JPH06501848A - 遺伝子工学バクテリオファージおよびこれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子工学バクテリオファージおよびこれを含むワクチン発明の分野 本発明は、遺伝子工学バクテリオファージおよびこれを含むワクチンに関する。

発明の背景 感染症の処置は重要な問題を残している。新規および／または改良ワクチンを開 発するために大きな努力がなされている。様々な理由のために、進展がゆっくり であり、しかし、保護免疫が病原体の構成タンパク質の１種だけおよび幾つかの 場合にタンパク質の一部分だけの投与により得られ得るという発見はワクチンの 製造において新たな希望を提供している。

口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）は、正感受性ＲＮＡウィルスの１科であるピコルナ ウィルス科に属する。ＦＭＤＶは、幾つかの大陸で家畜の大きな災いである。

この疾患の防御は、ＦＭＤＶが通常発生しないそれらの国では畜殺、風土病域で は予防接種のいずれかによるものである。現在使用しているワクチンは不活化ウ ィルスから製造され、組織培養細胞中で増殖させている。このワクチンは疾患を 制御するのに非常に効果的であることが判明しているが、高度感染性剤を多量に 取り扱うこと、および完全に不活化を確かにすることに関して多くの問題がある 。

更に、これらのワクチンは遠隔地域に投与し難く、更にこの疾患のために大きな 経済的損失を生じる。

広範囲に広がる疾患のもう１つのよい例は、長年にわたって免疫学者の目を免れ て来たマラリアである。主なヒトマラリア病原体であるプラスモディウム・ファ ルシパルムは、複雑な生活周期およびヒト免疫系を非常に有効に回避させる表面 抗原の絶えず変化する変形体を有する。疾患の制御を何度も試みたが、広範囲に わたる投与に適当である満足できるワクチンは得られていない。

照射スポロゾイトはヒトの免疫化に使用され、マラリアに対する防御を達成した 。しかしながら、ワクチンのこのタイプにおいて、寄生菌の有性および無性型両 方を必要とする。従って、感染した蚊の唾液腺または培養した赤血球のどちらか から製造しなければならない。前者は非常に少量であり、後者は高価な方法であ る。

照射スポロゾイトへの防御的な反応は、有機体の表面で発現し、世代間で突然変 異しないタンパク質（スポロゾイト周囲タンパク質と称される）に存在している 。このポリペプチド鎖の最も顕著な性質はアミノ酸配列ＮＡＮＰ（配列番号１） の長い中央の繰り返しであり、時に配列ＮＤＶＰ　＜配列番号２）が存在する。

更に、この繰り返し配列の１２種のアミノ酸単位が全分子に対する抗体反応性の 産生に十分であるとうことが示された。ポロゾイド周囲タンパク質の繰り返し領 域を含む、１２種またはそれ以上のアミノ酸からなる非常に様々なペプチドが、 ウサギおよびマウスを接種するのに使用されている：例えば、ヤング等、サイエ ンス、２２８巻、（１９８５年）、９８５頁参照。免疫原性反応は得られたが、 τｌＪコペプチドが一般に体液性反応を誘発しないため、これらは制限される。

免疫系の細胞により見のがされ、またはそれらが遭遇する細胞と弱い相互反応を するために、短いペプチドは免疫原性が乏しい。更に、短いペプチドは、腎臓か ら排泄され、したがって、皿流中に短時間のみ存在する。動物系において、それ ら問題の幾つかは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、また：；ペプチド を有する水酸化アルミニウムを茄えることにより解決し得るが、これらのアジュ バントはともに高い毒性があり、ヒトに投与することはできない。ペプチドが合 成された後に、ペプチドが大きな担体系に結合するならば、ペプチドはより大き な免疫原になり得るが、このことはワクチン製造の複雑性、および！用の損失を もたらす。

抗原として短いペプチドの使用に関する幾つかの問題を解決するために、ワクチ ン製造の別の手段が検討された。ウィルスの遺伝子物質の使用は、異種抗原性ペ プチドをピリオンの表面に発現する−ように操作する。抗原をニード化するＤＮ Ａ配列をニートタンパク質遺伝子の１種に挿入する。多くのウィルスがＤＮＡよ りＲＮＡを含むので、これは複雑な製造法であり得る。例えば、ポリ不つイルス ＩＩＩ型からの抗原性エピトープがタバコモザイクウィルスのコートタンパク質 に挿入されている：ヘイネス等、バイオテクノロジー、４巻、（１９８６年）、 ６３７頁参照。ハイブリッドコートタンパク質を製造し、エシェリキア・コリに 過発現させ、精製後、ウィルスタイプ桿菌へ集めることができた。ラットへ注射 したハイブリッドＴＭＶ粒子はポリオウィルスを中和し得る抗体の産生を刺激し 得た。不幸にも、ＦＣＡを使用したときにだけ、この反応が起こった。

抗体を弱毒化動物ウィルス、例えば、ワクチニア、ヘルペス、およびポリオなど のウィルス表面で発現させた：ディモック等（編集）　、Ｆｏｃ、　Ｇｅｎ、　 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｓｙｍｐ、第４５巻、「ウィルス性疾患の制御」ケンブリッジ・ユニパーツティ ・プレス（１９９０年）発行参照。ワクチンとして動物ウィルスの使用に関して 幾つかの問題点がある：それらは複雑であり、それらの遺伝子物質は取り扱いが 困難であり得る。それらは多量には製造し難く、従って高価である。それらはと きどき病原に先祖返りし、または毒性の何か別の影響を発現し得る。

線維状バクテリオファージは、タンパク質鞘内に収められた一本鎖ＤＮＡゲノム を含む。ＤＮＡは、エシェリキア・コリである宿主株の感染後、二本鎖になり、 ＤＮＡの二本鎖および一本鎖ともに容易に精製および使用し得る（突然変異誘発 用部位および配列決定のベクターとしで常用される、ウィルスＭ１３は、線維状 バクテリオファージである）。ゲノムは１０種のタンパク質をコード化し、うち ５種は成熟ファージ粒子中発見される。遺伝子■ＩＩＩは、ファージカプシドの 管状構造を形成する主要なコートタンパク質をコードし、遺伝子ＶＩＩおよびＩ Ｘはファージ粒子の一方の末端に位置する非主要コートタンパク質をコードし、 遺伝子ＩＩＩおよびＶＩはもう一方の末端に位置する非主要コートタンパク質を コード化する。ウィルス粒子は非主要コートタンパク質のそれぞれの約５個のコ ピーを含む。

遺伝子ＩＩＩの生成物は、宿主細胞の感染中に含まれた大きなタンパク質である 。化学的合成りＮＡカセットを遺伝子ＩＩＩヘクローン化し、組換えタンパク質 を製造する。ド・う・プレス等、ジャーナル・オブ・バイオロノヵル・ケミスト リー、第９巻、（１９８８年）、４３１８頁。多数の組換えタンパク質がウィル ス性粒子に取り込まれ、ウサギおよびマウスを接種するのに使用され、しかし免 疫系が免疫を与える十分な強さで反応する場合はなかった。この方法で設計され たファージはワクチンとしての使用に適当であるとは思えない（大量かつ非常に 危険な量が免疫誘発のために必要であろうから）が、この機構は、例えば、抗体 の特異性の観察するために、使用される「エピトープーライブラリーズ」の製造 のために開発されている。スコツトおよびスミス、サイエンス、２４９巻、（１ ９９０年）、３８６頁参照。

イリシーブ等、ドクレデイ・アカデミイ・ノウク・ＳＳＲ，３０７（２）巻（１ ９８９年、７月）、４８１〜３頁には、５種のアミノ成長の異種ペプチドを有し 、主要エンベロープタンパク質へ取り込まれるファージＭ１３を報告している。

ファージの感染に対する実質的効果は、以下のように報告されている：この効果 は、約１０％であるが、再感染の可能性のかなりの減少である。遺伝子工学的ウ ィルスの他の性質は報告されなかった。

ロウィッチ等、ジャーナル・オフ・モレキュラー・ノくイオロジー、２０４巻、 （１９８８年Ｌ６６３〜６７４頁、はハイブリッドファージ組立てを開示する。

本発明の概要 本発明では、線維状バクテリオファージは、その主要コートタン／くり質の少な くとも一部分に、生物学的反応を誘発し得る６個またはそれ以上のアミノ酸の異 種ペプチドを含む。

本発明は、ワクチン製造の遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の失敗は、各ファージで 発見される少数のタンパク質および／または巨大なウィルス構造によるエピトー プのマスキングのためであろうという認識に基づいている。しかしながら、主要 コートタンパク質（遺伝子Ｖｌ１１の生成物）は、ウィルス当り約２５００コピ ーであることが判明し、今回免疫原性効果を有するペプチドをこのタンパク質へ 挿入した。更に、それらはウィルスの表面にさらされていることが知られている コートタンパク質の領域に発現される。以下に示すように、異種ペプチドを含む コートタンパク質は非修飾（野生型）ウィルスコートタンパク質と平行して存在 し得る。

図面の説明 第１図は、ハイブリッド線維状バクテリオファージの概略図である。遺伝子ＩＩ Ｔタンパク貫１、エピトープを有するコートタンパク質２、野生型コートタンパ ク質３、およびサブユニットの正常バッキングに大きすぎるエピトープ４を示す 。　第２図は、プラスミドｐＫｆｄＨの構築を示す。工程はＮ　１　ａ　Ｉ　Ｖ 断片、ついで５ｎａＢＩ／Ｎ］ａＩＶ断片の分離、ついでＳｍａＩ／ホスファタ ーゼ処理ｐＫＫ２２３−３への結合を含む。

発明の記述 本発明のバクテリオファージは異種タンパク質を含む：ペプチドは抗原性であっ てもよく、例えば、所望の免疫反応を起こす、例えば、マラリア寄生虫の一形態 に対して、または口蹄疫ウィルスのような他のウィルスに対してである。このペ プチドは、この目的ではすでに公知であり得る。その長さは、その反応を起こす には十分であるが、バクテリオファージの性質を不適当に修飾し、またはその組 み込みの阻害には不十分である、例えば、少なくとも９個のアミノ酸である。

本発明のバクテリオファージは好ましくは免疫原性であり、ワクチンにおける使 用に適しており、一般的に治療的／診断的製品として適している。したがって、 本発明の生成物は、ワクチン組成物を製造するために、適当な生理学的に許容さ れ得る希釈剤または担体のいずれとも処方され得る。

更に、２種またはそれ以上の遺伝子工学的コートタンパク質遺伝子を適当に担持 する適当なベクターを使用することにより、２種またはそれ以上の別々に修飾さ れたコートタンパク質を、同じピリオンに集め得ることができ、１種以上のペプ チドに同時に発現させ得る。これは多目的ワクチンの生産およびこれに対応して 複雑な生物学的性質を有するピリオンの表面上により複雑な構造の生成をもたら す。

ワクチンとしてこれまたはその他のウィルスの潜在的な欠点は、それらが防御す る動物への注射において望ましくないとみなされるかもしれなＩ、ＮＤＮＡを含 むことである。ここに記載の線維状ノくクテリオファージ担体につＬ）て１′！ 、ビＩＪオン中のＤＮＡを、注射前に酸性ｐＨで透析して選択的に減成できる。

本発明の別の具体例において、異種ペプチドは、細胞受容体の作用薬／拮抗薬（ 例えば、ホルモン、放出因子または成長因子のような生物学的−活性ペプチド） 、または酵素の阻害因子（例えば、レニンまたはＡＩＤＳＩＤＳライ２レスプロ テイナーゼ因子）、または酵素（ファージ酵素）または抗体（ファージ抗体）ま たは所望の生物学的活性を有するその他のタンパク質またはペプチドである。あ る種の目的のために、ペプチドは非代謝成分を含み得る。様々なそのようなペプ チドを含むバクチリオフ７−ノは、好ましい構造および活性をスクリーニングす るの使用し得る。さらに、ハイブリッドファーン系は他の広い適用性を有する。

表現されるべきペプチドをコード化する様々なまたは任意のＤＮＡ配列を挿入す ることにより、ばく大な数のペプチドが、ピリオンの表面上に発現し得、すなわ ち、「エピトープライブラリー」を創造する。

エピトープライブラリーは、多数（時には、１００万）の短いペプチドにつ％ｓ で、所望の性質、例えば、抗体、需要体または他の結合タンノくり質に対する結 合強固性を調べることになる。例えば、抗体が自己免疫疾患である患者の血清力 Ａら精製し得るとき、抗体の標的は、しばしば判明していなし一エピトープライ ブラリーは抗体の抗原性標的を発見するのに使用し得、したがって疾患の生理的 部位を決定し、治療法の経路を示唆することに使用される。ホルモン、サイトカ イン、酵素基質、神経ペプチド、および他の生体分子の生物学的活性領域１こよ く似るペプチドを発見することもまた可能である。天然リガンドの作用（二代替 また（ま変更のいずれかを行い得るペプチドは薬剤開発の有効な候補である。〕 ＼イブ１ノ・ンドファージはそれぞれのウィルス粒子上に表れたペプチドのコピ ー数ｔど（す、ある広し１範囲内で制御し、強い感受性を供与し得る。

線維状のバクテリオファージｆｄの主要なコートタンパク質は遺伝子ＩＩＩによ りコード化される。成熟タンパク質のＮ−末端に付着した２３個のアミノ酸のリ ーダーペプチドを含むプロコートとしてタンパク質を合成した。合成後、プロコ −トタンバク質はエシェリキア・コリの内膜へ迅速に挿入され、そこで、膜をス パンする５０種のアミノ酸成熟コートタンパク質を残すように処理される。この タンパク質は、疎水性膜−スパンニングドメイン、細胞の細胞質へ向いている正 電荷Ｃ末端ドメイン、および周縁質へ伸長している負電荷Ｎ末端ドメインである ３種のドメインを有する。ウィルス粒子の集合中、コートタンパク質のサブユニ ットを細胞膜の外に取り出し、ウィルスのＤＮＡの周辺にらせん状の配列にする 。ウィルス粒子において、タンパク質サブユニットのＣ末端領域は、ＤＮＡの方 に内側に向かっており、正電荷の残基は、糖リン酸塩主鎖の負電荷を中和し得る 。反対に、Ｎ−末端ドメインは周囲の環境にさらされる粒子の外表面上にある。

核磁気共鳴の検討は、この領域がタンパク質の膜結合形態およびファージ粒子の 外側に存在するときも伸縮自在であることを示している。この領域は高い抗原性 でも知られており、抗体は全ファージ粒子に対して調製され、はとんどこのコー トタンパク質のこのドメインに向かってのみ向けられている。本発明では、ペプ チドはファージコートタンパク質の外側に付着し、ウィルス性粒子へうま（集ま っている伸長コートタンパク質を生成させ、強い免疫反応を誘発する。

従って、本発明の具体例を実施するために、バクテリオファージｆｄの主要なコ ートタンパク質のＮ−末端ドメインにエピトープが挿入されるので、それらは組 立てられたファージ粒子の外側を装飾する。この問題は、遺伝子ＩＩＩへの制限 酵素認識部位を設計し、所望のエピトープをコード化するオリゴヌクレオチドカ セットをファージゲノムに直接挿入させることによる、完全にＤＮＡ段階で解決 され得る。しかしながら、制御された方法でこの問題を検討するために、ファー ジ粒子の組立てから幾つかのハイブリッドコートタンパク質の合成を分離するこ とが好ましかった。これは新規コートタンパク質のクローニングおよび発現、膜 への挿入およびファージ組立てのパッケージング工程を独立した存在として検討 することを可能にする。

ｆｄコートタンパク質遺伝子の独立的発現をもたらすために、遺伝子ＩＩＩはｔ ａｃプロモーターを使用するｐＫＫ２２３−３のような制御され得る発現ベクタ ーへサブクローン化し得る。しかしながら、野生型遺伝子ＶＬＩＩはオリゴヌク レオチドカセットの挿入のための適当な制限酵素部位を含まない（エピトープを コード化するのに使用されるだろう）。従って、遺伝子がサブクローン化される 前に、適当な部位は部位−指向突然変異誘発により導入され得る。例として、こ の部位は、平滑末端（ＤＮＡの「イン−フレーム」挿入を可能にする）であり、 成熟コートタンパク質の第３番目と第４番目のコドンの間に位置しくプロコート 中リーダーペプチダーゼ認識配列の分裂を最小限にするために）、ｐＫＫ２２３ −３中に認識部位をもたないＨｐａｒにより認識される、すなわち、独特のクロ ーニング部位を提供する 本発明のハイブリッドバクテリオファージの製造において、中間生成物は修飾物 をコード化するプラスミドである。そのようなプラスミドの損失を防ぐために、 遺伝子工学的コートタンパク質がファージ、ファージミド、または他のレプリコ ン中ヘハンゲージングングナルを伴って移植される。ついで、組換え遺伝子は、 パッケージングされ、次の複製のために選択され得る。

以下の実施例は本発明の製造および生成物の利用を詳細に説明する。下記の方法 Ａ、ＢおよびＣを除いて、全ての実験操作はグリーンウッド等、ジャーナル・オ ブ・モレキュラー・バイオロジー、第２２０巻、（１９９０年）、８２１〜８２ ７頁に記載と同様である。ロウィノチ等、（１９８８年）、止揚、参照。

Ａ　トリノン緩衝系を用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動タンパク質を以下 からなる変性ポリアクリルアミドゲルで分離する：４９．５％（Ｗ／　Ｖ　）ア クリルアミド１０．５％（ｗ／ｖ）ビスアクリルアミド（７ｍｌ）、３Ｍトリス ＨＣＬ　ｐＨ８，４（７ｍｌ）　、グリセリン（４，２ｍ１）および２５％（Ｗ ／Ｖ）過硫酸アンモニウム（２００μ））およびＴＥＭＥＤ　（う０４ｍ）を含 む水（２，８ｍ１）。濃縮用ケルは以下のものを含む　４９５％（Ｗ／Ｖ）アク リルアミド１０．５％（Ｗ／　Ｖ　）　ビスアクリルアミド（１ｍｌ）　、３Ｍ トリスＨＣＬ　ｐＨ８，４（２，５ｍ１）および２５％（ｗ／ｖ）過硫酸アンモ ニウム（１００μ＋）およびＴＥＭＥＤ　（１０μりを含む水（６，８ｍ１）。

ゲルカセットを測定すると１７ｃｍｘ１７ｃｍおよび厚さ１ｃｍであった。

試料を、試料の４倍容量の変性緩衝液、即ち、ＤＴＴ　（１，５４ｍｇ）　、１ ０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ　（２ｍｌ）　、グリセリン（１ｍｌ）　、ＩＭ　）リス ＨＣＩ、ｐＨ６，８（１７０μｌ）　、水（１，６３ｍＬエタノール（２００μ ｌ）中１２％（Ｗ／Ｖ）ブロモフェノールブルー）に入れる。試料をゲ２しに入 れる前に２分間１００℃で加熱した。分留緩衝液は、以下のものを含んだ２１． ８％（Ｗ／ｖ）トリシン、１．２％（ｗ／ｖ）　トリス塩基および１％（ｗ／ｖ ）ＳＤＳ０ゲルに、ブロモフェノールブルーの着色面が底部に届くまで、１００ Ｖで一夜または２５０Ｖで一日中通電させた。

Ｂ　ＰＶＤＦ膜上タ膜上タンパ重質泳動上部電極緩衝液中２ｍＭメルカプト酢酸 （Ｎ−保護遊離基を捕集するのに使用した）を添加して方法Ａに記載と同様にト リシン−ＰＡＧＥを用いて分離した。

ゲルの通電が完了したとき、１０分間移動緩衝液（２５ｍＭ　トリス塩基、１９ ０ｍＭグリシン、１０％（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ）中に浸した。ＰＶＤＦ膜を、１０ 秒間ＭｅＯＨｄｐ液浸し、ついで５分間移動緩衝液中平衡化し製造した。タンパ ク質をバイオラド泳動装置を使用してＰＶＤＦ膜上を電気泳動させた。移動は１ ６℃に冷却しつつ、３〜１６時間１時間１５フＤＦを振盪しつつ１０分間水中す ぐに液浸した。膜を水ですすぎ、放置して完全に空気乾燥した。

Ｃ　アルカリホスファターゼを使用してウェスタンプロットでのタンパク質の検 出 タンパク質をニトロセルロース上を電気泳動により移動させた。膜を１０分開Ｔ ＢＳＴＩ衝液（１０ｍＭＩ−リスＨＣＩ、ｐＨ８．０、０　９％（ｗ／ｖ）Ｎａ Ｃ１、０　０５％（ｖ／ｖ）トウィーン２０）中に浸し、ついで２０分間１％（ Ｗ／Ｖ）ＢＳＡと含む同じ緩衝液で行った。膜を１０分間ＴＢＳＴ　（ＢＳＡを 含まない）で洗浄した。膜を、３０分間バタテリオファージｆｄまたはハイブリ ッドバクテリオファー７に対する抗体を含むＴＢＳＴ　（１４℃抗体／１ｍ１Ｔ ＢＳＴ）中に浸し、ついてＴＢＳＴ中で３回（１０分間／回）洗浄した。洗浄後 、ヤギ抗つサギＩｇＧーアルカリホスファターゼコンジュゲート（１４℃抗体／ １ｍ１ＴＢＳＴ）を加え、インキュベーションを３０分間続けた。膜を前記と同 様に３回洗浄し、プロットをニトロブルーテトラゾリム約１．６ｍｇおよび５− ブロモ−４−クロロ−３〜インドリルホスフェート約０．８ｍｇを含む３ｐ緩衝 液（１００ｍＭトリスＨｃ］、ｐＨ９．０、１　００ｍＭＮａＣ　ｌ、５ｍＭＭ ｇＣｌ□）で発色させた。両方の物質は使用直前に水に溶解して調製し得た。

実施例１ １、１　部位指向突然変異誘発およびｆｄ遺伝子ＶＩＩＩのサブクローニング１ ８ｍｅｒオリゴヌクレオチド（配列番号３）をホスホアミディトケミストリーを 使用してバイオサーチ８６００１！Ｍで合成し、ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により精製した。−末鎖ＤＮＡ鋳型を野生型ｆｄから製造し、突然変異誘発を アマンヤム社製インターナショナルｐｌｃからキット形態で市販のホスホロチオ エート法を使用して行った。多数のバクテリオファージを選択し、遺伝子ＶＩＩ Ｉの３゛末端方向に結合する第２のオリゴヌクレオチド（配列番号４、上記と同 様に合成および製造した）を使用して配列決定した。確実に変異を有するファー ジを分離し、ｆｄＨと称した。

Ｈｐａ１部位の挿入は、位置３および４のＧｌｙ−ＡｓｐからＶａｌ−Ａｓｎ（ 配列番号６）に成熟コートタンパク質（配列番号５）のアミノ酸配列に変化をも たらす。変異ファージが生きていて、野生型に匹敵し得る収串で繁殖し得るので 、そのような変化は明らかに膜挿入およびプロコ−トタンバク貿の処理にも、ま たバクテリオファージ粒子中へのコートタンパク質の組立てにも著しい影響を及 ぼさない。

ｆｄＨ遺伝子ＶＩＩＩをサブクローニングする反応式を第２図に示す。ｆｄＨの 二本＠ＲＦ　ＤＮＡを製造し、平滑末端の切断剤ＮＩａＩＶで消化し、遺伝子Ｖ ＩｉＩを含む２９２ｂｐ断片を含む多数の断片を産生させた。このバンドをポリ アクリルアミドゲル電気泳動で分離し、更に第２の平滑末端の切断剤Ｓｎ　ａＢ Ｉで消化し、遺伝子の２０種塩基対上流（野生型遺伝子の有効な発現の妨害は周 知である）を除去した。短縮した断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動により 再び精製し、Ｓｍａ　１で切断したｐＫＫ２２３−３へクローン化し、子ウシ腸 内アルカリホスファターゼで処理した。発現のため正しい方向でｆｄＨ遺伝子を 含む組換え型を制限酵素消化により決定し、ｐＫｆｄＨと称した。

１、２ｆｄＨ遺伝子の発現 ｆｄＨ遺伝子の発現を、プラスミドｐＫｆｄＨで形質転換したエシェリキア・コ リ株ＴＧＩ　（ｌ　ａｃ　Ｉ　ｑ）を使用してインビボで試験した。形質転換し た細胞を約０３のＡ６゜。値に、３７℃でアンピシリン５０μｇ／ｍｌを補った ＹＴ丁培中で増殖させ、ついでＩＰＴＧ（最終濃度２５０μＭ）で誘発した。誘 発後数回、細胞の試料を採取し、遠心分離で集め、洗浄し、トリンン緩衝液系（ トリシン−ＰＡＧＥ）を使用してポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し た。銀でのゲルの染色は、誘発前、コートタンパク質の製造は検出し得なかった ：誘発後、形質転換された細胞は、野生型コートタンパク質の電気泳動移動度と 同様のそれを有する増量のタンパク質を含んだ。インビボでのそれ句害験におい て、プロコ−トタンバク質は細胞膜内へ挿入されており、リーダーペプチダーゼ により処理されている。ｆｄＨタンパク質の場合に、突然変異は明らかにそれら 工程のいずれかで妨害されず、細胞膜内に利用し得る多量の加工コートタンバク 質があった。

従って、Ｈａｐ１部位の挿入およびプロコ−トタンバク質の第１次構造における 随伴的変化はバクテリオファージの組立てを妨害しなかった。突体変異コートタ ンパク質は、その合成が自由自在に誘発され得る、制御可能な発現ベクターｐＫ Ｋ２２３−３へ成功裏にクローン化された。プラスミドから合成したプロコ−ト タンバク質は膜挿入に適しており、正しく加工された。

ｆｄ遺伝子〜’ＩＩ）へのＨｐａ部位の挿入は、膜挿入およびわずかに変化した プロコ−トタンバク質の加工に対してほとんど影響しないことは多分驚くことも ないが、この小さいタンパク質へ多数の余分のアミノ酸の添加は、新規およびよ り劇的な製造法であり、膜挿入に対する効果は予測できなかった。この段階での 失敗は、ウィルス粒子への融合コートタンパク質の組立てをあきらかに妨げるこ とである。

従って、研究の第２の工程はＨｐａ１部位へオリゴヌクレオチドカセ・ノドを挿 入すること、および膜挿入および生じたプロコ−トタンバク質の一連の変化に対 する影響を歓察することであった。選択したエピトープ（配列番号７）は、プラ スモデイウム・ファル／パルムコートタンバク質（配列番号１）の繰り退し配列 であった。これは、合成ペプチドとして投与したとき、免疫反応を誘発すること で知られ、１２種のアミノ酸だけで、最も小さくエピトープを十分限定するもの の１つであった。

１．３ｆｄＨ遺伝子へのＤＮＡカッセトの挿入２種のオリゴヌクレオチドを、セ クション１．１に記載と同様に合成し、精製した。１種は（ＮＡＮＡＰ）ｓをコ ード化する配列番号７であり、他の１種は、相補的配列（配列番号８）であった 。二本鎖ＤＮＡカセットを製造するために、これら２種のオリゴヌクレオチドの 等量を６７℃に加熱し、放渾してゆっくりと室温に冷却した。３６ｂｐカセツト を、ＨｐａＩおよびウシ腸アルカリホスファターゼで処理しておいたｐＫｆｄＨ ＤＮＡへ結合させた。結合プラスミドをエシェリキア・コリ株ＪＭ１０９　（ｌ ａｃｌｑ、ｒｅｃｏ）へ形質転換した。ＤＮＡの挿入が成功すればＨｐａ１部位 を破壊するかもしれないので、組換え体を初めに制限酵素分析で同定した。Ｈｐ ａＩで消化に耐性であることが判明したプラスミドは、挿入されたカセットの数 および方向を決定するために配列決定した。

発現のために正確な方向の３６ｂｐカセツトの１つのコピーを含むクローンを分 離し、ｐＫｆｄＭａｌと称した。

１４インビボでのｆｄ融合タンパク質ｆｄＭａ　Ｉの発現プラスミドｐＫｆｄＭ ａ　Ｉを含んでいるエシェリキア・コリ細胞（株ＪＭＩＯ９）をｐＫｆｄＨ（セ クション１２）を含む細胞について記載したと同様に正確にＩＰＴＧで誘発する 。誘発前に、エシェリキア・コリタンパク質だけが存在した。誘発後、野生型ｆ ｄコートタンパク質より相当多く大きい多量のタンパク質が現れた。ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動法から推定タンパク質分子量（約７ｋＤａ）はｆｄＭａ　 Ｉ融合タンパク質であるものと一致した。更に、これはプロコート融合タンパク 質が細胞膜に挿入され、正確に処理されたことを強く示唆した。誘発した細胞か らのタンパク質のウェスタンブロッティングは、融合タンパク質は野生型ｆｄフ ァージに対して生じる抗体により認識されなかったことを示した。

結果として、エシェリキア・コリ中融合タンパク質の製造の一般反応式を作成し た。追加の３６個の塩基対を含む遺伝子は首尾よ（クローン化され、発現した。

融合タンパク質はプロコ−トタンバク質の中央に挿入された１２個のアミノ酸（ 成熟領域の大きさで１６％増大）を含むが、それらの余分残基はタン／ぐり質の 膜挿入で妨害されなかった。リーダーペプチドは効果的に膜−結合プロコートか ら除去され、挿入されたエピトープはリーダーペプチダーゼ認識配列を分裂しな かったことを示した。野生型ｆｄファージに対して生じる抗体は、融合タンノく り貿を認識せず、この系が免疫原的特異性をもたらすことを示した。−エシェリ キア・コリの非すプレッサー株中プラスミドから発現したｆｄコートタンパク質 は、それ自身のコートタンパク質中にアムバー突然変異を有するノくクテリオフ ァージＲ２５２の成長を助は得ることが先行の研究から知られている。

更に、ファージゲノムから発現する野生型コートタンパク質と宿主細胞内プラス ミドから発現した突状変異コートタンパク質を含む「／−イブリッド」ノくクテ リオファー７を製造することが可能である。これは、突然変異コートタンノくり 質が野生型コートタンパク質の不存在下でファージ増殖を維持し得ないときでさ え可能であった。従って、分離時および野生型コートタンパク質での「希釈」時 の両方でバクテリオファージ粒子へ集まるｆｄＭａｌコートタンノくり質の活性 を検討することが可能である。

１５　ハイプリントバクテリオファージの製造プラスミドｐＫｆｄＭａｌで形質 転換されたエシェリキア・コリ株Ｊ　Ｍ　１０９（ｌａｃｌｑ、ｓｕ）を１．Ａ ａｏｏ値が−０３になるまで、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＹ下塔地 中振盪しながら３７℃で増殖させた。ついで、細胞をファージｆｄまたはファー ジＲ２５２て感染させ、増殖を２０分間続け、細胞をＩＰＴＧ（最終１度１０μ Ｍ）で誘発した。増殖を一夜続けた。ファージを採取し、グリーンウッド等（１ ９９１）止揚と同様に精製し、試料をトリンンーＰ　Ａ　Ｇ　Ｅにより分析し、 ついて銀により染色した。

Ｒ２５２フアーノの収率は非常に悪（、電気泳動分析は、存在する唯一のコート タンパク質は野生型コートタンパク質と同様の泳動性であることを示した。少量 の産生じたファージは、アンバー突然変異ファージの集団内で生じた低い程度の 回復および疑似回復のためであると思われる。

もう一方で、ｆｄファージの収率は良い（培養液１１から精製ファージ約１０ｍ ｇ）。電気泳動分析は、２種のコートタンパク質を示し、１種は、野生型と同じ 移動性を、もう１種はｐＫｆｄＭａｌから発現したｆｄＭａ　１タンパク質と同 じ移動性を有する。これら２種のタンパク質は、はぼ同量で存在した（野生型コ ートタンパク質が僅かに多い）。

１．５　ｆｄＭａｌタンパク質の特徴 より大きいタンパク質の同定の確実な確認のために、試料を電気泳動により野生 型タンパク質から分離し、ＰＶＤＦ膜へ移した（方法Ｂ）。Ｎ末端配列を配列番 号９、即ち、ＡＥＶ　（ＮＡＮＰ）＊Ｎとして決定した。これは、完全なペプチ ドがコートタンパク質の所望の位置に挿入され、プロコートの正常な一連の変化 が生じたことを示した。

従って、野生型コートタンパク質もまた存在しないのなら、ファージの成熟タン パク質のＮ末端領域への１２種のアミノ酸の付加は、ファージ組立てと両立しな いことは明らかであった。これについて最も適当な解釈は、余分のペプチドが大 きすぎて、融合タンパク質だけでコートを構成しているコートタンパク質バッキ ングを許容させ得ない：しかしながら、野生型コートタンパク質も存在するとき 、これらは融合タンパク質が取り込まれることを可能にする「スペーサー」とし て作用し得る。これを図式化して第１図に表した。これは融合タンパク質を含む ファージの産生の複雑性を僅かに増加するけれども（ファージゲノムに亘接にオ リゴヌクレオチドカセットを挿入しようとするのは明らかに無駄であるので）、 ペプチドのより大きな間隔が正しい３次元構造に折りたたまれることが可能にな るので、免疫または他の特異的生物学的反応の産生を促進するから、実際、抗体 の製造または他の生物学的活性挿入に有利であり得る。

ワクチンにおけるｆｄＭａ　Ｉハイブリッドファージの好結果をもたらす使用に ついで多（の重要な判定基準がある。例えば、もしファージをヒトに注射するな ら、フロインドアツユバンドまたは水酸化アルミニウムなどの刺激剤を添加しな いで、優れた免疫反応が達成されることが必要である。コートタンパク質内のマ ラリアエピトープが免疫系に利用し得ること、および異なる形態、例えば、溶液 中の遊離ペプチド（および、最終的にマラリア寄生虫の部分として）で存在する 時に、エピトープを融合タンパク質に対して産生ずる幾つかの抗体が認識し得る ことが重要である。結局、抗体がマラリアエピトープに特異的に反応することが 重要である。

１７　抗体の製造 二二ノーランド白ウサギに、野生型バクテリオファージｆｄおよび野生型／ｆｄ Ｍａ　］ハイブリッドバクテリオファージのいずれかの試料０．５ｍｇ、１ｍｇ ／ｍｌを皮下注射した。ウサギに１．１４．２８．３８．４２．５６、および６ ６日ロー注射した。他の化合物は投与されなかった。６週間後、ウサギから採血 し、血清を分離した。

１８　ウェスタンプロット分析 野生型ファー／および野生型／ｆｄＭａｌハイブリッドファージのサンプルは、 トリノンＰＡＧＥに置き電気泳動をしてニトロセルロースに移し変えたつウェス タンプロット法は、抗ｆｄまたは抗ｆｄ／ｆｄＭａｌ抗体の何れをも使用して調 製した。抗ｆｄ抗体は野生型ｆｄコート蛋白を強く認識したが、ｆｄＭａ　ｌ蛋 白は認識しなかった。抗ｆ　ｄ／　ｆ　ｄＭａ　］抗体は、ｆｄｌ蛋白よびｆｄ ｋ・Ｉａｌ蛋白の両方を認識した。これは、両方の蛋白がウサギに注射されたハ イブリッドファージ中に存在することから予想された。しかしながら、ｆｄ〜１ ａｌｌ白に対する反応は、野生型蛋白に対する反応と比べて著しく高かった。こ れは２つのことを示唆する （１）より大きい融合蛋白は、ｆｄコート蛋白より抗原性があるがまたは、野生 型蛋白を免疫系から保護するかのいずれかでしたがって、ｆｄＭａｌに対する抗 体をｆｄに対する抗体より多く産生ずる。（２）抗ｆｄＭａｌ抗体は野生型コー ト蛋白を認識しない。これらの両方の要素は、ハイブリッドファージが、ファー ジ自身よりもむしろファージに結合しているマラリアエピトープに対する優勢な 反応を生じさせていることを示した。

１．９　合成ペプチドの認識 ｆｄ／ｆｄＭａｌハイブリッドファージに対して産生じた抗体は、ｆｄＭａｌ融 合蛋白に対して明らかに反応した。：しかしながら、異なった形態で存在するマ ラリアエピトープもまた認識できることが重要である。これを試験する最も容易 な方法は、化学的に合成された（ＮＡＮＰ）、ペプチドに対すや反応性を調べる ことである。

実際、（ＮＡＮＰ）！それ自体の合成は、技術的に困難である、なぜならＣ−末 端プロリン残基が未成熟末端によるものだからである。この困難さを除くために 、余分のアミノ酸（ａｓｎ＝Ｎ）をＣ−末端に添加する。精製された（　Ｎ　Ａ 　Ｎ　Ｐ　）　ｓ　Ｎ　（配列番号１０参照）のサンプルはニトロセルロース上 にスポットされ、乾燥される。

比較のため、他の無関係なペプチド（配列番号１１）、ファージｆｄのサンプル およびファージｆｄ／ｆｄＭａｌのサンプルを同様の方法で処理した。これらの サンプルハ、抗ｆｄ抗体（１：１０００希釈）ｔたは抗ｆｄ／ｆｄＭａ１抗体（ １５００，１：１０００，１：２０００，１：５０００希釈）ノイずレカト共に インキュベーションした。フィルターを洗浄後、ヤギ抗つサギＩｇＧ−アルカリ フォスファターゼ結合体を添加した。更に洗浄後、フィルターはニトロブルーテ トラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェートを 加えることにより発色させた。

バクテリオファージｆｄに対して生じさせた抗体は、ｆｄおよびｆ　ｄ／ｆ　ｃ １Ｍａｌハイブリハイブリッドファージサンプルも反応する。これらの抗体は、 合成（Ｎ、ＡＮＰ）３Ｎペプチドまたは対照ペプチドのいずれとも全く交差反応 しない。

しかしながら、ｆｄ／ｆｄＭａ　ｌハイブリッドに対して生じさせた抗体は、両 方の純粋およびハイブリッドファージサンプルとだけでなく、合成（ＮＡＮＰ） ３Ｎペプチドともまた強く反応する。対照ペプチドとの反応は見られない。

フロイント完全アジュバントのような免疫促進剤を添加しない、ハイブリッドバ クテリオファージのウサギへの注射は、十分強い免疫反応を引き起こす。抗体の 高い力価が産生じ、これらはハイブリッドバクテリオファージサンプルと強力に 反応する。抗体の混合集団は、マラリア融合蛋白に対して高い親和性を持ち、マ ラリアペプチドの合成変形を認識でき、無関係ペプチドとは交差反応しない。

それゆえ、免疫反応は活発てあり、非常に特異的である。

実施例１の要約として、マラリア寄生虫ペプチドは、バクテリオファージｆｄの カブノドに挿入された。ウサギの中の活発な抗体産生および合成マラリアペプチ ドとの抗体の強い交差反応能力を示した。

実施例２ この実施例では、オリゴヌクレオチドか、ＦＭＤＶ　ｖｐ１由来の１４１−１６ ０エピトープの領域がファージ粒子の外部に発現できるように設計され、遺伝子 ■ＤＮＡにサブクローニングされた。

２１　ｆｄ／ｆｄＦＭＤｖハイブリノドバクテリオファーンの製造オリゴヌクレ γチドカセノト（配列番号１２および１３）が合Ｆ５．された。こｎらはＦＮｉ ＤＶ　Ｖｐｌの１４１−１５４をコードする。オリゴヌクレオチドは、酵素ポリ ヌクレオチドキアーセで処理し、アニールし、ｐＫｆｄＨに（上記と同様に）ラ イケートした。正しい向きにカセットを含有するプラスミドは、ＤＮＡノークニ ンノングでスクリーニングした。ハイブリッドバクテリ万ファーンは（上記と； 同様に）製造され、イミ張されたコート蛋白に対して野生型を３１の比で含んだ 。ウサギにこれらのバクテリτファー／を接種した。血清を分離し、ＥＬＩＳＡ 系を使用して検定した。キー丁−ルリンペット（スカンガイ）ヘモンアニンに架 橋させた０　１μｇ／ｍｌのバクテリオファージまたは配列番号１４の化学合成 ペプチドも、Ｏ，１Ｍ炭酸７トリウム緩衝液、ｐＨ８，３の入った９６−ウェル のプレートに入ｎだ。室温１６時間後、非占領部位を、室温で２時間トコノス緩 衝液生理食塩水および０１％ヒトィーン２０　ＣＴＢＳＴ）ｂの５％ウノ血清ア ルブミン添加によりブフノクした。ついて、ウサギ血清を、プレートに一定の希 釈の範囲で添加した。

室温で３０分後、血清を除去し、プレートをＴＢＳＴで洗浄した。プレートはア ルカリフォスファターゼ架橋ヤギ抗ウサギＩｇＧの１　：　１０００希釈で３０ 分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、過剰の第２抗体を除去し、ア ルカリフォスファターゼの存在はＡＭＰＡＫシステム（ノボ・ビオ）を使用して 決めた。

ウサギ血清はハイブリッドバクテリオファージおよび化学合成ペプチドの両方に 強く反応することが判明し、ウサギはバクテリオファージの、外面に発現するエ ピトープに反応を示した。

２．２　ｆｄ／ＦＭＤＶバクテリオファージのワクチンとしての試験モルモット （５群および対即にそれぞれ動物４匹）にｆｄ／ＦＭＤＶハイブリッドバクテリ オファージおよび種々のアジュバントを接種した。ついで、動物は生存ウィルス に感染させた。

ファージ、アジュバントの投与量および結果は以下の表に示す（ＦＩＣＡ＝フロ インド不完全アジュバント）。結果は、明らかにｆｄ／ｆｄＦＭＤＶハイブリッ ドバクテリオファージがＦＭＤＶに対する防御を有することを示す。

要約する払実施例２はバクテリオファージの表面にエピトープを発現することに より、ＦＭＤ〜′に高い有効性をもつワクチンを製造Ｔることが可能である。

このワクチンは、既に市販されているものに比べて多くの有力な利点がある。そ れは非常に安定であり、冷却の必要がない。それは非常に安価で製造が容易であ る。さらに、広範囲の種々のエピトープをバクテリオファージ表面に発現でき、 多くの抗原型に対して防御することができるワクチンを製造することができる。

この技術はＡＩＤＳを含む多（の感染性疾患に対するワクチンの開発に使用でき る。

実施例３ 独特のＨｐａＩ−制限部位を、成熟コート蛋白の３および４残基を特定している コドンの間に設計しくベクターｆｄＨを産生ずるため）、６ｊのペプチドＹＧＦ ＷＧＭ　（配列番号１５）をコードするオリゴヌクレオチドをバクテリオファー ンｆｄＨＲＦ　ＤＮＡのこの部位にクローニングする。種々の子孫が全てのケー スから単離された。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動では、拡大したコー ト蛋白の低移動性は添加６−アミノ酸の挿入と一致し、このアミノ酸の組成は同 様に一致することが判明した。しかしながら、この技術でバクテリオファーンｆ ｄの主要コート蛋白に、６個以上のアミノ酸を直接挿入することが可能であるこ とは証明されていない。これは下記の数個の理由のうちの１個またはそれ以上の 理由によるのであろう、修飾蛋白の不安定性、膜−透過性および新規プロコート 分子のプロセシングの失敗、または次のＤＮＡのパッケージの不可能であること 。

配列表 配列番号・１ 配列の型　ペプチド 配列の長さ：４アミノ酸 起源生物名　・プラスモジウム　フＴルンパルム＾ａｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒ 。

配列番号：２ 配列の型・ペプチド 配列の長さ、４アミノ酸 起源生物名：　プラスモジウム　７Ｔルソ八ルムＡｓｎ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｒ 。

配列番号　３ 配列の型：ヌクレオチド 配列の長さ、１８塩基 鎮の数、１本鎖 トポロジー、直鎖状 ＧＧＧＡＴＣＧＴＴＡ　ＡＣＣＴＣＡＧＣ配列番号：４ 配列の型・ヌクレオチド 配列の長さ　１７塩基 鎖の数：１本鎖 トポロン−直鎖状 ＣＣＡＴＣＧＣＣＣＡ　ＣＧＣＡＴＡＡ配列の型、ヌクレオチド 配列の長さ、３６塩基 鎖の数　１本鎖 トポロジー、直鎖状 ＣＴＧ　ＣＧＣＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＧＣＣＧＣＧ　ＣＡＧ　 ＧＴｒ　ＣＧＧ配列番号・１４ 配列の型・ペプチド 配列の長さ、１９アミノ酸 Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

配列番号、１５ 配列の型・ヌクレオチドと対応するペプチド配列の長さ　１８塩基 起源生物芯　β−エンドルフィンのＮ−末端ペプチド〜、ユ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／１２　 ＡＤＹ　９２８４−４ＣＣ１２Ｎ　１５／７０ （７２）発明者　ライリス、アン・エリザベスイギリス国ケンブリッジ、シービ ー２・１エヌデイー、ノーウィッチ・ストリート９３番 Ｉ （７２）発明者　グリーンウッド、シュディスイギリス国ケンブリッジシャー、 シーピー４・４エルニー、インピングトン、ニュー・ロード、゛°トックホール ズ°゛　（番地の表示なし）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも主要コート蛋白の一部に、生物学的反応を誘発し得る少なくとも ６個のアミノ酸の異種ペプチドを含む線維状バクテリオファージ。
2. ２．ペプチドが少なくとも９個のアミノ酸を有する、請求項１記載のバクテリオ ファージ。
3. ３．ペプチドが、細胞受容体または酵素阻害剤の促進剤または拮抗剤である、請 求項１または２記載のバクテリオファージ。
4. ４．ペプチドが抗原性または免疫原性である、請求項１または２記載のバクテリ オファージ。
5. ５．ペプチドがマラリアに対する反応を生じさせる、請求項４記載のバクテリオ ファージ。
6. ６．ペプチドが、口蹄病に対する反応を生じさせる、請求項４記載のバクテリオ ファージ。
7. ７．ＤＮＡが減成している、請求項１〜６のいずれか１項記載のバクテリオファ ージ。
8. ８．生理学的に許容され得る担体または希釈剤と共に、請求項４〜７のいずれか １項記載のバクテリオファージを含むワクチン組成物。
9. ９．特定の制限酵素部位を遺伝子ＶＩＩＩ上に導入し、当該修飾遺伝子ＶＩＩＩ を制御可能な発現ベクターにサブクローニングし、ペプチドをコードするカセッ トをベクター中に挿入し、得られたベクターの蛋白産物を野生型バクテリオファ ージ中に集めることを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のバクテリーファ ージを製造する方法。
10. １０．遺伝子工学コート蛋白をコードする遺伝子がパッケージングシグナルを含 むレプリコンに移植される、請求項９記載の方法。