JPS6069100A - 担体上への生物学的高分子の固定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、担体上への生物学的高分子の固定方法に関す
る。

固体担体上に固定された生物学的高分子の使用は、医学
、生物学齋宛、生物工学または化物・医学工学の分野に
おける数多くの要求に応えていることが知られている。

関係する高分子は、たとえば、変換すべき溶液を処理す
る生命反応器を作る時に使用されるような型の酵素であ
る。それはまた、例えば、放射線免疫学、または酵素免
疫学測定に使用される管または球の上に固定された抗体
である。

同様に、生物学的高分子の大部分は、それらの天然のリ
ガンドのクロマトグライーのために一定の同位相で使用
される。すなわち、受容体を浄化するためのホルモン、
酵素を浄化すルための基盤、抗体のための抗原またはそ
の逆。

今までこの様な高分子を固定するために使用された方法
は２つの概念に基づいていた。すなわち、主として次の
ようなものである。

１　担体および固定すべき高分子は、互いに反応し得る
適当な機能を呈することが必然的に前提となる化学的連
結。従って、もしそれが重合体の担体であれば、あるい
はこの重合体の合成時に、あるいは後に、高分子内に存
在する反応機能（たとえば、アミン機能）と共に反応す
るようにされている反応機能（たとえばカルボキシル基
の）を、カルボジイミドやアルキルクロロカルボナート
のような標準的な活性剤で出現させることが出来る。同
様に、担体上にアミン機能を出現させることが出来る。

この機能は、高分子上にすでに存在している反応機能（
たとえばカルボキシル基機能）に前もって連結されてい
る機能である。従って、強塩基によって処理されたポリ
アミド（“ナイロン″）は表面上を部分的に加水分解さ
れ、カルボキシル基機能またはアミン機能が出現するが
ままにする。これらの機能は、ポリアミド型の担体上に
固定すべき高分子中にすでに存在しているアミン機能ま
たはカルボキシル基機能と共にそれぞれ反応することが
可能である。

同様に、クロマトグラフィー（１体として非常によく使
用される一群の多糖類内に、周３υｊ的陰イオンまたは
臭化シアンによって反応集団を新たに作り出すことが出
来、この一群の多糖類上に高分子のアミン機能が重なる
ことが可能である。従って、ジアゾ５屯角吉、セミキノ
二／１こよるＸｉ。

合、等のような化学連結に基づいたこの第１の概念を明
らかにする実施例をふやすことが可能であろう。

２、　ある一定の担体に対する若干の高分子の１１穎誌
された親和力。

その際固定は、共有原子価ではない）６合によって自然
に行なわれる。最もよく知られているケースは、ポリビ
ニル゛よたはポリスチレン型の、疎水性重合担体上に付
着している抗体（免疫グロブリン）のケースである。ま
たガラス質の担体上に自然に付着している陽イオンペグ
チドのケースも知られている。

上記された方法は、有利な面と不都合な面の両方を呈示
している。

第１のケースでは、堅固、な結合を得ること力Ｓ出来る
が、しかしそれは担体上での化学的操作によってであり
、この操作は大規模になると常に実現可能ではなく、ま
た可能な担体の種類を制限する。

第２のケースでは、応用の範囲が、一定の担体に対する
一定の高分子の親和力に左右さ４１．、この特性がすべ
ての担体にまで広げることが出来ないことから、より一
層制限される。その上、得られた表面はもろ（、一定の
時間が過ぎると不安定になる。さらに、どちらの場合に
おいても、固定すべき高分子の量を抑制することは出来
ない。

本発明は、上記された従来の方法の障害をあらかじめ除
去し、一方では、任意の生物学的高分子の任意の担体上
における堅固な耐久性のある固定が、他方では、この高
分子の一定の量の制御が可能である方法を目的としてい
る。

本方法は主に、固定すべき生物学的高分子をベースとし
た、またはこれに化合した、または結合された重合構造
を、前記の高分子の親和力よりも高い親和力を担体に対
して有する被覆を形成するために、作ることから成り立
つことによって特徴づけられる。

実施可能な方法に従って、被覆は、固定すべき生物学的
高分子の互いの重合から結果と１７で生じる生成物によ
って作られる。

実際、出願人は、担体に対してほとんど親和力を持たな
い若干の生物学的高分子が、それらが重合された状態に
ある時この担体に対してより高い親和力を示すことを発
見した。

実現可能なもう一つの方法によって、およびさらにすぐ
れた固定を確実にするために、高分子を生物学的高分子
に連結または化合させ、担体に対して必要な親和力を有
する高分子の重合構造を実現する。

さらにもう一つの実現可能な方法によって、連結、立体
重合および（または）重合によって固定される生物学的
高分子に対して、新しい担体を構成するようにして、上
記担体上に、この担体に対してすぐれた親和力を持つ被
覆を作る。

これら実施方法を、一定の担体に対して弱い親和力を持
つことで、またはこの担体上に固定しにくいことで知ら
れる生物学的高分子をＡで示すことによって、次の仕方
で明らかにすることが出来る。

一実現方法に従って、本発明による方法はこの高分子Ａ
をそれ自体と重合させることによって成り立つ。担体上
に作られた被覆は、その際単量体の付着力よりも極めて
高い付着力を示す。

もう一つの実現の方法に従って、高分子へに高分子Ｂを
連結させるかまたは結合させ、重合または立体重合の操
作の後、高い付着力を示す−まとまりの重合体を得る。

−さらにもう一つの実現の方法に従って、連結、立体重
合または重合の後、Ａを受け取り、Ａを固定することに
なっているＢ（重合された、または重合されていない）
によって担体上に被覆を作る。その１察全体は強力に付
着した最終的な被覆を形成する。

本発明に従って行なうことによって、下で見るように、
担体上に固定すべき生物学的高分子の量の制御または調
節が可能である。

本発明は、抗体（免疫グロブリン）、抗原血清アルブミ
ン、オバルアルブミン、膠原質、カゼイン、酵素、ホル
モン、ヘパリンのような生物学的活動状態の多糖類、同
じくビールス、バクテリア、微住物、亜細胞部分、等の
ようなあらゆる型の生物学的高分子に応用ｉｉｊ能であ
る。

同様に本発明は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビ
ニルおよびその類似物のような銅鉄、ガラス、プラスチ
ック材のあらゆる担体にも、形態や大きさを制限するこ
となく応用７ｓＪ能である。

重合または立体重合は、カルボジイミド、アルデヒド（
グルタルアルデヒド）、ヒドロキノン等のような従来か
ら使用されている作用体の１つによって行なわれ得る。

有利な特性にょって、今よでは生物学的高分子の重合に
おいては利用されなかった反応体の種類、すなわち２塩
化スクシニールのような２塩化ジアジド、が使用される
た゛ろう。

次の各実施例は本発明の少しも制限的でない実例として
示されている。

実施例　１ ポリスチレンの管上への抗体の直接固定うさぎおよび他
の種類の動物の抗体は多かれ少なかれポリスチレンおよ
び（ｉ１２のプラスチック材（ポリビニール、ポリカル
ボナート、等）に安定して付着することが知られている
。この現象は、とりわけ免疫分析（放射線免疫学の測定
または免疫酵素学の測定）の分野において数多くの応用
の基礎となっている。

本実施例は、本発明によるこの固定の安定性を明らかに
している。

ポリスチレンの管（溶血用の管１３Ｘ７５Ｔｔｍ）は、
中性または弱アルカリ性のパッドの中に０１り／−の抗
体の溶液を受け取る。室温での４時間の培養の後、・百
の表面はＩ　ＣＪあたり約１μ？の抗体を吸着した。

固定を安定させるために、および本発明に従って、 一管を乾燥させる、 一乾燥した管を２塩化スクニルの飽和蒸気圧にさらして
抗体の重合を行なう。

一水で濯ぎ、乾燥させる。

固定が安定されたこと、すなわち、抗体は゛トリトンＸ
１００”のような消毒剤の存在下においてさえ、もはや
取り除かれ得ないことが確認された。

実施例　２ “中１継網”を使用する抗体の間接固定および固定され
た抗体の量の制御 実施例１に従って固定される抗体の骨は、担体の表面の
吸着能力によってだけ決定され、抗体の溶液の濃度およ
び培養の時間の複合した方法に左右される。この実施例
１に記載されたやや異なった方法は、抗体の過剰か望ま
しい反応に有利に応用される。

抗体の滑を制御したい時、これは免疫学的測定において
必要であるので、本発明に従って、次の方法で行なう。

一燐酸塩５　ｍＭｐ　Ｈ７，３のパッド中に、アルブミ
゛・の濃縮液６ｍｙ／づを調整する。

一活性化されたビオチンをジメチルホルムアミドの中で
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって１０り／　ｎｒ
ｌの割合で溶解し、この溶液をアルブミンの溶７（Ｊ＋
００ｍ６に対して１．５６　ｍｅ加え、ついで室温で１
時間培養させることによって、アルブミン上にビオチン
をＩａｆｆｉする。

−ビオチンの超過を透析する。

一結果として生じる廓質の重合は、その際次の方法で行
なわれる。すなわち、ビオチンに連結されたアルブミン
の溶液を１　？／Ｒに調節し、モルホリノ・エタン・ス
ルフオニクのパッド２０１１１ＭをｐＨ５，５に調節す
る。１−エチル−３゜３−ジメチルアミノプロピルカル
小ジイミ１″ドを１７／２加え、１時間攪拌する。新た
にカルボジイミド１２／λを加え、さらに１峙間攪拌す
る。

一結果として生じる重合された溶液は次に烟・酸塩０．
０５Ｍ１．Ｈ７，３ノハットノ中テ１０　ｒａｇ／ｆＬ
に希釈され、ついでこの溶液はポリスチレンの（または
ポリエチレンの）各管内に分配され、そこで室温で１６
時間滞留する。こうして、層の固定が得られ、この層を
ＮａＣ１の、８液０．１５　Ｍによって２回濯ぐ。

一次に、これらの管の中に、同じ）斉酸塩０．０５ＭＰ
Ｈ７のパ゛ンド中のアビジン（ｅｌ　ｊｆ　５　ｍｙ　
／　ｆｌを自己分する。１６時間後、管は空にされ、；
譬酸塩ＩＱ　ｍＭ　、　ＮａＣＩＱ、　ｌ　５　Ｍ　、
窒化ナトリウムｌ　Ｑ　ｍＭ、ｐＨ７，３のパッドの溶
液で濯がれ、そのまま保存されるかまたは室温で乾燥さ
れる。こうしてアビジンの層はビオチンにしっかりと固
定され、本発明によって研究された網が形成される。

−別の操作において、ビオチンに結合された抗体を、−
５ＥＰＨＡＤＥＸ　ａｏ　２５　”　上チク０７　）　
クラフィーによってビオチンの過剰を注意深く除去しな
がら、アルブミンに役だったのと同じ手１１１４で調製
する。

一抗体は、燐酸塩］Ｑ’ｍＭ、窒化物Ｉ　Ｑ　ｍＭ　、
　ＮａＣ１１５ＱｍＭＳｐＨ７，３、アルブ°ミン０．
１ｙ／ｆ！、のパッドの中で望ましい濃度（特に０．０
１〜００５ｒグ／ｉｔ）に希釈される。

一ビオチンが結合した血清アルブミンとアビジンによっ
て処理された各管はそこで抗体の溶液を受け取る。１６
Ｂ：４間後、ビオチンが粘合した抗体は定量でアビジン
に固定され、ついでＮ　ａ　ＣｉＯ，１５Ｍで清かれ、
乾船される。

この固定は確実で耐久力がある。

実施例　３ 同じ手順（同じ溶液、同じ’Ｂ　４時間）が、必要な密
度で（１ミクログラム／ｃｎｙまで）、ラテックスの球
の上に抗体または抗原を固定するために使用される。こ
れらの球は、それらの大きさく０から２００μまで制限
なし）に従って使用され得る。すなわち、 一試験・冴内の診断テストにおいて、通常、梅毒。

のために使用されるテストとして。

−細胞浄化の装置として。この型のノ１５用において、
好ましくは磁気法が選択されるだろう。これらの球は、
浮遊状態の細胞を含んでいるｇ器の中で、細胞か球によ
ってもたらされた抗体によって固定されるまで、まず、
攪拌される。次に磁場は球を上の方に引き寄せるのに利
用され、−刃固定されない細胞は下の方に沈澱する。

この様な装置はたとえば、移植のために人間の髄の片鱗
を浄化するために役立ち得る。

実施例　４ 一生命資材上へのヘパリンの固定 ヘパリンの固定は、あるいは人工補整術の場合において
、あるいは体外使用（たとえば腎臓透析）の場合におい
て、血液と接触する資桐の迎合という古い問題の解決を
１指している。ヘパリンの表面活性と血液凝固を防ぐと
いう特性は資材と接触する時の血液の凝固を妨げる。ヘ
パリンの固定は次の各条件で実現されることが可能であ
る。

一アルブミン１？／におよびヘパリン１ｔ／２を含有す
る溶液をモルホリノエタン・スルフオニツク５０　ｍＭ
ｐＨ５，５のパッドの中で調製スる。

重合は１−エチル−３−３°ジメチルアミノプロピルカ
ルポジイミドＩｆｆ／ｆｌで行なわれる。重合の１時間
後、溶液は１０倍に希釈される。

アルブミン−ヘパリンの共同重合体の有効な固定を得る
には、その際資材を４時間浸すだけで十分である。疎水
性が不十分な資材の場合には、またはガラス上では、乾
燥の後実施例１に記載されたように２塩化スクシニール
の蒸気にさらすことによって処理を完全なものにするこ
とが出来る。アビジン−ビオチンの中継も実施例２にお
けるように使用され得る。

短曲管、フィルター、腎臓透析のモジュール、ペレット
、コンタクトレンズはこのようにして処理され得る。

また非常に特別に、本発明による方法は、球（特にポリ
エチレンの）の生物学的高分子によって被覆を得ること
が出来ることが確認されるだるう。この球は弱い密度（
球が使用される溶媒中または媒質中の密度よりも低い）
を示し、従って、現在では自由に処分用；７６　、、ｊ
＝、そしてそのすべての有用性が認められるであろう生
成物に通じている。従って、これらの球は新らしい工業
的生成物である。本発明は少しも制限的でなくもっばら
実例としてしか記載されていす、あらゆる有効な変更が
その範囲を出ることなくもたらされ得ることはいうまで
もないことである。

代　理　人　安　達　光　雄゛゛　” 同　安　ｊ幸　！　：；：：′：”ｌ。

手続補正用・ 昭和σ年＼ｒ月７０　［Ｆ Ａ′″ＬＩ−二へ■１移樗杓愕金）υｌ；ＩＬＪ３、補
正をする者 事イ！Ｉとの関係　ｈ　行来ａ＊　、（≠−≠←手許弔
ト ４代理人 住　所　大阪市四区ｌ［戸堀１丁目２２番３２号窪訴０
６）４４１−１８１６・４４４４５３０）　、１４．７
ｙ　−、。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １一方において、担体上に生物学的高分子の確実な耐久
   力のある固定を、他方においてはこの高分子の固定され
   た量の制御を可能にする方法であって、主に、前記の生
   物学的高分子をベースとしたまたはこれと化合したまた
   は結合した重合構造を、担体に対して前記高分子の親和
   力よりも高い親和力を有する被覆を形成するために、実
   現することによって成り立つことを特徴とする方法。 ２　被覆゛は、固定すべき生物学的高分子の互いの重合
   から結果として生じる生成物によって行なわれることで
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３　問分子を前記の生物学的高分子に連結または化合さ
   せ、前記の担体に対し−（必要な親和力を有する高分子
   の重合構造を実現することを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４、　連結、立体重合および（または）重合によって固
   定される前記の生物学同高分子に対して新しい担体を作
   るようにして、上記担体上に、この担体に対してすぐれ
   た親和力を有する被覆を作ることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ５、連結、立体重合および（または）重合は、カルボジ
   イミド、グルタルアルテビド型のアルデビド、２塩化ジ
   アジド、とりわけ２塩化スクシニールの様な化学剤によ
   って行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第４項
   記載の方法。 ６　鋼鉄、ガラス、プラスチック材および類似物型のあ
   らゆる担体の場合における、抗体、抗原、アルブミン、
   オバルブミン、膠原質、酵素、ホルモン、生物学的活動
   性のポリサッカライド型のあらゆる生物学的高分子に対
   する、特許請求の範囲第１〜５項のうちいずれか１項記
   戦の方法の応用。 ７、　固定すべき物質がビールス、バクテリア、微生物
   、亜細胞部分である、特許請求の範囲第１〜５項のうち
   いずれか１項記載の方法の応用。 ８、　固体担体が免疫学（放射免疫学、免疫酵素、免疫
   螢光測定、等）的測定に抗原才たは抗体をもたらす、特
   許請求の範囲第６項または第７項記載の方法の応用。 ９、ＩＩ体担体が、親和力の方法による生物学的物質の
   または細胞の分離のために使用される生物学的高分子ま
   たは生物学的物質を持つ、特許請求の範囲第１〜５項の
   何れか一つに記載の方法の応用。 １０、人間の血液または若干の部分のような、生物学的
   物質と接触するようにされた固体担体（そこでは固定さ
   れた高分子が担体のこれら生物学的物質との適合を改善
   することになっている）に対しての、特許請求の範囲＄
   １〜５項のうちいずれか１項記載の方法の応用。 １１　固体担体に固定された高分子はヘパリンである、
   特許請求の範囲第１０項記載の応用。 Ｉ２　生物学的高分子をまとった、ポリエチレン型のプ
   ラスチック杓の密度の小さい球（この密度は球が使用さ
   れる媒質の密度より低い）。