JPH05276996A - コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キット - Google Patents
コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キットInfo
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- JPH05276996A JPH05276996A JP4079800A JP7980092A JPH05276996A JP H05276996 A JPH05276996 A JP H05276996A JP 4079800 A JP4079800 A JP 4079800A JP 7980092 A JP7980092 A JP 7980092A JP H05276996 A JPH05276996 A JP H05276996A
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- Japan
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- cholera toxin
- oligonucleotide
- detecting
- producing
- cholera
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 直接的で簡便、迅速、特異的且つ高感度なコ
レラ毒素産生性コレラ菌の検出に用いるオリゴヌクレオ
チドを提供する。 【構成】 配列表・配列番号１〜６に示す核酸配列を有
するか、またはそれらに相補的な配列を有するコレラ毒
素産生性コレラ菌検出用オリゴヌクレオチド、該オリゴ
ヌクレオチドを標識化した標識化オリゴヌクレオチドお
よびこれらのオリゴヌクレオチドをプローブあるいはプ
ライマーとして使用する試料中のコレラ毒素産生菌の検
出法および検出用試薬キット。
レラ毒素産生性コレラ菌の検出に用いるオリゴヌクレオ
チドを提供する。 【構成】 配列表・配列番号１〜６に示す核酸配列を有
するか、またはそれらに相補的な配列を有するコレラ毒
素産生性コレラ菌検出用オリゴヌクレオチド、該オリゴ
ヌクレオチドを標識化した標識化オリゴヌクレオチドお
よびこれらのオリゴヌクレオチドをプローブあるいはプ
ライマーとして使用する試料中のコレラ毒素産生菌の検
出法および検出用試薬キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はコレラ毒素産生菌、具体
的にはビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）中でコレ
ラ毒素を産生する菌を簡便かつ迅速に検出することに関
する。
的にはビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）中でコレ
ラ毒素を産生する菌を簡便かつ迅速に検出することに関
する。
【０００２】
【従来の技術】コレラ菌は飲食物を介して経口感染によ
りコレラを起こす法定伝染病原因菌である。発展途上国
では大規模な流行を示し、患者は嘔吐と大量の下痢のた
め脱水症状が強くなりショック状態に陥り、死に至るこ
とも多い。しかし、生化学的性状で分類されるコレラ菌
の中にはコレラ毒素を産生せず、病原性を示さないコレ
ラ菌もあり、コレラ毒素産生性の判定が重要である。従
ってコレラ毒素産生性コレラ菌の検出、同定は食品産
業、公衆衛生、臨床検査分野に於て重要であり、且つコ
レラが法定伝染病であるという性格上迅速な測定が望ま
れている。しかし、コレラ毒素産生コレラ菌とコレラ毒
素非産生コレラ菌は血清学的にも生化学的にも全く区別
は出来ない。そこでコレラ毒素そのものの産生性を見る
必要がある。従来からコレラ毒素の産生性を検出する方
法としては、De test （ウサギの腸管を結紮し、その中
に菌液を接種する方法）、Duttatest（乳飲みウサギに
経口的に菌液を投与しコレラ症状を起こす方法）などの
生物学的検出法があるが、手技が複雑で簡便な検査とは
言えない。コレラ菌は一般に抗血清との反応性による同
定がなされている。これはＯ抗原と呼ばれる細菌表面の
糖鎖抗原による分類である。コレラ菌には稲葉型抗原、
小川型抗原という２つの抗原があり、それぞれに特異な
抗血清を作ることができる。このコレラ菌に特異的な抗
原をまとめてＯ１抗原と言う。コレラ菌（Vibrio chole
rae ）中でこの抗Ｏ１血清と免疫反応を起こす菌がコレ
ラ菌として分類されている。一方この抗Ｏ１血清と免疫
反応を起こさない、血清学的に性状の異なる非Ｏ−１型
コレラ菌(Vibrio cholerae non O-1: ナグビブリオと呼
ぶことがある）も存在し、これらの中にはコレラ毒素と
ほとんど同じ毒素を産生し、食中毒の原因菌となるもの
もある。従ってこれらの毒素を産生するナグビブリオの
判定も重要である。またポリミキシンＢ感受性やニワト
リ赤血球凝集反応などによりアジア型コレラ菌とエルト
ールコレラ菌に分類され、現在ではエルトールコレラ菌
が主流を占めている。更にファージ型分類、免疫学的分
類などもあるが、これらはコレラ毒素産生性とは直接関
係がない。近年、ＤＮＡプローブを初めとする遺伝子検
査による細菌の同定や毒素遺伝子の検出が多くなされて
いる。コレラ毒素の遺伝子配列は明かにされているが、
コレラ毒素は毒素原性大腸菌の易熱性毒素(Enteroxigen
ic Escherichia coli heat-labile enterotoxin: ETEC-
LT) との類似性が高く、遺伝子レベルでの類似性も高い
ことが知られており、ＤＮＡプローブでの分別も困難で
ある。更にこのＥＴＥＣ−ＬＴ毒素による腸管感染症で
は症状がコレラと非常に類似しており臨床症状からの鑑
別は困難であるため、正確な検査法が待ち望まれてい
る。
りコレラを起こす法定伝染病原因菌である。発展途上国
では大規模な流行を示し、患者は嘔吐と大量の下痢のた
め脱水症状が強くなりショック状態に陥り、死に至るこ
とも多い。しかし、生化学的性状で分類されるコレラ菌
の中にはコレラ毒素を産生せず、病原性を示さないコレ
ラ菌もあり、コレラ毒素産生性の判定が重要である。従
ってコレラ毒素産生性コレラ菌の検出、同定は食品産
業、公衆衛生、臨床検査分野に於て重要であり、且つコ
レラが法定伝染病であるという性格上迅速な測定が望ま
れている。しかし、コレラ毒素産生コレラ菌とコレラ毒
素非産生コレラ菌は血清学的にも生化学的にも全く区別
は出来ない。そこでコレラ毒素そのものの産生性を見る
必要がある。従来からコレラ毒素の産生性を検出する方
法としては、De test （ウサギの腸管を結紮し、その中
に菌液を接種する方法）、Duttatest（乳飲みウサギに
経口的に菌液を投与しコレラ症状を起こす方法）などの
生物学的検出法があるが、手技が複雑で簡便な検査とは
言えない。コレラ菌は一般に抗血清との反応性による同
定がなされている。これはＯ抗原と呼ばれる細菌表面の
糖鎖抗原による分類である。コレラ菌には稲葉型抗原、
小川型抗原という２つの抗原があり、それぞれに特異な
抗血清を作ることができる。このコレラ菌に特異的な抗
原をまとめてＯ１抗原と言う。コレラ菌（Vibrio chole
rae ）中でこの抗Ｏ１血清と免疫反応を起こす菌がコレ
ラ菌として分類されている。一方この抗Ｏ１血清と免疫
反応を起こさない、血清学的に性状の異なる非Ｏ−１型
コレラ菌(Vibrio cholerae non O-1: ナグビブリオと呼
ぶことがある）も存在し、これらの中にはコレラ毒素と
ほとんど同じ毒素を産生し、食中毒の原因菌となるもの
もある。従ってこれらの毒素を産生するナグビブリオの
判定も重要である。またポリミキシンＢ感受性やニワト
リ赤血球凝集反応などによりアジア型コレラ菌とエルト
ールコレラ菌に分類され、現在ではエルトールコレラ菌
が主流を占めている。更にファージ型分類、免疫学的分
類などもあるが、これらはコレラ毒素産生性とは直接関
係がない。近年、ＤＮＡプローブを初めとする遺伝子検
査による細菌の同定や毒素遺伝子の検出が多くなされて
いる。コレラ毒素の遺伝子配列は明かにされているが、
コレラ毒素は毒素原性大腸菌の易熱性毒素(Enteroxigen
ic Escherichia coli heat-labile enterotoxin: ETEC-
LT) との類似性が高く、遺伝子レベルでの類似性も高い
ことが知られており、ＤＮＡプローブでの分別も困難で
ある。更にこのＥＴＥＣ−ＬＴ毒素による腸管感染症で
は症状がコレラと非常に類似しており臨床症状からの鑑
別は困難であるため、正確な検査法が待ち望まれてい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的は
直接的で簡便、迅速、特異的且つ高感度なコレラ毒素産
生性コレラ菌の検出に用いるオリゴヌクレオチドを提供
することである。
直接的で簡便、迅速、特異的且つ高感度なコレラ毒素産
生性コレラ菌の検出に用いるオリゴヌクレオチドを提供
することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者はコレラ毒素の
遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、ＥＴＥＣ−Ｌ
Ｔなど類似の毒素とも反応しない特異性の高い、高感度
かつ簡便、迅速に診断可能なオリゴヌクレオチドを得、
それを用いた検出方法を確立し、本発明を完成させるに
至った。
遺伝子に関する種々の検討を重ねた結果、ＥＴＥＣ−Ｌ
Ｔなど類似の毒素とも反応しない特異性の高い、高感度
かつ簡便、迅速に診断可能なオリゴヌクレオチドを得、
それを用いた検出方法を確立し、本発明を完成させるに
至った。
【０００５】すなわち、本発明はコレラ毒素産生性コレ
ラ菌に特異的なオリゴヌクレオチド、配列表・配列番号
１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されてもよい。）に示す核酸配列を有
するか、またはそれらに相補的な配列を有するコレラ毒
素産生性コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよび該オ
リゴヌクレオチドを標識化した標識オリゴヌクレオチド
である。本発明は該コレラ毒素産生性コレラ菌検出用オ
リゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のコレ
ラ毒素産生性コレラ菌の検出法、または該コレラ毒素産
生性コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸
プライマーとするか、または標識化して得られた標識プ
ライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プ
ライマーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定
することを特徴とする試料中のコレラ毒素産生性コレラ
菌の検出法である。さらに本発明はプローブとして該オ
リゴヌクレオチドを含むコレラ毒素産生菌検出用試薬キ
ットおよびプライマーとして該オリゴヌクレオチドまた
は標識オリゴヌクレオチドを含むコレラ毒素産生菌検出
用試薬キットである。
ラ菌に特異的なオリゴヌクレオチド、配列表・配列番号
１〜６（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグア
ニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラ
シル（Ｕ）と置換されてもよい。）に示す核酸配列を有
するか、またはそれらに相補的な配列を有するコレラ毒
素産生性コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよび該オ
リゴヌクレオチドを標識化した標識オリゴヌクレオチド
である。本発明は該コレラ毒素産生性コレラ菌検出用オ
リゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プロー
ブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した
結合体の標識を測定することを特徴とする試料中のコレ
ラ毒素産生性コレラ菌の検出法、または該コレラ毒素産
生性コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸
プライマーとするか、または標識化して得られた標識プ
ライマーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プ
ライマーを伸長させ、得られたプライマー伸長物を測定
することを特徴とする試料中のコレラ毒素産生性コレラ
菌の検出法である。さらに本発明はプローブとして該オ
リゴヌクレオチドを含むコレラ毒素産生菌検出用試薬キ
ットおよびプライマーとして該オリゴヌクレオチドまた
は標識オリゴヌクレオチドを含むコレラ毒素産生菌検出
用試薬キットである。
【０００６】本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成に
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ容易、大量且つ安価に
一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意
の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を
含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴ
に変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。ま
たオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置換とい
った点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
オリゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物
質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体など
の標識物質を導入することにより標識オリゴヌクレオチ
ドを得る。標識結合法は通常の方法に従う。たとえばリ
ンカーアームを有するヌクレオチドを配列表・配列番号
１のオリゴヌクレオチドの一員として置換することによ
り酵素を標識化することができる（Nucleic Asids Rese
arch, 14, 6115, 1986 など) 。その一例として 5位に
リンカーアームを有するウリジンを特表昭60-500717 号
公報に記載される合成法によりデオキシウリジンから化
学合成し、蒸気ヌクレオチドへ導入することもできる。
標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよ
い。また糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよ
い。
より調製できるので、クローン化したオリゴヌクレオチ
ドまたはポリヌクレオチドに比べ容易、大量且つ安価に
一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能であ
る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸
の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読
み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意
の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリジン残基を
含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴ
に変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。ま
たオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるいは置換とい
った点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあってもよい。
オリゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物
質、発光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体など
の標識物質を導入することにより標識オリゴヌクレオチ
ドを得る。標識結合法は通常の方法に従う。たとえばリ
ンカーアームを有するヌクレオチドを配列表・配列番号
１のオリゴヌクレオチドの一員として置換することによ
り酵素を標識化することができる（Nucleic Asids Rese
arch, 14, 6115, 1986 など) 。その一例として 5位に
リンカーアームを有するウリジンを特表昭60-500717 号
公報に記載される合成法によりデオキシウリジンから化
学合成し、蒸気ヌクレオチドへ導入することもできる。
標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよ
い。また糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよ
い。
【０００７】本発明のオリゴヌクレオチドを用いて試料
中のコレラ毒素産生性コレラ菌を検出する場合、（１）
オリゴヌクレオチドをプローブとして試料中のＤＮＡま
たはＲＮＡと交雑させ、交雑物を検出する方法、または
（２）オリゴヌクレオチドをプライマーとして試料中の
ＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポリメラーゼ等
により伸長反応を行い、得られた伸長物から目的核酸を
検出する方法がある。これらの場合、上述のようにオリ
ゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物質、発
光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体などの標識
を導入することにより容易に検出が可能となる。標識オ
リゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、試料と
のハイブリダイゼーション後に上記のような標識を適当
な検出法で検出することで試料中のコレラ毒素産生性コ
レラ菌を検出できる。オリゴヌクレオチドをプライマー
として用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による遺伝子
増幅（ＰＣＲ；特開昭62-281号公報参照）を行なうこと
によりコレラ毒素遺伝子のみを特異的に増幅することが
できる。ＰＣＲに際しては反応時に放射性標識ヌクレオ
チドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により
分画して特異なバンドを検出することで容易にコレラ毒
素遺伝子の存在、すなわちコレラ毒素産生性コレラ菌を
検出することができる。また前述の標識オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いれば増幅産物を直接検出す
ることも可能である。
中のコレラ毒素産生性コレラ菌を検出する場合、（１）
オリゴヌクレオチドをプローブとして試料中のＤＮＡま
たはＲＮＡと交雑させ、交雑物を検出する方法、または
（２）オリゴヌクレオチドをプライマーとして試料中の
ＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、ＤＮＡポリメラーゼ等
により伸長反応を行い、得られた伸長物から目的核酸を
検出する方法がある。これらの場合、上述のようにオリ
ゴヌクレオチドに抗原、ハプテン、酵素、蛍光物質、発
光物質、酵素基質、放射性物質、不溶性担体などの標識
を導入することにより容易に検出が可能となる。標識オ
リゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、試料と
のハイブリダイゼーション後に上記のような標識を適当
な検出法で検出することで試料中のコレラ毒素産生性コ
レラ菌を検出できる。オリゴヌクレオチドをプライマー
として用いる場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による遺伝子
増幅（ＰＣＲ；特開昭62-281号公報参照）を行なうこと
によりコレラ毒素遺伝子のみを特異的に増幅することが
できる。ＰＣＲに際しては反応時に放射性標識ヌクレオ
チドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動により
分画して特異なバンドを検出することで容易にコレラ毒
素遺伝子の存在、すなわちコレラ毒素産生性コレラ菌を
検出することができる。また前述の標識オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用いれば増幅産物を直接検出す
ることも可能である。
【０００８】本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して
捕捉する方法もある。またオリゴヌクレオチドをビオチ
ンで標識し、ハイブリダイゼーション後アビジン結合担
体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイにおい
てはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチドを用い
れば、オリゴヌクレオチドにより特異的な測定が可能と
なり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干低くて
もなんら問題はない。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイを行ってもよいし、標的核酸を標識して
捕捉する方法もある。またオリゴヌクレオチドをビオチ
ンで標識し、ハイブリダイゼーション後アビジン結合担
体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセイにおい
てはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチドを用い
れば、オリゴヌクレオチドにより特異的な測定が可能と
なり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干低くて
もなんら問題はない。
【０００９】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に説明す
る。 実施例１ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー391 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて配列表・配列番号２〜６に示される配
列を有するオリゴヌクレオチドを各種合成した。以下、
配列表・配列番号２〜６に示される各種オリゴヌクレオ
チドをそれぞれオリゴヌクレオチド(2) 〜(6) と呼ぶ。
手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、0.2 μmol スケール
で実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモ
ニア水で55℃一夜実施した。精製はファルマシア社製Ｆ
ＰＬＣで逆相カラムにて実施した。なお合成したオリゴ
ヌクレオチドは必要により以下の方法で5'末端に32P-リ
ン酸基を結合させた。 反応液組成 オリゴヌクレオチド 5 〜20pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μｌ １mM [γ-32PATP(10mCi/ml)] 1 μｌ T4ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製） 10 単位 水 全量が 100μl となる量 上記のように調製した反応混合液を37℃で１時間反応さ
せた。ここで10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液と
は、0.5M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M MgCl2、0.1M2- メル
カプトエタノールを示す。
る。 実施例１ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー391 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて配列表・配列番号２〜６に示される配
列を有するオリゴヌクレオチドを各種合成した。以下、
配列表・配列番号２〜６に示される各種オリゴヌクレオ
チドをそれぞれオリゴヌクレオチド(2) 〜(6) と呼ぶ。
手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、0.2 μmol スケール
で実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモ
ニア水で55℃一夜実施した。精製はファルマシア社製Ｆ
ＰＬＣで逆相カラムにて実施した。なお合成したオリゴ
ヌクレオチドは必要により以下の方法で5'末端に32P-リ
ン酸基を結合させた。 反応液組成 オリゴヌクレオチド 5 〜20pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μｌ １mM [γ-32PATP(10mCi/ml)] 1 μｌ T4ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡製） 10 単位 水 全量が 100μl となる量 上記のように調製した反応混合液を37℃で１時間反応さ
せた。ここで10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液と
は、0.5M Tris-HCl(pH8.0)、0.1M MgCl2、0.1M2- メル
カプトエタノールを示す。
【００１０】実施例２ （１）コレラ毒素産生コレラ菌由来核酸を増幅するため
の試薬キット （ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド(3) （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド(4) （ｃ）実施例１のオリゴヌクレオチド(5) （ｄ）実施例１のオリゴヌクレオチド(6) （ｅ）Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）、dATP, dCT
P, dGTP, dTTP （２）検体の調製 コレラ患者から糞便試料を採取し、PBS に縣濁し、15,0
00rpm 、10分間遠心分離した後、200 μl の水を加え煮
沸することにより核酸を抽出した。コレラ毒素産生コレ
ラ菌の標準株としVibrio Cholerae 569B株を培養し同様
に処理し検体として用いた。 （３）ＰＣＲ 反応液90μl に上記核酸溶液10μl 、実施例１のオリゴ
ヌクレオチド各 5μlずつをプライマーとして加え、コ
レラ毒素産生コレラ菌由来核酸の増幅を行った。反応液
組成は1mM ジチオスレイトール, 50mM KCl, 10mM Tris-
HCl(pH8.3), 1.5mM MgCl2, 0.01%(wt/vol)ゼラチン、そ
れぞれ0.2mM のdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびTth DNA
ポリメラーゼ40単位/ml である。反応条件は次の通りで
ある。はじめに94℃ 5分の変性処理を行った後、 熱変性： 94℃、 1分、 アニーリング：58℃、 2分 重合反応： 75℃、1.5 分 を30回繰り返した。これらの操作はパーキン−エルマー
／シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサ
イクラーを用いて行った。
の試薬キット （ａ）実施例１のオリゴヌクレオチド(3) （ｂ）実施例１のオリゴヌクレオチド(4) （ｃ）実施例１のオリゴヌクレオチド(5) （ｄ）実施例１のオリゴヌクレオチド(6) （ｅ）Tth DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）、dATP, dCT
P, dGTP, dTTP （２）検体の調製 コレラ患者から糞便試料を採取し、PBS に縣濁し、15,0
00rpm 、10分間遠心分離した後、200 μl の水を加え煮
沸することにより核酸を抽出した。コレラ毒素産生コレ
ラ菌の標準株としVibrio Cholerae 569B株を培養し同様
に処理し検体として用いた。 （３）ＰＣＲ 反応液90μl に上記核酸溶液10μl 、実施例１のオリゴ
ヌクレオチド各 5μlずつをプライマーとして加え、コ
レラ毒素産生コレラ菌由来核酸の増幅を行った。反応液
組成は1mM ジチオスレイトール, 50mM KCl, 10mM Tris-
HCl(pH8.3), 1.5mM MgCl2, 0.01%(wt/vol)ゼラチン、そ
れぞれ0.2mM のdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびTth DNA
ポリメラーゼ40単位/ml である。反応条件は次の通りで
ある。はじめに94℃ 5分の変性処理を行った後、 熱変性： 94℃、 1分、 アニーリング：58℃、 2分 重合反応： 75℃、1.5 分 を30回繰り返した。これらの操作はパーキン−エルマー
／シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサ
イクラーを用いて行った。
【００１１】（４）検出 10μｌの反応液を 2％アガロースゲル電気泳動し、エチ
ジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出し
た。泳動の電気的条件は、定電圧100V、時間は30分行っ
た。操作方法並びに他の条件はManiatisらのMolecular
Cloning(1982)に記載の方法に従った。反応液の他に分
子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動度の比較によ
り、検出されたヌクレオチド断片の長さを算出した。 （５）結果 患者より得られた検体のＰＣＲ産物はプライマー(3)(4)
の組合せでは 372塩基、プライマー(5)(6)の組合せでは
318塩基を示し、コレラ毒素産生コレラ菌標準株と同じ
ヌクレオチド長を有していた。これは国内分離株の核酸
配列から計算されるヌクレオチドの長さとよく一致した
（表１）。
ジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出し
た。泳動の電気的条件は、定電圧100V、時間は30分行っ
た。操作方法並びに他の条件はManiatisらのMolecular
Cloning(1982)に記載の方法に従った。反応液の他に分
子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動度の比較によ
り、検出されたヌクレオチド断片の長さを算出した。 （５）結果 患者より得られた検体のＰＣＲ産物はプライマー(3)(4)
の組合せでは 372塩基、プライマー(5)(6)の組合せでは
318塩基を示し、コレラ毒素産生コレラ菌標準株と同じ
ヌクレオチド長を有していた。これは国内分離株の核酸
配列から計算されるヌクレオチドの長さとよく一致した
（表１）。
【００１２】
【表１】
【００１３】参考例１ 試薬キットの特異性の確認 実施例２の結果がコレラ毒素産生コレラ菌に特異的であ
ることを確認するために他の細菌についても実施例２と
同様の操作を行なった。他の細菌には下記表２の菌を用
いた。結果は表２のごとくコレラ毒素産生コレラ菌及び
コレラ毒素を産生することが確認されているナグビブリ
オ、ビブリオミミカス以外には増幅バンドは見られなか
った。
ることを確認するために他の細菌についても実施例２と
同様の操作を行なった。他の細菌には下記表２の菌を用
いた。結果は表２のごとくコレラ毒素産生コレラ菌及び
コレラ毒素を産生することが確認されているナグビブリ
オ、ビブリオミミカス以外には増幅バンドは見られなか
った。
【００１４】
【表２】
【００１５】実施例３ コレラ毒素産生コレラ菌核酸検出用プローブとして、5'
末端に、32P-リン酸基を有している核酸を含む実施例１
のオリゴヌクレオチド(2) を調製した。
末端に、32P-リン酸基を有している核酸を含む実施例１
のオリゴヌクレオチド(2) を調製した。
【００１６】（１）オリゴヌクレオチドの合成 リンカーアームを有するコレラ毒素産生性コレラ菌検出
用のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機 380A 型（アプ
ライド バイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダ
イト法により合成した。 塩基配列は以下のとおりである。 5'-AATAGGGGCTACAGAGAXAGATATTACAGT-3' 該配列中、Ｘは 5位にリンカーアームを有するウリジン
をしめす。この配列は配列表・配列番号１の配列の一部
のＴ部分をＸに置換したものである。この 5位にリンカ
ーアームを有するウリジンは、特表昭 60-500717号公報
に記載された合成法によりデオキシウリジンから化学合
成により調製しオリゴヌクレオチドに導入した。合成さ
れたオリゴヌクレオチドは27％アンモニア水で55℃、 4
時間脱保護処理を施した後、陰イオン交換高速液体クロ
マトグラフィーMono-Q FPLC （ファルマシア社）を用い
て精製した。0.2 μmol スケールの合成を行ない、約1
1.5Ａ260 （260nm における吸光度より求めた絶対量）
のオリゴヌクレオチドを得た。
用のオリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機 380A 型（アプ
ライド バイオシステムズ社）を用いて、ホスホアミダ
イト法により合成した。 塩基配列は以下のとおりである。 5'-AATAGGGGCTACAGAGAXAGATATTACAGT-3' 該配列中、Ｘは 5位にリンカーアームを有するウリジン
をしめす。この配列は配列表・配列番号１の配列の一部
のＴ部分をＸに置換したものである。この 5位にリンカ
ーアームを有するウリジンは、特表昭 60-500717号公報
に記載された合成法によりデオキシウリジンから化学合
成により調製しオリゴヌクレオチドに導入した。合成さ
れたオリゴヌクレオチドは27％アンモニア水で55℃、 4
時間脱保護処理を施した後、陰イオン交換高速液体クロ
マトグラフィーMono-Q FPLC （ファルマシア社）を用い
て精製した。0.2 μmol スケールの合成を行ない、約1
1.5Ａ260 （260nm における吸光度より求めた絶対量）
のオリゴヌクレオチドを得た。
【００１７】（２）標識オリゴヌクレオチドの合成 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献 (Nucleic Acids Research,14,6115,1986)に従って行
なった。リンカーオリゴヌクレオチド 1.0 A260 を 0.2
M NaHCO3 60 μｌに溶解し、ここへスベリン酸ジスクシ
ニミジル（DSS ）1.25mgを加えて室温、２分間反応させ
た。反応液を１mM CH3COONa (pH5.0)で平衡化したSepha
dex G-25 カラム (1cmφx30cm) でゲル濾過して過剰の
DSSを除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドを、更にモル比で 2倍等量のアル
カリ性ホスファターゼ (ベーリンガーマンハイム社)(10
0mM NaHCO3, 3M NaCl に溶解したもの)と室温、16時間
反応させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プ
ローブを得た。得られた標識プローブは、陰イオン交換
高速液体クロマトグラフィーMono-Q FPLC （ファルマシ
ア社）を用いて精製した。標識プローブを含む画分を集
め、セントリコン３０Ｋ (アミコン社）を用いて限外濾
過法により濃縮した。
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献 (Nucleic Acids Research,14,6115,1986)に従って行
なった。リンカーオリゴヌクレオチド 1.0 A260 を 0.2
M NaHCO3 60 μｌに溶解し、ここへスベリン酸ジスクシ
ニミジル（DSS ）1.25mgを加えて室温、２分間反応させ
た。反応液を１mM CH3COONa (pH5.0)で平衡化したSepha
dex G-25 カラム (1cmφx30cm) でゲル濾過して過剰の
DSSを除去した。末端のアミノ基が活性化されたリンカ
ーオリゴヌクレオチドを、更にモル比で 2倍等量のアル
カリ性ホスファターゼ (ベーリンガーマンハイム社)(10
0mM NaHCO3, 3M NaCl に溶解したもの)と室温、16時間
反応させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核酸プ
ローブを得た。得られた標識プローブは、陰イオン交換
高速液体クロマトグラフィーMono-Q FPLC （ファルマシ
ア社）を用いて精製した。標識プローブを含む画分を集
め、セントリコン３０Ｋ (アミコン社）を用いて限外濾
過法により濃縮した。
【００１８】（３）アルカリ性ホスファターゼ標識核酸
プローブの検討 この検討には、既に逆受身赤血球凝集反応（ＲＰＬＡ）
法、ELISA 法により毒素産生性が同定されているコレラ
菌株 109株（臨床分離株88株、環境分離株21株）を用い
た。各菌株をアルカリ性ペプトン水(pH8.4) に接種し、
37℃で一晩回転培養した。各菌液 2μ1 づつをナイロン
膜に滴下し、アルカリ条件で溶菌、ナイロン膜に核酸を
固定した。この膜を中和後ハイブリダイゼーションバッ
ク(BRL社)に膜を移し、25μl のアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識核酸プローブ液を含むハイブリダイゼーション
バッファー (5xSSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、0.5%ポ
リビニールピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム) 5m
l を加えてポリシーラーでシールし50℃15分間プレハイ
ブリダイゼーションを行なった。膜をポリバッグから取
り出し、洗浄液-1(1xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウム)
で50℃、 5分間で 2回、振とう洗浄した。更に洗浄液-2
(1xSSC, 1%トリトン X-100) で50℃、 5分間で 2回、室
温 5分間で 2回振とう洗浄した。最後に洗浄液-3(1xSS
C)で室温 5分間で 2回振とう洗浄した。膜を新しいハイ
ブリダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M Tris-H
Cl、0.1M NaCl 、0.1M MgCl2、0.3mg/ml、ニトロブルー
テトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフェリー
ルホスフェート、pH7.5 ) を入れポリシーラーでシール
し 37 ℃で１時間インキュベートした。アルカリ性ホス
ファターゼにより生じる紫色色素のスポットを目視によ
り判定した。
プローブの検討 この検討には、既に逆受身赤血球凝集反応（ＲＰＬＡ）
法、ELISA 法により毒素産生性が同定されているコレラ
菌株 109株（臨床分離株88株、環境分離株21株）を用い
た。各菌株をアルカリ性ペプトン水(pH8.4) に接種し、
37℃で一晩回転培養した。各菌液 2μ1 づつをナイロン
膜に滴下し、アルカリ条件で溶菌、ナイロン膜に核酸を
固定した。この膜を中和後ハイブリダイゼーションバッ
ク(BRL社)に膜を移し、25μl のアルカリ性ホスファタ
ーゼ標識核酸プローブ液を含むハイブリダイゼーション
バッファー (5xSSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、0.5%ポ
リビニールピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム) 5m
l を加えてポリシーラーでシールし50℃15分間プレハイ
ブリダイゼーションを行なった。膜をポリバッグから取
り出し、洗浄液-1(1xSSC, 1%ドデシル硫酸ナトリウム)
で50℃、 5分間で 2回、振とう洗浄した。更に洗浄液-2
(1xSSC, 1%トリトン X-100) で50℃、 5分間で 2回、室
温 5分間で 2回振とう洗浄した。最後に洗浄液-3(1xSS
C)で室温 5分間で 2回振とう洗浄した。膜を新しいハイ
ブリダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M Tris-H
Cl、0.1M NaCl 、0.1M MgCl2、0.3mg/ml、ニトロブルー
テトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフェリー
ルホスフェート、pH7.5 ) を入れポリシーラーでシール
し 37 ℃で１時間インキュベートした。アルカリ性ホス
ファターゼにより生じる紫色色素のスポットを目視によ
り判定した。
【００１９】結果を下表に示す。
【００２０】
【表３】 全体では感度９８．６％、特異性９４．７％と良好な結
果を得た。
果を得た。
【００２１】上記アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プ
ローブの特異性の特異性を下記菌に対して検討した。コ
レラ菌と同属のビブリオ属の菌と、コレラ菌と同様に下
痢起炎菌となりうる細菌、ヒト胎盤由来のDNA を用いて
クロスハイブリダイゼーションの有無を調べた。細菌は
全て臨床分離株を用い、適当な培地で増殖させ、実施例
８と同様の方法で測定した。結果はコレラ菌及びコレラ
毒素様毒素を産生することが確認されているナグビブリ
オ、ビブリオミミカスのみが陽性であった。以下に結果
を示す。
ローブの特異性の特異性を下記菌に対して検討した。コ
レラ菌と同属のビブリオ属の菌と、コレラ菌と同様に下
痢起炎菌となりうる細菌、ヒト胎盤由来のDNA を用いて
クロスハイブリダイゼーションの有無を調べた。細菌は
全て臨床分離株を用い、適当な培地で増殖させ、実施例
８と同様の方法で測定した。結果はコレラ菌及びコレラ
毒素様毒素を産生することが確認されているナグビブリ
オ、ビブリオミミカスのみが陽性であった。以下に結果
を示す。
【００２２】
【表４】
【００２３】
【発明の効果】本発明によりコレラ毒素産生コレラ菌を
迅速、簡便に特異的且つ高感度で測定することが可能と
なった。本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応のプラ
イマーとしても、直接検出用のプローブとしても用いる
ことが可能である。特に増幅反応では高い検出感度のた
め少量の検体からでもコレラ毒素産生コレラ菌を検出す
ることが可能で、その臨床的意義は大きい。
迅速、簡便に特異的且つ高感度で測定することが可能と
なった。本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応のプラ
イマーとしても、直接検出用のプローブとしても用いる
ことが可能である。特に増幅反応では高い検出感度のた
め少量の検体からでもコレラ毒素産生コレラ菌を検出す
ることが可能で、その臨床的意義は大きい。
【００２４】
配列番号：1 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：S 他の特徴：コレラ毒素産生コレラ菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 AATAGGGGCT ACAGAGATAGA TATTACAGT 30
列を有する。 配列 AATAGGGGCT ACAGAGATAGA TATTACAGT 30
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：S 他の特徴：コレラ毒素産生コレラ菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 TATCTTACTG AAGCTAAAGT CGAAAAGTTA 30
列を有する。 配列 TATCTTACTG AAGCTAAAGT CGAAAAGTTA 30
【００２６】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：コレラ毒素産生コレラ菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22
列を有する。 配列 GGTCAAACTA TATTGTCTGG TC 22
【００２７】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：コレラ毒素産生コレラ菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21
列を有する。 配列 ACTCATCGAT GATCTTGGAG C 21
【００２８】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：コレラ毒素産生コレラ菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 GCATATGCAC ATGGAACACC T 21
列を有する。 配列 GCATATGCAC ATGGAACACC T 21
【００２９】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..21 特徴を決定した方法：S 他の特徴：コレラ毒素産生コレラ菌の配列と相補的な配
列を有する。 配列 CATACTAATT GCGGCAATCG C 21
列を有する。 配列 CATACTAATT GCGGCAATCG C 21
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:63） (72)発明者 柴田 秀司 滋賀県大津市堅田二丁目１番１号 東洋紡 績株式会社総合研究所内
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１〜６（但し、Ａはア
デニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
てもよい。）に示す核酸配列を有するか、またはそれら
の相補的配列を有するコレラ毒素産生菌検出用オリゴヌ
クレオチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載のコレラ毒素産生菌検出
用オリゴヌクレオチドを標識化したコレラ毒素産生菌検
出用標識オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項１に記載のコレラ毒素産生菌検出
用オリゴヌクレオチドを標識化し、得られた標識核酸プ
ローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑
した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中の
コレラ毒素産生菌の検出法。 - 【請求項４】 請求項１のコレラ毒素産生菌検出用オリ
ゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマーとするかまた
は標識化して得られた標識核酸プライマーを、試料中の
ＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長させ、
得られたプライマー伸長物を測定することを特徴とする
試料中のコレラ毒素産生菌の検出法。 - 【請求項５】 請求項１のコレラ毒素産生菌検出用オリ
ゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プローブを含むこ
とを特徴とする試料中のコレラ毒素産生菌の検出用試薬
キット。 - 【請求項６】 請求項１のコレラ毒素産生菌検出用オリ
ゴヌクレオチドをそのままプライマーとするか、または
標識して得られた標識核酸プローブを含むことを特徴と
する試料中のコレラ毒素産生菌の増幅及び／または検出
用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4079800A JPH05276996A (ja) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4079800A JPH05276996A (ja) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05276996A true JPH05276996A (ja) | 1993-10-26 |
Family
ID=13700298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4079800A Pending JPH05276996A (ja) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | コレラ毒素産生菌検出用オリゴヌクレオチド、コレラ毒素産生菌の検出法及び検出用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05276996A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0669399A3 (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-22 | Shimadzu Corp | Oligonucleotides and methods for the detection of bacteria. |
| US5607835A (en) * | 1992-05-28 | 1997-03-04 | Florida State University | Species-specific DNA probes for vibrio cholerae and methods |
| WO2004055188A1 (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | Nichirei Foods Inc. | ビブリオコレラ又はビブリオミミカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
| KR100922217B1 (ko) * | 2007-05-23 | 2009-10-20 | 우석생명과학원(주) | 비브리오균 검출용 유전자 조성물 및 이를 이용한 비브리오균 검출방법 |
| KR100941990B1 (ko) * | 2007-07-20 | 2010-02-11 | 서강대학교산학협력단 | 콜레라－유발 비브리오 콜레라에 검출용 유전자 증폭키트및 마이크로어레이 |
-
1992
- 1992-04-01 JP JP4079800A patent/JPH05276996A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5607835A (en) * | 1992-05-28 | 1997-03-04 | Florida State University | Species-specific DNA probes for vibrio cholerae and methods |
| US6312891B1 (en) * | 1992-05-28 | 2001-11-06 | Florida State University | Species-specific DNA probes for Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae, methods and kits |
| EP0669399A3 (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-22 | Shimadzu Corp | Oligonucleotides and methods for the detection of bacteria. |
| US5795717A (en) * | 1994-02-28 | 1998-08-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| EP1036846A3 (en) * | 1994-02-28 | 2000-10-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
| US6218110B1 (en) | 1994-02-28 | 2001-04-17 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting verotoxin-producing E. coli and detection process |
| WO2004055188A1 (ja) * | 2002-12-13 | 2004-07-01 | Nichirei Foods Inc. | ビブリオコレラ又はビブリオミミカスの検出用プライマー及びプローブ並びにそれらを用いる検出方法 |
| KR100922217B1 (ko) * | 2007-05-23 | 2009-10-20 | 우석생명과학원(주) | 비브리오균 검출용 유전자 조성물 및 이를 이용한 비브리오균 검출방법 |
| KR100941990B1 (ko) * | 2007-07-20 | 2010-02-11 | 서강대학교산학협력단 | 콜레라－유발 비브리오 콜레라에 검출용 유전자 증폭키트및 마이크로어레이 |
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