鎖 に相当する一連の縮重オリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌク レオチドは有利にはその５゛末端に非縮重尾部を含むだろう。それぞれのコード 鎖オリゴヌクレオチドの尾部は、例えば、ＥｃｏＲ１制限部位を含み、一方それ ぞれの非コード鎖オリゴヌクレオチドの尾部は、例えば、５ａｉｌ制限部位を含 む。各コード鎖オリゴヌクレオチドはその後、鋳型としてう、ント１細胞由来の ｃＤＮＡを使用する個々のＰＣＲ反応において、各非コードオリゴヌクレオチド と組み合わせる。ＰＣＲ反応とゲノムおよびｃＤＮＡ鋳型の調製は、Ｍａｉｓｏ ｎｐｉｅｒｒｅ、　Ｃ，ｅｔ　ａｔ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７： １４４６−１４５１およびＢｏｔｈｗｅｌｌ、　Ａ、、　Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏ ｓ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ａｌｔ、Ｆ、、１９９０．　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｇ ｅｎｅｓ　（真核生物遺伝子のクローニングおよび分析方法）″、　Ｊｏｎｅｓ 　ａｎｄ　Ｂａｒｔｌｅｔｔ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡに記載される通りに行う 。例えば、ＱＹＩＧＥＧコードオリゴヌクレオチドとＤＬＫＰＳＮ非コードオリ ゴヌクレオチド（ＱＹＤＬと称する）を用いて得られり増幅産物はセファデック スＧ−５０スピンカラムを使って単離し、ＥｃｏＲｌと５ａｉｌて消化し、２％ Ｎｕｓｉｅｖｅ　（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いてケル精製し、そし てｐＧＥＭ４Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような適当な制限部位を含むベク ターにサブクローニングする。

その後、ＭＡＰ２キナーゼ遺伝子を含むと考えられる適当なライブラリーを標識 核酸プローブ（例えば、ＰＣＲに基づいたプロトコール（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒ ｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５ １）を使って放射性標識したサブクローン化ＰＣＲ産物）てスクリーニングする 。適当なライブラリーの例としては、２．３の名を挙げると、ラット脳またはＴ リンパ球ｃＤＮＡライブラリー、またはＰＣ１２細胞あるいは有糸分裂後の副腎 クロム親和性細胞から作製されたｃＤＮＡライブラリーがある。ｌ＼イブリダイ ゼーション条件はＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９０，５ｃｉｅｎｃｅ　２ ４７：１４４６−１４５１）に記載される通りに行うか、または標準技法を使っ て行う。フィルターの洗浄は初めに低緊縮条件（２ＸＳＳＣ（２０ｍＭクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７，０，０，１５Ｍ　ＮａＣｌ）　、０．１％　ＳＤＳ、６０ ℃）で行い、次に高緊縮条件（０，２ＸＳＳＣ１０，１％　ＳＤＳ、６０℃）で 行うことが好ましい。

ひとたび得られると、ＭＡＰ２キナーゼ遺伝子は当分野で知られた方法によりク ローニングまたはサブクローニングされる。当分野で知られた多数のベクター− 宿主系を使用することができる。可能なベクターとしてはコスミド、プラスミド または修飾ウィルスがあり、これらに限定されないが、ベクター系は使用する宿 主細胞と適合するものでなければならない。かかるベクターにはラムダ誘導体の ようなバクテリオファージ、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＠　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミド誘導体のようなプラスミドが含まれ、 これらに限定されない。組み換え分子は形質転換、トランスフェクション、感染 、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞に導入される。

ＭＡＰ２キナーゼ遺伝子は、多コピー数の該遺伝子配列が形成されるように、相 応の宿主細胞への形質転換、トランスフエクノヨン、または感染に使用できるク ローニングベクターに挿入させる。これは相補的付着末端を有するクローニング ベクターにＤＮＡ断片を連結することにより達成できる。しかしながら、ＤＮＡ の断片化に使用した相補的制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合 は、Ｄ　Ｎ　Ａ分子の末端を酵素で修飾することかできる。ベクターへの挿入を 容易にするために、ポリメラーゼ・チェイン・リアクションで使用するオリゴヌ クレオチドプライマーに制限エンドヌクレアーゼ切断部位を組み込むことが有利 である。これとは別に、Ｄ　Ｎ　Ａ末端にヌクレオチド配列（リンカ−）を連結 して希望の部位を作ることもてきる。これらの連結されたリンカ−は制限エンド ヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学合成されたオリゴヌクレオチドで あり得る。別の方法では、開裂されたベクターとＭＡＰ２キナーゼ遺伝子をホモ ポリマー付加により修飾してもよい。

特定の態様では、単離したＭＡＰ２キナーゼ遺伝子、ｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ、または 合成り　Ｎ　Ａ配列を含む組み換えＤＮＡ分子による宿主細胞の形質転換が多コ ピー数の遺伝子の形成を可能にする。かくして、形質転換体を増殖し、形質転換 体から組み換えＤＮＡ分子を単離腰必要ならば、単離した組み換えＤ　Ｎ　、Ａ 、から挿入遺伝子を回収することにより、当該遺伝子を大量に得ることができる 。

本発明の好適な態様によれば、ひとたびＭＡＰ２キナーゼをコードするｃＤＮＡ 誘導クローンが得られたら、ＭＡＰ２キナーゼをコードするゲノムクローンを当 分野で知られた標準技法により単離する。例えば、ＭＡＰ２キナーゼクローンか ら標識核酸プローブを誘導し、これを使って核酸ハイブリダイゼーションにより ゲノムＤ　Ｎ　Ａライブラリーをスクリーニングする。例えば、バクテリオファ ージライブラリーではＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓ　（１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ 　１９６：１８０）の方法を使用し、プラスミドライブラリーではＧｒｕｎｓｔ ｅｉｎと　Ｈｏｇｎｅｓｓ　（１９７５，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、ｔｌｓＡ　７２：３９６１−３９６５）の方法を使用する。その後、回収し たクローンは当分野で公知の方法を使って制限断片マツピングおよびシーフェン シング技法により分析する。

さらに、本発明により得られた配列を使って、ｃＤＮＡライブラリーから別のｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａクローンを同定することもてきる。

（本頁以下余白） ５．２．ＭＡＰ２プロティンキナーゼファミリーの他のメンバ一本発明は、実質 的に第２Ｂ図（配列番号、■）、第３Ａ図（配列番号・３）及び第３Ｂ図（配列 番号・５）に記載された核酸配列又はそｉらの少なくともｌＯヌクレオチド部分 に相同の哺乳類の核酸に相当する組換え核酸を提供する。

本発明に従うことにより、（ゲノムＤＮＡ又は好適にはｃＤＮＡを含む）ＤＮＡ ライブラリーを、タンパク質配列データ又は第２Ｂ図（配列番号＝１）、第３Ａ 図（配列番号、３）及び第３Ｂ図（配列番号＝５）に記載の核酸配列のいずれか に由来するＭＡＰ２キナーゼ配列に相応するオリゴヌクレオチドてスクリーニン グすることにより、ＭＡＰ２キナーゼファミリーの他のメンノく−が同定され− Ｃいる下記の第７節において示されるように、ＭＡＰ２キナーゼの明白なメンバ ーをコードするクローンを同定し得る０ハイブリツド形成の緊縮を減することに より、ファミリーのやや分岐したメンバーを同定する機会が増大しうる。例えば Ｖ又は■ドメインからの配列のように、好適に配列されたＭＡＰ２キナーゼファ ミリーのメンバーにより実質的に共有されている配列を使用することも望ましい ：かかる高度に保存された領域は、ＭＡＰ２キナ−セファミリ−の他のメンバー を同定する際に特に有用であり得る。ライブラリースクリーニングは、例えば、 ベントン（Ｂｅｎｊｏｎ）及びデービス（Ｄａｖｉｓ）のハイブリッド形成手法 （１９７７゜５ｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０）又はグルンスタイン（Ｇｒｕｎ 　５ｔｅｉｎ）及びホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）の方法（１９７５，Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２３９６１−３９６５ ）を使用して実施しうる。／Ｘイブリント形成により同定されたクローンは、次 いてさらに分析され、そして、新しいファミリーメンバーは制限断片マツピング 及び配列解析手法により本分野で良く知られた方法に従って同定しつる。

ＭＡＰ２プロティンキナーゼファミリーの他のメンバーを同定するために、ポリ メラーゼ・チェイン・リアクション（Ｐ　ＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ　ら、１９８５ ．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０−１３５４）を使用することも望ましいか もしれない。例えば、既知のＭＡＰ２プロティンキナーゼ配列に相応するセンス 及びアンチセンスプライマー（これは好適にはＭ　Ａ　Ｐ　２プロテインキナー ゼフアミリーの特性決定されたメンバーに保存されているように思われる）は、 鋳型としてＭＡ　Ｐ　２キナーゼを生成する細胞から得られるｃＤＮＡとともに ＰＣＲにおいて使用し得るかもしれない。これらのプライマーは、相応のクロー ニングベクターにＰＣＲ生成物を挿入するのを助ける制限酵素開裂部位が含まれ るように、デザインするのが望ましいかもしれない。ＰＣＲ生成物は、上述の第 ５．１節において述べたとおり、適当なベクターに挿入することができ、生成し たクローンは新しいファミリーメンバーについてスクリーニングし得る。

このスクリーニングは、既知のＭ、ＡＰ２キナーゼ配列に相応するプローブを使 用するハイブリッド形成分析を含む慣用の方法を使用して実施できる。例えば、 既に特性決定されたＭＡＰ２キナーゼプロテインの異なる領域を表わす一連のプ ローブは、先に概略述へたように、ＰＣＲを使用して生成されたクローンからの ＤＮＡを保有する復製フィルターに、低緊縮条件で対合させることもてきる。種 々のクローンはいくつかのプローブと対合しうるが、他のものとは対合しないこ とが観察されるかもしれない。新しいファミリーメンバーもまた、ハイブリッド 形成条件の緊縮度を増大させることにより同定可能であり、この際既知のメンノ λ−（例えば、ＥＲＫｌ、ＥＲＫ２又はＥＲＫ３）に由来するプローブに同一で ない新しいメンバーは、高度の緊縮度においてはより弱い程度に対合するであろ う。代わりに、新しいファミリーメン／＜−は制限マツピング又は慣用の方法を 使用する配列決定分析により同定可能であり、既知のファミリーメンバーと比較 すれば制限マツプ又は配列における差異が明らかになる。

５．３１組換え〜１ＡＰ２プロティンキナーゼの発現本発明は、第２Ｂ図（配列 番号＝２）、第３Ａ図（配列番号。

４）又は第３Ｂ図（配列番号二６）に実質的に示されているアミノ酸配列又はそ れらの一部を含む組換えＭＡＰ２プロティンキナーゼ分子を提供するが、これは 、Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅによれば約４１から４８ｋＤａの間、又は約６ ２〜６３ｋＤａの分子量を有し、又は、これは酵母ＦＵＳ３又はＫＳＳＩプロテ ィンキナーゼに相同の部位並びに短かいアミノ末端伸長を有し、又は、これは約 １８０個のアミノ酸のカルボキシル末端伸長を有する。本発明は、また、上述の 分子に相同の捕乳類のＭ　Ａ　Ｐ　２プロテインキナーゼを提供する。

組換えＭＡＰ２キナーゼを発現するために、ＭＡＰ２キナーゼプロティンをコー ドする核酸配列又はそれらの部分は、相応の発現ベクター、即ち、挿入された蛋 白質コード配列の転写及び翻訳のために必要な要素を含むベクターに挿入するこ とかできる。必要な転写及び翻訳シグナルは、また、天然のＭＡＰ２キナーゼ遺 伝子及び／又はそのフランキング領域により供給され得る。種々の宿主−ベクタ ー系が蛋白質コード化配列を発現させるために使用しうる。これらは、限定され るものではないが、ウィルス（例えば、ワクシニアウィルス、アデノウィルス等 ）により感染された晴乳動物細胞系；ウィルス（例えばバキュロウィルス（ｂａ ｃｕｌ。

ｖｉｒｕｓ））により感染された昆虫細胞系、酵母ベクターを含む酵母のような 微生物、又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ により形質転換されたバクテリアを含む。

これらのベクターの発現要素は、その強さ及び特異性において相違する。使用す る宿主−ベクター系に応じて、多数の適当な転写及び翻訳要素のいずれか１つが 使用しうる。

相応の転写、／翻訳調節ノブナル及び蛋白質コード化配列から成るキメラ遺伝子 を含む発現ベクターを構築するために、ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入 について先に記述したいずれかの方法か使用しうる。これらの方法には、インビ トロの組換えＤＮＡ法及び合成手法及びインビボ組換え（遺伝子組換え）が含ま れ得る。ＭＡＰ２キナーゼ蛋白質又はペプチドフラグメントをコードする核酸配 列の発現は、第２の核酸配列により制御可能であり、その結果、ＭＡＰ２キナー ゼ蛋白質又はペプチドは組換えＤ　Ｎ　Ａ分子で形質転換された宿主内で発現さ れる。例えば、ＭＡＰ２キナーゼの発現は当該分野で既知のいずれかのプロモー ター／エンハンサ−によりコントロールされ得る。ＭＡＰ２キナーゼ発現を制御 するために使用しうるプロモーターは、限定されるものではないが、以下のもの を含む。ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、 　１９８１．　Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４−３１０）、　ｌｌ：ｃＭＶプロモ ータコラウス肉腫（Ｒｏｕｓ　ｓａｒｃｏｍａ）ウィルスの３゛　ターミナルリ ピートに含まれるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｊｏら、、　１９８０．　Ｃｅ１ｌ 　２２ニア８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅ ｒら、、　１９８１゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、Ａ、　７８：１４４−１４４５）、メタロチオニン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉ ｎｓｔｅｒら、、１９８２．　Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２）　；β−ラ クタマーゼプロモーターのような原核細胞発現ベクター（Ｖｉ　Ｉ　Ｉａ−Ｋａ ｍａｒｏｆ　ｆ　ら、、１９７８．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、７５：３７２７−３７３１）　、又はｔａｃプロモーター（Ｄｅ　 Ｂｏｅｒら、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：２ｌ−２５）　、また、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒ ｉｃａｎ、　１９８０．２４２ニア４−９４中の“ＩＪｓｅｆｕｌ　ｐｒｏ仁ｅ ｉｒ＋ｓ　ｆｒａｒｎ　ｒｅｃｏｒｎｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ”を参照 ；Ｇａ１４プロモーターのように酵母又は他の真菌からのプロモーター要素、Ａ ＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ　（フオスフオグリ セロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、及び 組織特異性を示し、かつトランスンエニ・ツク動物において使用された、下記の 動物転写制御領域：膵臓の線層細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領 域（Ｓｗｉｆｔら、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６３９−６４６　；　０ ｒｎｉｔｚ　ら、、１９８６．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙ ｍｐ、Ｑｕａｎ（Ｂｉｏｌ、　５０：３９９−４０９；　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、 　１９８７．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５）　：膵臓のベータ 細胞において活性のインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、　１９８５ ．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２）、リンノく細胞で活性のイムノグ ロブＩＪ　ン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓ−Ｃｈｅｄｌ　ら、　１９８４．　Ｃ ｅ１１３８：６４７−６５８：　Ａｄａｍｅｓら、、１９８５．Ｎａｔｕｒｅ　 ３１８：５３３−５３８；　Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、、　１９８７．　Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　７：１４３６−１４４４）、精巣、胸部、リンパ及 びマスト細胞において活性であるマウスの乳ガンウィルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ら、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４５：４８５−４９５）　、肝臓において活性 であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、、　１９８７．　Ｇｅｎ ｅｓａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　ｌ：２６８−２７６）　、肝臓で活性のアルファー フェトプロティン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、、１９８５．　Ｍｏ１ ．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

５：１６３９−１６４８；　Ｈａｍｍｅｒら、、　１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ２ ３５：５３−５８）；肝臓で活性であるアルファｌ−アンチトリプシン遺伝子制 御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、 　ｌ：１６１−１７１）、骨髄細胞中で活性のベーターグロビン遺伝子制御領域 （Ｍｏｇｒａｍら、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０ＨＫ ｏｌｌｉａｓら、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４６：８９−９４）；脳のオリゴ デンドロサイト細胞において活性なミニリン塩基性プロティン遺伝子制御領域（ Ｒｅａｄｈｅａｄら、、　１９８７．　Ｃｅ１ｌ　４８ニア０３−７１２）；骨 格筋で活性のミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、　１９８５．　Ｎａ ｔｕｒｅ　３１４：２８３−２８６）　、及び視床下部で活性の性腺刺激ホルモ ン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ 　２３４：１３７２−１３７８）。

Ｍ　Ａ　Ｐ　２キナーゼ遺伝子挿入物を含む発現ベクターは、３通りの一般的な 方法により同定てきる：（ａｌＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成、（ｂｌ“マー カー”遺伝子機能の存在又は不存在、及び（Ｃ１挿入された配列の発現。第１番 目のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入 されたＭＡＰ２キナーゼ遺伝子に相同である配列を含むプローブを使用して、Ｄ ＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成により検出され得る。第２の方法において、組換 えベクター／宿主系は、ベクターに外来遺伝子を挿入することにより生ずる、一 定の“マーカー”遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、 形質転換表現型、バキュロウィルスにおける封入体形成等）の存在又は不存在に 基づき同定されかつ選択され得る。例えば、ＭＡＰ２キナーゼ遺伝子がベクター のマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、ＭＡＰ２キナーゼ挿入物を含む組換 え物はマーカー遺伝子機能の不存在により同定され得る。第３のアプローチにお いて、組換え発現ベクターは組換えにより発現される外来遺伝子生成物をア、ソ セイすることにより同定され得る。かかるアッセイは、例えば、上記５．２９節 において記述したようにパイオアッセインステムにおけるＭ　Ａ　Ｐ　２キナー ゼ遺伝子生成物の物理的又は機能的特性に基つくことが可能である。

しかしなから、もしＭＡＰ２キナーゼ発現構築物を含む細胞が固有のＭＡＰ２キ ナーゼを含むならば、この構築物から生ずる活性は内因性のキナーゼ活性（例え ば、組換え分子上に識別用標識を付ける）又は内因性キナーゼのバンクグラウン ドレベルを引き算することにより区別され得る。

特定の組換えＤＮＡ分子が一度同定され、分離されれば、当該分野で既知の幾つ かの方法がこれを増殖させるために使用され得る。適当な宿主系及び増殖条件が 設定されれば、組換え発現ベクターは増殖させ、大量に製造させることができる 。先に述べたとおり、使用てきる発現ベクターは、限定するものではないが、次 のベクター又はその誘導体を含みうる　ワクシニアウィルス又はアデノウィルス のようなヒト又は動物ウィルス：バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵母 ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、及びプラスミド並 びにコスミドＤＮ、へベクター、その他。

加えて、宿主細胞株は挿入された配列の発現を調整し、又は、所望の特別の態様 で遺伝子生成物を修飾し、及び処理するものが選択しうる。特定のプロモーター からの発現は、成る誘導物質の存在下で高めることができる：こうして、遺伝子 操作されたＭＡＰ２キナーゼ蛋白質の発現が制御できる。さらに、異なる宿主細 胞は蛋白質の翻訳及び翻訳後プロセッシング及び修飾（例えば、糖鎖形成、開裂 ）に対して特徴のある特異的なメカニズムを有する。発現される外因性蛋白質の 所望の修飾及びプロセッンングを確実にするために、相応のセルライン又は宿主 システムを選択しうる。例えば、細菌系における発現は糖鎖形成がなされていな いコア蛋白質生成物を製造するために使用され得る。酵母における発現は糖鎖形 成された生成物を生成するであろう。哺乳動物細胞における発現は、非相同のＭ ＡＰ２キナーゼ蛋白質の“天然の”糖鎖形成を確保するために使用され得る。さ らに、異なるベクター／宿主発現系は異なる程度に蛋白質加水分解的開裂をさせ るようなプロセッシング反応に影響するかもしれない。

ＭＡＰ２キナーゼ遺伝子を発現する組換え体が一度同定されれば、遺伝子生成物 は分析されるべきである。このことは、生成物の物理的又は機能的特性に基づく アッセイにより成し得る。

ＭＡＰ２キナーゼ蛋白質が同定されれば、クロマトグラフィー（例えば、イオン 交換、アフィニティ、及びサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差異 のある溶解度、又は蛋白質を精製するための他の通常の手法を含む慣用の方法に より分離及び精製され得る。

機能的なＭＡＰ２キナーゼ活性の存在は、下記の第５，５節に記載するようにし て決定し得る。

５．３．１．ＭＡＰ２遺伝子キナーゼ遺伝子及び蛋白質先に詳述した方法及び第 ６及び７節の例における方法を使用して、次の核酸配列か決定され、それらの相 応のアミノ酸配列か推定された。２匹のラントＭＡＰ２キナーゼｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ の配列が決定され、これは第２Ｂ図（配列番号、ｌ）、第３Ａ図（配列番号・３ ）及び第３Ｂ図（配列番号　５）に示されている。これらの各々の配列又は機能 的に均等のものを本発明に従って使用することができる。さらに、本発明は、ブ タ、羊、牛、ネコ、鴨、馬又は大並びに霊長類源及びＭＡＰ２キナーゼ活性が存 在する他の種のものから分離されるＭＡＰ２キナーゼ遺伝子及び蛋白質に関する 。

本発明は、また、下記第７節で同定し、記載するように、約４５ｋＤａの分子量 を有する蛋白に相当するＥＲＫ４を提供する。さらに、本発明は、例えば、核酸 ハイブリッド形成アッセイ、サザン及びノーザンプロット分析等において使用さ れるＭＡＰ２キナーゼ配列の対合可能な部位を含む配列の如く、少なくとも１０ 個のヌクレオチドを含む〜ＩＡＰ２キナーゼ核酸の相同の配列に向けられる。

本発明はまた、第２Ｂ図（配列番号・２）、第３Ａ図（配列番号４）及び第３Ｂ 図（配列番号　６）に示されているアミノ酸配列に従って、ＭＡＰ２キナーゼ蛋 白、そのフラグメント及び誘導体、又はその機能的均等物及びかかる蛋白質に少 なくとも約３０％相同であるような蛋白質を提供する。本発明は、抗原決定基を 有する、又は機能的に活性である、又は少なくとも６個のアミノ酸の長さである ＭＡＰ２キナーゼ蛋白質のフラグメント又は誘導体を提供する。ここで使用され る場合、機能的に活性とはＭＡＰ２又は他の関連する基質（例えば、ＭＢＰ、Ｓ ６キナーゼ、上記第５．５節参照）をリン酸化する能力を有することを意味する 。

例えば、第２Ｂ図（配列番号、ｌ）、第３Ａ図（配列番号・３）及び第３Ｂ図（ 配列番号：５）に記載された核酸配列は、機能的に均等な分子を提供する置換、 付加又は削除により変えることができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のため に、第２Ｂ図（配列番号、２）、第３Ａ図（配列番号＝４）及び第３Ｂ図（配列 番号＝６）に示されているのと実質的に同一のアミノ酸配列をコードする他のＤ ＮＡ配列を、本発明を実施する際に使用しつる。これらは、限定されるものでは ないが、第２Ｂ図（配列番号：ｌ）、第３Ａ図（配列番号・３）及び第３Ｂ図（ 配列番号：５）に示されているＭＡＰ２キナーゼ遺伝子の全部又は一部を含み、 配列内で機能的に均等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変 更され、それゆえサイレント変更を生ずるヌクレオチドの配列を含む。同様に、 本発明のＭＡＰ２キナーゼ蛋白質、又はそれらのフラグメント又は誘導体は、そ れに限定されるものではないが、−次アミノ酸配列として、第２Ｂ図（配列番号 ：２）、第３Ａ図（配列番号＝４）及び第３Ｂ図（配列番号：６）に実質的に示 されているアミノ酸配列の全て又は一部を含み、サイレント変更を生ずる、配列 内における残基が機能的に均等のアミノ酸残基で置換されたものであるような変 更された配列を有するものを含む。例えば、配列内の１又は複数のアミノ酸残基 は、機能的に均等のものとして作用し、サイレント変更を生ずる類似の極性を有 する他のアミノ酸により置換することができる。配列内のアミノ酸の変更は、ア ミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択しうる。例えば、無極性の（疎水 性の）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、 フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンか含まれる。極性の中性アミ ノ酸には、グリツジ、セリン、トレオニン、ンステイン、チロシン、アスパラギ ン及びグルタミンか含まれる。正に荷電された（塩基性の）アミノ酸には、アル キニン、リンノ及びヒスチノンか含まれる。負に荷電された（酸性の）アミノ酸 は、アス、＜ラギン酸及びグルタミン酸を含む。さらに、ＭＡＰ２キナーゼ蛋白 質又はそれらのフラグメント又は誘導体であって、翻訳の間に又はその後で、例 えば、リン酸化、グリコジル化、蛋白加水分解的開裂、抗体分子又は他の細胞リ ガンドへの結合等により異なるように修飾されたものか、本発明の範囲内に含ま れる。例えば、特異的リン酸化、即ち、セリントレオニンはもはや必要とされず 、又は重要なものではないように、ＭＡＰ２キナーゼの配列を修飾することか望 ましいかもしれない。

加えて、本発明の組換えＭ　Ａ　Ｐ　２キナーゼをコードする核酸配列は、Ｍ　 Ａ　Ｐ　２キナーゼのプロセシング又は発現を修飾するように、操作され得る。

例えば、限定されるものではないが、シグナル配列が、〜ＩＡＰ２キナーゼの分 泌を可能とし、そのことにより収穫又はバイオアベイラビリティ−を促進するた めに、ＭＡＰ２キナーゼコード配列の上流に挿入され得る。

さらに、与えられた〜ＩＡＰ２キナーゼは、インビトロ又はインヒポにおいて、 翻訳、開始、及び／又は終止配列の生成及び／又は破壊のために、又は、コード 領域における変更を生じさせ及び／又は新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形 成させ又は既に存在しているものを破壊するために、さらにインビトロでの修飾 を促進させるために突然変異を起こさせることができる。本分野て既に知られて いる変異誘発のためのいずれの手法も使用でき、限定されるものではないが、イ ンビトロでの部位特異的突然変異（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、、１９７８．　Ｊ 、Ｂｉａｌ、Ｃｈｅｍ、２５３：６５５１）　、ＴＡＢｊ！’リンカ−（Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ）等の使用が含まれる。

５．４．抗−ＭＡＰ２プロテインキナーゼ抗体の産生本発明によれば、ＭＡＰ２ キナーゼプロティン又はそれらのフラグメント又は誘導体は、抗ＭＡＰ２キナー ゼ抗体を産生するための免疫原として使用しつる。蛋白質合成のための組換え法 （本発明のＭＡＰ２キナーゼ核酸配列に基つく）を使用して、比較的大量のＭＡ Ｐ２キナーゼ蛋白質を製造する方法を提供することにより、ＭＡＰ２キナーゼ量 が限定されるという問題は回避できた。

さらに、抗−ＭＡＰ２キナーゼ免疫応答を生じさせる可能性を改善するために、 ＭＡＰ２キナーゼのアミノ酸配列は、増大した免疫原性と関連しうる分子の部分 を同定するために分析し得る。

例えば、Ｍ　Ａ　Ｐ　２キナーゼの親水性、表面可能性（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒ ｏｂａｂｉｌｉｔｙ）、フレキンビリティ−１抗原指数、両親媒性ヘリックス、 アンフィフエリックシート（ａｍｐｈｉｐｈｅｌｉｃ　５ｈｅｅｔ）及び二次構 造のコンピュータ形成プロットを与える表面エピトープを同定するためにアミノ 酸配列をコンピュータ分析にかけることができる。代わりに、異なる種からのＭ ＡＰ２キナーゼの推定したアミノ酸配列を比較し、相対的に非相同の領域を同定 することもてきるであろう。これらの非相同の領域は、種々の種を通して免疫原 性である可能性が大きい。

ＭＡＰ２キナーゼに向けられたモノクローナル抗体の製造のために、培養下の連 続セルラインによる抗体分子の製造を提供するいずれの方法も使用しうる。例え ば、本来コーラ−及びミルスタインにより開発されたハイブリドーマ法（１９７ ５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：　４９５〜４９７）並びにトリオーマ法、ヒトＢ− 細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、、１９８３．　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 　Ｔｏｄａｙ　４ニア２）　、及びヒトモノクローナル抗体産生のためのＥＢＶ −ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、。

１９８５、　”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、”中、ＡｌａｎＲ，Ｌｉ５ｓ社、第７７−９６頁）及 び同様の方法が本発明の範囲内にある。

治療上使用するためのモノクローナル抗体は、ヒトのモノクローナル抗体又はキ メラヒト−マウス（又は池の種）モノクローナル抗体である。ヒトモノクローナ ル抗体は、当該分野で既知の多くの方法のいずれかにより製造され得る（例えば 、Ｔｅｎｇら、、１９８３゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ、８０ニア３０８−７３１２：　Ｋｏｚｂｏｒら、、　１９８３゜Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニア２−７９：０１ｓｓｏｎら、、１９８２．　Ｍ ｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ。

９２：３−１６）。キメラ抗体分子は、マウス抗原−結合領域にヒトの定常領域 を含ませることで製造しうる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ 。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１：６８５１．　タケダ ら、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２）。

ＭＡＰ２キナーゼのエピトープに対するポリクローナル抗体を製造するために、 種々の既知の方法が使用できる。抗体を産生ずるために、限定されるものではな いが、ウサギ、マウス、ラット等を含む動物を、ＭＡ　Ｐ　２キナーゼ蛋白質又 はそれらのフラグメント又は誘導体を注射することにより免疫することかできる 。

免疫応答を増加させるために、宿主の種に依存して種々のアジュバントが使用で き、これには限定されるものではないか、フロイント（完全又は不完全のもの） 、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレンンのような表面活性物質、プ ルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホ ールリンベソトヘモンアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（Ｂａｃ百Ｉｅ 　ＣａｌｍｅＮｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）のような本来的に有用なヒトアジュバン及び コリネバクテリウムパルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ ）が含まれる。

ＭＡＰ２キナーゼエピトープに対する抗体の分子クローンは既知の方法で製造し うる。組換えＤＮＡ法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、、　１９８２゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）は、モノクローナル抗体分子、又はそれらの 抗原結合領域をコードする核酸配列を構築させるために使用しうる。

抗体分子は、既知の方法、例えば、免疫吸着又は免疫親和性クロマトグラフィー 、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなりロフトグラフ法又はそれ らの組みあわせにより精製することができる。

本発明は、抗体分子並びに抗体分子のフラグメントを提供する。

この分子の個特異的抗原を含む抗体フラグメントは、既知の方法により産生しう る。例えば、限定されるものではないが、これらのフラグメントは抗体分子のペ プシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント：　Ｆ（ａｂ“）２フ ラグメントのジスルフィド結合を還元して生成されるＦａｂ’フラグメント及び パパイン及び還元剤で抗体分子を処理して生成することのできるＦａｂフラグメ ントを含む。

５．５．ＭＡＰ２キナーゼ活性のバイオアッセイＭＡＰ２キナーゼ活性は、当該 分野で既知のいずれかの適当なキナーゼアッセイを使用して測定しうる。例えば 、限定されるものではないか、次のように記載される方法である（Ｂｏｕｌｔｏ ｎら、。

１９９０、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：２７１３−２７１９）　 ｏ　ＭＡＰ　２のリン酸化のためのアッセイは、Ｈｅｐｅｓ　３０ｍＭ、　ｐＨ ８，ＡＴＰ　５０ＰＭ　（１〜５０ｃｐｍ／ｆｍｏｌ）、ジチオトレイトール１ ｍＭ、ベンズアミジン１ｍＭ、　ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、牛血清アルブミン１００ μｇ／ｍｌ、　ＭＡＰ　２３μｇ及び試料蛋白質ｌＯμｇ以下を最終容積３０μ Ｉ中に含み、３０°Ｃで１０分間アッセイする。アッセイ（１００μｇ／ｍｌ） 中のＭＡＰ２の量は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる及び沈降による、両方の分析に都 合のよいように選択されうる。酵素は、　１．３６ｎ＋ｇ　ＭＡ　Ｐ　２　／ｍ ｌにおいてさえも基質により飽和されない。　１００μｇ　ＭＡ　Ｐ　２　／ｍ ｌにより、酵素活性は少なくとも３０分間時間に対して線形であることが期待さ れ得る。

分画化されていない上澄みを除き、すべての試料は牛血清アルブミン１ｍｇの存 在下において上述のように日常的にアッセイしうる。

アッセイは１０％トリクロル酢酸を添加することにより停止させる二とてき、沈 澱はガラスファイバーフィルター上に集めうる。上述のものを除き、すべてのア ッセイは、メルカプトエタノール２Ｍ、５０％グリセロール及び１０％ＳＤＳを 含む０．３ＭのＴｒｉｓ−１（ＣＩ、ｐＨ６，９の０．２５容積を添加して停止 させることができ、５％（ＭＡＰ２）ポリアクリルアミドゲルを使用してＳＤＳ における電気泳動により分析される。このゲルはクーマン−ブルーにより染色で き、１０％メタノール及び】０％酢酸中で脱染色でき、乾燥され、そしてデュポ ンカンタ（Ｑｕａｎｔａ）　ｍインテンンファイーイングスクリーンてコダック Ｘ５−５又はＢＢ−５フイルムを使用して一８００Ｃにてオートラジオグラフィ ーにかけることができる。基質バンドはゲルから削り取り、３２Ｐが液体シンチ レーションカウンターを使用して定量され得る。

５．６９本発明の有用性 本発明は、ホルモン及び池の細胞系因子のメカニズムを研究するための独特のモ デル系を提供するために使用でき、また、ホルモン／細胞系因子活性について化 合物をスクリーニングする方法において、及びアゴニスト又はアンタゴニストと して機能する物質を同定するために使用しうる。

本発明の種々の態様に従って、組換えＭＡＰ２キナーゼ分子は、ホルモン及び他 の細胞系因子の研究のための新規なモデル系を作るために使用することができる 。例えば、限定されるものではないが、本発明の組換え分子は、通常の量より多 くのＭＡＰ２キナーゼが産生されるように細胞又は生物体に挿入することが可能 であり、その結果、ＭＡＰ２キナーゼのハイパーアクチベーション効果が評価し うる。ＭＡＰ２キナーゼの過剰生産は、特に、通常の量のＭＡＰ２キナーゼを産 生する細胞又は生物体と比較して評価される際には、ＭＡＰ２キナーゼ活性に関 連するホルモン／細胞系因子応答の側面を同定しうる。

代わりに、組換えＭＡＰ２キナーゼ分子は、組換え分子を含む細胞又は生物体が 、例えば正常のＭＡＰ２キナーゼのセリン／トレオニンキナーゼ活性を欠如しう るＭＡＰ２キナーゼの変異型を産生するように操作しうる。変異型キナーゼは、 濃度を基礎して、正常のＭＡＰ２キナーゼの作用にまさり、又はこれを滴定しう るものであり、そのことにより、機能的に異常なＭＡＰ２キナーゼ機能を有する 細胞又は生物体を生成しうる。さらにまた、かかる変異型の核酸配列は例えば、 相同組換えにより、内因性のＭＡＰ２キナーゼ遺伝子の変異を起こして、真のＭ ＡＰ２キナーゼ変異性を生成する。中枢神経系でのＭＡＰ２キナーゼをコードす るｍＲＮ　Ａの高レベルの発現並びに神経原繊維の変形を生ずる際のＭＡＰ２の 役割を考えると、中枢神経系において変異型ＭＡＰ２キナーゼ分子を発現させ、 及び、アルツハイマー症のような神経系の障害又は末梢神経障害のための動物モ デル系として使用しうるヒト以外のトランスジェニック動物を生成させることが できる。

加えて、本発明は初めて大量の精製されたＭＡＰ２キナーゼの製造を可能とする ので、抗−ＭＡＰ２キナーゼ抗体の製造が可能である。抗−ＭＡＰ２キナーゼ抗 体、ポリクローナル又はモノクローナルはＭＡＰ２キナーゼ機能を選択的に中和 する作用を研究する、細胞又は生物体を利用する実験において使用しうる。かか る実験は、さらに、ホルモン又は細胞因子活性におけるＭ　Ａ　Ｐ　２キナーゼ の特異的役割を解明する可能性かある。

本発明の重要な態様は、ホルモン又は細胞因子活性についての化合物のスクリー ニングのための方法に関する。特定の態様において、本発明は神経成長因子様の 活性を有する化合物の存在を検出する方法を提供し、この方法は、（１）（例え ば、培養時に交感神経の成長を支持する能力を含む、ＮＧＦと必ずしも同一では ないが、類似の活性を意味すると解される）神経成長因子様活性を有すると考え られる化合物の存在下において（神経成長因子により活性化される）ＭＡＰ２プ ロティンキナーゼを生成する細胞を培養すること、及び（ｉｉ）ＭＡＰ２プロテ インキナーゼ活性のレベルの変化を検出すること、ここで、活性の増加は神経成 長因子様活性の存在の指標となるものである、を含むものである。同様に、他の 特定の態様において、本発明はインシュリン様活性を有する化合物の存在を検出 する方法を提供し、この方法は（ｉ）（例えば、インシュリン応答細胞において ＭＡＰ２キナーゼを活性化する能力を含む、必ずしもインシュリンとは同一では ないが類似の活性を意味すると考えられる）インシュリン様活性を有する可能性 のある化合物の存在下で（インシュリンにより活性化される）ＭＡＰ２プロティ ンキナーゼを生成する細胞を培養すること及び（ｉｉ）ＭＡＰ２プロティンキナ ーゼ活性のレベルの変化を検出すること、ここで活性の増大はインシュリン様活 性の存在の指標である、を含むものである。それゆえ、本発明は糖尿病の治療に 有用であり得る化合物を同定するための強力な方法を提供する。本発明は、また 、他のホルモン又は細胞系因子の活性をスクリーニングする類似の方法を提供す る。本発明の異なる態様において、上述のスクリーニング方法においては、限定 されるものではないが、第２Ｂ図（配列番号：１）、第３Ａ図（配列番号＝３） 及び第３Ｂ図（配列番号＝５）に実質的に示されているとおりの配列を有する組 換え核酸分子を含む、哺乳動物のＭＡＰ２キナーゼをコードする組換え核酸分子 を有するセルラインを使用することが望ましいかもしれない。かかるセルライン は好適には高レベルのＭＡＰ２キナーゼを発現でき、それゆえ、Ｎ１ＡＰ２キナ ーゼ活性化についてのより感度の高いアッセイを提供するであろう。

本発明は、また、スクリーニングのために使用される細胞か第２Ｂ図（配列番号 　ｌ）、第３Ａ図（配列番号・３）及び第３Ｂ図（配列番号・５）に実質的に示 されている配列又はその一部と相同の組換え核酸配列を含む、類似の方法を提供 する。本発明の方法は、末梢神経障害の治療に効果的である、又は神経の再生を 促進し得る化合物を同定するために使用できる。さらに、基底前脳核（ｂａｓａ ｌ　ｆｏｒｅｂｒａｉｎ　ｎｕｃｌｅｉｃ）のＮＧＦ一応答コリン作動性ニュー ロンは一貫してアルツハイマー症の初期の段階において冒されるから、本発明の 方法はアルツハイマー症の治療において有効なＮＧＦ−１活性を有する化合物を 同定する際に特に有用であるかもしれない。加えて、かかる方法はホルモン／受 容体相互作用を迂回しうる分子の同定を可能とするかもしれない。例えば、プリ ン類似体のような小さな分子を使用して、生物体てＭＡＰ２キナーゼの活性を抑 制することは、臨床的に有用であるかもしれない。

本発明のその他の態様において、組換えＭＡＰ２キナーゼは、細胞因子又はホル モン作用に関係するキナーゼの如く、他の分子を同定するために使用し得るかも しれない。例えば、組換えＭ　ＡＰ２キナーゼはアフィニチイ精製により別のキ ナーゼを同定するために使用可能であり、ここで、ＭＡＰ２キナーゼはＭＡＰ２ 関連リン酸化カスケードに関与する他のキナーゼに接着させるために使用され得 る。ＮＧＦ受容体の配列決定された部分は、未だ同定されていないプロティンキ ナーゼと物理的に結合しているかもしれない。組換えＭＡＰ２キナーゼはかかる 相互作用を研究する際有用である。

池の態様において、Ｍ　Ａ　Ｐ　２プロテインキナーゼ活性に影響することか知 られた、又は、その可能性のある化合物の存在下で、細胞を培養することから生 ずるＭＡＰ２プロテインキナーゼ活性の変化を検出することは、かかる化合物並 びにＭＡＰ２キナーゼ活性のレベルを調整するその能力の存在を検出し、又はそ の量を測定するために使用できる。ＭＡＰ２キナーゼ活性に対するかかる作用は 、直接的に又は間接的に（例えば、シグナル変換経路により）生ずることができ る。かかる態様の特別の例において、（に限定されるものではないが、ＭＧＦ、 脳由来の神経栄養因子、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及び分子のＮＧＦ ／ＢＤＮＦ／ＮＴ−３フアミリーの他のメンバーを含む）ニューロトロフィン（ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）分子の存在は、かかるニューロトロフィン分子を含 む可能性のある試料の存在下で細胞を培養する際の〜ＩＡＰ２プロティンキナー ゼ活性の増加を検出することにより検出され得る。かかるアッセイにおいて培養 される細胞は、検出しようとするニューロトロフィン分子に対する受容体、この 受容体は内因性又は組換え体であり得るが、この受容体を発現すべきである。

（本頁以下余白） ６、実施例、　インシュリン刺激ＭＡＰ２プロティンキナーゼの分子クローニン グ・　フェロモン制御細胞周期調節におけるラットＩ　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞（Ｍｃ Ｃｌａｉｎら、１９８７、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６２：１４６６３−１ ４６７１）は、Ｄｏｎ　ＭｃＣＩａｉｎ　（Ｖｅｔｅｒａｎｓ　Ａｄｍｉｎｉｓ ｔｒａｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ） から得られたものである。ブタインシュリンは、Ｍａｒｙ　Ｒｏｏｔ（Ｅｌｉ　 Ｌｉ１ｌｙ）から贈与されたものである。制限酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ 　ＢｉｏｌａｂＳから得られたものである。

ＭＡＰ２キナーゼはトリプシンで消化した、インシュリン処理のラットｌ　ＨＩ Ｒｃ　Ｂ細胞（Ｂｏｕｌｔｏｎら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３０：２７８ −２８６）から精製し、得られたペプチドをＨＰＬＣにかけた（Ａｂｅｒｓｏｌ ｄら、１９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：６９７ ０−６９７４）。得られたピークの一つからのペプチドは、２番目のクロマトグ ラフィー分離に供した。アミノ酸配列は７つの異なるピークから得られた。一つ のピークは、３種のペプチドの混合物を含んでおり、１つか主成分であり、２つ がマイナー成分であった：　主ペプチドの配列は回収に基ついて決定されたが、 マイナー成分中のアミノ酸をそれらのそれぞれのペプチド配列へ割り当てること はｃＤＮＡ配列に基ついたものであった（下記参照）。

得られたトリプシン消化ペプチド配列のフラグメントのコード鎖または非コード 鎖に対応する一連の縮重オリゴヌクレオチドを合成した。これらオリゴヌクレオ チドは非縮重末端を５゛末端側に含んでいた：　それぞれのコード鎖オリゴヌク レオチドはＥｃｏＲ１制限部位を持っており、一方、それぞれの非コード鎖オリ ゴヌクレオチドは５ａｌｌ制限部位を含んでいた。ラット１の細胞からのラット 染色体Ｄ　Ｎ　ＡまたはｃＤＮＡを鋳型として用いる個々のＰＣＲ反応で、それ ぞれのコード鎖オリゴヌクレオチドは、それぞれの非コード鎖オリゴヌクレオチ ドに結合させた；　ＰＣＲ反応および染色体ＤＮＡとｃＤＮＡの鋳型の調製は、 Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（１９９０，５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６− １４５１）とＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｕｓおよびＡｌｔ（１９９０、”Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｆｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙ ｏｔｉｃ　Ｇｅｎｅｓ”　、ＪｏｎｅｓおよびＢａｒｔｌｅｔｔＳＢｏｓｔｏｎ 、ＭＡ）に記載の通り実施した。ＱＹＩＧＥＧのコードオリゴヌクレオチドとＤ ＬＫＰＳＮの非コードオリゴヌクレオチドを用いて得られた増幅生成物（ＱＹＤ Ｌと表わす）は、セファデックスＧ−５０スピンカラムを用いて単離され、Ｅｃ ｏＲｌと５ａｌｌて消化され、２％Ｎｕｓｉｅｖｅ（ＦＭＣＢｉｏｐｒｏｄｕｃ ｔｓ）を用いてケル精製し、ｐＧＥＭ４２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブ クローン化した。

６．１．４．ｃＤＮＡのスクリーニングラムダＺａｐ２ベクター（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ）中に構築したラット脳ｃＤＮＡライブラリーからの６００，０００プ ラークは、サブクローン化したＱＹＤＬ　ＰＣＲ生成物をプローブとして用いて 選別された：　該プローブは、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅらに記載されたＰＣＲ に基つくプロトコールを用いて放射能標識された。ハイブリダイゼーシヨンの条 件は、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら（こよりｇ己載されている。　ハイブリダイ ゼーシヨンの後、ライブラリー・フィルターは最初に低いストリンジエンシー（ ２Ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ、６０°Ｃ）で洗浄し、次に高いストリンジエン シー（０，２Ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ、６８°Ｃ）で洗浄した。

６．１．５．ＤＮＡの配列決定 配列の決定は、ンデオキ／ヌクレオチド・チェイン・ターミネーノヨン法を用い て（Ｓａｎｇｅｒら、■９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、 ｓ、、Ａ、　７４：５４６３−５４６７）、ンークエナーゼ・キット（バージョ ン２．０）および推薦されたプロトコール（Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｊｃａｌ） により実施した。ＭＡＰ２キナーゼ配列またはフランキング・プラスミド配列に 相応する適当なオリゴヌクレオチドを用い、ＤＮＡの両路の配列決定によって、 丁へての配列か確かめられた。

６、　１．　６．　ノーザン分析 ＲＮＡの単離、ノーサンプロット、および標識プローブへのハイブリダイゼーシ ョンは、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅらにより記載されたように行なった（＋９９ ０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：インシュリン処理のラットＩ　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞 から単離された精製Ｍ　Ａ　Ｐ　２キナーゼは、Ｍｒ＝４３，０００の一つの主 バンドからなる。ＮＧＦ処理またはコントロールのＰＣＩ２細胞から単離された 最終Ｑセファロース＃２フラクションのＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動 により、ＰＣ１２細胞からのＭＡＰ２キナーゼの精製は、インシュリン処理のラ ットＨＩＲｃ　Ｂ細胞からのＭＡＰ２キナーゼの精製に相応するらしいことが示 された（第２Ａ図）。トリプシンによる切断後、７つのトリプシンペプチドのア ミノ酸配列が４３ｋｄバンドから得られた：　これらのペプチドには第２図で下 線を引いた。該ペプチドは、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中のタンパクには含ま れていない。しかし、セリン／トレオニン・プロティンキナーゼ（Ｈａｎｋｓら 、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：４２−５２）ｌ：特徴的な共通配列、Ｇ ＥＧＡＹＧ　（ヌクレオチド結合部位の部分）およびＤＬＫＰＳＮは、このタン パクから単離されたトリプシンペプチド中に見いだされた。

得られたアミノ酸配列中の幾つかの異なる領域に対応している縮重オリゴヌクレ オチドはＰＣＲ反応で利用された。保存されたＧＥＧＡＹＧおよびＤＬＫＰＳＮ 配列を含むペプチドのセグメントに対応するオリゴヌクレオチドは、ラットＩ繊 維芽細胞から調製されたｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ鋳型を用いて、予期されるサイズの増 幅フラグメントを最も明確に生成した。池のプロティンキナーゼとの相同性に基 ついて、ＧＥＧＡＹＧ配列はタンパクＮ末端により近く、ＤＬＫＰＳＮはタンパ クＣ末端により近いと思われた。　これらの配列は、はとんとのプロティンキナ ーゼにおいて約１２０アミノ酸により分離されている。アミノ酸ＱＹＩＧＥＧを コードしている縮重オリゴヌクレオチド（配列番号　７）（５’　−ＴＴＣＴＡ ＧＡＡＴＴＣＣＡ　（Ａ、Ｇ）ＴＡ　（Ｃ，Ｔ）ＡＴ　（Ａ、Ｔ、Ｃ）ＧＧ　（ Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｇ）ＧＡ　（Ａ、Ｇ）ＧＧ−３’　配列番号＝８）とアミノ酸ＤＬ ＫＰＳＮの非コード鎖に相応する縮重オリゴヌクレオチド（配列番号・９）（５ ’　−ＴＴＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣ（Ａ、　Ｇ）　ＴＴ　（Ａ、　Ｔ、Ｃ，Ｇ） 　ＧＡ　（Ａ、　Ｔ、Ｃ，Ｇ）ＧＧ　（Ｃ，Ｔ）　ＴＴ　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｇ ）　Ａ　（Ａ、　Ｇ）Ａ、　Ｇ）　ＴＣ−３°、配列番号　１０）を用いるＰＣ ＲＦｉ応は、約３６０ｂｐの増幅された生成物を作った。そのＰＣＲ生成物はサ ブクローン化され、配列の決定を行ない、それを新規なプロティンキナーゼとし て同定確認した。次に、このＰＣＲ生成物は、ラット脳ＣＤＮＡライブラリーを 選別するためのプローブとして用いた。高いストリンジエンシーでハイブリダイ ズする単一のクローンが単離された。　このクローンは、１．９ｋｂのｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａ挿入断片を含むっノーサンプロット分析は、１．９ｋｂのｍＲＮＡに対応 するバンドを明らかにし、このことは挿入物か全長クローンに対応することを示 すものである。

ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ挿入物は、４２，０００以上のＭ「を有する少なくとも３６７残 基のタンパクをコードできる単一の長いオープン・リーディング・フレームを有 している。　これは、インシュリン刺激Ｍ　Ａ　Ｐ　２キナーゼから単離された ７種類のトリプシンペプチドの一次配列を含むものである。更に、混合配列から の２つの付加的ペプチドの正確な配列か、翻訳されたｃＤＮＡ中に見いだされる 。これらトリプシンペプチドはともに１１５残基からなり、翻訳されたｃＤＮＡ 中の配列にこれらすべてが一致し、このことは推定翻訳生成物の３１％を占める ものである。多くのトリプシンペプチド配列と推定翻訳生成物との正確な一致は 、該ｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａがインシュリン刺激ＭＡＰ２キナーゼをコードしていると いう実質的な証拠を与えるものである。我々は細胞外シグナル調節キナーゼ１を 遺伝子ＥＲＫＩと命名した。

ＥＲＫＩはすべてのプロティンキナーゼ中に見いだされる１５個の不変の残基を 含む、　これは、Ｈａｎｋｓら（１９８８，５ｃｉｅｎｃｅ、２４１：４２−５ ２）により定義されたすべてのサブドメインとの実質的な相同性を示し、セリン ／トレオニン・プロティンキナーゼに特徴的な残基を含んでいる。他のプロティ ンキナーゼとの比較は、ＭＡＰ２キナーゼと最近酵母から単離されたプロティン キナーゼであるＫＳＳＩ　（Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅら、１９８９、Ｃｅ１ｌ　５ ８：１１０７−１１１９）およびＦＵＳ３　（Ｅｌｉｏｎら、Ｃｅ１ｌ　６０： ６４９−６６４）　との顕著な類似性を明らかにするものである。下記および第 ４図を参照。ＥＲＫＩキナーゼはＫＳＳＩと５６％同一であり、ＦＵＳ３と５６ ％同一である。ＫＳＳＩとＦＵＳ３はＭＡＰ２キナーゼに対するとほぼ同じ程度 （５７％）に互いに類似性を示す：　それらすべての他のキナーゼに対する相同 は、それらの互いに対する相同性よりも著しく低い。これら３種類のものすべて が、キナーゼのＣＤＣ２８ｃｄｃ”サブファミリーに対して次に高い相同性を共 有している（ＥＲＫＩキナーゼはこのキナーゼに対して４１％同一である）。し かし、ＫＳＳｌ、ＦＵＳ３およびＭ　Ａ　Ｐ２キナーゼはすべて、ＣＤＣ２８の すべての機能的相同体のサブドメインＩＩＩに見られるＶＰＳＴＡＩＲ配列か欠 如しているっさらに、これら３種類のものすべてかＣＤＣ２８／ｃｄｃ’−キナ ーゼに見られないＣ末端延長部分も共有している。ＦＵＳ３やＫＳＳｌとは異な って、Ｍ　ＡＰ　２キナーゼは少なくとも１７アミノ酸の顕著なＮ末端延長部分 を含んでいる。

ＥＲＫｌはＣ末端において、その酵母相同体と異なり、さらにリン酸化可能な残 基（例えばＥＲＫＩのＴｈｒ−２３８およびＴｈｒ−２４２）を有する異なる長 さの挿入物を含む、サブドメインＶＩＩとＶＩＩＩのＤＦＧモチーフとＡＰＥモ チーフとの間においても異なる。酵母キナーゼ間で弱く保存されている両頭域は 、個々のキナーゼの独特な機能的特徴の決定に関与している。多くのキナーゼに おいてサブドメインＶＩＩとＶＩＩＩとの間にあるセグメントは、酵素的活性に 影響を与えるような方法で自己リン酸化する（例えば、ｃ　、Ａ　Ｍ　Ｐ依存性 プロテインキナーゼインシュリンレセブター）、、キナーゼ間の保存も機能的に 重要な残基を明らかにするかも知れない。サブドメインｌには保存されたチロシ ンかあり、ＣＤＣ２８におけるそのチロシンのリン酸化は、プロティンキナーゼ 活性を阻害することか知られている。該タンパクのＣ末端近くには、インシュリ ンレセプターの自己リン酸化調節領域に興味深い類似性のために、チロシンリン 酸化の潜在的部位として特別な注意を引く配列（残基３６７−３７９）かある。

３つのチロシン残基は、レセプター中のチロシン残基（ＹＸ、ＹＹ）と同様に配 置されて、この領域内に位置している；　プロティンチロシンキナーゼによる認 識のために重要な決定基である４つの酸性残基は隣接して存在する。インシュリ ンレセプターリン酸化部位に似ている配列の存在は、ＥＲＫＩ　（ＭＡＰ２キナ ーゼ）がインシュリンレセプターのための基質かもしれないことを示唆する証拠 に一致をみるものである。

６、　２．　１．組織分布とＭＡＰ２キナーゼ転写物の誘導性ＭＡＰ２キナーゼ ｃＤＮＡから作られたプローブは、ノーサンプロット分析で単一の１，９ｋｂ転 写物を識別し、これは我々のｃＤＮＡクローンかほぼ全長の転写物を表わすこと を示すものである。ＭＡＰ２キナーゼ転写物は、調べられたすべての組織と細胞 系において検出てきる。興味深いことに、該転写物は、調べられた他の組織に比 べて中枢神経系で最大レベル（３倍〜６倍）で発現された。成熟ラット脳中のＭ ＡＰ２キナーゼ転写物の量は、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーから高いストリン ジエンシイ−で１０６フアーンをスクリーニングすることにより約０．０００５ ％であると算定された。該転写物は、ラットｌ繊維芽細胞およびＰＣ１２細胞系 において明らかに検出でき、その両方が強く活性化できるＭＡＰ２キナーゼを発 現する。

６．３．考察 アミノ酸配列は、インシュリン刺激ラット繊維芽細胞から６０００倍精製された ＭＡＰ２プロティンキナーゼから単離されたトリプシンペプチドから得られたも のである。該配列はＰＣＲに基つく方法による１、９ｋｂのｃＤＮＡの分子クロ ーニングに導く縮重オリゴヌクレオチドを設計するために用いた。該ｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａは、ＥＲＫｌと呼ばれる４２．０００以上の分子量を有するタンパクを予測 し、これは、精製されたＭ　Ａ　Ｐ　２キナーゼから得られたすべてのトリプシ ンペプチド配列に一致する配列を含むものであり、該タンパクの一次配列の３１ ％以上を占めるものである。従って、このｃ　Ｄ　Ｎ　Ａはインシュリンで刺激 したＭＡＰ２キナーゼをコードしていると思われる。

多くのプロティンキナーゼはＭＡＰ２をリン酸化する（Ａｋｌｙａｍａら、１９ ８６、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６１：１４７９７−１４８０３；　Ａｋｉ Ｖａｍａら、１９８６、Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２６１：１５６４８−１５ ６５１＋　Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、１９８７、Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、　４８ ：８４−９３）。ここで分子的にクローン化されたＭＡＰ２キナーゼは、インシ ュリンによるその速かな活性化により区別される（Ｂｏｕｌｔｏｎら、１９９０ 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：２７１３−２７１９：　Ｒａｙら、１９ ８７、Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：１５０２−１５０６：　Ｒ ａｙら、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８ ５：３７５３−３７５７；　Ｒａｙら、１９８８、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　 ２６３：１２７２１−１２７２７；　Ｈｏ５ｈｉら、１９８８、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、２６３：５３９６−５４０１；　Ｓｔｕｒｇｉｌｌら、１９８８、Ｎ ａｔｕｒｅ、３３４ニア１５−７１８：　Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０．Ｎａ ｔｕｒｅ　３４３：６５１−６５３）。この酵素の生理学的機能は知られていな いが、ＭＡＰ２キナーゼはＸｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓから精製されたＳ６キ ナーゼＩ　Ｉ　（Ｓｔｕｒｇｉ　Ｉ　ｌら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ　３３４ニ ア１５−７１８）ならびにウサギ肝臓Ｓ６キナーゼ（Ｇｒｅｇｏｒｙら、１９８ ９、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６４：１８３９７−１８４０１）をリン酸化し 活性化することが示された後、Ｓ６リン酸化の調節における役割が提案された。

ＭＡＰ２キナーゼのシグナリング経路への関与はさらにキナーゼ上のホスホチロ シンの存在により示されている（Ｒａｙら、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：３７５３−３７５７；　Ｂｏｕｌｔｏｎ ら、１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３０：２７８−２８６；　Ｂｏｕｌｔｏｎら 、１９９１年５月、Ｃｅ１ｌ）。インシュリンレセプターがこのリン酸化を触媒 することが示されていない一方で、チロシン残基の脱リン酸化が活性を減少させ るということ（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：６５１ −６５３；　ＢｏｕｌｔｏｎおよびＣｏｂｂ、１９９１年５月、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ ｇｕｌａｔｉ。

ｎ、Ｖｏｌ。ＩＩ）はＭＡＰ２キナーゼがシグナル変換経路の初期の段階で機能 し、従ってインシュリンレセプターによりおそらく直接に調節を受けるという考 えを支持するものである。多くの薬剤によるシダナリングにおけるこのキナーゼ の役割を示す追加的証拠は、Ｍ　Ａ　Ｐ　２キナーゼはウィルスによる形質転換 や成長因子への接触（Ｃｏｐｐｅｒら、１９８１、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ 、　１：１６５−１７８）後にホスホチロシン含量か増加するタンパクのｐｐ４ ２　（Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏら、１９８９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６６９４０−６９４３）かも知れないことを示す証拠に より強化されるものである。ＭＡＰ２キナーゼや、緊密な関連酵素は、細胞増殖 を促進しないが、分化もしくは分化した機能の発現を促進する多様な試薬によっ ても活性化される（Ｂｏｕｌｔｏｎら、ｌ９９０、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　 ２６５：２７１３−２７１９：　Ｒａｙら、１９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１． Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、、Ａ、　８４：１５０２−１５０６；　Ｒａｙら、 １９８８、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

８５：３７５３−３７５７；　ＲａＹら、１９８８、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、　２６３：１２７２１−１２７２７；　Ｈｏ５ｈｌら、１９８８ 、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３：５３９６−５４０１＋　Ｅｌｙら、１９ ９０、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

１１０ニア３１　７４２；　Ｖｏｌｏｎｔｅら、１９８９、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ ｏｌ、１０９：２３９５−２４０３＋　ＭｉＹａｓａｋａら、１９９０、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：４７３０　４７３：＋）。例えば、最近、我々は ＰＣＩ２細胞から神経成長因子で刺激したＭＡＰ２キナーゼを、インシュリンで 刺激した酵素を精製するために開発された同じ方法によって、はとんと均一にま で精製した。この酵素は５ＤＳ−ＰＡＧＥによればインシュリンで刺激したキナ ーゼと大きさか同じである。さらに、その活性は、Ｇｒｅｅｎｅと共同研究者に より記載の神経成長因子活性化〜ＩＡＰキナーゼと共通する特徴を持っている（ Ｖｏｌｏｎｔｅら、１９８９、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０９：２３９５− ２４０３およびＭ　ｉ　ｙ　ａ　ｓ　ａ　ｋ　ａら、１９９０、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 ｃｈｅｍ、　２６５：４７３０−４７３５）。

ＥＲＫＩと２種類の酵母キナーゼであるＫＳＳＩおよびＦＵＳ３との注目すべき 相同性は、この新しいファミリーのキナーゼが細胞外シグナルに対する応答を仲 介する点て重大で進化的に保存された役割と調和するものである。酵母キナーゼ は、酵母における細胞間コミュニケーションを仲介する唯−知られているペプチ ドホルモンである接合因子に応答して酵母細胞周期の調節で拮抗的な役割をはた している。両キナーゼは、おそらく酵母サイクリンとの相互作用による分裂周期 の必須の調節物質である関連プロティン・セリン／トレオニン・キナーゼのＣＤ Ｃ２８の活性を調整することにより働いているように見える。ＦＵＳ　３は明ら かに２種類の調節役割を持っている。ＣＤＣ２８の活性化を直接に阻害するか、 またはＣＤＣ２８活性化のために必要なサイクリンの不活性化を促進することに よって、Ｇｌのフェロモン誘導の細胞周期停止に導いている点において、ＦＵＳ ３は重要であるように思われる；　フェロモンによるＦＵＳ活性化も独立して接 合特異的機能を促進する。対照的に、ＫＳＳＩはフェロモン誘導の細胞周期停止 後の細胞周期への再入を促進する；　ＫＳＳＩはＦＵＳ３が不活性化することの できる同じサイクリンを活性化することにより働くことができる。ＥＲＫＩは明 らかに補乳類のおそらく機能的ならびに進化的に酵母キナーゼと対応するものを 表している。従って、ＥＲＫＩは多様な細胞外シグナルに応答して細胞周期を調 節するために、類似の経路を経て作用てきる。ＦＵＳ３と同じように、ＥＲＫｌ はまた明らかに細胞周期に直接には関与しない応答において調節的役割もはたす 。ＥＲＫｌと酵母キナーゼとの劇的な相同性は、その機能の分析のため、酵母が ＥＲＫＩ導人の有用な実験系を提供できる可能性を高めるものである。

ＭＡＰ２キナーゼ、またはＭＡＰ２キナーゼ様活性は、かなり多様な刺激に応し て多くの異なる種類の細胞で高まる。ＥＲＫ　１のクローニングの過程において 、我々はまた他の緊密に関連するキナーゼを分子的にクローン化した。酵母のＫ ＳＳＩとＦＵＳ　３キナーゼの構造的相同体である哺乳類のＭＡＰ２キナーゼ関 連酵素ファミリーの同定は、多細胞の高等真核生物が、もとは単細胞生物による 環境的な混乱を検知するために用いられていたキナーゼを細胞外シグナルに対す る応答を仲介するために使用して０ることを示唆するものである。このファミリ ーのＭＡＰキナーゼ関連タンパクの分子クローニングは、このグループの酵素の 調節機構と生理学的役割の研究の解明に役立ってあろう。

７、実施例：　インシュリンとＮＧＦに応答して活性化され、チロシンリン酸化 されるプロティン・セリン／トレオニン・キナーゼのファミリーであるＥＲＫ Ｓａｕ３Ａ制限エンドヌクレアーゼで部分的に消化し、次にＥＭＢＬ３／ＳＰ６ 　／Ｔ７バクテリオフアーン・ベクター（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）中にクローン化し たラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）肝臓Ｄ　Ｎ　Ａに由来するラノトゲ ノムＤＮＡライブラリーとラムダＺａｐ　ＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ）中に構築されたラット５　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリーの両方を選別するため に、Ｂｏｕｌｔｏｎらに述べられたＱＹＤＬプローブ（１９９０，５ｃｉｅｎｃ ｅ　２４９：６４−６７）か用いらた。ノ＼イブリダイゼー’ｙＢン（Ｍａｉｓ ｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９０ａ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５ １）の後、ＥＲＫ２およびＥＲＫ３ファージクローンは、低い通常のストリンジ エンシー（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０，０，１５ＭＮａＣｌ、Ｏ ，１％ドデンル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　、６０°Ｃ）を用いて、ライブラリ ーフィルターを洗浄することにより同定した（最終的に精製した）。ファージク ローン中の挿入物は、Ｂ］ｕｅｓｃｒｉｐｔ２プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ ｅ）中にクローン化して、ジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネーショ ン法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　７４　：５４６３−６４６７）を用 いて、シークエナーゼ・バージョン２．０キツトおよび提示されたプロトコール （Ｕ、Ｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）によるＤＮＡ配列分析によってその特性決 定を行なった。

７．１．２．ＥＲＫ特異的プローブの作成ＥＲＫＩ（アミノ酸５−６７）、ＥＲ Ｋ２　（アミノ酸１４−１３８）、およびＥＲＫ３　（アミノ酸１ｌ−１０５） の比較的保存されていないＮ末端領域をボーダーリングするＤＮＡ配列に対応す るオリゴヌクレオチド（１７塩基）は、ＥＲＫ−ｃＤＮＡ挿入物のそれぞれを含 むプラスミドからのこれらのコード領域を正確に増幅するために用いた。Ｎ末端 のコード領域が用いられた理由は、それらがこれら３種類のＥＲＫ間で相同性が 最も少ない領域であるためである。これらのプライマーの各々のペアーにより、 鋳型としてラント脳ｃＤＮＡかゲノムラントＤＮＡを用いて、ポリメラーゼ・チ ェイン・リアクション（ＰＣＲ）増幅も行なわれた。用いられたのかゲノムＤ　 Ｎ　Ａかｃ　Ｄ　Ｎ　Ａかにかかわらす、これら増幅のそれぞれが区別できない フラグメントを生成し、これらのプローブはＥＲＫ遺伝子内でとんなイントロン にもかからなかったことを示している。プラスミドから増幅された３種類のフラ グメントは、それぞれポリメラーゼ・チェイン・リアクノヨン法を用いて放射能 標識し、ラットとヒトゲノムＤＮＡを含むササンプロットに（Ｍａｉｓｏｎｐｉ ｅｒｒｅら、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１に記載の 通り）ハイブリダイズした：　６８℃で０．５〜１のリン酸ナトリウム、ｐ　Ｈ ７。

０．１％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、ングマ）、７％ＳＤＳ、１ｍＮ ｉ　ＥＤＴＡ　（Ｍａｈｍｏｕｄ　ｉおよびＬｉｎ、１９８９、Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｉｑｕｅｓ　７：３３１−３３３）および１００μｌ　／　ｍ　ｌの超音波処 理の変性サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａの存在下で、該フィルターは、それぞれの放射能標 識したＥＲＫ特異的プローブにハイブリダイズされ、次にＭａｉｓｏｎｐｉｅｒ ｒｅら（１９９０，５ｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４４６−１４５１）におけるよ うに６８℃で洗浄腰オートランオグラフイーに供した。

７．１．３．　ノーザンブロント分析 Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌ　ｅｙ　ラ　ノ　ト　（Ｈａｒｌａｎ　Ｓ　ｐ　ｒａ ｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｃ、）の組織および脳領域を細かく切り分けること は、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９０、Ｎｅｕｒｏｎ　５：５０１−５０ ９に記載のように行なった。細かく切り分けた試料はすくに液体窒素で冷凍した 。肝組織を得るために適時に妊娠しているラントを用い、精子陽性の日をＥ１日 、出生臼をＰＯとした。成熟したラットは平均１５０−２７５ｇであった（６− ８週令）。全ＲＮＡは、Ｂｏｔｈｗｅｌｌら、１９９０、”Ｐｒｅｐａｒａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ、　Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｆｏｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｇｅｎ ｅＳ″、Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂａｒｔｌｅｔｔ、Ｂｏｓｔｏｎ。

ＭＤ、ｌ）ｐ、１５−１６に記載のように、３Ｍ　ＬｉＣ１／６Ｍ尿素中でホモ ノナイズすることにより単離した。ケル電気泳動、ナイロン・膜への毛管移行（ ＭａｇｎａＧｒａｐｈ、Ｍｉ　ｃ　ｒ。

５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ、）、および膜へのＵＶクロス・リンキングは 、Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、１９９０、Ｎｅｕｒｏｎ　５：５０１−５０９ に記載のように行なった。該フィルターは放射能標識したＥＲＫ特異的プローブ にハイブリダイズさせ、前章で記載の通り洗浄した。３通りのゲルの臭化エチン ウム染色により、等量の全ＲＮＡか各々のプロット上で定量される（Ｍａｉｓｏ ｎｐｉｅｒｒｅら、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ２４７：１４４６−１４５１）こ とが示された：　このことは、幾つかのプロットを２８５　ｒＲＮＡのためのプ ローブとハイブリダイズさせることにより確かめられた。

精製されたアストログリア細胞を得るために、新生のラットからの海馬を細かく 裂き、分離し、血清含有培地（１０％ウシ胎児血清を補ったＤＭＥＭ）中で培養 した。培養７日目と９日目に、フラスコを激しく振とうし、非アストログリアル 細胞を除去した。次に、アストログリアを１００ｍｍ培養皿上にまき、ＲＮ　Ａ 調製の前の２８日間培養した。Ｐ１９胚性かん腫細胞の５Ｉ８０１Ａｌサブクロ ーン（ＭｃＢｕｒｎｅｙら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　２９９９：１６５−１６ ７）を培養し、ＤｉｎｓｍｏｒｅおよびＳｏｌｏｍｏｎ、１９９１、Ｃｅ１ｌ　 ６４：８１７−８２６に記載の通り誘導した。ＲＮＡは誘導の３日後に調製した 。

７．１．５．菌株とプラスミド ラクトースオペロンリプレッサーを過剰生産する大腸菌Ｗ３１１０　１ａｃ　１ ’Ｆ−とプラスミドベクターｐｃＰ１１０をＰａｎａｙｏｔａｔｏｓ、、１９８ ８、Ｇｅｎｅ　７４：３５７−３６３に記載の研究に用いた。ＥＲＫ２発現のた めに、ポリメラーゼ・チェイン・リアクンヨンを用いてベクターを以下の通り作 成した： ５°合成オリゴデオキシリボヌクレオチド・プライマー（ＲＡ　Ｅ−２１）は、 ＧＴＡ−ＣＧＡ　（Ｖａ　ｌ−Ａｒｇ）配列をＴＣＧ−ＡＣＡ　（Ｓ　ｅ　ｒ− Ｔｈ　ｒ）に変えることにより、開始メチオニン、Ａ　Ｔ　Ｇコドンのすぐ後に 唯一のＳａｌ　Ｉ部位を生成するようにデザインした。３“プライマー（ＲＡＥ ２２）は、Ｔ　Ａ　Ａ終止コドンの後に唯一のＥａｇ　Ｉ部位を含んでいた。発 現ベクターｐＣＰＩＩＯは、Ｓａｌ　ＩとＥａｇ　Ｉにより線状化され、得られ た３６５２ｂｐフラグメントはアガロースケル電気泳動により精製された。同し ように消化され精製されたベクターおよびＰＣＲフラグメントは結合され、大腸 菌Ｗ３１１０　１ａｃ　１ＱＦ−を形質転換した。形質転換体は、所望のプラス ミドのため制限マツピングにより選別され、ポジティブな候補（ｐＲＰＮ１１７ ）は、Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定によって、正しい読み枠て翻訳開始ノブナルに融合さ れた予期された全長遺伝子を持つことか確認された。

ｐＲＰＮ１２５：　このプラスミドは、最初の２つのアミノ酸のコドンが天然の 配列に復元された以外は、ｐＲＰＮＩ　１７と同しである。これは、ターゲット 配列を超えて延び、所望の修飾を有する２つの内部ＰＣＲプライマーと、所望の フラグメントを増幅する役割をはたす２つの外部ＰＣＲプライマーにより達成さ れた。２反応は、それぞれが鋳型として１８ｇのｐＲＰＮＩ　Ｉ　７を用いて設 定された：　一つは５Ｍｇ　ＲＡＥ−１０プライマーおよび０．５Ｍｇ　ＲＡＥ −２８プライマーを含んでおり、他方は５Ｍｇ　ＲＡＥ−２２プライマーおよび ０．　５ＭｇＲＡＥ−２７プライマーを含んでいた。ＰＣＲの１０サイクル（個 々のサイクルは９２℃で１分間、５５℃で２分間、７２℃で２分間のインキュベ ーションからなる）後、２つの試料を一緒にして、ＤＮＡサーマルサイクラ−中 でさらに２５サイクル（９４８Ｃで１分間、５５℃で２分間、７４℃で４分間の インキュベーションからなる）処理した。内部プライマーＲＡＥ−２８およびＲ ＡＥ−２７は互いに完全に相補的であるために、最初の段階のＰＣＲ反応の生成 物は次にアニールできる。さらに、第２段階反応において、実質的により高い濃 度の外部プライマーＲＡＥ−１０およびＲＡＥ−２２の存在は、大量の望まれる 全長生成物の合成を起こさせる。最初のＰＣＲ反応の生成物はＰＡＧＥにより精 製された。３３４９ｂｐフラグメントはｐＲＰＮｌ　１７を、ＡａｔＩＩとＥａ ｇＩて消化することにより得られ、アガロースゲル電気泳動により精製された。

両フラグメントは結合され、大腸菌Ｗ３１１０１ａｃ　ＭＦ−を形質転換した。

形質転換体は、所望のプラスミドのための制限マツピングにより選別され、ボッ チイブな候補の一つ（ｐＲＰＮ　ｌ　２５）をさらに５′プライマー領域を経る ＤＮＡ配列決定により同定した。

発酵のために、細胞はＬＢブロス地中で３７°Ｃて○Ｄ、］、＝１まで振とうし た。ラクトースは最終濃度か１％になるまで添加し、インキユベーシヨンを２０ 時間続けた。細胞は６．ＯＯＯＸｇで３０分間遠心して集め、３倍（Ｗ／Ｖ）過 剰の緩衝液Ａ（１００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ７，５、５０ｍＭ　 ＥＤＴ、八ｐＨａ、Ｏ１０，２ｍＭ　ＤＴ、Ｔ）に再Ｗ！濁し、−２０°Ｃて保 存した。

７、　１．　６．組換えＥＲＫ２の精製細胞（２ｇ）を室温で融解し、２　ｍ　 ｇのリゾチームと水中で２０分間インキュベートし、８０００１）Ｓｉてフレン チプレス（ＳＬ〜□ｌ−Ａｍ　ｉ　ｎ　ｃ　ｏ）を通した。粘性のある懸濁液は 次に緩衝液Ａで２倍に希釈し、さらに４のセツティングでポリトロン（Ｋｉｎｅ ｍａｔｉｃａ）の１分間の処理３回でホモ／ナイスした。１１．０００＞ζｇで １０分間４°Ｃで遠心後、上清を緩衝液Ｂ（２０ｍ　ＭＨｅ　ｐ　ｅ　ｓ　、　 ｐ　Ｈ７、５、Ｏ、Ｉ　ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、２ｍ〜１／チオスレイトール 、および２０ｍＭ　ＮａＣ１）で５倍に希釈し、緩衝液Ｂて平衡化したアフィゲ ル・ブルー（Ｂ　ｉ　ｏ　ｒ　ａ　ｄ）にかけた。タンパクは、緩衝液Ｂ中の０ ．０２−ＬＭ　ＮａＣ１直線勾配置００ｍ１で溶出した。ＥＲＫ２のフラクショ ン（０４−１Ｍ　ＮａＣ１）は緩衝液Ｃ（２０ｍ〜丁　ヒスチ／ン、ｐＨ５６、 Ｏ，１ｍＮｉ　ＥＤＴ、へ、２ｍＭンチオスレイトール、および２０　ｍＭ　Ｎ 　ａ　ＣＩ　）で希釈して、Ｎ　ａ　ＣｌをＯ，ＩＭまて減らし、緩衝液Ｃて平 衡化したＤＥＡＥセルロースカートリ、ン（ＺｅｔａＰｒｅｐ　６０．ＣＵＮＯ ）にかけた。カートリッジは、０．１Ｍずつ増加させる０、１−ＬＭ　ＮａＣｌ により段階的に洗浄した。ＥＲＫ２は、０．６および０．９Ｍ　ＮａＣｌの間で 溶出し、９０％以上の純度であることが判明した（例えば第ＥＲＫ２の自己リン 酸化は、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣＩ：、１ｍ〜１ノチオスレイトール、１ｍＭベンズ アミジン、３０ｍＭＨｅｐｅｓ、ｐＨ８，Ｏｌおよび１７　”ＰＩ；八ＴＰの存 在下、３０°Ｃて３０分間行なった。キナーゼ活性はＥＲＫ２を５０ｇＭ　ＡＴ Ｐ、２０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１ｍＭジ千オスレイトール、１ｍ〜１ベンズアミン ンおよびＭＢＰまたはＭＡＰ　２　（０，１ｍｇ／ｍ　りでインキュベートする ことて測定した。該反応は、Ｂｏｕ　Ｉ　ｔＯｎら、１９９１、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　３０：２７８−２８６にあるように１０％トリクロロ酢酸で止めた 。

２枚の１００ｍｍ皿中のラットＩ　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞またはＰＣＩ２細胞は２％ ラウン清アルブミン中の無血清クレブス−リンケル−重炭酸塩溶液（Ｓｍｉｔｈ ら、１９８０、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、八　ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　 Ａ、　、７７　：２６４　１−２６４５）に−晩もしくは６０分間で変え、次に 細胞を１２ｐオルトリ＞酸（１ｍｃ　ｉ／ｍｌ）で５０分間、インキユベーシヨ ンの最後の５分間はインシュリン（０，１８，ｃｚＭ）またはＮＧＦ（７５Ｍｇ ／ｍｌ）を添加するか添加しないで、標識を行なった。該細胞を冷やした培地中 で洗浄し、２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリドおよびＯ，ｌμＭペプス タチンを含有するホモンナイセーンヨン緩衝液（２０ｍＭ　ｐ−二トロフェニル ホスフエート、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ５０ｍＭフッ化ナトリウム、５０ＭＭオルトノくナンン酸ナトリウムおよび５ｍ Ｍベンズアミジン）１ｍｌ中でこすり、ダウンソングによりホモジナイズした。

１００．０００Ｘｇて１時間４°Ｃての沈殿後、上清（１ｍｌ）を免疫前血清で 一回前もって透明にし、次に５μｍの抗血清８３７または免疫前血清で１時間水 中でインキュベートするために分割した。免疫複合体はＰａｎ５ｏｒｂｉｎ　（ Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）て集め、最初に２Ｍ　ＮａＣ１、次に０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃ１、最後に０．０１％ＳＤＳを加えた０、１５Ｍ　ＮａＣ１を含有し、０．２ ％トリトンＸ−１００を加えたホモジナイゼーンヨン緩衝液中で洗浄した。ペレ ットを４０μｌの２，５倍濃縮した電気泳動試料緩衝液中に再懸濁し、１０分間 沸騰させ、ＳＤＳ中の１０％ポリアクリルアミドに乗せた。

ＥＲＫＩ標準品とともに試料（５μｌ）をニトロセルロースに移して、イムノプ ロットによって、それぞれの免疫沈殿物中の放射能標識のバンドがＥＲＫｌと一 緒に移動することを確かめた。変性免疫沈殿のために、上清は０．５％ＳＤＳお よび１ｍＭ／チオスレイトールの最終濃度になるように調整した。それら試料は １〜２分間沸騰させ、１．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１．２５％トリ トンＸ−１００、および０．１または１ｍＭノ千オスレイトールを含むホモノナ イゼーション緩衝液で４倍に希釈し、次に上記の様に免疫沈殿させた。ＥＲＫｌ に対応するバンドを乾燥させたケルから切り取り、６Ｎ　ＨＣＩで９０分間加水 分解した。ホスホアミノ酸はＣｏｏｐｅｒら、１９８３、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″、Ｖｏｌ、９９、Ｊ、Ｄ、ＣｏｒｂｉｎおよびＪ、 Ｇ、Ｈａｒｄｍａｎ、ｅｄｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、ｐｐ、３８７−４０２に記載のように分析した。

免疫複合体をプロットするために、１ｍｇの上清を変性条件下で免疫沈殿させた 。電気泳動前に、Ｐａｎ５ｏｒｂｉｎペレツトを０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７ ，５，０，１Ｍ　ＮａＣ１で２回洗浄した。ホスホチロシンを検出するために、 該プロットをホスホチロシンに対するモノクローナル抗体（ＵＢＩ）を用いて染 色し、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼと複合した第２抗体で目に見 えるようにした。６９１イムノプロツトは、ヤギ抗つサギＩｇＧ西洋ワサビパー オキシダーゼと複合した第２抗体で展開した。

ＰＣ１２細胞は、非被覆プラスチック血上にて５％ウシ胎児血清および５％ウマ 血清を有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地中て集密的になるまで生育さ せた。ＮＧＦは１０枚のうちの５枚の１５０ｍｍ皿に５０Ｍｇ／ｍｌの最終濃度 で５分間添加した。細胞はホモジナイゼーション緩衝液中でかきとり、可溶性フ ラクションを調製し、タンパクを記載（Ｂｏｕｌｔｏｎら、１９９１、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、３０　：　２７８−２８６）（Ｄ通す測定シタ。可溶性フラクションは ３倍容量の水で希釈し、５０ｍＭ　β−グリセロホスフェート、ｐＨ７，３，１ ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭｍチンスレイトール、０゜１ｍＭバナンン酸ナトリウム 、およびｏ、ｉμ〜１ペブスクチン中で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ　ＨＲ５／１５ カラムにかけた。タンパクはこの緩衝液中の０−０．３ＭＮａＣ１のグランエン ドで溶出した。各１ｍｌの６０フラクションを集め、０．３ｍｇ／ｍｌ　ＭＢＰ を用いてＭＢＰキナーゼ活性の定量を行なった。

ＥＲＫｌのｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａ、の単離に使用される同じプローブ（Ｂｏｕｌｔｏ ｎら、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ　２４９：６４−６５）かラット脳ｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａライブラリーを低ノーマルストリンジエンシーで選別するために用いられ、 多種のハイブリッドｃＤＮＡクローンか同定された。これらクローンの分析によ り、少なくとも二種類の新規なプロティンキナーゼが発見され、これをＥＲＫ２ およびＥＲＫ３　（第３Ａ図（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３およびＮＯ：４）および ３Ｂ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５およびＮＯ：６））と名付けた。ＥＲＫＩ、ＥＲ Ｋ２およびＥＲＫ３はすへて、池のプロティンキナーゼに対するよりも、酵母キ ナーゼのＫｓｓｔｇよびＦＵＳ３に対して、より緊密な関連性を持っている（４ Ａ図および４Ｂ図）。ＥＲＫは酵母キナーゼに対して約３７％（ＥＲＫ３）から ５６％（ＥＲＫＩおよび２）の同一性を共有し、それらは、次に関連性のあるキ ナーゼのｃｄｃ２ファミリー（ＬｅｅおよびＮｕｒｓｅ、１９８７、Ｎａｔｕｒ ｅ　３２７：３ｌ−３５）に対してかなり低い関連性を示す（ＥＲＫ３て２６％ の同一、性、それにＥＲＫｌおよび２て４１％の同一性）。ＥＲＫＩおよびＥＲ Ｋ２はＥＲＫ３に対するよりも互いにかなり関連性（９０％の同一性）を有して いる（第２Ｂ図）。（開始部位のためのＫＯｚａｋコンセンサス（Ｋｏｎｚａｋ 、１９８７、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１５：８１２５−８１４８） を満足させる）最初のｉｎ−ｆｒａｍｅメチオニンを用いて、ＥＲＫ２のｃＤＮ Ａにより予測されるタンパクは、ＥＲＫＩ（〜４３ｋＤａ）よりも小さい４１． ２ｋＤａの分子量を有し、触媒ドメインの上流のアミノ末端で、より少ない残基 を有している。ＥＲＫ２のための第２ｉｎ−ｆｒａｍｅメチオニンは、ＫＳＳＩ およびＦＵＳ３に存在する開始メチオニンと一列に整合できる。

ＥＲＫ３の推定されるアミノ酸配列により、６２．６ｋＤａのタンパクが予測さ れる。開始メチオニンは、ＥＲＫ２で予測されるもののすく下流に位置するか、 ＥＲＫ３は、ＥＲＫＩおよびＥＲＫ２に比較して、約１８０アミノ酸のＣ末端延 長を有している。この長いＣ末端延長にかかわらず、ＥＲＫ３は、ＥＲＫＩおよ びＥＲＫ２に対して、次に関連性のあるものよりも、顕著に高い関連性がある（ 触媒ドメイン内部で〜５０％の同一性）（第４Ｂ図）。さらに、ＥＲＫ間の近い 同一性を持つクラスター（例えばサブドメインＶ−８３％の同一性およびサブド メインＶＩ−９５％の同一性、　第４Ａ図を参照）から、ＥＲＫＩおよびＥＲＫ ２は、ＫＳＳＩおよびＦＵＳ　３に対するよりもＥＲＫ３に対して緊密に関連性 かあることが示された。２種類の独立したＣ　Ｄ　Ｎ　Ａりローンの配列決定に より、ＥＲＫ３はサブドメインＶｌｌｌ中においてＡＰＥよりもむしろＳＰＲを 含んでいることが確かめられた。　ＡＰＥ配列におけるグルタミン酸は、プロテ インキナーゼ中の１５の不変残基のただ１つであり（Ｈａｎｋｓら、１９８８． ５ｃｉｅｎｃｅ　２４１：４２−５２）、該アミノ酸＋；！　Ｅ　ＲＫ３中には 保存されていない。ｓｒｃチロシン・キナーゼによる変異分析により、このグル タミン酸の代わりに置換されたりシン残基は活性の低下を導くことが明らかとな った（ＢｒｙａｎｔおよびＰａｒｓｏｎｓ、１９８４、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｊ ｏｌ、４＋８６２−８６６）。サブドメインＶＩにおいて、ＥＲＫ３はチロシン キナーゼとセリン／′トレオニン・キナーゼの両方を連想させる配合であるＤＬ ＫＰＡＮを含有する。

７、　２．　２．別のＥＲＫの証拠 状々は、このファミリーの別のメンバーが存在するがとぅがを決定するために、 個々のＥＲＫに特異的なプローブを用いた（第５Ａ図）。これらのプローブは、 ３つのＥＲＫのそれぞれの最も保存されることの少なかった部分から作られ（材 料と方法を参照）、それぞれのプローブは、他の公知のＥＲＫとクロスハイブリ ダイズしないことが示された（第５Ａ図）。ＥＲＫＩに特異的なプローブは、Ｅ ｃｏＲｌて消化されたラットゲノムＤＮＡ中で幾つかの弱くハイブリダイズする フラグメントと単一の強くハイブリダイズするフラグメントを認識したが、他の 酵素で消化されたラットゲノムＤＮＡ中では多種の強くハイブリダイズするフラ グメントが認識された（５Ｂおよび５ｃ図）。ＥＲＫ２に特異的なプローブは、 ラット染色体Ｄ　Ｎ　Ａ中で２つの異なるＥｃｏＲｌとヒトゲノムＤＮＡ中で３ つの異なるＥｃｏＲ１フラグメントを認識した（第５Ｂ図）。ＥＲＫ３に特異的 なプローブは、ラットゲノムＤＮＡ中では２つのフラグメントを、ヒトゲノムＤ ＮＡ中では４つのフラグメントを認識した（第５Ｂ図）。これらのプローブはど んなイントロンにもかがらず、また分析で用いられるどの制限部位をも含まない ために（材料と方法を参照）、これらのハイブリダイゼーションにより、既に単 離されたＥＲＫに加えて多種のＥＲＫが存在し、ＥＲＫはさらにサブファミリー へグループ分けができることが示唆された。ラットゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ ライブラリーをＥＲＫに特異的なプローブによってスクリーニングすることは、 さらに、特異的プローブの一つのみに（しかし低ノーマルストリンジエンシーで ）ハイブリダイズする多くのクローンが単離されているために、サブファミリー メンバーという考えを支持するものである。しかし、ゲノムクローンの一つの部 分的ヌクレオチド配列は、それがＥＲＫＩに緊密に関連した擬似遺伝子（ＥＲＫ Ｉψと命名、第３ｃ図）を含んでいることを明らかにしているので、これらがす べて機能遺伝子を表わすわけではないかも知れない。

７、　２．　３．　ＥＲＫの異なる発生分布と組織分布ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、お よびＥＲＫ３に特異的なプローブは、Ｅ’ＲＫのｍＲＮＡ発現の発生分布と組織 分布を決定するために用いた。成熟ラットにおいて、すべてのｍ　ＲＮ　Ａは、 調べられたすべての組織で検出できたが（第６Ａ図）、３種類のＥＲＫのすべて のｍＲＮＡは、神経系内において最大レベルで発現された。神経組織内部におい て、ＥＲＫ２およびＥＲＫ３は、ｍＲＮＡ発現の明らかな相互パターンを示して おり、後脳部ではＥＲＫ３がより高く発現され、前脳部ではＥＲＫ２がより高く 発現された７比較すれば、ＥＲＫＩはより均一に発現された。神経系の外部では 、それぞれのＥＲＫが異なる組織において最大量で発現された。ＥＲＫＩは、腸 および胎盤で最大レベル発現され、肺でより少ない種度に発現された。ＥＲＫ２ のｍＲＮＡは、筋肉、胸腺、および心臓において最大レベル発現された。ＥＲＫ ２プローブは、異なる組織で異なる比率で発現される３種類の異なる転写物を認 識した：　これらの転写物は、処理の異なる形のＥＲＫ２　ｍＲＮＡであるかも 知れないし、ＥＲＫ２サブファミリーにおける他の遺伝子から生じているのかも 知れない。ＥＲＫ３のｍ　ＲＮ　Ａは、骨格筋において最大レベルで発現された 。

＋　ＥＲＫＩ、ＥＲＫ２、およびＥＲＫ３の神経系内における発現の発生的研究 により、ＥＲＫ３のｍＲＮＡが発生の初期に（特に、を髄と海馬において）最大 レベル発現されたことを示し、一方ＥＲＫＩとＥＲＫ２のｍ　ＲＮ　Ａの発現は 一般的に発生の間に増加した（第６Ｂ図）。脳内部におけるこれら２種類のキナ ーゼのｍＲＮ　Ａの発生的増加は、ＥＲＫＩとＥＲＫ２タンパクの量の変化を反 映したものである（下記参照）。肝臓および心臓では、３種類のすべてのＥＲＫ の発現は成熟ラットにおいては減少している（第６Ｂ図）。ＥＲＫのはっきり区 別される分布と発生パターンは、異なる細胞において（また恐らくシグナルの異 なるレパートリ−に応じて）それらか独特な生理学的役割をはたしていることを 示唆している。

挫骨神経にュートロン軸索およびニュートロン支持細胞（グリア）を含んでいる が、ニュートロン細胞体を欠如し、よってニュートロン特異的ｍ　ＲＮ　、Ａか 欠如している）におけるＥＲＫ２とＥＲＫ３転写物の低いレベルは、この末梢神 経におけるＥＲＫｌのｍＲＮＡの高いレベルとは対照的である（第６Ａ図）。従 って、末梢神経とは反対に脳中のＥＲＫ２とＥＲＫ３の高いレベルは、ニューロ ン内での特異的発現の反映かも知れない。この可能性をさらに調べるために、全 脳中と新生脳由来のニューロンを含まないダリア培養物中でのＥＲＫのそれぞれ のレベルを比較した（第６Ｃ図）。これらの培養物中におけるＥＲＫｌの発現に 比較して、ＥＲＫ２およびＥＲＫ３発現の低いレベルは、ＥＲＫ２とＥＲＫ３の ニューロン特異性を示すものである。

？、２，４．胚性かん腫細胞におけるニューロン分化または筋骨化の誘導の際の ＥＲＫ転写物の異なる調節胚性かん腫細胞系Ｐ１９は、通常、未分化の表現型を 示すか、レチノイン酸（ＲＡ）またはジメチルスルフオキシド（ＤＭＳＯ）　（ ＭｃＢｕｒｎｅｙら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ　２９９９：１６５−１６７）に よる処理後は、ニューロン筋系統に分化するように誘導することが可能である。

３種類のＥＲＫプローブにハイブリダイズする転写物は、ＰＩ３が分化する間に それぞれが特異的に制御される。ＥＲＫ１転写物は、ニューロンまたは筋肉様表 現型への誘導で、まったく減少しないか僅かに減少することを示すが、他方、Ｅ ＲＫ２の転写物は、ニューロン誘導でのみ顕著な増加を示しくこれは低親和性Ｎ ＧＦレセプターで観察されたパターンに匹敵する）、モしてＥＲＫ３転写物は、 ニューロンもしくは筋肉への分化で増加する。分化でのこれらの発現パターンは 、それぞれのＥＲＫがインビボで示す特異的な分布と符号しく上記参照）、ＥＲ Ｋ２とＥＲＫ３両者の（ダリア特異性よりもむしろ）ニューロン特異性への更な る支持を与えるものである。従って、Ｐ１９分化系は、ニューロンおよび筋肉分 化中の個々のＥＲＫの役割を研究するための有用なモデル系であると思われる。

興味深いことに、少なくともいくつかのＥＲＫの通常の基質を代表することので きるＭ　Ａ　Ｐ　２は、ＰＩ３のニューロン分化過程の重要な特徴、例えば軸索 延長や増殖停止等に明らかに必要とされる（ＤｉｎｓｍｏｒｅおよびＳｏ　Ｉｏ ｍｏｎ、１９９１．Ｃｅ　１１６４：８１７−８２６）。

７、　２．　５．組換えＥＲＫ２の活性新規なＥＲＫの性質とインシュリンで処 理した繊維芽細胞から精製されたＥＲＫＩの性質（Ｂｏｕｌｔｏｎら、１９９１ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、３０：２７８−２８６）との比較を開始するために、我々は 大腸菌て合成した組換えＥＲＫ２を精製した（第７Ａ図）。精製した組換えＥＲ Ｋ２はそれ自身をリン酸化しく第７Ｃ図）、時間依存的（第７Ｄ図）および濃度 依存的に外因性基質のＭＡＰ２とＭＢＰをリン酸化した。精製したＥＲＫ２の２ 種類の調製物の比活性は、Ｍ　Ａ　Ｐ　２またはＭＢＰを基質として、０．６お よびｌｎｍｏｌ／ｍｉｎ／タンパクｍｇであった。これは、ＥＲＫｌの高精製調 製物の比活性であるＭＡＰ２の３００　ｎｍｏ　ｌ／ｍｉｎ／ｍｇに匹敵し、ま たフォスファターゼ２ａの触媒サブユニットであらかじめ完全に脱リン酸化して おいた同じＥＲＫＩ調製物の比活性４　ｎｍｏ　ｌ／ｍｉ　ｎ／ｍｇに匹敵する ものである。

組換えＥＲＫ２が脱リン酸化された天然のＥＲＫＩと同様な比活性を持っている ことは、該組換えタンパクはリン酸化によって活性化される適当なコンフォメー ションにあることを示唆している。

２種類の異なるポリクローナル抗血清は、ともにＥＲＫＩの１６のＣ末端残基（ このうち１０残基はＥＲＫ２に保存されている）からなるペプチドに対して作っ たもので、イムノプロットで精製ＥＲＫＩと組換えＥＲＫ２を区別てき、また、 これらのタンパクや新規なＥＲＫを粗製細胞抽出物中で認識することもできた。

抗血清８３７は、精製したＥＲＫＩと組換えＥＲＫ２の両方を認識しく第７Ｂ図 ）、さらに粗製脳抽出物中で同じサイズの２種類のタンパクも認識した（第８Ｃ 図）。抗血清９５６は、ＥＲＫＩを認識したが、組換えＥＲＫ２は認識しなかっ た；　粗製脳抽出物においては、この抗血清は精製ＥＲＫＩならびに４５ｋＤａ の新規なＥＲＫとともに移動するタンパクを認識した（第８Ｂ図）。ＥＲＫＩの 他のサブドメインからのペプチドに対して作った抗体もこれら３種類のタンパク すべてを認識しくＢｏｕｌｔｏｎおよびＣｏｂｂ、１９９１年５月、Ｃｅ１ｌ　 Ｒｅｇｕｌａｔｉ。

ｎ、Ｖｏ　１．　Ｉ　Ｉ）　、これはＥＲＫＩとＥＲＫ２の認識を確証し、新規 な４５ｋＤａのＥＲＫの存在を確認させた。イムノブロッティングにより、４３ ｋＤａと４５ｋＤａのタンパクは、未発達の脳に比較した成体脳中において、劇 的に増加しく８Ｂ図および８０図）、このことは脳中のＥＲＫＩとＥＲＫ２のｍ 　ＲＮ　Ａの蓄積が発生的に調節されて増加することと符号する。抗血清の精製 ＥＲＫに対する特異性ならびにタンパク量とｍＲＮＡ量の関連性に基ついて、我 々は、両抗血清による粗製脳抽出物中に認識された４３ｋＤａタンパクをＥＲＫ Ｉと命名し、抗血清８３７によってのみ認識された４１ｋＤａタンパクをＥＲＫ ２と命名し、新規な４５ｋＤａのＥＲＫをＥＲＫ４と命名した。

ＭＡＰキナーゼ活性と同時クロマトグラフィーされるタンパクは、インシュリン に応答してトレオニンおよびチロシン残基上でリン酸化されることが報告されて いる（ＲａｙおよびＳｔｕｒｇｉｌｌ、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：３７５３−３７５７）。両タイプのリン酸化 は、最大ＭＡＰ２キナーゼ活性のために必要とされるのかも知れない（Ａｎｄｅ ｒｓｏｎら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ　３４３：６５１−６５３；　、Ａｈｎら 、１９９０、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６５：１１４９５−１１５９１：　 Ｇｏｍｅｚら、１９９０、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２７１：１１９−１２２；　 Ｂ。

ｕｌｔｏｎおよびＣｏｂｂ、１９９１、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｉｎ 　ｐｒｅｓｓ）ｏ我々は、２種類の異なる成長因子であるインシュリンとＮＧＦ に応答したこのキナーゼファミリーの個々のメンバーの活性化とリン酸化状態を 調べるために、個々のＥＲＫを特異的に認識する我々の抗体試薬を利用した。

インシュリンとＮＧＦのＥＲＫＩリン酸化に対する影響を直接に調べるため、イ ンツユリンまたはＮＧＦ刺激前と刺激後の３２Ｐで標識したラットＩ　ＨＩＲｃ ＢまたはＰＣ１２６細胞からＥＲＫｌを免疫沈殿させるために、我々は抗血清８ ３７を用いた（第９Ａ図）。抗血清８３７は、ＥＲＫＩ、ＥＲＫ２、およびＥＲ Ｋ４を変性条件下でイムノプロット上で認識したが、該血清は非変性条件下で粗 製抽出物から４３　ｋＤａのＥＲＫＩ、少量の４５ｋＤａのＥＲＫ４を免疫沈殿 させたが、４１ｋＤａのＥＲＫ２は免疫沈殿させなかった。”Ｐて標識されたバ ンドは、未処理の細胞からの免疫沈殿物中に検出されなかったが、一方、＋２ｐ で標識されたＥＲＫＩ　（４３ｋＤａ）と少量の”Ｐて標識されたＥＲＫ４（４ ５ｋＤａ）は、インシュリン処理またはＮＧＦ処理の両方の細胞から免疫沈殿し 、このことは、これら両方のＥＲＫのホルモン依存的リン酸化か存在することを 示すものである（第９Ａ図）。変性条件下では、少量の標識化されたＥＲＫ２も ＮＧＦによる刺激の後で検出できる程度に沈殿しく第９Ｂ図）、このことは、Ｅ ＲＫＩおよびＥＲＫ４と同じく、ＥＲＫ２はホルモン依存的リン酸化を受けたこ とを示すものである。

これらのリン酸化がチロノンを含むものかどうが決定するために、ホスホアミノ 酸分析とホスホチロノンイムノブロッティングの両方を免疫沈殿されたＥＲＫ上 に対して行なった。２通りの免疫沈殿物（変性条件下（方法を参照）てラッ）Ｉ 　ＨＩＲｃＢ細胞て行なった）を、ＥＲＫ抗体ならびにホスホチロシンに対する 抗体てイムノプロットしたときに、インシュリン刺激抽出物がらのＥＲＫＩとＥ ＲＫ２の両方がホスホチロシンを含み、一方、未刺激細胞からのタンパクにはほ とんど検出できるホスホチロシンが存在しなかったことは明らかであった（第１ ０図）。ＥＲＫ４には、ホスホチロノンがまったく検出されながった：　このこ とは、このタンパクか免疫沈殿したのは非常に少ないために、それを抗体で検出 することができなかったために違いない、　逆に、ホルモン誘導によるＥＲＫ４ のリン酸の増加は、セリン／トレオニン残基上のみかも知れない。第９Ａ図のゲ ルから切り取った１２Ｐで標識した４３ｋＤａのＥＲＫｌのホスホアミノ酸分析 は、トレオニン、セリン、およびチロシンがＮ　Ｇ　Ｆに応答してリン酸化され たことを示した（第９Ｃ図）。同しことがインシュリン処理細胞からのＥＲＫＩ にも当てはまる。これらの発見は、少なくとも３種類のＥＲＫタンパクがインシ ュリンおよびＮＧＦに応答してリン酸化され、少なくともこれらの２種類のもの がホスホチロシンを含むことを示すものである。

ＮＧＦ刺激後のこれらのタンパクのリン酸化をそれらの活性と関連つけるために 、我々は９５６抗血清と８３７抗血清を用いて、未処理およびＮＧＦ処理のＰＣ Ｉ２細胞のＭｏｎｏ−Ｑプロフィールからのイムノプロット上にＥＲＫｌとＥＲ Ｋ２を置いた。ＮＧＦ処理の結果、ＥＲＫＩ　（フラクション２９〜３１からフ ラクション３８〜４１まて）および明らかにＥＲＫ２　（フラクション２５〜２ ７からフラクション２９〜３１まて）の両方の部分の溶出がシフトしく第１１図 ）、これは恐らくこれらタンパクのリン酸化の変化のためてあろう。抗ホスホチ ロシン抗体で調べられた同しイムノプロットは、ＮＧＦ処理前のＥＲＫｌまたは ＥＲＫ２上にはとんとまたは全くホスホチロシンを示さなかった。ＮＧＦ処理に より、ＥＲＫｌとＥＲＫ２の両者のチロシン残基のリン酸化か増した。ホスホチ ロシンはシフトのないＥＲＫＩタンパクとラットしたＥＲＫＩタンパクの両方で 検出でき、これにより、多様な修飾（例えば、さらに、チロシン、トレオニン、 および／マタはセリン残基上でのリン酸化であり、これらは上記の免疫沈殿ＥＲ ＫＩのホスホアミノ酸分析と一致するであろう）は、Ｍｏｎｏ−Ｑからの溶出を 遅らせるために必要なことが示唆される。インシュリン処理細胞からのバンドを 同じゲル上で分析することにより、ＥＲＫと交差反応するバンドとホスホチロシ ンを含むバンドは一緒に移動することが示された。

ＮＧＦで処理することによっても、未処理細胞からのプロフィールには存在しな かったＭＢＰキナーゼ活性の２つの主要なピークがＭｏｎｏ−Ｑプロフィールに 現れた。その最初の活性ピークは、シフトしたＥＲＫ２タンパクとともに溶出し た（しかし、シフトしないＥＲＫｌタンパクとオーバーラツプした）が、その第 ２のピークは、シフトしたＥＲＫＩタンパクとともに溶出した。最初のＭＢＰキ ナーゼ活性ピークは、第２のピークとは異なり、抗血清８３７で免疫沈殿できな かった。さらに、最初のピークからのある活性は、ＥＲＫ２を免疫沈殿する限定 された能力を有する（組換えＥＲＫ２に対する）抗体で沈殿できたが、第２のピ ークからのものは、沈殿することができなかった。更に、両方のピークからの活 性を、セリン／トレオニン選択性フォスファターゼ２ａおよびチロシン選択性フ ォスファターゼＣＤ４５　（Ｂｏｕ　ｌ　ｔ○ｎおよびＣｏｂｂ、１９９１年５ 月、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ｖｏ　］、Ｉ　Ｉ）の両者とも不活性化 することができた。

従って、これらの観察により、第２のピークにおける活性は、完全に修飾された ＥＲＫＩによるものであり、最初のピークにおける活性は、活性化されたＥＲＫ ２によるもので、部分的に修飾されたＥＲＫＩによるものではないという結論が 支持されるのである。要するに、これらデータによれば、ＥＲＫｌおよびＥＲＫ ２はインシュリンやＮＧＦなとの細胞外シグナルに応答して迅速に活性化される ことか示され、この活性化は、増加したチロシン・リン酸化に関連性のあること が示されているが、完全な活性化は、付加的な修飾を必要とすることが示されて いる。

７．３．考察 我々は、ＥＲＫファミリーの３メンバーの配列を比較した。ラットおよびヒトゲ ノムＤＮＡへのハイブリダイゼーション（これは、ラットにおけるＥＲＫｉ　Ｅ ＲＫ２およびＥＲＫ３に加えて、最小限で３種類の新しいＥＲＫ遺伝子を明らか に示すものである）、ゲノムライブラリーとｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ ング、およびＥＲＫに特異的な抗血清によるイムノブロッティング（ＥＲＫ２お よびＥＲＫ３に加えて少なくとも一つの新規なＥＲＫを明らかに示している）は 、ラット中には別のＥＲＫ遺伝子があり、おそらくヒトにおいてはさらに多いＥ ＲＫ遺伝子があることを示唆している。多様なシグナルに応答し、異なる細胞型 中で、ＭＡＰ２／ＭＢＰキナーゼ活性の刺激のための証拠が存在する；４Ｏ−４ ５ｋＤａタンパクの細胞刺激に応答するチロシンリン酸化のためにより広範な証 拠さえもある（ＣｏｏｐｅｒおよびＨｕｎ　ｔ　ｅ　ｒ、１９８１．Ｍｏ１．Ｃ ｅ１１．Ｂｉｏｌ、１：１６５−］　７８　；　Ｍａｓｔ　ｉｎら、１９８４、 Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５９：１２１３５−１２１４３＋　Ｃｏｏｐｅｒら、１９８４、 Ｍｏｂ　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　４：３０−３７；　Ｍａｒｔｉｎｅｚら、１９ ８２、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉ。

１、２＋６５３−６８５；　Ｃｏｏｐｅｒら、１９８２、ＣｅＩＩ　３１：２６ ３−２７３；　Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏら、１９８９、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

８６：６９４０−６９４３；　ＦｅｒｒｅｌｌおよびＭａｒｔｉｎ、１９９０、 Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１０：３０２０−３０２５；　Ｇｏｌｄら 、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：　８１０−８１３）。我々の結果は、イ ンシュリン刺激およびＮＧＦ刺激細胞からの抽出物中で測定されたＭ　、Ａ　Ｐ 　２　／　Ｍ　Ｂ　Ｐキナーゼ活性は、単一酵素に由来するものではなく、少な くとも２種類の異なるプロティンキナーゼであるＥＲＫＩとＥＲＫ２に由来する ものであることを示すものである。これらのデータはラットにおけるＥＲＫ関連 酵素の拡がったファミリーを示唆する我々の発見と一致する。我々は、他の刺激 に応答する他の種類の細胞中に見つけられた同様な活性は、ＥＲＫＩまたはＥＲ Ｋ２によるか、またはその両方の酵素によるか、または恐らくこのファミリーの 他のメンバーによるものでありうる。このファミリーの最初の３種類の特徴付け られたメンバーは、脳ｃＤＮＡライブラリーより単離されたもので、神経系内に 最も高いレベルで存在するものであるが、それぞれのＥＲＫの発現は異なる組織 と発生的制御を示すものである。他の組織からのライブラリーのスクリーニング は、非神経組織において主として作用するＥＲＫを生むかも知れない。

該ＥＲＫに次に最も関連性のあるキナーゼは、以前に酵母からクローン化された ＫＳＳＩ遺伝子の生成物（Ｃｏｕｒｃｈｅｓｎｅら、１９８９、Ｃｅ１ｌ　５８ ：１１０７−１１１）とＦＵＳ３の遺伝子の生成物（Ｅｌｌｏｎら、１９９０、 Ｃｅ１ｌ　６０６４９−６６４）である。ＫＳＳＩは、接合因子で誘導される成 長停止を克服する。対照的に、ＦＵＳ３は、接合因子に応答して、細胞周期の停 止を導く。３種類のすべてのＥＲＫの間の新しい同一性を持つ領域のために、そ れらは共通の前駆体から生しるように思われる。該ＥＲＫと酵母におけるそれら の関連物との関係は、多細胞高等真核生物が、もとは単細胞生物中で根本的な接 合応答により利用されていたキナーゼを細胞外シグナルに対する応答を仲介する ために使用していることを示唆するものである。

さらに、次に該ＥＲＫに緊密に関連するｃｄｃ２キナーゼは、酵母やヒトなと多 様な真核生物中の細胞周期を調節する類似の役割を明らかにはたしている。興味 を引くことに、ＥＲＫの場合のようにｃｄｃ２キナーゼも、チロシンおよびトレ オニンの両方に対するリン酸化によって（ネガティブにてはあるが）調節を受け ている。

シグナル変換を理解するには、レセプター活性化チロシンリン酸化が、下流ター ゲットを調節しているセリン／トレオニンジン酸化に変換される機構の解明が必 要である。我々は、セリン−トレオニン・プロティンキナーゼ（ＥＲＫ）のファ ミリーをＮＧＦやインシュリンに応答してチロシン残基上で活性化されリン酸化 されるメンバーで示した。インツユリンおよびＮＧＦによるＥＲＫの活性化とな る一連の出来事の開始は、異なるレセプターを介して起こるのかも知れない：　 しかじ、前記両方のホルモンはチロシンリン酸化を誘導することが知られている 。インシュリン・レセプターが数年の間固有のチロシン・キナーゼ活性を抑制す ることが認識されてきた一方で、どのようにしてＮＧＦレセプターの活性化が細 胞内チロシンリン酸化を誘導するのかは今だに不明である。最近の証拠によれば 、ＮＧＦレセプターはチロシン・キナーゼ活性を抑制するか（Ｋａｐｌａｎら、 １９９１．Ｎａｔｕｒｅ　３５０：１５８−１６０）そうしたタンパクと関連性 があるか（Ｍｅａｋｉｎおよび５ｈｏｏｔｅｒ、１９９Ｌ　Ｎｅｕｒｏｎ　６： １５３−１６３）のどちらかであることが示唆されている。どんな機構が関与す るかにかかわらず、ＥＲＫのリン酸化は、ＮＧＦに応答してチロシン上でリン酸 化を受ける特定の細胞内タンパクの最初の実例を代表するものである。

我々の発見により、このキナーゼファミリーの特徴的な性質は、著しく多様な細 胞外シグナルに応答して、セリン／トレオニンジン酸化カスケードを活性化する ためにチロシンリン酸化に依存する中間体として機能することにあるが、ＥＲＫ はレセプター関連チロシン・キナーゼの直接の基質であるのか、またはそれらは カスケード中のさらに下流にあるのかは今だに不明である。リン酸化ネットワー クへの個々のＥＲＫの関与、それにＥＲＫがどのように共同して働くことができ るのかを正確に描くためには、いかに異なる細胞型が、チロシンリン酸化の活性 化を行なう多くの細胞外シグナルに対して複雑な応答を発しているのかを決定す ることが必要であろう。例えば、異なる発生段階の間、または異なる細胞型にお いて、同じレセプターを通して働く同じシグナルは、異なった応答を生じること ができる（例えば、増殖対分化）。

異なる状況において、特異的なＥＲＫの活性化か、同しシグナルの多様な解釈ま たは異なるシグナルに対する共通の応答に寄与するであろう。３種類のキナーゼ が発生の間の組織で異なって発現されるという観察と、ＥＲＫ２とＥＲＫ３か、 ニューロン発生のモデル系において誘導され、一方、ＥＲＫＩが、このプロセス の間に失われるという発見により、これらの酵素は発達中に強化されたシグナル 変換経路において独特な役割をはたしているという考えか支持される。さらに、 そのように潜在的に重要なシグナルを送る分子の膜制御が、細胞形質転換と発ガ ンに関与するのかも知れない。

ＥＲＫ遺伝子のクローニングおよび分化している細胞系（そこでは遺伝子は独立 に調節されている）の同定は、リン酸化カスケードにおけるＥＲＫの役割の解明 に用いることができるであろうし、また、このキナーゼファミリーの調節に関与 する機構を明らかにするためにも用いることかできるであろう。組換えＥＲＫタ ンパクおよびその変異体の発現は、インビボでのこれらのキナーゼの役割を明ら かにし、またＥＲＫ機能と活性化に関与する残基を決定するのに用いることかで きる。ＥＲＫの共通で独特な領域に対する抗体は、いかに個々のメンバーが多様 な応答に関与するかを調べるのに役立ってあろう。活性および不活性のＥＲＫＩ は、刺激でホスホチロシンを含むというＭｏｎｏ−Ｑプロフィールからの証拠に よれば、ＥＲＫＩ活性化の程度はチロシン／セリン・リン酸化によっても決定さ れることが示唆される。オカダイック酸（ｏｋａｄａｉｃ　ａｃｉｄ）により誘 導されるＭＢＰキナーゼ活性の大きな増加（Ｈａｙｓｔｅａｄら、１９９０、Ｊ 、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、　２６５：１６５７１−１６５８０）はこの考えに一致する。組 換えタンパクの利用可能性は、ＥＲＫ活性化におけるセリン／トレオニンおよび チロシンの両方のリン酸化の役割を細かく分析するために用いることができょう 。この点において、組換えＥＲＫ２は、脱リン酸化された天然のＥＲＫＩに似た 活性を有しており、このことは該組換えタンパクがリン酸化によって活性化され る適当なコンフォメーンヨンにあるかも知れないことを示唆している。実際、実 験によれば、脱リン酸化ＥＲＫＩの活性は、精製した活性タンパクの比活性まで 増加し、組換えＥＲＫ２の活性は、Ａｈｎら（１９９１Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 。

２６６：４２２０−４２２７）により最近記述されたＥＧＦ感受感受グアクチベ ーターり１５０倍から２００倍まで増加している。組換えＥＲＫ２をインビトロ で活性化する能力により、共有される又は独特な基質、アクチベータ−（例えば セリン／トレオニン・キナーゼおよびチロシン・キナーゼ）およびインアクチベ ーター（例えば、ホスファターゼ）を探すための組換えＥＲＫタンパクの利用が 確証される。

８、微生物の寄託 多様な引例をここで挙げたが、その開示は引用することてそれらの内容全てをこ こに編入するものである。

以下のプラスミドと細胞系をメリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクションに寄託した。

寄託番号　寄託日 細胞系ラット　Ｉ　ＨＩ　Ｒｃ　Ｂ　ＣＲＬ１０４７６　１９９０年５月３１日 プラスミドｐＢＳ−ｒＥＲＫｌ　４０８０８　１９９０年５月２３日プラスミド ｐＢＳ−ｒＥＲＫ２　４０８０９　１９９０年５月２３日プラスミドｐＢＳ−ｒ ＥＲＫ３　７５００９　１９９０年５月１４日本発明は、本発明の２〜３の特徴 の記載を意図する本実施例において寄託された構築物または開示された実施態様 によりその範囲が限定されるものではなく、機能的に等価なとんな実施態様も本 発明の範囲に入るものである。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明 の多様な修正改良は当業者には自明となるものであり、本クレームの範囲に入る ことが意図されるのである。

多様な引例がここに引用されたが、その開示は引用によりここにすべて編入され るものである。

（本頁以下余白） ホルモン Ｆｉｇｕｒｅユ ＦＩＧｔｌρＥ　ユＡ ＴＡ（１１ＡＣＩＡＴ［ＪＴＧＴＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡｒｖ 丁ｙｒ　ＬＹ５　Ｌｅｕ　Ｌ＋ｓｕ　Ｌｙｓ　丁ｈｒ　Ｇｌｎ　Ｈａｓ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｈａｓ　Ｉ　ｌｅ　Ｃｙｓ　Ｔ凾秩@Ｐｈｅ　Ｌｅ ｕ ＴＡＣＡＡＧ　ＣＴＣＴＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＡ　ＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＣＡＧＣＭ Ｔ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＡＴＣＴＧＣＴＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＴ@５５５ ＡＭＣＣＴ［ＪＣＣＧＧＧＣ［ＪＣＡＴＡｎＴＡ　丁ＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴ ＣＣＣＡＴＧＴＴＭＧＴＣＧＧＴＴＡＩＶ Ｉ Ｉｒｌ Ｇｌｎ　Ｌｐｕ　ＩＩＥＩ　Ｌｐｖ　Ｇｌｕ　５ｅｒＩｌｅ　Ｐｒｏ　ＶＱＩ　 ＶＱＩ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＣＡＧ　ＣＴＧ　ＡＴＣＴＴ［Ｊ　Ｇ ＡＧ　Ｔ口Ｔ　ＡＴＣＣＣＴ　ＧＴＴ　ＧＴ［ｌｌ　ＣＡＣＧＡＧ　ＧＭ　ＧＡ Ｔ　１１５４Ｃ１１−−ロじツー　＼■　−−Ｉ−１Ｌ：＋−−■　−Ｌ　（Ｊ 　ＯＪ　１−　−口　・　シー・くロ　−　乙−」・　Ｉ−ＩＬ：Ｉ　−工くｍ −〇＜−〇Ｊｃ−３・　ＱＪＩ−−ζ口　く−ＬＬＩＩ　−−一　・　−←　− −く　・くζ　−−く　・　−く　・　Ｌ）ＬＪ　・ＬＬｊ　−ζ口　−コω　 ・　ＣＬ■　・ＱＪ−−一＜　・　〜ト　−　いく　−ηく　・　じＱ　・　− 一−＜ロ　− Ｑ、＋■　１−ａ、Ｉ−一・ωω　−ｅＬ）　−ミー　・　−１−二一　−←　 −−＜。

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Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物のＭＡＰ２キナーゼをコードする、単離した組み換え核酸分子。
2. ２．実質的に図２Ｂ（配列番号：１）に示した通りの核酸配列を含む、請求項１ 記載の組み換え核酸分子。
3. ３．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８０８を有するベクターｐＢＳ−ＥＲＫ １中に含まれる、請求項２記載の組み換え核酸分子。
4. ４．約４３−４８キロダルトンの分子量を有するセリン−トレオニンプロテイン キナーゼをコードする、請求項１記載の組み換え核酸分子。
5. ５．実質的に図２Ｂ（配列番号：１）に示した通りの核酸配列、またはその一部 、を有する核酸分子にハイブリダイズし得る哺乳動物の核酸を含む、単離した組 み換え核酸分子。
6. ６．実質的に図２Ｂ（配列番号：２）に示した通りのアミノ酸配列を有するタン パク質、またはその少なくとも６アミノ酸からなる部分、をコードする、単離し た組み換え核酸分子。
7. ７．請求項１または６記載の組み換え核酸分子を含む生物。
8. ８．請求項１、２または６記載の組み換え核酸分子を含む細胞。
9. ９．神経系から誘導される、請求項８記載の細胞。
10. １０．遺伝子の発現を制御し得る核酸配列をさらに含む、請求項１または６記載 の組み換え核酸分子。
11. １１．実質的に図２Ｂ（配列番号：２）に示した通りのアミノ酸配列を含む、実 質的に精製したＭＡＰ２プロテインキナーゼ分子、またはその少なくとも６アミ ノ酸からなる部分。
12. １２．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、約４１−４８キロダ ルトンの分子量を有する、請求項１１記載の実質的に精製したＭＡＰ２プロテイ ンキナーゼ。
13. １３．（ａ）酵母ＦＵＳ３またはＫＳＳ１プロテインキナーゼに相同な部分およ び（ｂ）約６９アミノ酸の非相同アミノ末端部分を含む、実質的に精製したＭＡ Ｐ２プロテインキナーゼ分子。
14. １４．請求項３または５記載の組み換え核酸分子によりコードされる実質的に精 製したＭＡＰ２プロテインキナーゼ。
15. １５．請求項１１記載の組み換えＭＡＰ２プロテインキナーゼの６アミノ酸部分 。
16. １６．請求項１１記載の組み換えＭＡＰ２プロテインキナーゼを認識するモノク ローナル抗体。
17. １７．実質的に図３Ａ（配列番号：３）に示した通りの核酸配列を含む、単離し た組み換え核酸分子。
18. １８．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号４０８０９を有するベクターｐＢＳ−ｒＥ ＲＫ２中に含まれる、請求項１７記載の組み換え核酸分子。
19. １９．約４１−４８キロダルトンの分子量を有するセリン−トレオニンプロテイ ンキナーゼをコードする、請求項１７記載の組み換え核酸分子。
20. ２０．実質的に図３Ａ（配列番号：３）に示した通りの核酸配列、またはその一 部、を有する核酸分子にハイプリダイズし得る哺乳動物の核酸を含む、単離した 組み換え核酸分子。
21. ２１．実質的に図３Ａ（配列番号：４）に示した通りのアミノ酸配列を有するタ ンパク質、またはその少なくとも６アミノ酸からなる部分、をコードする、単離 した組み換え核酸分子。
22. ２２．請求項２１記載の組み換え核酸分子を含む生物。
23. ２３．請求項１７または２１記載の組み換え核酸分子を含む細胞。
24. ２４．実質的に図３Ａ（配列番号：４）に示した通りのアミノ酸配列を含む、実 質的に精製したＭＡＰ２プロテインキナーゼ分子、またはその少なくとも６アミ ノ酸からなる部分。
25. ２５．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定して、約４１−４８キロダ ルトンの分子量を有する、請求項２４記載の実質的に精製したＭＡＰ２プロテイ ンキナーゼ。
26. ２６．請求項１８または２０記載の組み換え核酸分子によりコードされる実質的 に精製したＭＡＰ２プロテインキナーゼ。
27. ２７．請求項２１記載の組み換えＭＡＰ２プロテインキナーゼの６アミノ酸部分 。
28. ２８．実質的に図３Ｂ（配列番号：５）に示した通りの核酸配列を含む、請求項 １記載の組み換え核酸分子。
29. ２９．ＡＴＣＣに寄託されて受託番号７５００９を有するベクターｐＢＳ−ｒＥ ＲＫ３中に含まれる、請求項２８記載の組み換え核酸分子。
30. ３０．実質的に図３Ｂ（配列番号：５）に示した通りの核酸配列、またはその一 部、を有する核酸分子にハイブリダイズし得る哺乳動物の核酸を含む、単離した 組み換え核酸分子。
31. ３１．実質的に図３Ｂ（配列番号：６）に示した通りのアミノ酸配列を有するタ ンパク質、またはその少なくとも６アミノ酸からなる部分、をコードする、単離 した組み換え核酸分子。
32. ３２．請求項２８記載の組み換え核酸分子を含む生物。
33. ３３．請求項２８または３１記載の組み換え核酸分子を含む細胞。
34. ３４．遺伝子の発現を制御し得る核酸配列をさらに含む、請求項３１記載の組み 換え核酸分子。
35. ３５．実質的に図３Ｂ（配列番号：６）に示した通りのアミノ酸配列を含む、実 質的に精製したＭＡＰ２プロテインキナーゼ分子、またはその少なくとも６アミ ノ酸からなる部分。
36. ３６．請求項３５記載の組み換えＭＡＰ２プロテインキナーゼに相同な、実質的 に精製した哺乳動物のプロテインキナーゼ。
37. ３７．請求項２９または３４記載の組み換え核酸分子によりコードされる実質的 に精製したＭＡＰ２プロテインキナーゼ。
38. ３８．神経成長因子様活性を有する化合物の存在を検出する方法であって、 （ｉ）神経成長因子様活性をもつらしい化合物の存在下で神経成長因子により活 性化されるＭＡＰ２プロテインキナーゼを産生する細胞を培養し；そして （ｉｉ）ＭＡＰ２プロテインキナーゼ活性のレベルの変化を検出する ことからなり、その際の活性増加が神経成長因子様活性の存在の指標となる、上 記方法。
39. ３９．細胞がＰＣ１２細胞である、請求項３８記載の方法。
40. ４０．細胞が哺乳動物のＭＡＰ２キナーゼをコードする組み換え核酸分子を含む 、請求項３８記載の方法。
41. ４１．インシュリン様活性を有する化合物の存在を検出する方法であって、 （ｉ）インシュリン様活性をもつらしい化合物の存在下でインシュリンにより活 性化されるＭＡＰ２プロテインキナーゼを産生する細胞を培養し；そして （ｉｉ）ＭＡＰ２プロテインキナーゼ活性のレベルの変化を検出する ことからなり、その際の活性増加がインシュリン様活性の存在の指標となる、上 記方法。
42. ４２．細胞がラット１　ＨＩＲｃ　Ｂ細胞である、請求項４１記載の方法。
43. ４３．細胞が哺乳動物のＭＡＰ２キナーゼをコードする組み換え核酸分子を含む 、請求項４１記載の方法。
44. ４４．ＭＡＰ２プロテインキナーゼ活性のレベルの変化を直接または間接的に引 き起こす化合物の存在を検出する方法であって、（ｉ）化合物の存在下でＭＡＰ ２プロテインキナーゼを産生する細胞を培養し；そして （ｉｉ）ＭＡＰ２プロテインキナーゼ活性のレベルの変化を検出する ことからなり、その際の活性変化が該化合物の存在の指標となる上記方法。
45. ４５．化合物が神経栄養分子であり、そして活性変化が活性の増加である、請求 項４３記載の方法。