JPH06502156A - 共有結合された生体高分子を含む親水性の外層によって被覆された固体表面、そのような表面を製造する方法、およびそのための共役体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 共有結合された生体高分子を含む親水性の外層によって被覆された固体表面、そ のような表面を製造する方法、およびそのための共役体 この発明は生体高分子の、親水化された表面への固定化、およびそのような生成 物に関する。ポリエチレンイミンを介して固体表面に結合された親水性の層は、 自発的吸着が低い。

タンパク質および他の生体高分子の固体表面への固定化は固相診断、バイオセン サを使用しての分析、アフィニティクロマトグラフィ、体外治療、および生物有 機合成のように多くの用途において確立された技術である。これらのすべての場 合、生体高分子は固体表面に結合し、そこではその生物学的活性は特定の目的の ために利用される。そのような応用の例は、固相診断、体外治療、生物学的合成 および移植の処理である。

固相診断において、抗体はしばしば通常ポリスチレンからなるプラスチック表面 に固定化される。体液と接触すると、固定化された抗体は、存在するかもしれな い抗原と結合する。抗体−抗原複合体は標識付けられた抗体によって検出される 。標識付けは放射性同位体、蛍光性の基または酵素共役体の形式であってもよい 。

体外治療において、生物学的に活性の物質は患者の血液がそれを介して導かれる チャンバに結合される。体外治療の現行の例は固定化された免疫刺激物質上を通 る血液潅流である。インターフェロンおよびインターロイキンはそのような物質 の例である。この技術によって治療され得る疾病の例は癌およびＡＩＤＳである 。

生物有機合成において、有機化合物を生成するために酵素が使用される。生物有 機合成のための適当な使用は、脂質転換、つまり通常は、トリグリセリドである 脂質を別のものに転換することである。多くの酵素は高価であり、頻繁な再利用 が、良好な処理の経済性を確実にするために必要とされる。そのために、固定化 された酵素の使用は多くの大規模な酵素処理にとって興味あるものである。

移植の治療において、生体高分子は生物学的組織と接触するようになる表面に結 合される。生体高分子、たとえばコラーゲンは、移植組織片上で、組織の成長を 促進し、細胞のコロニー化を刺激し、増大された生物適合性という結果をもたら す。この技術は細胞付着を向上するのに細胞培養皿の生体外での処理にもまた利 用され得る。

上に述べられたように、タンパク質の両有機表面および無機表面への固定化は今 日十分に確立された技術であり（７酵素の固定化の原理（Ｐｒｉコｃｉ、＋ｂ＋ 　ｏｆ　Ｉｉｍｏｂｉｌｉ＋ａ＋１ｏｑｏ：　Ｅｎｄ：ｕｓ　）　４　、ハンド ブック・オブ・エンザイム・バイオテクノロジー（ｉｌａ：＋ａ’＋ｏｏｋ　ｏ ｆ　ＥｎＢ！ｌｌｅ　Ｂｉｏ＋ｅｃｈｎｏ！ｑｇ７）、東２版、ニリス・ホーウ ッド・リミテッドＣ０１口→’ＪＴ’１ＯＯｄ　Ｌｉｚｉ：ｓａ　）　、１９８ ５年の４章を参照）、多量のタンパク質を、適当な生物学的活性を保持する一方 で、表面に結合することが可能である。

しかしながら、大抵の固体表面はタンパク質および他の生体高分子を自発的に吸 着するように設計されているということがわかった。水溶液における吸着は物理 力、つまり静電的引力および疎水性相互作用の２つの型によって主に促進される 。大抵の表面は、正常なｐＨで、負に荷電され、しかしながら通常疎水性領域を も含む。タンパク質は通常圧、負の両方の部分および疎水性の部分を有し、それ は一方で表面において正の部分および負に荷電された基の間での静電的な引力に よって、かつ他方でタンパク質の疎水性領域および表面の間の疎水性相互作用に よって、タンパク質は大抵の表面に牽引されるということを意味する。これはた とえば［生物医学的ポリマーの表面および界面の様子（Ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ 　Ｉ＋Ｎｅｒｌａｃｉｘｌ＾５ｐｅｃｊｓ　ｏｆ　Ｂｉｏａ＋ｅｄｉｃａｌ　ｉ ’ｏｌＹｗｅｔｓ）　ｊ　、出版者、Ｊ、Ｄ、アンドレード（１，Ｄ、Ａｎｄｒ ａｄｅ）、ブレニウムプレス（Ｐｉｅｎａｍ　Ｐｌｅａ＋）　１９８５年、第２ 巻、８１頁に説明される。

この非特異的吸着は上に述べられた応用にとって所望されない現象である。面相 診断において、それは弱められた感受性および診断用キットのより短い寿命を結 果としてもたらす。体外治療および生物有機合成の両者において、自発的吸着は 損なわれた活性およびより短い生成物の寿命をもたらす。

面体表面上の吸着タンパク質および他の生体高分子を徹底的に減する１方法は、 荷電されない親水性ポリマーの層を表面に与えることである。この目的のために 使用されてきたポリマーの１例はポリエチレングリコールであるが（Ｃ，−Ｇ、 ゴランダ（Ｃ，−Ｇ、Ｇ１１ｌａｎｄｅ＋）、「官能基化されたポリマー表面の 調製および特性（Ｐｒｅｐｕａ）ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｆｏｐｅ＋ｔｉｅ＋　ｏｆ 　Ｆｕｎｃ＋１ｏｎａｌｉｓｅｄ　Ｐｏ１７ｍｅｒ　５ｕｌａｃｅ）論文、ロイ ヤル・インスティチュート・オブ・テクノロジー（Ｒｏｌａｌ　１ｎｕｉ＋ｕｅ 　ｏｆ　ＴｅｃｈｎｏｌｏＨ）　、ストックホルム１９８６年を参照）、多糖類 のような他の物質、たとえばデキストラン、セルロースエーテルおよびデンプン 、ポリビニルアルコールおよび中性シリカゾルもまたこの目的のために使用され てきた。

荷電されていない親水ポリマーの層で表面を被覆することによって、静電的引力 および疎水性相互作用は両方とも回避され得る。

ポリエチレングリコールの尾を、固体ポリマー表面に付ける１方法は、まず表面 をいわゆる酸性エツチングにさらし、それから陽イオンポリマー、ポリエチレン イミンを表面に吸着し、最後に反応性ポリエチレングリコール誘導体をポリエチ レンイミン層における利用可能なアミノ基に反応させることである。この技術は ？ｒａｇ、Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｐｏ１ｌ：Ｉｌ、Ｓｃｉ、７４，１１３−１ｉ９　 （１９８７］に説明されている。濃硫酸中の過マンガン酸カリウムによって実行 される酸性エツチングの間、カルボン酸基およびスルホン酸基は硫酸エステルと 同様、表面に形成される。この高度に負に荷電したポリマー表面に、陽イオンポ リエチレンイミンは、静電力によってかなり強く結合される。さらに、ポリエチ レンイミンにおけるアミノ基と表面上のカルボン酸基およびスルホン酸基との間 の塩結合は、徐々に乾燥すると、アミド結合に転換され、それはポリエチレンイ ミドの表面へのさらにより強い結合を与えるようである。

たとえ上の論文において説明された技術によって製造された親水化された表面が 生体高分子の改良された忌避性を提供するとしても、その吸着は、多数の用途に とって未だ多すぎる。

この型の親水化された表面は、固定化されたタンパク質の上に述べられた応用に とってとりわけ大変興味深いものである。タンパク質をそのような表面に共有結 合するために、親水性の層にタンパク質の固定点として役に立つ反応性官能基を 導入することが必要である。しかしながら、タンパク質を完全に親水化された表 面に共有結合することは、たとえその表面が反応性基の高濃度を含もうとも、極 端に難しいということがわかった。親水性表面はタンパク質を引き付けない。反 対に、それは忌避体として作用する、なぜなら水溶液中のタンパク質がそのよう な表面に近づくのはエネルギ的に好ましくないからである。結果として、固定化 されたタンパク質の量は、固相診断のための抗体、体外治療のための免疫刺激物 質、または生物有機合成のための酵素のいずれかに関係なく低いであろう。

したがって、生体高分子を親水性の層に固定化する改良された方法が、自発的吸 着を低くするためにより高度に発展された親水性の層を製造する必要性と同様必 要とされる。

完全に発展された親水性の層は他方、望ましい生体高分子の導入をより困難にす る。

この発明に従って、望ましいポリマーの固定化を改良することが、同時に低い自 発的吸着の完全に発展された親水性の層を得る一方で、可能であるということが わかった。

この発明に従って、これは、以下によって達成され、ａ）　ポリエチレンイミン および少なくとも部分的に生体高分子に共有結合された非イオン性の親水ポリマ ー鎖からなる水溶性共役体を、アミノ基と反応することが可能であるアニオン基 を有する固体表面と反応させるか、またはｂ）　アミン基と反応可能であるアニ オン基を含む固体表面を、非イオン性の親水ポリマー鎖で置換されたポリエチレ ンイミンと反応させ、そこで、生体高分子は、純水の誘電率の１０％より小さい 誘電率を有する反応媒質の存在下において、非イオン性親水ポリマー鎖の反応性 基と反応させられるか、または Ｃ）　アミン基と反応する二とが可能なアニオン基を有する固体表面を、最終生 成物が使用される温度より少なくとも５℃高い、曇点を有する非イオン性親水ポ リマーから得られるアニオン親水ポリマー鎖で置換されたポリエチレンイミンと 反応させ、それはさらに生体高分子反応性の基を含み、そこで、生体高分子は、 それ自体公知の態様で水系反応溶媒において非イオン性ポリマーの反応性基に、 反応溶媒における非イオン性親水ポリマーの曇点より５℃以上低い温度で共有結 合される。

この方法によって得られる固体表面は、共有結合された生体高分子を有しかつ非 イオン性親水鏡からなる親水性外層により被覆されたおり、この非イオン性親水 鎖は、また、固体表面のアニオン基にアミノ基を介して結合されるポリエチレン イミンに結合される。この方法は、ポリエチレンイミンの重量に基づいて少なく とも５０％を構成するような量の親水非イオン性ポリマー鎖をたやすく導入する ことが可能であり、ゆえに自発的吸着が確実に低くなる。

まず水溶性共役体または親水非イオン性ポリマー鎖を有するポリエチレンイミン 誘導体を形成し、次にそれらを負に荷電した表面に吸着させることによって、濃 密な親水性の層が得られる。

この発明に従って、水溶性共役体は、まずポリエチレンイミンをアミノ基と反応 することが可能である基を有する非イオン性親水ポリマーと反応させることによ って合成され得る。そのような基の例は、オ千シラン環、アルデヒド基、スルホ ン酸エステル、トレンラード、メジラード、トシラート、塩化シアヌル、カルボ ニルイミダゾール、および活性なカルボン酸エステルである。ポリエチレンイミ ンにおける反応性アミノ基の非イオン性ポリマーにおける反応性基に対する割合 は、後者が低い結合数で結合するように調整される。

親水非イオン性ポリマー鎖をポリエチレンイミンに付ける別の方法は、後者にエ チレンオキシド、またはエチレンオキシドとプロピレンオキシド、ブチレンオキ シドおよび／またはテトラヒドロフランを所望された鎖の長さまで付加すること である。共重合が実行されると、反応物はランダムにもしくはブロックに、また はそれらの組合せに分配され得る。アルコキシル化が終わると、末端のヒドロキ シル基は上に述べられた反応性基のいずれかに転換される。

生体高分子は、それからそれ自体公知の態様でポリエチレンイミン誘導体に、親 水非イオン性ポリマー鎖上の反応性基と生体高分子上の官能基との間の反応によ って結合される。各親水非イオン性ポリマー鎖に結合される生体高分子の個数は 、生体高分子および親水非イオン性ポリマーの型ならびに固定化の所望された度 合に依存して広い限度内で変化してもよい。通常、親水ポリマー鎖の少なくとも ５％が共有結合された生体高分子を有する。非イオン性親水ポリマー鎖が生体高 分子と反応性である２つまたは３つ以上の基を有し得ると、たとえばそれらがセ ルロースエーテルから得られると、各鎖における共有結合された生体高分子の個 数は１より多くてもよい。そのような生体高分子のための多くの結合反応は、タ ンパク質のように、たとえばＶａｃ＋ｏｍｏ１．Ｃｈｅｍ、　Ｐｈ７＋、２５（ １９８５年）ｐｐ、　３２５−３７３のような文献に説明される。生体高分子の 結合は、通常反応媒質としての水中で実行され、ポリエチレンイミン誘導体が水 中で溶解され、固体表面に与えられないという事実によって容易になされる。こ の発明に従って、固定化は、もし反応環境においておよび代替的な製法ｂ）およ びＣ）において説明された状況下で実行されると、さらに促進され得、それは以 下により詳細に説明される。結合が終わると、残りの反応性基はある適切な態様 で親水非イオン性ポリマー鎖上で、たとえば２−メルカプトエタノールおよび２ −アミノエタノールとの反応によって反応され、アニオン基を有する固体表面へ の適用にふされしい水溶性共役体を結果としてもたらす。

生体高分子の結合は、まず親水非イオン性ポリマーを生体高分子に結合し、それ から結果としての生成物を上に述べられた態様でポリエチレンイミンと反応させ ることによって実行されてもよい。

タンパク質およびペプチドを結合するためにアミノ、チ不一ルまたはフェノール 性ヒドロキシル基が好ましくは使用され、それらはポリエチレングリコール鎖の 末端で電子性の反応性基と核攻撃によって反応する。そのような基の例はエポキ シド、アルデヒド、トレシラート、メジラードおよびトシラートのようなスルホ ン酸ニルチル、塩化シアヌル、カルボニルイミダゾールならびにカルボン酸エス テルである。糖タンパク質および炭水化物は、適切な基、たとえばアミノ基をポ リエチレングリコール鎖の末端に付け、かつ多塘類において、たとえば過ヨウ素 酸酸化により、もともと存在するかまたは生成されたアルデヒド基またはカルボ ン酸基と反応させることによって、逆に結合され得る。この技術は米国特許第４ ．２１７．３３８号に記載される。

得られる可溶性共役体は、次に負に荷電された固体表面に吸着するようにされる 。適切な表面の例は、本来、負の正味の電荷を有するもの、たとえばシリカおよ びガラス、または負の電荷が化学的または物理的手段によって生成されるもので ある。負の電荷は有機ポリマー表面に、たとえば酸性エツチング、つまり濃硫酸 における過マンガン酸カリウム、またはプラズマ誘導もしくは放射誘導されたア クリル酸またはメタクリル酸のようなアニオン成分の移植によって誘導され得る 。この目的に適当な有機ポリマーの例は、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリ エチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホンおよび 酢酸セルロースである。

生体高分子を、まず溶液中でそれを水溶性ポリマーに結合し、それから表面に可 溶性共役体を吸着することによる表面への固定化の方法は、以前に説明されてき た。ラン血清アルブミンへの結合はタンパク質およびペプチドに関してときおり 使用される技術であり、ＰＣＴ／′５Ｅ８８／’００２４３はこの目的のために 、疎水化された水溶性ポリマーの使用を、特に疎水化された荷電していない多糖 の使用を説明する。この発明は、しかしながら、新規なかつ改良された原理を開 示する。生体高分子を親水非イオン性ポリマー鎖の稠密な層を介して表面に結合 することによって、はとんど非特異的な吸着が起こらない荷電していない親水性 の裏表面が得られ、同時に、水相に届くスペーサアームに固定化される生体高分 子はたとえば、抗体−抗原反応に高い接近能力を有する。

この発明の方法は、親木非イオン性ポリマー鎖の層に、親水非イオン性ポリマー の固体表面への直接結合によって得られるよりもより高い、大変高い濃度を与え る。密に詰め込まれた親水性の層を得ることの難しさは、個々の親水非イオン性 ポリマーが互いにはじき合う点にある。同様の忌避性質はもちろんポリエチレン イミンが溶液中で親水非イオン性ポリマー誘導体と反応されるときにもまた発生 する。しかしながら、まず溶液中で親水非イオン性ポリマーとポリエチレンイミ ンとの間で移植ポリマーを生成し、次に生体高分子を結合し、最後にポリエチレ ンイミンを含むこの共役体を固体表面のもとへ吸着させることによって、すべて の親水非イオン性ポリマー鎖は、−これは生体高分子を結合したものおよび自由 な末端基を有するものの両者にあてはまる一水の側に押しやられる。二次元的に 見れば、水側への親水非イオン性ポリマー鎖の個数は、共役体がボに溶解された ときの２倍になるであろう。

この発明に従って、まず、アニオン基を有する固体表面を、非イオン性親水ポリ マー鎖によって置換されたポリエチレンイミンからなる上に述べられたボリニチ レンイミン誘導体で被覆し、それから生体高分子を非イオン性親水ポリマー鎖に おける反応性基を介して結合することもまた可能である。この技術によって、結 合は、純水の誘電率の１０％より少ない、好ましくは５％より少ない誘電率を有 する反応溶媒の存在において起こる。非イオン性親水ポリマー鎖が最終生成物が 使用される温度より少なくとも５℃高い曇点を有する非イオン性親水ポリマーか ら得られる場合、生体高分子は、反応溶媒における非イオン性親水ポリマーの曇 点より５℃以上低い温度で水系反応溶媒においてもまた結合され得る。生体高分 子を導入するこれらの方法は、スウェーデン国特許出願９００２９０９−１およ び９０４３９７−８にそれぞれ記載される。

低い誘電率を有する反応溶媒の特に好ましい形態は、ミクロニマルンヨンである 。ミクロエマルションにおける水の量は通常０．５−２５重量％、好ましくは１ −１５重量％である。

ミクロニマルンヨンにおける無極性の反応溶媒および疎水性成分は通常、脂肪族 炭化水素、たとえばヘキサンもしくはノナン、またはより広範な葦留フラクシコ ン、たとえば石油エーテル６０−８０である。ミクロエマルションの疎水性成分 は、６３−９８．５．重量％を構成する。

界面活性成分は通常界面活性化合物およびいわゆる界面活性助剤の組合せである 。界面活性助剤はアニオン性、カチオン性、両性または非イオン性であってもよ （、界面活性助剤は通常アルコールまたは低分子アルキレンオキシド付加物であ る。この型の従来の物質の例は、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、エ チレングリコールモノブチルエーテルおよびジエチレングリコールモノブチルエ ーテルである。界面活性成分の量は通常ミクロエマルションの重量の０．５−２ ０重量％を構成する。界面活性助剤を使用せずにミクロエマルションを形成する ことができる界面活性化合物を使用すると特に有利であることがわかっている。

この能力を有する界面活性化合物は、エチレンオキシドの重合によって、または エチレンオキシドおよびプロピレンおよび／またはブチレンオキシドの組合せに よって生成されたポリアルキレングリコール鎖を親水基として有するある非イオ ン性化合物であるとともに、炭化水素鎖上の末端でない位置にイオン性親水基を 有するあるイオン性化合物である。

非イオン性界面活性剤に関して、好ましい親水部分は最も好ましい場合平均で３ から８のエチレンオキシド単位の間の長さを有するポリエチレングリコール鎖で ある。疎水部分は全体で８−２０炭素原子からなるアルキル鎖、または９−２４ 炭素原子からなるアルキルアリール基を含むヒドロキシル化合物またはカルボキ シル化合物から得られてもよい。このような化合物の例はノニルフェノール、オ クチルフェノールおよび脂肪族アルコールのエチレンオキシド付加物である。

好ましいイオン性界面活性剤はスルホン酸、硫酸、カルボン酸、リン酸およびホ スホン酸のようなアニオン性基であり、スルホン酸が特に好ましい。所望ならば 、これらの界面活性剤はアニオン基と疎水基との間のカップリング剤としてエチ レンオキシドのようなアルキレンオキシド基を含んでもよい。疎水部分は全体で １０−２２炭素原子からなるアルキル鎖、または９−２４炭素原子からなるアル キルアリール基から構成されてもよい。２．３のエーテル、エステルまたはアミ ド結合が疎水部分で生じてもよい。適当なイオン性化合物の例は、１−４のエチ レンオキシド基を含むカルボキシメチル化されたノニルフェノールエトキシレー トおよびジ（２〜二チルヘキシル）スルホスクシネートである。

前述のように、非イオン水溶性ポリマーによって示された通常にはない温度依存 性を利用すること、および水性の環境で生体高分子を固定化することも可能であ る。それゆえ、ポリアルキレングリコールおよび非イオン性セルロースエーテル は上昇した温度で水溶性が低下する。この温度依存性の背後にある機構はまだ十 分に説明されていないが、エチレンオキシド基の：ンホメーンヨンが１度の上昇 に関係して変化し、エチレンオキシド基を特性において著しく疎水性にし、した がって低水溶性にする。所与の温度において、ポリマーの水溶性は極めて低いた め、溶液が相分離される。この温度は通常溶液の曇点と称される。ポリアルキレ ングリコールおよびセルロースエーテルはいずれも所定の曇点で生成され得、特 にその曇点が１０−１００℃、好ましくは３０−５０℃内にあるポリマーが有用 である。

非イオン性親水ポリマーはタンパク質により覆われた表面が使用される温度で親 水性であろう。それは曇点が、覆われた表面が使用される温度を少なくとも５℃ 、好ましくは少なくとも１０℃上回るように選択される。好ましいタンパク質固 定化温度は、反応媒質中での非イオン性親水ポリマーの凝集温度を３℃から５０ ℃まで下回る。

適当なポリアルキレングリコールの例は３−４炭素原子を有するアルキレンオキ シドおよびエチレンオキシド、またはテトラヒドラフランが、ランダムに分配さ れた、またはブロックに分配されたものである。特に適当なのは、２゜０００− １０，０００の分子量を有し、かつ３００−３゜０００の分子量を有するポリオ キシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロックを１つ以上含むポリアルキ レングリコールである。他の型の適当なポリアルキレングリコールは、グリセロ ールまたはペンタエリトリトールのようなジヒドロキシまたはポリヒドロキシ化 合物を含む、高級アルキレンオキシドまたはテトラヒドロフランと組合わされた エチレンオキシドの付加上である。

セルロースエーテルは好ましくはその１％水溶液が、２０℃でブルックフィール ド（Ｂｒｏｏｋｌｉｅｌり　、ＬＶ、　１２　ｒｐｍに従って測定された粘度１ ０−１０，０ＯＯｃＰ、好ましくは３０−５，０００ｃＰを有するような重合度 を有する。これらはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ベンジルおよび８−２ ４炭素原子を有する高級炭化水素基のような疎水性炭化水素基、またはヒドロキ シエチル、ヒドロキシプロピルおよびヒドロキシブチルのような極性のヒドロキ シル基、または炭化水素基および極性基の組合せを含んでもよい。適当なセルロ ースエーテルの例は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチル セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロー ス、メチルヒドロキシプロピルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース およびベンジルエチルヒドロキシエチルセルロースである。アルキルヒドロキシ アルキルセルロースが好ましいセルロースエーテルである。

親水ポリマー鎖を有するポリエチレンイミンは、少なくとも９０重量％までが、 −Ｃ，、ＨＮＨ−１−Ｃ２Ｈ４Ｎお　４ および−Ｃ２Ｈ４ＮＨ２のユニットによって組立てられる分子量１０，０００− １．０００．０００、好ましくは５０．０００−５００，０００のポリエチレン イミン骨格からなり、そこにおいて、好ましくは２０％より少ないイミノおよび アミノ基の反応性水素が、親水ポリマー鎖、および任意に、アルキル基のような 他の置換基、または親水ポリマー鎖の移植に使用されるヒドロキシル基含有有基 よって置換される。親水ポリマー鎖は、ポリエチレングリコール、またはエチレ ンオキシドと３−４炭素原子を有するアルキレンオキシドとの間でランダムに分 配された、もしくはブロックに分配されたポリアルキレングリコールのような非 イオン性アルキレンオキシド付加物、またはテトラヒドロフランから適当に得ら れる。他の型のアルキレンオキシド付加物は、グリセロールおよびペンタエリト リトールのようなジヒドロキシまたはポリヒドロキシ化合物を含む、高級アルキ レンオキシドまたはテトラヒドロフランと任意に組合わされたエチレンオキシド 付加物である。デキストランおよび澱粉のような多糖類と、メチルセルロース、 メチルヒドロキシプロピルセルロース、またはエチルヒドロキシエチルセルロー スのようなセルロースエーテルと、ポリビニルアルコールとが他の適当な親水ポ リマーである。

親水ポリマー鎖は水溶性であり、それらの分子量は通常４００から２００．００ ０、好ましくは１，０００から１０ｏ、ｏｏｏである。

この発明は以下の例によってさらに示されるであろう。

例１ ２Ｘ２ｃｍの寸法を有するポリエチレンプレートが超音波浴において３分間７０ ％エタノール中で洗浄された。プレートは空気乾燥され、２ｇ／ｌのＫＭｎＯ４ ／Ｈ２Ｓ○４で３０秒間酸化された。プレートは蒸留水で洗浄された。

３２０工チレンオキシド単位をジ（トリメチロールプロパン）へ添加することに よって得られた１０％のニポキシ化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および５ ％のヒトアルブミンを含む溶液が、ｐＨ７，０，３０℃で１５時間反応され、そ こでｐＨが水酸化ナトリウムによって９．５に調整された。ポリエチレンイミン （ＰＥＩ）は最終濃度０゜０７％まで添加され、攪拌されながら４５℃で反応さ れた。

２．５時間後、ポリエチレンプレートは溶液中に置かれ、アルブミン−ＰＥＧ− ＰＥＩ複合体は４０℃で２時間吸着させられた。

平行して、ＰＥＧ−ＰＥ　Ｉ付加物のみ上記のように合成され、ポリエチレンプ レートは親水化された。未反応のエポキシドはメルカプトエタノールと反応され た。反応されたＰＥＧ−ＰＥ　Ｉ付加物へもアルブミンが付加され、フリーのア ルブミンの共重合体はポリエチレンプレートに吸着させられた。ＰＥＧＩの厚さ は、偏光解析法によりまずＰＥ１１のみの厚さとＰＥＧ−ＰＥＩ層の厚さを測定 し、そこで前者の値が後者の値から減算されることによって２７ｎｍに測定され た。

結合されたアルブミンの量はアルブミンに対するペルオキシダーゼ共役抗体を使 用するＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって検出された。吸着されたタンパク質の量は４９ ０ｎｍｌこおける吸光Ｉに比例する。結果は以下のとおりであった。

サンプル　ＯＤま９５ユｍ　ハ虹胆１　ｍ１ｌｋ！！この発明に従った 固定化されたアルブミン　１．２６５　７８対照、アルブミンなし　Ｏ，０５４ ７ｇ対照、アルブミンあり　３．１７ｇ　７！これらの結果はこの発明に従った プレートが高い含量のアルブミンを有するということと、親水１は生体高分子の 自発的吸着が少ないということとを示す。

例２ ポリスチレンの９６−ウェルのミクロタイタープレート（：ｎｉ：：ｏ＋１ｔｓ ｒ　）ｌｉｆｅ）がクロトン酸およびガンマ放射線によって移植された。

０．０７％ポリエチレンイミンおよび分子量７，０００の１０％のトレシラート 化されたポリエチレングリコールを含む溶液が３７℃、ｐＨ９，０で２時間反応 された。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）が１％の濃度まで添加され、３７℃でさら に３時間反応させられた。溶液はミクロタイタープレートへ分配され、４０℃で ２時間吸着させられた。

平行して、ＰＥＧ−ＰＥ　Ｉ付加物のみ上述のように合成され、マイクロタイタ ープレートが親水化された。未反応のトレシラート基が１ｓ丁＞酸化ナトリウム で反応された。

結合されたＩｇＧの量はＩｇＧに対するペルオキシダーゼ共役抗体を使用Ｔるに ＥＬＩＳＡ法によって検ａされた。

次の結果が得られた。

サンプル　ＯＤ　４９５　コｍ　ＰＥＧ／ＰＥＩ重量〜この発明に従った 固定化されたＩｇＧ　０．９８３　８Ｑ対照、ＩｇＧなし　０．０２６　８０ これらの結果はＩｇＧの高い固定化と親水層への低い自発的吸着を示す。

例３ ２Ｘ６ｃｍの寸法を有するＰｖＣプレートが例１のポリエチレンプレートと同じ ように活性化された。

２％フィブリノーゲンと、３５℃の曇点を有し、両端にエボ午シト基を備えたエ チレンオキシドおよびプロピレンオキシドの５％のブロックポリマーを含む溶液 が、３７℃、ｐＨ７，０で８時間反応させられた。そして、ｐＨが水酸化ナトリ ウムで９．５に調整され、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が最終濃度０．０３％ まで添加された。反応は攪拌されながら４５℃で２．５時間進行させられ、次に 活性化されたＰｖＣプレートは溶液中に浸漬され、フィブリノーゲン−ブロック ポリマー−ＰＥ　Ｉ複合体が１時間、４０℃で吸着させられた。

参照として、タンパク質を含まないブロックポリマー−ＰＥＩ付加物によって親 水化されたＰＶＣプレートが使用され、そこにおいていかなる残留エポキシド基 もＩＭのＨＣｌＯ４を使用する１時間の処理によって反応された。ブロックポリ マー層の厚さは偏光解析法によって、まずＰＥＩの層の厚さおよびブロックポリ マー−ＰＥ１層の厚さを測定し、そこで前者の値が後者の値から減算されること によって３Ｑｎｍと測定された。

結合されたフィブリノーゲンの量はフィブリノーゲンに対するペルオキシダーゼ 共役抗体を使用するＥ　Ｌ　ｌ−８Ａ法によって検出された。

この発明に従った　１．６０５　７５ 固定化された フィブリノーゲン 対照、フィブリノーゲ　０．０７０　了５ンなし これらの結果はフィブリノーゲンの高い固定化と低い自発的吸着を示す。

１際調査報告 ＋＋１＋＋ｓ＋＋Ｉｍｍ　Ａ＋＋ｍｌｃｓｌ１ｍ　ｌｌａ　ＰＣゴ／ＳＥ　９１ １００７０１国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１１１０８　 Ａ　２１２１−４ＢＩ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．共有結合された生体高分子を有し、かつ非イオン性ポリマー鎖からなる親水 性の外層で覆われた固体表面を作る方法であって、 ａ）ポリエチレンイミンおよび少なくとも部分的に生体高分子に共有結合され、 非イオン性親水ポリマーからなる水溶性共役体を、アミノ基と反応することが可 能なアニオン基を有する固体表面と反応せしめるか、またはｂ）アミノ基と反応 することが可能なアニオン基を有する固体表面を、非イオン性親水ポリマー鎖に よって置換されたポリエチレンイミンと反応せしめ、その上に生体高分子が、純 水の誘電率の１０％より低い誘電率を有する反応媒質の存在下で非イオン性親水 ポリマー鎖の反応性基と反応させられるか、または ｃ）アミノ基と反応することが可能なアニオン基を有する固体表面を、最終生成 物が使用されるべき温度を少なくとも５℃上回る曇点を有する非イオン性親水ポ リマーから得られ、かつさらに生体高分子と反応性基を含むアニオン性親水ポリ マーによって置換されたポリエチレンイミンと反応せしめ、その上、生体高分子 が、反応媒質における非イオン性親水ポリマーの曇点を５℃より多く下回る温度 で水系の反応媒質中、非イオン性ポリマーの反応性基と本来既知の態様で共有結 合されることを特徴とする、方法。
2. ２．生体高分子は、アミノ、チオールまたはフェノール性ヒドロキシル基を介し て親水非イオン性ポリマー鎖のエポキシド基、アルデヒド基、スルホン酸エステ ル基、塩化シアヌル基、カルボニルイミダゾール基またはカルボン酸エステル基 へ結合されたタンパク質またはペプチドであることを特徴とする、請求項１に記 載の方法。
3. ３．生体分子は親水非イオン性ポリマー鎖において既存の、または生成されたア ルデヒド基またはカルボン酸基を介してＮＨ２基へ結合された炭水化物残基を含 む炭水化物または生体高分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. ４．ポリエチレンイミンは１０，０００−１００，０００の分子量を有すること と、親水非イオン性ポリマー鎖は４００−２００，０００の分子量を有するセル ロースエーテルまたはアルキレンオキシド付加物の鎖であり、親水非イオン性ポ リマー鎖の量はポリエチレンイミンの重量の少なくとも５０重量％であることと を特徴とする、請求項１−３のいずれか１つに記載の方法。
5. ５．固体表面は、水溶性共役体のアミノ基とまたはポリエチレンイミン誘導体の アミノ基と反応するカルボキシル基またはアルデヒド基によって活性化された、 ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポ リカーボネート、ポリスルホンまたは酢酸セルロースからなることを特徴とする 、請求項１−４のいずれか１つに記載の方法。
6. ６．共有結合された生体高分子を有し、かつ非イオン性ポリマー鎖からなる親水 性の外層で覆われた固体表面であって、非イオン性ポリマー鎖はポリエチレンイ ミンに共有結合され、ポリエチレンイミンはさらにアミノ基と反応することが可 能なアニオン基を備えた固体表面へ結合され、非イオン性ポリマー鎖の重量がポ リエチレンイミンの重量の少なくとも５０％であることを特徴とする、固体表面 。
7. ７．生体高分子はアミノ、チオールまたはフェノール性ヒドロキシル基を介して 、親水非イオン性ポリマー鎖のエポキシド基、アルデヒド基、スルホン酸エステ ル基、塩化シアヌル基、カルボニルイミダゾール基、またはカルボン酸ニステル 基へ結合されるタンパク質であることを特徴とする、請求項６に記載の固体表面 。
8. ８．生体高分子は、既存の、または生成されたアルデヒド基またはカルボン酸基 を介して、親水非イオン性ポリマー鎖のＮＨ２基へ結合される炭水化物残基を含 むことを特徴とする、請求項６に記載の固体表面。
9. ９．ポリエチレンイミンは１０，０００−１００，０００の分子量を有すること と、親水非イオン性ポリマー鎖は４００−２００，０００の分子量を有するセル ロースエーテルまたはアルキルオキシド付加物の鎖であり、親水非イオン性ポリ マー鎖の量がポリエチレンイミンの重量の少なくとも５０重量％である二ととを 特徴とする、請求項６−８のいずれか１つに記載の固体表面。
10. １０．固体表面は、水溶性共役体のアミノ基とまたはポリエチレンイミン誘導体 のアミノ基と反応するカルボキシル基またはアルデヒド基によって活性化された 、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、 ポリカーボネート、ポリスルホンまたは酢酸セルロースからなることを特徴とす る、請求項６−９のいずれか１つに記載の固体表面。
11. １１．ポリエチレンイミンと、かつ少なくとも部分的に生体高分子と共有結合さ れる非イオン性親水ポリマー鎖からなることを特徴とする、水溶性共役体。
12. １２．親水非イオン性ポリマー鎖の重量はポリエチレンイミンの重量の少なくと も５０重量％であることを特徴とする、請求項１１に記載の水溶性共役体。
13. １３．生体高分子は、アミノ、チオールまたはフェノール性ヒドロキシル基を介 して、親水非イオン性ポリマー鎖のエポキシド基、アルデヒド基、スルホン酸エ ステル基、塩化シアヌル基、カルボニルイミダゾール基またはカルボン酸エステ ル基と結合されるタンパク質またはペプチドであることを特徴とする、請求項１ １または１２に記載の水溶性共役体。
14. １４．生体高分子は、既存の、または生成されたアルデヒド基またはカルボン酸 基を介して、親水非イオン性ポリマー鎖のＮＨ２基へ結合される炭水化物残基を 含む炭水化物または生体高分子であることを特徴とする、請求項１１および１２ に記載の水溶性共役体。
15. １５．ポリエチレンイミンは１０，０００−１００，０００の分子量を有するこ とと、親水非イオン性ポリマー鎖は４００−２００，０００の分子量を有するセ ルロースエーテルまたはアルキレンオキシド付加物の鎖であり、親水非イオン性 ポリマー鎖の量がポリエチレンイミンの重量の少なくとも５０重量％であること とを特徴とする、請求項１１−１４のいずれか１つに記載の水溶性共役体。