JPH06502082A - 赤痢菌同定用核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 赤痢菌同定用核酸プローブ 発明の背景 バーギーズ分類微生物７ニユ７ｋ　（Ｂｅｒｇｅｙ’　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏ ｒ　５ｙｓｔｅ＋ｎａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）　（Ｎ、Ｒ，クリー ブ編（Ｎ、Ｒ，Ｋｒｉｅｇ）　ｐｐ、４２３−４２７　（１９８４）　）で分類 されているように、赤痢菌には４種類がある（主要血清群）。志賀赤痢菌（Ｓ、 　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）（Ａ群）、フレクスナー赤痢菌（Ｓ、ｆｌｅｘｎｅ ｒｉ）　（８群）、ボイド赤痢菌（Ｓ、　ｂｏｙｄｉｉ）（０群）、ワンネ赤痢 菌（Ｓ、５ｏｎｎｅｉ）　（Ｄ群）。これらの血清群は、さらに血清型に分類さ れる。（表１）赤痢菌と大腸菌は系統発生的に親密な関係にある。ブレナー（Ｂ ｒｅｎｎｅｒ）らは、ＤＮＡ／ＤＮＡ再会合実験に基づき、２つがもっとよく考 えられり同胞種であルコトヲ示唆シタ。（Ｄ、　Ｊ、ブレナーら（Ｄ、　Ｊ、　 ｂｒｅｎｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊ、　Ｓｙ ｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２３：１−７　（１９７３）　 ）　これらの研究により赤痢菌は、ＤＮＡレベルで大腸菌と平均８０−８９％関 係があると示された。赤痢菌同士の関係もまた平均８０−８９％である。血清型 １３のボイド赤痢菌は他の血清型赤痢菌や大腸菌と６５％しか関係がないという 点で非典型的である。

赤痢菌はヒトにたいして発病性を持つ。１０から１００の菌の感染というレベル で赤痢が起きる。対照的に、大部分の大腸菌（９００００：Ｈ血清型）は、下痢 とは関係がない。病原性血清型大腸菌は、腸内毒性大腸菌（ＥＶＥのと集合的に 呼ばれる。

（Ｊ、　Ｒ，ラプスキーら（Ｊ、　Ｒ，Ｌｕｐｓｋｉ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、 　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　１５５@：３７７−３８９ （１９８７）　；Ｍ、Ａ、カーマリ（Ｍ、　Ａ、　Ｋａｒｍａｌｆ）　、　Ｃ１ １ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ＲｅｖｉｅｖｓA−２＋１５− ３８　（１９８９）　）　この群には少なくとも５つのサブクラスの大腸菌が含 まれており、それぞれが下痢にいたる特徴的な発病経路を持っている。サブクラ スには、腸内毒素産生大腸菌（ＥＴＥＣ）　、ベロ毒素産生大腸菌（ＶＴＥＣ） 　、腸内病原性大腸菌（ＥＰＥＣ）、腸内接着性大腸菌（ＥＡＥＣ）　、腸内侵 襲性大腸菌（ＥＩＥＣ）が含まれる。腸内出血性大腸菌（ＥＩｌＥＣ）は、ベロ 毒素を産生ずるのでＶＴＥＣに含まれる。

腸内侵襲性大腸菌による発病は、赤痢菌のそれと非常によく似ている。どちらに おいても、結腸上皮細胞の侵襲が起き、下痢と共に血液と粘液の放出にいたる細 胞内増殖が起きて赤痢となる。

それで、赤痢菌とＥＩＥＣの同定は、様々な医学的状況において重要な意味を持 つ。

例えば、便のサンプル中に赤痢菌かＥＩＥＣが存在すれば、胃腸炎を示唆するこ とになり、それらの存在をスクリーニングできれば、胃腸炎の処置と管理に有益 である。食物のような様々な媒介物中における赤痢菌とＥＩＥＣの同定はまた、 胃腸炎の拡散防止においても重要だ。

現在、便のサンプル中の赤痢菌の存在は、それらのバクテリアの増殖にふされし い条件の微生物培地上で適当に調製したサンプルを培養することによって同定し ている。生じるコロニーの微生物学的、生化学的特徴を調べる。その過程は、普 通少なくとも３日かかり、たくさんのサンプルを処理することはできない。しか し、普通便の中に存在する多くの非病原性大腸菌の中でＥＩＥＣを同定するのに 必要な血清型分けの困難さのために病院は便中のＥＩＥＣの存在をテストしない 。

発明の要約 本発明は、核酸プローブを用いる赤痢菌と腸内侵襲性大腸菌（ＩＪＥＣ）のバク テリアの同定法に関する。さらに本発明は、非赤痢菌ＤＮＡに対するサブトラク テイブハイプリダイゼインヨンにより単離された赤痢菌特異的染色体配列及び断 片、そして赤痢菌特異的断片由来のプローブに関する。またプローブは、赤痢菌 ｏｍｐＡ遺伝子の配列に由来する。特に約４０ヌクレオチドの一連のプローブは 、赤痢菌に対する、あるいは赤痢菌と腸内侵襲性大腸菌の両方に対する特異性を 持ち、高い感度を得るのに増幅を必要とする非アイソトープテストで利用できる ようにデザインされている。加えて、腸内出血性大腸菌ばかりでなくワンネ赤痢 菌、−フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌、志賀赤痢菌を含む全ての臨床的に重 要な血清型赤痢菌を十分同定できる特異的ハイブリダイゼイノヨンプローブセッ トが開発された。本発明のプローブやプローブセットは赤痢菌や腸内侵襲性大腸 菌同定の多くの形式のハイブリダイゼイションで使用可能である。例えば、サン プル中の細胞を溶解し、赤痢菌やＥＩＥＣＤＮＡとプローブのノゾブリダイゼイ ションに適当な条件下でＤＮＡプローブセントとサンプルを接触させ、プローブ とサンプルＤＮＡとで形成された結合物を捕らえ、適当な方法でサンプル中にお ける赤痢菌とＥＩＥＣの存在の指標として結合物を同定することにより、サンプ ル中の１種以上の赤痢菌や１種以上のＥＩＥＣの存在は決定される。

図の簡潔な記載 図１はご標的”ＤＮＡからの赤痢菌特異的ＤＮＡ配列の単離と標的ＤＮＡクロー ンのライブラリーからの赤痢菌特異的断片の単離の方法を示したフローチャート である。

図２は、赤痢菌特異的断片ＮＴ６のヌクレオチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ）と近接配列、及びこれらの配列に由来するプローブ１５００　（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：１４）　、　１５０１　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｌ５）　、　１９１１ 　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）の位置と配列を示している。

図３は、赤痢菌特異的断片ＮＴｌｌ−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）のヌクレオ チド配列、及びこの断片に由来するプローブ１６８２　（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ： １７）　、　１６８３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ｇ）　、　１７０８　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ＋１９）　、　１７０９　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）　ノ位 置と配列を示しティる。

図４は、ワンネ赤痢菌から単離されたクラス■反復を含む、赤痢菌特異的断片Ｎ Ｔ１４　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）とＮＴ１５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３） のヌクレオチド配列、及びこれらの断片に由来するプローブ１８６４　（ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：２２）　、４３７　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）の位置と配列 を示している。大腸菌（Ｅ、ｃ、１；ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５　：Ｅ、ｃ、２； ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

ニア）とフレクスナー赤痢菌（Ｓ、　ｆ、　：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８　ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：９）から単離された３つのクラス■反復の配列も示されている 。

図５は、赤痢菌特異的断片ＮＴ１８−１ａ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）の配 列、及びこの断片に由来するプローブ１７１２　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３） 　、　１７１３　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ°２４）の位置と配列を示している。

図６は、赤痢菌特異的断片ＮＴ１９−２　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）の配列 、及びこの断片に由来するプローブ１６８４　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）　 、　１６８５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）の位置と配列を示している。

図７は、志賀赤痢菌（Ｓ、ｄ、）　ｏｍｐＡ遺伝子（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２ ）の配列の一部、及びｏｍｐ＾遺伝子配列に由来するプローブ１７０６　（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２７）　、　１７０７　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）の位置 と配列を示している。同じ領域に相当する大腸菌（Ｅ、ｃ、）　ｏｍｐ＾遺伝子 配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）が比較のため示されている。

赤痢菌特異的プローブの開発に興味を持つこれまでの研究者は、毒性プラスミド 標的としてきた。赤痢菌とＥＩＥＣは、侵襲に必須の約１４０ＭＤ　（２１５キ ロベースベア）のシングルコピー毒性プラスミドを持っている。（Ｔ、　Ｌヘイ ル（Ｔ、　Ｌ、　Ｈａｌｅ）　、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍ＋ｍｕｎ ｉｔｙ、４０：３４０−３５０　（１９８３）　）　たとえば、Ｕ、　Ｓ、特許 Ｎｏ、　４．８１６．R８９ （サンスネッティら（Ｓａｎｓｃｎｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｔ、　）　）は、毒性プ ラスミドの２７キロベースベア（ｋｂ）領域が侵襲に必要であることを証明して いる。これらの研究者は、バクテリアあたり１コピー存在する毒性ブラストが不 安定であり、プラスミドの一部が欠失しているであろうことを示した。研究室に 貯蔵したり移動させたりした赤痢菌やＥＩＥＣ株は、しばしばサイズが縮んだ毒 性プラスミドを持っていることが分かった。（Ｃ，ササカワら（Ｃ，Ｓａｓａｋ ａｗａ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔ ｙ、　５１：４７０−４７５　（１９８６）　；Ａ、Ｔモウレリら（Ａ、　Ｔ、 　Ｍａｕｒｅｌｌｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　≠獅п@ｆ ｍｕｎｉｔｙ、　４３　：３９７−４０１）　サンソネッティら（Ｓａｎｓｏｎ ｅｔｔｉ　ｅｔ　ａｌ、　）のプローブは、２７ｋｂ領域に由来していたが、そ の領域は不安定な部分の−っであることが示された。（Ｐ、　Ｋ、ウッド（Ｐ、 　Ｋ、　Ｗｏｏｄ）、　Ｊ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、　２４：４９８−５００　i１９８６）　） ２７ｋｂ１１１的領域の一部を持たない赤痢菌やＩＪＥＣの株は、プローブによ って同定されないし非赤痢菌や非ＥＩＥＣとして誤って認識される。

さらに、２７ｋｂプローブ領域は腸内細菌に普遍的な挿入要素１　（ＩＳＩ）を 含んでいる。（Ｍヴエンカテサンら（Ｍ、　ｔｌｅｎｋａｔｅｓａｎ　ｅｔ　ａ ｌ、　）　、　Ｔ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙB ２６：２６１−２６６　（１９８８）　”）　その領域はまた少なくとも１コピ ーの挿入要素６００　（ＩＳ６０１１：Ｓ、　？ツタニら（Ｓ、　１ｌａｔｓｕ ｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｊ」ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　 １９６：４４５−S５５　（１９８ ７））を含んでいる。このことは、赤痢菌やＥＩＥＣばかりでなく、病原性、非 病原性両方の大腸菌においてもしばしば起きる。（未発表の結果）これらの広く 分布した挿入要素の存在と２７ｋｂ領域からデザインしたプローブの巨大なサイ ズは、高い感度を得るために増幅を必要とする非アイソトープテストでのこれら のプローブの有用性を下げることになる。

対照的に、本発明は、（１）赤痢菌の染色体配列に由来する赤痢菌特異的断片よ り開発され、（２）それぞれ約４０ベースという適当なサイズであるプローブと プローブセットと関連がある。プローブにより同定される、毒性プラスミドの配 列に相当する染色体配列の安定性が上昇することにより、同定の信頼性が上昇す る。さらに、適当なサイズのプローブは、高い感度を得るために増幅を必要とす る非アイソトープテストで有用である。赤痢菌特異的断片とそれらに由来するプ ローブはまた、他の形式においてハイブリダイゼイションプローブとしても有用 である。赤痢菌染色体由来の断片にはまた、侵襲性プラスミドや他のプラスミド 上にエビソームとして存在しているものもある。

具体的に述べると、本発明は、本質的ｌ二次のような配列を持つ核酸から成る核 酸プローブセントを特色としている。

ａ、　ワン不赤痢菌（ＡＴＣＣ２９９３０，指名型株）と２ａ型フレクスナー赤 痢菌（ＡＴＣＣ２９９０３、指名型株）の代表的バクテリアの染色体配列に由来 するがこれらのバクテリアの全染色体配列より小さい配列。

ｂ　４つの既知の赤痢菌のＤＮＡと腸内侵襲性大腸菌（ＥＩＥのにハイブリダイ ズできる配列。

Ｃ赤痢菌でもＥＩＥＣ群でもないバクテリアのＤＮＡに完全に、あるいは弱くし かハイブリダイズできない配列。

このように用いる場合、”染色体配列由来の“配列断片やオリゴヌクレオチドは 、染色体配列に同一か相補的な配列、あるいは染色体配列の変異体に同一か相補 的な配列を持つ、天然あるいは工業的あるいは合成分子である。選択的染色体配 列の変異体に同一か相補的な配列断片やオリゴヌクレオチドは（変異体は染色体 配列と配列が異なる）、選択的染色体配列に同一か相補的な配列断片やオリゴヌ クレオチドの相同物である。このタイプの相同物は、染色体配列に十分似たヌク レオチド配列を持ち、希望された、選択的染色体配列に同一の断片やオリゴヌク レオチドの持つ機能を保持している（染色体配列に同一か相補的な配列断片やオ リゴヌクレオチドがハイブリダイズできる核酸に、同様のハイブリダイゼイショ ン条件下で十分同様にハイブリダイズできる）。相同物はおそらく染色体配列と 異なる配列を持ち、修飾されたヌクレオチドやヌクレオチドアナログを含んでい る（例えばフォスフォロチオエ−）　（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ） 　、メチルフオスフオネイト（ｍｅｔｈｉｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）　）。

相同物は、染色体配列に同一か相補的な配列断片やオリゴヌクレオチドがハイブ リダイズできる核酸に、同様のハイブリダイゼインヨン条件下で同様にハイブリ ダイズできなくてはならない。熟練者の間で、２本鎖ＤＮＡ配列のどちらの１本 鎖でも相補プローブの標的として機能できるということが知られている。得られ たプローブの相補物は、同様のハイブリダイゼイノミン条件下で十分に同様のハ イブリダイゼイションパターンを持つと考えられる。

プローブはおそらく、ＤＮＡか［ｌＮ＾、あるいは修飾されたＤＮＡがＲＮＡで ある。

染色体配列、相同物、前述の物すべての相補物由来の配列を含む核酸断片やオリ ゴヌクレオチドはプローブとして使用できるだろう。例えば、赤痢菌特異的断片 、その一部分、赤痢菌特異的断片由来のオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼ イションプローブとして使用できるだろう。

具体的に述べると、合成核酸プローブ（約４０ヌクレオチド）の２つのプローブ セットのどちらもがワンネ赤痢菌、フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌、志賀赤 痢菌を含む全ての臨床的に重要な血清型赤痢菌を十分同定できる。臨床的に重要 な血清型や分離物とは、ヒトに対して病原性を持つものである。加えて、これら のプローブセットは、大腸菌の腸内侵襲性株の一部あるいは全てを認識し、エス ケリチアフエルグソニ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）を除 き、試されたその他の腸内バクテリアは認識しない。

本発明はさらに、サンプル中の赤痢菌やＥＩＥＣの同定方法と関連がある。例え ば、サンプル中の細胞を溶解し、本発明の核酸プローブとサンプルをプローブが サンプル中の赤痢菌やＥＩＥＣＤＮＡとハイブリダイズするような条件下で接触 させ、結合核酸複合体を形成させ、プローブとサンプル中のＤＮＡで形成された 結合核酸複合体を単離し、サンプル中の赤痢菌やＥＩＥＣの指標として結合核酸 複合体を同定することによりサンプル中に存在する１つ以上の赤痢菌血清型やＥ ＩＥＣを同定することができる。例えば、サンプル中の赤痢菌やＥＩＥＣの存在 を確認するために、臨床的標本（例えば、便）、環境的標本（例えば、水）、食 物標本をそのようなテストに用いることができる。

より具体的に方法を述べると、１つ以上のプローブの組が、２重プローブ溶液ハ イブリダイゼインヨンで用いられる捕獲プローブと同定プローブのベアーとじて 選択される。これらのプローブは、化学合成法や酵素合成法で合成される。それ らは、おそらくもっと大きな分子の一部として合成される。例えば、酵素ターミ ナルチオキシヌクレオチドトラシスフニラーゼ（ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｄｅｏｘｙ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を用いて、捕獲プローブにデ オキシアデノノン３リン酸（ｄＡＴＰ）残基１５０−２００の尾をつけることが できる。同定プローブを、ビオチンーストレブトアヴイジンーアルカリフォスフ ァターゼシステム（ｂｉｏｔｉｎ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ａｌｋａｌｉｎ ｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｓｙｓｔｅｍ）のような増幅／同定システムに組 み込むことができる。捕獲プローブと同定プローブの両方を、サンプルからの競 合核酸のバックグランドの中で標的核酸とハイブリダイズさせることができる。

ハイブリダイズ産物は、晋ｆｆ１１４残基以上のデオキシチミヂン１リン酸の尾 と結合した磁気ビーズによって混合物から捕らえられる。捕らえられたハイブリ ダイズ産物（磁気ビーズに付着したり捕らえられたもの）は、選択された増幅／ 同定システムにより同定される。

赤痢菌特異的なりＮＡ断片の単離 赤痢菌に特異的なゲノム配列は、ビオチン−ストレプトアビジン−アガロース親 和性カラムクロマトグラフィー法を用いたサブトラクトハイプリダイゼーンヨン により単離した。ビオチンーストレブトアビンンーアガロース親和性カラムクロ マトグラフィー法に関してはここに参考文献として挙げるＬａｎｇｅ　ｒ等（Ｌ ａｎｇｅｒ、Ｐ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、７８：６６３３−６６３７　（１９８１））およびＷｅｌｃｈｅｒ等（ Ｗｅｌｃｈｅｒ、Ａ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　、Ａｃ１ｄｓ＝Ｒｅ 互、、１４４１００２７−１００４４　（１９８６））の記した方法に従った。

方法の概略を図１に示す。

ここでは−例として図１に記すように複合的なりＮＡコンペティターが混合した ような、競合ＤＮＡの混合物を用いる。一般に複合的なコンペティターＤＮＡの 混合物は、一種以上の腸内出血性ス腸菌、腸内毒性大腸菌、非病原性の大腸菌か ら調製された（標的ＤＮＡに対して）過剰量のＤＮＡである。既に回収された赤 痢菌特異的な配列や、非特異的な配列を取り除くように人為的に作製した配列を 、この混合物にさらに含有させることもできる。たとえばｐＨ５４０３３のよう な赤ｔＲ１１Ｉ溶国プラスミドの１７ｋｂ領域を含んだプラスミドや、クラス■ 反復ＤＮＡ、Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡを混ぜることもできる。

ここで特に用いた複合コンパティターＤＮＡ混合物は、腸内出血性大腸菌菌株で あるｌＧ３０４０、腸内毒性大腸菌菌株であるｌＧ３０６０、非病原性の大腸菌 （ＹＭＣ）のそれぞれから調製したもので、質量にして（標的ＤＮＡに比べて） ６倍の過剰量のＤＮＡである。この混合物は、さらに質量にして標的ＤＮＡと同 量の以下に挙げる諸成分を含んでいる。赤痢菌溶菌プラスミド（プラスミドｐＨ ３４０３３、Ｂｏｉｌｅａｕ、Ｃ，Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、２０　（５）：９５９−９６１　（１９８４））の１７ｋｂ領域ヲ クローン化してもつ１）ＢＲ３２２，Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡ、およびク ラス■反復（Ｃ１ａｓｓ　ｎ［Ｒ−ＩＧ９００）をｐＢＲ３２２にクローン化し たもの（１，３ｋｂのクラス■反復配列と隣接する染色体ＤＮＡをｐＢＲ３２２ にクローン化したもの。挿入された全長は３．５ｋｂ）。この全混合物をニック トランスレーション法を用いて、ビオチン−１１−ｄＵＴＰでラベルした。特異 的な配列を同定するための“標的ＤＮＡ”は、単一の赤＠菌種からＤＮＡを調製 し、制限酵素５ａｕ３Ａにより消化した後、末端をＤＮＡポリメラーゼ■による 反応で平滑化する際にｓｚｐでラベルすることにより単離した。

競合するＤＮＡが、赤痢菌ＤＮＡに比して２０−４０倍のモル量過剰になるよう 二種のＤＮＡ試料を混合した。混合物を変性し、溶液のまま緩い条件下で一晩ハ イブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション緩衝液の組成は０．−７５ Ｍ　ＮａＣ＋、５０ｍＭ　ＮａＰＯ，，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％　ＳＤＳ 。

４０％ホルムアミドである。この後ハイブリダイゼーションした混合物をストレ プトアビジン−アガロースカラムに通した。赤＠菌ＤＮＡ配列の中でコンペティ ターＤＮＡに対して十分な相補性を持ち、ここで用いた条件下でハイブリッドを 形成したものは、コンペティターＤＮＡに取りこまれたビオチンのためストレプ トアビジン−アガロース親和性カラムに吸着される。これに対し、こうした条件 下でハイブリッドを形成できなかった配列はカラムを素通りした核酸の両分に濃 縮される。この後者の配列には赤痢菌特異的な配列が含まれることになる。　（ 既に３２ｐでラベルされた）赤痢菌特異的な配列が濃縮されたＤＮＡ溶液の少量 をプローブに用いて、赤痢菌および大腸菌の特定のＤＮＡ　（それぞれ０．１ｎ ｇ量のＤＮＡを３μｍとしてニトロセルロース上にスポットしである）の検索を 行った。

ハイブリダイゼーションの条件は以下に述べる実施例■のニックトランスレーシ ョンした断片と同様である。大腸菌のコンペティターＤＮＡとクロスハイブリダ イゼーションが見られたことから、赤痢菌の“標的”ＤＮＡのさらなる濃縮が必 要であることがわかった。典型的な場合、クロスハイブリダイゼーションを除（ ためには、ビオチン化された大腸菌コンペティターＤＮＡに対して競合ハイブリ ダイゼーシヨンを４回行わなければならなかった。こうした操作の際には競合ハ イブリダイゼーションと親和性吸着のサイクルを繰り返し、前のサイクルでカラ ムを通過してきた赤痢菌ＤＮＡを次のサイクルの初期材料として用いた。この方 法によって、ラベルされた赤痢菌の標的ＤＮＡが、各サイクル毎に徐々に赤痢菌 特異的な配列として濃縮された。

次に赤痢菌特異的配列が濃縮された核酸をプローブに用いて、サブトラクトハイ ブリダイゼーションの“標的ＤＮＡ”として用いたのと同じ赤痢菌菌株の５ａｕ ３Ａライブラリーを検索した。用いたライブラリーはｐＵｃ１８をプラスミドベ クターとして構築したものである。ポジティブなりローンから挿入（断片）をベ クターと分離回収し、ニックトランスレーションによりＨＰでラベルした後、こ のプローブに関して、実施例Ｉおよび■に記すように包括性または排他性をもつ 生物種の微少量サイトドツトパネルを検索した。あるプローブを用いた特定のハ イブリダイゼーションの条件下で、ある生物種のＤＮＡがこれとハイブリダイズ するならば、この生物種に対するプローブの包括性が示されたことになる。一方 性の生物種のＤＮＡと同条件下でハイブリダイズしなければ（あるいはハイブリ ダイゼーションがかろうじて検出できるような場合には）、この生物種に対する プローブの排他性が示されたことになる。

多（の場合、包括性のある生物種に対するハイブリダイゼーションはコンペティ ターまたは排他性のある生物種に対するハイブリダイゼーションよりもはるかに 強い。必要な場合にはサブクローニングを行い、コンペティターとクロスハイブ リダイゼーションする配列を除いた。除いた後でニックトランスレーションによ り３２ｐで断片をラベルし、これをプローブとして包括性または排他性に関して 生物種の細胞トンドパネルを完全に検索した。

包括性をもつ生物種のパネルは、赤痢菌としての既知のあらゆる血清型を示す細 菌、および赤痢菌と同様の病原性をもつ腸内浸潤性の大腸菌により構成される。

これらの生物種は表２から表６に挙げた。排他性をもつ生物種のパネルは非病原 性の大腸菌、腸内毒性大ａｍ、腸内病原性大腸菌、腸内出血性大腸菌、および他 の大腸菌種とグラム陰性の腸内細菌から構成される。排他性をもつ生物種を表６ と表７８／７ｂ１．：挙げた。

表中においては、実験に用いた条件下でシグナルがなかったものを（−）、かろ うじて検出できたものを（＋／−）または（−／＋）　、弱いが再現性のあるシ グナルおよび容易に検出できるシグナルを（÷）、適度のシグナルを（＋＋）、 強いシグナルを（＋＋ｉ）、ポジティブコントロール（ＤＮＡ断片の単離に用い た生物種のＤＮＡ、または用いているプローブと同一の既知の配列）に匹敵する ノブナルを示す。サブトラクトハイブリダイゼーションにより同定されたゲノム （染色体）ＤＮＡ断片、および以上に記載した精製の実験操作を赤痢菌特異的Ｄ Ｎ、へ断片と呼ぶものとする。

１　赤痢菌特異的ＤＮＡ断片ＮＴ１９−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）お、Ｊ ＪＪＮＴ１８　１ａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）はフレクスナー赤痢菌（Ｓｂ ｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（ＡＴＣＣ２９９０３）ゲノムクローンライ ブラリーから単離された。単離に際しては３２ｐでラベルされたフレクスナー赤 痢菌（ＡＴＣＣ２２９０３）の“標的”ＤＮＡから、上記のサブトラクトハイブ リダイゼーション段階に記した“複合コンペテノターＤＮＡ混合物”を用いて同 定した赤痢菌特異的配列をプローブとして、ライブラリーを検索した。

２　赤痢菌特異的Ｄ　Ｎ　Ａ断片ＮＴ６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を参照）、Ｎ Ｔｌｌ２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）、ＮＴ１４（ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：４） 、ＮＴ１５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）はワンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　 ｓ。

ｎｎｅ　１）（ＡＴＣＣ２９９３０）ゲノムクローンライブラリーから単離され た。単離に際しては、単一の非病原性大腸菌（ＭＭＣ）のＤＮＡと１ａｇのｐＢ Ｒ３２２ベクターＤＮＡをサブトラクトハイブリダイゼーションのコンペティタ ーＤＮＡとし、３２Ｐでラベルされたワンネ赤痢菌（ＡＴＣＣ２２９３０）の“ 標的”ＤＮＡから同定した赤痢菌特異的な配列をプローブにして、ライブラリー を検索した。このサブトラクトハイブリダイゼーションにおいてはストレプトア ビジン−アガロースではなくアジピン−アガロースを親和性カラムに用いた。

包含性のある生物種および排他性のある生物種に対する、これらの赤痢菌特異的 配列のハイブリダイゼーションの結果は表２−７に記した。さらにこれまでに発 表されているデータ（Ｇ、Ｂｒａｕｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ （ｏｍｐＡ）の配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）と大腸菌のｏｍｐＡの配列（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）の比較を行い、一連のｏｍｐＡプローブを開発した 。これらの二つのｏｍｐＡ配列間でもっとも異なると思われる配列領域をテスト プローブの開発に際して選んだ。これらの配列を合成し、以上に述べたのと同′ 様のハイブリダイゼーション解析によりアッセイした。

で、包含性を持つ生物種に対してきわめて著しい特異性を示したものである。こ れらの断片の塩基配列を決定し、吸着プローブおよび検出プローブとして有用な オリゴヌクレオチドプローブをこの配列から設計した。ｏｍｐＡの配列の断片に ついても吸着および検出用のオリゴヌクレオチドプローブを、配列の比較解析に より設計した。オリゴヌクレオチドを合成の後、３：Ｐでラベルし、実施例■に 記載した細胞ドツトハイブリダイゼーション解析によりテストを行い、これらの オリゴヌクレオチドが望みｗ！ＩＩ′）の包含性、排他性の振る舞い、特性を示 すかどうかを確かめた。いくつかについてはこの時点で、さらに排他性のある他 の生物種のパネルを用いてテストした（表８）。このパネルは、グラム陽性、グ ラム陰性の微生物のＤＮＡ　４μｇをドツトプロットしたもので、微生物として は大便中に見出される代表的な好気性細菌、嫌気性細菌を用いた。ＤＮＡの調製 に際しては、グラスビーズを用いて微生物の細胞壁を物理的に破壊する方法に従 った。各ＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に３μｍの溶液としてスポット した後、ＤＮＡを変性、中和し、実施例■に記載した方法で固定し、サイトドツ トパネルとした。

プローブおよび包含性および排他性に関するハイブリダイゼーションの振る舞い ２μｍ オリゴヌクレオチドプローブは、親和性クロマトグラフィーにより同定された赤 痢菌特異的配列に由来するもの、およびｏｍｐＡ配列に由来するものである。

各オリゴヌクレオチドプローブおよびこれらが由来する赤痢菌特異的ＤＮＡ配列 は表９に記載した。各クローンおよびサブクローンに関する包含性および排他性 を検索する際のハイブリダイゼーションの振る舞い、これらの配列から設計した オリゴヌクレオチドについては以下に記載する。

ＮＴ５断片およびプローブ１５００．１５０１．１９１１ＮＴ６（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：１参照）は１２４塩基対の５ａｕ３Ａ赤痢菌特異的断片である。この配 列はワンネ赤痢Ｅｌ（ＳｈｊｇＪ　Ｉａ　５ｏｎｎｅｉ）（ＡＴＣＣ２９９３０ ）染色体ＤＮＡ上で６回反復する。また他の赤痢菌菌株のプラスミド上に１〜２ コピー見られる。全断片の塩基配列を決定した（図２）。図２の最初の１２４塩 基対がＮ７６由来の配列である（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニー１参照）。ＮＴ−６配 列の３″末端の５ａｕ３Ａ部位を示した。一連の図において不明確な塩基および 配列を指示する際にはＩＵＰＡＣ法に従った。

確定した塩基：　Ａ、ｃ、　ｃｒ、　Ｔ　（またはＵ）二つの可能性のある塩基 ＋Ｍ（ＡまたはＣ）Ｒ（ＡまたはＧ） Ｗ（ＡまたはＴ） Ｓ（ＣまたはＧ） Ｙ（ＣまたはＴ） Ｋ（ＧまたはＴ） 三つの可能性のある塩基：Ｂ（Ｃ，ＧまたはＴ）Ｄ　（Ａ、　ＧまたはＴ） Ｈ（Ａ、　ＣまたはＴ） Ｖ（Ａ、ＣまたはＧ） 四つの可能性のある塩基：Ｎ　（Ａ、Ｃ，ＧまたはＴ）ここで塩基配列決定のゲ ル上で弱いバンドが検出され、他にバンドが無い場合には、この塩基を不明確な 塩基を示す文字で記した。バンドの圧縮によりヌクレオチドの順序が不明瞭な領 域は丸括弧で括フた。

ＮＴ６に由来する、各３５塩基対長の二種のオリゴヌクレオチド（１５００゜Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４お、Ｊ、び１５０１．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）を設 計し、捕獲および検出用のプローブとして用いた（表９）。第三のプローブとし て４０塩基対のもの（１９１１，ＳＥＱ　ＴＤ　ＮＯ：１６）をＮＴ６およびＮ Ｔ６断片の５ａｕ３Ａ部位に隣接する余分な配列（３８塩基対；ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：１参照）から設計した。この余分な配列は、１２４塩基対のＮＴ６断片を プローブとじてンンネ赤痢菌のライブラリーを検索単離したクローンから得られ たものである。ＮＴ６の配列中のプライマーを用いて塩基配列の決定を行った後 、オリゴヌクレオチド１９１１を設計しテストした。１９１１のハイブリダイゼ ーションの特性はＮＴ６と同一であったことから、この配列は反復単位の一部で あると考えられた。　゛− 個々のオリゴヌクレオチドを用いて、包括性または排他性を持つ生物種に関して ハイブリダイゼーションを行った。これら三種のプローブが全て同一の／％イブ リダイゼーションの特性を示した場合には、結果を別々に記載しなかった。個々 のオリゴヌクレオチドは、それが由来する元のＤＮＡ断片と同様に、テストに用 いた全てのワンネ赤痢菌菌株に対してハイブリダイズしく＋をハイブリダイゼー シコンの最低の限界を示すものとして用いた）、古賀赤痢菌（Ｓ、ｄｙｓｅｎｔ ｒｉａｅ）、ボイド赤痢菌（Ｓ、ｂｏｙｄ　ｉ　ｉ）　、フレクスナー赤痢ＩＩ （Ｓ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の血清型の多くとハイブリダイズした。ハイブリダイ ズしたものの中にはフレクスナー赤痢菌のタイプ６も含まれていた（表２から５ 、まとめたのが表１０）。またＮＴ６に由来する個々のオリゴヌクレオチドは、 全ての膓内浸潤性大ａｍとハイブリダイズしたが、他のクラスの病原性大腸菌、 非病原性大腸菌、大便中に一般に見られる他の細菌とはハイブリダイズしなかっ た（表６ＮＴＩＩ−２（ＳＥＱ　ＪＤ　ＮＯ：２）は、本来３．５塩基対の長さ の５ａｕ３Ａ断片（ＮＴ１１）のうちのサブクローン化した７９６塩基対のＨｈ ａＩ断片である。ＮＴｌｌ−２断片については塩基配列を決定しである（図３； ５ＥＱＩＤ　ＮＯ：２）。この断片の両末端から捕獲および検出用のプローブの 対を設計し、二組のオリゴヌクレオチドプローブとした。プローブ１６８２　（ ＳＥＱＩＤ　Ｎ○＝１７）とプローブ１６８３（ＳＥＱ　Ｉ［ＮＯ：１８）は４ １ヌクレオチド長である。プローブ１７０８　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１９） とプローブ１７０９（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２０）はそれぞれ３５ヌクレオチド 長、３６ヌクレオチド長である。捕獲／検出プローブとして用いる際には、各捕 獲プローブの３°末端に余分な３ヌクレオチド（ＴＡＴ）を付けて合成し、ター ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを転移酵素して作用させる際 に有効なテールとしてやることもできる。表２から５とこれをまとめた表１０は 、これらの二組のオリゴヌクレオチドが異なるハイブリダイゼーションの特性を 持つことを示している。４種のプローブを同時に用いた際のハイブリダイゼーシ ョンの累加的な特性は、元の断片ＮＴｌｌ−２と同様であり、ワンネ赤痢菌（Ｓ 、５ｏｎｎｅｉ）の全ての菌株に対してハイブリダイズし、古賀赤痢菌（Ｓ、ｄ ｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、ボイド赤痢菌（Ｓ、ｂｏｙｄ　ｉ　ｉ）　、フレクス ナー赤痢菌（Ｓ。

ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の菌株の中にもハイブリダイズするものがある。しかし捕獲 ／検出プローブの対として用いる際（たとえば１６８２と１６８３を組み合わせ る、あるいは１７０８と１７０９を組み合わせる場合）には、各プローブの組の 一方が菌株（たとえば志賀赤＠ＩＩ（Ｓ、ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）のタイプ９ および１０、ボイド赤痢菌（Ｓ、ｂｏｙｄ　ｉ　ｉ）のタイプ１７）とハイブリ ダイズしないため、検出できない血清型が存在する。４種の腸内浸潤性大腸菌の うち一種は１７０８／１７０９で強く検出でき、１６８２／１６８３で弱く検出 可能である。二種の病原性大腸菌菌株が１７０８／１７０９により検出できるが 、１６８２／１６８３を用いた場合これらの一方しか検出されない。これらの病 原性大腸菌菌株以外についての結果を見ると、これらのオリゴヌクレオチドは他 の非病原性の大腸菌や大便中に一般に見られる他の細菌とはクロスハイブリダイ ズしない（表６および７ａ）。

ＮＴ１４．ＮＴ１５断片とプローブ４３７．１８６４ＮＴ１４（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：４）とＮＴ１５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）はそれぞれおよそ８００塩 基対および６００塩基対の５ａｕ３Ａ断片である。これら二つの断片は塩基配列 が決定されており、１．３ｋｂにわたる高頻度反復単位の一部である。ワンネ赤 痢菌（Ｓ、５ｏｎｎｅ　１）（ＡＴＣＣ２９９３０）およびフレクスナー赤痢菌 （Ｓ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（ＡＴＣＣ２９９０３）のそれぞれの代表的な反復配 列一つずつと、大腸菌（ＩＧ９００）の二個の反復配列をクローン化し、塩基配 列を決定した（図４＋Ｓ、５ｏｎｎｅｉ反復配列、ＳＥＱ　ｆＤ　Ｎｏ・３およ びＮｏ＝４、大腸菌反復配列１．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５．大腸菌反復配列２． ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６およびＮＯニア；Ｓ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ反復配列、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：８およびＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：９）。反復配列は高度に保存さ れ、転移因子の特徴をもつ。こうした反復配列は赤ＩＲ菌の染色体および溶菌プ ラスミド中に２０コピ一以上存在する。また大腸菌のコンパティター中にも１か ら３コピー存在する場合があるが、他の細菌種には存在しない。

図４に示した大腸菌およびワンネ赤痢菌の配列にはわずかな違いしかない。そこ で１７塩基のオリゴヌクレオチドプローブ（プローブ１８６４　ＳＥＱ　ＩＮＯ ：　２２）を設計する際には、プローブの両末端から８塩基の位置にミスマツチ が一つ存在するようにした（表９）。このプローブはテストに用いた赤痢菌およ びＥ■ＥＣの大部分とハイブリダイズしたが、コンペテイター細菌とはクロスハ イブリダイゼーションしなかった（表２−８およびこれをまとめた表１０）。

１８６４を特異的な捕獲プローブとして用いる際、対にして用いる検出プローブ としては、１８６４のいずれかの一端に位置するクラス■反復配列中の配列を用 いることができる。このような−例としてプローブ４３７（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

：２１）（４９塩基）の相補的な領域を用い、この配列に関する包括性、排他性 を表２から８に記した。このプローブは、赤痢菌についてはボイド赤痢菌（Ｓ。

ｂｏｙｄ　ｉ　ｉ）の血清型１３を除くすべての血清型と強くハイブリダイズす る。

プローブ４３７は、非病原性もしくは病原性の大腸菌菌株の多くとハイブリダイ ズするが、テストに用いた池の腸内細菌とはハイブリダイズしない。大腸菌のい くつかでハイブリダイゼーションが検出されたのは、大腸菌属がクラス■反復配 列を低コピー数しか持たないのに対し、赤痢菌属が高コピー数の反復配列を持つ ことによる。

プローブ４３７には、ソンネ赤痢菌の配列の塩基決定の間違いのため、二個の余 分な塩基を付は加わっている（ＧとＴ）が、この余分な塩基のおがげで、赤痢菌 菌株に比して大腸菌菌株が与えるシグナルの検出を低く抑えることができること がわかった。プローブ４３７はソンネ赤痢菌またはフレクスナー赤＠菌といった ポジティブコントロールに対しても、期待されるほどにはハイブリダイズしない ので、この二個のヌクレオチドはソンネ赤痢菌の配列中には存在しないと考えら れる。ここで見られた結果は、大腸菌と赤痢菌属の間でのコピー数の違いに関係 しているのかもしれない。

プローブ１８６４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌＯ）は、テストした古賀赤府菌（Ｓ 、ｄｙｓｅｎｔｒｉａｅ）菌株では血清型１　（ｌＧ８２６）一種を除く全てと ハイブリダイズする。しかしこの血清型１に関しては血清学的にはよくわがって いない。

ＮＴ１８−１ａ断片とプローブ１７１２．１７１３ＮＴ１８−１ａ（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：１０）は元のＳ　ａ　ｕ　３　、Ａ断片であるＮＴ１８から二段階を 経てサブクローン化された。ＮＴ１８　（１５００塩基対）をＰｓｔＩ／５ａｃ ｌで二重に消化した結果、ＮＴ１８−１断片（１２５０塩基対）が生じた。これ をさらにＨａ　ｅＩｆｆで制限酵素処理し、ＮＴ１８−１ａ　（６３０塩基対） か得られた。低分子量のマルチコピープラスミドは侵入性の２１５ｋｂｐのプラ スミドとは明確に区別されるが、ＮＴ１８断片に類似の配列は、こうしたマルチ コピープラスミド上に見出されることがわかった。ＮＴ１８−４ａの配列を図５ に示した（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）。この配列から捕獲／検出プローブとし て適当な、ともに３７塩基対長のオリゴヌクレオチドプローブ１７１２（ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ・２３）と１７１３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）を設計した（図 ５９表９）。このオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの特性 （検出される菌株）は、フレクスナー赤痢菌（Ｓ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ）の一種を 除いて元の赤痢菌特異的ＤＮＡ断片ＮＴ１８−１ａと同一であった（表２−５． ７ｂ）ハイブリダイズしなかった菌株（ｌＧ７１１）はオリゴヌクレオチドプロ ーブ１７１３では検出できたが、１７１２では検出できなかった。これら二つの プローブを液体ハイブリダイゼーションアッセイの際の捕獲／検出プローブとし て用いるならば、この菌種は検出できないということになる。実験に用いた条件 下ではこのプローブは、６／８のタイプｌの古賀赤痢１ｉ（Ｓ、ｄｙｓｅｎｔｉ ａｅ）とハイブリダイズした。またフレクスナー赤痢薗（Ｓ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ ）については、３種の型の６Ｉ１株すなわち上で述べたｌＧ７１１、およびｌＧ ３７２、ｌＧ７４１、ｌＧ７０９を除けば全ての菌株とハイブリダイズした（表 ２から５．まとめたのが表１０）。このプローブは腸内浸潤性大腸菌は検出しな かったが、病原性大腸菌一種とクロスハイブリダイズした。非病原性大腸菌およ び大便中に一般に見られる他の細菌とはクロスハイブリダイズしなかった（俵６ ＮＴ１９−２　（３８ｇ塩基対：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）は、元の１０７０ 塩基対長の５ａｕ３Ａ断片のＲｓａＩ断片をサブクローン化したものである。Ｎ Ｔ１９−２の塩基配列を決定しく図６：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）、各３５塩 基長のオリゴヌクレオチドプローブ１６８４　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　２５） と１６８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）を設計した（図９）。これらのプロー ブは捕獲／検出プローブに適当である。個々のオリゴヌクレオチドプローブによ るハイブリダイゼーションで検出される菌株の種属、範囲は、元の断片と同一で あった。ハイブリダイゼーションが観察されたのは、ボイド赤痢ｍ　（Ｓ、ｂｏ ｙｄ　ｉｉ）の数種、ソンネ赤痢菌（Ｓ、５ｏｎｎｅｊ）の数種、タイプ６を除 くフレクスナー赤痢菌（Ｓ、ｆｌｅｘｎｅｒｉ）全種であった０表２−５、まと めの表１０）。このプローブは腸内浸潤性大腸９５Ｎのうち一種とノ）イブリダ イズしたが、他の病原性大腸菌や非病原性大腸菌、大便中に一般に見られる他の 細菌とはクロスハイブリダイズしなかった（表６から８）。

０ｆｆｉｐ＾断片とプローブ１７０６及び１７０７オリゴヌクレオチド１７０６ 　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）及び１７０７　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２８） を、公表済Ａ群赤痢菌の外膜タンパク質遺伝子（ｏｍｐＡ）の塩基配列をもとに デザインした。

第７図はＡ群赤痢菌ｏｍｐＡ遺伝子配列の核酸にして８９３から１０７６番目ま で（ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ら（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１０（７） ：　２３６７−２３７８（１９８２）：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１Q） の番号付けに従うを示している。この領域には、大腸菌とＡ群赤痢菌ｏｍｐ＾コ ード配列の間で意味のある相違が存在している。大腸菌ａｍｐ人遺伝子の相当す る領域の配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１３）を比較対象として、また、プローブ １７０６　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）及び１７０７　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：２８）の　位置を、第７図に示しである。

オリゴヌクレオチドは両方とも３５塩基の長さである（表９）。プローブ１７０ ６はは大腸菌とＡ群赤痢菌の配列では７箇所の違いがある。プローブ１７０７を デザインするちととなった領域は、大腸菌の場合よりも１５塩基短い。この他に も、プローブ部位には大腸菌とＡ群赤痢菌の間には数多くの違いがある。これら ０プローブはＡ群赤痢菌１型と２塁及び６群赤痢菌の多くの血清型にハイブリダ イズする（表２−５、表１０にまとめ）。プローブ１７０７を特異的な捕獲プロ ーブ、１７０６を液体ハイブリダイゼーション中での検出プローブとして用いる 場合、腸内大腸菌、その他の病原性、非病原性大腸菌、及び便に存在するそのほ かの細菌（例外：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）ではハイ ブリダイゼーションは起こらないと予測される（表６−８）。

プローブセットＩ 望ましい包括／排除パターンを、プローブの様々な組み合わせを用いることによ って得ることができる。一つのありうる方法は、プローブのペアを複数集めてプ ローブセットを作ることである。例えば、断片ＮＴ６　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： １）　、ＮＴ１９−２　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）及びｏ叩＾遺伝子（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１２）からデザインした捕獲／検出オリゴヌクレオチドを、プ ローブセットあるいは組み合わせとして、実際に臨床的に重要な赤痢菌血清型金 てを検出するために用いることが可能である。

一つのありうるプローブセットは、３種の捕獲／検出プローブベア（プローブベ ア１６８４／１６８５．１７０７／１７０６．及びプローブ１５００／１９１１ ／１５０１から選んだペア）からなるものである。この十分に包括的なプローブ セットは、Ａ群赤痢菌１０型及び０群赤痢菌１３型を除（全ての赤痢菌血清型を 検出する（＋１個はハイブリダイゼーションの最小限のシグナルとして用いる） 。さらに、このプローブセットは、用いた条件下では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉを除く検査した競合菌のいずれにもクロスハイブリダイ ズしなかった。

これらの条件下でプローブセットＩで検出されない赤痢菌血清型２種は、疾病コ ントロールセンター（ｔｈｅ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｎｔ ｒｏｌ）の記録の示すところによるとアメリカ合衆国では希にしか朧離されない 。例えば、１９７６から１９８７年までの疾病コントロールセンターによる報告 では、赤痢菌血清型１６７、９１５件中、Ａ群赤痢菌１０型として確認されたの は２件、０群赤痢菌１３型としては３件のみであった。

捕獲／検出アッセイ方式では、捕獲／検出ベアの中でより特異的なオリゴヌクレ オチドが捕獲プローブとして好ましい。１６８４／１６８５プローブセツトの場 合、どちらのオリゴヌクレオチドを捕獲プローブとしても同等のハイブリダイゼ ーション結果を得ることができる。一方、１７０７／１７０６プローブセツトの 場合は、オリゴヌクレオチド１７０７の方が、競合菌にクロスハイブリしないと いう理由で、捕獲プローブとしてより好ましい。（プローブ１７ｏ６は、ある種 の競合菌とでは（＋／−）ハイフリダイゼーションシグナルを与え、Ｅ、　ｂｌ ａｔｔａｅ単離菌とは強単離グナルを与える（表６．７ｂ））。

１５００／１９１１／１５０１オリゴヌクレオチドプローブの場合、１５００あ るいは１９１１のいずれかを捕獲プローブとして用いるのが最良である。プロー ブ１５０１はある種の競合菌とでは（＋／−）ハイブリダイゼーションシグナル を持つが（表８）、検出プローブとしては難点なく用いることが可能である。

プローブセット■ もう一つの選択可能なプローブセットは、クラスエリピート（断片１４及び１５ ；それぞれＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３である）とｏｍ ｐＡ遺伝子（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）を組み合わせたものである。この十分 に包括的なプローブセット１７０７／１７０６及び１．８６４／４３７−相補は ０群赤痢菌１３型を除く全ての赤痢菌を検出し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅ ｒｇｕｓｏｎｉｉに弱くクロスハイブリダイズする。

捕獲／検出ベア１８６４／４３７−相補の場合、オリゴヌクレオチド１８６４を 捕獲プローブとして用いることが、ベアの中でそちらがより特異的なプローブで あるので、最良である。１８６４が作り出された配列の左あるいは右方向（５゛ 　あるいは３゛方向の同じ側の鎖）の配列よりデザインされたオリゴヌクレオチ ドプローブも、検出プローブとして用いることができる。プローブ４３７の相補 鎖はこのような例の一つであり、実質的にはプローブ４３７のハイブリダイゼー ションパターンを維持していると予想される。

プローブ組み合わせ汀を用いる場合には、６種の代わりに４種のオリゴヌクレオ チドしか必要でないが、望ましい包括性及び排除性（この場合は、十分に包括的 である）を得る。さらに、プローブ１８６４の標的は多コピー（２０−３０コピ ー）で存在すし、このことによって増加した感度を得ることができる。しかしな がら、プローブ１８６４の特異性は、繰り返し要素（クラスエリピート）を持つ 赤ｊＦｉＪ菌と大腸菌を区別するためのただ１つの不一致に依存しているため、 ハイブリダイゼーション条件を注意深く制御することが、プローブセット■の排 除性を維持するために必要である。

表１２は、検出のカット−オフ（除外度）を（＋＋）　／＼イブリダイゼーンヨ ンシグナルとした捕獲／検出方式を用いた場合に、ブローブセッｌ−Ｉ及びプロ ーブセット■で検出されると予測される単離体の数を表示しである。プローブセ ット■及びＨに対する捕獲／検出方式での結果は、（＋）シグナルを検出のカッ ト−オフ（除外度）として用いた場合には同じであると予想される。

プローブセットあるいは組み合わせを赤痢菌特異的断片から作り出すことが可能 である。これら”赤痢菌特異的断片の配列由来”断片あるいはオリゴヌクレオチ ド（プローブ）は赤痢菌特異的断片の配列の一部と（従って、赤痢菌染色体と） 同一または相補的である。プローブの一部しかもとの赤痢菌特異的断片の配列と 同一でないことも、場合によって有り得る。赤痢菌特異的断片の配列と同一ある いは相補的であるプローブの部分は、プローブ中で連続していないことも有り得 る。

好ましいプローブは包括的な性質を保持し、要望があれば排除性を保持するであ ろう。赤痢菌特異的断片由来で、選択した赤痢菌特異的断片の′包括的な性質を 十分に保持している”プローブは、もとの断片がハイブリダイズする（分類され た）血清型の９０％以上の各型最低１つの単離体に、それと同じ条件下で、ハイ ブリダイズする。表１に示した３５ある血清型の中の一つで、もとの赤痢菌特異 的断片がハイブリダイズする単離体がただ一つでもある場合には、その断片はそ の血清型にハイブリダイズするということする。選択した赤痢菌特異的断片の” 包括的な性質を適度に保持している′プローブは、もとの断片がハイブリダイズ する血清型の８３％以上９０％未満の各型最低１つの単離体に、それと同じ条件 下で、ハイブリダイズする。選択した赤痢菌特異的断片の”包括的な性質を一部 保持している”プローブは、もとの断片がハイブリダイズする血清型のｔ７０％ 以上８３％未満の各型最低１つの単離体に、それと同じ条件下で、ハイブリダイ 排除性は排除生物２セツトを用いて決定した。スクリーンした排除生物は、表６ ．７Ａ及び７Ｂに挙げ、また本明細書で非ＥＴＥＣＩｉｌ内細菌排除生物と定義 した１５２の非ＥＴＥＣ株を含んでいた。さらに、表８に挙げた９１の株は、本 明細書で便でよ（発見される排除生物として定義した排除生物の第２番目のセッ トから成っている。

赤痢菌特異的断片由来の、与えられた排除生物（例えば非ＥＩＥＣ腸内細菌）の セットに対して″改良された″排除的な性質を持つプローブは、ドツトプロット 方式で排除生物全てをスクリーンし、そのプローブのもとの断片が検出（シグナ ル（＋）以上でハイブリダイズする）する排除生物よりも少ない数のそのセット の排除生物を、同じハイブリダイゼーション条件下で検出するものである。赤痢 菌特異的断片由来の、与えられた排除生物のセットに対して排除的な性質を”十 分に保持しているプローブは、ドツトプロット方式で排除生物の９０％以上をス クリーンし、同じハイブリダイゼーション条件下で、十分に同等あるいは同一の 排除的な性質を持つものである。特に、由来する断片が検出しない排除生物セン トの中の１３株のみを検出すると予測され、もとの断片によって検出される排除 生物を検出するあるいは検出しないと思われるプローブを、その断片の排除的な 性質を”十分に保持している”ものと定義する。与えられた排除生物セット１０ ０％に対して排除性を示すが、もとの断片と同じ数あるいはそれ以上（ただしさ らに１３株以下）の排除生物の排除様を検出するものは、この後者の範躊に入る 。

さらに、生物１００％の排除性を示さないと決定されたプローブが、”改良され た”排除的性質を持つことが示される可能性がある。例えば、プローブ１６８４ （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）と１６８５　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）は、 ４種の非ＥＩＥＣ膓内細菌に対して排除性を持だなかりたが、ＮＴ１９−２　（ ＳＥＱ　ＩＤ〜０：１１）によって検出された２株（表６）は検出しない。これ らのプローブが検査していない株を３あるいは４株検出しなければ、その場合そ れらは改良された排除的性質を持つことになるが、これらは今のところＮＴ１　 ’ｌの排除性を十分に保持しているものとしで分類されている。従つて、２つの 分類法は相互に排他的なものではない。赤痢菌特異的断片出来の断片及びオリゴ ヌクレオチドの相同体で、赤痢菌特異的断片由来の断片及びオリゴヌクレオチド と同様の血清型に、同じハイブリダイゼーション条件下で実質的にハイブリダイ ズするものも用いることができる。赤痢菌特異的断片白来の配列断片及びオリゴ ヌクレオチドの相同体は赤痢菌特異的断片の配列の変異型と全長あるいは一部が 同一または相補的であると予想される。

例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、通常約１０塩基から５０塩基までの長 さのもので、赤痢菌特異的断片の一部と同一の配列からなるものをデザインする ことが可能である。しかし、オリゴヌクレオチドプローブは５０塩基より長いこ とも有り得る。全長断片の一部と同一の配列からなるより大きい断片は、例えば 、単離したクローンの制限酵素による消化、エクソヌクレアーゼ消化、選択した プライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応あるいは他の適当な方法を用いることに よって調製できる。

赤痢菌特異的断片、あるいはその相補体や相同体に由来するその他のプローブは 、ドツトプロット方式（実施例中のサイト−ドツトあるいはＤＮＡドツトプロッ ト方式など）を用いてスクリーン可能である。これら追加の断片やオリゴヌクレ オチドプローブは、単独、様々なプローブのベアや組み合わせ、または表９より 選んだプローブ、プローブベアや組み合わせの形で用いることができる。また、 表９に示したプローブのかわりとして用いることもできる。例えば、赤痢菌特異 的断片ＮＴｌｌ−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）をプローブ１６８３　（ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮＯ：１８）の代わりにプローブ１６８２　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋１ ７）と共に用いることができた。捕獲／検出方式に用いるためには、プローブを プローブ１６８２と同じ側の赤痢菌特異的断片の鎖に由来するように予定した。

例として、ＮＴｌｌ−２の包括的パターンを十分に保持するプローブを選択でき た。さらに、本発明のプローブは他のプローブと組み合わせて赤痢菌、腸内大腸 菌またはそのほかの生物（例：サルモネラ、ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒなど） 用に用いることができる。

推薦したプローブセットに対するシグナルが、プローブを追加することで増強す る可能性が十分認識されると予測される。追加するプローブは、表９に表示した プローブ、開示されている大きい赤痢菌特異的断片由来のオリゴヌクレオチド、 前述のいずれかの相同体や相補体、あるいはその他の適したプローブから選択す ることが可能である。プローブの中ｌ二は、排除生物とハイブリダイズするため に、捕獲／検出プローブ方式において検出プローブとしてのほうが好まれるもの もあるが、各プローブは捕獲／検出プローブのどちらとしても使用できる。

を得ることができる。さらに、包括及び排除の性質は、ハイブリダイゼーション の条件及び／または　カント−オフ（除外度）としてハイブリダイゼーションの 特異的なレベルをとることによって調節することができる。例えば、表１０にお いて、（＋）シグナルは弱いが再現性のある、容易に検出できるシグナルである が、それをドツトプロット方式（サイト−ドツトあるいはＤＮＡドツト方式）の 包括性あるいは検出のカット−オフ（除外度）として設定している。

表１１では、（十＋）カット−オフ（除外度）を用いている。表１１では、プロ ーブＮＴ６、ＮＴｌｌ−２、ＮＴ１８−１ａ、ＮＴ１９−２が（十＋）以上のソ ゲナルを示してハイブリダイズした各血清型の単離数あるいはあるいは分類され ていない単離体の単離数が示されている。さらに、１９１１／１５００／１５０ １．１６８２／１６８３゜１７０８／１７０９．１７１２／１７１３．１６８４ ／１６８５．あるいは１７０６／１７０７から選択したプローブベアが、（＋＋ ）以上のシグナルで、捕獲／検出方式においてハイブリダイズする、各血清型あ るいは分類されていない単離体の予想単離数も示されている。（ＮＤは特定の単 離体に対してハイブリダイゼーションが行われなかったことを示す。）本明細書 中では特にことわらない限り、単離体あるいは血清型“を検出する゛及び°の検 出用“プローブは、用いたハイブリダイゼーション条件下で、（＋）以上のシグ ナルで４１離体や特異的血清型に属す単離体とハイブリダイズするものである。

プローブ各々（断片あるいはオリゴヌクレオチド）、プローブペアあるいはプロ ーブセット（プローブ及び／またはプローブペアの組み合わせ）で、ドツトプロ ット方式で用いられるハイブリダイゼーション条件下で、表１に列記された血清 型の９０％以上の各型最低１つの単離体を検出する（中以上のシグナルでハイブ リダイズする）ものを、十分に包括的なプローブ、プローブペア、あるいはプロ ーブセクトとして定義する。同様に、プローブ、プローブペア、あるいはプロー ブセットで、ドツトプロット方式で用いられる／１イブリダイゼーション条件下 で、表１に列記された血清型の８３％以上９０％未満の各型最低１つの単離体を 検出するものを、適度に包括的なプローブ、プローブペア、あるいはプローブセ ットとして定義する。プローブ、プローブペア、あるいはプローブセットで、ド ツトプロット方式で用いられるハイブリダイゼーション条件下で、表１に列記さ れた血清型の５０％以上８３％未満の冬型最低１つの単離体を検出するものを、 部分的に包括的なプローブ、プローブペア、あるいはプローブセットとして定義 する。例えば、上記のプローブセットＩ及び■は十分に包括的なプローブセット である。ドツトプロットデータ（まとめ表１０参照）をもとにのっとって考える と、これらの組合せは、それぞれ捕獲／検出方式で３５種の血清型中３３及び３ ４種のものを少なくとも１個は検出すると予測される（９４．２％及び９７．１ ％）。実際、これらのプローブセットは、それぞれ検出した血清型に属する検査 した単離体全てを検出すると予測される。

オリゴヌクレオチド１９００．１５００あるいは１５０１のような各々のプロー ブは、表１に列記した血清型の６０％からそれぞれ少なくとも１個を検出し、断 片ｎＮＴ６は表１に列記した血清型（表１０参照）のおよそ６８％を検出するが 、これらは部分的に包括的なプローブと考えられる。プローブ１８６４は十分に 包括的なプローブである。部分的な、適度に及び十分に包括的プローブは、互い にあるいは他のプローブを組み合わせて適当なベアあるいはセットにすることで 、望ましい包括パターンを得ることができる。

上述したように、スクリーンした排除生物は表６．７Ａ及び７Ｂに列記した非Ｅ ＩＥＣ株１５２種を含み、これらを本明細書では非ＥＩＥＣ腸内細菌排除生物と 定義した。さらに、表８に列記した９１株を本明細書では便でよく発見される排 除生物として定義した排除生物の第２セツトと定義した。各プローブ（断片ある いはオリゴヌクレオチド）、プローブペア、プローブセット（プローブ及び／あ るいはプローブペアの組み合せ）で、ドツトプロット方式で用いられる／・メブ リダイゼーション条件下で、表６．７Ａ及び７Ｂに列記された非ＥＩＥＣ１５２ 株をどれも検出しない（十未満のシグナルでハイブリダイズする）ものを、非Ｅ ＩＥＣ膓内細菌排除生物に関して排除プローブ、プローブペア、あるいはプロー ブセットとして定義する。プローブ、プローブペア、あるいはプローブセットで 、表で用いられるハイブリダイゼーション条件下で、表６．７Ａ及びＢに列記さ れた非ＥＩＥＣ１５２株の１０％以下のみ検出する（中以上のシグナルでハイブ リダイズする）ものを、これらの大腸菌及び腸内細菌排除生物に関して十分な排 除プローブ、プローブペア、あるいはプローブセットとして、一方、表６．７Ａ 及びＢに列記された非ＥＩＥＣ１５２株の２０％以下のみ検出するものを、非Ｅ ＩＥＣ腸内細菌排除生物の適度な排除プローブ、プローブペア、あるいはプロー ブセットとして定義する。排除プローブは、適度な及び十分な排除プローブの基 準もまた満たしている。

プローブ、プローブペア、あるいはプローブセットで、ドツトプロット方式で用 いられるハイブリダイゼーション条件下において、表８に列記された便でよく発 見される排除生物９１株をどれも検出しない（十未満のシグナルでハイブリダイ ズする）ものを、便でよく発見される排除生物に関して“排除″プローブ、プロ ーブペア、あるいはプローブセットとして定義する。プローブ、プローブペア、 あるいはプローブセントで、表で用いられるハイブリダイゼーション条件下で、 表８に列記された９１株の１０％以下のみ検出する（中以上のシグナルでハイブ リダイズする）ものを、便でよく発見される排除生物の”十分な排除”プローブ 、プローブペア、あるいはプローブセットとして定義する。従って、表８の生物 の排除プローブはまた、同一の生物の十分な排除プローブでもある。

例えば、プローブ１５００．１５０１あるいは１９１１は表６．７の非ＥｒＥＣ 同様、便でよ（発見される株である腸内細菌についても排除的である。プローブ １６８４及び１６８５は検査した非ＥＩＥＣのいずれも検出しなかったが、４生 物（２，６％）については調べなかった。従って、１６８４及び１６８５は十分 に排除的であることがわかっている。これら４生物とも検出されない場合、これ らのプローブは排除的である。プローブセットＩは、捕獲／検出方式で用−いた 場合、表７からの株のうち２株（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ ）を検出すると予想される。しかし、表７の４株については調べていない（ＮＤ ）。従って、プローブセットＩは、非ＥＩＥＣ生物を最高でも３，９％（６／１ ５２）Ｌか検出しないため、非ＥＴＥＣ腸内細菌排除生物１ご十分に排除的”で ある。プローブセットＩは便でよく発見される排除生物（表８に列記）について もまた排除的である。

プローブ４３７は非ＥＩＥＣ生物の約９．９％（１５）を検出する：しかし非Ｅ ｒＥＣ腸内細菌の１０／１５２はスクリーンしなかった。従って。糖プローブの 非ＥｒＥＣ腸内細菌に対する排除は１６．４％（適度に排除的）と９．９％（十 分に排除的）の間である。しかし、捕獲／検出方式では、プローブセラ）ＩＩは 、４３７の相補鎖を用いることができるが、非ＥＩＥＣ腸内細菌排除生物に十分 に排除的であり、伊でよく発見される排除生物（表８に列記）については、ブ、 ローブ１８６４の性質のためにも排除的である。捕獲検出方式におけるＥＩＥＣ 。

非ＥｒＥＣ腸内細菌及び便によく発見される株に関するプローブセットＩ及びＨ のプローブペアの予測される性質は表１３（検出用カット−オフ（除外度）とし て（＋）シグナルを用いている）にまとめである。（表１３では、表１１及び１ ２と同様、プローブ１５００．１５０１及び１９１１から選択したいずれのベア も示した性質を表わしている。） プローブ用アッセイ方式 プローブ、プローブペア及びプローブセットは、様々なハイブリダイゼーション アッセイ方式で用いることができる。このハイブリダイゼーションアッセイは、 検出されるべき配列とプローブが溶液中で自由に動く液体ハイブリダイゼーショ ン、あるいは、配列またはプローブが固体支持体に固定されているアッセイを含 む。赤痢菌特異的断片、その一部、その断片由来のオリゴヌクレオチドプローブ 、相補体あるいは相同体が、ドツトプロット方式あるいはその他の適当なハイブ リダイゼーションを基本とするアッセイ方式に用いることが可能である。例えば 、大きな断片あるいはその一部を、ニックトランスレーションあるいはフィルタ ーハイブリダイゼーションのための他の適当な方法で調製することができる（例 ：米国特許第４．３５８，５３５号、コアルコ−（Ｆａｌｋｏｗ）ら参照）。′ −プローブは、適した捕獲検出アッセイ方式（例：Ｄ、Ｖ、モリラン−（Ｍｏｒ ｒｉｓｓｅｙ）　ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１ ８１：３４５−３５９（１９８９）；　Ｗ、Ｒ，ハンサカー（Ｈｕｎｓａｋｅｒ ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８１：３６０− ３７０（１９８９）：Ｈ，ロメリー（Ｌｏｍｅｌｉ）ら、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　３５：１８２６−１８３１（１９８９）：　ブリットチャ ード、（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ）Ｃ，Ｇ　とＪ、Ｅ、ステファン（ｓｔｅｆａｎｏ ）、＾ｎｎ、　Ｂｉｏｌ、　ｃｌｉｎ、　４８：４９２−２９７（１９９０）参 照）。捕獲／検出方式では、プローブペアは赤痢菌特異的断片あるいはその変異 型の同じ側の鎖（選択した鎖）の重ならない部分から好んで選ばれる。プローブ は、選択したアッセイでの活性はその間の距離に比例している。従って、標準的 な捕獲／検出方式では、プローブは、試料調製によって望ましい検出感度が損な われる程に相補配列が分離することのないように、十分近くなければならない。

ＲＮＡプローブもまた調製可能である。例えば、プローブ塩基配列をｆａｌ−ｓ ｔ　ＭＤＶ　ｃＤＮＡ構築に結合し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて線上化し たプラスミドから転写させることができる。このようにして調製した検出プロー ブは、ひとつあるいは複数の捕獲プローブとともに用いて、Ｑβレブリカーゼシ ステム（ブリッチャードとステ７７）、Ａｎｎ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ１１ｎ、　４ Ｂ：　４９２−４９７　（１９９０））で増幅することができる。

上述した、あるいは赤痢菌特異的断片の配列に基づくそのほかのオリゴヌクレオ チドプローブは、ポリメラーゼ鎖反応に用いることができる。第二のオリゴヌク レオチドは連鎖から調製することができる。

本発明は以下に続〈実施例によって以後解説するが、それらの実施例はどの様な かたちでも制限を意図したものではない。

（実施例） 実施例１　サイト−ドツトパネル すべてのサイト−ドツトパネルは、５μｌ容量中の各細菌分離物を約１×１０８ 細胞だけニトロセルロース上にスポットすることにより調製した。この細菌を溶 菌し、ニトロセルロースフィルターを０．５Ｍ　ＮａＯＨと１．５Ｍ　ＮａＣ１ で濡らした３ＭＭ紙上に１０分間置（ことにより、そのＩ）ＮＡを変性させた。

この処理の後、ニトロセルロースフィルターを、ＩＭ　トリス　ＤＨ７，５と１ ゜５Ｍ　ＮａＣｌで濡らした３ＭＭ紙上に１０分間置くことにより中和した。後 者の中和過程を繰り返し、真空下で１−１．５時間、８０℃でベイクすることに よりＤＮＡをフィルター上に固定した。

実施例２　ハイブリダイゼーション条件ニック−トランスレートされた断片すべ てに対するハイブリダイゼーション条件は以下のようであった：プレハイブリダ イゼーションについては、１０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ″Ｓ）　、５Ｘ ＳＥＴ、Ｏ，ＬＭ　リン酸緩衝液　ｐＨ７，０１％　ピクリン酸ナトリウム、０ ．１％　ＳＯ５中で６５℃で３時間であった。（注：２０ＸＳＥＴは３Ｍ　Ｎａ Ｃｌ、０，４〜丁　トリス−塩酸　ｐＨ７，５および２０ｍＭ　ＥＤＴＡである 。）ハイブリダイゼーションについては、２×デンハルト、５ＸＳＥＴ、Ｏ，Ｌ Ｍ　リン酸緩衝液　ｐＨ７，０，１％　ピクリン酸ナトリウム、０１％　ＳＤＳ およびハイブリダイゼーション溶液１ｍｌあたりｌＸｌ０’カウントのニック− トランスレートされたプローブ中で行った。ハイブリダイゼーションは６５℃で 一晩行われた。オートラジオグラフは１５時間感光させた。

リン酸化されたオリゴヌクレオチドすべてに対するハイブリダイゼーションの条 件は（１７塩基（ｂ）オリゴヌクレオチドであるプローブ１８６４を除き）以下 のようであった：ブレハイブリダイゼーションについては、５×デンハルト、５ ｘＳＥＴ、０、ＩＭ　リン酸緩衝液　ｐＨ７，０，１％　ピクリン酸ナトリウム 、０．１％　ＳＤＳ中で６０℃で３時間であった。ハイブリダイゼーションにつ いては、１×デンハルト、６ｘＳＥＴ、Ｏ，ＩＭ　リン酸緩衝液　ｐ）（７，０ ゜１％　ピクリン酸ナトリウム、０．１％　ＳＯ８およびハイブリダイゼーショ ン溶液１ｍｌあたりｌＸｌ０’カウント／分のリン酸化されたオリゴヌクレオチ ドプローブ中で行った。ハイブリダイゼーションは６０℃で一晩行われた。オー トラジオグラフは１５時間または７日間感光させた。表２−８に記録されている オートラジオグラフは７日間感光のものである。２種類の感光条件の結果はほぼ 同じであった。プローブ１８６４　（１７ｂ）に対するハイブリダイゼーション 条件は、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温 度がＳｈｉｇｅｌｌａの分類の簡単な概要 表６Ａ：　Ｅ、ｃｏｌｉに対するＳｈｉｇｅｌｌａプローブの／−イブーノダイ ゼーシジンｉｔ漫襲性Ｅ、ｃｏｌｉ 腸管毒性Ｅ、ｃｏｌｉ ＋−―−− コ１６０　−　− 表６Ａ：続き 腸管病原性Ｅ、ｃｏｌｉ ０１５７血清型 腸管病原性Ｅ、ｃｏｌｉ 表６Ａ、続き 属／橿　菌株■Ｄ　ＮＴ　”５００　ＮＴ６　１５０１　１１−２　’Ｊ−６Ｂ ２　１６８３１７０８　１７０９腸管病原性Ｅ、ｃｏｌｉ 非０１５７血清型 ８４６　＋＋＋＋　−−−−−− 非病原性Ｅ、ｃｏｌｉ コＬ６１　−　＋　＋　＋　＋　＋　−表６８：　Ｅ、ｃｏｌｉに対するＳｈｉ ｇｅｌｌａプローブのハイブリダイゼーション属／ＨＢｙ、５ＤＮＴ　１７１２ １７１３　ＮＴ　１６８４　ｏｍｐＡ　ＣＲ３１Ｂ−４ａ　１９−２１６８５１ ７０７１７０６　４３７１８６４腸管漫襲性Ｅ、ｃｏｌｉ コ１コ””　−−”／−−−−−十＋＋十コ１４５　−　−　−　４−／−−− −＋　＋＋＋＋１４６　−　−　＋＋＋＋　４−＋１＋　−−＋＋＋＋３１５７ 　−　−　−　十／−−−＋　＋よ　→＋コ（１１７−−−十／−−−−＋＋　 −／十腸管毒性Ｅ、ｃｏｌｉ コ１２０　−　−　−　＋／−−−−／＋　−−／＋３１２９　−　−　−　＋ ／−−−−７＋　＋＋　づ＋３１５４　−　ＮＤ　ＮＤ　＋／−−−−−−コ１ ５６　−　−　−　＋／−−−−十＋　−／＋３１５８　−　−　−　＋　−− −＋＋　ＮＯコ１６０　−　−　−　十／−−−−十　−表６Ｂ　：Ｊｉ！！き ａ７ｇ　菌株ＩＤＮＴ　１７１２１７１コ　ＮＴ　１６８４　ｏｍｐＡ　ＣＲ３ １８−１ａ　１９−２　１６８５　１７０７　１７０６　４コア　１８６４腸管 病原性Ｅ、ｃｏｌｉ Ｏ１５７血清型 ３１５５−　−　ｋＲｒ＋１−−　−　−　−　−編管肩原性Ｅ、ｃｏｌｉ 非０１５７血清型 ３ｏ３ｓ’−−−＋／−−−−−− コ０コ９　＋十＋＋＋＋＋十＋＋＋　４−／　−−−−＋　−コ０４１　−　− 　−　＋　−−−十＋　ＮＤ８４５　−　−　−　＋／−−−−＋　−表６Ｂ− 続き 、７３　１１株ＩＤ　ＮＴ　１７１２１７１コ　ＮＴ　１６８４　ｏｍｐＡ　Ｃ Ｒコ１［１−１ａ　１９−２１６８５１７Ｑ７１７０６　４３７　ｍ９６４腸管 病原性Ｅ、ｃｏｌｉ 非０１５７血清型 非病原性Ｅ、ｃｏｌｉ コニ２ｇ　−−−十／　−−−−十−／＋３１５８　−　ＮＤ　ＮＤ　十／−− −−十　ＮＤ３１６１　−　−　−　＋／　−−−−／＋　＋　ＮＤ特表十６− ５０２０８２　（２１） 均等発明 当業者は、これ以上の繰り返し実験を用いることなく、本明細書に記載された本 発明の特定の具体例と均等である多くの発明を理解し、また確かめることができ るであろう。このような均等物も本発明の目的の範囲内に含むことを意図するも のである。

ｒ配列表】 配列番号＝１ 配列の長さ＝１６４塩基対 配列の型：核酸 鑓の数二二本鎖 トポロジｍ：［！ｌ状 配列コ 配列番号：２ 配列の長さ＝７９６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：ＷＬ綿線 状列・ 一−ＣＣτ＾ｅｃ　ＣＣＣＣＴＡＣＴＴＣＴＴ：ＡＣＡ丁ＣＣＡ　丁ＣＡ丁ＡＴ ＴＣＡ丁　Ｃ，ｋＡＣＴｌ＾入入Ａ　ＴＴＣＡＧＣＴＴＡＡ@７８０ Ｃ，ＧｋＡＣＴＧＭＣＣＡＧＡＡＧ　７９６配列番号：３ 配列の長さ：５８７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー二直線状 配列： 配列番号＝４ 配列の長さニア８６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直線状 配列： 配列番号＝５ 配列の長さ：１１７４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー二直線状 配列： ＡにＴ？（１１；Ａｃ′ＴＡ　丁ＡＧＣＴＣ丁ＡＣ７ＧＣ；ＣＡＡＴＡＣにＧ　 ＡＣＡＣＡＣＣＡＴＴ　ＴＧＴＴＣＴＴｒＴＴ　ＴＴＡＡＧbＡＧＣＡ　６０ 配列番号：６ 配列の長さ二６４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直線状 配列： 配列番号ニア 配列の長さ：１１９６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列： 配列番号＝８ 配列の長さ：６４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列： 配列番号：９ 配列の長さ・１１８８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー・直線状 配列： 配列番号、１０ 配列の長さ：６３０塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー、直線状 配列： 配列番号：１１ 配列の長さ：３８８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直線状 配列： 配列番号＝１２ 配列の長さ：１８４塩基対 配列の型：核酸 蛸の数二二本鎖 トポロジー：［線状 配列： 配列番号：１３ 配列の長さ・１６９塩基対 配列の型・ｖ２＃ 鎖の数二二本鎖 トポロジー：直線状 配列： 配列番号：１４ 配列の長さ：３５塩基 配列の型、核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー二直線状 ＴＴＧＣＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＣＴＡＣＣＧ　ＧＡＴＡＣＡＧＣＣＴ　ＣＣＡＴ Ｔ　３５配列番号：１５ 配列の長さ＝３５塩基 配列の型、核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列： ＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧ　ＧＧＣＧＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＧＴＴＣＡＣＡｎＧＴ　 ３５配列番号：１６ 配列の長さ＝４０塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列番号＝１７ 配列の長さ：４１塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列： ＣＴＧＧＴＧＡＡＣＡ　ＡＣＧＴＣＴＴＡＣＡ　ＡＡＧＡＴＧＧ丁丁ＣＣ丁ＧＧ ＡＴＧＧＡＴ　Ｔ　４１配列番号：１８ 配列の長さ＝４１塩基 配列の型：核酸 鎖の数、−末鎖 トポロジー：直線状 配列： ＡＧＴＣｍＣＣＧ　ＴＧｍＣＴＣＡＧ　ＡＡＡＴＧＧＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡ ＡＡ　Ａ配列番号＝１９ 配列の長さ＝３５塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列： ＣＣＡＣＣＧＴｒＧＡ　ＡＧＣＧＴＡＡＡＣＣＧＴＴＴＧＡＣＣＧＡ　ＴＧＧＡ Ｔ配列番号：２０ 配列の長さ：３６塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列・ ＧＣＴＧＧＧＧＴＣＴ　ＡＣＡＧＧＴＧＣＡＡ　ＴＡＡＣＣＡＣＴＴＡ　ＧＡＣ ＧＧＴ配列番号：２１ 配列の長さ：４８塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー二直線状 配列： ４１　ＣＧＡＴＧＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＣＴ　ＧＧ ＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＴｒＣＣ４配列番号＝２２ 配列の長さ；１７塩基 配列の型、核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列： ３５　ＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴ　ＧＧＴＣＴＧ＾　１配列番号：２３ 配列の長さ：３７塩基 配列の型：核酸 鎖の数ニー末鎖 トポロジー：直線状 配列： ３６　ＣＣＴＧＴＧＧＣＴＣＴＣＧＧＴＴＣＴＧＡ　ＴＧＧＴＡＴＡＧＣＡ　Ａ ＣＴＡＡＡＴ　３配列番号＝３０ 配列の長さ：４１塩基 配列の型：核酸 鎖の数　−末鎖 トポロジー、＠線状 配列： ＴＴＴＴＧＣＡＣＧＴ　丁ＧＣＣＣＣＣＡＴＴ　ＴＣＴＧＡＧ＾＾＾ＣＡＣＧＧ ＡＡＡＧＡＣＴＣ二ＣυＲ三ノ 変性およびハイブリダイゼーション ↓ ↓ 選択されたクローンの分析 −Ｎ　−へ　−へ　−へ　Ｆｌｌへ ４１　４＋　４Ｊ４１　４Ｊ　匍　萄 ｚ　２　上　上　電　ｚ　ｚ 手続補正書

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．フレクスナー赤痢菌（Ｓ，．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）を“標的”ＤＮＡとして、 複合ＤＮＡコンペティター混合物をコンペティターＤＮＡとして用いたサブスト ラクトハイブリダイゼーションにより同定される、赤痢菌染色体に排他的に特異 的な断片。
2. ２．ソンネ赤痢菌（Ｓ．Ｓｏｎｎｅｉ）を“標的”ＤＮＡとして、非病原性大腸 菌ＹＭＣのＤＮＡとｐＢＲ３２２ベクターのＤＮＡの混合物をコンペティターＤ ＮＡとして用いたサブストラクトハイブリダイゼーションにより同定される、赤 痢菌特異的な断片。
3. ３．ＮＴ−６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド１−１２４）、ＮＴ１１ −２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）、ＮＴ１４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）および ＮＴ１５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）からなるグループから選択される赤痢菌特 異的な断片である、ソンネ赤痢菌の染色体配列に由来する赤痢菌特異的な断片。
4. ４．ＮＴ１８−１ａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）、およびＮＴ１９−２（ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：１１）からなるグループから選択される赤痢菌特異的な断片で ある、フレクスナー赤痢菌の染色体配列に由来する赤痢菌特異的な断片。
5. ５．ａ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１）；ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１から派生し たプローブ；ｃ）ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）；ｄ）ＮＴ１１−２ から派生したプローブ；およびｅ）（ａ）から（ｄ）のホモログ からなるグループから選択され、少なくとも一つの分類されていない分離物、ま たは赤痢菌属の４つの種の各々の血清型のうち少なくとも一つの分離物を検出し うる、赤痢菌属の細菌の検出用プローブ。
6. ６．ａ）１５００（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）【配列があります】； ｂ）１５０１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）【配列があります】； ｃ）１９１１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）【配列があります】； ｄ）１６８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７）【配列があります】； ｅ）１６８３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）【配列があります】； ｆ）１７０８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）【配列があります】；および ｇ）（ａ）から（ｆ）の相補鎖 からなるグループから選択され、少なくとも一つの分類されていない分離物、ま たは赤痢菌属の４つの種の各々の血清型のうち少なくとも一つの分離物を検出し うる、請求項５に記載の赤痢菌属の細菌の検出用プローブ。
7. ７．ａ）ＮＴ１８−１ａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）；ｂ）ＮＴ１８−１ａか ら派生したプローブ；ｃ）（ａ）と（ｂ）のホモログ； ｄ）ＮＴ１９−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）；ｅ）ＮＴ１９−２から派生し たプローブ；およびｅ）（ｄ）と（ｅ）のホモログ からなるグループから選択され、フレクスナー赤痢菌の血清型１−５の各々のう ち少なくとも一つの分離物を検出しうるプローブ。
8. ８．ａ）１７１２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）【配列があります】； ｂ）１７１３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）【配列があります】；および ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖 からなるグループから選択され、フレクスナー赤痢菌の血清型１−５の各々のう ち少なくとも一つの分離物を検出しうる、請求項７に記載のプローブ。
9. ９．ボイド赤痢菌（Ｓ．ｂｏｙｄｉｉ）血清型５、ボイド赤痢菌血清型７、ボイ ド赤痢菌血清型９、ボイド赤痢菌血清型１１、ボイド赤痢菌血清型１６、ボイド 赤痢菌血清型１７、およびボイド赤痢菌血清型１からなるグループから選択され る赤痢菌属の細菌を更に検出する、請求項７（ｄ）から（ｆ）に記載のプローブ 。
10. １０．ａ）１６８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）【配列があります】； ｂ）１６８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）【配列があります】；および ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖 からなるグループから選択される、請求項９に記載のプローブ。
11. １１．ａ）１７０７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）【配列があります】； ｂ）１７０６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）【配列があります】； ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖、および ｄ）（ａ）から（ｃ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含むオリゴヌクレオチドプローブであり 、志賀赤痢菌（Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）血清型１と２、およびボイド赤痢 菌血清型５、７、９、１１、１２、１５、１６および１７からなるグループから 選択される赤痢菌のうち、少なくとも一つの赤痢菌の分離物を検出するためのオ リゴヌクレオチドプローブ。
12. １２．ａ）４３７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）【配列があります】； ｂ）１８６４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）【配列があります】； ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖；および ｄ）（ａ）と（ｂ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、赤痢菌属の細菌を検出するための 、実質的に包括的なオリゴヌクレオチドプローブ。
13. １３．捕獲プローブが ａ）１８６４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）；およびｂ）１８６４の相補鎖 からなるグループから選択され、検出プローブが断片ＮＴ１４（ＳＥＱ　ＩＤＮ Ｏ：４）とＮＴ１５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）を捕獲プローブとして含むソン ネ赤痢菌配列の同じ鎖から派生したオリゴヌクレオチド配列を有する、実質的に 包括的な捕獲プローブと検出プローブを含む、赤痢菌属の細菌を検出するための 実質的に包括的な捕獲／検出プローブペア。
14. １４．さらに、プローブベアが大便に一般的に見出だされる排他性微生物に排他 的であり、かつ、非ＥＩＥＣ腸内細菌科に実質的に排他的である、請求項１３に 記載の実質的に包括的な捕獲／検出プローブペア。
15. １５．捕獲プローブが１８６４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）であり、検出プロ ーブが４３７の相補鎖である、請求項１３に記載の捕獲／検出プローブペア。
16. １６．捕獲プローブが１８６４の相補鎖であり、検出プローブがプローブ４３７ （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１）である、請求項１３に記載の捕獲／検出プローブ ペア。
17. １７．さらにＥＩＥＣを検出し、少なくとも３つの捕獲／検出プローブペア（第 １のプローブペアはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１とそのホモログの選択された鎖から 派生した配列を有するオリゴヌクレオチドからなるグループから選択され、第２ のプローブペアは断片ＮＴ１９−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）とそのホモロ グの選択された鎖から派生した配列を有するオリゴヌクレオチドからなるグルー プから選択され、そして第３のプローブペアはヌクレオチド番号８９３から１０ ７６に渡る志賀赤痢菌ｏｍｐＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）とそのホモロ グの選択された鎖から派生した配列を有するオリゴヌクレオチドからなるグルー プから選択される）を含む、赤痢菌属の細菌を検出するための実質的に包括的な プローブセット。
18. １８．少なくとも３つの捕獲／検出プローブペア（第１のプローブペアはＳＥＱ ＩＤ　ＮＯ：１の選択された鎖から派生したオリゴヌクレオチド配列を有し、第 ２のプローブペアは断片ＮＴ１９−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）の選択され た鎖から派生したオリゴヌクレオチド配列を有し、そして第３のプローブベアは ヌクレオチド番号８９３から１０７６に渡る志賀赤痢菌ｏｍｐＡ配列（ＳＥＱＩ Ｄ　ＮＯ：１２）の選択された鎖から派生したオリゴヌクレオチド配列を有する ）を含む、請求項１７に記載の実質的に包括的なプローブセット。
19. １９．さらに、プローブペアが大便に一般的に見出だされる排他性微生物に排他 的であり、かつ、非ＥＩＥＣ腸内細菌科に実質的に排他的である、請求項１８に 記載の実質的に包括的なプローブセット。
20. ２０．第１のプローブペアが、プローブ１９１１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６） 、１５００（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）および１５０１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：１５）からなるグループから選択され、第２のプローブペアが、プローブ１６ ８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）、および１６８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２ ６）からなり、そして第３のプローブペアが、プローブ１７０６（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：２７）、および１７０７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）からなる、請求 項１９に記載の実質的に包括的なプローブセット。
21. ２１．さらにＥＩＥＣを検出し、少なくとも３つの捕獲／検出プローブペア（第 １のプローブペアは： ａ）１９１１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）；ｂ）１５００（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：１４）；およびｃ）１５０１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）からなるグルー プから選択され、第２のプローブペアは；ａ）１６８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ２５）；およびｂ）１６８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）からなるグループか ら選択され、第３のプローブペアは；ａ）１７０６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７ ）；およびｂ）１７０７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）からなるグループから選 択される）を含む、赤痢菌属の細菌を検出するための実質的に包括的なプローブ セット。
22. ２２．さらにＥＩＥＣを検出し、少なくとも２つの捕獲／検出プローブペア（第 １のプローブペアはソンネ赤痢菌の断片ＮＴ１４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）と ＮＴ１５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）およびそのホモログを含む配列の選択され た鎖から派生した配列を持つオリゴヌクレオチドからなるグループから選択され 、そして第２のプローブペアはヌクレオチド番号８９３から１０７６に渡る志賀 赤痢菌ｏｍｐＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）とそのホモログの選択された 鎖から派生した配列を持つオリゴヌクレオチドからなるグループから選択される ）を含む、赤痢菌属の細菌を検出するための実質的に包括的なプローブセット。
23. ２３．少なくとも２つの捕獲／検出プローブペア（第１のプローブペアはソンネ 赤痢菌の断片ＮＴ１４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）とＮＴ１５（ＳＥＱ　ＩＤＮ Ｏ：３）を含む配列の選択された鎖から派生したオリゴヌクレオチド配列を有し 、そして第２のプローブペアはヌクレオチド番号８９３から１０７６に渡る志賀 赤痢菌ｏｍｐＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）の選択された鎖から派生した オリゴヌクレオチド配列を有する）を含む、請求項２２に記載の実質的に包括的 なプローブセット。
24. ２４．さらに、プローブセットが大便に一般的に見出だされる排他性微生物に排 他的であり、非ＥＩＥＣ腸内細菌科に実質的に排他的である、請求項２３に記載 の実質的に包括的なプローブセット。
25. ２５．第１のプローブペアが、プローブ１８６４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２） と４３７の相補鎖からなり、そして第２のプローブペアが、プローブ１７０６（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）と１７０７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）からなる 、請求項２４に記載の実質的に包括的なプローブセット。
26. ２６．さらにＥＩＥＣを検出し、少なくとも２つの捕獲／検出プローブペア（第 １のプローブペアは１８６４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２）と４３７の相補鎖で あり、そして第２のプローブペアは１７０６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７）と１ ７０７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８）である）を含む、赤痢菌属の細菌を検出す るための実質的に包括的なプローブセット。
27. ２７．赤痢菌特異的な断片ＮＴ−６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のヌクレオチド１ −１２４）から派生したオリゴヌクレオチドプローブであって、ＮＴ−６の包括 性の性質を実質的に保持したプローブ。
28. ２８．非ＥＩＥＣ腸内細菌科に対する改善された排他性の性質を有し、大便に一 般的に見出だされるような排他性微生物に排他的な、請求項２７に記載のオリゴ ヌクレオチドプローブ。
29. ２９．ａ）１９１１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）【配列があります】； ｂ）１５００（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４）【配列があります】： ｃ）１５０１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５）【配列があります】； ｄ）（ａ）から（ｃ）の相補鎖；およびｅ）（ａ）から（ｄ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、請求項２８に記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。
30. ３０．赤痢菌特異的な断片ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）から派生し たオリドヌクレオチドプローブであって、ＮＴ１１−２の包括性の性質を実質的 に保持したプローブ。
31. ３１．ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）の非ＥＩＥＣ−腸内細菌科に対 する排他性の性質を実質的に保持した請求項３０に記載のオリゴヌクレオチドプ ローブ。
32. ３２．ａ）１６８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７）【配列があります】； ｂ）１６８２の相補鎖（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９）【配列があります】；およ び ｃ）（ａ）と（ｂ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、請求項３１に記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。
33. ３３．赤痢菌特異的な断片ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）から派生し たオリドヌクレオチドプローブであって、ＮＴ１１−２の包括性の性質を適度に 保持したプローブ。
34. ３４．ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）の非ＥＩＥＣ−腸内細菌科に対 する排他性の性質を実質的に保持した請求項３３に記載のオリゴヌクレオチドプ ローブ。
35. ３５．ａ）１６８３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８）【配列があります】； ｂ）１６８３の相補鎖（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０）【配列があります】；およ び ｃ）（ａ）と（ｂ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、請求項３４に記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。
36. ３６．赤痢菌特異的な断片ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）から派生し たオリドヌクレオチドプローブであって、ＮＴ１１−２の包括性の性質を部分的 に保持したプローブ。
37. ３７．ＮＴ１１−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）の非ＥＩＥＣ−腸内細菌科に対 する排他性の性質を実質的に保持した請求項３６に記載のオリゴヌクレオチドプ ローブ。
38. ３８．ａ）１７０８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９）【配列があります】； ｂ）１７０９（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０）【配列があります】； ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖；および ｄ）（ａ）から（ｃ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、請求項３７に記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。
39. ３９．赤痢菌特異的な断片ＮＴ１８−１ａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）から派 生したオリドヌクレオチドプローブであって、ＮＴ１８−１ａの包括性の性質を 実質的に保持したプローブ。
40. ４０．ＮＴ１８−１ａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）の非ＥＩＥＣ−腸内細菌科 に対する排他性の性質を実質的に保持した請求項３９に記載のオリゴヌクレオチ ドプローブ。
41. ４１．ａ）１７１２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）【配列があります】； ｂ）１７１３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４）【配列があります】； ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖；および ｄ）（ａ）から（ｃ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、請求項４０に記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。
42. ４２．赤痢菌特異的な断片ＮＴ１９−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）から派生 したオリドヌクレオチドプローブであって、ＮＴ１９−２の包括性の性質を実質 的に保持したプローブ。
43. ４３．ＮＴ１９−２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１）の非ＥＩＥＣ−腸内細菌科に 対する排他性の性質を実質的に保持した請求項４２に記載のオリゴヌクレオチド プローブ。
44. ４４．ａ）１６８４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５）【配列があります】； ｂ）１６８５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６）【配列があります】； ｃ）（ａ）と（ｂ）の相補鎖；および ｄ）（ａ）から（ｃ）のホモログ からなるグループから選択される配列を含む、請求項４３に記載のオリゴヌクレ オチドプローブ。